PL243661B1 - Sposób otrzymywania suchego ekstraktu z melisy - Google Patents

Abstract

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania suchego ekstraktu z liścia melisy charakteryzujący się tym, że obejmuje następujące etapy: a) dwustopniową ekstrakcję wodną stosując wodę w ilości od 6 do 10 razy więcej w porównaniu do ilości rośliny; b) filtrację wstępną i mikrofiltrację; c) ultrafiltrację; d) nanofiltrację permeatu z procesu ultrafiltracji; e) diafiltrację retentatu na membranie nanoflitracyjnej, f) suszenie próżniowe lub rozpyłowe.

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywania suchego ekstraktu z melisy, o standaryzowanej zawartości kwasu rozmarynowego oraz związków polifenolowych.

Melisa (Melissa officinalis) pochodzi z rejonu Morza Śródziemnego, w Polsce jest uprawiana na plantacjach. Liść melisy (Melissae folium) jest znanym surowcem farmaceutycznym, posiadającym monografie w Farmakopei Polskiej i Europejskiej, Europejskiej Agencji Leków (EMA), ESCOP oraz WHO. O jego aktywności farmakologicznej decyduje obecność olejku eterycznego i związków polifenolowych, głównie kwasu rozmarynowego. Zawartość olejku (0,05 - 0,3%) zależy od klimatu i pochodzenia surowca. Olejek melisowy zawiera związki terpenowe: cytral A (geranial), cytral B (neral), cytronelal, aldehydy terpenowe, seskwiterpeny, którym zawdzięcza charakterystyczny cytrynowy aromat. Wśród substancji polifenolowych najważniejsze bioaktywne związki to garbniki (do 5%), fenolokwasy (4%): kwas rozmarynowy, kawowy, chlorogenowy, ferulowy oraz flawonoidy.

Melisa jest polecana jako środek na uspokojenie, ułatwiający zasypianie. Jest stosowana w stanach pobudzenia nerwowego, niepokoju, bezsenności i wyczerpaniu intensywną pracą umysłową. Melisę wykorzystuje się też w zaburzeniach pracy przewodu pokarmowego, jako środek przeciwskurczowy, żółciopędny i wiatropędny. W leczeniu geriatrycznym, sprawdza się u osób cierpiących na zaburzenia emocjonalne, neurastenie, przy uczuciu niepokoju i zagrożenia, nerwicy wegetatywnej, problemach z zasypianiem. Raporty z badań klinicznych sugerują, że dieta bogata w zioła (melisa, szałwia, rozmaryn) może pomagać pacjentom z Alzheimerem.

Liczne badania potwierdzają interesującą aktywność biologiczną związków polifenolowych z liści melisy. Olejek z melisy oraz ekstrakt wodny wykazują działanie przeciwbakteryjne, przeciwwirusowe i przeciwgrzybiczne. Wg. badań niemieckich olejek działał skutecznie przeciwko wirusom opryszczki nawet w tak małych stężeniach jak 0.0004% (HSV-1) i 0.00008% (HSV-2). Wirus pozostaje w komórkach nerwowych, ale przy stresie i obniżeniu odporności, ponownie atakuje organizm. Aktywnym składnikiem ekstraktów przeciwko HSV-1 jest kwas rozmarynowy. Preparaty zawierające wyciągi z melisy lekarskiej zawierającej kwas rozmarynowy są stosowane w leczeniu opryszczki. (Fecka I. i inni, Kwas rozmarynowy, ważny składnik terapeutyczny niektórych surowców roślinnych. Postępy fitoterapii 8, 2001).

Kwas rozmarynowy jest przedmiotem zainteresowania naukowców, z uwagi na jego właściwości przeciwutleniające, przeciwzapalne oraz przeciwdrobnoustrojowe. Jest silnym antyoksydantem, ma działanie przeciwzapalne i przeciwdrobnoustrojowe (Petersen M, Simmonds MSJ. Rosmarinic acid. Phytochemistry 62:121-125, 2003). Kwas rozmarynowy jest inhibitorem enzymów (np. hialuronidazy) uczestniczących w rozkładzie kwasu hialuronowego. Kwas hialuronowy wiąże wodę w naskórku i jest składnikiem macierzy międzykomórkowej skóry właściwej. W młodej skórze jest wystarczająco dużo kwasu hialuronowego aby gwarantować jej sprężystość. Z wiekiem jednak ilość kwasu maleje, co skutkuje starzeniem skóry i powstawaniem zmarszczek. Pokazano również, że ekstrakty bogate w kwas rozmarynowy działają fotoprotekcyjnie, zmiatając wolne rodniki powstające pod wpływe m UV oraz wzmacniając system obronny organizmu poprzez wpływ na aktywność tyrozynazy i stymulowanie produkcji melaniny. Ekstrakt podany doustnie, istotnie zmniejszał zmiany w skórze poddanej działaniu UV, działał też anty mutagennie (fotokarcynogeneza) (Sanchez-Campillo M, Gabaldon JA, Castillo J, i inni. Rosmarinic acid, a photo-protective agent against UV and other ionizing radiations. Food Chem Toxicol. 2009; 47(2):386-92.).

Podstawową metodą otrzymywania ekstraktów z melisy jest ekstrakcja przy użyciu wody lub roztworów etanolowo-wodnych. Z roztworów odparowuje się rozpuszczalnik, a następnie suszy.

Ekstrakty z melisy można uzyskiwać również metodą ekstrakcji dwutlenkiem węgla w stanie nadkrytycznym (Bogdanovica A, Tadicb V, Arsicc I, Milovanovica S, Petrovica S, Skalaa D, Supercritical and high pressure subcriticalfluid extraction from Lemon balm (Melissa ojficinalis L., Lamiaceae) J. Supercritical Fluids, 107 (2016) 234-242). Ze względu na lipofilowy charakter rozpuszczalnika ekstrakcyjnego, metoda ta nie nadaje się do pozyskiwania związków polifenolowych.

Dokument EP0036087A2 ujawnia sposób izolacji kwasu rozmarynowego z liści melisy polegający na jednokrotnej do trzykrotnej ekstrakcji rozdrobnionej rośliny wodą w temperaturze 80-100°C przez 30 - 60 minut, zakwaszeniu ekstraktu do pH 2 do 2,5 i ekstrakcji roztworu rozpuszczalnikiem organicznym z grupy eterów organicznych, wyższych alkanoli niemieszalnych z wodą lub estrów alifatycznych kwasów karboksylowych. Z uzyskanej fazy organicznej odparowuje się rozpuszczalnik, a następnie miesza z wodą i separuje krystaliczny kwas rozmarynowy poprzez redukcję objętości roztworu i pozostawienie w temperaturze 2 do 8°C.

Ponadto z dokumentu GB2471293A znany jest sposób otrzymywania ekstraktów z surowców roślinnych, w tym liścia melisy, polegający na ekstrakcji wodą w stanie nadkrytycznym w zakresie temperatur 150 - 230°C pod ciśnieniem 15 - 100 bar, a następnie usunięciu wody przez odparowanie i liofilizację lub suszenie rozpyłowe.

Innym sposobem zastosowanie do ekstrakcji roztworu soli. Z dokumentu EP1156995 znany jest sposób ekstrakcji kwasu rozmarynowego w postaci soli z roślin z rodziny Labiatae, który obejmuje kolejno poddanie tkanki roślinnej ekstrakcji pierwszym ekstrahentem wybranym z grupy składającej się z alkalicznych wodnych ekstrahentów (korzystnie wybranych z kationów sodu, litu, potasu, amonu). Po czym następuje oddzielenie fazy wodnej od substancji nierozpuszczalnej, zakwaszenie i usunięcie materiału nierozpuszczalnego w kwasie. Następnie w zależności od potrzeb użytkownika następuje ekstrakcja oddzielonej fazy wodnej za pomocą roztworu wodnego zawierającego etanol albo odparowanie wspomnianej oddzielonej fazy wodnej w celu uzyskania postaci suchej ekstraktu albo poddanie wspomnianej fazy wodnej rozdziałowi chromatograficznemu.

Najbardziej rozpowszechnione są sposoby otrzymywania ekstraktów roślinnych z zastosowaniem rozpuszczalników organicznych. Z dokumentu EP2632559 A1 znany jest sposób ekstrakcji kwasu rozmarynowego z roślin z rodziny Labiatae obejmujący ekstrakcję 40 - 90% roztworem wodnym etanolu. Natomiast z dokumentu EP0920872 A1 znany jest sposób przygotowania całkowitego ekstraktu z liści Rosmarinus officinalis obejmujący następujące etapy: mieszanie wspomnianych liści z uwodnionym roztworem alkoholu etylowego (korzystnie 80 - 95%) z wytworzeniem mieszaniny; macerowanie wspomnianej mieszaniny przez dłuższy czas oraz filtrowanie wspomnianej mieszaniny w celu oddzielenia ekstraktu, tworząc w ten sposób całkowity ekstrakt Rosmarinus officinalis.

Znane są również sposoby wykorzystujące dwu- i wieloetapowe ekstrakcje, w których ekstrakcja wstępna zachodzi przy użyciu wody, a następnie jest prowadzona dalsza ekstrakcja z użyciem rozpuszczalnika organicznego. Np. z dokumentu EP0036087 A2 znany jest sposób izolacji kwasu rozmarynowego z roślin lub części roślin z gatunku Melissa officinalis, w którym ekstrakcję pokruszonych roślin lub części roślin prowadzi się od jednego do trzech przy pomocy wody w ilości 20 - 30 razy więcej w porównaniu do ilości rośliny w temperaturze 80 - 100°C, przez 30 - 60 minut z mieszaniem, zakwaszając ekstrakt do pH 2 - 2,5. Następnie zakwaszone roztwory wodne są ekstrahowane rozpuszczalnikiem organicznym wybranym z grupy obejmującej z etery organiczne, wyższe alkanole nie mieszające się z wodą i estrami - alifatyczne kwasy karboksylowe. Rozpuszczalnik jest oddzielany przez odparowanie, a osad miesza się z wodą w temperaturze 40 - 80°C przez 20 - 40 minut, oczyszczając powstały roztwór i oddzielając krystaliczny kwas rozmarynowy przez zmniejszenie objętości roztworu i przechowywanie roztworu w temperaturze 2 - 8°C. Korzystnie rozpuszczalnikiem organicznym jest eter dietylowy lub eter diizopropylowy.

Podobnie w dokumencie CN105315706 materiał roślinny z rozmarynu ekstrahowano wodą stosując proporcje materiału do wody wynoszące 1:8 - 10. Ekstrakcję prowadzono przez 1,5 - 2 godz. w temperaturze 70 - 75°C. Ekstrakt zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem, stężony roztwór ekstrahowano octanem etylu w celu usunięcia zanieczyszczeń.

Z dokumentu WO03053148 A1 znany jest sposób wytwarzania rozpuszczalnego w wodzie ekstraktu z biomasy roślinnej roślin z rodziny Labiatae (korzystnie melisy). Wspomniany sposób obejmuje (a) kontaktowanie biomasy roślinnej z gorącą wodą z wytworzeniem rozpuszczalnego w wodzie surowego ekstraktu; (b) doprowadzenie pH surowego ekstraktu do wartości między około 1,7 a 3,5 z wytworzeniem zakwaszonego ekstraktu roślinnego; (c) dodanie niemieszającego się z wodą organicznego rozpuszczalnika; (d) ekstrakcję wymienionych związków przeciwutleniających do rozpuszczalnika organicznego; i (e) izolowanie wspomnianego rozpuszczalnika organicznego w celu zapewnienia wspomnianego ulepszonego rozpuszczalnego w wodzie ekstraktu roślinnego. Korzystnie rozpuszczalnik organiczny jest wybrany grupy obejmującej octan etylu, octan n-propylu, octan izopropylu, octan n-butylu, octan sec-butylu, octan t-butylu, eter dietylowy i eter metylo-t-butylowy.

Natomiast z dokumentu EP3277788 A2 znany jest sposób przygotowania rozpuszczalnego w wodzie ekstraktu na bazie biomasy roślinnej z rodziny Melissa officinalis, którego ekstrakt stosuje się jako substytut siarczynu w procesie produkcji wina. Ujawniony sposób obejmuje jeden lub więcej z następujących etapów: a) zbieranie ziół, b) suszenie zioła uzyskanego w etapie a), c) ekstrakcja suszonego zioła uzyskanego w etapie b). Przy czym etap ekstrakcji c) jest dwuetapowy, z czego pierwszy etap obejmuje pierwszy etap ekstrakcji wodą a otrzymana faza wodna działa jako materiał wyjściowy dla drugiego podetapu obejmującego etap ekstrakcji rozpuszczalnikiem organicznym. Przy czym fazę wodną zakwasza się przed drugim etapem ekstrakcji.

Ekstrakty z melisy wytwarzane z zastosowaniem rozpuszczalników organicznych w procesie oczyszczania zawierają ich pozostałości, które stanowią zanieczyszczenie. Z kolei wytwarzanie ekstraktów przy użyciu rozpuszczalników w stanie nadkrytycznym wpływa na znaczne zwiększenie kosztów procesu. Ponadto ekstrakcja dwutlenkiem węgla w stanie nadkrytycznym nie jest procesem odpowiednim dla uzyskania ekstraktu zawierającego kwas rozmarynowy i pozostałe związki polifenolowe.

Celem wynalazku było zapewnienie sposobu ekstrakcji pozbawionego powyższych ograniczeń.

Istotą wynalazku jest sposób wytwarzania suchego ekstraktu z liścia melisy z charakteryzujący się tym, że obejmuje następujące etapy:

a) dwustopniową ekstrakcję wodną stosując wodę w ilości od 6 do 10 razy więcej w porównaniu do ilości rośliny,

b) filtrację wstępną i mikrofiltrację,

c) ultrafiltrację permeatu z procesu mikrofiltracji,

d) nanofiltrację permeatu z procesu ultrafiltracji,

e) diafiltrację retentatu na membranie nanofiltracyjnej,

f) suszenie próżniowe lub rozpyłowe.

Korzystnie ekstrakcję wodną prowadzi się w zakresie temperatur 70 - 100°C, korzystnie 100°C, w czasie 2 godzin dla pierwszego stopnia oraz 1 godziny dla drugiego stopnia ekstrakcji.

Korzystnie filtrację wstępną prowadzi się na płytach celulozowych o porowatości 2 μm, a mikrofiltrację na membranach o porowatości 0,2 - 0,45 μm, korzystnie 0,2 μm.

Korzystnie ultrafiltrację prowadzi się na membranach o MWCO 150 - 300 kDa, korzystnie 300 kDa.

Korzystnie etap nanofiltracji prowadzi się na membranie poliamidowej w temperaturze 25 - 30°C.

Korzystnie membranę stanowi membrana typu Filmtec.

Korzystnie etap diafiltracji prowadzi się na membranie poliamidowej nanofitracyjnej w temperaturze 25 - 30°C.

Wynalazek dostarcza następujących korzyści:

• Pozwala na uzyskanie suchego ekstraktu z melisy zawierającego standaryzowaną zawartość kwasu rozmarynowego i związków polifenolowych oraz charakteryzującego się niską zawartością polisacharydów i białek, a także soli i innych niskocząsteczkowych związków nieorganicznych.

• Proces produkcyjny prowadzony jest w całości w roztworze wodnym, przez co nie wymaga stosowania rozpuszczalników organicznych.

• Wyekstrahowane związki wysokocząsteczkowe, w tym polisacharydy oraz białka są usuwane na etapie ultrafiltracji, co powoduje wzrost stężenia polifenoli oraz kwasu rozmarynowego w ekstrakcie.

• Wyekstrahowane niskocząsteczkowe związki nieorganiczne, w tym sole są usuwane na etapach nanofiltracji oraz diafiltracji na membranie nanofiltracyjnej, co powoduje wzrost stężenia polifenoli oraz kwasu rozmarynowego w ekstrakcie.

• Sposób według wynalazku eliminuje wady ekstraktów uzyskiwanych bez nowoczesnych technik rozdziału, jakimi są techniki membranowe: mikrofiltracja, ultrafiltracja oraz nanofiltracja.

Przedmiot wynalazku obrazują poniższe przykłady wykonania, nie ograniczające zakresu ochrony wyznaczonej zastrzeżeniami patentowymi.

Przykład 1

W tym przykładzie wykonania jako surowiec do ekstrakcji użyto 7,8 kg suszonego, rozdrobnionego liścia melisy. Ekstrakcję prowadzono dwustopniowo za pomocą 70 l wody w pierwszym stopniu ekstrakcji i 52 l wody w drugim stopniu ekstrakcji. Liść melisy ekstrahowano w temperaturze 100°C, pierwszy stopień przez 2 godziny a drugi stopień przez 1 godzinę. Po oddzieleniu od surowca otrzymano łącznie 105 l ekstraktu o zawartości 2,3% suchej masy.

Uzyskany ekstrakt przefiltrowano przez filtr workowy o porowatości 5 μm i następnie za pomocą prasy filtracyjnej wyposażonej w płyty celulozowe o porowatości 2 μm.

Następnie ekstrakt poddano mikrofiltracji prowadzonej na 7-kanałowej membranie z TO2 o długości 600 mm, średnicy 10 mm i porowatości 0,45 μm.

Permeat z mikrofiltracji wykorzystano do kolejnego etapu - ultrafiltracji na 7-kanałowej membranie z TiO2 o długości 600 mm, średnicy 10 mm i MWCO 300 kDa, przy czym celem było usunięcie związków wielkocząsteczkowych, w tym białek oraz polisacharydów.

Do kolejnego etapu wykorzystano permeat z ultrafiltracji w ilości 101 litrów, który podano na poliamidową membranę nanofiltracyjną Filmtec NF 90 o powierzchni 2,6 m² i prowadzono proces nanofiltracji w temperaturze 30°C, przy czym celem było usunięcie niskocząsteczkowych związków nieorganicznych, w tym soli. Przewodność permeatu po procesie nanofiltracji wynosiła 2,67 mS/cm, wskazującą na zawartość soli.

Retentat poddano diafiltracji na tej samej membranie nanofiltracyjnej w temperaturze 30°C, dodając 20 l wody dejonizowanej. Przewodność permeatu po diafiltracji wyniosła 1,91 mS/cm, co wskazuje na zawartość soli. Otrzymano 8,9 kg retentatu końcowego o suchej masie 21,9%.

Po wysuszeniu retentatu w suszami rozpyłowej otrzymano 1,8 kg suchego ekstraktu. Zawartość polifenoli w suchym ekstrakcie wynosiła 23,42% a kwasu rozmarynowego 8,09%.

Przykład 2

W tym przykładzie wykonania jako surowiec do ekstrakcji użyto 8,0 kg suszonego, rozdrobnionego liścia melisy. Ekstrakcję prowadzono dwustopniowo za pomocą 72 l wody w pierwszym stopniu ekstrakcji i 53 l wody w drugim stopniu ekstrakcji. Liść melisy ekstrahowano w temperaturze 100°C, pierwszy stopień przez 2 godziny a drugi stopień przez 1 godzinę. Po oddzieleniu od surowca otrzymano łącznie 108 l ekstraktu o zawartości 2,3% suchej masy.

Uzyskany ekstrakt przefiltrowano przez filtr workowy o porowatości 5 μm i następnie za pomocą prasy filtracyjnej wyposażonej w płyty celulozowe o porowatości 2 μm.

Następnie ekstrakt poddano mikrofiltracji prowadzonej na 7-kanałowej membranie z TO2 o długości 600 mm, średnicy 10 mm i porowatości 0,2 μm.

Permeat z mikrofiltracji wykorzystano do kolejnego etapu - ultrafiltracji na 7-kanałowej membranie z TiO2 o długości 600 mm, średnicy 10 mm i MWCO 300 kDa, przy czym celem było usunięcie związków wielkocząsteczkowych, w tym białek oraz polisacharydów.

Do kolejnego etapu wykorzystano permeat z ultrafiltracji w ilości 101 litrów, który podano na poliamidową membranę nanofiltracyjną Filmtec NF 90 o powierzchni 2,6 m² i prowadzono proces nanofiltracji w temperaturze 25°C, przy czym celem było usunięcie niskocząsteczkowych związków nieorganicznych, w tym soli. Przewodność permeatu po procesie nanofiltracji wynosiła 2,91 mS/cm, wskazującą na zawartość soli.

Retentat poddano diafiltracji na tej samej membranie nanofiltracyjnej w temperaturze 25°C, dodając 20 l wody dejonizowanej. Otrzymany permeat miał przewodność 1,91 mS/cm co wskazuje na zawartość soli. Otrzymano 9,1 kg retentatu końcowego o suchej masie 23,1%. Po wysuszeniu retentatu w suszarni rozpyłowej otrzymano 1,8 kg suchego ekstraktu. Zawartość polifenoli w suchym ekstrakcie wynosiła 24,11% a kwasu rozmarynowego 8,56%.

Przykład 3

W tym przykładzie wykonania jako surowiec do ekstrakcji użyto 8,0 kg suszonego, rozdrobnionego liścia melisy. Ekstrakcję prowadzono tak, jak w przykładzie 2, przy czym temperatura ekstrakcji wynosiła 70°C. Otrzymano 113 l ekstraktu o suchej masie 1,7%.

Kolejne etapy procesu przeprowadzono tak jak w przykładzie nr 2, przy czym przewodność permeatu po procesie nanofiltracji wyniosła 2,32 mS/cm, natomiast przewodność permeatu po diafiltracji wyniosła 1,41 mS/cm, co wskazuje na zawartość soli.

Otrzymano 9,0 kg retentatu końcowego o suchej masie 20,5%. Po wysuszeniu retentatu w suszami próżniowej otrzymano 1,62 kg suchego ekstraktu. Zawartość polifenoli w suchym ekstrakcie wynosiła 21,01 a kwasu rozmarynowego 7,66%.

Przykład 4

Sposób wytwarzania suchego ekstraktu z melisy jak w przykładzie 3, z tym, że proces ultrafiltracji prowadzono na membranach o MWCO 150 kDa.

Claims (8)

1. Sposób wytwarzania suchego ekstraktu z liścia melisy, znamienny tym, że obejmuje następujące etapy:

a) dwustopniową ekstrakcję wodną stosując wodę w ilości od 6 do 10 razy więcej w porównaniu do ilości rośliny

b) filtrację wstępną i mikrofiltrację

c) ultrafiltrację

d) nanofiltrację permeatu z procesu ultrafiltracji

e) diafiltrację retentatu na membranie nanofiltracyjnej

f) suszenie próżniowe lub rozpyłowe.

2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że ekstrakcję wodną prowadzi się w zakresie temperatur 70 - 100°C, korzystnie 100°C, przy czym czas ekstrakcji pierwszego stopnia wynosi 2 godziny, a czas ekstrakcji drugiego stopnia wynosi 1 godzinę.

3. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że filtrację wstępną prowadzi się na workach filtracyjnych o porowatości 5 μm i płytach filtracyjnych o porowatości 2 μm, a mikrofiltrację na membranach o porowatości 0,2 - 0,45 μm, korzystnie 0,2 μm.

4. Sposób według dowolnego z poprzednich zastrzeżeń od 1 do 3, znamienny tym, że ultrafiltrację prowadzi się na membranach o MWCO 150 - 300 kDa, korzystnie 300 kDa.

5. Sposób według dowolnego z poprzednich zastrzeżeń od 1 do 4, znamienny tym, że etap nanofiltracji prowadzi się na membranie poliamidowej w temperaturze 25 - 30°C.

6. Sposób według zastrz. 5, znamienny tym, że membranę stanowi membrana typu Filmtec.

7. Sposób według dowolnego z poprzednich zastrzeżeń od 1 do 6, znamienny tym, że etap diafiltracji prowadzi się na membranie poliamidowej nanofiltracyjnej w temperaturze 25 - 30°C.

8. Sposób według zastrz. 7, znamienny tym, że membranę stanowi membrana typu Filmtec.