Wynalazek dotyczy sposobu otrzymywania z pewnych gatunków grzybów dotychczas nie¬ znanych substancji o dzialaniu psychotropo¬ wym, psylocybiny i psylocyny. Sposób wedlug wynalazku polega na tym, ze z Psilocybe mexicana Heim albo ze sztucznie wyhodowane¬ go materialu grzybowego, otrzymanego z kul¬ tur lub biologicznych wariantów albo mutan¬ tów tego grzyba przez zaszczepianie natural¬ nych lub sztucznych pozywek i dojrzewanie tych kultur na swietle lub w ciemnosci w sta¬ lej temperaturze miedzy 18 i 27°C, ekstrahuje sie wedlug znanych metod substancje czynne a nastepnie oczyszcza, oddziela od siebie i ewentualnie uwalnia od chlorowca.Prócz tego stwierdzono, ze psylocybine i psy- locyne mozna otrzymac w stanie czystym zgodnie z wyzej przytoczonym sposobem po¬ stepowania, wychodzac z materialu grzybowego *) Wlasciciel patentu oswiadczyl, ze twórca wynalazku jest Roger Cailleux. pochodzenia naturalnego rodzajów Psilocybe, Stropharia, Conocybe, Panaeolus, Amanita lub Russula lub ze sztucznie wyhodowanego mate¬ rialu grzybowego, otrzymanego z kultur po¬ szczególnych gatunków grzybów albo ich bio¬ logicznych wariantów lub mutantów.Jest juz rzecza znana (R. Heim, Cr. hebd.Seances Acad. Sci. 242, 965 (1956)), ze szereg gatunków grzybów pochodzenia naturalnego z Meksyku, Wschodniej Syberii, Kamczatki i in¬ nych krajów Azji i Ameryki stosuje sie do celów rytualnych lub jako uzywki albo srodki oszalamiajace. Wywoluja one swoiste dzialanie na cialo, a przede wszystkim na psychike czlo¬ wieka. Przy tych, tak zwanych grzybach halu- cynacyjnych chodzi o nastepujace rodzaje: Psi¬ locybe, Stropharia, Panaeolus, Conocybe, Ama¬ nita, Russula. Dotychczas nie udalo sie jednak wyizolowac substancji czynnych ani z grzybów pochodzenia naturalnego ani z materialu grzy¬ bowego sztucznie wyhodowanego. Nie potra¬ fiono równiez wychodzac z grzybów (o wlasci-wosciach halucynacyjnych) pochodzenia natu¬ ralnego wyhodowac w laboratorium takich gatunków, w których tworzylyby sie substancje czynne w ilosci wystarczajacej do otrzymania tych cial w skali preparatywnej.Wynalazek dotyczy sposobu, wedlug którego * mozna otrzymac dotychczas nieznane substan- cje czynne gatunków grzybów halucynacyjnych, ^pfzede wszystkim Psiilocybe mexicana Heim, Psilocybe caerulescens Murrill var. Mazateco- rum Heim, P. caerulescens Murrill var. nigri- pes Heim, P. Zapotecorum Heim, P. semper- viva Heim i Cailleux, P. Aztecorum Heim, Stropharia cubensis Earle. Te substancje czyn¬ ne mozna otrzymac w stanie czystym wedlug znanych metod, albo bezposrednio z materialu grzybowego pochodzenia naturalnego albo z materialu grzybowego wyhodowanego z kul¬ tur, wywodzacych sie z naturalnych lub z sztucznych substratów, przy czym hodowle tych kultur prowadzi sie wedlug takich me¬ tod, które pozwolilyby otrzymac substancje czynne w ilosci technicznie przydatnej.Sposób postepowania jest przewaznie naste¬ pujacy: dla hodowli na naturalnych substratach sporzadza sie kompost z przefermentowanej slomy pszenicznej, mieszanki lisci i lodyg ku¬ kurydzy oraz zdzbel dzikiej trawy, który na¬ stepnie przemywa sie duza iloscia biezacej wo¬ dy, rozdrabnia w glinianej misie i sterylizuje w autoklawie. Kompost zaszczepia sie grzybnia z pierwotnych kultur i poddaje dojrzewaniu w ciagu okolo dwóch tygodni w temperaturze 24—27°C, kultury zas pokrywa sie sterylnym piaskiem i pozostawia w temperaturze 18—27°C w szklanych skrzynkach na swietle dziennym, utrzymujac przy tym stala wilgotnosc. Po czterech do pieciu tygodniach ukazuja sie owoc¬ nie: zbiory nastepuja w ciagu jednego do dwóch miesiecy od zaczecia tworzenia sie za¬ rodników.Poniewaz jednak otrzymanie na tej drodze wiekszych ilosci materialu wyjsciowego jest klopotliwe, opracowano inne metody hodowli.Stwierdzono przy tym nieoczekiwanie, ze grzy¬ by in vitro nastawione na substratach boga¬ tych w pozywke tworza zamiast grzybni z owoc¬ niami w duzej ilosci prawie wylacznie aktywna grzytfhie i czesciowo sklerocje, zas na substra¬ tach ubogich w pozywke znane owocnie. Na przyklad dla pozywki na podlozu agarowym (o zawartosci 1,5% agaru) optimum wytwarza¬ nia sie owocni lezy przy stezeniu suchej sub¬ stancji ekstraktu slodowego od 0,2—0,7%, na¬ tomiast optimum wytwarzania sie grzybni i sklerocji lezy przy stezeniu 4—10% zaleznie od gatunku grzyba.Podczas gdy do tworzenia sie owocni nie¬ zbedne jest swiatlo dzienne, stwierdzono w przeciwienstwie do tego, ze przy dojrzewa¬ niu kultur w ciemnosci zachodzi glównie ob¬ fite wytwarzanie sie sklerocji lub grzybni.Najlepsze wydajnosci aktywnego materialu grzybowego (grzybni i sklerocji) otrzymuje sie wtedy, gd^ kultury powierzchniowe nastawi sie na roztworze pozywki z ekstraktu slodo¬ wego (brzeczki piwnej lub handlowego prepa¬ ratu ekstraktu slodowego) o zawartosci 4—10% suchej substancji i gdy te kultury pozostawi sie do dojrzewania w ciemnosci w stalej tem¬ peraturze miedzy 22—26°C. Dla dobrego wzro¬ stu nalezy dodac do roztworu pozywki 0,2% agaru. W tym prawie cieklym osrodku grzyb znajduje dostateczny punkt oparcia do szybkie¬ go wytworzenia zamknietej pokrywy grzybni.Dodatek soli Fe11 jest niezbedny, oprócz tego okazuje sie, ze bardzo korzystnie wplywaja dodatki soli cynku, potasu, wapnia i magnezu, zawierajace jony azotanowe, fosforanowe i siar¬ czanowe, jak równiez ekstraktu drozdzowego lub namoku kukurydzianego.Ten sposób hodowli oznacza wielki postep techniczny, gdyz pozwala w krótszym czasie i przy mniejszyin nakladzie pracy w porówna¬ niu z hodowla na naturalnych substratach, otrzymac ponad dziesieciokrotnie wieksza wy¬ dajnosc aktywnego materialu wyjsciowego.Aktywny material grzybowy (owocnie, skle¬ rocje lub grzybnie) suszy sie ostroznie w stru¬ mieniu powietrza lub w prózni w temperaturze 20—40°C, drobno miele i dokladnie ekstrahuje woda, nizszym alkoholem alifatycznym iub mieszanina wody i rozpuszczalnika organicz¬ nego mieszajacego sie z woda. Ekstrakcje przeprowadza sie w temperaturze pokojowej.Ektrakty odparowuje sie w prózni w niskiej temperaturze, a pozostalosc odtluszcza sie ete¬ rem naftowym i ekstrahuje acetonem lub mieszanina chloroform-alkohol, w celu uwol¬ nienia jej od nieaktywnych substancji towarzy¬ szacych. Pozostale substancje balastowe oddzie¬ la sie przez rozpuszczenie pozostalosci w moz¬ liwie malej ilosci wody i powtórne wytracenie za pomoca bezwodnego etanolu albo acetonu.Przesacz odparowuje sie w prózni w niskiej temperaturze.Dalsze oczyszczanie odbywa sie na drodze chromatograficznej w kolumnie z proszkiem - 2 -celulozowym. Eluacje przeprowadza sie za po¬ moca butanolu nasyconego woda lub innego alkoholu nie mieszajacego sie z woda. Pobrane frakcje poddaje sie próbie z odczynnikiem Kellera (chlorek zelaza w kwasie octowym i stezony kwas siarkowy) na zawartosc sub¬ stancji czynnych. Frakcje wykazujace dodatnia reakcje barwna laczy sie i w razie potrzeby poddaje ponownemu rozdzieleniu na kolumnie chromatograficznej wypelnionej proszkiem celu¬ lozowym. Z chromatogramu eluuje sie strefe szybciej przesuwajaca sie, k-tórla daje czysto niebieskie zabarwienie w reakcji Kellera, i z której otrzymuje sie substancje czynna zwana „psylocyna", podczas gdy z wolniej przesuwajacej sie strefy otrzymuje sie druga, przewazajaca pod wzgledem ilosciowym sub¬ stancje czynna „psylocybine", która daje fiole¬ towa reakcje barwna.Otrzymane z kolumny juz w dosc czystej postaci substancje czynne, zawieraja chloro¬ wiec i z tego wzgledu nie krystalizuja. Dopie¬ ro na drodze obróbki chemicznej mozna usu¬ nac chlorowiec, przez co otrzymuje sie zwiazki zdolne do krystalizacji. W tym celu roztwór wodny cial czynnych traktuje sie weglem srebrowym a przesacz uwalnia sie od nadmiaru jonów srebrowych za pomoca siarkowodoru.Nastepnie przesacz zageszcza sie w prózni w niskiej temperaturze, przy czym ze stezo¬ nego roztworu krystalizuja substancje czynne.Do celów analitycznych psylocybine pod¬ daje sie ponownemu przekrystalizowaniu z me¬ tanolu lub z wody. Z wody otrzymuje sie drob¬ ne, snieznobiale igielki, z metanolu — bezbarw¬ ne szesciokatne plytki lub pryzmy, zawierajace metanol, które topia sie z rozkladem w tempe¬ raturze 195—200°C. Otrzymany zwiazek rozpu¬ szcza sie w 120 czesciach objetosciowych wrza¬ cego metanolu lub w 20 czesciach objetoscio¬ wych wrzacej wody: w wyzszych alkoholach lub w innych rozpuszczalnikach organicznych jest on bardzo trudno rozpuszczalny lub cal¬ kowicie nierozpuszczalny.Do analizy suszy sie czysta substancje w prózni w temperaturze 100°C, przy czym nastepuje ubytek ciezaru równy 10,4%. Wyniki analizy elementarnej odpowiadaja wzorowi sumarycznemu Cs2Hl704N2P (ciezar czasteczko¬ wy 284,2). Psylocybina jest zwiazkiem amfote- rycznym, optycznie nieczynnym i rozpuszcza sie latwo z wytworzeniem soli w rozcienczo¬ nych wodnych roztworach kwasów mineral¬ nych i alkaliów. Roztwór psylocybiny w 80%-g- wym roztworze wodnym etanolu reaguje slabo kwasno (pH = 5,2). Widmo ultrafioletowe w roz¬ tworze metanolowym wykazuje maksima przy 222, 267 i 290 m jjl .Do analizy psylocyne oczyszcza sie przez po¬ nowne chromatografowanie na kolumnie wy¬ pelnionej proszkiem celulozowym za pomoca nasyconego woda butanolu lub przez traktowa¬ nie kwasnym weglanem sodowym w roztworze wodnym i wytrzasanie z eterem lub innym rozpuszczalnikiem organicznym. Wyniki analizy elementarnej odpowiadaja wzorowi sumarycz¬ nemu Ci2H16N02. Psylocyna krystalizuje z me¬ tanolu lub z acetonu: jest ona umiarkowanie rozpuszczalna w wodzie a latwo rozpuszczalna w rozcienczonym kwasie. Temperatura topnie¬ nia 173—176°C (rozklad).Psylocyna charakteryzuje sie widmem ultra¬ fioletowym (w roztworze metanolowym) o mak¬ simach przy 222, 260, 267, 283 i 293 mp, oraz reakcja barwna Kellera, w której w przeci¬ wienstwie do psylocybiny daje zabarwienie czysto niebieskie.Przy wstrzykiwaniu podskórnym lub poda¬ waniu doustnym 2—8 mg psylocybiny wywoluje ona u ludzi objawiajace sie na zewnatrz po¬ czucie blogostanu, któremu towarzyszy brak pobudliwosci i apatia. Przy wyzszych dawkach wystepuja obok objawów wegetatywnych pew¬ ne dostrzegalne zmiany zewnetrzne. Omówione zwiazki moga byc stosowane do badania cho¬ rób umyslowych i psychoz róznorodnego po¬ chodzenia oraz moga byc stosowane jako sku¬ teczny srodek pomocniczy przy leczeniu psycho¬ terapeutycznym psychicznie chorych.Przyklad 1. Psylocybina i psylocyna z Psi- locybe mexicana Heim pochodzenia naturalne¬ go.Do hodowli na naturalnym substracie spo¬ rzadza sie kompost z przefermentowanej *slomy pszenicznej. Kompost przemywa~ sie duza ilos¬ cia biezacej wody, rozdrabnia w glinianej misie, sterylizuje w autoklawie, a nastepnie zaszczepia grzybnia z pierwotnych kultur i pod¬ daje dojrzewaniu w ciagu okolo 2 tygodni w temperaturze 24—27°C. Po tym czasie kul¬ tury przykrywa sie sterylnym piaskiem i pozo¬ stawia w szklanych skrzynkach na swietle dziennym w temperaturze 21—22°C. Po 4 do 5 tygodniach pojawiaja sie owocnie: zbiór na¬ stepuje w ciagu jednego do dwóch miesiecy od chwili kiedy zaczely sie tworzyc zarodniki. - 3 -Dojrzale owocnie Psylocybe mexicana * Heim suszy sie nastepnie ostroznie w strumieniu po¬ wietrza w temperaturze 30°C. 54 g wysuszo¬ nych grzybów miele sie drobno i wytrzasa jeden raz z 600 nil i trzykrotnie z 300 ml metanolu . w ciagu 1/2 godziny. Ekstrakty oczyszcza sie i odparowuje w prózni do su¬ chosci. Pozostalsc 12 g.Pozostalosc po ekstrakcji metanolem uciera sie czterokrotnie z 250 ml eteru naftowego i jeszcze i» razy ze 100 ml chloroformu z do¬ datkiem 10% alkoholu w celu usuniecia tlusz¬ czów. Nierozpuszczona jeszcze pozostalosc roz¬ puszcza sie w 10 ml wody i powoli zadaje 100 ml absolutnego alkoholu, przy czym roz¬ twór wzbogaca sie w substancje czynna. Te operacje powtarza sie jeszcze 2 lub 3 razy.Zdekantowane roztwory odparowuje sie w prózni do suchosci, ponownie rozpuszcza w me¬ tanolu i zadaje 20 g proszku celulozowego z dodatkiem 5% wody. Metanol ponownie od¬ parowuje sie w prózni a proszek celulozowy obciazony substancja czynna wprowadza sie do kolumny wypelnionej 100 g sproszkowanej ce¬ lulozy z dodatkiem 5% wody (kolumne oczysz¬ cza sie uprzednio przez przemycie butanolem nasyconym woda). Eluacje przeprowadza sie za pomoca butanolu nasyconego woda i odbie¬ ra sie frakcje po 20 ml. Pozostalosc po odpa¬ rowaniu poszczególnych frakcji poddaje sie próbie na zawartosc substancji czynnych za pomoca barwnej reakcji Kellera. W tym celu 0,25 mg próbki z pozostalosci po odparowaniu traktuje sie 2 ml odczynnika Kellera.Frakcje o dodatniej reakcji barwnej laczy sie. Bezpostaciowy piroszek rozpuszcza bie w 20 ml wody i wytrzasa z 0,5 g weglanu srebrowego. Po przesaczeniu usuwa sie z roz¬ tworu jony srebrowe za pomoca siarkowodoru a nastepnie roztwór ostroznie zageszcza sie.Ze stezonego roztworu krystalizuje psylocybina pxl postacia bezbarwnych, drobnych igiel (wy¬ dajnosc 200 mg).Psylocyne otrzymuje sie z owocni tylko w ilosciach sladowych.Psylocybine otrzymuje sie w stanie anali¬ tycznie czystym po powtórnym przekrystalizo- waniu z metanolu lub wody. Rozpuszcza sie ja w 120 czesciach wagowych wrzacego me¬ tanolu lub w 20 czesciach wagowych wody w temperaturze wrzenia. Z metanolu otrzymuje sie bezbarwne pryzmy, które topia sie w tem¬ peraturze 195—220°C z równoczesnym rozkla¬ dem.Podane wartosci odpowiadaja wedlug analizy wzorowi sumarycznemu CiaH^Oa^P^ Widmo ultrafioletowe otrzymane w metanolu wykazuje nastepujace maxima: 222 m[i , 267 m[j, i 290 m^ Nowa substancja czynna posiada charakter amfoteryczny. Rozpuszcza sie ona zarówno w rozcienczonych wodnych roztworach alka¬ liów jak równiez w wodnych roztworach kwa¬ sów. Roztwór psylocybiny w 80%-owym wod¬ nym roztworze alkoholu reaguje kwasno (pH-5,2).Przyklad II. Otrzymywanie psylocybiny i psylocyny z Stropharia cubensis Earle po¬ chodzenia naturalnego.Owocnie Stropharia cubensis Earle zebrane w Meksyku suszy sie na powietrzu, w cieniu, w temperaturze pokojowej. 24,2 g wysuszonej owocni miele sie drobno i wytrzasa sie w tem¬ peraturze pokojowej jeden raz z 300 ml i trzy razy z 150 mi metanolu w ciagu 1/2 godziny.Ekstrakty laczy sie i odparowuje w prózni do suchosci. Pozostalosc (6 g) w celu odluszczenia uciera sie czterokrotnie z 125 ml eteru nafto¬ wego a nastepnie trzykrotnie z 50 ml chloro- fcjrmu zawierajacego 10% etanolu. Nieroz¬ puszczona jeszcze reszte w ilosci okolo 5 g rozpuszcza sie w 5 ml wody i z roztworu tego wytraca sie inne substancje towarzyszace, przez powolne traktowanie 50 ml absolutnego etanolu, przy czym roztwór wzbogaca sie w substancje czynne. Oczyszczanie na tej sa¬ mej drodze powtarza sie jeszcze dwu- lub trzykrotnie. Zdekantowane roztwory laczy sie i odparowuje w prózni do suchosci. Pozosta¬ losc roztwarza sie w metanolu i traktuje 10 g proszku celulozowego z dodatkiem 5% wody.Metanol odparowuje sie w prózni a proszek celulozowy zawierajacy substancje czynna wprowadza sie na kolumne wypelniona 50 g proszku celulozowego zawierajacego 5% wody (uprzednio kolumne przemywa sie butanolem nasyconym woda). Eluacje przeprowadza sie za pomoca nasyconego Woda butanolu i od¬ biera frakcje po 10 ml. Poszczególne frakcje odparowuje sie w wysokiej prózni przy tem¬ peraturze lazni najwyzej 50CC i przeprowadza próbe na zawartosc substancji czynnych za pomoca lodowatego kwasu octowego, zawie¬ rajacego chlorek zelazowy oraz stezonego kwa¬ su siarkawego. W tym celu próbki pozostalosci po 8,85 rtig traktuje sie 2 cm3 odczynnika Kel- - 4 -lera. Frakcje czynne daja fioletowe (psylocybi- na) lub czysto niebieskie (psylocyna) zabarwie¬ nie w reakcji Kellera.Frakcje dajace dodatnia reakcje barwna o tym samym zabarwieniu laczy sie razem.Bezpostaciowy proszek otrzymany jako pozo¬ stalosc po odparowaniu powyzszych frakcji rozpuszcza sie w 2 ml wody i wytrzasa z 0,25 g weglanu srebrowego. Po przesaczeniu usuwa sie nadmiar jonów srebrowych siarkowodorem.Z roztworu zageszczonego w warunkach za¬ chowawczych krystalizuje psylocybina pod po¬ stacia bezbarwnych drobnych igiel. Otrzymuje sie 58 g krystalicznej psylocybiny, oo odpowia¬ da wydajnosci 0,24% w odniesieniu do wysu¬ szonej owocni, oraz slady psylocyny.Przyklad III. Otrzymywanie psylocybiny i psylocyny z czystych kultur Psilocybe sem- perviva Heim et Cailleux. a. Otrzymywanie szczepionki: Czyste kultury z zarodników meksykanskich grzybów kapeluszowych Psilocybe semperviva Heim et Cailleux wprowadza sie na pozywke z brzeczki piwnej i agaru. W tym celu zarod¬ niki opadajace z blaszek dojrzalej owocni chwyta sie na sterylna podstawke, wprowadza na brzeczke piwna z agarem i poddaje dojrze¬ waniu. Z tak wytworzonych kultur pierwot¬ nych otrzymuje sie w nastepujacy sposób ma¬ terial do zaszczepienia: Grzybnie przy sterylnym doplywie wody ze- skrobuje sie ostra lopatka tak, ze powstaje zawiesina zawierajaca drobne klaczki grzybni.Ta zawiesina zaszczepia sie kolbki Erlenmeye- ra, które zawieraja pozywke i wypelnienia porcelanowe w ksztalcie siodelkowatym. Naj¬ lepiej przeprowadza sie doswiadczenia w kolb- kach Erlenmeyera o pojemnosci 300 ml, za¬ wierajacych 50 g wypelnienia w ksztalcie siodelkowatym (wielkosc 1 cm, ciezar okolo 0,9 g) i 80 ml pozywki, skladajacej sie z brzecz¬ ki piwnej o zawartosci okolo 4% suchej sub¬ stancji i 0,2% agaru.Kultura dojrzewa w temperaturze 24°C, po uplywie dwóch tygodni tworzy sie na po¬ wierzchni scisla pokrywa grzybni. Cala kultu¬ re wytrzasa sie w ciagu 30 minut na wstrza- sarce obrotowej, przy czym siodelkowate wy¬ pelnienie swymi ostrymi krawedziami powoduje zmielenie grzybni. Wytwarza sie przy tym drobna zawiesina klaczków grzybni. Tak otrzymana szczepionka wystarcza do zaszcze¬ pienia 50 litrów pozywki. b. Otrzymywanie kultury: Swieza jasna brzeczke piwna bez- dodatku chmielu rozciencza sie woda do zawartosci 8% suchej substancji/ Jeden litr tego roztworu zawiera: FeS04 . 7H20 0,00417 g ZnSC4 • 7H20 0,00172 g Ca(N03)2 1,0 g KI12P04 0,0624 g MgS04 . 7H20 0,0624 g KC1 0,0312 g Agar-Agar 2,0 g Te pozywke rozlewa sie w porcjach po 1 li¬ trze do kolb penicylinowych i sterylizuje w autoklawie w ciagu 25 minut w tempera¬ turze 108CC. Po ochlodzeniu zaszczepia sie za¬ wartosc kolb za pomoca 2 ml zawiesiny, P. semperviva Heim et Cailleux. Otrzymane kultury dojrzewaja w ciemnosci w temperatu¬ rze 24—26°C. Wytwarza sie pokrywa grzybni, jak opisano pod Ilia. c. Wyodrebnienie materialu grzybowego: Po siedmiu tygodniach dojrzala kulture prze¬ sacza sie przez gaze, material grzybowy wy¬ ciska i susz^ w prózni w temperaturze 30°C.Z jednej szarzy 100 kolb penicylinowych, za¬ wierajacych 100 litrów pozywki otrzymuje sie przy zbiorze po uplywie 49 tygodni 2540 g suchego materialu, to jest 25,4 g na litr na¬ stawionej pozywki. Przesacz z kultury, który zawiera takze pewna ilosc substancji czynnych, poddaje sie obróbce w taki sam sposób jak ponizej opisany material grzybowy. d. Otrzymywanie substancji czynnych: 306 g wysuszonego materialu grzybowego poddaje sie dokladnemu sproszkowaniu i wy¬ trzasa trzykrotnie z chloroformem w ilosci po 500 ml a nastepnie trzykrotnie z chloroformem zawierajacym 10% etanolu w ilosci po 500 ml.Nieaktywne substancje towarzyszace przecho¬ dza przy tym do roztworu w ilosci 2,8 g.Wstepnie wyekstrahowany material grzybowy luguje sie wyczerpujaco jeden raz 3 litrami i trzykrotnie po 1,5 litra metanolu. Polaczone wyciagi odparowuje sie pod zmniejszonym cisnieniem do suchosci, przy czym pozostaje jasno brunatny osad w ilosci 17,5 g. W celu oddzielenia od zanieczyszczen tluszczowych roz¬ puszcza sie ten osad w 17,5 ml wody a za¬ wiesine wytrzasa jeden raz z 500 ml i dwa razy z eterem naftowym w ilosci po 250 ml.Roztwór w eterze naftowym zawiera 0,75 g nieaktywnych substancji towarzyszacych.: Po- - 5 -zostaly roztwór wodny zageszcza sie w prózni do okolo 25 ml i zadaje przy silnym miesza¬ niu 250 ml absolutnego etanolu. Roztwór za¬ wierajacy substancje czynne oddziela sie przez dekantacje od powstalego przy tym kleistego osadu. Osad ponownie rozpuszcza sie w malej ilosci wody i traktuje dziesieciokrotna iloscia absolutnego alkoholu etylowego. To oczyszcza¬ nie osadu przez stracanie powtarza sie jeszcze dwukrotnie. Roztwory laczy sie i odparowuje w prózni do suchosci. Otrzymuje sie 11,7 g pozostalosci, która zawiera calkowita ilosc substancji czynnych.Do chromatografii w kolumnie celulozowej pozostalosc rozpuszcza sie w mozliwie niewiel¬ kiej ilosci 50%-owego metanolu a otrzymany roztwór dokladnie miesza z 40 g proszku ce¬ lulozowego i suszy w prózni. Proszek celulozo¬ wy obciazony w ten sposób substancja wpro¬ wadza sie na kolumne celulozowa, której wy¬ pelnienie przygotowano przez odszlamowanie S50 g-proszku celulozowego za pomoca butanolu nasyconego woda. Chromatogram rozwija sie za pomoca butanolu nasyconego woda, przy czym oddziela sie frakcje po 100 ml i odpa¬ rowuje w wysokiej prózni przy temperaturze lazni nie przekraczajacej 50°C. Srednie frakcje (3,35 g), które daja dodatnia reakcje barwna z odczynnikiem Kellera oczyszcza sie jeszcze raz przez chromatografowanie na proszku ce¬ lulozowym.Przy rozwijaniu chromatogramu za pomoca butanolu nasyconego woda, oddziela sie frak¬ cje po 50 ml i po odparowaniu w wysokiej prózni przy temperaturze lazni najwyzej 50°C, poddaje próbie na barwna reakcje Kellera.Otrzymuje sie przy tym nastepujacy podzial: Frakcja nr. Pozostalosc Barwna reakcja mg Kellera 1 — 7 8 — 16 17 — 20 21 — 30 31 — 43 1270 87 79 1053 758 ujemna czysto niebieska ujemna fioletowa ujemna Pozostalosc z frakcji 8—16 (87 mg) dostarcza po traktowaniu weglanem srebrowym 45 mg czystej psylocyny, jak opisano w przykladzie II. Frakcje 21—30 (1053 mg) dostarczaja po traktowaniu weglanem srebrowym 765 mg czy¬ stej psylocybiny.W taki sam sposób otrzymuje sie substancje czynne z przesaczu -po kulturze. W tym celu przesacz zageszcza sie, w prózni do okolo 1/10 objetosci. Substancje towarzyszace wytraca sie za pomoca dziesieciokrotnej objetosci metano¬ lu, nastepnie odsacza sie, a roztwór odparowu¬ je w prózni do suchosci i ekstrahuje pozosta¬ losc trzy razy dziesieciokrotna iloscia metano¬ lu. Pozostalosc po odparowaniu ekstraktów me¬ tanolowych poddaje sie dalszej obróbce jak powyzej. Z 12 litrów przesaczu po kulturze otrzymuje sie 80 mg psylocybiny i 6 mg psylo¬ cyny. Ogólna wydajnosc: 845 mg psylocybiny i 51 mg psylocyny, co odpowiada zawartosci 0,28% lub 0,017% w odniesieniu do suchego \ materialu grzybowego.Przyklad IV. Otrzymanie psylocybi¬ ny i psylocyny z czystych kultur Psilocybe me- xicana Heim.W przykladzie tym podaje sie dokladny opis hodowli grzybów Psilocybe mexicana Heim in vitro w celu wytworzenia grzybni i sklerocji, jak równiez otrzymywanie czystych substan¬ cji czynnych.Swieza, pozbawiona chmielu brzeczke piwna rozciencza sie woda do zawartosci 4,0—4,5% suchej substancji. Na kazdy litr tego roztworu dodaje sie: FeS04-7H20 0,00417 g ZnS04-7H20 0,00172 g agar-agar 2,0 g Pozywke te rozlewa sie porcjami po 500 ml do kolb Fernbacha o pojemnosci 1,6 litra i ste¬ rylizuje w autoklawie w ciagu 25 minut w tem¬ peraturze 108°C. Po ochlodzeniu zaszczepia sie zawartosc kolb 2 ml zawiesiny grzyba Psilocy¬ be mexicana Heim. Szczepionke otrzymuje ( sie przez umieszczenie zarodników czystych kultur wymienionych grzybów kapeluszowych na brzeczce piwnej i agarze. Zarodniki opa¬ dajace z blaszek dojrzalej owocni, wprowadza sie na pozywke z brzeczki piwnej i agaru i poddaje dojrzewaniu. Z wytworzonych w ten sposób kultur pierwotnych mozna otrzymac szczepionke w sposób nastepujacy: grzybnie przy sterylnym doplywie wody zeskrobuje sie ostra lopatka tak, ze wytwarza sie zawiesina drobnych klaczków grzybni. Ta szczepionka zaszczepia sie umieszczona w kolbkach Erlen- meyera pozywke (w której umieszczone sa sio¬ delkowate porcelanowe ksztaltki wypelniajace).Najlepiej przeprowadza sie doswiadczenia z kolbami Erlenmeyera zawierajacymi 50 g sio¬ delkowatych ksztaltek wypelniajacych (wiel¬ kosc — 1 cm, ciezar okolo 0,9 g) i 80 ml po¬ zywki, skladajacej sie z brzeczki piwnej o za¬ wartosci 'okolo 4P/o suchej substancji i 0,^% - 6 -'agaru. W czacie dojrzewania w temperaturze 24PC, po~ uplywie 2 tygodni tworzy sie na po¬ wierzchni szczelna pokrywa grzybni. Cala ho¬ dowle wiruje sie w ciagu 30 minut na wstrza- sarce, przy czym ksztaltki siodelkowe rozdrab¬ niaja grzybnie, tak ze powstaje drobna zawie¬ sina klaczków grzybni. Tak otrzymana szcze¬ pionka wystarcza do zaszczepienia 25 litrów pozywki..Zaszczepione kultury dojrzewaja w ciemnosci w temperaturze 24—26°C. Tworzy sie przy tym juz opisana pokrywa grzybni, zacierajaca bardzo liczne sklerocje, które ogólnie biorac osiagaja wielkosc okolo 1 cm (w poszczególnych przy¬ padkach moga byc znacznie wieksze). W celu oddzielenia grzybni i sklerocjii przesacza sie czyste kultury przez gaze, sprasowuje sie i su¬ szy w suszarce w temperaturze 35—40CC. Z jednej szarzy 135 kolb Fernbadha, zawierajacych 67 li¬ trów pozywki, otrzymuje sie przy zbiorze po uplywie 62 dni 1149 g suchego materialu (sklerocji i grzybni), co odpowiada 17,14 g na lrtr nastawionej pozywki.W celu otrzymania substancji czynnych, sproszkowuje sie dokladnie na przyklad 612 g wysuszonego materialu, skladajacego sie z skie¬ rocji i grzybni i ekstrahuje 3 razy chlorofor¬ mem w ilosci po 1 litrze i jeszcze 3 razy chloro¬ formem z dodatkiem 10% etanolu w ilosci po 1 litrze. Do ekstraktu przechodzi przy tym 5,6 g nieaktywnych cial towarzyszacych. Wstepnie wyekstrahowany material grzybowy luguje sie nastepnie dokladnie metanolem (jeden raz w ilo¬ sci 6 litrów i 3 razy w ilosci 3 litrów). Polaczone wyciagi metanolowe odparowuje sie pod zmniej¬ szonym cisnieniem do suchosci i otrzymuje sie przy tym 35 g jasno brunatnej pozostalosci- Te pozostalosc w celu usuniecia zanieczyszczen tlu¬ szczowych zalewa sie 35 ml wody i wytrzasa sie jeden raz z 1 litrem i dwa razy po 0,5 libra eteru naftowego. Eter naftowy zawiera teraz 1,5 g nieaktywnych substancji towarzyszacych.Pozostaly roztwór wodny zageszcza sie uprzed¬ nio w prózni do okolo 50 ml i nastepnie silnie mieszajac zadaje 500 ml bezwodnego etanolu.Roztwór zawierajacy substancje czynne oddzie¬ la sie przez dekantacje od powstalego kleistego osadu. Osad rozpuszcza sie jeszcze raz w malej ilosci wody i ponownie traktuje dziesieciokrot¬ na iloscia bezwodnego alkoholu. Te operacje stracania powtarza sie jeszcze 2 razy. Roztwory laczy sie i odparowuje w prózni do suchosci.Otrzymuje sie stala pozostalosc w ilosci 23,4 g, która zawiera calkowita ilosc substancji czyn¬ nych.Do chromatografowania na kolumnie celulozo¬ wej rozpuszcza sie csad w mozliwie malej ilosci 50%-owego metanolu, a roztwór miesza sie do¬ kladnie z 80 g proszku celulozowego, .po czym tak otrzymany material suszy sie w prózni. Pro¬ szek celulozowy obciazony w ten sposób sub¬ stancja wprowadza sie na kolumne celulozowa, której wypelnienie przygotowano przez odszla- mowanie 700 g proszku celulozowego za pomoca butanolu nasyconego woda. Chromatogram roz¬ wija sie butanolem nasyconym woda, przy czym wydziela sie frakcje po 200 ml, które odparowuje sie w wysokiej prózni w temperaturze lazni nie przekraczajacej 50°C. Otrzymuje sie przy tym nastepujacy podzial: Frakcja nr 1-14 15-34 35-40 Tabela 1 Pozostalosc S 2,170 6,660 3,540 12,370 Reakcja barwna Kellera ujemna dodatnia - ujemna Reszta w ilosci okolo 11 g zostaje zatrzymana na kolumnie.Frakcje 15—34, które dostarczaja lacznie 6,660 g pozostalosci, zawieraja pewna ilosd substancji czynnych. W celu dalszego oczyszczenia poddaje sie je ponownie chroim&tografawaniu w sposób ponizej opisany. 6,6 g pozostalosci rozpuszcza sie w mozliwie malej ilosci metanolu, otrzymanym roztworem nasyca sie'20 g proszku celulozowe¬ go, suszy i nastepnie wprowadza na kolumne wypelniona 600 g proszku celulozowego podda¬ nego obróbce jak wyzej. Przy rozwijaniu chro^ matogramu za pomoca butanolu nasyconego wo¬ da wydziela sie frakcje po 100 ml, które po od¬ parowaniu w wysokiej prózni poddlaje sie próbie na reakcje barwna. Otrzymuje sie przy tym na¬ stepujacy podzial: Tabela 2 Frakcja nr 1- 8 9-17 18-21 22-31 32-45 Pozostalosc mg 2,950 180 155 912 1,510 Reakcja barwna Kellera ujemna czysto niebieska ujemna fioletowa ujemna """ Pozostalosc frakcji 9-17 (180 mg) dostarcza po obróbce weglanem srebrowym, jak opisano w przykladzie I, 90 mg czystej "psylocyny.Fraikcje 22—31 (tabela 2) dostarczaja po obróbce za pomoca weglanu srebrowego, opisanej w przy¬ kladzie I, 619 mg czystej psylocybiny o wlasci¬ wosciach opisanych w przykladzie I. Z przesa¬ czu po kulturach otrzymuje sie substancje czyn¬ ne w taki sam sposób jak powyzej opisano dla sklerocji. W tym celu przesacz po kulturach zageszcza sie w prózni do okolo 1/10 jego obje¬ tosci, zadaje dziesieciokrotna objetoscia meta¬ nolu, przesacza, a pozostalosc ekstrahuje 3 razy dziesieciokrotna iloscia metanolu. Pozostalosc po odparowaniu ekstraktów metanolowych prze¬ rabia sie dalej, jak opisano wyzej. Z 10 litrów przesaczu po kulturach otrzymuje sie na przy¬ klad 220 mg psylocybiny i 12 mg psylocyny.PrzykladV. Otrzymywanie psylocybiny i psy¬ locyny z czystych kultur Stropharia cubensis Earle.Pozywke przyrzadza sie nastepujaco: swieza, jasna brzeczke piwna bez dodatku chmielu roz¬ ciencza sie woda biezaca do 6% zawartosci su¬ chej substancji. Do kazdego litra tego roztworu dodaje sie: FeS04-7H20 0,0021 g ZnS04.7H20 0,0009 g Ca/N03/2 1,0 g KH2P04 0,0624 g MgS04.7H20 0,0624 g KC1 0,0312 g Agar-agar 2,0 g Pozywke te sterylizuje sie jak w przykladzie III i zaszczepia 2 ml zawiesiny grzyba Stopharia cubensis Earle na litr pozywki. Otrzymywanie tej szczepionki w zawiesinie odbywa sie tak, jak podano w przykladzie III. Po 52 dniach doj¬ rzewania w ciemnosci w temperaturze 24°C otrzymuje sie z ladunku 20 litrów 452 g suchego materialu grzybowego, to jest 22,6 g na litr po¬ zywki. Otrzymanie substancji czynnych z ma¬ terialu grzybowego przeprowadza sie w spo¬ sób opisany w przykladzie III. Wydajnosc: 1083 mg czystej krystalicznej psylocybiny i 45 mg psylocyny, co odpowiada wydajnosci 0,24% lub 0,010% w odniesieniu do suchego ma¬ terialu grzybowego.Przyklad VI. Otrzymywanie psylocybiny i psylocyny z Psilocybe semperviva Heim et Cailleux pochodzenia naturalnego.Dojrzale owocnie grzyba Psilocybe semperviva Heim et Cailleux otrzymane na drodze sztucznej hodowli ma naturalnej pozywce (kompost) suszy sie ostroznie w strumieniu powietrza w tempe¬ raturze 30°C. 32 g wysuszonej owocni miele sie drobno i wytrzasa w temperaturze pokojowej po 1/2 godziny raz z 300 ml metanolu i trzy¬ krotnie z metanolem w ilosci po 150 ml. Pola¬ czone ekstrakty odparowuje sie w prózni do suchosci. Pozostalosc (3,3 g) w celu odtluszcze¬ nia uciera sie czterokrotnie z eterem naftowym w ilosci po 125 ml i trzykrotnie z chloroformem, który zawiera 10% etanolu w ilosci po 50 ml.Otrzymuje sie 6,5 g pozostalosci, która rozpusz¬ cza sie w 6 ml wody. Roztwór ten traktuje sie powoli 60 ml bezwodnego etanolu w celu wy¬ tracenia pozostalych substancji towarzyszacych, przy czym roztwór wzbogaca sie w substancje czynne. Oczyszczanie na tej drodze powtarza sie jeszcze dwa razy. Roztwory dekantuje sie, laczy sie razem i odparowuje w prózni do suchosci.Pozostalosc rozpuszcza sie w metanolu i chro¬ matografuje na proszku celulozowym, jak to opisano w przykladzie II. Tak otrzymane ciala czynne uwalnia sie od chlorowca przez obróbke weglanem srebrowym. Po przekrystalizowaniu otrzymuje sie 160 mg krystalicznej psylocybiny i 32 mg psylocyny, co odpowiada zawartosci 0,5% lub 0,1% w odniesieniu do wysuszonego materialu grzybowego.Przyklad VII. Otrzymywanie psylocybiny z Psilocibe caerulescens Murril var. Mazatecorum Heim pochodzenia naturalnego.Dojrzale owocnie grzyba Psilocibe caerusce- lens Murrill var. Mazatecorum Heim otrzymane droga sztucznej hodowli na naturalnej pozywce (kompost), suszy sie <«stroznie, po czym wysu¬ szony material grzybowy (7,3 g) miele sie drobno i ekstrahuje dokladnie metanolem, jak opisano w przykladzie II. Ekstrakty laczy sie i odparo¬ wuje w prózni do suchosci. Otrzymana jak w przykladzie II pozostalosc poddaje sie dalszej przeróbce w celu otrzymania substancji czyn¬ nych. Otrzymuje sie 14,6 mg psylocybiny (w od¬ niesieniu do materialu grzybowego wysuszone¬ go). Z przerobionej próbki grzyba nie otrzymuje sie psylocyny.Przyklad VIII. Otrzymywanie psylocybiny z czystych kultur Psilocibe carulescens Murrill var. Mazatecorum Heim.* Srodowisko hodowlane przygotowuje sie przez rozcienczenie woda biezaca swiezej brzeczki piwnej bez dodatku chmielu do zawartosci 4,0% suchej substancji. Na kazdy litr tego roztworu dodaje sie: namoku kukurydzianego 10,0 g FeS04-7H20 0,00834 g Ca/OH/2 0,20 g K2HP04 0,20 g NH4ÓH 0,25 g Agar-agar 2,0 g - 8 -Pozywke te sterylizuje sie jak podano w przy¬ kladzie III, zaszczepia zawiesina grzybni czystej hodowli Psilócibe caerulescens Murrill var. Ma- zate-cerum Heim z Mek?yku, a wytworzone kul^ tury poddaje dojrzewaniu w ciemnosci w tem¬ peraturze 26°C. Po 48 dniach zbiega sie 20,4 g suchego materialu grzybowego na litr roztworu.Wyodrebnienie i oczyszczenie substancji czyn¬ nych z tego materialu odbywa sie tak, jak poda¬ no w przykladzie III. Wydajnosc z jednego la¬ dunki; z 10 litrów pozywki wynosi: 449 mg psy¬ iocybiny, co odpowiada zawartosci 0,23% w od¬ niesieniu do wysuszonego materialu grzybowe¬ go. W ladunku tym nie znaleziono psylocyny.Przyklad IX. Otrzymywanie psyiocybiny z Psilccibe Zapotecorum Heim pochodzenia na¬ turalnego.Dojrzale owocnie Psilccibe Zapotecorum Heim zebrane i przebrane w Meksyku w okolicach zwanych „pays chatino" ostroznie suszy sie (po¬ zostalosc 42,4 g) drobno miele i wytrzasa sie z metanolem jak podano w przykladzie II. Po¬ laczone ekstrakty metanolowe odparowuje sie w prózni do suchosci. Pozostalosc przerabia sie dalej jak podano w przykladzie II. Otrzymuje sie 212 mg czystej psyiocybiny, co odpowiada zawartosci 0,5%. Z przerobionego materialu grzybowego nie otrzymuje sie psylocyny.Przyklad X. Otrzymywanie psyiocybiny z czystych kultur Psilócibe Zapotecorum Heim.Swieza, jasna brzeczke piwna bez dodatku chmielu rozciencza sie woda biezaca do zawar¬ tosci 4,5% suchej substancji. Na kazdy litr tego roztworu dodajesie: * FeS04 namoku kukurydzianego NH4OH K2HPO4 Agar-agar pH roztworu: 5,5 To srodowisko hodowlane sterylizuje sie jak opisano w przykladzie III i zaszczepia zawiesina grzybni czystej kultury, która otrzymano z za¬ rodników dojrzalej owocni Psilócibe Zapotecorum Heim z „pays chatamo" w Meksyku. Po 57 dniach dojrzewania w ciemnosci w temperaturze 24°C otrzymuje sie z ladunku 25 litrów, 430 g wysu¬ szonego materialu grzybowego, to jest 17,2 g na litr pozywki. Otrzymywanie substancji czynnych z tego materialu odbywa sie wedlug sposobu po¬ danego w przykladzie III. Wydajnosc: 903 mg czystej psyiocybiny, co odpowiada zawartosci 0,21% w odniesieniu do suchego materialu grzy¬ bowego. Psylocyny aiie otrzymuje sie.« Przyklad XI. Otrzymywanie psyiocybiny i psylocyny z Psilócibe Aztecorum Heim pocho- *¦¦¦¦ dzenia naturalnego.Dojrzale owocnie Psilócibe Aztecorum Heim zebrane w Meksyku w kraju Azteków (Na Popo- catepetl na wysokosci 3300—3500 m nad pozio¬ mem morza) suszy sie ostroznie, miele drobno i dokladnie ekstrahuje metanolem jak opisano w przykladzie II. Ekstrakty laczy sie i odparo¬ wuje w prózni do suchosci. Pozostalosc przera¬ bia sie w celu wyizolowania substancji czynnych jak podano w przykladzie II. Otrzymuje sie 570 mg czystej psyiocybiny i 47 mg psylocyny, co odpowiada zawartosci 0,2% lub, 0,017% w od¬ niesieniu do suchego materialu grzybowego (285 g).Przyk lad XII. Otrzymywanie psyiocybiny i psylocyny z czystych kultur Psilócibe Azteco¬ rum Heim.W sklad pozywki wchodza: 0,00834 g 10,0 0,30 0,30 2,0 g g era era ekstrakt slodowy - FeS047H20 ZnOS4-7H,C Ca/NOjj/a KH2P04 MgS04-7H20 KC1 Agar-agar 100 g 0,00417 g 0,00172 g 1,0 g 0,25 g 0,25 g J 0,125 g 2,0 g woda biezaca do 1000 ml Pozywke sterylizuje sie w autoklawie w ciagu 25 minut w temperaturze 108°C. 1 litr zaszczepia sie 2 ml zawiesiny grzyba Psilócibe Aztecorum Heim. Otrzymywanie tej szczepionki zawiesino¬ wej przeprowadza sie jak podano w przykladzie Ilia. Kultury dojrzewaja w ciemnosci przez 45 dni w temperaturze 24CC a zbiór przeprowadza sie jak opisano w przykladzie Hic. *Wydajnosc z 10 litrów pozywki wynosi 86,5 g suchej grzybni.Drobno zmielona grzybnie wytrzasa sie w tem¬ peraturze pokojowej przez 1/2 godzony z 1 litrem 80%-owego etanolu. Pozostalosc po odsaczeniu ekstrahuje sie jeszcze* trzykrotnie w ten sam sposób. Pozostalosc otrzymana przez odparowa¬ nie polaczonych ekstraktów (8,9 g), w celu od¬ dzielenia od tluszczowych substancji towarzy¬ szacych 1 nieaktywnych substancji balastowych, luguje sie kolejno dwukrotnie 100 ml eteru naftowego, dwukrotnie 80 ml chloroformu i dwukrotnie 50 ml' acetonu. Otrzymuje sie 5,6 g proszku rozpuszczalnego w wodzie, który rozpuszcza sie w 6 ml wody. Roztwór mieszajac traktuje sie powoli 80 ml acetonu, oddziela wytracony osad, który rozpuszcza sie nastepnie w malej ilosci wody i wytraca jeszcze raz. dziesieciokrotna iloscia acetonu. - 9 - /To oczyszczanie przez stracanie osadu po¬ wtarza sie jeszcze dwa razy, przy czym pewna ilosc substancji cynaiych przechodzi do ekstraktu wodirwnacetonowego. Ekstrakty odparowuje sie w prózni, a pozostalosc (2,8 g) oczyszcza sie i roz¬ dziela przez chromiatografowanie na kolumnie z proszkiem celulozowym.Po dwukrotnym chromatografowaniu otrzymu¬ je sie 225 mg krystalicznej psylocybiny 1 15 mg psylocyny, co odpowiada wydajnosci 0,26% lub 0,017% w odniesieniu do suchego materialu grzybowego.Przyklad XIII. Otrzymywanie kultury.Pozywke otrzymuje sie nastepujaco: Swieza brzeczke piwna (jasna bez chmielu) rozciencza sie biezaca woda do zawartosci su¬ chej substancji od 4,0 do 4,5%. Do jednego litra tego roztworu dodaje sie: FeS04.7H20 0,00209 g ZnS04-7H20 0,00086 g Ca/N03/2 0,25 g KH2P04 0,0625 g MgS04 0,0625 g KC1 0,031 g Agar-agar 2,0 g Pozywke te starylizuje sie i zaszczepia jak w przykladzie IV. Po 48^dniowym dojrzewaniu w temperaturze 24°C, osiaga sie na niej z jedne¬ go ladunku 55 litrów, wydajnosc 924 g sklerocji i grzybni (suchej substancji), co stanowi 16,6 g na litr pozywki. Otrzymanie z tego materialu cial czynnych przeprowadza sie jak opisano w przykladzie IV. Wydajnosc: 0,018% psylocyny i 0,12% psylocybiny w odniesieniu do suchego materialu grzybowego.Przyklad XIV. Otrzymywanie kultury.Pozywke otrzymuje sie nastepujaco: Swieza brzeczke piwna (jasna, bez chmielu) rozciencza sie woda biezaca do zawartosci su¬ chej substancji 4,0—4,5%. Na kazdy litr tego roztworu dodaje sie: FeS04'7H20 0,00209 g ZnS04.7H20 0,00086 g Ca/NOa/a 1,0 g Agar-agar 2,0 g Pozywka sterylizuje sie, zaszczepia i poddaje dojrzewaniu jak w przykladzie IV. Po 48 dniach zbiera sie 20,5 g suchej grzybni i sklerocji na litr pozywki, z których wydziela sie substancja czynne jak w przykladzie IV. Wydajnosc: 0,011% psylocyny i 0,14% psylocybiny w stosunku do wysuszonego materialu grzybowego.Przyklad XV. Otrzymywanie kultury.Pozywke otrzymuje sie nastepujaco: Swieza brzeczke piwna (jasna, bez chmielu) rozciencza sie woda biezaca do zawartosci su¬ chej substancji 4,0—4,5%. Do kazdego litra tego roztworu dodaje sie: FeS04.7H20 0,00209 g ZnS04.7H20 0,00086 g KH2P04 0,25 g Agar-agar 2,0 g Dalsza obróbke przeprowadza sie jak opisano w przykladzie IV. Wydajnosc wysuszonych skle¬ rocji i grzybni wynosi po 48 dniach 15,9 g na litr pozywki. Wydzielenie substancji czynnych prze¬ prowadza sie jak opisano w przykladzie IV. Wy¬ dajnosc: 0,02% psylocyny i 0,11% psylocybiny w stosunku do wysuszonego materialu grzybo¬ wego.Przyklad XVI. Otrzymywanie kultury.Pozywke otrzymuje sie nastepujaco: Swieza brzeczke piwna (jasna, bez chmielu* rozciencza sie woda biezaca do zawartosci su¬ chej substancji 4,0—4,5%. Do kazdego litra tego roztworu dodaje sie: FeS04.7H20 0,00209 g ZnS04.7H20 0,00086 g namoku kukurydzianego 20,0 g Agar-agar 2,0 g Dalsza obróbke przeprowadza sie jak opisano w przykladzie IV. Wydajnosc wysuszonych skle¬ rocji i grzybni po 48 dniach wynosi 29,3 g na litr pozywki. Wydzielenie cial czynnych prze¬ prowadza sie tak jak opisano w przykladzie IV.Wydajnosc: 0,012% psjdocyny i 0,22% psylocy¬ biny w stosunku do suchego materialu grzybo¬ wego.Przyklad XVII. Otrzymywanie kultury.Jako pozywke stosuje sie: ekstrakt slodowy 45 g FeS04-7H20 0,00417 g ZnS04.7H20 0,00172 g wode biezaca 1000 ml Pozywke sterylizuje sie w autoklawie w tem¬ peraturze 108°C w ciagu 25 minut. 1 litr pozywki zaszczepia sie 10 ml zawiesiny grzyba Psilocibe mexicana, przy czym otrzymywanie szczepionki w zawiesinie odbywa sie tak jak opisano w przy¬ kladzie IV. Po zaszczepieniu grzyb rozmnaza si? na tej pozywce w temperaturze 24°C. Tworza sie przy tym, kuleczki grzybni podobne do sago, co jest rzecza znana przy rozmnazaniu sie niz¬ szych grzybów. Po 30 dniach grzybnie oddziela sie przez odsaczenie. Otrzymuje sie 7,0 g suchej grzybni na litr pozywki. 430 g wysuszonej, drobno zmielonej grzybni wytrzasa sie w temperaturze pokojowej przez 1/9 godziny z 4,5 litra 80%-owego etanolu. Po -- 10 -odsaczeniu pozostalosci ekstrahuje sie w ten sam sposób jeszcze trzy razy. Pozostalosc po odpa¬ rowaniu polaczonych ekstraktów (41 g) luguje sie kolejno dwukrotnie 500 nil eteru naftowego, dwukrotnie 400 ml chloroformu i dwukrotnie 200 ml acetonu w celu oddzielenia substancji balastowych. Pozostaje 25 g rozpuszczalnego w wodzie proszku, który rozpuszcza sie w 25 ml wody. Do roztworu dodaje sie powoli, dobrze mieszajac, 250 ml acetonu, a wytracony osad po oddzieleniu od cieczy rozpuszcza jeszcze raz w malej ilosci wody i ponownie wytraca za po¬ moca dziesieciokrotnej ilosci acetonu. Te opera¬ cje z osadem nierozpuszczalnym w acetonie, po¬ wtarza sie jeszcze dwukrotnie, przy czym wszystkie substancje czynne przechodza do wy¬ ciagów wodno-acetonowych. Wyciagi te odparo¬ wuje sie dobrze mieszajac, a pozostalosc (9,8 g) rozdziela dalej przez chromatografie na kolum¬ nie celulozowej jak opasano w przykladzie IV.Po dwukrotnym chromatografowaniu otrzymuje sie 32 mg krystalicznej psylocyny i 225 mg psy- locybiny, co odpowiada wydajnosci 0,007 lub 0,05% w odniesieniu do suchej grzybni. PL PL