PL246645B1 - 4-[(2-chlorofenylo)sulfanylo]-2-[(E)-2-(2-metoksyfenylo)etenylo] pirydo[2,3-d]pirymidyna oraz jej zastosowanie - Google Patents

4-[(2-chlorofenylo)sulfanylo]-2-[(E)-2-(2-metoksyfenylo)etenylo] pirydo[2,3-d]pirymidyna oraz jej zastosowanie Download PDF

Info

Publication number
PL246645B1
PL246645B1 PL444568A PL44456823A PL246645B1 PL 246645 B1 PL246645 B1 PL 246645B1 PL 444568 A PL444568 A PL 444568A PL 44456823 A PL44456823 A PL 44456823A PL 246645 B1 PL246645 B1 PL 246645B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
pyrido
pyrimidine
ethenyl
methoxyphenyl
sulfanyl
Prior art date
Application number
PL444568A
Other languages
English (en)
Other versions
PL444568A1 (pl
Inventor
Katarzyna Malarz
Patrycja Rawicka
Jacek Mularski
Anna Mrozek-Wilczkiewicz
Original Assignee
Univ Slaski
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Univ Slaski filed Critical Univ Slaski
Priority to PL444568A priority Critical patent/PL246645B1/pl
Publication of PL444568A1 publication Critical patent/PL444568A1/pl
Publication of PL246645B1 publication Critical patent/PL246645B1/pl

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D471/00—Heterocyclic compounds containing nitrogen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system, at least one ring being a six-membered ring with one nitrogen atom, not provided for by groups C07D451/00 - C07D463/00
    • C07D471/02—Heterocyclic compounds containing nitrogen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system, at least one ring being a six-membered ring with one nitrogen atom, not provided for by groups C07D451/00 - C07D463/00 in which the condensed system contains two hetero rings
    • C07D471/04—Ortho-condensed systems
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • C09K—MATERIALS FOR MISCELLANEOUS APPLICATIONS, NOT PROVIDED FOR ELSEWHERE
    • C09K11/00—Luminescent materials, e.g. electroluminescent or chemiluminescent
    • C09K11/06—Luminescent materials, e.g. electroluminescent or chemiluminescent containing organic luminescent materials
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/52—Use of compounds or compositions for colorimetric, spectrophotometric or fluorometric investigation, e.g. use of reagent paper and including single- and multilayer analytical elements
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • C09K—MATERIALS FOR MISCELLANEOUS APPLICATIONS, NOT PROVIDED FOR ELSEWHERE
    • C09K2211/00—Chemical nature of organic luminescent or tenebrescent compounds
    • C09K2211/10—Non-macromolecular compounds
    • C09K2211/1018—Heterocyclic compounds
    • C09K2211/1025—Heterocyclic compounds characterised by ligands
    • C09K2211/1059—Heterocyclic compounds characterised by ligands containing three nitrogen atoms as heteroatoms

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Materials Engineering (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

Przedmiotem zgłoszenia jest 4-[(2chlorofenylo)sulfanylo]-2-[(2-metoksyfenylo)etenylo]pirydo[2,3-d]pirymidyna oraz jej zastosowanie jako barwnika fluorescencyjnego do barwienia biologicznych struktur komórkowych, korzystnie do barwienia błoniastych struktur komórkowych, najkorzystniej do barwienia błoniastych struktur komórkowych nowotworów nabłonkowych płuc lub błoniastych struktur komórkowych nowotworów mózgu.

Description

Opis wynalazku
Przedmiotem wynalazku jest 4-[(2-chlorofenylo)sulfanylo]-2-[(E)-2-(2-metoksyfenylo)etenylo]pirydo[2,3-d]pirymidyna będąca pochodną pirydo[2,3-d]pirymidyny, oraz jej zastosowanie do barwienia biologicznych struktur komórkowych.
Obrazowanie struktur komórkowych jest istotnym zagadnieniem z punktu widzenia badań biomedycznych i wykorzystania ich potencjału do postawienia prawidłowej diagnozy. Wykorzystanie związków światłoczułych, które po wzbudzeniu odpowiednią wiązką światła emitują fluorescencję ma również istotne znaczenie dla rozwoju dziedziny chirurgii onkologicznej. Zjawisko fluorescencji pochodzące od barwników, które gromadzą się w tkankach zmienionych chorobowo może w wyjątkowy sposób uwydatnić i określić miejsce położenia guza, oraz jego rozmiar. Przykładami takich stosowanych barwników - fotouczulaczy są pochodne i analogi protoporfiryny IX, takie jak fotofrin, feoforbid a, werteporfina lub ich prekursory zwane prolekami jak kwas 5-aminolewulinowy opisany w dokumentach patentowych WO84/04665 oraz WO2013/184830. Z drugiej jednak strony, związki te posiadają pewną toksyczność po aktywacji wiązką światła, co uniemożliwia ich wykorzystanie do nieinwazyjnego barwienia struktur komórkowych. Innymi najbardziej znanymi barwnikami fluorescencyjnymi są izotiocyjanian 5-fluoresceiny (FITC), czy oranż akrydyny służące do wybarwiania struktur komórkowych, poprzez wiązanie z elementami cytoszkieletu oraz kwasami nukleinowymi (opisy patentowe: US9102835, US5075556, US20100184042, US20040156782). Co więcej, popularnym środkiem fluorescencyjnym stosowanym w diagnostyce medycznej przy badaniu kontrastowym jest zieleń indocyjaninowa, której zastosowanie wskazano w dokumencie patentowym US20040156782.
Znanym ze stanu techniki (patent PL233179) barwnikiem fluoroscencyjnym służącym do barwienia organelli komórkowych jest także pochodna para-iminostyrylochinoliny, która znana jest ze swojego zastosowania w diagnostyce chorób nowotworowych, zwłaszcza chorób nowotworowych jelita grubego.
Inne znane ze stanu techniki pochodne mające zastosowanie do barwienia komórek nowotworowych to pochodne fenotiazyny (polskie zgłoszenie patentowe P.438052) zawierające w swojej strukturze sprzężony pierścień imidazolu.
Pomimo szerokiego wachlarza zastosowań, wiele z obecnie stosowanych barwników fluorescencyjnych nie pozostaje bez wad. W pracy Jensen, E.C., Anat Rec 2012, 295, 2031-2036 opisano ograniczenia stosowania popularnych barwników wraz ze wskazaniem najistotniejszych trudności jakie napotykają dzisiejsze badania związane z obrazowaniem. Dlatego też znalezienie dobrego barwnika stanowi duże wyzwanie, a tym samym badania związane z poszukiwaniem nowych związków mających zastosowanie w obrazowaniu struktur komórkowych są szczególnie istotne. Związki wykazujące fluorescencję dedykowane do wybarwiania organelli komórkowych czy też monitorowania zmian strukturalnych oraz biochemicznych zachodzących w układach komórkowych powinny posiadać kilka istotnych cech. Ze względu na możliwości wykorzystania związków w barwieniach przyżyciowych, najważniejszym elementem jest ich brak cytotoksyczności wobec komórek, nawet w przypadku długoczasowych procedur. Dodatkowo, brak wpływu na cykl i mechanizmy zachodzące w komórkach, jak i wysokie powinowactwo do określonych struktur komórkowych to niezbędniki dobrego barwnika. Z punktu widzenia właściwości spektroskopowych, barwniki do wskazanych zastosowań powinny charakteryzować się wysoką kwantową wydajnością fluorescencji, dużym przesunięciem Stokesa oraz brakiem fotowybielenia. Cechy te gwarantują uzyskanie najwyższej jakości obrazów mikroskopowych przy wysokim sygnale fluorescencji w stosunku do szumu, generowanego przez autofluorescencję komórek. Przyjmuje się również, że związki przeznaczone do barwień komórkowych powinny charakteryzować się emisją fluorescencji minimum w granicach barwy zielonej. Stąd też, barwniki emitujące zieloną barwę są jednymi z najbardziej popularnych i są przedmiotem zainteresowania badaczy pracujących nad zmodyfikowaniem i ulepszeniem cech, które ograniczają ich możliwości stosowania [Swenson ES, Price JG, Brazelton T, Krause DS., Stem Cells 2007, 25, 2593-2600]. Warto również nadmienić, iż badania związane z zastosowaniem barwników są niejednokrotnie wstępem i podwaliną do złożonych badań klinicznych i dlatego mają bezpośrednie przełożenie na użycie przedmiotu tych badań w medycynie. Wobec tego, synteza nowych pochodnych opartych na nowych szkieletach, które wykazują specyficzne własności jest działaniem potrzebnym i pożądanym.
Celem twórców niniejszego wynalazku stało się opracowanie pochodnej pirydo[2,3-d]pirymidyny o korzystnych własnościach spektroskopowych. Dotychczasowe doniesienia o związkach opartych na szkielecie pirydo[2,3-d]pirymidyny dotyczą jedynie ich zastosowania w zakresie hamowania aktywności kinaz białkowych takich jak FGFR4 czy też białek mTOR i Akt odpowiedzialnych za procesy przeżycia komórek. Związki takie są opisane w dokumentach patentowych: US10618902, US2008194546,
WO2007/060404. Żaden z nich nie dotyczy możliwości wykorzystania związków zawierających szkielet pirydo[2,3-d]pirymidyny z dołączonym 1-chloro-2-(metylosulfanylo)benzenem do barwienia struktur komórkowych lub wykorzystania w diagnostyce chorób nowotworowych.
Istotę niniejszego wynalazku stanowi 4-[(2-chlorofenylo)sulfanylo]-2-[(E)-2-(2-metoksyfenylo)etenylo]pirydo[2,3-d]pirymidyna, o postaci chemicznej przedstawionej wzorem 1, będąca pochodną pirydo[2,3-d]pirymidyny.
Istotę wynalazku stanowi także zastosowanie 4-[(2-chlorofenylo)sulfanylo]-2-[(E)-2-(2-metoksyfenylo)etenylo]pirydo[2,3-d]pirymidyny przedstawionej wzorem 1 jako barwnika fluorescencyjnego do barwienia biologicznych struktur komórkowych, przy czym stosuje się ją, to jest podaje do komórek, w pożywce hodowlanej umożliwiającej przeżycie komórek, po uprzednim rozpuszczeniu w rozpuszczalniku.
Korzystnie, w roztworze gotowym do podania do komórek, stężenie rozpuszczalnika w pożywce hodowlanej nie przekracza 0,3%.
Korzystnie, 4-[(2-chlorofenylo)sulfanylo]-2-[(E)-2-(2-metoksyfenylo)etenylo]pirydo[2,3-d]pirymidynę przedstawioną wzorem 1 stosuje się rozpuszczoną w dimetylosulf otlenku (DMSO).
Korzystnie, jako pożywkę hodowlaną stosuje się pożywkę Dulbecco's Modified Eagle Medium DMEM.
Korzystnie, 4-[(2-chlorofenylo)sulfanylo]-2-[(E)-2-(2-metoksyfenylo)etenylo]pirydo[2,3-d]pirymidynę przedstawioną wzorem 1 stosuje się jako barwnik fluorescencyjny do barwienia błoniastych struktur komórkowych.
Korzystnie, 4-[(2-chlorofenylo)sulfanylo]-2-[(E)-2-(2-metoksyfenylo)etenylo]pirydo[2,3-d]pirymidynę przedstawioną wzorem 1 stosuje się jako barwnik fluorescencyjny do barwienia błoniastych struktur komórkowych nowotworów nabłonkowych płuc.
Korzystnie, 4-[(2-chlorofenylo)sulfanylo]-2-[(E)-2-(2-metoksyfenylo)etenylo]pirydo[2,3-d]pirymidynę przedstawioną wzorem 1 stosuje się jako barwnik fluorescencyjny do barwienia błoniastych struktur komórkowych nowotworów mózgu.
Nowo zsyntezowana pochodna pirydo[2,3-d]pirymidyny została scharakteryzowana pod kątem widm absorbcji i emisji. Prezentowane w przykładzie 1 dane wskazują, iż przedmiot niniejszego wynalazku wykazuje dwa pasma absorbcji w zakresie 300-360 nm oraz fluorescencję w zakresie 464 nm. Duże przesunięcie Stokesa (powyżej 110 nm) oraz wysoka intensywność fluorescencji zakwalifikowały prezentowaną pochodną do badań komórkowych dotyczących obrazowania. Związek ten może być stosowany zgodnie z wynalazkiem w postaci farmaceutycznie dostępnych preparatów, takich jak roztwory rozpuszczone w korzystnym dla komórek rozpuszczalniku. Takim rozpuszczalnikiem może być dimetylosulfotlenek (DMSO) lub etanol. Jednakże, przy przygotowaniu roztworu gotowego do podania do układu komórkowego należy uwzględnić bezpieczną dawkę rozpuszczalnika, która nie powinna przekraczać 0,3% objętości pożywki hodowlanej gotowej do podania do układu komórkowego. Z przeprowadzonych testów biologicznych wynika, że badana pochodna pirydo(2,3-d)pirymidyny tj. 4-[(2-chlorofenylo)sulfanylo]-2-[(E)-2-(2-metoksyfenylo)etenylo]pirydo[2,3-d]pirymidyna wykazuje brak bądź znikomą cytotoksyczność względem kilku linii komórek nowotworowych. Inkubacja pochodnej według wynalazku z testowanymi liniami komórkowymi nie wpływała znacząco na spadek żywotności tych komórek co zostało potwierdzone oceną morfologii komórek, jak również znacznie wydłużonym (do 72 godzin) czasem inkubacji w stosunku do czasu eksperymentu obrazowania, który wynosił 2 godziny. W typowej procedurze barwienia, po 2-godzinnym czasie inkubacji związku, komórki linii A549 (nowotwór płuca), oraz komórki linii U251, LN-18 i LN-229 (nowotwory mózgu) zostały poddane obserwacji z zastosowaniem techniki mikroskopii fluorescencyjnej. Zwykle obrazy powstałe w wyniku użycia tych metod, można rejestrować przy użyciu kamery CCD. Przedstawione obrazy w przykładach niniejszego wynalazku wskazują na intensywną zieloną fluorescencję obszarów błoniastych komórki. Dodatkowo, ten specyficzny mechanizm powinowactwa związku do komórkowych struktur błoniastych, jakie występują w mitochondriach oraz lizosomach potwierdziło przeprowadzone kontrbarwienie 4-[(2-chlorofenylo)sulfanylo]-2-[(E)-2-(2-metoksyfenylo)etenylo]pirydo[2,3-d]pirymidyny z zastosowaniem komercyjnych barwników dedykowanych poszczególnym organellom. Warunkiem stosowania tej metody jest różna długość fali promieniowania wzbudzającego oraz emitowanego badanego związku i stosowanego komercyjnie dostępnego barwnika.
Pochodną według wynalazku można otrzymać z wykorzystaniem metod znanych ze stanu techniki, na przykład z wykorzystaniem procedury syntezy, opisanej w publikacjach: Mularski J, Malarz K,
Pacholczyk M, Musiol R., Eur J Med Chem. 2019, 163, 610-625 oraz Malarz K, Mularski J, Kuczak M, Mrozek-Wilczkiewicz A, Musiol R., Cancers 2021, 13, 1790 z modyfikacjami.
Poniżej przedstawiono rozwiązania według wynalazku, które mają charakter przykładowy. W przykładzie 1 przedstawiono postać chemiczną otrzymanej pochodnej pirydo[2,3-d]pirymidyny, tj. 4-[(2-chlorofenylo)sulfanylo]-2-[(E)-2-(2-metoksyfenylo)etenylo]pirydo[2,3-d]pirymidyny (oznaczenie kodowe związku: ET-06) oraz przykładowy sposób jej otrzymywania. Dodatkowo przedstawiono właściwości spektroskopowe pochodnej według wynalazku, które są istotne przy jej zastosowaniu. Ponadto, przedstawiono przykładowe widma absorpcji i emisji 4-[(2-chlorofenylo)sulfanylo]-2-[(E)-2-(2-metoksyfenylo)etenylo]pirydo[2,3-d]pirymidyny według wynalazku. Wskazano także właściwości spektroskopowe 4-[(2-chlorofenylo)sulfanylo]-2-[(E)-2-(2-metoksyfenylo)etenylo]pirydo[2,3-d]pirymidyny w zależności od stosowanego rozpuszczalnika. Dodatkowo przedstawiono cytotoksyczność badanej pochodnej ET-06 wobec różnych typów komórek nowotworowych. W przykładach od 2 do 4 przedstawiono możliwość zastosowania 4-[(2-chlorofenylo)sulfanylo]-2-[(E)-2-(2-metoksyfenylo)etenylo]pirydo[2,3-d]pirymidyny w barwieniu biologicznych struktur komórkowych.
Przykład 1
4-[(2-chlorofenylo)sulfanylo]-2-[(E)-2-(2-metoksyfenylo)etenylo]pirydo[2,3-d]pirymidyna (ET-06) o wzorze 1.
Związek otrzymano według przykładowej metody, która polegała na tym, że w naczyniu umieszczono (0,1 mmol, 43 mg) 2-[(E)-2-(2-metoksyfenylo)etenylo]pirydo[2,3-d]pirymidino-4-ylo-4-metylobenzeno-1-sulfonianu o wzorze 2 stanowiącego bezpośredni prekursor ET-06, dodano chlorek metylenu CH2CI2 oraz 2-propanol (1:5 V/V; 2 mL), 2-chlorobenzeno-1-tiol (0,1 mmol; 15 mg) oraz DIPEA - N,N-diizopropyloetyloaminę (0,1 mmol; 14 mg), po czym całość mieszano ogrzewając w temperaturze wrzenia 2-propanolu przez 15 minut. Z roztworu wykrystalizowano związek ET-06, który zbierano na lejku i rekrystalizowano z 2-propanolu (2 mL). 1H NMR (500 MHz, DMSO) δ 9,23 (dd, J = 4,4, 1,9 Hz, 1H), 8,69 (dd, J = 8,2, 1,9 Hz, 1H), 7,91 (dd, J = 7,7, 1,6 Hz, 1H), 7,86 -7,78 (m, 2H), 7,74 (ddd, J = 8,1,7,5, 1,7 Hz, 1H), 7,71 (dd, J = 8,2, 4,4 Hz, 1H), 7,65 (dd, J = 7,7, 1,7 Hz, 1H), 7.59 (apptd, J = 7,6, 1,4 Hz, 1H), 7,37 (ddd, J = 8,4, 7,3, 1,7 Hz, 1H), 7,17 (d, J = 16,0 Hz, 1H), 7,07 (dd, J = 8,4, 1.1 Hz, 1H), 7,016,96 (m, 1H), 3,87 (s, 3H).
Natomiast bezpośredni prekursor ET-06, to jest 2-[(E)-2-(2-metoksyfenylo)etenylo]pirydo[2,3-d]pirymidino-4-ylo-4-metylobenzeno-1-sulfonian wytworzono uprzednio według przykładowej metody, która polegała na tym, że w naczyniu umieszczono (0,2 mmol, 56 mg) [2-[(E)-2-(2-metoksyfenylo)etenylo]pirydo[2,3-d]pirymidyno-4(3H)-on. Dodano chlorek metylenu - CH2CI2 (3 mL), DIPEA - N,N-diizopropyloetyloaminę (0,3 mmol; 39 mg), TsCl - chlorek 4-metylobenzenosulfonowy (0,3 mmol, 57 mg) oraz DMAP - 4-dimetyloaminopirydynę (0,02 mmol; 3 mg). Całość mieszano w atmosferze gazu obojętnego (w temperaturze pokojowej 20-22°C) do zaniku sygnału pochodzącego od [2-[(E)-2-(2-metoksyfenylo)etenylo]pirydo[2,3-d]pirymidyno-4(3H)-onu. Następnie dokonano identyfikacji sygnału za pomocą cienkiej warstwy TLC (CH2Cb:heksan - 1:1). Związek wydzielano poprzez rozdział chromatograficzny stosując kartridż wypełniony żelem krzemionkowym (40-63 gm, 60 A). 1H NMR (500 MHz, CD2CI2) δ 9,19 (dd, J = 4.4, 2.0 Hz, 1H), 8.52 (dd, J = 8,2, 2,0 Hz, 1H), 8,42 (d, J = 16,1 Hz, 1H), 8,29-8,18 (m, 2H), 7,74 (dd, J = 7,5, 1,6 Hz, 1H), 7,56 (dd, J = 8,2, 4,4 Hz, 1H), 7,48-7,40 (m, 3H), 7,36 (d, J = Hz, 1H), 7,17-7,04 (m, 2H), 4,07 (s, 3H).
Natomiast [2-[(E)-2-(2-metoksyfenylo)etenylo]pirydo[2,3-d]pirymidyno-4(3H)-on, potrzebny do uzyskania bezpośredniego prekursora ET-06, to jest 2-[(E)-2-(2-metoksyfenylo)etenylo]pirydo[2,3-d]pirymidino-4-ylo-4-metylobenzeno-1-sulfonianu otrzymano w wyniku następującej przykładowej trzyetapowej syntezy:
1) Najpierw przeprowadzono reakcję kwasu 2-aminonikotynowego z nadmiarem stechiometrycznym bezwodnika octowego (50 ekwiwalentów molowych), w temperaturze 80°C w reaktorze mikrofalowym - o mocy 80 W. Wynikiem reakcji jest 2-metylo-4H-pirydo[2,3-d][1,3]oksazyn-4-on. 1H NMR (500 MHz, DMSO) δ 8,96 (dd, J = 4,7, 2,0 Hz, 1H), 8,50 (dd, J = 7,8, 2,0 Hz, 1H), 7,61 (dd, J = 7,8, 4,7 Hz, 1H), 2,45 (s, 4H); Surowy produkt wydzielono poprzez filtrację.
2) 2-metylo-4H-pirydo[2,3-d][1,3]oksazyn-4-on (8 g) wymieszano z 40 mL wodnego roztworu amoniaku (32%) w temperaturze pokojowej (20-22°C) do całkowitego rozpuszczenia się osadu. Nasycanie roztworu reakcyjnego dwutlenkiem węgla powoduje precypitację produktu 2-metylopirydo[2,3-d]pirymidin-4(3H)-onu, który zebrano na lejku filtracyjnym i przemyto 2-propanolem - otrzymując chinazolon z wydajnością 40%. Reakcja została sprawdzona w skali 50 mmol; 1H NMR (500 MHz, DMSO) δ 12,48 (s, 1H), 8,90 (dd, J = 4,6, 2,1 Hz, 1H), 8,45 (dd, J = 7,8, 2,1 Hz, 1H), 7,48 (dd, J = 7,8, 4,6 Hz, 1H), 2,40 (s, 3H);
3) W trzecim etapie przeprowadzono reakcję 2-metylopirydo[2,3-d]pirymidin-4(3H)-onu z aldehydem 2-metoksysalicylowym w kwasie octowym (przykładowo stosowano taką ilość, aby nie przekroczyć 2 M stężenia substratu). Reakcję można prowadzić stosując reaktor mikrofalowy (130°C, 80 W, 120 minut) lub na łaźni olejowej (130°C, 12 h). Produkt krystalizował z medium reakcyjnego z wydajnością 45%. 1H NMR (500 MHz, DMSO) δ 12,62 (s, 1H), 8,93 (dd, J = 4,5, 2,1 Hz, 1H), 8,46 (dd, J = 7,8, 2,1 Hz, 1H), 8,29 (d, J = 16,0 Hz, 1H), 7,64 (dd, J = 7,7, 1,7 Hz, 1H), 7,47 (dd, J = 7,8, 4,6 Hz, 1H), 7,44 (ddd, J = 8,8, 7,4, 1,7 Hz, 1H), 7,16- 7,09 (m, 2H), 7,06 (appt, J = 7,5, 1H), 3,93 (s, 3H).
Właściwości spektroskopowe 4-[(2-chlorofenylo)sulfanylo]-2-[(E)-2-(2-metoksyfenylo)etenylo]pirydo[2,3-d]pirymidyny.
W tabeli nr 1 przedstawiono zbiór najważniejszych parametrów spektroskopowych 4-[(2-chlorofenylo)sulfanylo]-2-[(E)-2-(2-metoksyfenylo)etenylo]pirydo[2,3-d]pirymidyny w chloroformie jako najkorzystniejszym rozpuszczalniku do badań właściwości spektroskopowych. Parametry te potwierdzają przydatność wskazanej pochodnej z przykładu 1 do barwienia biologicznych struktur komórkowych. Zgodnie z przedstawionymi danymi można zaobserwować, że badana pochodna ET-06 wykazuje dwa pasma absorbcji (306 nm oraz 353 nm) oraz maksimum fluorescencji w zakresie długości fali 464 nm, co odpowiada barwie zielonej. Związek ET-06 cechuje także wysoka intensywność fluorescencji (dla badanego stężenia 5*10Λ-5 M) oraz duże przesunięcie Stokesa (111 nm). Wskazane parametry spektroskopowe są szczególnie korzystne i istotne w zakresie uzyskania wysokiego sygnału fluorescencji w stosunku do tła, co jest gwarantem otrzymania najwyższej jakości obrazów mikroskopowych. Z kolei, te cechy są szczególnie ważne dla wskazanego zastosowania w niniejszym wynalazku.
Przykładowe widma absorpcji i emisji 4-[(2-chlorofenylo)sulfanylo]-2-[(E)-2-(2-metoksyfenylo)etenylo]pirydo[2,3-d]pirymidyny.
Widma absorpcji dla pochodnej ET-06 w chloroformie (przedstawione na Fig. 4). Widma emisji (wzbudzenie 353 nm) dla pochodnej ET-06 w chloroformie (przedstawione na Fig. 5).
Prezentowane widma absorpcji i fluorescencji potwierdzają korzystne własności spektroskopowe pochodnej ET-06, a także potwierdzają przydatność wskazanej pochodnej do barwienia biologicznych struktur komórkowych. Na wszystkich prezentowanych widmach widoczna jest zależność intensywności położenia pasm absorpcji oraz fluorescencji od badanego stężenia związku. Co ważne, zastosowanie prezentowanej pochodnej ET-06 w niskim stężeniu: 6,25*10Λ-6 M nadal potwierdza wysoką intensywność fluorescencji (powyżej 1000). W związku z tym, tak korzystne parametry spektroskopowe zakwalifikowały związek do dalszych badań komórkowych.
Właściwości spektroskopowe 4-[(2-chlorofenylo)sulfanylo]-2-[(E)-2-(2-metoksyfenylo)etenylo]pirydo[2,3-d]pirymidyny w zależności od stosowanego rozpuszczalnika.
Tabela nr 2 przedstawia właściwości solwatochromiczne 4-[(2-chlorofenylo)sulfanylo]-2-[(E)-2-(2-metoksyfenylo)etenylo]pirydo[2,3-d]pirymidyny, to jest zmiany właściwości spektroskopowych związku z przykładu 1 w zależności od stosowanego rozpuszczalnika (polarności). Rozpuszczalniki uporządkowane wg indeksu polarności (klasyfikacja Burdick & Jackson).
Zgodnie z przedstawionymi danymi, pochodna ET-06 prezentuje szczególnie korzystne parametry spektroskopowe w wybranych rozpuszczalnikach, to jest w chloroformie lub DMSO. Szczególnie drugi rozpuszczalnik zgodnie z danymi literaturowymi obok etanolu i metanolu jest uważany za korzystny z uwagi na rozpuszczenie substancji przeznaczonej do barwienia materiału żywego [Nguyen, S., Nguyen, H., Truong, K., Biomed. Res. Ther. 2020, 7(7), 3855-3859 oraz Jamalzadeh, L., Ghafoori, H., Sariri, R., Rabuti, H., Nasirzade, J., Hasani, H., & Aghamaali, M. R., Avicenna J Med Biochem, 2016, 4(1), 10-33453]. Należy jednak zwrócić uwagę, aby bezpieczna dawka wskazanego rozpuszczalnika nie przekraczała 0,3% objętości pożywki hodowlanej gotowej do podania do układu komórkowego.
Cytotoksyczność badanej 4-[(2-chlorofenylo)sulfanylo]-2-[(E)-2-(2-metoksyfenylo)etenylo]pirydo[2,3-d]pirymidyny (ET-06) wobec różnych typów komórek nowotworowych.
Aktywność antyproliferacyjną testowanego związku oznaczono wobec ludzkich komórek nowotworów: mózgu linii U251, LN-18 oraz LN-229 oraz płuca linii A549. Komórki wysiewano na 96-dołkową płytkę w ilości 5 tysięcy na dołek (po 100 uL/dołek) i inkubowano przez 24 godziny w temperaturze 37°C i 5% CO2. Po tym czasie przygotowano i podawano roztwory związku ET-06 (rozpuszczonych w minimalnej ilości DMSO, tj. w taki sposób aby zawartość DMSO nie przekraczała 0,3% objętości pożywki hodowlanej gotowej do podania do układu komórkowego) w stężeniach umożliwiających wyznaczenie wartości IC50. Przykładowa aplikacja związku: rozpuszczenie związku w DMSO celem przygotowania roztworów o następujących stężeniach: 25 μΜ, 12,5 μΜ, 5 μΜ, 2,5 μΜ, 1 μΜ, 0,5 μΜ, 0,1 μΜ w pożywce hodowlanej Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), końcowa objętość w dołkach wynosiła 200 μL. Następnie roztwory zostały podane komórkom i inkubowane 72 godziny. Po tym czasie przeżywalność komórek została określona za pomocą standardowego testu MTS. Aktywność antyproliferacyjną badanej 4-[(2-chlorofenylo)sulfanylo]-2-[(E)-2-(2-metoksyfenylo)etenylo]pirydo[2,3-d]pirymidyny (ET-06), w postaci wyliczonych wartości IC50 przedstawiono w tabeli 3.
Zgodnie z przedstawionymi wynikami, dla badanej pochodnej ET-06 nie obserwowano cytotoksyczności wobec nowotworu nabłonkowego płuc. Dodatkowo, prezentowane dane wskazują na znikomą cytotoksyczność pochodnej o wzorze 1 wobec kilku różnych typów komórek nowotworowych. W związku z powyższym, pochodna opisana wynalazkiem dobrze nadaje się do stosowania w obrazowaniu biologicznych struktur komórkowych w stężeniu pozwalającym osiągnąć wysoki poziom fluorescencji przy jednoczesnym braku lub znikomej cytotoksyczności.
Przykład 2
Zastosowanie 4-[(2-chlorofenylo)sulfanylo]-2-[(E)-2-(2-metoksyfenylo)etenylo]pirydo[2,3-d]pirymidyny (ET-06) do barwienia błoniastych struktur komórkowych nowotworów nabłonkowych płuc.
Przykładowa procedura barwienia komórek ludzkiego nowotworu nabłonkowego płuca linii A549. Komórki wysiano w ilości 150 tys. (wraz z 1 mL DMEM) na wcześniej przygotowane specjalne szalki do obrazowania posiadające powierzchnię zawierającą szkiełko nakrywkowe, a następnie inkubowano przez 24 godziny w 37°C, 5% CO2. Po tym czasie przygotowano roztwór związku ET-06 (rozpuszczalnik DMSO, którego zawartość nie przekracza 0,3% objętości pożywki hodowlanej gotowej do podania do układu komórkowego) w stężeniu 25 μM w pożywce hodowlanej Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), końcowa objętość na szkiełku wynosiła 1 mL. Następnie roztwór został podany komórkom i inkubowany przez 2 godziny w 37°C, celem wniknięcia związku przez błonę komórkową. Po inkubacji komórki przemywano dwukrotnie DMEM (bez FBS i czerwieni fenolowej), a następnie obserwowano przy pomocy mikroskopu fluorescencyjnego po wzbudzeniu filtrem DAPI, co przedstawiono na Fig. 1. Zgodnie z przedstawionym obrazem, badana pochodna wykazuje jasną, intensywną zieloną fluorescencję w komórkach raka płuca. Umiejscowienie sygnału fluorescencyjnego na obszarze komórki może wskazywać powinowactwo do struktur błoniastych.
Przykład 3
Zastosowanie 4-[(2-chlorofenylo)sulfanylo]-2-[(E)-2-(2-metoksyfenylo)etenylo]pirydo[2,3-d]pirymidyny (ET-06) do barwienia błoniastych struktur komórkowych nowotworów mózgu.
Przykładowa procedura barwienia komórek ludzkiego nowotworu mózgu linii U251 oraz LN-229. Komórki wysiano w ilości 150 tys. (wraz z 1 mL DMEM) na wcześniej przygotowane specjalne szalki do obrazowania posiadające powierzchnię zawierającą szkiełko nakrywkowe, a następnie inkubowano przez 24 godziny w 37°C, 5% CO2. Po tym czasie przygotowano roztwór związku o wzorze 1 (rozpuszczalnik DMSO, którego zawartość nie przekracza 0,3% objętości pożywki hodowlanej gotowej do podania do układu komórkowego) w stężeniu 25 μM w pożywce hodowlanej DMEM, końcowa objętość na szkiełku wynosiła 1 mL. Następnie roztwór został podany komórkom i inkubowany przez 2 godziny w 37°C, celem wniknięcia związku przez błonę komórkową. Po inkubacji komórki przemywano dwukrotnie DMEM (bez FBS i czerwieni fenolowej), a następnie obserwowano przy pomocy mikroskopu fluorescencyjnego po wzbudzeniu filtrem DAPI, co przedstawiono na Fig. 2A oraz Fig. 2B. Przedstawione obrazy, wyraźnie wskazują na akumulację pochodnej ET-06 we wnętrzu komórek dwóch typów nowotworów mózgu: linii U251 (Fig. 2A) i linii LN-229 (Fig. 2B). Zgodnie z przedstawionymi danymi związek charakteryzuje się intensywną zieloną fluorescencję, która może występować w obszarach błoniastych komórek.
Przykład 4
Zastosowanie pochodnej pirydo[2,3-d]pirymidyny o kodowaniu ET-06 do selektywnego barwienia zmian w błoniastych strukturach komórkowych i diagnostyki chorób nowotworowych nabłonkowych płuc.
Przykładowa procedura barwienia struktur komórkowych ludzkiego nowotworu nabłonkowego płuca linii A549. Komórki wysiano w ilości 150 tys. (wraz z 1 mL DMEM) na wcześniej przygotowane specjalne szalki do obrazowania posiadające powierzchnię zawierającą szkiełko nakrywkowe, a następ nie inkubowano przez 24 godziny w 37°C, 5% CO2. Po tym czasie przygotowano roztwór związku o wzorze 1 (rozpuszczalnik DMSO, którego zawartość nie przekracza 0,3% objętości pożywki hodowlanej gotowej do podania do układu komórkowego) w stężeniu 25 pM w pożywce hodowlanej DMEM, końcowa objętość na szkiełku wynosiła 1 mL. Następnie roztwór został podany komórkom i inkubowany przez 2 godziny w 37°C, celem wniknięcia związku przez błonę komórkową. Po zakończonej inkubacji komórki przepłukano dwukrotnie DMEM (bez FBS i czerwieni fenolowej), a następnie dodano roztwór odpowiedniego markera fluorescencyjnego, tj. barwnika do mitochondriów (przykładowe warunki barwienia: 100 nM, 30 min) lub lizosomów (przykładowe warunki barwienia: 5 μΜ, 1 godzina). Zastosowane fluorofory pozwoliły na specyficzne wybarwienie wybranych struktur wewnątrzkomórkowych: lizosomów oraz mitochondriów. Zastosowanie powyższych barwników ułatwiło ocenę akumulacji badanego związku we wnętrzu komórek na tle wybarwionych struktur. Po upływie wymaganego czasu inkubacji, dołki przepłukano dwukrotnie DMEM (bez FBS i czerwieni fenolowej), a następnie obserwowano przy pomocy mikroskopu fluorescencyjnego po wzbudzeniu filtrem o odpowiedniej długości fali, co przedstawiono na Fig. 3A oraz Fig. 3B.
Prezentowane dane potwierdzają specyficzny mechanizm związku i tendencję do akumulacji w komórkowych strukturach błoniastych, jakie występują w mitochondriach oraz lizosomach. Nałożenie obrazów powstałych w wyniku przeprowadzonego kontrbarwienia 4-[(2-chlorofenylo)sulfanylo]-2-[(E)-2-(2-metoksyfenylo)etenylo]pirydo[2,3-d]pirymidyny (Fig. 3A) z barwnikami komercyjnie dostępnymi (dedykowanymi dla poszczególnych organelli komórkowych, tj. mitochondriów Fig. 3B) pozwala jednoznacznie stwierdzić umiejscowienie badanego związku w komórce.

Claims (8)

1. 4-[(2-chlorofenylo)sulfanylo]-2-[(E)-2-(2-metoksyfenylo)etenylo]pirydo[2,3-d]pirymidyna, o postaci chemicznej przedstawionej wzorem 1.
2. Zastosowanie 4-[(2-chlorofenylo)sulfanylo]-2-[(E)-2-(2-metoksyfenylo)etenylo]pirydo[2,3-d]pirymidyny przedstawionej wzorem 1 jako barwnika fluorescencyjnego do barwienia biologicznych struktur komórkowych, przy czym stosuje się ją, to jest podaje do komórek, w pożywce hodowlanej umożliwiającej przeżycie komórek, po uprzednim rozpuszczeniu w rozpuszczalniku.
3. Zastosowanie według zastrz. 2 znamienne tym, że w roztworze gotowym do podania do komórek, stężenie rozpuszczalnika w pożywce hodowlanej nie przekracza 0,3%.
4. Zastosowanie według zastrz. 2 do 3 znamienne tym, że 4-[(2-chlorofenylo)sulfanylo]-2-[(E)-2-(2-metoksyfenylo)etenylo]pirydo[2,3-d]pirymidyna rozpuszczona jest w dimetylosulfotlenku.
5. Zastosowanie według zastrz. 2 do 4 znamienne tym, że jako pożywkę hodowlaną stosuje się pożywkę Dulbecco's Modified Eagle Medium - DMEM.
6. Zastosowanie według któregokolwiek z zastrzeżeń 2 do 5 znamienne tym, że 4-[(2-chlorofenylo)sulfanylo]-2-[(E)-2-(2-metoksyfenylo)etenylo]pirydo[2,3-d]pirymidynę stosuje się jako barwnik fluorescencyjny do barwienia błoniastych struktur komórkowych.
7. Zastosowanie według któregokolwiek z zastrzeżeń 2 do 6 znamienne tym, że 4-[(2-chlorofenylo)sulfanylo]-2-[(E)-2-(2-metoksyfenylo)etenylo]pirydo[2,3-d]pirymidynę stosuje się jako barwnik fluorescencyjny do barwienia błoniastych struktur komórkowych nowotworów nabłonkowych płuc.
8. Zastosowanie według któregokolwiek z zastrzeżeń 2 do 6 znamienne tym, że 4-[(2-chlorofenylo)sulfanylo]-2-[(E)-2-(2-metoksyfenylo)etenylo]pirydo[2,3-d]pirymidynę stosuje się jako barwnik fluorescencyjny do barwienia błoniastych struktur komórkowych nowotworów mózgu.
PL444568A 2023-04-25 2023-04-25 4-[(2-chlorofenylo)sulfanylo]-2-[(E)-2-(2-metoksyfenylo)etenylo] pirydo[2,3-d]pirymidyna oraz jej zastosowanie PL246645B1 (pl)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PL444568A PL246645B1 (pl) 2023-04-25 2023-04-25 4-[(2-chlorofenylo)sulfanylo]-2-[(E)-2-(2-metoksyfenylo)etenylo] pirydo[2,3-d]pirymidyna oraz jej zastosowanie

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PL444568A PL246645B1 (pl) 2023-04-25 2023-04-25 4-[(2-chlorofenylo)sulfanylo]-2-[(E)-2-(2-metoksyfenylo)etenylo] pirydo[2,3-d]pirymidyna oraz jej zastosowanie

Publications (2)

Publication Number Publication Date
PL444568A1 PL444568A1 (pl) 2024-10-28
PL246645B1 true PL246645B1 (pl) 2025-02-17

Family

ID=93289650

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL444568A PL246645B1 (pl) 2023-04-25 2023-04-25 4-[(2-chlorofenylo)sulfanylo]-2-[(E)-2-(2-metoksyfenylo)etenylo] pirydo[2,3-d]pirymidyna oraz jej zastosowanie

Country Status (1)

Country Link
PL (1) PL246645B1 (pl)

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2017014601A1 (ko) * 2015-07-23 2017-01-26 서울대학교 산학협력단 인돌리지노[3,2-ｃ]퀴놀린계 형광 프로브
PL233179B1 (pl) * 2016-10-31 2019-09-30 Univ Slaski Nowe zastosowanie pochodnych para-iminostyrylochinoliny

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2017014601A1 (ko) * 2015-07-23 2017-01-26 서울대학교 산학협력단 인돌리지노[3,2-ｃ]퀴놀린계 형광 프로브
PL233179B1 (pl) * 2016-10-31 2019-09-30 Univ Slaski Nowe zastosowanie pochodnych para-iminostyrylochinoliny

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BARBARA CZAPLIŃSKA I IN.: "Scientific Reports 2019, 9:15304", „ACID SELECTIVE PRO-DYE FOR CELLULAR COMPARTMENTS" *

Also Published As

Publication number Publication date
PL444568A1 (pl) 2024-10-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US10876003B2 (en) Class of stable heptamethine cyanine fluorophores and biomedical applications thereof
Gebremedhin et al. Development of a red-light emission hypoxia-sensitive two-photon fluorescent probe for in vivo nitroreductase imaging
Solomatina et al. Water-soluble cyclometalated platinum (II) and iridium (III) complexes: Synthesis, tuning of the photophysical properties, and in vitro and in vivo phosphorescence lifetime imaging
Arrowsmith et al. Fluorescent gallium and indium bis (thiosemicarbazonates) and their radiolabelled analogues: Synthesis, structures and cellular confocal fluorescence imaging investigations
CN102762555B (zh) 荧光细胞标记
WO2013131235A1 (zh) 一类以萘为母体的双光子荧光探针、其制备方法及应用
KR101662427B1 (ko) 새로운 파이계 확장 아세단 유도체, 이의 생체 영상화 응용, 및 알츠하이머병 동물 모델에서의 아밀로이드-베타 플라크의 이광자 현미경 영상화에의 응용
François et al. A functionalized heterobimetallic 99m Tc/Re complex as a potential dual-modality imaging probe: synthesis, photophysical properties, cytotoxicity and cellular imaging investigations
Wu et al. A near-infrared hemicyanine-based colorimetric and fluorescent chemosensor for highly sensitive detection of Cu2+ and imaging in living cells and in vivo
Ma et al. Synthesis, optical properties and cytotoxicity of meso-heteroatom substituted IR-786 analogs
CN116768789A (zh) 一种聚集诱导发光自报告光敏剂探针及其制备方法与应用
CN113597547B (zh) 细胞和组织内脂滴的荧光成像试剂
CN109796444B (zh) 一种近红外双荧光探针化合物及制法和应用
PL246645B1 (pl) 4-[(2-chlorofenylo)sulfanylo]-2-[(E)-2-(2-metoksyfenylo)etenylo] pirydo[2,3-d]pirymidyna oraz jej zastosowanie
WO2020020905A1 (en) Near-infrared (nir) tricarbocyanine n-triazole chromophores
TWI664981B (zh) 用於多模式、非侵入性的腫瘤特定治療診斷前藥之鑭系元素工具箱
PL246646B1 (pl) 2-[(E)-2-(2-metoksyfenylo)etenylo]pirydo[2,3-d]pirymidino- -4-ylo-4-metylobenzeno-1-sulfonian i jego zastosowanie
Li et al. Novel hemicyanine dyes with a large Stokes shift and strong fluorescence: mitochondrial-targeted imaging
CN116217569B (zh) pH响应型亚胺咔啉喹啉鎓化合物及其制备方法与应用
O’Connor et al. Phase partitioning, solvent-switchable BODIPY probes for high contrast cellular imaging and FCS
CN113402523B (zh) 一种靶向肥大细胞MrgX2小分子荧光探针及制备方法和应用
Lopes et al. Tacrine-pyrimidine photoactive molecular hybrids: Synthesis, photophysics, docking and BSA interaction study
CN114249696A (zh) 一种鲁米诺类化合物及其制备方法和应用、药物组合物
CN113683562A (zh) 一种新型抗溶剂猝灭的近红外二区染料、及其制备方法和应用
PL233179B1 (pl) Nowe zastosowanie pochodnych para-iminostyrylochinoliny