PL249265B1 - Sposób określania ryzyka raków u kobiet w zależności od stężenia cynku we krwi - Google Patents

Abstract

Przedmiotem zgłoszenia jest sposób określenia ryzyka raka, charakteryzujący się tym, że obejmuje ilościową ocenę stężenia cynku w próbce biologicznej osoby badanej, przy czym stężenie cynku wskazuje na znacząco obniżone ryzyko: rozwoju raka w przypadku występowania wysokiej wartości stężenia cynku we krwi, u kobiet poniżej 60 r.ż., zwłaszcza powyżej 6800,00 µg/l, rozwoju raka w przypadku występowania stężeń cynku we krwi, u kobiet powyżej 60 r.ż., zwłaszcza w zakresie od 5600,00 do 6000,00 µg/l.

Description

Wynalazek dotyczy sposobu określania ryzyka raków u kobiet. Opisywany wynalazek opiera się na ustaleniu, że istnieje korelacja między stężeniem cynku we krwi pełnej a ryzykiem raków u kobiet nie będących nosicielkami żadnej z mutacji założycielskich w genie BRCA1 typowych dla populacji polskiej. Prezentowany sposób powinien znaleźć zastosowanie w szeroko rozumianej diagnostyce i profilaktyce nowotworów, zwłaszcza u kobiet.

Cynk jest niezbędnym dla zdrowia mikroelementem będącym składnikiem ok. 300 enzymów (m.in. anhydrazy węglowej, dehydrogenazy jabłczanowej, mleczanowej oraz alkoholowej) (Plum LM, 2010). Jest również składnikiem tzw. palców cynkowych - domen białkowych występujących w białkach wiążących DNA. Cynk spełnia rolę ochronną przed wolnymi rodnikami, między innymi wchodząc w skład dysmutazy ponadtlenkowej (SOD). Bierze udział w procesach immunologicznych, warunkując prawidłową funkcję skóry oraz błon śluzowych, oraz w magazynowaniu i wydzielaniu insuliny z trzustki, utrzymując równowagę jonową innych mikroelementów w tym selenu, magnezu i miedzi. Niedobór cynku może powodować m.in. nieprawidłowe gojenie ran, obniżenie płodności czy problemy ze wzrokiem (Puzanowska - Tarasiewicz H, 2009). Może spełniać funkcję detoksykacyjną w stosunku do metali ciężkich. Zaobserwowano że poziom cynku ulega zmianom w komórkach nowotworowych. Prawidłowe komórki nabłonkowe prostaty akumulują cynk, zaś w komórkach rakowych poziom tego pierwiastka jest znacznie niższy (Zaichick VY, 1997). Uważa się, że cynk ma działanie przeciwnowotworowe - hamujące wzrost komórek nowotworowych i aktywujące apoptozę. Znane są badania oceniające związek między stężeniem cynku a ryzykiem raków, jednak ich wyniki nie są jednoznaczne. Dane literaturowe wykazują zarówno wyższe stężenie cynku w surowicy u osób z nowotworem (Siddiqui MK, 2006; Pasha Q, 2008; el-Ahmady 0, 1995) jak i w grupie osób zdrowych (KuoHW, 2002). Wyniki przeprowadzonych do tej pory badań sugerują również, że odpowiednia ilość cynku w diecie działa chemoprewencyjnie. Osoby, których dieta jest bogata w cynk wykazują niższe ryzyko raka płuc niż osoby stosujące dietę ubogocynkową (OR 0,71; 95% CI 0,5-0,99) (Zhou W, 2005). Również ryzyko raka jelita grubego i odbytu jest niższe przy stosowaniu diety bogatocynkowej (OR 0,86; 95% CI 0,73-1,02) (Zhang X, 2011). Natomiast suplementacja cynkiem w bardzo wysokich dawkach powyżej 100 mg/dzień (podczas gdy zalecane dzienne spożycie cynku wynosi 8 mg/dzień dla kobiet a 12 mg/dzień dla mężczyzn) odnosi odwrotny efekt, znacząco zwiększając ryzyko wystąpienia raka prostaty (OR 2,29; 95% CI 1,06-4,95, p=0,03) (Leitzmann MF, 2003). Wyniki opublikowanych dotychczas badań prospektywnych, nie wykazały wpływu stężenia cynku w surowicy na ryzyko raków (Song-Yi P, 2013; Kabuto M, 1994). Żadne z powyżej cytowanych badań nie oceniało wpływu stężenia cynku na występowanie nowotworów w zależności od wieku pacjentów.

Przedmiotem wynalazku jest sposób określania ryzyka raka charakteryzujący się tym, że obejmuje ilościową ocenę stężenia cynku w próbce krwi pobranej od badanej kobiety, przy czym stężenie cynku wskazuje na istotnie 3,3-krotnie obniżone ryzyko rozwoju raka u kobiety poniżej 60 roku życia w przypadku występowania stężenia cynku we krwi wynoszącego ponad 6800 μg/l, przy czym badaną kobietą jest pacjentka pochodzenia polskiego nie będąca nosicielką mutacji w genie BRCA1 wybranej spośród: 5382insC, C61G lub 4153delA.

Korzystnie, stężenie cynku w próbce oznacza się przez bezpośredni pomiar tego pierwiastka we krwi pełnej.

Przykład realizacji wynalazku

Grupa obserwacyjna została wybrana spośród osób, których materiał znajduje się w biobanku naszego ośrodka. Pacjenci, którzy zgłosili się w latach 2010-2016 do Onkologicznej Poradni Genetycznej przy Szpitalu Klinicznym Pomorskiego Uniwersytetu Medycznego w Szczecinie, byli zapraszani do oddania próbki krwi w celu biobankowania i podpisywali zgodę na przechowywanie i wykorzystywanie materiału w celach naukowych. Próbki krwi były pobierane w godzinach 8-14, a pacjenci byli poinformowani o konieczności bycia na czczo przez co najmniej przez 4 godziny przed pobraniem. Dla większości pacjentów próbka była pobrana tylko raz, ale w niektórych przypadkach również więcej razy przy okazji kolejnych wizyt. Próbkę krwi przechowywano w -80°C do momentu oznaczenia stężenia cynku.

W biobanku zgromadzono próbki od 33062 osób, które nigdy wcześniej przed pobraniem próbki nie chorowały na nowotwór złośliwy. Na potrzeby badania grupę 1698 osób bez mutacji w genie BRCA1 charakterystycznych dla populacji polskiej tj. 5382insC, C61G, 4153delA poddano ponad 3 letniej obserwacji. Do grupy nie włączono osób z nowotworem złośliwym rozpoznanym przed pobraniem próbki krwi. Następnie w trzech głównych ośrodkach onkologicznych w Szczecinie, sprawdzano która z osób wyjściowo zdrowych w momencie włączenia do biobanku, zachorowała. Spośród 1698 osób, w ciągu

PL 249265 Β1 ponad 3 lat obserwacji, na nowotwór złośliwy zachorowało 110 kobiet. Pozostała część grupy stanowiła grupę kontrolną badania.

Charakterystykę kohorty prospektywnej przedstawiono w tabeli poniżej (Tabela 1).

Tabela 1. Charakterystyka grupy

Cecha Chore Zdrowe fe⁸® · l iczba osób ₄ 110 osób . ' 1588 osób _: «, ;λ 6./.’Υ .

Średni wiek w momencie

55,60 lat 55,10 lat zabezpieczenia materiału i Średni okres śledzenia 7 ^: '«Μ' ^fi i ' ' 39,50 miesięcy | stanu zdrowia (fołłow-up) ‘'

[ .. . . π , j u u j

Lokalizacja narządowa raka ;	Liczba osób	Procentowy udział w całej grupie chorych
Pierś	68		61,81
Jajniki	5 6	IŁ	5,45
Jelito grube	.............τ......		4,55
Szpiczak	5	' 4,55
Macica	5		4,55
Pęcherz moczowy	- 4		3,64
Białaczka/Chłoniak	4		3,64
Tarczyca	4	3,64
Szyjka macicy	2		1,81
Nerka	2	1,81
Skóra (czerniak)	2		1,81
Endometrium	i	0,91
Płuco	1 0,91
Centralny układ nerwowy	1 ' '	0,91

Materiał

Od każdej osoby włączonej do badania pobrano próbkę krwi do pomiaru stężenia cynku.

Metoda oznaczania zawartości Zn we krwi pełnej.

1.1 Aparat

Do określenia zawartości wskazanych metali wykorzystana została technika spektrometrii mas ze wzbudzeniem w plazmie indukcyjnie sprzężonej. Do wykonania pomiaru wykorzystano spektrometr mas ELAN DRC-e (PerkinElmer) oraz NexlON 350D (PerkinElmer). Wykorzystanie ICP-MS pozwala

PL 249265 Β1 uzyskać limity detekcji <0,1 pg/L Podczas prowadzenia oznaczeń populacji nieeksponowanej zawodowo na metale i ich związki, czułość aparatury odgrywa kluczową rolę.

1.2 Przygotowanie do pomiaru

Zebrane próby krwi, zostały rozmrożone z temperatury -80°C do temperatury pokojowej, w dniu wykonywania analiz. Każda próbka została dokładnie wymieszana przy użyciu wstrząsarki lub worteksu w celu uzyskania możliwie największej homogenności materiału. Proces ten został powtórzony bezpośrednio przed pobraniem objętości krwi do rozcieńczeń z uwagi na zjawisko rozwarstwiania się krwi. Stosując możliwie najprostszą technikę, próbki krwi zostały rozcieńczone w stosunku 1:30 (50 μΙ krwi : 1450 μΙ buforu). Z uwagi na specyfikę pomiaru do rozcieńczeń zastosowano roztwór wodorotlenku tetrametyloamonowego (TMAH). Alkaliczne pH zapewnia dobrą rozpuszczalność składników krwi, nie powodując tym samym precypitacji żadnej z frakcji. Dodatkowo w celu lepszej dyspersji rozpuszczonych składników krwi zastosowano dodatek niejonowego surfaktantu w postaci Trytonu Χ-100. Wykorzystanie tego związku nie tylko ułatwia rozpuszczanie m.in. białek ale także przyczynia się do szybszego wypłukiwania próbki z układu wprowadzenia spektrometru. Do korekcji efektu matrycy oraz dryfu aparatu użyty został standard wewnętrzny w postaci rodu (¹⁰⁵Rh). Do uzyskania stabilności jonów metali rozpuszczonych w roztworze zastosowany został dodatek kwasu wersenowego (EDTA). Dodatkowo, z racji zawartości związków zawierających węgiel, zastosowano dodatek butanolu do wszystkich roztworów w celu niwelacji efektu związanego ze znaczną ilością węgla w badanej próbie.

1.3 Warunki pomiaru

Wszystkie oznaczenia przeprowadzono z wykorzystaniem kwadrupolowej celi reakcyjnej spektrometru, tzw. trybie DRC (ang. Dynamie Reaction Celi) aparatu Elan DRC-e oraz NexlON 350D (PerkinElmer) z tlenem jako gazem reakcyjnym. Tlen jest gazem z wyboru dla prowadzenia oznaczeń As i Cd. W przypadku oznaczeń As, wykorzystanie tlenu pozwala na uzyskanie na drodze reakcji chemicznej stabilnego produktu w postaci jonu ⁷⁵As¹⁶O⁺. Jon ten posiada masę 91, która wolna jest od interferencji spektralnych. Rozwiązanie to zapewnia maksimum specyfiki pomiaru As. Podobne rozwiązanie dotyczy oznaczeń kadmu. W tym przypadku jednak dokonano transferu atomu tlenu na interferent a nie jak w przypadku As na pożądany jon. Najpoważniejszą interferencję w oznaczeniach ¹¹⁴Cd stanowi tlenek molibdenu ⁹⁸Mo¹⁶O. Zastosowanie tlenu pozwala na uzyskanie ditlenku molibdenu ⁹⁸Mo¹⁶O2, niwelując tym samym problem nakładania się tych dwóch mas. Obecnie jest to najbardziej czuła technika oznaczeń dla materiału biologicznego. W przypadku Zn tlen pozostaje inertny.

1.4 Walidacja pomiarów

Do walidacji pomiarów zastosowano następujące materiały referencyjne ClinCheck (Recipe, Niemcy), NIST 955c (National Institute of Standards and Technology, Stany Zjednoczone) oraz BCR 634 (European Commission, Community Bureau of Reference). Są to standardy odniesienia powszechnie stosowane w spektrometrii, pozwalające na potwierdzenie precyzji, czułości i specyfiki pomiaru.

Statystyka

Różnice w częstościach pomiędzy analizowanymi grupami oceniano przy pomocy Testu Zgodności Fishera.

Wyniki

Analiza otrzymanych wyników wykazała istotną zależność między ryzykiem raków u kobiet a stężeniem cynku we krwi.

Cynk

Kobiety poniżej 60 roku życia ze stężeniem cynku we krwi powyżej 6800 pg/l wykazują istotnie ponad 3 krotnie obniżone ryzyko rozwoju raka w porównaniu do kobiet ze stężeniami cynku poniżej 6800 pg/l (OR=3,30; p=0,036; 95% Cl: 1,03-10,8) (Tabela 2).

Tabela 2. Częstość występowania raków w zależności od stężenia cynku we krwi wśród kobiet poniżej 60 roku życia

Grupa	Zakres stężeń pg/l	Chore	Zdrowe
Π	7 -6800 ; 3 <6800 60	ł47 ’“ ΤΊ 881

PL 249265 Β1

Kobiety powyżej 60 roku życia ze stężeniem cynku we krwi zawierającym się w przedziale od 5600 do 6000 pg/l wykazują tendencję do 3 krotnie obniżonego ryzyka rozwoju raka w porównaniu do kobiet ze stężeniami cynku we krwi poza powyższym przedziałem (OR=3,00; p=0,0631; 95% Cl: 0,90-9,80) (Tabela 3).

Tabela 3. Częstość występowania raków w zależności od stężenia cynku we krwi wśród kobiet powyżej 60 roku życia

Grupa	Zakres stężeń pg/l	Chore	Zdrowe
	i Ίυι·ι·		95
.•'zrr. ·. · >!··.. ·“·'.'ί>. Π	<5600 i >-6000 ’	44	465

Literatura

El-Ahmady O, et al.: Serum copper, zinc, and iron in patients with malignant and benign pulmonary diseases. Nutrition. 1995; 11(5 Suppl):498-501.

Kabuto M, Imai H, Yonezawa C, Neriishi K, Akiba S, Kato H, Suzuki T, Land CE, Biot WJ. Prediagnostic serum selenium and zinc levels and subsequent risk of lung and stornach cancer in Japan. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 1994 Sep;3(6):465-9).

Kuo HW, et al.: Serum and tissue tracę elements in patients with breast cancer in Taiwan. Biol Tracę Elem Res. 2002 Oct;89(1 ):1-11.

Leitzmann MF, et al.: Zinc supplement use and risk of prostatę cancer. J Natl Cancer Inst. 2003 Jul 2;95(13).

Pasha Q, et al.: Statistical analysis of tracę metals in the plasma of cancer patients versus Controls. J Hazard Mater. 2008; May 30; 153(3): 1215-21.

Plum LM, et al.: The essential toxin: impact of zinc on human health, Int J Environ Res Public Health. 2010 Apr;7(4): 1342-6.

Puzanowska-Tarasiewicz H, et al.: Funkcje biologiczne wybranych pierwiastków. Cynk - składnik i aktywator enzymów.

Siddiqui MK, et al.: Comparison of some tracę elements concentration in blood, tumorfree breast and tumor tissues of women with benign and malignant breast lesions: an Indian study. Environ Int. 2006 Jul;32(5):630-7.

Song-Yi Park, Lynne R. Wilkens, J. Steven Morris, Brian E. Henderson, Laurence N. Kolonel. Serum zinc and prostatę cancer risk in a nested case-control study: the Multiethnic Cohort, Prostatę. 2013 Feb 15; 73(3):261-266.

Zaichick VY, et al.: Zinc in the human prostatę gland: normal, hyperplastic and cancerous. Int Uroi Nephrol. 1997;29(5):565-74.

Zhang X, et al.: A prospective study of intakes of zinc and heme iron and colorectal cancer risk in men and women. Cancer Causes Control. 2011 Dec;22(12): 1627-37.

Zhou W, et al.: Dietary iron, zinc, and calcium and the risk of lung cancer. Epidemiology. 2005 Nov; 16(6):772-9.

Claims (2)

1. Sposób określania ryzyka raka, znamienny tym, że obejmuje ilościową ocenę stężenia cynku w próbce krwi pobranej od badanej kobiety, przy czym stężenie cynku wskazuje na istotnie 3,3-krotnie obniżone ryzyko rozwoju raka u kobiety poniżej 60 roku życia w przypadku występowania stężenia cynku we krwi wynoszącego ponad 6800 pg/l, przy czym badaną kobietą jest pacjentka pochodzenia polskiego nie będąca nosicielką mutacji w genie BRCA1 wybranej spośród: 5382insC, C61G lub 4153delA.

2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stężenie cynku w próbce oznacza się przez bezpośredni pomiar tego pierwiastka we krwi pełnej.