PL249867B1 - Sposób otrzymywania lupeolu z betuliny - Google Patents

Abstract

Przedmiotem zgłoszenia jest sposób otrzymywania lupeolu z betuliny, charakteryzującego się wieloma użytecznymi właściwościami biologicznymi, co powoduje, iż związek ten wraz ze swoimi pochodnymi znajduje zastosowanie jako składnik wielu kosmetyków pochodzenia naturalnego, a także leków o działaniu przeciwalergicznym, przeciwzapalnym oraz przeciwwirusowym. Zgłoszenie rozwiązuje problem techniczny w postaci opracowania nowego sposobu otrzymywania lupeolu z betuliny o wysokiej klasie czystości, z produktami pośrednimi nie wymagającymi izolacji.

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywania lupeolu z betuliny, charakteryzującego się wieloma użytecznymi właściwościami biologicznymi, co powoduje, iż związek ten wraz ze swoimi pochodnymi znajduje zastosowanie jako składnik wielu kosmetyków pochodzenia naturalnego, a także leków o działaniu przeciwalergicznym, przeciwzapalnym oraz przeciwwirusowym.

Betulina, o wzorze ogólnym przedstawionym na rysunku jako wzór 1, należy do triterpenów pentacyklicznych typu lupanu. W małych ilościach betulinę można wyizolować z wielu gatunków roślin, np. z kory leszczyny (Corylus avellana), z kilku gatunków olchy (Alnus) oraz z grabu (Carpinus betulus). W skali przemysłowej betulinę pozyskuje się z dwóch gatunków brzozy brodawkowej (Betula verrucosa) i omszonej (Betula pubescens).

Lupeol o wzorze ogólnym przedstawionym na rysunku jako wzór 2, to triterpenowy alkohol, będący pochodną betuliny, który w materiale roślinnym występuje zwykle w stężeniach nie przekraczających kilku procent, a jego obecności zawsze towarzyszy znaczna różnorodność podobnych strukturalnie związków.

Jak opisują autorzy publikacji Stork, G. i współautorzy, Journal of the American Chemical Society 1971,93, (19) oraz Surendra, K. i inni, Journal of the American Chemical Society 2009, 131, (39), procesy otrzymywania lupeolu przebiegają wieloetapowo z użyciem skomplikowanej aparatury i w warunkach możliwych do zastosowania jedynie na skalę laboratoryjną.

Alternatywne metody pozyskiwania lupeolu polegają na ekstrakcji z materiału roślinnego, jak opisują Das, A. i współautorzy w Antileishmanial and immunomodulatory activities of lupeol, a triterpene compound isolated from Sterculia villosa. International Journal of Antimicrobial Agents 2017, 50, (4), oraz Laghari, A. H. i współautorzy w Alhagi maurorum: A convenient source of lupeol. Industrial Crops and Products 2011, 34, (1), 1141-1145. Tego rodzaju rozwiązania znane są także z opisów patentowych takich jak, CN109180769, CZ2015670, EP1206481, WO2007121482, CN114010644, CN103626829, WO0026174, JP2023168437, CN102911245, WO2008027426, CN101967176, CN109517024 czy też PL 202948.

Jednakże relatywnie niskie stężenie lupeolu w materiale roślinnym wynoszące maksymalnie do 8-10% powoduje, że znane dotychczas procesy jego wyizolowania uznawane są za mało wydajne lub wręcz nierentowne.

W związku z powyższym, wiele prac skupia się na półsyntetycznych metodach otrzymywania lupeolu lub jego pochodnych z wykorzystaniem betuliny jako substratu. Przykładem tego są metody opisane przez Hiroya, K. i współautorów w artykule Synthesis of betulin derivatives and their protective effects against the cytotoxicity of cadmium, opublikowanym w Bioorganic & Medicinal Chemistry 2002, 10, (10) oraz Liu, S.; Xu, F.; Liu, L.; Ma, D., A convenient synthesis of Lupeol from Betulin. Industrial Crops and Products 2015, 74, 494-496, czy też Thibeault, D. i inni, Synthesis and structure-activity relationship study of cytotoxic germanicane- and lupane-type 3/>-O-monodesmosidic saponins starting from betulin. Bioorganic & Medicinal Chemistry 2007, 15. Tego typu sposoby otrzymywania lupeolu opisano także w opisach patentowych CN104744551, CN112646834, RU2270202, CN104119418, CN111454320.

Do głównych niedogodności znanych sposobów należy konieczność zastosowania toksycznych odczynników w charakterze katalizatorów lub rozpuszczalników, co w oczywisty sposób rzutuje na rentowność oraz ekologiczność całego procesu. W większości przypadków, metody te wymagają zastosowania znacznych ilości rozpuszczalników niezbędnych do preparatywnego, chromatograficznego oczyszczania poszczególnych półproduktów reakcji, co niekorzystnie wpływa na ekologię oraz ekonomię całego procesu.

Celem wynalazku było opracowanie syntezy lupeolu z betuliny eliminującego bądź ograniczającego przedstawione wyżej niedogodności.

Sposób otrzymywania lupeolu z betuliny, według wynalazku, charakteryzuje się tym, że do 3-5% roztworu betuliny w dichlorometanie, w obecności katalizatora w postaci trietyloaminy, dodawany jest chlorek acetylu w proporcji wagowej do betuliny jak 1 do 5, a po uzyskaniu klarownego roztworu świadczącego o przereagowaniu betuliny do^3,28-diocatnu betuliny, określanego jako intermediat 1, do mieszaniny reakcyjnej dodaje się izopropanol w proporcji wagowej chlorek acetylu/izopropanol jak 1 do 1, co powoduje samoczynne podniesienie temperatury mieszaniny do wrzenia, po czym, po ochłodzeniu do temperatury pokojowej. Następnie mieszaninę reakcyjną przemywa się wodą i po rozdzieleniu warstw w rozdzielaczu, warstwę organiczną suszy siarczanem magnezu i odparowuje do sucha, usuwając zarówno rozpuszczalnik, jak i powstały octan izopropylu.

Do tak uzyskanego intermediatu 1 dodaje się izopropanol oraz izopropanolan glinu w ilości wagowej betulina/izopropanol/izopropanolan glinu jak 1 do 15 do 2 otrzymując półprodukt w postaci 3-octanu betuliny, określany jako intermediat 2, który ekstrahuje się z mieszaniny reakcyjnej za pomocą dichlorometanu, po czym fazę organiczną poddaje się suszeniu z użyciem siarczanu magnezu i odparowuje 2/3 objętości roztworu, a następnie dodaje się chlorochromian pirydyny w stosunku wagowym betulina/chlorochromian pirydyny jak 1 : 1. Po zakończeniu reakcji z mieszaniny reakcyjnej odparowuje się rozpuszczalnik, zaś osad 3-acetylobetulinalu, określanego dalej jako intermediat 3, poddaje się oczyszczaniu na kolumnie chromatograficznej z żelem krzemionkowym, stosując jako eluent 95% roztwór octanu etylu w heksanie. Do tak uzyskanego osadu dodaje się wodorotlenek potasu w proporcji wagowej betulina/KOH jak 1 do 2 oraz 80% roztwór wodzianu hydrazyny w ilości wagowej do betuliny jak 1 do 2, po czym miesza się w środowisku wrzącego eteru dimetylowego glikolu dietylenowego. Po zakończeniu reakcji do mieszaniny reakcyjnej dodaje się wodę, a następnie przeprowadza się ekstrakcję lupeolu za pomocą octanu etylu, a po jego odparowaniu lupeol wytrąca się poprzez dodanie wody, odfiltrowuje i suszy w temperaturze pokojowej.

Poniżej przedstawiono szczegółowy sposób otrzymywania lupeolu z betuliny według wynalazku, poszerzony o zachodzące w nim mechanizmy reakcji, jakie uwidoczniono na schemacie 1.

W pierwszym etapie syntezy surowiec w postaci betuliny poddaje się acetylowaniu celem otrzymania 3,28-diocatnu betuliny. Reakcja prowadzona jest w środowisku dichlorometanu (DCM) w obecności trietyloaminy. W odróżnieniu od typowych metod, które wykorzystują w tej reakcji bezwodnik octowy oraz ogrzewanie lub różnego rodzaju katalizatory, w niniejszym rozwiązaniu jako czynnik acetylujący zastosowano chlorek acetylu. Po drugie, zastosowanie dichlorometanu jako medium umożliwia dogodny sposób obserwacji postępu reakcji acetylowania. Surowiec betulinowy jest słabo rozpuszczalny w DCM, natomiast intermediat 1 dobrze rozpuszcza się DCM. Zatem w początkowym stadium cechą charakterystyczną mieszaniny. reakcyjnej jest obecność zmętnienia, które ustępuje wraz z postępem reakcji acetylowania. Zakończenie reakcji acetyl owania skutkuje powstaniem klarownego roztworu. Następnie do mieszaniny reakcyjnej dodaje się izopropanol w ilości odpowiedniej do przekształcenia pozostałości nieprzereagowanego chlorku acetylu w octan izopropylu. Dodatek izopropanolu skutkuje samoistnym podniesieniem temperatury mieszaniny reakcyjnej do temperatury wrzenia dichlorometanu. Po ochłodzeniu do temperatury pokojowej mieszaninę reakcyjną przemywa się wodą. Warstwę organiczną po wysuszeniu siarczanem magnezu odparowuje się do sucha na wyparce próżniowej. Odparowanie umożliwia usunięcie zarówno rozpuszczalnika, jak i powstałego octanu izopropylu. Odzyskany dichlorometan można wykorzystać ponownie. Ponieważ reakcja acetylowania zachodzi ilościowo, otrzymany intermediat 1 (3,28-dioctan betuliny) bez dodatkowego oczyszczania poddaje się kolejnej reakcji prowadzącej do powstania intermediatu 2 (3-octanu betuliny).

Drugi etap syntezy polega na selektywnej deacetylacji intermediatu 1 za pomocą odpowiedniej ilości izopropanolanu glinu. Reakcja ta prowadzona jest w środowisku izopropanolu w temperaturze wrzenia mieszaniny. Następnie mieszaninę reakcyjną odparowuje się do sucha i do uzyskanego osadu dodaje się odpowiednią ilość wody celem wyeliminowania nadmiaru izopropanolanu glinu. Skutkuje to powstaniem w mieszaninie reakcyjnej izopropanolu oraz wodorotlenku glinu, które usuwane są z mieszaniny poprzez ekstrakcję dichlorometanem. Po ekstrakcji, fazę organiczną poddaje się suszeniu za pomocą siarczanu magnezu i ponownie odparowuje się do sucha na wyparce próżniowej. W ten sposób otrzymuje się intermediat 2, który bez dodatkowego oczyszczania poddaje się dalszej reakcji prowadzącej do otrzymania 3-acetylobetulinalu, określanego dalej jako intermediat 3. Obecny w niewielkiej ilości nieprzereagowany intermediat 1 nie stanowi przeszkody w dalszych etapach syntezy lupeolu. Warto zaznaczyć, iż istnieje na tym etapie możliwość usunięcia pozostałości intermediatu 1 przy pomocy metod chromatografii preparatywnej, jednakże nie jest to konieczne do dalszych etapów syntezy lupeolu. Odzyskany na wyparce DCM można wykorzystać ponownie.

Trzeci etap syntezy polega na łagodnym utlenieniu grupy hydroksylowej intermediatu 2 za pomocą chlorochromianu pirydyny w temperaturze pokojowej, w środowisku DCM i otrzymaniu 3-acetylobetulinalu, określanego dalej jako intermediat 3. Po zakończeniu reakcji mieszaninę reakcyjną odparowuje się do sucha, a odzyskany na wyparce DCM można wykorzystać ponownie. Uzyskany osad 3-acetylobetulinalu, poddaje się oczyszczaniu na kolumnie chromatograficznej z żelem krzemionkowym stosując jako eluent mieszaninę heksan/octan etylu. Oczyszczanie intermediatu 3 metodą chromatografii kolumnowej jest w tym przypadku niezbędne. Otrzymany roztwór odparowuje się na wyparce próżniowej do sucha uzyskując intermediat 3 w nieznacznym stopniu zanieczysz czony pozostałościami intermediatu 1, który nie stanowi przeszkody w dalszych przekształceniach chemicznych intermediatu 3. Podobnie jak w przypadku otrzymywania intermediatu 2 także i w tym przypadku istnieje możliwość usunięcia pozostałości intermediatu 1 przy pomocy metod chromatografii preparatywnej, jednakże zabieg ten nie jest konieczny do otrzymania produktu końcowego.

Ostatnim, czwartym etapem syntezy jest aminowanie redukcyjne grupy aldehydowej intermediatu 3 z jednoczesną deacetylacją grupy hydroksylowej w pozycji 3. Reakcję tę prowadzi się za pomocą mieszaniny KOH/wodzian hydrazyny w środowisku wrzącego eteru dimetylowego glikolu dietylenowego. Po zakończeniu reakcji do mieszaniny reakcyjnej dodaje się wodę, a następnie przeprowadza się ekstrakcję za pomocą octanu etylu. Następnie, octan etylu odparowuje się na wyparce próżniowej. Produkt finalny wytrąca się z pozostałości po odparowaniu octanu etylu poprzez dodanie odpowiedniej ilości wody. Wytrącony produkt odfiltrowuje się pod zmniejszonym ciśnieniem i suszy. Głównym zanieczyszczeniem obecnym w niewielkiej ilości w produkcie finalnym jest betulina będąca produktem deacetylacji niewielkich ilości intermediatu 1. Celem otrzymania lupeolu o wysokim stopniu czystości, otrzymany produkt oczyszcza się z pozostałości betuliny wielokrotnie, za pomocą preparatywnej chromatografii cieczowej.

Wynalazek rozwiązuje problem techniczny w postaci opracowania nowego sposobu otrzymywania lupeolu z betuliny o wysokiej klasie czystości, z produktami pośrednimi - intermediatami 1, 2 i 3, z których 1 i 2 nie wymagają izolacji, a więc skomplikowanych zabiegów oczyszczania z użyciem preparatywnych kolumn chromatograficznych. Rozwiązanie umożliwia odzysk znacznej ilości rozpuszczalników stosowanych w trakcie syntezy, co wpływa istotnie na ekologię procesu oraz podnosi jego rentowność. Zarówno warunki syntezy oraz właściwości wszystkich intermediatów, jak i produktu końcowego, umożliwiają ich sprawną analizę jakościową za pomocą spektroskopii IR. Eliminuje to konieczność korzystania z znacznie bardziej kosztownych i czasochłonnych metod analizy takich jak np. HPLC lub HPLC-MS.

Wynalazek został uwidoczniony w następujących przykładach wykonania.

Przykład 1

W kolbie zaopatrzonej w mieszadło umieszczono 3% roztwór betuliny w dichlorometanie w ilości zawierającej 1 g czystej betuliny do którego, mieszając, dodano trietyloaminę w ilości 0,2 g oraz 5 g chlorku acetylu. Po upływie ok. 30 minut kiedy uzyskano klarowny roztwór, dodano izopropanol w ilości 5 g i kontynuowano mieszanie do osiągnięcia temperatury pokojowej. Następnie wytrząsając, przemywano mieszaninę wodą, a odseparowaną warstwę organiczną wysuszono za pomocą siarczanu magnezu i odparowano do sucha na wyparce próżniowej, po czym dodano mieszaninę izopropanolu z izopropanolanem glinu o zawartości obydwu składników w stosunku wagowym do betuliny, odpowiednio 15 g i 2,0 g. Całość ogrzewano pod chłodnicą zwrotną przez 2 godziny, a następnie ochłodzono i odparowano izopropanol na wyparce próżniowej. Do pozostałości dodano 100 g wody i ekstrahowano trzema porcjami dichlorometanu po 30 g. Warstwy organiczne połączono, wysuszono przy pomocy siarczanu magnezu i zatężono na wyparce próżniowej do ok 1/3 objętości. Następnie do mieszaniny reakcyjnej dodano 1 g chlorochromianu pirydyny i mieszano przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej, po czym odparowano DCM, a otrzymany osad oczyszczono na kolumnie z żelem krzemionkowym stosując jako eluent 95% roztwór octanu etylu w heksanie. Osad rozpuszczono w 2 g w eteru dimetylowego glikolu dietylenowego i dodano 2 g wodorotlenku potasu oraz 2 g 80% wodzianu hydrazyny. Mieszaninę ogrzewano do wrzenia pod chłodnicą zwrotną przez 8 godzin. Po ochłodzeniu do temperatury pokojowej dodano 50 g wody i ekstrahowano trzema porcjami po 40 g octanu etylu. Warstwy organiczne połączono, wysuszono za pomocą siarczanu magnezu, odparowano octan etylu, a pozostałość rozpuszczono w wodzie. Wytrącony osad odfiltrowano i wysuszono w temperaturze pokojowej, otrzymując lupeol w postaci białego proszku.

Przykład 2

W kolbie zaopatrzonej w mieszadło umieszczono 5% roztwór betuliny w dichlorometanie w ilości zawierającej 5 g czystej betuliny, do którego mieszając, dodano trietyloaminę w ilości 1,0 g oraz 25 g chlorku acetylu. Po upływie ok. 30 minut kiedy uzyskano klarowny roztwór, dodano izopropanol w ilości 25 g i kontynuowano mieszanie do osiągnięcia temperatury pokojowej. Następnie wytrząsając, przemywano mieszaninę wodą, a odseparowaną warstwę organiczną wysuszono za pomocą siarczanu magnezu i odparowano do sucha na wyparce próżniowej, po czym dodano mieszaninę izopropanolu z izopropanolanem glinu o zawartości składników w stosunku wagowym do betuliny odpowiednio:

g i 10 g. Całość ogrzewano pod chłodnicą zwrotną przez 2 godziny, a następnie ochłodzono i odparowano izopropanol na wyparce próżniowej. Do pozostałości dodano 100 g wody i ekstrahowano trzema porcjami dichlorometanu po 30 g. Warstwy organiczne połączono, wysuszono przy pomocy siarczanu magnezu i zatężono na wyparce próżniowej do ok 1/3 objętości. Następnie do mieszaniny reakcyjnej dodano 5 g chlorochromianu pirydyny i mieszano przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej, po czym odparowano DCM, a otrzymany osad oczyszczono na kolumnie z żelem krzemionkowym stosując jako eluent 95% roztwór octanu etylu w heksanie. Osad rozpuszczono w 10 g w eteru dimetylowego glikolu dietylenowego i dodano 10 g wodorotlenku potasu oraz 10 g 80% wodzianu hydrazyny. Mieszaninę ogrzewano do wrzenia pod chłodnicą zwrotną przez 8 godzin. Po ochłodzeniu do temperatury pokojowej dodano 50 g wody i ekstrahowano trzema porcjami po 40 g octanu etylu. Warstwy organiczne połączono, wysuszono za pomocą siarczanu magnezu, odparowano octan etylu, a pozostałość rozpuszczono w wodzie. Wytrącony osad odfiltrowano i wysuszono w temperaturze pokojowej, otrzymując lupeol w postaci białego proszku.

Claims (1)

1. Sposób otrzymywania lupeolu z betuliny znamienny tym, że do 3-5% roztworu betuliny w dichlorometanie, w obecności katalizatora w postaci trietyloaminy, dodawany jest chlorek acetylu w proporcji wagowej do betuliny jak 1 do 5, a po uzyskaniu klarownego roztworu świadczącego o przereagowaniu betuliny do 3,28-diocatnu betuliny, określanego jako intermediat 1, do mieszaniny reakcyjnej dodaje się izopropanol w proporcji wagowej chlorek acetylu/izopropanol jak 1 do 1 i po samoczynnym podniesieniu temperatury mieszaniny do wrzenia, a następnie po ochłodzeniu do temperatury pokojowej, mieszaninę reakcyjną przemywa się wodą, rozdziela na warstwy w rozdzielaczu i warstwę organiczną suszy siarczanem magnezu, odparowuje do sucha, usuwając zarówno rozpuszczalnik jak i powstały octan izopropylu, a następnie do tak uzyskanego intermediatu 1 dodaje się izopropanol oraz izopropanolan glinu w ilości wagowej betulina/izopropanol/izopropanolan glinu jak 1 do 15 do 2 otrzymując półprodukt w postaci 3-octanu betuliny, określany jako intermediat 2, który ekstrahuje się z mieszaniny reakcyjnej za pomocą dichlorometanu, po czym fazę organiczną poddaje się suszeniu z użyciem siarczanu magnezu i odparowuje 2/3 objętości roztworu, a następnie dodaje się chlorochromian pirydyny w stosunku wagowym betulina/chlorochromian pirydyny jak 1 : 1, a po zakończeniu reakcji z mieszaniny reakcyjnej odparowuje się rozpuszczalnik, zaś osad 3-acetylobetulinalu, określanego dalej jako intermediat 3, poddaje się oczyszczaniu na kolumnie chromatograficznej z żelem krzemionkowym, stosując jako eluent 95% octan etylu w heksanie, po czym do tak uzyskanego osadu dodaje się wodorotlenek potasu w proporcji wagowej betulina/KOH jak 1 do 2 oraz 80% roztwór wodzianu hydrazyny w ilości wagowej do betuliny jak 1 do 2, po czym miesza się w środowisku wrzącego eteru dimetylowego glikolu dietylenowego, zaś po zakończeniu reakcji do mieszaniny reakcyjnej dodaje się wodę, a następnie przeprowadza się ekstrakcję lupeolu za pomocą octanu etylu, a po jego odparowaniu, lupeol wytrąca się poprzez dodanie wody, odfiltrowuje i suszy w temperaturze pokojowej.