PL 440842 A1 2/10 2' -Hydroksy-4-metylo-5' -O-/3-D-( 4" -O-metyloglukopiranozylo ) dihydrochalkon i sposób wytwarzania 2'-hydroksy-4-metylo-5' -O-/3-D-( 4"-O-metyloglukopiranozylo ) dihydrochalkonu Przedmiotem wynalazku jest 2' -hydroksy-4-m etylo-5' -O-/3-D-( 4" -O metyloglukopiranozylo )-d ihydrochalkon o wzorze 2 przedstawionym na rysunku. Przedmiotem wynalazku jest równiez sposób wytwarzania 2' -hydroksy-4-metylo-5' -O-/3-D-( 4" -O-metyloglukopiranozylo ) dihydrochalkonu. 2' -hydroksy-4-metylo-5' -O-/3-D-( 4" -O-m etyloglukopiranozylo )- dihydrochalkon moze znalezc zastosowanie jako zwiazek przeciwdrobnoustrojowy, immunomodulujacy i przeciwnowotworowy w preparatach farmaceutycznych kosmetycznych oraz produktach spozywczych. Naturalne flawonoidy z jedna lub kilkoma grupami metylowymi wystepuja w roslinach sporadycznie. Z azjatyckiego drzewa Syzygium neNosum (Cleistocalyx operculatus) izolowano C- i O-metylowane chalkony: (E)-4,2' ,4' -trihydroksy-6' -metoksy-3', 5' -dimetylochalkon, (E)-2' ,4'-dihydroksy-6'-metoksy-3' ,5'-dimetylochalkon, (E)-2' ,4'-dihydroksy- 6' -metoksy-3' -metylochalkon, (E)-2,2' ,4' -trihydroksy-6' -metoksy-3' ,5' - dimetylochalkon. Zwiazki te wykazywaly silna inhibicje wobec enzymów pochodzacych od dwóch szczepów wirusa grypy: H1 N1 oraz H9N2. Blokowaly one dzialanie neuraminidaz, umozliwiajacych wirusom opuszczanie zakazonych komórek poprzez rozklad ich blon komórkowych (Dao T. T. , Tung B. T., Nguyen P. H., Thuong P. T., Yoo S. PL 440842 A1 3/10 S., Kim E. H., Kim S. K., Oh W. K. C-methylated flavonoids form Cleistocalyx operculatus and their inhibitory effects on novel influenza A (H1 N1) neuram inidase. Journal of Natura! Products 201 O, 73, 1636-1642). Dihydrochalkony wykazuja slodki smak i moga znalezc zastosowanie jako prozdrowotne slodziki (Janeczko T., Gladkowski W., Kostrzewa-Suslow E. Microbial transformations of chalcones to produce food sweetener derivatives. Journal of Mo/ecu/ar Catalysis B: Enzymatic 2013, 98, 55-61; Luzny M., Kozlowska E., Kostrzewa-Suslow E., Janeczko T. Highly efective, regiospecific hydrogenation of methoxychalcone by Yarrowia lipolytica enables production of food sweeteners. Catalysts 2020, 1 O, 1135). Najlepiej poznany i zbadany dihydrochalkon pozyskiwany ze skórek owoców cytrusowych dihydrochalkon neohesperydyny (E-959) zostal dopuszczony do stosowania jako slodzik i substancja wzmacniajaca smak, a jego zastosowanie reguluje Rozporzadzenie Komisji Europejskiej nr 1129/2011 z 11 listopada 2011 r. Wiekszosc flawonoidów, poza katechinami, jest obecna w roslinach w polaczeniu z cukrami, jako ,6-glikozydy. Glikozylacja skutkuje wzrostem rozpuszczalnosci w wodzie i stabilnosci czasteczki flawonoidu oraz przyswajalnosci przyjmowanych z pokarmem zwiazków flawonoidowych. Zasadniczo glukozydy sa jedynymi glikozydami, które moga byc absorbowane w jelicie cienkim. Natomiast flawonoidy niezaabsorbowane w jelicie cienkim oraz zaabsorbowane flawonoidy wydzielone z zólcia ulegaja degradacji wraz z rozerwaniem struktury pierscieniowej przez mikroorganizmy (Hollman, P. C. Absorption, bioavailability, and metabolism of flavonoids. Pharmaceutical Biology, 2004, 42, 74-83, Plaza, M.; Pozzo, T.; Liu, J.; Gulshan Ara, K. Z.; Turner, C.; Nordberg Karlsson, E. Substituent effects on in vitro antioxidizing properties, stability, and solubility in flavonoids. Journal of Agricultural Food Chemistry, 2014, 62, 3321-3333). Znany jest szczep lsaria fumosorosea KCH J2 ujawniony w zgloszeniu patentowym o numerze P.416996. W ostatnich latach, w leczeniu róznych chorób i ich zapobieganiu, PL 440842 A1 4/10 coraz wieksze znaczenie zyskuja zwiazki pochodzenia naturalnego oraz ich odpowiedniki uznawane za naturalne, które uzyskano na drodze przeksztalcen mikrobiologicznych. Dlatego istotne jest opracowywanie nowych metod wytwarzania zwiazków aktywnych biologicznie na drodze biotransformacji, uzytecznych dla przemyslu farmaceutycznego, kosmetycznego i spozywczego. W dostepnej literaturze brak jest informacji na temat otrzymywania 2' -hydroksy-4-metylo-5' -O-,B-D-( 4" -O-metylogl ukopiranozylo ) dihydrochalkonu. Istota wynalazku jest 2' -hydroksy-4-m etylo-5' -O-,B-D-( 4" -O- metyloglukopiranozylo )-dihydrochalkon. Istota sposobu polega na tym, ze do podloza odpowiedniego dla grzybów strzepkowych wprowadza sie szczep lsaria fumosorosea KCH J2. Po uplywie co najmniej 72 godzin do hodowli wprowadza sie substrat, którym jest 2' -hydroksy-4-metylochalkon, rozpuszczony w rozpuszczalniku organicznym mieszajacym sie z woda. Transformacje prowadzi sie w temperaturze od 20 do 30 stopni Celsjusza, przy ciaglym wstrzasaniu, przez co najmniej 96 godzin. Nastepnie produkt ekstrahuje sie rozpuszczalnikiem organicznym niemieszajacym sie z woda oraz oczyszcza chromatograficznie. 2' -Hydroksy-4-m etylo-5' -O-,B-D-( 4" -O- metyloglukopiranozylo )-dihydrochalkon znajduje sie we frakcji o posredniej polarnosci, w czwartym pasmie od linii startu. Korzystnie jest, gdy stosunek masy dodawanego substratu do objetosci hodowli wynosi O, 1 mg: 1 cm 3. Korzystnie takze jest, gdy proces prowadzi sie w temperaturze 25 stopni Celsjusza. Dodatkowo, korzystnie jest, gdy transformacje prowadzi sie przez 9 dni. Korzystnie równiez jest, gdy oczyszczanie prowadzi sie wykorzystujac cienkowarstwowa chromatografie preparatywna w ukladzie eluujacym z chloroformem i metanolem w stosunku objetosciowym 9: 1. PL 440842 A1 /10 Postepujac zgodnie z wynalazkiem, w wyniku dzialania ukladu enzymatycznego zawartego w komórkach szczepu lsaria fumosorosea KCH J2, nastepuje przylaczenie 4-metoksy-,B-D-glukozy przy C-5' oraz redukcja wiazania podwójnego. Uzyskany w ten sposób produkt wydziela sie z wodnej kultury mikroorganizmu, znanym sposobem, przez ekstrakcje rozpuszczalnikiem organicznym niemieszajacym sie z woda (octan etylu). Zasadnicza zaleta wynalazku jest otrzymanie 2' -hydroksy-4-metylo-5' - O-,B-D-( 4" -O-metyloglukopiranozylo )-d ihydrochalkonu w tern peraturze pokojowej i przy pH naturalnym dla szczepu oraz wykorzystujac mikroorganizm niebedacy patogenem ludzkim. Wykorzystanie biotransformacji, zamiast syntezy chemicznej, umozliwia, w sposób przyjazny dla srodowiska, uzyskanie zwiazków o wiekszej biodostepnosci i aktywnosci biologicznej, niz uzyte substraty. Wynalazek jest blizej objasniony na przykladzie wykonania. Przyklad. Do kolby stozkowej o pojemnosci 2000 cm 3 , w której znajduje sie 500 cm 3 sterylnej pozywki zawierajacej 1 O g aminobaku i 30 g sacharozy, wprowadza sie szczep /saria fumosorosea KCH J2. Po 72 godzinach jego wzrostu dodaje sie 50 mg 2' -hydroksy-4-metylochalkonu o wzorze 1, rozpuszczonego w 1 cm 3 dimetylosulfotlenku. Transformacje prowadzi sie w 25 stopniach Celsjusza przy ciaglym wstrzasaniu przez 9 dni. Nastepnie mieszanine poreakcyjna ekstrahuje sie dwukrotnie octanem etylu, osusza bezwodnym siarczanem magnezu i odparowuje rozpuszczalnik. Otrzymany ekstrakt oczyszcza sie chromatograficznie z zastosowaniem jako eluentu mieszaniny chloroformu i metanolu w stosunku objetosciowym 9: 1. Produkt znajduje sie we frakcji o posredniej polarnosci, w czwartym pasmie od linii startu. Na tej drodze otrzymuje sie 4,4 mg 2'-hydroksy-4-metylo-5'-O-,B-D ( 4" -O-metyloglukopiranozylo )-dihydrochalkonu (wydajnosc 4, 9% ). Stopien konwersji substratu wedlug HPLC 99%. Uzyskany produkt charakteryzuje sie nastepujacymi danymi spektralnymi. Opis sygnalów pochodzacych z widma 1 H NMR (601 MHz, Aceton-ds) PL 440842 A1 6/10 Sygnaly pochodzace od protonów Sygnaly pochodzace od protonów szkieletu flawonoidowego jednostki cukrowej ó [ppm] J [Hz] H ó [ppm] J [Hz] H 3,42 (m) a 4,83 (d) 7,8 1" 3,00 (t) 7,5 ~ 3,42 (m) 2" 7,19(d) 8,0 2 3,59 (m) 3" 7,09 (d) 7,8 3 3, 15 (dd) 9,7; 8,9 4" 7,09 (d) 7,8 5 3,47 (m) 5" 7,19 (d) 8,0 6 3,84 (m) 6" 3,67 (m) 6,87 (d) 9,0 3' 3,55 (s) C4"-OCH3 7,28 (dd) 9,0; 3,0 4' 4,62 (d) 2,6 2"-OH 7,64 (d) 2,9 6' 4,39 (d) 3,5 3"-OH 11,95 (s) C-2'-OH 3,84 (m) 6"-OH 2,27 (s) C-4-CH3 Symulacje komputerowe przy uzyciu platformy SwissADME, sluzacej do oceny farmakokinetyki i przydatnosci malych czasteczek jako leków, wykazaly wzrost rozpuszczalnosci w wodzie 2' -hydroksy-4-metylo-5' -0-/3- D-( 4" -O-metyloglukopiranozylo )-dihydrochalkonu wzgledem 2' -hydroksy-4- metylochalkonu. Ponadto zwiazek ten moze byc aktywnie transportowany w organizmie przez glikoproteine P w przeciwienstwie do swojego aglikonu i w wysokim stopniu absorbowany w ukladzie pokarmowym czlowieka. Symulacje przeprowadzone z uzyciem programu PASS online sluzacego do przewidywania m.in. biologicznej aktywnosci, efektów farmakologicznych i mechanizmu dzialania zwiazków chemicznych na podstawie ich struktury wykazaly, ze 2' -hydroksy-4-metylo-5' -O-/3-D-( 4" -O metyloglukopiranozylo )-dihydrochalkon z 94% prawdopodobienstwem bedzie wykazywal dzialanie przeciwdrobnoustrojowe, na przyklad jako inhibitor glicerofosfotransferazy COP-glicerolu odpowiedzialnej za polimeryzacje lancuchów kwasów tejchojowych, które odrywaja kluczowa PL 440842 A1 7/10 role w nadawaniu ksztaltu komórce bakteryjnej, integracji jej otoczki, tworzeniu biofilmu bakteryjnego, a w konsekwencji patogenezie bakterii gram-dodatnich (Brown S., Meredith T., Swoboda J., Walker S. Staphylococcus aureus and Bacillus subtilis W23 make polyribitol wali teichoic acids using different enzymatic pathways. Chemistry & biology 2010, 17(10), 1101-1110). Symulacje pokazuja równiez, ze z 81 % prawdopodobienstwem bedzie dzialal inhibujaco na poliproteine zaangazowana w transkrypcje i replikacje wirusa SARS CoV-2 oraz z okolo 60% prawdopodobienstwem przeciwbakteryjnie przeciwko miedzy innymi Clostridium ramosum, Actinomyces meyeri i Acinetobacter pittii. Przeprowadzone symulacje wykazaly równiez. ze 2'-hydroksy-4- metylo-5' -O-/3-D-( 4"-O-metyloglukopiranozylo )-dihydrochalkon moze byc antagonista receptorów anafilatoksyn, ograniczajac ich nadaktywnosc. Anafilatoksyny odgrywaja istotna role w trakcie odpowiedzi na infekcje bakteryjne i procesach zapalnych, ale takze w sepsie, uszkodzeniach niedokrwienno-reperfuzyjnych, zlozonych chorobach immunologicznych i astmie (Haas P.J., van Strijp J. Anaphylatoxins. Immunologie Research 2007, 37, 161-175). Symulacje wykazaly równiez 93% prawdopodobienstwo aktywnosci przeciwnowotworowej 2' -hydroksy-4-m etylo-5' -O-/3-D-( 4" -O metyloglukopiranozylo )-d ihydrochalkonu na przyklad poprzez inhibicje monooksygenazy monofenolowej (tyrozynazy), której zwiekszona aktywnosc zwiazana jest z rozwojem czerniaka zlosliwego (James E. Talmadge, Kenneth H. Cowan. Gene Therapy in Oncology, Abeloff's Clinical Oncology (Fifth Edition), 2014). PL 440842 A1 8/10 Zastrzezenia patentowe 1 . 2' -Hydroksy-4-metylo-5' -O-,B-D-( 4" -O-metyloglukopiranozylo ) dihydrochalkon o wzorze 2. 2. Sposób wytwarzania 2'-hydroksy-4-metylo-5'-O-,6-0-(4"-O- metyloglukopiranozylo )-dihydrochalkonu znamienny tym, ze do podloza odpowiedniego dla grzybów strzepkowych wprowadza sie szczep lsaria fumosorosea KCH J2, nastepnie po uplywie co najmniej 72 godzin do hodowli wprowadza sie substrat, którym jest 2'-hydroksy-4- metylochalkon o wzorze 1, rozpuszczony w rozpuszczalniku organicznym mieszajacym sie z woda, transformacje prowadzi sie w temperaturze od 20 do 30 stopni Celsjusza, przy ciaglym wstrzasaniu, co najmniej 96 godzin, po czym produkt ekstrahuje sie rozpuszczalnikiem organicznym niemieszajacym sie z woda oczyszcza chromatograficznie, przy czym 2' -hydroksy-4-metylo-5' -O-,B-D-( 4" -O metyloglukopiranozylo )-dihydrochalkon o wzorze 2 znajduje sie we frakcji o posredniej polarnosci, w czwartym pasmie od linii startu. 3. Sposób wedlug zastrz. 2., znamienny tym, ze stosunek masy dodawanego substratu do objetosci hodowli wynosi O, 1 mg: 1 cm 3. 4. Sposób wedlug zastrz. 2., znamienny tym, ze proces prowadzi sie w temperaturze 25 stopni Celsjusza. . Sposób wedlug zastrz. 2., znamienny tym, ze transformacje prowadzi sie przez 9 dni. 6. Sposób wedlug zastrz. 2., znamienny tym, ze oczyszczanie prowadzi sie wykorzystujac cienkowarstwowa chromatografie preparatywna w ukladzie eluujacym chloroform:metanol w stosunku objetosciowym 9: 1. PL 440842 A1 9/10 3 4' lsaria fumosorosea KCH J2 3' wzór1 wzór2 PL 440842 A1 /10 al. Niepodleglosci 188/192 00-950 Warszawa, skr. poczt. 203 URZAD PATENTOWY RZECZYPOSPOLITEJ POLSKIEJ tel.: (+48) 22 579 05 55 I fax: (+48) 22 579 00 Ol e-mail: kontakt@uprp.gov.pl I www.uprp.gov.pl SPRAWOZDANIE O STANIE TECHNIKI DO ZGLOSZENIA NR P . ..J...J.08..J.2 Kfasyfikacja zgloszenia: C07H 15/203 (2006.Cll) Cl 2P 19/4..J. (2006.01) Cl 2R 1/645 (2006 O I) Poszukiwania prowadzone w klasach: C07H, C12P, C12R Bazy komputerowe w których prowadzono poszukhrnnia: EPODOC, WPT. PA TENTSCOPE. STNcxt: REGISTRY, bazy UPRP, Kategoria dokumentu A A Dokumenty - z podana identyfikacja PL234085 BI (UNIWERSYTET PRZYRODNICZY WE WROCLAWIU) 2020- 01-31 PL234086 B 1 (UNIWERSYTET PRZYRODNICZY WE WROCLA WTU) 2020- 01-31 D Dalszy ciag ,,:ykazu dokumentów na nastepnej stronie A dokument okrcshljqc~- 012óh1y stnn techniki. który nic _icst 11w87.m1y 7[1 posinrln_iycy szczc12óh1c 71lrlC7.Cllic. f dokument -;tr111m:ri,1c~- wczesniejs?e z;:dos7.enie lub pntent. nle op11bhkmnm~· ''" h1h po dacie 7.gloszeni[l_ Odniesienie do LastrL. 1-6 1-6 L -dokument. który 111O7c podcbwnc Y\' ,:qtplhvosc 7.nstrzc,gmic picnvs7cnst,vo(-v,·n). lub pr7:vtClC7.ClffV ,v celu 11stnlc11in dnt~- p11bhknc_ii itmc~o c~·tmvm1cg0 cfokmnc11h1 hib 7 im1cg0 S7Czc_góh1c_!20 p0w0d11 O dok11ment od110S7IJC~- sie do Hlnw11ieni[l 11";tnego pr7ez 7:-1Stos01vn11ie. w~·st[l·wie11ie h1b 11_jrnvnienie ''" in11:v sposób P dok11ment 0p11blil-::m;rnny pT7.ed dnt[I z_!2lOS7.elli[I. [Ile pó7nie_i ni 7. z[lstr7.eg[ln[I dnt[I pienYszenst,v[I. T - dok11ment pó711ie_jc;zy opublik0wnnv po cbcie 7._!210S7.enin lub w d[lcie pieni;c;ze1lst,v[I i niebedqc~- w konflikcie ze 7.glos7eniem. [Ile cytov;[ln~- w celu zrnz11mieni[I 7.[ISrld l11h teorii le7[Jc~·ch u podsrnw wynr11[17.ku. X dokument 0 S7C7.ególnym 7Jrnc7.eniu: 7.rlStT7.egm1~' 1Y:vn[1fa7ek nie mo7.e byc uwn7.[IHV 7:-1 now~- hib nie mo7e b~-c 11w[l7,nn~- 7.[I p0sindn_j[lc:v po7iom w~-n[!fazc7.y. je7eli ten dok11mcnt hrn11:v jest pod 11v,·;1ge smnodziclnie. Y dokument o S7Cze_gólnvm 71lrlC7.enin: 7.rlStT7.egr111~., v,·:vn[IJ[l7ek nie mo7.e byc uw[l7.m1:v 7rl posi[ldrl_if!c~- po7fom '-'-:Vll[!fa7C7,Y. je7.eli ten dokument z0st[lnie pol1c7on~- z jedn~-m lub kilkonrn tego typu dok11mentmni. [I t[lkie pol1c7enie hed7ie ocz~·wiste db 7nnwc~-. & dokument 1rnle7.ac:v do te_j S[lmej r0d7in:v pr1tent0wei. Sprawozdanie wykonal/-a: Agnieszka Ucinska Ekspert Koordynator Data: 02.12.2022 Uwagi do zgloszenia Sprawozdanie zostalo wykonane w oparciu o zastrz. z dnia 01.04.2022 r. Podpis: /podpisano kwalifikowanym podpisem elektronicznym/ Pismo wydane w formie dokumentu elektronicznego PL