PL249366B1 - Zastosowanie nanocząstek srebra jako środka fungistatycznego do ochrony roślin bobowatych (Fabaceae), szczególnie grochu siewnego (Pisum sativum L.) przed Didymella pinodes - Google Patents

Abstract

Przedmiotem zgłoszenia są nanocząstki srebra (AgNPs) pozyskane za pomocą bakterii kwasu mlekowego jako środek fungistatyczny do zastosowania w ochronie roślin bobowatych (Fabaceae), szczególnie grochu siewnego (Pisum sativum L.) przed Didymella pinodes. Nanocząstki srebra (AgNPs) pozyskane za pomocą bakterii kwasu mlekowego mają postać zawiesiny.

Description

Opis wynalazku

Wynalazek dotyczy zastosowania nanocząstek srebra jako środka fungistatycznego do ochrony roślin bobowatych (Fabaceae), szczególnie grochu siewnego (Pisum sativum L.) przed Didymella pinodes.

Rośliny z rodziny bobowatych, a szczególnie groch siewny, w fazie siewki jak i podczas pełnej wegetacji atakowane są przez patogenny grzyb Didymella pinodes, wywołujący askochytozę (zgorzelową plamistość grochu) - jedną z najgroźniejszych chorób grzybowych grochu. Objawy tej choroby pojawiają się początkowo na liściach i łodygach, później na strąkach i nasionach, prowadząc do ich niedorozwoju, przebarwień i pomarszczeń [1]. Na silnie porażonym materiale nasiennym, jak również w glebie (na pozostałościach pożniwnych), patogen może przetrwać przez wiele lat. Grzyb Mycosphaerella pinodes, stadium doskonałe - Didymella pinodes powoduje obniżenie plonu grochu nawet o ponad 30%, a w szczególnych przypadkach nawet 100%. Wykazano, że porażenie roślin w obrębie 10-12 węzłów powodowało zmniejszenie liczby nasion o 20-25% oraz zwiększało udział nasion drobnych o 14-17%, w porównaniu z plonem z roślin zdrowych. Odmiany i linie hodowlane grochu nie są odporne na tę chorobę, a poszukiwania odporniejszych genotypów dotychczas nie przyczyniło się do uzyskania odmian w pełni odpornych na askochytozę. Dlatego aktualna ochrona grochu przed tą chorobą polega na odpowiedniej agrotechnice, m.in. opóźnianiu terminu siewu, o ile pozwalają na to warunki klimatyczne, zachowaniu odpowiedniego płodozmianu i stosowaniu szeregu fungicydów. Jednak częste stosowanie tych samych fungicydów może prowadzić do wykształcania odporności przez D. pinodes, co zostało zaobserwowane w Australii [2], a same fungicydy i ich pozostałości stanowią zagrożenie dla środowiska i zdrowia zwierząt i ludzi [3].

W ostatnich latach coraz szersze zastosowanie w zwalczaniu chorobotwórczych bakterii i grzybów znajdują nanocząstki metali/tlenków metali, w tym nanocząstki srebra (ang. silver nanoparticles, AgNPs), pierwiastka znanego z antyseptycznych właściwości [4]. Bakterio- i grzybobójcze działanie AgNPs polega na: dezintegracji ściany komórkowej mikroorganizmu, zniszczeniu integralności i selektywności błony komórkowej, zakłócaniu mitochondrialnego oddychania, nadprodukcji reaktywnych form tlenu (ROS), peroksydacji lipidów, uszkodzeniach DNA, transkrypcji, translacji oraz zakłóceniach w syntezie białek (w tym enzymatycznych) i składników ściany komórkowej. Efektywność działania AgNPs wobec mikroorganizmów zależy od fizykochemicznych właściwości nanocząstek (wielkości, kształtu, stosunku powierzchni do objętości, rodzaju substancji powlekających/osłonowych, stabilności/agregacji) i ich stężenia oraz właściwości mikroorganizmów, na które działają. Istotny wpływ na toksyczność AgNPs wobec bakterii i grzybów ma też metoda ich syntezy [5, 6].

Dążenie do zmniejszenia stosowania środków chemicznych w rolnictwie i nakładów energii powoduje wzrost zainteresowania wytwarzaniem AgNPs jako potencjalnych nanopestycydów otrzymanych metodami „zielonej chemii” - m.in. za pomocą ekstraktów roślinnych oraz metabolitów produkowanych przez mikroorganizmy. Metody biologicznej syntezy AgNPs uważane są za szybkie, proste i przyjazne dla środowiska, ze względu na mniejsze zużycie związków chemicznych (w tym toksycznych) i nakładów energii w porównaniu do klasycznych metod chemicznych i fizycznych. Istotną zaletą tak wytwarzanych AgNPs jest możliwość uzyskiwania nanocząstek o wysokiej skuteczności w zwalczaniu patogennych mikroorganizmów, a jednocześnie mniej toksycznych od nanocząstek wytwarzanych chemicznie [7-9].

W ostatnich latach badane są możliwości wykorzystania różnych gatunków bakterii kwasu mlekowego (ang. lactic acid bacteria, LAB: Lactobacillus acidophilus, L. casei, L. bulgaricus, L. plantarum, L. lactis, L. ruminis, L. paracasei, L. bravis) obecnych m.in. w produktach mleczarskich, do syntezy AgNPs, co wpisuje się w ideę zrównoważonego rolnictwa [10] . Produkty metabolizmu LAB, wydzielane na zewnątrz komórek [11, 12], jak również egzo-polisacharydy kapsydu bakterii stanowią zarówno czynniki redukujące jony srebra Ag+ do Ag⁰ jak i stabilizujące powstałe nanocząstki srebra [13]. Uzyskiwane AgNPs są niewielkie (5-40 nm), sferyczne i wykazują silne działanie antybakteryjne wobec chorobotwórczych bakterii gram-dodatnich, np. Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes [14] lub gram-ujemnych, np. Klebsiella pneumoniae [11], jak też obu rodzajów bakterii [12, 15, 16]. Efekt bakteriobójczy zależy od gatunku/szczepu LAB wytwarzającego AgNPs, stężenia samych nanocząstek i gatunku bakterii, na którą oddziałują.

Niektóre AgNPs, wytwarzane za pomocą LAB, wykazują (w stężeniu od kilku do kilkudziesięciu mg/dcm³) działanie fungistatyczne wobec Pythium aphanidermatum, Fusarium oxysporum, Phytophthora parasitica [14]; Aspergillus flavus, Aspergillus ochraceus, Penicillum expansum [17]; Candidia albicans [10]; Saccharomyces cerevisiae [15]. Działanie takie w w/w pracach analizowano w badaniach in vitro w testach dołkowych na szalkach z pożywką glukozowo-ziemniaczaną (PDA) i kulturami zawiesinowymi patogennego grzyba.

Jak dotąd brakuje informacji i danych naukowych, zarówno z badań in vitro jak i z in vivo, dotyczących aktywności fungistatycznej/grzybobójczej AgNPs wytwarzanych za pomocą LAB wobec D. pinodes.

Przedmiotem wynalazku jest zastosowanie nanocząstek srebra (AgNPs) pozyskanych za pomocą bakterii kwasu mlekowego do wytwarzania środka fungistatycznego do ochrony roślin bobowatych (Fabaceae), szczególnie grochu siewnego (Pisum sativum L.) przed Didymella pinodes.

Zastosowanie według wynalazku polega na tym, że nanocząstki srebra (AgNPs) pozyskane za pomocą bakterii kwasu mlekowego stosuje się do wytwarzania środka do ochrony roślin bobowatych (Fabaceae), szczególnie grochu siewnego (Pisum sativum L.) przed Didymella pinodes w postaci wodnej zawiesiny.

Zastosowanie według wynalazku polega na przedsiewnym zaprawianiu nasion zawiesiną AgNPs, obejmującym krótkotrwałe moczenie nasion w zawiesinie AgNPs, a następnie ich wysuszenie. Zaletami zastosowania AgNPs wg wynalazku są: krótki okres zaprawiania nasion, niskie stężenie stosowanych AgNPs (do 100 ppm), wysoka skuteczność fungistatyczna środka wobec D. pinodes, zapewnienie ochrony grochu przed infekcją D. pinodes przenoszonego z materiałem nasiennym oraz brak negatywnego wpływu na parametry plonotwórcze roślin. Dodatkowo, zaprawianie nasion fungistatycznym środkiem według wynalazku, może być przeprowadzone na kilka miesięcy przed wysiewem nasion, bez szkody dla ich żywotności i wigoru. Jednak w tym przypadku niewskazane jest wydłużanie czasu moczenia nasion (do 90 minut) lub zwiększenie stężenia AgNPs (przy moczeniu przez 30-60 minut) do 150 mg/dcm³, gdyż zmiany te powodują spadek wigoru siewek.

Przedmiot wynalazku został przedstawiony w przykładach wykonania na rysunkach: fig. 1 litera A pokazuje wpływ stężenia AgNPs na liniowy wzrost D. pinodes w doświadczeniu in vitro (F - fungicyd azoksystrobina), a litera B pokazuje minimalne stężenie hamujące AgNPs wobec D. pinodes w teście z resazuryną, na fig. 2 litera A przedstawia fotografie podstawy łodygi i korzenia siewek grochu w 14 dniu od infekcji D. pinodes, a litera B - wartość indeksu porażenia siewek grochu przez D. pinodes; fig. 3 przedstawia ilość gDNA D. pinodes w tkankach zainfekowanych roślin grochu (w 21 dniu po infekcji) po zaprawianiu nasion AgNPs (A-seria 1, B-seria 2 - doświadczenie szklarniowe).

Przykład 1

Wytwarzanie nanocząstek srebra za pomocą bakterii kwasu mlekowego Lactobacillus curvatus MEVP1 [OM736187], wyizolowanych z serwatki wg metody opisanej wcześniej [18], przeprowadzono zgodnie z międzynarodowym zgłoszeniem patentowym nr EP22460029 z dnia 30.06.2022 i opisem w publikacji Railean i in. [19]. Całe ujawnienie tego wynalazku winno być traktowane jako odsyłacz literaturowy do niniejszego zgłoszenia i jest włączone do opisu przez odniesienie. Hodowlę bakterii przeprowadzono na podłożu MRS w bioreaktorze Biostat A (Sartorius Stedim Biotech, Niemcy) w temperaturze 26°C przez 48 godzin, po czym komórki bakteryjne eliminowano metodą wirowania i pożywkę pohodowlaną połączono z AgNO3 (do 5 mM końcowego stężenia) na 1 minutę i odwirowano, oddzielając supernatant (z nanocząstkami srebra) od osadu (zawierającego nanocząstki chlorku srebra). Supernatant inkubowano w ciemności w temp. 40°C przez 36 godzin w celu pełnej syntezy AgNPs. Po odwirowaniu osady parokrotnie oczyszczano z pozostałości azotanu srebra i niskocząsteczkowych metabolitów poprzez przemywanie osadu wodą i wirowanie oraz ostatecznie pięciodniową dializę (odcięcie 3 kDa, Spectrumlab, USA). Uzyskane nanocząstki srebra (bio-AgNPs) charakteryzowały się strukturą krystaliczną, obecnością tylko srebra (bez chloru), sferycznym kształtem, średnicą w zakresie 5-30 nm (24,06 ± 8,43 nm), obecnością na powierzchni związków organicznych i odpornością na aglomerację (przez 3-7 dni).

Aktywność fungi statyczną AgNPs wobec D. pinodes określono na podstawie dwóch testów. Zawiesinę AgNPs przygotowano poprzez dyspersję nanocząstek srebra w wodzie redestylowanej i poddanie jej działaniu ultradźwięków (310 W, w wodnej łaźni ultradźwiękowej, POLSONIC Pałczyński Sp. J. Warszawa, Polska) przez 30 minut bezpośrednio przed użyciem.

W pierwszym z testów - metodzie zatrutych podłoży, wykorzystano jednozarodnikowe kultury grzyba D. pinodes (szczep 165/T; NCBI: NC_029396.1) pochodzące z kolekcji Katedry Entomologii, Fitopatologii i Diagnostyki Molekularnej UWM w Olsztynie. Pobrane 6-cio milimetrowe krążki grzybni D. pinodes hodowano na pożywce PDA z dodatkiem przygotowanej zawiesiny AgNPs (do końcowego stężenia 10, 100, 150 i 200 mg/dcm³). W celu weryfikacji efektywności nanocząstek w ograniczeniu wzrostu badanego gatunku grzyba zastosowano fungicyd Amistar 250 S.C. (substancja czynna: azoksystrobina). Doświadczenie prowadzono przez 14 dni, w temperaturze 22°C, przy dostępie światła dziennego. Po 7 i 14 dniach dokonywano pomiaru wzrostu grzybni w dwóch prostopadłych kierunkach oraz określano stopień zahamowania jej wzrostu. Wykazano, że zawiesina AgNPs w stężeniach 100, 150 i 200 mg/dcm³ redukowała przyrost grzybni D. pinodes o około 50%. Wzrost stężenia AgNPs z 10 do 100 mg/dcm³ 3-krotnie zwiększał procent zahamowania wzrostu grzybni, natomiast dalsze zwiększanie stężenia nanocząstek (do 150-200 mg/dcm³) nie miało już istotnego wpływu na ten efekt co przedstawione jest na fig. 1A.

W drugim teście, dla określenia minimalnego stężenia hamującego (MIC) wytworzonego wg wynalazku środka fungistatycznego wobec D. pinodes przeprowadzono test przeżywalności z barwnikiem resazuryną (której zmiany koloru w obecności żywych komórek są następstwem ich aktywności oddechowej) na płytkach wielodołkowych. Do dołków zawierających po 100 μL płynnej pożywki glukozowo-ziemniaczanej (PDB), dodawano AgNPs do otrzymania stężeń: 500, 250, 125, 62,5, 31,25 i 15,62 mg/dcm³. Do dołków dodawano po 10 μL zarodników D. pinodes w stężeniu 2 x 106 zarodników/cm³ (gęstości określonej za pomocą hemocytometru Bruckera). Barwnik - resazurynę (Tokio Chemical Industry, Japan, CAS RN: 62758-13-8, cat. no. R0203) rozpuszczono (10 mg) w 3 mL sterylnej wody i do wszystkich dołków dodawano po 10 μL tak przygotowanego roztworu. Inkubację prowadzono przez 4 dni w temp. 22°C (dzień/noc, w warunkach laboratoryjnych). Wykazano, że wartość MIC wynosi 62,5 mg/dcm³ co przedstawiono na fig. 1B.

Przykład 2

Zastosowanie zawiesiny AgNPs do ochrony grochu przed D. pinodes polegało na namoczeniu nasion ogólnoużytkowej wąsolistnej odmiany grochu siewnego ‘Nemo’ przez 30-60 minut w zawiesinach AgNPs przygotowanych w stężeniu 50 i 100 mg/dcm³ (poniżej i powyżej wartości MIC, wykazanej w przykładzie 1, dodawanych do nasion w proporcji objętościowo-wagowej równej 1:1. Następnie zawiesinę usunięto a nasiona (bez przepłukiwania wodą) pozostawiono do wyschnięcia w temperaturze pokojowej przy naturalnym obiegu powietrza z dostępem światła dziennego, przez 48 godzin.

Wpływ zastosowania wynalazku na odporność grochu na D. pinodes analizowano w teście sztucznej infekcji na siewkach oraz podczas wegetacji roślin w uprawie wazonowej (doświadczenie szklarniowe). W pierwszym przypadku, nasiona kontrolne - bez zaprawiania oraz zaprawiane w zaprawie nasiennej (MAXIM 025 FS, Syngenta) z fludioksonilem jako substancją czynną, oraz zaprawiane zawiesinami AgNPs poddano kiełkowaniu w wilgotnych rulonach z bibuły filtracyjnej (Eurochem BDG, Tarnów, Poland) przez 5 dni (w ciemności w komorze ILW 115-T STD, Pol-Eko-Aparatura), po czym prawidłowo rozwinięte siewki umieszczono w szklanych probówkach z 10 mL wody redestylowanej tak, aby tylko korzeń był zanurzony w wodzie. Po dwóch dobach na epikotyl nanoszono zarodnikującą grzybnię D. pinodes (w stężeniu zarodników: 1 x 10⁷ CFU), siewki okryto przezroczystą folią na 24 godziny (dla odpowiedniej wilgotności dla rozwijających się grzybów) i po 14 dniach od infekcji określono stopień porażenia siewek, ich długość oraz świeżą i suchą masę. Wykazano, że siewki wyrosłe z nasion zaprawianych AgNPs wykazywały wysoką odporność na D. pinodes - wyższą, niż siewki z nasion zaprawianych fungicydem, co pokazano na fig. 2.

W drugim eksperymencie, nasiona suche, moczone w zawiesinie AgNPs w stężeniu 50 mg/dcm³ przez 1 godzinę oraz nasiona zaprawiane w zaprawie MAXIM 025 FS (z fludioksonilem jako substancją czynną) wysiano do wazonów (po 6 szt. na wazon) wypełnionych 10 litrami mieszaniny ziemi ogrodowej z prażonym piaskiem w proporcji objętościowej 2:1, na głębokość 1 cm. Na każde nasiono wysiane do wazonu wlano po 5 mL grzybni D. pinodes z zarodnikami w stężeniu 1 x 10⁷ CFU i zasypano ziemią. Po 50 dniach od infekcji dokonano oceny porażenia roślin (w tym z wykorzystaniem techniki qPCR). Rośliny uprawiano do pełnej dojrzałości (140 dni od wysiewu), po czym przeprowadzono analizy morfometryczne, uwzględniając elementy struktury plonu: wysokość roślin, wysokość osadzania pierwszego strąka, liczba strąków z rośliny, liczba nasion w strąku, liczba nasion z rośliny, masa 1000 nasion.

Najwyższy poziom infekcji (25,3%) stwierdzono w wariancie kontrolnym, w którym gleba została potraktowana zarodnikami D. pinodes, podczas gdy zaprawianie AgNPs znacząco obniżyło porażenie roślin (indeks porażenia 8,1 ± 3,4%) w stopniu zbliżonym do zaobserwowanego na roślinach wyrosłych z nasion traktowanych zaprawą nasienną (5,3 ± 1,2%). Powyższe wyniki potwierdzono metodą qPCR (fig. 3) - w kontrolnych roślinach infekowanych wykazano obecność 707,5-882,5 pg DNA D. pinodes (w obu seriach badań), podczas gdy w roślinach z nasion zaprawionych AgNPs poziom patogennego DNA był wielokrotnie niższy (96-107 pg DNA).

Pomiary wysokości dojrzałych roślin (w momencie zbioru), osadzania pierwszego strąka, liczby strąków z rośliny, liczby nasion w strąku i masy 1000 nasion nie wykazały statystycznie istotnych różnic pomiędzy roślinami kontrolnymi a rozwijającymi się z nasion zaprawianych zaprawą nasienną i środkiem fungistatycznym wg wynalazku (wodna zawiesiną AgNPs w stężeniu 50 mg/dcm³).

Literatura

1. Narayanasamy, P. 2017. Epidemiology of seed- and propagule-borne diseases. Microbial Plant Pathogens, doi: 10.1002/9781119195801, (1-51).

2. Bowness R., Gossen B.D., Chang K.-F., Goswani R., Willenborg C.J., Holtz M., Strelkov S.

2016. Sensitivity of Mycosphaerella pinodes to pyraclostrobin fungicide. Plant Dis. 100: 192-199.

3. Komarek M., Cadkova E., Chrastny V., Bordas F., Bollinger J-C. 2010. Contamination of vineyard soils with fungicides: A review of environmental and toxicological aspects. Environment International. 36: 138-151.

4. More P.R., Pandit S., Filippis A.D., Franci G., Mijakovic F, Galdiero M. 2023. Silver nanoparticles: Bactericidal and mechanistic approach against drug resistant pathogens. Microorganisms, 11: 369.

5. Cruz-Luna A.R., Cruz-Martinez H., Vasquez-López A., Medina, D.I. 2021. Metal nanoparticles as novel antifungal agents for sustainable agriculture: Current advances and future directions. J. Fungi, 7: 1033.

6. Matras E., Gorczyca A., Przemieniecki S.W., Oćwieja M. 2022 Surface properties-dependent antifungal activity of silver nanoparticles. Scientific Reports, 12: 18046.

7. Mishra S., Singh H.B. 2015. Biosynthesized silver nanoparticles as a nano weapon against phytopathogens: exploring their scope and potential in agriculture. Appl. Microbiol. Biotechnol. 99: 1097-1107.

8. Alharbi N.S., Alsubhi N.S., Felimban A.I., 2022. Green synthesis of silver nanoparticles using medicinal plants: Characterization and application. Journal of Radiation Research and Applied Sciences, 15: 109-124.

9. Naganthran A., Verasoundarapandian G., Khalid F.E., Masarudin M.J., Zulkharnain A., Nawawi N.M., Karim M., Che Abdullah C. A., Ahmad S. A. 2022. Synthesis, characterization and biomedical application of silver nanoparticles. Materials, 15: 427.

10. Syame S.M., Mansour A.S., Khalaf D.D., Ibrahim E.S., Gaber E.S. 2020. Green synthesis of silver nanoparticles using lactic acid bacteria: Assessment of antimicrobial activity. World Vet. J., 10 (4): 625-633.

11. Rajesh S., Dharanishanthi V., Kanna A.V. 2015. Antibacterial mechanism of biogenic silver nanoparticles of Lactobacillus acidophilus, Journal of Experimental Nanoscience, 10(15): 1143-1152.

12. Railean-Plugaru V., Pomastowski P., Meller K., Złoch M., Rafmska K., Buszewski B. 2017. Lactococcus lactis as a safe and inexpensive source of bioactive silver composites. Appl. Microbiol. Biotechnol. 101: 7141-7153.

13. Reyes-Escogido M.L., Meneses-Rodriguez D., Guardado-Mendoza R. 2017. Carbohydrate source affects the synthesis of silver nanoparticles by Lactobacillus plantarum 1449 and Lactobacillus ruminis 1313. IET Nanobiotechnol. 11(8): 1035-1039.

14. Sharma S., Sharma N., Kaushal N. 2022. Comparative account of biogenic synthesis of silver nanoparticles using probiotics and their antimicrobial activity against challenging pathogens. BioNanoScience 12: 833-840.

15. Railean-Plugaru V., Pomastowski P., Buszewski B. 2021. Use of Lactobacillus paracasei isolated from whey for silver nanocomposite synthesis: Antiradical and antimicrobial properties against selected pathogens. J. Dairy Sci. 104: 2480-2498.

16. Verma A.K., Kumari N., Jha A.K. 2022. Biosynthesis of silver nanoparticles using milk whey and its applications. IOSR Journal of Applied Chemistry, 15(3): 60-66.

17. Matei A., Matei S., Matei G.-M., Cogalniceanu G., Cornea C.P. 2020. Biosynthesis of silver nanoparticles mediated by culture filtrate of lactic acid bacteria, characterization and antifungal activity. EuroBiotech Journal, 4(2): 97-103.

18. Railean-Plugaru V., Pomastowski P., Buszewski B. 2017. Use of Lactobacillus paracasei isolated from the whey for silver nanocomposite synthesis: Antiradical and antimicrobial properties against selected pathogens. J. Dairy. Sci. 104: 2480-2498.

19. Railean V., Pomastowski P., Płociński T., Gloc M., Dobrucka R., Kurzydłowski K.J., Buszewski B. 2023. Consideration of a new approach to clarify the mechanism formation of AgNPs, AgNCl and AgNPs@AgNCl synthesized by biological method. DiscoverNano 18(2).

Claims (2)

1. Zastosowanie nanocząstek srebra (AgNPs), pozyskanych za pomocą kwasu mlekowego, jako środka fungistatycznego do ochrony roślin bobowatych (Fabaceae), szczególnie grochu siewnego (Pisum sativum L.) przed Didymella pinodes.

2. Zastosowanie nanocząstek srebra (AgNPs) pozyskanych za pomocą bakterii kwasu mlekowego według zastrz. 1 znamienne tym, że nanocząstki mają postać wodnej zawiesiny do zaprawiania nasion.