4-[ (2-chlorof enylo )sulfanylo ]-2-[ (E)-2-(2-metoksyf enylo )eteny Io ]pirydo[2,3- d]pirymidyna oraz jej zastosowanie Przedmiotem wynalazku jest 4-[ (2-chlorofenylo )sulfanylo ]-2-[ (E)-2-(2- metoksyfenylo )etenylo ]pirydo[2,3-d]pirymidyna bedaca pochodna pirydo[2,3- d]pirymidyny, oraz jej zastosowanie do barwienia biologicznych struktur komórkowych. Obrazowanie struktur komórkowych jest istotnym zagadnieniem z punktu widzenia badan biomedycznych i wykorzystania ich potencjalu do postawienia prawidlowej diagnozy. Wykorzystanie zwiazków swiatloczulych, które po wzbudzeniu odpowiednia wiazka swiatla emituja fluorescencje ma równiez istotne znaczenie dla rozwoju dziedziny chirurgii onkologicznej. Zjawisko fluorescencji pochodzace od barwników, które gromadza sie w tkankach zmienionych chorobowo moze w wyjatkowy sposób uwydatnic i okreslic miejsce polozenia guza, oraz Jego rozmiar. Przykladami takich stosowanych barwników - fotouczulaczy sa pochodne i analogi protoporfiryny IX, takie jak fotofrin, feoforbid a, werteporfina lub ich prekursory zwane prolekami jak kwas -aminolewulinowy opisany w dokumentach patentowych WO84/04665 oraz WO2013/184830. Z drugiej jednak strony, zwiazki te posiadaja pewna toksycznosc po aktywacji wiazka swiatla, co uniemozliwia ich wykorzystanie do nieinwazyjnego barwienia struktur komórkowych. Innymi najbardziej znanymi barwnikami fluorescencyjnymi sa izotiocyjanian 5-fluoresceiny (FITC), czy oranz akrydyny sluzace do wybarwiania struktur komórkowych, poprzez wiazanie z elementami cytoszkieletu oraz kwasami nukleinowymi (opisy patentowe: US9102835, US5075556, US20100184042, US20040156782). Co wiecej, popularnym srodkiem fluorescencyjnym stosowanym w diagnostyce medycznej przy badaniu kontrastowym jest zielen indocyj aninowa, której zastosowanie wskazano w dokumencie patentowym US20040156782. Znanym ze stanu techniki (patent PL233179) barwnikiem fluoroscencyjnym sluzacym do barwienia organelli komórkowych jest takze pochodna para-iminostyrylochinoliny, która znana jest ze swojego zastosowania PL 444568 A1 2/20w diagnostyce chorób nowotworowych, zwlaszcza chorób nowotworowych jelita grubego. Inne znane ze stanu techniki pochodne majace zastosowanie do barwienia komórek nowotworowych to pochodne fenotiazyny (polskie zgloszenie patentowe P.438052) zawierajace w swojej strukturze sprzezony pierscien imidazolu. Pomimo szerokiego wachlarza zastosowan, wiele z obecnie stosowanych barwników fluorescencyjnych nie pozostaje bez wad. W pracy Jensen, E.C., Anat Rec 2012, 295, 2031-2036 opisano ograniczenia stosowania popularnych barwników wraz ze wskazaniem najistotniejszych trudnosci jakie napotykaja dzisiejsze badania zwiazane z obrazowaniem. Dlatego tez znalezienie dobrego barwnika stanowi duze wyzwame, a tym samym badania zwiazane z poszukiwaniem nowych zwiazków majacych zastosowanie w obrazowaniu struktur komórkowych sa szczególnie istotne. Zwiazki wykazujace fluorescencje dedykowane do wybarwiania organelli komórkowych czy tez monitorowania zmian strukturalnych oraz biochemicznych zachodzacych w ukladach komórkowych powinny posiadac kilka istotnych cech. Ze wzgledu na mozliwosci wykorzystania zwiazków w barwieniach przyzyciowych, najwazniejszym elementem jest ich brak cytotoksycznosci wobec komórek, nawet w przypadku dlugoczasowych procedur. Dodatkowo, brak wplywu na cykl i mechanizmy zachodzace w komórkach, jak i wysokie powinowactwo do okreslonych struktur komórkowych to niezbedniki dobrego barwnika. Z punktu widzenia wlasciwosci spektroskopowych, barwniki do wskazanych zastosowan powmny charakteryzowac sie wysoka kwantowa wydajnoscia fluorescencji, duzym przesunieciem Stokesa oraz brakiem fotowybielenia. Cechy te gwarantuja uzyskanie najwyzszej jakosci obrazów mikroskopowych przy wysokim sygnale fluorescencji w stosunku do szumu, generowanego przez autofluorescencje komórek. Przyjmuje sie równiez, ze zwiazki przeznaczone do barwien komórkowych powinny charakteryzowac sie emisja fluorescencji minimum w granicach barwy zielonej. Stad tez, barwniki emitujace zielona barwe sa jednymi z najbardziej popularnych i sa przedmiotem zainteresowania badaczy pracujacych nad zmodyfikowaniem i ulepszeniem cech, które ograniczaja ich mozliwosci PL 444568 A1 3/20stosowania [Swenson ES, Price JG, Brazelton T, Krause DS., Stern Cells 2007, 25, 2593-2600]. Warto równiez nadmienic, iz badania zwiazane z zastosowaniem barwników sa niejednokrotnie wstepem i podwalina do zlozonych badan klinicznych i dlatego maja bezposrednie przelozenie na uzycie przedmiotu tych badan w medycynie. Wobec tego, synteza nowych pochodnych opartych na nowych szkieletach, które wykazuja specyficzne wlasnosci jest dzialaniem potrzebnym i pozadanym. Celem twórców niniejszego wynalazku stalo sie opracowanie pochodnej pirydo[2,3-d]pirymidyny o korzystnych wlasnosciach spektroskopowych. Dotychczasowe doniesienia o zwiazkach opartych na szkielecie pirydo[2,3- d]pirymidyny dotycza jedynie ich zastosowania w zakresie hamowania aktywnosci kinaz bialkowych takich jak FGFR4 czy tez bialek mTOR i Akt odpowiedzialnych za procesy przezycia komórek. Zwiazki takie sa opisane w dokumentach patentowych: US10618902, US2008194546, WO2007/060404. Zaden z nich nie dotyczy mozliwosci wykorzystania zwiazków zawierajacych szkielet pirydo[2,3-d]piryrnidyny z dolaczonym l-chloro-2- (metylosulfanylo )benzenem do barwienia struktur komórkowych lub wykorzystania w diagnostyce chorób nowotworowych. Istote niniejszego wynalazku stanowi 4-[(2-chlorofenylo)sulfanylo]-2-[(E)- 2-(2-metoksyfenylo )etenylo ]pirydo[2,3-d]pirymidyna, o postaci chemicznej przedstawionej wzorem 1, bedaca pochodna pirydo[2,3-d]pirymidyny. Istote wynalazku stanowi takze zastosowanie 4-[(2- chlorofenylo)sulfanylo]-2-[(E)-2-(2-metoksyfenylo)etenylo]pirydo[2,3- d]pirymidyny przedstawionej wzorem 1 jako barwnika fluorescencyjnego do barwienia biologicznych struktur komórkowych, przy czym stosuje sie ja, to jest podaje do komórek, w pozywce hodowlanej umozliwiajacej przezycie komórek, po uprzednim rozpuszczeniu w rozpuszczalniku. Korzystnie, w roztworze gotowym do podania do komórek, stezenie rozpuszczalnika w pozywce hodowlanej nie przekracza 0,3%. PL 444568 A1 4/20Korzystnie, 4-[ (2-chlorofen y Io )sulfony Io ]-2-[ (E )-2-(2- metoksyfen y lo )eteny lo ]pirydo [2,3-d ]pirymidyne przedstawiona wzorem I stosuje sie rozpuszczona w dimetylosulfotlenku (DMSO). Korzystnie, jako pozywke hodowlana stosuje sie pozywke Dulbecco's Modified Eagle Medium - DMEM. Korzystnie, 4-[ (2-chlorofen y Io )sulfony Io ]-2-[ (E )-2-(2- metoksyfen y Io )eteny Io ]pirydo [2,3-d ]pirymidyne przedstawi ona wzorem I stosuje sie jako barwnik fluorescencyjny do barwienia bloniastych struktur komórkowych. Korzystnie, 4-[ (2-chlorofen y Io )sulfony Io ]-2-[ (E )-2-(2- metoksyfen y Io )eteny Io ]pirydo [2,3-d ]pirymidyne przedstawi ona wzorem I stosuje sie jako barwnik fluorescencyjny do barwienia bloniastych struktur komórkowych nowotworów nablonkowych pluc. Korzystnie, 4-[ (2-chlorofen y Io )sulfony Io ]-2-[ (E )-2-(2- metoksyfen y lo )eteny Io ]pirydo[2,3-d]pirymidyne przedstawiona wzorem I stosuje sie jako barwnik fluorescencyjny do barwienia bloniastych struktur komórkowych nowotworów mózgu. Nowo zsyntezowana pochodna pirydo[2,3-d]pirymidyny zostala scharakteryzowana pod katem widm absorbcji i emisji. Prezentowane w przykladzie I dane wskazuja, iz przedmiot niniejszego wynalazku wykazuje dwa pasma absorbcji w zakresie 300-360 nm oraz fluorescencje w zakresie 464 nm. Duze przesuniecie Stokesa (powyzej 110 nm) oraz wysoka intensywnosc fluorescencji zakwalifikowaly prezentowana pochodna do badan komórkowych dotyczacych obrazowania. Zwiazek ten moze byc stosowany zgodnie z wynalazkiem w postaci farmaceutycznie dostepnych preparatów, takich jak roztwory rozpuszczone w korzystnym dla komórek rozpuszczalniku. Takim rozpuszczalnikiem moze byc dimetylosulfotlenek (DMSO) lub etanol. Jednakze, przy przygotowaniu roztworu gotowego do podania do ukladu komórkowego nalezy uwzglednic bezpieczna dawke rozpuszczalnika, która nie powinna przekraczac 0,3% objetosci pozywki hodowlanej gotowej do podania do ukladu PL 444568 A1 /20komórkowego. Z przeprowadzonych testów biologicznych wynika, ze badana pochodna pirydo(2,3-d )pirymidyny tj. 4-[ (2-chlorofen y Io) sulfan y Io ]-2-[ (E )-2-(2- metoksyfen y lo )eteny lo ]pirydo [2,3-d ]pirymidyna wykazuje brak badz znikoma cytotoksycznosc wzgledem kilku linii komórek nowotworowych. Inkubacja pochodnej wedlug wynalazku z testowanymi liniami komórkowymi nie wplywala znaczaco na spadek zywotnosci tych komórek co zostalo potwierdzone ocena morfologii komórek, jak równiez znacznie wydluzonym (do 72 godzin) czasem inkubacji w stosunku do czasu eksperymentu obrazowania, który wynosil 2 godziny. W typowej procedurze barwienia, po 2-godzinnym czasie inkubacji zwiazku, komórki linii A549 (nowotwór pluca), oraz komórki linii U251, LN-18 i LN-229 (nowotwory mózgu) zostaly poddane obserwacji z zastosowaniem techniki mikroskopii fluorescencyjnej. Zwykle obrazy powstale w wyniku uzycia tych metod, mozna rejestrowac przy uzyciu kamery CCD. Przedstawione obrazy w przykladach niniejszego wynalazku wskazuja na intensywna zielona fluorescencje obszarów bloniastych komórki. Dodatkowo, ten specyficzny mechanizm powinowactwa zwiazku do komórkowych struktur bloniastych, jakie wystepuja w mitochondriach oraz lizosomach potwierdzilo przeprowadzone kontrbarwienie 4-[ (2-chlorofen y Io) sulfony Io ]-2-[ (E )-2-(2- metoksyfen y Io )eteny Io ]pirydo [2,3-d ]pirymidyny z zastosowaniem komercyjnych barwników dedykowanych poszczególnym organellom. Warunkiem stosowania tej metody jest rózna dlugosc fali promieniowania wzbudzajacego oraz emitowanego badanego zwiazku i stosowanego komercyjnie dostepnego barwnika. Pochodna wedlug wynalazku mozna otrzymac z wykorzystaniem metod znanych ze stanu techniki, na przyklad z wykorzystaniem procedury syntezy, opisanej w publikacjach: Mularski J, Malarz K, Pacholczyk M, Musiol R., Eur J Med Chem. 2019, 163, 610-625 oraz Malarz K, Mularski J, Kuczak M, Mrozek-Wilczkiewicz A, Musiol R., Cancers 2021, 13, 1790 z modyfikacjami. Ponizej przedstawiono rozwiazania wedlug wynalazku, które maja charakter przykladowy. W przykladzie 1 przedstawiono postac chemiczna otrzymanej pochodnej pirydo[2,3-d]pirymidyny, tj. 4-[ (2-chlorofenylo )sulfanylo ]- 2-[ (E)-2-(2-metoksyfen y Io )eteny Io ]pirydo [2,3-d ]pirymidyny ( oznaczenie kodowe PL 444568 A1 6/20zwiazku: ET-06) oraz przykladowy sposób jej otrzymywania. Dodatkowo przedstawiono wlasciwosci spektroskopowe pochodnej wedlug wynalazku, które sa istotne przy jej zastosowaniu. Ponadto, przedstawiono przykladowe widma absorpcji i emisji 4-[ (2-chlorofen y Io) sulfan y Io ]-2-[ (E)-2-(2- metoksyfen y lo )eteny Io ]pirydo[2,3-d]pirymidyny wedlug wynalazku. W skazano takze wlasciwosci spektroskopowe 4-[ (2-chlorofen y Io) sulfan y Io ]-2-[ (E )-2-(2- metoksyfen y lo )eteny lo ]pirydo [2,3-d ]pirymidyny w zaleznosci od stosowanego rozpuszczalnika. Dodatkowo przedstawiono cytotoksycznosc badanej pochodnej ET-06 wobec róznych typów komórek nowotworowych. W przykladach od 2 do 4 przedstawi ono mozliwosc zastosowania 4-[ (2-chlorofen y Io) sulfan y Io ]-2-[ (E)-2-(2- metoksyfen y Io )eteny Io ]pirydo [2,3-d ]pirymidyny w barwieniu biologicznych struktur komórkowych. Przyklad 1 4-[ (2-chlorofenylo )sulfanylo ]-2-[ (E)-2-(2-metoksyfenylo )eteny Io ]pirydo[2,3- d]pirymidyna (ET-06) o wzorze 1. Zwiazek otrzymano wedlug przykladowej metody, która polegala na tym, ze w naczyniu umieszczono (0,1 mmol, 43 mg) 2-[(E)-2-(2- metoksyfenylo )eteny Io ]pirydo[2,3-d]pirymidino-4-ylo-4-metylobenzeno-l sulfonianu o wzorze 2 stanowiacego bezposredni prekursor ET-06, dodano chlorek metylenu - CH2Ch oraz 2-propanol (1:5 V/V; 2 mL), 2-chlorobenzeno-1-tiol (0,1 mmol; 15 mg) oraz DIPEA -N,N-diizopropyloetyloamine (0,1 mmol; 14 mg), po czym calosc mieszano ogrzewajac w temperaturze wrzenia 2-propanolu przez minut. Z roztworu wykrystalizowano zwiazek ET-06, który zbierano na lejku i rekrystalizowano z 2-propanolu (2 mL). 1 H NMR (500 MHz, DMSO) 8 9,23 (dd, J = 4,4, 1,9 Hz, lH), 8,69 (dd, J = 8,2, 1,9 Hz, lH), 7.91 (dd, J = 7,7, 1,6 Hz, lH), 7,86 - 7,78 (m, 2H), 7,74 (ddd, J = 8,1, 7,5, 1,7 Hz, lH), 7,71 (dd, J = 8,2, 4,4 Hz, lH), 7,65 (dd, J = 7,7, 1,7 Hz, lH), 7.59 (apptd, J = 7,6, 1,4 Hz, lH), 7,37 (ddd, J = 8,4, 7,3, 1,7 Hz, lH), 7,17 (d, J = 16,0 Hz, lH), 7,07 (dd, J = 8,4, 1.1 Hz, lH), 7,01 - 6,96 (m, lH), 3,87 (s, 3H). PL 444568 A1 7/20Natomiast bezposredni prekursor ET-06, to jest 2-[(E)-2-(2- metoksyfenylo )eteny Io ]pirydo[2,3-d]pirymidino-4-ylo-4-metylobenzeno-l sulfonian wytworzono uprzednio wedlug przykladowej metody, która polegala na tym, ze w naczyniu umieszczono (0,2 mmol, 56 mg) [2-[(E)-2-(2- metoksyfen y Io )eteny Io ]pirydo [2,3-d ]pirymid yno-4(3 H)-on. Dodano chlorek metylenu - CH2Ch (3 mL), DIPEA - N,N- diizopropyloetyloamine (0,3 mmol; 39 mg), TsCl - chlorek 4-metylobenzenosulfonowy (0,3 mmol, 57 mg) oraz DMAP - 4-dimetyloaminopirydyne (0,02 mmol; 3 mg). Calosc mieszano w atmosferze gazu obojetnego (w temperaturze pokojowej 20-22°C) do zaniku sygnalu pochodzacego od [2-[ (E)-2-(2-metoksyfenylo )eteny Io ]pirydo[2,3-d]pirymidyno- 4(3H)-onu. Nastepnie dokonano identyfikacji sygnalu za pomoca cienkiej warstwy TLC (CH2Ch:heksan - I: I). Zwiazek wydzielano poprzez rozdzial chromatograficzny stosujac kartridz wypelniony zelem krzemionkowym (40 - 63 µm, 60 A). 1 H NMR (500 MHz, CD2Ch) 8 9,19 (dd, J = 4.4, 2.0 Hz, lH), 8.52 (dd, J = 8,2, 2,0 Hz, lH), 8,42 (d, J = 16,1 Hz, lH), 8,29 - 8,18 (m, 2H), 7,74 (dd, J = 7,5, 1,6 Hz, lH), 7,56 (dd, J = 8,2, 4,4 Hz, lH), 7,48 - 7,40 (m, 3H), 7,36 (d, J = 16,1 Hz, lH), 7,17 - 7,04 (m, 2H), 4,07 (s, 3H). Natomiast [2-[ (E)-2-(2-metoksyfenylo )eteny Io ]pirydo[2,3-d]pirymidyno-4(3H) on, potrzebny do uzyskania bezposredniego prekursora ET-06, to jest 2-[(E)-2-(2- metoksyfenylo )eteny Io ]pirydo[2,3-d]pirymidino-4-ylo-4-metylobenzeno-l sulfonianu otrzymano w wyniku nastepujacej przykladowej trzyetapowej syntezy: 1) Najpierw przeprowadzono reakcje kwasu 2-aminonikotynowego z nadmiarem stechiometrycznym bezwodnika octowego (50 ekwiwalentów molowych), w temperaturze 80°C w reaktorze mikrofalowym - o mocy 80 W. Wynikiem reakcji jest 2-metylo-4H-pirydo[2,3-d][l,3]oksazyn-4-on. 1 H NMR (500 MHz, DMSO) 8 8,96 (dd, J = 4,7, 2,0 Hz, lH), 8.50 (dd, J = 7,8, 2,0 Hz, lH), 7,61 (dd, J = 7,8, 4,7 Hz, lH), 2,45 (s, 4H); Surowy produkt wydzielono poprzez filtracje. 2) 2-metylo-4H-pirydo[2,3-d][l,3]oksazyn-4-on (8 g) wymieszano z 40 mL wodnego roztworu amoniaku (32%) w temperaturze pokojowej (20-22°C) do calkowitego rozpuszczenia sie osadu. Nasycanie roztworu reakcyjnego PL 444568 A1 8/20dwutlenkiem wegla powoduje precypitacje produktu 2-metylopirydo[2,3- d]pirymidin-4(3H)-onu, który zebrano na lejku filtracyjnym i przemyto 2-propanolem - otrzymujac chinazolon z wydajnoscia 40%. Reakcja zostala sprawdzona w skali 50 mmol; 1 H NMR (500 MHz, DMSO) 8 12,48 (s, IH), 8,90 (dd, J = 4,6, 2,1 Hz, lH), 8,45 (dd, J = 7,8, 2,1 Hz, lH), 7,48 (dd, J = 7,8, 4,6 Hz, lH), 2,40 (s, 3H); 3) W trzecim etapie przeprowadzono reakcje 2-metylopirydo[2,3-d]pirymidin- 4(3H)-onu z aldehydem 2-metoksysalicylowym w kwasie octowym (przykladowo stosowano taka ilosc, aby nie przekroczyc 2 M stezenia substratu). Reakcje mozna prowadzic stosujac reaktor mikrofalowy (130°C, 80 W, 120 minut) lub na lazni olejowej (130°C, 12 h). Produkt krystalizowal z medium reakcyjnego z wydajnoscia 45%. 1 H NMR (500 MHz, DMSO) 8 12,62 (s, IH), 8,93 (dd, J = 4,5, 2,1 Hz, lH), 8,46 (dd, J = 7,8, 2,1 Hz, lH), 8,29 (d, J = 16,0 Hz, lH), 7.64 (dd, J = 7,7, 1,7 Hz, lH), 7.47 (dd, J = 7,8, 4,6 Hz, lH), 7.44 (ddd, J = 8,8, 7,4, 1,7 Hz, lH), 7,16 - 7,09 (m, 2H), 7,06 (appt, J = 7,5, lH), 3,93 (s, 3H). Wlasciwosci spektroskopowe 4-[(2-chlorofenylo )sulfanylo ]-2-[ (E)-2-(2- metoksyf enylo )etenylo ]pirydo[2,3-d]pirymidyny. W tabeli nr 1 przedstawiono zbiór najwazniej szych parametrów spektroskopowych 4-[ (2-chlorofenylo )sulfanylo ]-2-[ (E)-2-(2-metoksyfenylo )eteny Io ]pirydo[2,3- d]pirymidyny w chloroformie jako najkorzystniejszym rozpuszczalniku do badan wlasciwosci spektroskopowych. Parametry te potwierdzaja przydatnosc wskazanej pochodnej z przykladu I do barwienia biologicznych struktur komórkowych. Zgodnie z przedstawionymi danymi mozna zaobserwowac, ze badana pochodna ET-06 wykazuje dwa pasma absorbcji (306 nm oraz 353 nm) oraz maksimum fluorescencji w zakresie dlugosci fali 464 nm, co odpowiada barwie zielonej. Zwiazek ET-06 cechuje takze wysoka intensywnosc fluorescencji (dla badanego stezenia 5*10/\-5 M) oraz duze przesuniecie Stokesa (11 I nm). Wskazane parametry spektroskopowe sa szczególnie korzystne i istotne w zakresie uzyskania wysokiego sygnalu fluorescencji w stosunku do tla, co jest gwarantem otrzymania PL 444568 A1 9/20najwyzszej jakosci obrazów mikroskopowych. Z kolei, te cechy sa szczególnie wazne dla wskazanego zastosowania w niniejszym wynalazku. Przykladowe widma absorpcji i emisji 4-[(2-chlorofenylo)sulfanylo]-2-[(E)-2- (2-metoksyf enylo )etenylo ]pirydo[2,3-d]pirymidyny. Widma absorpcji dla pochodnej ET-06 w chloroformie (przedstawione na Fig. 4). Widma emisji (wzbudzenie 353 nm) dla pochodnej ET-06 w chloroformie (przedstawione na Fig. 5). Prezentowane widma absorpcji i fluorescencji potwierdzaja korzystne wlasnosci spektroskopowe pochodnej ET-06, a takze potwierdzaja przydatnosc wskazanej pochodnej do barwienia biologicznych struktur komórkowych. Na wszystkich prezentowanych widmach widoczna jest zaleznosc intensywnosci polozenia pasm absorpcji oraz fluorescencji od badanego stezenia zwiazku. Co wazne, zastosowanie prezentowanej pochodnej ET-06 w niskim stezeniu: 6,25*10/\-6 M nadal potwierdza wysoka intensywnosc fluorescencji (powyzej 1000). W zwiazku z tym, tak korzystne parametry spektroskopowe zakwalifikowaly zwiazek do dalszych badan komórkowych. Wlasciwosci spektroskopowe 4-[ (2-chlorof enylo )sulfanylo ]-2-[ (E)-2-(2- metoksyf enylo )etenylo ]pirydo[2,3-d]pirymidyny w zaleznosci od stosowanego rozpuszczalnika. Tabela nr 2 przedstawia wlasciwosci solwatochromiczne 4-[(2- chlorofen y Io) sulfan y Io ]-2-[ (E )-2-(2-metoksyfen y Io )eteny Io ]pirydo [2,3- d ]pirymidyny, to jest zmiany wlasciwosci spektroskopowych zwiazku z przykladu I w zaleznosci od stosowanego rozpuszczalnika (polarnosci). Rozpuszczalniki uporzadkowane wg indeksu polarnosci (klasyfikacja Burdick & Jackson). Zgodnie z przedstawionymi danymi, pochodna ET-06 prezentuje szczególnie korzystne parametry spektroskopowe w wybranych rozpuszczalnikach, to jest w chloroformie lub DMSO. Szczególnie drugi rozpuszczalnik zgodnie z danymi literaturowymi obok etanolu i metanolu jest uwazany za korzystny z uwagi na rozpuszczenie substancji przeznaczonej do barwienia materialu zywego [Nguyen, PL 444568 A1 /20S., Nguyen, H., Truong, K., Biomed. Res. Ther. 2020, 7(7), 3855-3859 oraz Jamalzadeh, L., Ghafoori, H., Sariri, R., Rabuti, H., Nasirzade, J., Hasani, H., & Aghamaali, M. R., Avicenna J Med Biochem, 2016, 4(1), 10-33453]. Nalezy jednak zwrócic uwage, aby bezpieczna dawka wskazanego rozpuszczalnika nie przekraczala 0,3% objetosci pozywki hodowlanej gotowej do podania do ukladu komórkowego. Cytotoksycznosc badanej 4-[ (2-chlorof enylo )sulfanylo ]-2-[ (E)-2-(2- metoksyf enylo )etenylo ]pirydo[2,3-d]pirymidyny (ET-06) wobec róznych typów komórek nowotworowych. Aktywnosc antyproliferacyjna testowanego zwiazku oznaczono wobec ludzkich komórek nowotworów: mózgu linii U251, LN-18 oraz LN-229 oraz pluca linii A549. Komórki wysiewano na 96-dolkowa plytke w ilosci 5 tysiecy na dolek (po 100 µL/dolek) i inkubowano przez 24 godziny w temperaturze 37°C i 5% CO2. Po tym czasie przygotowano podawano roztwory zwiazku ET-06 (rozpuszczonych w minimalnej ilosci DMSO, tj. w taki sposób aby zawartosc DMSO nie przekraczala 0,3% objetosci pozywki hodowlanej gotowej do podania do ukladu komórkowego) w stezeniach umozliwiajacych wyznaczenie wartosci ICso. Przykladowa aplikacja zwiazku: rozpuszczenie zwiazku w DMSO celem przygotowania roztworów o nastepujacych stezeniach: 25 µM, 12,5 µM, 5 µM, 2,5 µM, I µM, 0,5 µM, 0,1 µM w pozywce hodowlanej Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), koncowa objetosc w dolkach wynosila 200 µL. Nastepnie roztwory zostaly podane komórkom i inkubowane 72 godziny. Po tym czasie przezywalnosc komórek zostala okreslona za pomoca standardowego testu MTS. Aktywnosc antyproliferacyj na badanej 4-[ (2-chlorofen y Io) sulfan y Io ]-2-[ (E )-2-(2- metoksyfen y lo )eteny Io ]pirydo[2,3-d]pirymidyny (ET-06), w postaci wyliczonych wartosci ICso przedstawiono w tabeli 3. Zgodnie z przedstawionymi wynikami, dla badanej pochodnej ET-06 nie obserwowano cytotoksycznosci wobec nowotworu nablonkowego pluc. Dodatkowo, prezentowane dane wskazuja na znikoma cytotoksycznosc pochodnej o wzorze I wobec kilku róznych typów komórek nowotworowych. W zwiazku PL 444568 A1 11/20z powyzszym, pochodna opisana wynalazkiem dobrze nadaje sie do stosowania w obrazowaniu biologicznych struktur komórkowych w stezeniu pozwalajacym osiagnac wysoki poziom fluorescencji przy jednoczesnym braku lub znikomej cytotoksycznosci. Przyklad 2 Zastosowanie 4-[ (2-chlorofenylo )sulfanylo ]-2-[ (E)-2-(2- metoksyfen y Io )eteny Io ]pirydo [2,3-d ]pirymidyny (ET-06) do barwienia bloniastych struktur komórkowych nowotworów nablonkowych pluc. Przykladowa procedura barwienia komórek ludzkiego nowotworu nablonkowego pluca linii A549. Komórki wysiano w ilosci 150 tys. (wraz z 1 mL DMEM) na wczesniej przygotowane specjalne szalki do obrazowania posiadajace powierzchnie zawierajaca szkielko nakrywkowe, a nastepnie inkubowano przez 24 godziny w 3 7°C, 5% CO2. Po tym czasie przygotowano roztwór zwiazku ET-06 (rozpuszczalnik DMSO, którego zawartosc nie przekracza 0,3% objetosci pozywki hodowlanej gotowej do podania do ukladu komórkowego ) w stezeniu 25 µM w pozywce hodowlanej Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), koncowa objetosc na szkielku wynosila 1 mL. Nastepnie roztwór zostal podany komórkom i inkubowany przez 2 godziny w 37°C, celem wnikniecia zwiazku przez blone komórkowa. Po inkubacji komórki przemywano dwukrotnie DMEM (bez FBS i czerwieni fenolowej), a nastepnie obserwowano przy pomocy mikroskopu fluorescencyjnego po wzbudzeniu filtrem DAPI, co przedstawiono na Fig. 1. Zgodnie z przedstawionym obrazem, badana pochodna wykazuje jasna, intensywna zielona fluorescencje w komórkach raka pluca. Umiejscowienie sygnalu fluorescencyjnego na obszarze komórki moze wskazywac powinowactwo do struktur bloniastych. Przyklad 3 Zastosowanie 4-[ (2-chlorofenylo )sulfanylo ]-2-[ (E)-2-(2- metoksyfen y Io )eteny Io ]pirydo [2,3-d ]pirymidyny (ET-06) do barwienia bloniastych struktur komórkowych nowotworów mózgu. PL 444568 A1 12/20Przykladowa procedura barwienia komórek ludzkiego nowotworu mózgu linii U251 oraz LN-229. Komórki wysiano w ilosci 150 tys. (wraz z I mL DMEM) na wczesniej przygotowane specjalne szalki do obrazowania posiadajace powierzchnie zawierajaca szkielko nakrywkowe, a nastepnie inkubowano przez 24 godziny w 37°C, 5% CO2. Po tym czasie przygotowano roztwór zwiazku o wzorze 1 (rozpuszczalnik DMSO, którego zawartosc nie przekracza 0,3% objetosci pozywki hodowlanej gotowej do podania do ukladu komórkowego) w stezeniu 25 µM w pozywce hodowlanej DMEM, koncowa objetosc na szkielku wynosila I mL. Nastepnie roztwór zostal podany komórkom i inkubowany przez 2 godziny w 37°C, celem wnikniecia zwiazku przez blone komórkowa. Po inkubacji komórki przemywano dwukrotnie DMEM (bez FBS i czerwieni fenolowej), a nastepnie obserwowano przy pomocy mikroskopu fluorescencyjnego po wzbudzeniu filtrem DAPI, co przedstawiono na Fig. 2A oraz Fig. 2B. Przedstawione obrazy, wyraznie wskazuja na akumulacje pochodnej ET-06 we wnetrzu komórek dwóch typów nowotworów mózgu: linii U251 (Fig. 2A) i linii LN-229 (Fig. 2B). Zgodnie z przedstawionymi danymi zwiazek charakteryzuje sie intensywna zielona fluorescencje, która moze wystepowac w obszarach bloniastych komórek. Przyklad 4 Zastosowanie pochodnej pirydo[2,3-d]pirymidyny o kodowaniu ET-06 do selektywnego barwienia zmian w bloniastych strukturach komórkowych i diagnostyki chorób nowotworowych nablonkowych pluc. Przykladowa procedura barwienia struktur komórkowych ludzkiego nowotworu nablonkowego pluca linii A549. Komórki wysiano w ilosci 150 tys. (wraz z I mL DMEM) na wczesniej przygotowane specjalne szalki do obrazowania posiadajace powierzchnie zawierajaca szkielko nakrywkowe, a nastepnie inkubowano przez 24 godziny w 37°C, 5% CO2. Po tym czasie przygotowano roztwór zwiazku o wzorze 1 (rozpuszczalnik DMSO, którego zawartosc nie przekracza 0,3% objetosci pozywki hodowlanej gotowej do podania do ukladu komórkowego) w stezeniu 25 µM w pozywce hodowlanej DMEM, koncowa objetosc na szkielku PL 444568 A1 13/20wynosila I mL. Nastepnie roztwór zostal podany komórkom i inkubowany przez 2 godziny w 37°C, celem wnikniecia zwiazku przez blone komórkowa. Po zakonczonej inkubacji komórki przeplukano dwukrotnie DMEM (bez FBS i czerwieni fenolowej), a nastepnie dodano roztwór odpowiedniego markera fluorescencyjnego, tj. barwnika do mitochondriów (przykladowe warunki barwienia: 100 nM, 30 min) lub lizosomów (przykladowe warunki barwienia: µM, 1 godzina). Zastosowane fluorofory pozwolily na specyficzne wybarwienie wybranych struktur wewnatrzkomórkowych: lizosomów oraz mitochondriów. Zastosowanie powyzszych barwników ulatwilo ocene akumulacji badanego zwiazku we wnetrzu komórek na tle wybarwionych struktur. Po uplywie wymaganego czasu inkubacji, dolki przeplukano dwukrotnie DMEM (bez FBS i czerwieni fenolowej), a nastepnie obserwowano przy pomocy mikroskopu fluorescencyjnego po wzbudzeniu filtrem o odpowiedniej dlugosci fali, co przedstawiono na Fig. 3A oraz Fig. 3B. Prezentowane dane potwierdzaja specyficzny mechanizm zwiazku i tendencje do akumulacji w komórkowych strukturach bloniastych, jakie wystepuja w mitochondriach oraz lizosomach. Nalozenie obrazów powstalych w wyniku przeprowadzonego kontrbarwienia 4-[ (2-chlorofenylo )sulfanylo ]-2-[ (E)-2-(2- metoksyfenylo )etenylo ]pirydo[2,3-d]pirymidyny (Fig. 3A) z barwnikami komercyjnie dostepnymi (dedykowanymi dla poszczególnych organelli komórkowych, tj. mitochondriów Fig. 3B) pozwala jednoznacznie stwierdzic umiejscowienie badanego zwiazku w komórce. PL 444568 A1 14/20Zastrzezenia patentowe 1. 4-[ (2-chlorofenylo )sulfanylo ]-2-[ (E)-2-(2-metoksyfenylo )eteny Io ]pirydo[2,3- d]pirymidyna, o postaci chemicznej przedstawionej wzorem 1. 2. Zastosowanie 4-[ (2-chlorofenylo )sulfanylo ]-2-[ (E)-2-(2- metoksyfen y Io )eteny Io ]pirydo [2,3-d ]pirymidyny przedstawionej wzorem 1 jako barwnika fluorescencyjnego do barwienia biologicznych struktur komórkowych, przy czym stosuje sie ja, to jest podaje do komórek, w pozywce hodowlanej umozliwiajacej przezycie komórek, po uprzednim rozpuszczeniuw rozpuszczalniku. 3. Zastosowanie wedlug zastrz. 2 znamienne tym, ze w roztworze gotowym do podania do komórek, stezenie rozpuszczalnika w pozywce hodowlanej nie przekracza 0,3%. 4. Zastosowanie wedlug zastrz. 2 do 3 znamienne tym, ze 4-[(2- chlorofenylo )sulfanylo ]-2-[ (E)-2-(2-metoksyfenylo )eteny Io ]pirydo[2,3- d]pirymidyna rozpuszczona jest w dimetylosulfotlenku. . Zastosowanie wedlug zastrz. 2 do 4 znamienne tym, ze jako pozywke hodowlana stosuje sie pozywke Dulbecco's Modified Eagle Medium - DMEM. 6. Zastosowanie wedlug któregokolwiek z zastrzezen 2 do 5 znamienne tym, ze 4-[ (2-chlorofenylo )sulfanylo ]-2-[ (E)-2-(2-metoksyfenylo )eten ylo ]pirydo[2,3- d]pirymidyne stosuje sie jako barwnik fluorescencyjny do barwienia bloniastych struktur komórkowych. 7. Zastosowanie wedlug któregokolwiek z zastrzezen 2 do 6 znamienne tym, ze 4-[ (2-chlorofenylo )sulfanylo ]-2-[ (E)-2-(2-metoksyfenylo )eten ylo ]pirydo[2,3- d]pirymidyne stosuje sie jako barwnik fluorescencyjny do barwienia bloniastych struktur komórkowych nowotworów nablonkowych pluc. 8. Zastosowanie wedlug któregokolwiek z zastrzezen 2 do 6 znamienne tym, ze 4-[ (2-chlorofenylo )sulfanylo ]-2-[ (E)-2-(2-metoksyfenylo )eten ylo ]pirydo[2,3- d]pirymidyne stosuje sie jako barwnik fluorescencyjny do barwienia bloniastych struktur komórkowych nowotworów mózgu. PL 444568 A1 /20N s ~ I Cl~ N V Wzórl 2: :N O N " I S- :-.... 11 O N o I Wzór2 Fig.1 PL 444568 A1 16/20Fig. 2A Fig. 2B ET-06 w komórkach A549 mitochondria w komórkach A549 Fig. 3A Fig. 3B PL 444568 A1 17/202,5 2,0 *10A-5 M 2,5*10A-5 M 1,25*1QA.5 M 6,25*10 11 "6M 0,0+--~~~~~~~~~~~...::...;~~~- 2ao 300 320 340 360 380 400 420 3500 3000 ,: ,s2500 :~ -~ 2000 ''-' ,(I) g 1500 ~ (I) a5 1000 :§ 500 400 Dlugosc fali (nm) Fig. 4 500 600 Dlugosc fali (nm) Fig. 5 *10"-5 M 2,5*10"-5 M 1,25*1 QA05 M 6,25*101\.-6 M 700 PL 444568 A1 18/20Tabela 1. Polozenie Zakres Maksimum Przesuniecie pasm fluorescencji Intensywnosc Zwiazek absorpcji Stokesa absorpcji fluorescencji [nm] i\max [nm] [nm] i\ [nm] ET-06 280-430 306;353 464 5584 111 Tabela 2. Polozenie Maksimum Przesuniecie pasm fluorescencji Intensywnosc Zwiazek Rozpuszczalnik Stokesa absorpcji fluorescencji A.max [nm] [nm] ;\ [nm] DMSO 306;356 498 2986 142 metanol 305;357 484 1153 127 ET-06 chloroform 306;353 464 5584 111 toluen 305;352 446 509 94 Tabela 3. Zwiazek Aktywnosc antyproliferacyjna - ICso [µM] 0251 LN-18 LN-229 A549 ET-06 15,63 ± 1,75 12,82 ± 0,94 18,91 ± 0,80 25 PL 444568 A1 19/20al. Niepodleglosci 188/192 00-950 Warszawa, skr. poczt. 203 URZAD PATENTOWY RZECZYPOSPOLITEJ POLSKIEJ tel.: (+48) 22 579 OS SS I fax: (+48) 22 579 00 01 e-mail: kontakt@uprp.gov.pl I www.uprp.gov.pl SPRAWOZDANIE O STANIE TECHNIKI DO ZGLOSZENIA NR P.444568 Klasyfikacja zgloszenia: C07D 471/04, G0lN 33/52, C09K 11/06 Podklasy w których prowadzono poszukiwania: C07D GO IN C09K Bazy komputerowe w których prowadzono poszukiwania: EPODOC WPI Caplus Registry bazy UPRP Google Kategoria dokumentu A A A Dokumenty - z podana identyfikacja PL233179 Bl (UNIWERSYTET SLASKI W KATOWICACH, PL) 30-09-2019 Barbara Czaplinska i in., ,,Acid selective pro-dye for cellular compartments", Scientific Reports 2019, 9:15304 WO2017014601 Al (SEOUL NAT UNIV R & DB FOUND, KR; I IN.) 26-01- 2017 D Dalszy ciag wykazu dokumentów na nastepnej stronie A- dokument okreslajacy ogólny stan techniki, który nie jest uwazany za posiadajacy szczególne znaczenie, E - dokument stanowiacy wczesniejsze zgloszenie lub patent, ale opublikowany w lub po dacie zgloszenia, Odniesienie do zastrz. 1-8 1-8 1-8 L - dokument, który moze poddawac w watpliwosc zastrzegane pierwszenstwo(-wa), lub przytoczony w celu ustalenia daty publikacji innego cytowanego dokumentu lub z innego szczególnego powodu, O - dokument odnoszacy sie do ujawnienia ustnego przez zastosowanie, wystawienie lub ujawnienie w inny sposób, P - dokument opublikowany przed data zgloszenia, ale pózniej niz zastrzegana data pierwszenstwa, T - dokument pózniejszy, opublikowany po dacie zgloszenia lub w dacie pierwszenstwa i niebedacy w konflikcie ze zgloszeniem, ale cytowany w celu zrozumienia zasad lub teorii lezacych u podstaw wynalazku, X - dokument o szczególnym znaczeniu; zastrzegany wynalazek nie moze byc uwazany za nowy lub nie moze byc uwazany za posiadajacy poziom wynalazczy, jezeli ten dokument brany jest pod uwage samodzielnie, Y - dokument o szczególnym znaczeniu; zastrzegany wynalazek nie moze byc uwazany za posiadajacy poziom wynalazczy, jezeli ten dokument zostanie polaczony z jednym lub kilkoma tego typu dokumentami, a takie polaczenie bedzie oczywiste dla znawcy, & - dokument nalezacy do tej samej rodziny patentowej. Sprawozdanie wykonali-a: Wioleta Swierczynska Naczelnik Wydzialu Data: .01.2024 Uwagi do zgloszenia Sprawozdanie zostalo wykonane w oparciu o zastrz. z dnia 25.04.2023 r. Podpis: /podpisano kwalifikowanym podpisem elektronicznym/ Pismo wydane w formie dokumentu elektronicznego PL 444568 A1 /20 PL