PL241698B1 - Polimeraza Pwo-NeqSSB, sposób jej otrzymywania, plazmid rekombinantowy, startery oraz zastosowanie polimerazy - Google Patents

Polimeraza Pwo-NeqSSB, sposób jej otrzymywania, plazmid rekombinantowy, startery oraz zastosowanie polimerazy Download PDF

Info

Publication number
PL241698B1
PL241698B1 PL436784A PL43678421A PL241698B1 PL 241698 B1 PL241698 B1 PL 241698B1 PL 436784 A PL436784 A PL 436784A PL 43678421 A PL43678421 A PL 43678421A PL 241698 B1 PL241698 B1 PL 241698B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
lys
glu
leu
gly
val
Prior art date
Application number
PL436784A
Other languages
English (en)
Other versions
PL436784A1 (pl
Inventor
Marta SKWARECKA
Marta Skwarecka
Kasjan SZEMIAKO
Kasjan Szemiako
Marcin Olszewski
Sabina ŻOŁĘDOWSKA
Sabina Żołędowska
Dawid NIDZWORSKI
Dawid Nidzworski
Original Assignee
Inst Biotechnologii I Medycyny Molekularnej
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Inst Biotechnologii I Medycyny Molekularnej filed Critical Inst Biotechnologii I Medycyny Molekularnej
Priority to PL436784A priority Critical patent/PL241698B1/pl
Priority to EP22153626.1A priority patent/EP4036237A1/en
Publication of PL436784A1 publication Critical patent/PL436784A1/pl
Publication of PL241698B1 publication Critical patent/PL241698B1/pl

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C12N9/1241—Nucleotidyltransferases (2.7.7)
    • C12N9/1252—DNA-directed DNA polymerase (2.7.7.7), i.e. DNA replicase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C12N9/1241—Nucleotidyltransferases (2.7.7)
    • C12N9/1276—RNA-directed DNA polymerase (2.7.7.49), i.e. reverse transcriptase or telomerase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y207/00—Transferases transferring phosphorus-containing groups (2.7)
    • C12Y207/07—Nucleotidyltransferases (2.7.7)
    • C12Y207/07007—DNA-directed DNA polymerase (2.7.7.7), i.e. DNA replicase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/80—Fusion polypeptide containing a DNA binding domain, e.g. Lacl or Tet-repressor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

Przedmiotem wynalazku jest polimeraza Pwo-NeqSSB oraz sposób jej klonowania. Ponadto przedmiotem wynalazku jest wyizolowany plazmid rekombinantowy, startery oraz zastosowanie polimerazy do powielania specyficznych sekwencji wirusa SARS CoV-2.

Description

Opis wynalazku
Przedmiotem wynalazku jest polimeraza Pwo-NeqSSB oraz sposób jej klonowania. Ponadto przedmiotem wynalazku jest wyizolowany plazmid rekombinantowy, startery oraz zastosowanie polimerazy do powielania specyficznych sekwencji wirusa SARS CoV-2.
Organizmy termofilne oraz hipertermofilne stanowią potencjalne źródło enzymów pożądanych w różnych gałęziach przemysłu, dzięki swojej wysokiej stabilności w wysokich temperaturach. Przykładem białek o szerokim zastosowaniu są termostabilne polimerazy DNA, których optymalna aktywność osiągana jest w temperaturze powyżej 70°C, a wiele z nich zachowuje swoją aktywność nawet powyżej 100°C. Budowa termostabilnych polimeraz DNA różni się od ich odpowiedników pochodzenia mezofilnego. Struktura ich jest sztywniejsza i bardziej upakowana. Stabilność α-helis jest zapewniona m.in. przez zmniejszoną zawartość takich reszt aminokwasowych jak izoleucyna czy walina, które w znacznym stopniu przyczyniają się do występowania przestrzennych naprężeń. W enzymach tych zaobserwowano znaczne zwiększenie oddziaływań, takich jak: oddziaływani a jonowe, van der Waalsa czy hydrofobowe, które również mają istotny wpływ na wzrost termostabilności białek. W technikach biologii molekularnej czy inżynierii genetycznej najczęściej korzysta się z termostabilnych polimeraz DNA pochodzenia bakteryjnego: Thermus aquaticus, Thermus thermophilus, Thermotoga maritima, Bacillus stearothermophilus lub z archeonów tj.: Thermococcus litoralis, Pyrococcus furiosus, Pyrococcus woesei. Główne zastosowanie tych polimeraz DNA to amplifikacja fragmentów DNA z udziałem techniki PCR oraz sekwencjonowanie DNA.
Jedną z najlepiej znanych polimeraz DNA, pochodzących z Euryarcheota i wykorzystywanych w biologii oraz diagnostyce molekularnej jest polimeraza DNA Pwo z Pyrococcus woesei. Jej struktura przypomina pierścień, na który składają się domena 3’^5’ egzonukleazy oraz domena polimeryzacyjna zbudowana z subdomeny śródręcza, palców i kciuka (rysunek 1).
Aktywność polimeryzacyjna oraz korektorska polimeraz DNA archeonów jest związana z pętlą w domenie odpowiedzialnej za aktywność egzonukleolityczną. Jest to element silnie zakonserwowany i występujący wyłącznie u tej grupy mikroorganizmów. Reszty aminokwasowe budujące pętlę oddziałują z dodatnio naładowaną krawędzią subdomeny kciuka i umożliwiają wiązanie końca 3’ ssDNA do centrum aktywnego enzymu. Polimeraza DNA Pwo charakteryzuje się wysoką procesywnością i wiernością replikacji DNA, co związane jest z obecnością domeny korektorskiej 3’^5’ egzonukleazy. Jej termostabilność znacznie przewyższa bakteryjną polimerazę DNA Taq, gdyż czas jej półtrwania wynosi prawie 3 h w 100°C. Ponadto wykazuje większą procesywność i rzadziej popełnia błędy w trakcie syntezy.
Białko NeqSSB należy do rodziny białek SSB (ang. Single-Stranded DNA Binding protein). Białka SSB wykazują różnorodność sekwencji aminokwasowych oraz struktury. Mimo to wszystkie posiadają charakterystyczną, silnie zakonserwowaną, ok. 100 - aminokwasową domenę oligonukleotydową OB (ang. Oligonucleotide/Oligosaccharide Binding Fold Domain). Występuje ona powszechnie u białek posiadających zdolności wiązania ssDNA, determinuje, więc tą podstawową i wspólną dla wszystkich białek SSB cechę - niespecyficzne wiązanie jednoniciowej nici DNA, a także, odkryte znacznie później, wiązanie RNA. Białka SSB odgrywają zasadniczą rolę w procesach ściśle związanych z ssDNA. Odgrywają istotną rolę w replikacji, rekombinacji i naprawie DNA. Odpowiadają za interakcje z jednoni ci owym DNA, zapobiegają tworzeniu struktur drugorzędowych i chronią przed degradacyjnym działaniem nukleaz.
Odkrycie białek SSB datuje się na połowę lat 60-tych XX wieku. Pierwsze wykryte białka to białko SSB faga T4 oraz E. coli. Odkryto wtedy ich silne właściwości związane z oddziaływaniem z ssDNA oraz elucję białka w złożu ssDNA-celuloza w obecności wysokiego stężenia soli - 2 M NaCl. Zwrócono również uwagę na bardzo wysoką selektywność tego białka do jednoni ci owego DNA. Potwierdzeniem fundamentalnej roli białek SSB w procesach związanych z ssDNA jest fakt, iż występują one u wszystkich organizmów żywych, a także u wirusów.
Wiązanie się białka SSB z ssDNA polega na upakowaniu aromatycznych reszt aminokwasowych między zasady w łańcuchu oligonukleotydowym. Ponadto dodatnio naładowane reszt aminokwasowych oddziałują ze szkieletem fosforanowym w cząsteczce ssDNA.
Mimo przynależności białka NeqSSB do rodziny białek SSB odbiega ono swoimi cechami od klasycznych białek SSB, stąd określane jest jako białko NeqSS B-podobne. Białko to pochodzi z hipertermofilnego archeona Nanoarchaeum equitans, który pasożytuje w craenarchaeonie Ignicoccus hospitalis. Optymalne warunki wzrostu tego mikroorganizmu wymagają ściśle beztleno
PL 241 698 B1 wych warunków i temperatury 90°C. Co ciekawe Nanoarchaeum equitans posiada najmniejszy znany genom składający się z 490,885 par zasad. W przeciwieństwie do większości znanych organizmów o obniżonych genomach, posiada pełny zestaw enzymów biorących udział w replikacji, naprawie i rekombinacji DNA, w tym białko SSB.
Białko NeqSSB podobnie jak inne białka z tej rodziny posiada naturalną zdolność wiązania DNA. Składa się z 243 reszt aminokwasowych, a w swojej strukturze ma jedną domenę OB (rys 1). Wykazuje biologiczną aktywność jako monomer, podobnie do niektórych wirusowych białek SSB. Badania wskazują na jego nietypowe dla innych białek SSB zdolności wiązania wszystkich form DNA (ssDNA, dsDNA) oraz mRNA bez strukturalnych preferencji. Ponadto białko charakteryzuje się wysoką termostabilnością. Czas półtrwania przy zachowaniu aktywności biologicznej wynosi 5 min w 100°C, natomiast temperatura topnienia to 100,2°C.
Celem wynalazku jest stworzenie nowej polimerazy Pwo-NeqSSB, która będzie miała zastosowanie do powielania specyficznych sekwencji wirusa SARS CoV-2.
Przedmiotem wynalazku jest polimeraza Pwo-NeqSSB o SEQ. ID 1.
Przedmiotem wynalazku jest również sposób klonowania polimerazy Pwo-NeqSSB o SEQ.ID 1, którą otrzymuje się DNA insertu przeznaczonego do klonowania, które polega na przeprowadzeniu dwóch niezależnych reakcji PCR:
- w pierwszej reakcji amplifikacji otrzymuje się produkt o sekwencji nukleotydowej odpowiadającej sekwencji genu kodującego polimerazę DNA Pwo z dodatkową sekwencją łącznika oraz komplementarną do 11 początkowych nukleotydów białka NeqSSB na C-końcu;
- drugi produkt zawiera sekwencję nukleotydową genu kodującego białko NeqSSB wiążącego DNA z dodatkowymi nukleotydarni charakterystycznymi dla łącznika oraz 11 dodatkowymi nukleotydarni komplementarnymi do końcowej sekwencji nukleotydowej polimerazy Pwo na N-końcu;
- matrycę do reakcji PCR stanowi wyizolowane genomowe DNA,
- otrzymane produkty w dwóch powyższych reakcjach rozdziela się w żelu agarozowym z bromkiem etydyny i poddaje się izolacji z żelu.
Sposób, gdzie produkty dwóch reakcji PCR służą, jako inserty w reakcji Gibsona, gdzie:
- Trawienie plazmidu pET30EKLIC
- w celu zlinearyzowania plazmidu pET30EKLIC poddaje się go trawieniu enzymem BamHI i Ndel (NEB), które tną w dwóch miejscach zostawiając niekomplementarne do siebie końce DNA,
- reakcję trawienia DNA wektora prowadzi się przez 2 h w temperaturze 37°C z dodatkiem odpowiedniego buforu,
- potrawiony plazmid poddaje się rozdziałowi elektroforetycznemu i izoluje się;
- Reakcja składania genów,
- reakcja Gibsona prowadzi się w termocyklerze w 50°C przez 60 min, gdzie mieszanina zawiera bufor, nukleotydy, enzymy, wodę jałową, insert I, Insert II, wektor,
- po reakcji mieszanina dodaje się do świeżo przygotowanych komórek kompetentnych E. coli TOP10,
- otrzymaną mieszaninę inkubuje się w lodzie przez 40 min, po tym czasie inkubacji przeprowadza się szok termiczny polegający na umieszczeniu mieszaniny komórek na 60 s w termobloku o temperaturze 42°C, a następnie 2 min inkubacji w lodzie, po szoku termicznym komórki poddaje się 60 min inkubacji w 37°C z dodatkiem 600 ml LB, po tym czasie komórki wiruje się (10 min, 1800 obr./min), odrzucono 500 ml przesączu, osad zawieszono w pozostałej ilości supernatantu i wysiano na płytki z podłożem LA z dodatkiem kanamycyny, płytki inkubowano przez ok. 16 h w 37°C.
Sposób, gdzie w celu uzyskania białka fuzyjnego Pwo-Neq SSB, komórki E. coli BL RIL poddaje się transformacji z użyciem DNA plazmidu rekombinantowego pET30-Pwo-NeqSSB i przeprowadza się produkcję pożądanych białek fuzyjnych, hodowle z dodatkiem kanamycyny i chloramfenikolu prowadzi się przez 16 h w 37°C, odmłodzono i po osiągnięciu przez hodowle OD600 = 0,5 dodaje się IPTG do końcowego stężenia 0,1 mM; po indukcji hodowle prowadzi się jeszcze przez 5 h, po czym wiruje się (10 min, 5000 obr./min) i poddaje się oczyszczaniu metodą metalopowinowactwa; rezultaty produkcji białek analizuje się za pomocą białkowej elektroforezy poliakrylamidowej w warunkach denaturujących.
PL 241 698 B1
Przedmiotem wynalazku jest również wyizolowany plazmid rekombinantowy, który obejmuje fragment nukleotydowej sekwencji białka kodujące polimerazę Pwo- NeqSSB od 5076 do 8168 z plazmidu pET30EKLIC o SEQ. ID. 5.
Wyizolowany plazmid pET30-Pwo-NeqSSB o sekwencji SEQ.ID.5.
Przedmiotem wynalazku są również startery do klonowania polimerazy Pwo-NeqSSB o sekwencjach SEQ.ID. 6.-9.
Przedmiotem wynalazku jest polimeraza Pwo-NeqSSB o SEQ. ID 1 do zastosowania do powielania specyficznych sekwencji wirusa SARS CoV-2.
Opis rysunków (figur) i sekwencji:
Rys. 1 - przedstawia strukturę czwartorzędową polimerazy DNA Pwo, która składa się z domeny egzonukleazy (kolor niebieski), domeny N-końcowej (kolor fioletowy) oraz trzech subdomen: śródręcza (kolor pomarańczowy), palców (kolor zielony), kciuka (kolor czerwony).
Rys. 2 - schematyczne przedstawienie podstawowych domen występujących w białku NeqSSB Rys. 3 - przedstawia schemat klonowania metodą Gibsona.
Rys. 4 - przedstawia rozdział elektroforetyczny produktów po reakcji PCR.
A - rozdział produktów po pierwszej reakcji PCR pozwalający na otrzymanie produktu o wielkości 762 pz.
B - rozdział produktów po drugiej reakcji PCR pozwalający na otrzymanie produktu o wielkości 2372 pz. M - marker DNA HyperLadder II, 1-4 oczekiwany produkt PCR.
Rys. 5 - przedstawia rozdział elektroforetyczny plazmidu pD454-SR po reakcji trawienia. M - marker DNA SM0311 (ThermoScientific), 1 - pET30EKLIC nietrawiony,
- pET30EKLIC po reakcji trawienia
Rys. 6 - przedstawia rozdział elektroforetyczny przedstawiający wyniki oczyszczania polimerazy DNA Pwo-Neq na kolumnie ze złożem His-Trap
M - Białkowy marker wielkości (14,4-116 kDa) o wielkości białek wzorcowych: 116; 66,2; 45; 35; 25; 18,4; 14,4 kDa;
- Lizat komórkowy E. coli BL RIL/pET30-Pwo-NeqSSB po sonikacji i denaturacji białek gospodarza
- Frakcja po płukaniu buforem B (200 ml)
- Frakcja po elucji buforem C (15 ml)
- Frakcja po drugiej elucji buforem C (15 ml)
Rys. 7 - przedstawia rozdział elektroforetyczny produktów po reakcji PCR z dodatkiem różnego stężenia jonów magnezu. 1-0,5 ul Mg2+ 50 mM, 2-0,75 ul Mg2+ 50 mM, 3-1 ul Mg2+‘ 50 mM, 4-1,25 ul Mg2+ 50 mM, 5-1,5 ul Mg2+ 50 mM, 6-1,75 ul Mg2+ 50 mM, 7-2 ul Mg2+ 50 mM, 8-2,25 ul Mg2+ 50 mM, 9-2,5 ul Mg2+ 50 mM, K- - bez magnezu.
Rys. 8 - przedstawia wykres zależności fluorescencji barwnika SybrGreen w czasie prowadzenia reakcji RT qPCR z zastosowaniem polimerazy Pwo-Neq w reakcji identyfikacji wirusa SARS-CoV-2 na matrycy wyizolowanego RNA wirusowego.
Rys. 9 - przedstawia wykres zależności fluorescencji barwnika SybrGreen w czasie prowadzenia reakcji RT qPCR z zastosowaniem polimerazy Pwo-Neq w reakcji identyfikacji wirusa SARS-CoV-2 bezpośrednio z wymazu.
Rys. 10 -przedstawia wykres zależności fluorescencji barwnika SybrGreen w czasie prowadzenia reakcji RT qPCR z zastosowaniem polimerazy Pwo-Neq w reakcji identyfikacji wirusa SARS-CoV-2 bezpośrednio ze śliny w buforze rozbijającym.
SEQ. ID 1 - przedstawia sekwencję aminokwasową konstruktu polimerazy fuzyjnej PwoNeqSSB, gdzie: Główny rdzeń polimerazy stanowi polimeraza Pwo, która na swoim C-końcu, za pomocą sześcioaminokwasowego łącznika (GSGGVD), połączona zostanie z białkiem NeqSSB (wyizolowanym z Nanoarchaeum equitans). Obecność łącznika zapewnia białku fuzyjnemu pewną elastyczność i stosunkowo swobodne ułożenie się w stosunku do polimerazy, co ma na celu zapobieganie ewentualnej zawadzie sterycznej.
SEQ.ID.2 - przedstawia sekwencję aminokwasową polimerazy Pwo
SEQ.ID.3 - przedstawia sewkencję aminokwasową łącznika/linkera
SEQ.ID.4 - przedstawia sekwencję aminokwasową białka NeqSSB.
PL 241 698 B1
SEQ.ID.5 - przedstawia sekwencję plazmidu z genem kodującym białko Pwo-NeqSSB SEQ.ID.6-9 - przedstawiają sekwencje starterów
Wynalazek ilustrują następujące przykłady wykonania, niestanowiące jego ograniczenia Przykład 1
I. Gen kodujący polimerazę, wektor ekspresyjny, system ekspresyjny
a) Gen kodujący polimerazę Pwo-NeqSSB
Sekwencję aminokwasową polimerazy Pwo-NeqSSB wydłużono o sekwencję domeny histydynowej niezbędnej do efektywnego oczyszczania polimerazy metodą metalopowinowactwa. Domena 6xHis przyłączona została na C-końcu polimerazy. Sekwencja nukleotydowa polimerazy została przedstawiona na SEQ ID 1.
b) Wektor ekspresyjny
Przy wyborze wektora do ekspresji enzymu kierowano się możliwością:
- selekcji antybiotykowej klonów
- przeprowadzenia klonowania i jego namnożenia w komórkach bakteryjnych - obecność promotora umożliwiającego łatwy sposób kontroli i indukcji ekspresji Wybrano wektor pET30EKLIC niosący gen oporności na kanamycynę, bakteryjne Ori replikacji oraz sekwencję promotora laktozowego T7 pozwalającą na indukcję ekspresji za pomocą IPTG. Wektor posiada miejsca rozpoznania dla enzymów restrykcyjnych BamHI i Ndel, które tną DNA plazmidowe w dwóch miejscach dając dwa niekomplementarne lepkie końce niezbędne na etapie klonowania c) System ekspresyjny
Do ekspresji termostabilnej polimerazy fuzyjnej Pwo-NeqSSB wybrano system prokariotyczny - E. coli, który jest najczęściej stosowanym układem do nadprodukcji białek zarówno na skalę laboratoryjną jak i przemysłową. Wytypowano szczepy IP-Free dostępne przez firmę Promega: Escherichia coli BL21(DE3)pLysS.
d) Zaprojektowanie starterów SEQ.ID 6
Polimeraz typu Phusion składa się z dwóch białek, które kodowane są przez dwa niezależne geny. Wymusza to zastosowanie metody klonowania, która umożliwi wklonowanie kilku fragmentów DNA jednocześnie. Zdecydowano skorzystać z metody Gibsona, która w jednej reakcji umożliwia wygenerowanie lepkich końców (egzonukleaza 5’^-3’), wydłużanie końców DNA (polimeraz DNA) oraz kowalencyjne połączenie dwóch końców DNA (ligaza DNA) kilku fragmentów jednocześnie. Zastosowano zestaw OverLap firmy A&A Biotechnology. Schemat klonowania przedstawia rysunek 3.
Przykład 2
II. Klonowanie polimerazy Pwo-Neq SSB
a) Amplifikacja produktów przeznaczonych do klonowania
Otrzymanie DNA insertu przeznaczonego do klonowania polegało na przeprowadzeniu dwóch niezależnych reakcji PCR. Pierwsza z reakcji amplifikacji pozwoliła na otrzymanie produktu o sekwencji nukleotydowej odpowiadającej sekwencji polimerazy DNA z dodatkową sekwencją łącznika oraz komplementarną do 11 początkowych nukleotydów białka NeqSSB na C-końcu. Drugi produkt zawierał sekwencję nukleotydową białka wiążącego DNA z dodatkowymi nukleotydami charakterystycznymi dla łącznika oraz 11 dodatkowymi nukleotydami komplementarnymi do końcowej sekwencji nukleotydowej polimerazy Pwo na N-końcu. Matrycę do reakcji PCR stanowiło wyizolowane genomowe DNA. Otrzymane produkty w dwóch powyższych reakcjach rozdzielono w żelu agarozowym z bromkiem etydyny i poddano izolacji z żelu z wykorzystaniem zestawu Gel-Out Concentrator (A&A Biotechnology). Wynik otrzymanych produktów po reakcji PCR przedstawia rysunek 4.
Produkty tych dwóch reakcji PCR posłużyły, jako inserty w reakcji Gibsona z wykorzystaniem zestawu OverLap Assembly mix (A&A Biotechnology).
b) Trawienie plazmidu pET30EKLIC
W celu zlinearyzowania plazmidu pET30EKLIC poddano go trawieniu enzymem BamHI i Ndel (NEB), który tnie w dwóch miejscach zostawiając niekomplementarne do siebie końce DNA. Reakcja trawienia DNA wektora prowadzona była przez 2 h w temperaturze 37°C z dodatkiem odpowiedniego buforu zalecanych przez producenta.
PL 241 698 Β1
Potrawiony plazmid poddano rozdziałowi elektroforetycznemu i wyizolowano zestawem Gel-Out Concentrator (A&A Biotechnology). Wynik trawienia przedstawia rysunek 5.
c) Reakcja składania genów
Reakcja Gibsona z wykorzystaniem zestawu OverLap Assembly mix prowadzona była w termocyklerze w 50°C przez 60 min. Skład mieszaniny znajduje się poniżej :
Składnik Ilość [ml]
Bufor ‘ 5'-OvcrLap .. Assembly (A&A A - ~ - *
Biotechnology) i u
Nukleotydy [10 mM] 2
Enzymy OvcrLap Assembly . (A&A 2 “ '
Biotechnology) ~ ;
Woda jałowa 3 ~~
ί Insert, I'[ 150ng/ml] \ 3:.' - A ’
Insert II [150ng/ml] 3 - .......
[ Wektor [150ng/ml] 3
Objętość końcowa 20
Po reakcji mieszanina dodawana była do świeżo przygotowanych komórek kompetentnych E. coli TOP 10.
d) Transformacja komórek kompetentnych
Mieszaninę po reakcji Gibsona dodano do 100 ml komórek kompetentnych E. coli TOP 10. Otrzymaną mieszaninę inkubowano w lodzie przez 40 min. Po tym czasie inkubacji przeprowadzono szok termiczny polegający na umieszczeniu mieszaniny komórek na 60 s w term obłoku o temperaturze 42°C, a następnie 2 min inkubacji w lodzie. Po szoku termicznym komórki poddano 60 min inkubacji w 37°C z dodatkiem 600 ml LB. Po tym czasie komórki żwirowano (10 min, 1800 obr./min), odrzucono 500 ml przesączu, osad zawieszono w pozostałej ilości supernatantu i wysiano na płytki z podłożem LA z dodatkiem kanamycyny. Płytki inkubowano przez ok. 16 h w 37°C.
Przykład 3
III. Ekspresja i oczyszczanie polimerazy Pwo-Neq SSB
W celu uzyskania białka fuzyjnego Pwo-NeqSSB, komórki E. coli BL RIL poddano transformacji z użyciem DNA plazmidu rekombinantowego pET30-Pwo-NeqSSB i przeprowadzono produkcję pożądanych białek fuzyjnych. Hodowle z dodatkiem kanamycyny i chloramfenikolu prowadzono przez 16 h w 37°C, odmłodzono i po osiągnięciu przez hodowle OD600 = 0,5 dodano IPTG do końcowego stężenia 0,1 mM. Po indukcji hodowle prowadzono jeszcze przez 5 h, po czym żwirowano (10 min, 5000 obr./min) i poddano oczyszczaniu metodą metalopowinowactwa. Rezultaty produkcji białek analizowano za pomocą białkowej elektroforezy poliakrylamidowej w warunkach denaturujących (SDS-PAGE) (rysunek 5). Masa molekularna białka obliczona przy pomocy programu komputerowego Expasy wynosiła 118,2 kDa:
Ilość aminokwasów: 1023
Masa molekularna: 118219.00
Teoretyczna wartość pl: 8.46
Wyniki rozdziałów elektroforetycznych przedstawiających stopień oczyszczenia i stężenie białek po każdym etapie oczyszczania przedstawia rysunek 6.
PL 241 698 B1
Przykład 4
IV. Aktywność i zastosowanie polimerazy Pwo-Neq SSB
1) Zastosowanie polimerazy w klasycznej reakcji PCR z detekcja w żelu agarozowym - target fragment plazmidowego DNA pUC19 o wielkości 1200 pz w różnym stężeniu jonów magnezu, Rys. 7.
2) Zastosowanie polimerazy w reakcji real-time PCR - identyfikacja genu S z wykorzystaniem różnych matryc RNA: totalnego RNA wirusa SARS-CoV-2, bezpośrednio z wymazu zainfekowanego wirusem oraz śliny z wirusem SARS- CoV-2.(Rys. 8-10).
Literatura:
[1] Vieille C, Burdette DS, Zeikus JG. Thermozymes. Biotechnol Annu Rev. 1996;2:1-83.
[2] Hamilton SC, Farchaus JW, Davis MC. DNA polymerases as engines for biotechnology. Biotechniques. 2001;31(2):370-6, 378-80, 382-3.
[3] Kim SW, Kim DU, Kim JK, Kang LW, Cho HS. Crystal structure of Pfu, the high fidelity DNA polymerase from Pyrococcus furiosus. Int J Biol Macromol. 2008;42(4):356-61.
[4] Takagi M, Nishioka M, Kakihara H, Kitabayashi M, Inoue H, Kawakami B, Oka M, Imanaka T. Characterization of DNA polymerase from Pyrococcus sp. strain KOD1 and its application to PCR. Appl Environ Microbiol. 1997;63(11):4504-10.
[5] Olszewski M, Balsewicz J, Nowak M, Maciejewska N, Cyranka-Czaja A, Zalewska-Piątek B, et al. Characterization of a Single-Stranded DNA-Binding-Like Protein from Nanoarchaeum equitans - Nucleic Acid Binding Protein with Broad Substrate Specificity. PLoS One. 2015; 10:e0126563.
[6] DNA Modifying enzymes.; Avaliable from:
https:/www.neb.com/~/media/Catalog/All-Products/0AA961B29E444AFBEDD5C4A904C76E6/Datacards or Manusals/ManualE2611 .pdf
PL 241 698 Β1
IBiMM _seq_P.436784
SEQUENCE LISTING <110> Instytut Biotechnologii i Medycyny Molekularnej <120> Polimeraza Pwo-NeqSSB, sposób jej otrzymywania, plazmid rekombinantowy, startery oraz zastosowanie polimerazy.
< 150> PLP.436784 <151> 2021-01-27 < 160> 9 < 170> BiSSAP 1.3.6 < 210> 1 < 211> 1023 < 212> PRT < 213> Artificial Sequence
<220> <223> fusior i 2 f iroteins
<400> 1 Met Ile Leu Asp Val Asp Tyr Ile Thr Glu Glu Gly Lys Pro Val Ile
1 Arg Leu Phe Lys 5 10 15 Lys Glu Asn Gly Lys Phe Lys Ile Glu His Asp Arg
Thr Phe Arg 20 Pro 25 30 Tyr Ile Tyr Ala Leu Leu Arg Asp Asp Ser Lys Ile
35 Glu Glu Val Lys 40 45 Lys Ile Thr Gly Glu Arg His Gly Lys Ile Val Arg
50 Ile Val Asp Val 55 60 Glu Lys Val Glu Lys Lys Phe Leu Gly Lys Pro Ile
65 Thr Val Trp Lys 70 75 80 Leu Tyr Leu Glu His Pro Gin Asp Val Pro Thr Ile
Arg Glu Lys Val 85 90 95 Arg Glu His Pro Ala Val Val Asp Ile Phe Glu Tyr
Asp Ile Pro 100 Phe 105 110 Ala Lys Arg Tyr Leu Ile Asp Lys Gly Leu Ile Pro
115 Met Glu Gly Glu 120 125 Glu Glu Leu Lys Ile Leu Ala Phe Asp Ile Glu Thr
130 Leu Tyr His Glu 135 140 Gly Glu Glu Phe Gly Lys Gly Pro Ile Ile Met Ile
145 Ser Tyr Ala Asp 150 155 160 Glu Asn Glu Ala Lys Val Ile Thr Trp Lys Asn Ile
Asp Leu Pro Tyr 165 170 175 Val Glu Val Val Ser Ser Glu Arg Glu Met Ile Lys
Arg Phe Leu 180 Arg 185 190 Ile Ile Arg Glu Lys Asp Pro Asp Ile Ile Val Thr
195 Tyr Asn Gly Asp 200 205 Ser Phe Asp Phe Pro Tyr Leu Ala Lys Arg Ala Glu
210 215 220
PL 241 698 Β1
IBiMM _seq_P.436784
Lys Leu Gly Ile 225
Met Gin Arg Ile
His Phe Asp Leu 26Θ
Tyr Thr Leu Glu 275
Lys Val Tyr Ala 290
Leu Glu Arg Val 3Θ5
Glu Leu Gly Lys
Val Gly Gin Pro 340
Val Glu Trp Phe 355
Pro Asn Lys Pro 370
Tyr Thr Gly Gly 385
Ile Val Tyr Leu
His Asn Val Ser 420
Asp Ile Ala Pro 435
Phe Ile Pro Ser 450
Lys Thr Lys Met 465
Asp Tyr Arg Gin
Tyr Tyr Gly Tyr 500
Ser Val Thr Ala 515
Leu Glu Glu Lys
S30
Leu Tyr Ala Thr 545
Ala Leu Glu Phe
Glu Leu Glu Tyr
580
Lys Arg Tyr Ala 595
Leu Glu Ile Val
610
Ala Arg Val Leu 625
Lys Leu Thr Ile Gly 230
Gly Asp Met Thr Ala 245
Tyr His Val Ile Thr
265
Ala Val Tyr Glu Ala 280
Asp Glu Ile Ala Lys 295
Ala Lys Tyr Ser Met 310
Glu Phe Leu Pro Met 325
Leu Trp Asp Val Ser 345
Leu Leu Arg Lys Ala 360
Ser Glu Glu Glu Tyr 375
Phe Val Lys Glu Pro 390
Asp Phe Arg Ala Leu 405
Pro Asp Thr Leu Asn
425
Gin Val Gly His Lys 440
Leu Leu Gly His Leu 455
Lys Glu Thr Gin Asp 470
Lys Ala Ile Lys Leu 485
Ala Lys Ala Arg Trp
505
Trp Gly Arg Lys Tyr 520
Phe Gly Phe Lys Val 535
Ile Pro Gly Gly Glu 550
Val Lys Tyr Ile Asn 565
Glu Gly Phe Tyr Lys
585
Val Ile Asp Glu Glu 600
Arg Arg Asp Trp Ser 615
Glu Thr Ile Leu Lys
630
Arg Asp Gly Ser Glu 235
Val Glu Val Lys Gly 250
Arg Thr Ile Asn Leu
270
Ile Phe Gly Lys Pro 285
Ala Trp Glu Ser Gly 300
Glu Asp Ala Lys Ala 315
Glu Ile Gin Leu Ser 330
Arg Ser Ser Thr Gly 350
Tyr Glu Arg Asn Glu 365
Gin Arg Arg Leu Arg 380
Glu Lys Gly Leu Trp 395
Tyr Pro Ser Ile Ile 410
Leu Glu Gly Cys Lys
430
Phe Cys Lys Asp Ile 445
Leu Glu Glu Arg Gin 46Θ
Pro Ile Glu Lys Ile 475
Leu Ala Asn Ser Phe 490
Tyr Cys Lys Glu Cys
510
Ile Glu Leu Val Trp 525
Leu Tyr Ile Asp Thr 540
Ser Glu Glu Ile Lys 555
Ser Lys Leu Pro Gly 570
Arg Gly Phe Phe Val
590
Gly Lys Val Ile Thr 605
Glu Ile Ala Lys Glu 620
His Gly Asp Val Glu 635
Pro Lys 240
Arg Ile 255 Pro Thr
Lys Glu
Glu Asn
Thr Tyr 320
Arg Leu 335 Asn Leu
Val Ala
Glu Ser
Glu Asn 400 Ile Thr 415 Asn Tyr
Pro Gly
Lys Ile
Leu Leu 480 Tyr Gly 495 Ala Glu
Lys Glu
Asp Gly
Lys Lys 560
Leu Leu 575 Thr Lys
Arg Gly
Thr Gin
Glu Ala 640
PL 241 698 Β1
IBiMM _seq_P.436784
Val Arg Ile Val Lys 645 Glu Val Ile Gin Lys 650 Leu Ala Asn Tyr Glu 655 He
Pro Pro Glu Lys 660 Leu Ala Ile Tyr Glu 665 Gin Ile Thr Arg Pro 670 Leu His
Glu Tyr Lys 675 Ala Ile Gly Pro His 680 Val Ala Val Ala Lys 685 Lys Leu Ala
Ala Lys 690 Gly Val Lys Ile Lys 695 Pro Gly Met Val Ile 70Θ Gly Tyr Ile val
Leu 705 Arg Gly Asp Gly Pro 710 Ile Ser Asn Arg Ala 715 Ile Leu Ala Glu Glu 720
Tyr Asp Pro Lys Lys 725 His Lys Tyr Asp Ala 730 Glu Tyr Tyr Ile Glu 735 Asn
Gin Val Leu Pro 740 Ala Val Leu Arg Ile 745 Leu Glu Gly Phe Gly 750 Tyr Arg
Lys Glu Asp 755 Leu Arg Tyr Gin Lys 760 Thr Arg Gin Val Gly 765 Leu Thr Ser
Trp Leu 770 Asn Ile Lys Lys Ser 775 Gly Ser Gly Gly Val 780 Asp Asp Glu Glu
Glu 785 Leu Ile Gin Leu Ile 790 Ile Glu Lys Thr Gly 795 Lys Ser Arg Glu Glu 800
Ile Glu Lys Met Val 805 Glu Glu Lys Ile Lys 810 Ala Phe Asn Asn Leu 815 Ile
Ser Arg Arg Gly 820 Ala Leu Leu Leu Val 825 Ala Lys Lys Leu Gly 830 Val Leu
Tyr Lys Asn 835 Thr Pro Lys Glu Lys 840 Lys Ile Gly Glu Leu 845 Glu Ser Trp
Glu Tyr 850 Val Lys Val Lys Gly 855 Lys Ile Leu Lys Ser 860 Phe Gly Leu Ile
Ser 865 Tyr Ser Lys Gly Lys 870 Phe Gin Pro Ile Ile 875 Leu Gly Asp Glu Thr 880
Gly Thr Ile Lys Ala 885 Ile Ile Trp Asn Thr 890 Asp Lys Glu Leu Pro 895 Glu
Asn Thr Val Ile 900 Glu Ala Ile Gly Lys 905 Thr Lys Ile Asn Lys 910 Lys Thr
Gly Asn Leu 915 Glu Leu His Ile Asp 920 Ser Tyr Lys Ile Leu 925 Glu Ser Asp
Leu Glu 930 Ile Lys Pro Gin Lys 935 Gin Glu Phe Val Gly 940 Ile Cys Ile Val
Lys 945 Tyr Pro Lys Lys Gin 950 Thr Gin Lys Gly Thr Ile Val Ser Lys Ala 960
Ile Leu Thr Ser Leu 965 Asp Arg Glu Leu Pro 970 Val Val Tyr Phe Asn 975 Asp
Phe Asp Trp Glu 980 Ile Gly His Ile Tyr 985 Lys Val Tyr Gly Lys 990 Leu Lys
Lys Asn Ile 995 Lys Thr Gly Lys He 1000 Glu Phe Phe Ala Asp 1005 Lys Val Glu
Glu Ala 1010 Thr Leu Lys Asp Leu 1015 Lys Ala Phe Lys Gly 1020 Glu Ala Asp
<210> 2 <211> 775 <212> PRT
PL 241 698 Β1 <213> Pyrococcus furiosus
IBiMM _seq_P.436784 <400> 2
Met Ile Leu Asp Val Asp Tyr Ile 15
Arg Leu Phe Lys Lys Glu Asn Gly 20
Thr Phe Arg Pro Tyr Ile Tyr Ala
3540
Glu Glu Val Lys Lys Ile Thr Gly 5055
Ile Val Asp Val Glu Lys Val Glu 6570
Thr Val Trp Lys Leu Tyr Leu Glu 85
Arg Glu Lys Val Arg Glu His Pro 100
Asp Ile Pro Phe Ala Lys Arg Tyr
115120
Met Glu Gly Glu Glu Glu Leu Lys 130135
Leu Tyr His Glu Gly Glu Glu Phe
14515Θ
Ser Tyr Ala Asp Glu Asn Glu Ala 165
Asp Leu Pro Tyr Val Glu Val Val 180
Arg Phe Leu Arg Ile Ile Arg Glu
195200
Tyr Asn Gly Asp Ser Phe Asp Phe 210215
Lys Leu Gly Ile Lys Leu Thr Ile 225230
Met Gin Arg Ile Gly Asp Met Thr 245
His Phe Asp Leu Tyr His Val Ile 26Θ
Tyr Thr Leu Glu Ala Val Tyr Glu
275280
Lys Val Tyr Ala Asp Glu Ile Ala 290295
Leu Glu Arg Val Ala Lys Tyr Ser
305310
Glu Leu Gly Lys Glu Phe Leu Pro 325
Val Gly Gin Pro Leu Trp Asp Val 340
Val Glu Trp Phe Leu Leu Arg Lys
355360
Pro Asn Lys Pro Ser Glu Glu Glu
370375
Thr Glu Glu Gly Lys Pro Val Ile 1015
Lys Phe Lys Ile Glu His Asp Arg 2530
Leu Leu Arg Asp Asp Ser Lys Ile 45
Glu Arg His Gly Lys Ile Val Arg 60
Lys Lys Phe Leu Gly Lys Pro Ile 7580
His Pro Gin Asp Val Pro Thr Ile 9095
Ala Val Val Asp Ile Phe Glu Tyr 105110
Leu Ile Asp Lys Gly Leu Ile Pro 125
Ile Leu Ala Phe Asp Ile Glu Thr 140
Gly Lys Gly Pro ile Ile Met Ile 155160
Lys Val Ile Thr Trp Lys Asn Ile 170175
Ser Ser Glu Arg Glu Met Ile Lys 185190
Lys Asp Pro Asp Ile Ile Val Thr 205
Pro Tyr Leu Ala Lys Arg Ala Glu 220
Gly Arg Asp Gly Ser Glu Pro Lys 235240
Ala Val Glu Val Lys Gly Arg Ile 250255
Thr Arg Thr Ile Asn Leu Pro Thr 26527Θ
Ala Ile Phe Gly Lys Pro Lys Glu 285
Lys Ala Trp Glu Ser Gly Glu Asn 300
Met Glu Asp Ala Lys Ala Thr Tyr 315320
Met Glu Ile Gin Leu Ser Arg Leu 330335
Ser Arg Ser Ser Thr Gly Asn Leu 345350
Ala Tyr Glu Arg Asn Glu Val Ala 365
Tyr Gin Arg Arg Leu Arg Glu Ser 380
PL 241 698 Β1
IBiMM _seq_P.436784
Tyr Thr Gly Gly Phe Val Lys Glu Pro Glu Lys Gly Leu Trp Glu Asn
385 Ile Val Tyr Leu 390 Asp Phe Arg Ala Leu Tyr 395 Pro Ser Ile Ile Ile 400 Thr
His Asn Val Ser 405 Pro Asp Thr 410 Leu Asn Leu Glu Gly Cys Lys 415 Asn Tyr
Asp Ile Ala 420 Pro Gin Val Gly 425 His Lys Phe Cys Lys Asp 430 Ile Pro Gly
Phe Ile 435 Pro Ser Leu Leu Gly 440 His Leu Leu Glu Glu 445 Arg Gin Lys Ile
450 Lys Thr Lys Met 455 Lys Glu Thr Gin Asp Pro Ile 460 Glu Lys Ile Leu Leu
465 Asp Tyr Arg Gin 470 Lys Ala Ile Lys Leu Leu 475 Ala Asn Ser Phe Tyr 480 Gly
Tyr Tyr Gly Tyr 485 Ala Lys Ala 490 Arg Trp Tyr Cys Lys Glu Cys 495 Ala Glu
Ser Val Thr 500 Ala Trp Gly Arg 505 Lys Tyr Ile Glu Leu Val 510 Trp Lys Glu
Leu Glu 515 Glu Lys Phe Gly Phe 520 Lys Val Leu Tyr Ile 525 Asp Thr Asp Gly
530 Leu Tyr Ala Thr 535 Ile Pro Gly Gly Glu Ser Glu 540 Glu Ile Lys Lys Lys
545 Ala Leu Glu Phe 550 Val Lys Tyr Ile Asn Ser 555 Lys Leu Pro Gly Leu 560 Leu
Glu Leu Glu Tyr 565 Glu Gly Phe 570 Tyr Lys Arg Gly Phe Phe Val 575 Thr Lys
Lys Arg Tyr 580 Ala Val Ile Asp 585 Glu Glu Gly Lys Val Ile 590 Thr Arg Gly
Leu Glu 595 Ile val Arg Arg Asp 600 Trp Ser Glu Ile Ala 605 Lys Glu Thr Gin
610 Ala Arg Val Leu 615 Glu Thr Ile Leu Lys His Gly 620 Asp Val Glu Glu Ala
625 Val Arg Ile Val 630 Lys Glu Val Ile Gin Lys 635 Leu Ala Asn Tyr Glu 640 Ile
Pro Pro Glu Lys 645 Leu Ala Ile 650 Tyr Glu Gin Ile Thr Arg Pro 655 Leu His
Glu Tyr Lys 660 Ala Ile Gly Pro 665 His Val Ala Val Ala Lys 670 Lys Leu Ala
Ala Lys 675 Gly Val Lys Ile Lys 680 Pro Gly Met Val Ile 685 Gly Tyr Ile Val
690 Leu Arg Gly Asp 695 Gly Pro Ile Ser Asn Arg Ala 70Θ Ile Leu Ala Glu Glu
705 Tyr Asp Pro Lys 710 Lys His Lys Tyr Asp Ala 715 Glu Tyr Tyr Ile Glu 720 Asn
Gin Val Leu Pro 725 Ala Val Leu 730 Arg Ile Leu Glu Gly Phe Gly 735 Tyr Arg
Lys Glu Asp 740 Leu Arg Tyr Gin 745 Lys Thr Arg Gin Val Gly 750 Leu Thr Ser
Trp Leu 770 755 Asn Ile Lys Lys Ser 775 760 765
<210> 3
PL 241 698 Β1
IBiMM _seq_P.436784 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220>
<223> Linker <400> 3
Gly Ser Gly Gly Val Asp 1 5 <210> 4 <211> 242 <212> PRT <213> Bacteria <prokaryote>
<400> 4
Asp Glu Glu 1
Arg Glu Glu
Asn Leu Ile
Gly Val Leu 50
Glu Ser Trp 65
Gly Leu ile
Asp Glu Thr
Leu Pro Glu
115
Lys Lys Thr 130
Glu Ser Asp 145
Cys Ile Val
Ser Lys Ala
Phe Asn Asp 195
Lys Leu Lys 21Θ
Lys Val Glu 225 Ala Asp
Glu Leu ile Gin Leu Ile Ile 10
5
Ile 20 Glu Lys Met Val Glu 25 Glu
Ser Arg Arg Gly Ala 40 Leu Leu
Tyr Lys Asn Thr 55 Pro Lys Glu
Glu Tyr Val 70 Lys Val Lys Gly
Ser Tyr Ser 85 Lys Gly Lys Phe 90
Gly 100 Thr Ile Lys Ala Ile 105 Ile
Asn Thr Val Ile Glu 120 Ala Ile
Gly Asn Leu Glu 135 Leu His Ile
Leu Glu Ile 150 Lys Pro Gin Lys
Lys Tyr Pro 165 Lys Lys Gin Thr 170
Ile 180 Leu Thr Ser Leu ASp 185 Arg
Phe Asp Trp Glu Ile 200 Gly His
Lys Asn Ile Lys 215 Thr Gly Lys
Glu Ala Thr 230 Leu Lys Asp Leu
Glu Lys Thr Gly Lys 15 Ser
Lys Ile Lys Ala 30 Phe Asn
Leu Val Ala 45 Lys Lys Leu
Lys Lys 60 Ile Gly Glu Leu
Lys 75 Ile Leu Lys Ser Phe 80
Gin Pro Ile Ile Leu 95 Gly
Trp Asn Thr Asp 110 Lys Glu
Gly Lys Thr 125 Lys Ile Asn
Asp Ser 140 Tyr Lys Ile Leu
Gin 155 Glu Phe Val Gly Ile 160
Gin Lys Gly Thr Ile 175 Val
Glu Leu Pro Val 190 Val Tyr
Ile Tyr Lys 205 Val Tyr Gly
Ile Glu 220 Phe Phe Ala Asp
Lys 235 Ala Phe Lys Gly Glu 240
PL 241 698 Β1
IBiMM _seq_P.436784 <210> 5 <211> 8371 < 212> DNA < 213> Artificial Sequence <220>
< 223> Recombinant plasmide pET30 EKLIC < 400> 5 tggcgaatgg gacgcgccct gtagcggcgc attaagcgcg gcgggtgtgg tggttacgcg60 cagcgtgacc gctacacttg ccagcgccct agcgcccgct cctttcgctt tcttcccttc120 ctttctcgcc acgttcgccg gctttccccg tcaagctcta aatcgggggc tccctttagg180 gttccgattt agtgctttac ggcacctcga ccccaaaaaa cttgattagg gtgatggttc240 acgtagtggg ccatcgccct gatagacggt ttttcgccct ttgacgttgg agtccacgtt300 ctttaatagt ggactcttgt tccaaactgg aacaacactc aaccctatct cggtctattc360 ttttgattta taagggattt tgccgatttc ggcctattgg ttaaaaaatg agctgattta420 acaaaaattt aacgcgaatt ttaacaaaat attaacgttt acaatttcag gtggcacttt480 tcggggaaat gtgcgcggaa cccctatttg tttatttttc taaatacatt caaatatgta540 tccgctcatg aattaattct tagaaaaact catcgagcat caaatgaaac tgcaatttat600 tcatatcagg attatcaata ccatattttt gaaaaagccg tttctgtaat gaaggagaaa660 actcaccgag gcagttccat aggatggcaa gatcctggta tcggtctgcg attccgactc720 gtccaacatc aatacaacct attaatttcc cctcgtcaaa aataaggtta tcaagtgaga780 aatcaccatg agtgacgact gaatccggtg agaatggcaa aagtttatgc atttctttcc840 agacttgttc aacaggccag ccattacgct cgtcatcaaa atcactcgca tcaaccaaac900 cgttattcat tcgtgattgc gcctgagcga gacgaaatac gcgatcgctg ttaaaaggac960 aattacaaac aggaatcgaa tgcaaccggc gcaggaacac tgccagcgca tcaacaatat1020 tttcacctga atcaggatat tcttctaata cctggaatgc tgttttcccg gggatcgcag1080 tggtgagtaa ccatgcatca tcaggagtac ggataaaatg cttgatggtc ggaagaggca1140 taaattccgt cagccagttt agtctgacca tctcatctgt aacatcattg gcaacgctac1200 ctttgccatg tttcagaaac aactctggcg catcgggctt cccatacaat cgatagattg1260
PL 241 698 Β1
IBiMM _seq_P.436784 tcgcacctga ttgcccgaca ttatcgcgag cccatttata cccatataaa tcagcatcca 1320 tgttggaatt taatcgcggc ctagagcaag acgtttcccg ttgaatatgg ctcataacac 1380 cccttgtatt actgtttatg taagcagaca gttttattgt tcatgaccaa aatcccttaa 1440 cgtgagtttt cgttccactg agcgtcagac cccgtagaaa agatcaaagg atcttcttga 1500 gatccttttt ttctgcgcgt aatctgctgc ttgcaaacaa aaaaaccacc gctaccagcg 1560 gtggtttgtt tgccggatca agagctacca actctttttc cgaaggtaac tggcttcagc 1620 agagcgcaga taccaaatac tgtccttcta gtgtagccgt agttaggcca ccacttcaag 1680 aactctgtag caccgcctac atacctcgct ctgctaatcc tgttaccagt ggctgctgcc 1740 agtggcgata agtcgtgtct taccgggttg gactcaagac gatagttacc ggataaggcg 1800 cagcggtcgg gctgaacggg gggttcgtgc acacagccca gcttggagcg aacgacctac 1860 accgaactga gatacctaca gcgtgagcta tgagaaagcg ccacgcttcc cgaagggaga 1920 aaggcggaca ggtatccggt aagcggcagg gtcggaacag gagagcgcac gagggagctt 1980 ccagggggaa acgcctggta tctttatagt cctgtcgggt ttcgccacct ctgacttgag 2040 cgtcgatttt tgtgatgctc gtcagggggg cggagcctat ggaaaaacgc cagcaacgcg 2100 gcctttttac ggttcctggc cttttgctgg ccttttgctc acatgttctt tcctgcgtta 2160 tcccctgatt ctgtggataa ccgtattacc gcctttgagt gagctgatac cgctcgccgc 2220 agccgaacga ccgagcgcag cgagtcagtg agcgaggaag cggaagagcg cctgatgcgg 2280 tattttctcc ttacgcatct gtgcggtatt tcacaccgca tatatggtgc actctcagta 2340 caatctgctc tgatgccgca tagttaagcc agtatacact ccgctatcgc tacgtgactg 2400 ggtcatggct gcgccccgac acccgccaac acccgctgac gcgccctgac gggcttgtct 2460 gctcccggca tccgcttaca gacaagctgt gaccgtctcc gggagctgca tgtgtcagag 2520 gttttcaccg tcatcaccga aacgcgcgag gcagctgcgg taaagctcat cagcgtggtc 2580 gtgaagcgat tcacagatgt ctgcctgttc atccgcgtcc agctcgttga gtttctccag 2640 aagcgttaat gtctggcttc tgataaagcg ggccatgtta agggcggttt tttcctgttt 2700 ggtcactgat gcctccgtgt aagggggatt tctgttcatg ggggtaatga taccgatgaa 2760 acgagagagg atgctcacga tacgggttac tgatgatgaa catgcccggt tactggaacg 2820
PL 241 698 Β1
IBiMM _seq_P.436784
ttgtgagggt aaacaactgg cggtatggat gcggcgggac cagagaaaaa tcactcaggg 2880
tcaatgccag cgcttcgtta atacagatgt aggtgttcca cagggtagcc agcagcatcc 2940
tgcgatgcag atccggaaca taatggtgca gggcgctgac ttccgcgttt ccagacttta 3000
cgaaacacgg aaaccgaaga ccattcatgt tgttgctcag gtcgcagacg ttttgcagca 3060
gcagtcgctt cacgttcgct cgcgtatcgg tgattcattc tgctaaccag taaggcaacc 3120
ccgccagcct agccgggtcc tcaacgacag gagcacgatc atgcgcaccc gtggggccgc 3180
catgccggcg ataatggcct gcttctcgcc gaaacgtttg gtggcgggac cagtgacgaa 3240
ggcttgagcg agggcgtgca agattccgaa taccgcaagc gacaggccga tcatcgtcgc 3300
gctccagcga aagcggtcct cgccgaaaat gacccagagc gctgccggca cctgtcctac 3360
gagttgcatg ataaagaaga cagtcataag tgcggcgacg atagtcatgc cccgcgccca 3420
ccggaaggag ctgactgggt tgaaggctct caagggcatc ggtcgagatc ccggtgccta 3480
atgagtgagc taacttacat taattgcgtt gcgctcactg cccgctttcc agtcgggaaa 3540
cctgtcgtgc cagctgcatt aatgaatcgg ccaacgcgcg gggagaggcg gtttgcgtat 3600
tgggcgccag ggtggttttt cttttcacca gtgagacggg caacagctga ttgcccttca 3660
ccgcctggcc ctgagagagt tgcagcaagc ggtccacgct ggtttgcccc agcaggcgaa 3720
aatcctgttt gatggtggtt aacggcggga tataacatga gctgtcttcg gtatcgtcgt 3780
atcccactac cgagatgtcc gcaccaacgc gcagcccgga ctcggtaatg gcgcgcattg 3840
cgcccagcgc catctgatcg ttggcaacca gcatcgcagt gggaacgatg ccctcattca 3900
gcatttgcat ggtttgttga aaaccggaca tggcactcca gtcgccttcc cgttccgcta 3960
tcggctgaat ttgattgcga gtgagatatt tatgccagcc agccagacgc agacgcgccg 4020
agacagaact taatgggccc gctaacagcg cgatttgctg gtgacccaat gcgaccagat 4080
gctccacgcc cagtcgcgta ccgtcttcat gggagaaaat aatactgttg atgggtgtct 4140
ggtcagagac atcaagaaat aacgccggaa cattagtgca ggcagcttcc acagcaatgg 4200
catcctggtc atccagcgga tagttaatga tcagcccact gacgcgttgc gcgagaagat 4260
tgtgcaccgc cgctttacag gcttcgacgc cgcttcgttc taccatcgac accaccacgc 4320
tggcacccag ttgatcggcg cgagatttaa tcgccgcgac aatttgcgac ggcgcgtgca 4380
PL 241 698 Β1
IBiMM _seq_P.436784 gggccagact ggaggtggca acgccaatca gcaacgactg tttgcccgcc agttgttgtg 4440 ccacgcggtt gggaatgtaa ttcagctccg ccatcgccgc ttccactttt tcccgcgttt 4500 tcgcagaaac gtggctggcc tggttcacca cgcgggaaac ggtctgataa gagacaccgg 4560 catactctgc gacatcgtat aacgttactg gtttcacatt caccaccctg aattgactct 4620 cttccgggcg ctatcatgcc ataccgcgaa aggttttgcg ccattcgatg gtgtccggga 4680 tctcgacgct ctcccttatg cgactcctgc attaggaagc agcccagtag taggttgagg 4740 ccgttgagca ccgccgccgc aaggaatggt gcatgcaagg agatggcgcc caacagtccc 4800 ccggccacgg ggcctgccac catacccacg ccgaaacaag cgctcatgag cccgaagtgg 4860 cgagcccgat cttccccatc ggtgatgtcg gcgatatagg cgccagcaac cgcacctgtg 4920 gcgccggtga tgccggccac gatgcgtccg gcgtagagga tcgagatcga tctcgatccc 4980 gcgaaattaa tacgactcac tataggggaa ttgtgagcgg ataacaattc ccctctagaa 5040 ataattttgt ttaactttaa gaaggagata tacatatgat tttagatgtg gattacataa 5100 ctgaagaagg aaaacctgtt attaggctat tcaaaaaaga gaacggaaaa tttaagatag 5160 agcatgatag aacttttaga ccatacattt acgctcttct cagggatgat tcaaagattg 5220 aagaagttaa gaaaataacg ggggaaaggc atggaaagat tgtgagaatt gttgatgtag 5280 agaaggttga gaaaaagttt ctcggcaagc ctattaccgt gtggaaactt tatttggaac 5340 atccccaaga tgttcccact attagagaaa aagttagaga acatccagca gttgtggaca 54Θ0 tcttcgaata cgatattcca tttgcaaaga gatacctcat cgacaaaggc ctaataccaa 5460 tggaggggga agaagagcta aagattcttg ccttcgatat agaaaccctc tatcacgaag 5520 gagaagagtt tggaaaaggc ccaattataa tgattagtta tgcagatgaa aatgaagcaa 5580 aggtgattac ttggaaaaac atagatcttc catacgttga ggttgtatca agcgagagag 5640 agatgataaa gagatttctc aggattatca gggagaagga tcctgacatt atagttactt 5700 ataatggaga ctcattcgac ttcccatatt tagcgaaaag ggcagaaaaa cttgggatta 5760 aattaaccat tggaagagat ggaagcgagc ccaagatgca gagaataggc gatatgacgg 5820 ctgtagaagt caagggaaga atacatttcg acttgtatca tgtaataaca aggacaataa 5880 atctcccaac atacacacta gaggctgtat atgaagcaat ttttggaaag ccaaaggaga 5940
PL 241 698 Β1
IBiMM _seq_P.436784 aggtatacgc cgacgagata gcaaaagcct gggaaagtgg agagaacctt gagagagttg 6000 ccaaatactc gatggaagat gcaaaggcaa cttatgaact cgggaaagaa ttccttccaa 6060 tggaaattca gctttcaaga ttagttggac aacctttatg ggatgtttca aggtcaagca 6120 cagggaacct tgtagagtgg ttcttactta ggaaagccta cgaaagaaac gaagtagctc 6180 caaacaagcc aagtgaagag gagtatcaaa gaaggctcag ggagagctac acaggtggat 6240 tcgttaaaga gccagaaaag gggttgtggg aaaacatagt atacctagat tttagagccc 6300 tatatccctc gattataatt acccacaatg tttctcccga tactctaaat cttgagggat 6360 gcaagaacta tgatatcgct cctcaagtag gccacaagtt ctgcaaggac atccctggtt 6420 ttataccaag tctcttggga catttgttag aggaaagaca aaagattaag acaaaaatga 6480 aggaaactca agatcctata gaaaaaatac tccttgacta tagacaaaaa gcgataaaac 6540 tcttagcaaa ttctttctac ggatattatg gctatgcaaa agcaagatgg tactgtaagg 6600 agtgtgctga gagcgttact gcctggggaa gaaagtacat cgagttagta tggaaggagc 6660 tcgaagaaaa gtttggattt aaagtcctct acattgacac tgatggtctc tatgcaacta 6720 tcccaggagg agaaagtgag gaaataaaga aaaaggctct agaatttgta aaatacataa 6780 attcaaagct ccctggactg ctagagcttg aatatgaagg gttttataag aggggattct 6840 tcgttacgaa gaagaggtat gcagtaatag atgaagaagg aaaagtcatt actcgtggtt 6900 tagagatagt taggagagat tggagtgaaa ttgcaaaaga aactcaagct agagttttgg 6960 agacaatact aaaacacgga gatgttgaag aagctgtgag aatagtaaaa gaagtaatac 7020 aaaagcttgc caattatgaa attccaccag agaagctcgc aatatatgag cagataacaa 7080 gaccattaca tgagtataag gcgataggtc ctcacgtagc tgttgcaaag aaactagctg 7140 ctaaaggagt taaaataaag ccaggaatgg taattggata catagtactt agaggcgatg 7200 gtccaattag caatagggca attctagctg aggaatacga tcccaaaaag cacaagtatg 7260 acgcagaata ttacattgag aaccaggttc ttccagcggt acttaggata ttggagggat 7320 ttggatacag aaaggaagac ctcagatacc aaaagacaag acaagtcggc ctaacttcct 7380 ggcttaacat taaaaaatcc ggaagcggag gggtcgacga tgaagaggaa ctaatacaac 7440 taataataga aaaaactggc aaatctcgag aggaaataga aaaaatggtg gaagaaaaaa 7500
PL 241 698 Β1
IBiMM _seq_P.436784
ttaaagcttt taacaattta atatctcgta ggggggcttt actattagta gcaaaaaaac 7560
ttggtgtttt gtataaaaac actccgaaag agaaaaaaat tggcgaatta gaaagctggg 7620
aatatgtaaa agtaaagggc aaaattctca aatcttttgg attaattagt tattcgaaag 7680
ggaaattcca acctattatt ttaggagacg aaaccggtac tattaaagct attatttgga 7740
ataccgataa agaattacct gaaaacactg taatagaagc tattgggaaa accaaaatta 7800
ataagaaaac tggcaattta gaattacata tagacagtta taaaatttta gaaagcgatt 7860
tagagataaa accccaaaag caagaatttg ttgggatttg catagttaaa tatccaaaaa 7920
aacaaaccca aaaaggcaca atagtatcga aagcaatttt aactagctta gatagggaat 7980
tgcctgtagt atatttcaac gattttgatt gggaaatagg ccatatatat aaagtatatg 8040
gaaagcttaa gaaaaacata aaaactggta aaatagaatt tttcgctgac aaagttgagg 8100
aagcaacatt aaaagatcta aaagctttta aaggagaggc cgattgacac caccaccacc 8160
accactaggg atccgaattc gagctccgtc gacaagcttg cggccgcact cgagcaccac 8220
caccaccacc actgagatcc ggctgctaac aaagcccgaa aggaagctga gttggctgct 8280
gccaccgctg agcaataact agcataaccc cttggggcct ctaaacgggt cttgaggggt 8340
tttttgctga aaggaggaac tatatccgga t 8371
<210> 6 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220>
<223> donic primer <400> 6 aactttaaga aggagatata catatgattt tagatgtgga ttacataact gaagaag 57 <21B> 7 <211> 49 < 212> DNA < 213> Artificial Sequence <220>
< 223> donic primer
PL 241 698 Β1
IBiMM _seq_P.436784 <400> 7 tcgtcgaccc ctccgcttcc ggatttttta atgttaagcc aggaagtta 49 <210> 8 <211> 51 < 212> DNA < 213> Artificial Sequence <220>
< 223> donic primer <400> 8 ccggaagcgg aggggtcgac gatgaagagg aactaataca actaataata g 51 <210> 9 <211> 78 < 212> DNA < 213> Artificial Sequence <220>
< 223> donic primer < 400> 9 gcaagcttgt cgacggagct cgaattcgga tccttagtgg tggtggtggt ggtgtcaatc 60 ggcctctcct ttaaaagc 78

Claims (8)

  1. Zastrzeżenia patentowe
    1. Polimeraza Pwo-NeqSSB o SEQ. ID 1.
  2. 2. Sposób klonowania polimerazy Pwo-NeqSSB o SEQ.ID 1, znamienny tym, że otrzymuje się DNA insertu przeznaczonego do klonowania, które polega na przeprowadzeniu dwóch niezależnych reakcji PCR:
    - w pierwszej reakcji amplifikacji otrzymuje się produkt o sekwencji nukleotydowej odpowiadającej sekwencji genu kodującego polimerazę DNA Pwo z dodatkową sekwencją łącznika oraz komplementarną do 11 początkowych nukleotydów białka NeqSSB na C-końcu;
    - drugi produkt zawiera sekwencję nukleotydową genu kodującego białko NeqSSB wiążącego DNA z dodatkowymi nukleotydami charakterystycznymi dla łącznika oraz 11 dodatkowymi nukleotydami komplementarnymi do końcowej sekwencji nukleotydowej polimerazy Pwo na N-końcu;
    - matrycę do reakcji PCR stanowi wyizolowane genom owe DNA,
    - otrzymane produkty w dwóch powyższych reakcjach rozdziela się w żelu agarozowym z bromkiem etydyny i poddaje się izolacji z żelu.
  3. 3. Sposób według zastrz.2, znamienny tym, że produkty dwóch reakcji PCR służą, jako inserty w reakcji Gibsona, gdzie:
    - Trawienie plazmidu pET30EKLIC
    PL 241 698 B1
    - w celu zlinearyzowania plazmidu pET30EKLIC poddaje się go trawieniu enzymem BamHI i Ndel (NEB), które tną w dwóch miejscach zostawiając niekomplementarne do siebie końce DNA,
    - reakcję trawienia DNA wektora prowadzi się przez 2 h w temperaturze 37°C z dodatkiem odpowiedniego buforu,
    - potrawiony plazmid poddaje się rozdziałowi elektroforetycznemu i izoluje się;
    - Reakcja składania genów
    - reakcja Gibsona prowadzi się w termocyklerze w 50°C przez 60 min, gdzie mieszanina zawiera bufor, nukleotydy, enzymy, wodę jałową, insert I, Insert II, wektor,
    - po reakcji mieszanina dodaje się do świeżo przygotowanych komórek kompetentnych E. coli TOP10,
    - otrzymaną mieszaninę inkubuje się w lodzie przez 40 min, po tym czasie inkubacji przeprowadza się szok termiczny polegający na umieszczeniu mieszaniny komórek na 60 s w termobloku o temperaturze 42°C, a następnie 2 min inkubacji w lodzie, po szoku termicznym komórki poddaje się 60 min inkubacji w 37°C z dodatkiem 600 ml LB, po tym czasie komórki wiruje się (10 min, 1800 obr./min), odrzucono 500 ml przesączu, osad zawieszono w pozostałej ilości supernatantu i wysiano na płytki z podłożem LA z dodatkiem kanamycyny, płytki inkubowano przez ok. 16 h w 37°C.
  4. 4. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że w celu uzyskania białka fuzyjnego Pwo-NeqSSB, komórki E. coli BL RIL poddaje się transformacji z użyciem DNA plazmidu rekombinantowego pET30-Pwo-NeqSSB i przeprowadza się produkcję pożądanych białek fuzyjnych, hodowle z dodatkiem kanamycyny i chloramfenikolu prowadzi się przez 16 h w 37°C, odmłodzono i po osiągnięciu przez hodowle OD600 = 0,5 dodaje się IPTG do końcowego stężenia 0,1 mM; po indukcji hodowle prowadzi się jeszcze przez 5h, po czym wiruje się (10 min, 5000 obr./min) i poddaje się oczyszczaniu metodą metalopowinowactwa; rezultaty produkcji białek analizuje się za pomocą białkowej elektroforezy poliakrylamidowej w warunkach denaturujących.
  5. 5. Wyizolowany plazmid rekombinantowy, znamienny tym, że obejmuje fragment nukleotydowej sekwencji białka kodujące polimerazę Pwo-NeqSSB od 5076 do 8168 z plazmidu pET30EKLIC o SEQ.ID.5.
  6. 6. Wyizolowany plazmid pET30-Pwo-NeqSSB o sekwencji SEQ.ID.5.
  7. 7. Startery do klonowania polimerazy Pwo-NeqSSB o sekwencjach SEQ.ID.6-9.
  8. 8. Polimeraza Pwo-NeqSSB o SEQ.ID do zastosowania do powielania specyficznych sekwencji wirusa SARS CoV-2.
PL436784A 2021-01-27 2021-01-27 Polimeraza Pwo-NeqSSB, sposób jej otrzymywania, plazmid rekombinantowy, startery oraz zastosowanie polimerazy PL241698B1 (pl)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PL436784A PL241698B1 (pl) 2021-01-27 2021-01-27 Polimeraza Pwo-NeqSSB, sposób jej otrzymywania, plazmid rekombinantowy, startery oraz zastosowanie polimerazy
EP22153626.1A EP4036237A1 (en) 2021-01-27 2022-01-27 Pwo-neqssb polymerase, method of its preparation, recombinant plasmid, primers and the use of polymerase

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PL436784A PL241698B1 (pl) 2021-01-27 2021-01-27 Polimeraza Pwo-NeqSSB, sposób jej otrzymywania, plazmid rekombinantowy, startery oraz zastosowanie polimerazy

Publications (2)

Publication Number Publication Date
PL436784A1 PL436784A1 (pl) 2022-08-01
PL241698B1 true PL241698B1 (pl) 2022-11-21

Family

ID=80445772

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL436784A PL241698B1 (pl) 2021-01-27 2021-01-27 Polimeraza Pwo-NeqSSB, sposób jej otrzymywania, plazmid rekombinantowy, startery oraz zastosowanie polimerazy

Country Status (2)

Country Link
EP (1) EP4036237A1 (pl)
PL (1) PL241698B1 (pl)

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6627424B1 (en) * 2000-05-26 2003-09-30 Mj Bioworks, Inc. Nucleic acid modifying enzymes
PL426093A1 (pl) * 2018-06-27 2020-01-02 Instytut Biotechnologii I Medycyny Molekularnej Fuzyjna polimeraza kwasu jednołańcuchowego DNA Bst, cząsteczka kwasu nukleinowego kodująca fuzyjną polimerazę DNA NeqSSB-Bst, sposób jej otrzymywania oraz zastosowanie
CN111549177A (zh) * 2020-04-27 2020-08-18 广州再生医学与健康广东省实验室 用于检测SARS-CoV-2的gRNA及试剂盒
PL241065B1 (pl) * 2020-06-26 2022-08-01 Geneme Spolka Z Ograniczona Odpowiedzialnoscia Zastosowanie fuzyjnej polimerazy DNA Bst-Nec do izotermalnego powielania specyficznych sekwencji wirusa SARS CoV-2

Also Published As

Publication number Publication date
PL436784A1 (pl) 2022-08-01
EP4036237A1 (en) 2022-08-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN111454978B (zh) 用于特异性吸附重金属铅的表面展示工程菌及构建方法和应用
CN111139194B (zh) 重组酵母、构建方法和其在制备酪醇及衍生物中的应用
CN111850007B (zh) 一种适用于低钙离子浓度的纤维小体对接蛋白组合突变体36864及应用
CN114774452B (zh) 一种用于吸附溶液汞离子的工程大肠杆菌构建方法及应用
CN113322243B (zh) 蛋白质ugt236及其编码基因与应用
CN111848758B (zh) 一种适用于低钙离子浓度的纤维小体对接蛋白突变体及应用
CN113337491B (zh) 一种提高角蛋白酶耐高温稳定性的结构域及其应用
CN114591985B (zh) 一种突变果胶裂解酶及应用
PL243940B1 (pl) Polimeraza Taq-NeqSSB, sposób jej otrzymywania, plazmid rekombinantowy, startery oraz zastosowanie polimerazy
CN113151214B (zh) 一种具有脂肪酶活性的蛋白PnlipA及其基因和应用
CN112481282B (zh) 一种特异性识别黄原胶侧链的碳水化合物结合模块cbm6b蛋白质及应用
PL241698B1 (pl) Polimeraza Pwo-NeqSSB, sposób jej otrzymywania, plazmid rekombinantowy, startery oraz zastosowanie polimerazy
CN111848757B (zh) 一种适用于低钙离子浓度的纤维小体对接蛋白组合突变体36862及应用
CN111850005B (zh) 一种适用于低钙离子浓度的纤维小体对接蛋白组合突变体36863及应用
CN115216485A (zh) 耐阿米卡星的重组质粒pET28a(+)-rmtB及其应用
CN113767169A (zh) 用于制备羟基化烃的基于氨基酸被丙氨酸取代的修饰的单加氧酶
CN113755460B (zh) 一种用于制备二氢槲皮素的黄酮还原酶
KR20060098528A (ko) 대장균 발현 시스템을 이용한 인간 단백질 타이로신 탈인산화 효소의 발현 및 정제방법
CN111850006B (zh) 一种适用于低钙离子浓度的纤维小体对接蛋白组合突变体36865及应用
CN115058405B (zh) 一种基于Tyr285改造提高酯酶DcaE4活性的方法及应用
CN113122561B (zh) 膜蛋白SohB的表达载体及其表达纯化方法
CN113122558B (zh) 膜蛋白AmpG的表达载体及其表达纯化方法
CN111848759B (zh) 一种活性提高的纤维小体对接蛋白突变体36741及应用
PL220977B1 (pl) Startery oligonukleotydowe do reakcji amplifikacji DNA kodującego białko syntazy trehalozy Deinococcus geothermalis DSMZ 11300, sekwencja DNA wraz z miejscami rozpoznania dla enzymów restrykcyjnych NdeI i XhoI, wektor ekspresyjny i sposób jego otrzymywania, rekombinantowy szczep Escherichia coli BL21 (DE3) pLysS i jego sposób otrzymywania oraz sposób wytwarzania białka rekombinantowego z metką oligohistydynową syntazy trehalozy (ST) Deinococcus geothermalis DSMZ 1130
CN113122562A (zh) 膜蛋白YddG的表达载体及其表达纯化方法