PL 440843 A1 2/10 4-Hydroksym etylo-2' -O-/3-D-( 4" -O-mety log lukopiranozylo )-dihydrochalkon i sposób wytwarzania 4-hydroksymetylo-2'-O-/3-D-(4"-O-metyloglukopiranozylo)-dihydrochalkonu Przedmiotem wynalazku jest 4-hydroksym etylo-2' -O-/3-D-( 4" -O metyloglukopiranozylo )-d ihydrochalkon o wzorze 2 przedstawionym na rysunku. Przedmiotem wynalazku jest równiez sposób wytwarzania 4-hydroksymetylo-2'-O-/3-D-(4"-O-metyloglukopiranozylo) dihydrochalkonu. 4-Hydroksymetylo-2' -O-/3-D-( 4" -O-metyloglukopiranozylo ) dihydrochalkon moze znalezc zastosowanie jako zwiazek przeciwdrobnoustrojowy, przeciwnowotworowy, hepato- i kardioprotekcyjny oraz potencjalny slodzik w preparatach farmaceutycznych i kosmetycznych oraz produktach spozywczych. Naturalne flawonoidy z jedna lub kilkoma grupami metylowymi wystepuja w roslinach sporadycznie. Z azjatyckiego drzewa Syzygium neNosum (Cleistocalyx operculatus) izolowano C- i O-metylowane chal kany: ( E)-4, 2', 4' -trihydroksy-6' -m etoksy-3', 5' -dim etylochalkon, (E)-2' ,4' -dihydroksy-6'-metoksy-3' ,5' -dimetylochalkon, (E)-2' ,4' -di hydroksy- 6' -metoksy-3' -metylochalkon, ( E)-2, 2', 4' -trihydroksy-6' -m etoksy-3', 5' - dimetylochalkon. Zwiazki te wykazywaly silna inhibicje wobec enzymów pochodzacych od dwóch szczepów wirusa grypy: H1 N1 oraz H9N2. Blokowaly one dzialanie neuraminidaz, umozliwiajacych wirusom opuszczanie zakazonych komórek poprzez rozklad ich blon komórkowych (Dao T. T. , Tung B. T., Nguyen P. H., Thuong P. T., Yoo S. S., Kim E. H., Kim S. K., Oh W. K. C-methylated flavonoids form Cleistocalyx operculatus and their inhibitory effects on novel influenza A (H1 N1) neuram inidase. Journal of Natura/ Products 201 O, 73, 1636-1642). PL 440843 A1 3/10 Dihydrochalkony wykazuja slodki smak i moga znalezc zastosowanie jako prozdrowotne slodziki (Janeczko T., Gladkowski W., Kostrzewa-Suslow E. Microbial transformations of chalcones to produce food sweetener derivatives. Journal of Mo/ecu/ar Catalysis B: Enzymatic 2013, 98, 55-61; Luzny M., Kozlowska E., Kostrzewa-Suslow E., Janeczko T. Highly efective, regiospecific hydrogenation of methoxychalcone by Yarrowia lipolytica enables production of food sweeteners. Catalysts 2020, 1 O, 1135). Najlepiej poznany i zbadany dihydrochalkon pozyskiwany ze skórek owoców cytrusowych dihydrochalkon neohesperydyny (E-959) zostal dopuszczony do stosowania jako slodzik i substancja wzmacniajaca smak, a jego zastosowanie reguluje Rozporzadzenie Komisji Europejskiej nr 1129/2011 z 11 listopada 2011 r. Wiekszosc flawonoidów, poza katechinami, jest obecna w roslinach w polaczeniu z cukrami, jako /3-glikozydy. Glikozylacja skutkuje: wzrostem rozpuszczalnosci w wodzie i stabilnosci czasteczki flawonoidu oraz przyswajalnosci przyjmowanych z pokarmem zwiazków flawonoidowych. Zasadniczo glukozydy sa jedynymi glikozydami, które moga byc absorbowane w jelicie cienkim. Natomiast flawonoidy niezaabsorbowane w jelicie cienkim oraz zaabsorbowane flawonoidy wydzielone z zólcia ulegaja degradacji wraz z rozerwaniem struktury pierscieniowej przez mikroorganizmy (Hollman, P. C. Absorption, bioavailability, and metabolism of flavonoids. Pharmaceutical Biology, 2004, 42, 7 4-83, Plaza, M.; Pozzo, T.; Liu, J.; Gulshan Ara, K. Z.; Turner, C.; Nordberg Karlsson, E. Substituent effects on in vitro antioxidizing properties, stability, and solubility in flavonoids. Journal of Agricultural Food Chemistry, 2014, 62, 3321-3333). Znany jest szczep lsaria fumosorosea KCH J2 ujawniony w zgloszeniu patentowym o numerze P.416996. W ostatnich latach, w leczeniu róznych chorób i ich zapobieganiu, coraz wieksze znaczenie zyskuja zwiazki pochodzenia naturalnego oraz ich odpowiedniki uznawane za naturalne, które uzyskano na drodze przeksztalcen mikrobiologicznych. Dlatego istotne jest opracowywanie PL 440843 A1 4/10 nowych metod wytwarzania zwiazków aktywnych biologicznie na drodze biotransformacji, uzytecznych dla przemyslu farmaceutycznego, kosmetycznego i spozywczego. W dostepnej literaturze brak jest informacji na temat otrzymywania 4-hydroksymetylo-2' -O-,B-D-( 4" -O-metylog lukopiranozylo ) dihydrochalkonu. Istota wynalazku jest 4-hydroksym etylo-2' -O-,B-D-( 4" -O- metyloglukopiranozylo )-dihydrochalkon. Istota sposobu polega na tym, ze do podloza odpowiedniego dla grzybów strzepkowych wprowadza sie szczep lsaria fumosorosea KCH J2. Po uplywie co najmniej 72 godzin do hodowli wprowadza sie substrat, którym jest 2' -hydroksy-4-metylochalkon, rozpuszczony w rozpuszczalniku organicznym mieszajacym sie z woda. Transformacje prowadzi sie w temperaturze od 20 do 30 stopni Celsjusza, przy ciaglym wstrzasaniu, przez co najmniej 96 godzin. Nastepnie produkt ekstrahuje sie rozpuszczalnikiem organicznym niemieszajacym sie z woda oraz oczyszcza chromatograficznie. 4-Hydroksym etylo-2' -O-,B-D-( 4" -O- metyloglukopiranozylo )-dihydrochalkon znajduje sie we frakcji o posredniej polarnosci, w drugim pasmie od linii startu. Korzystnie jest, gdy stosunek masy dodawanego substratu do objetosci hodowli wynosi O, 1 mg:1 cm 3 . Korzystnie takze jest, gdy proces prowadzi sie w temperaturze 25 stopni Celsjusza. Dodatkowo, korzystnie jest, gdy transformacje prowadzi sie przez 9 dni. Korzystnie równiez jest, gdy oczyszczanie prowadzi sie wykorzystujac cienkowarstwowa chromatografie preparatywna w ukladzie eluujacym z chloroformem i metanolem w stosunku objetosciowym 9: 1. Postepujac zgodnie z wynalazkiem, w wyniku dzialania ukladu enzymatycznego zawartego w komórkach szczepu lsaria fumosorosea PL 440843 A1 /10 KCH J2, nastepuje przylaczenie 4-metoksy-,B-D-glukozy przy C-2', hydroksylacja przy C-4-CH3 oraz redukcja wiazania podwójnego. Uzyskany w ten sposób produkt wydziela sie z wodnej kultury mikroorganizmu, znanym sposobem, przez ekstrakcje rozpuszczalnikiem organicznym niemieszajacym sie z woda (octan etylu). Zasadnicza zaleta wynalazku jest otrzymanie 4-hydroksymetylo-2' -O-,B D-( 4" -O-metyloglukopiranozylo )-dihydrochalkonu w temperaturze pokojowej i przy pH naturalnym dla szczepu oraz wykorzystujac mikroorganizm niebedacy patogenem ludzkim. Wykorzystanie biotransformacji, zamiast syntezy chemicznej, umozliwia, w sposób przyjazny dla srodowiska, uzyskanie zwiazków o wiekszej biodostepnosci i aktywnosci biologicznej, niz uzyte substraty. Wynalazek jest blizej objasniony na przykladzie wykonania. Przyklad. Do kolby stozkowej o pojemnosci 2000 cm 3 , w której znajduje sie 500 cm 3 sterylnej pozywki zawierajacej 1 O g aminobaku i 30 g sacharozy, wprowadza sie szczep lsaria fumosorosea KCH J2. Po 72 godzinach jego wzrostu dodaje sie 50 mg 2' -hydroksy-4-metylochalkonu o wzorze 1, rozpuszczonego w 1 cm 3 dimetylosulfotlenku. Transformacje prowadzi sie w 25 stopniach Celsjusza przy ciaglym wstrzasaniu przez 9 dni. Nastepnie mieszanine poreakcyjna ekstrahuje sie dwukrotnie octanem etylu, osusza bezwodnym siarczanem magnezu i odparowuje rozpuszczalnik. Otrzymany ekstrakt oczyszcza sie chromatograficznie z zastosowaniem jako eluentu mieszaniny chloroformu i metanolu w stosunku objetosciowym 9:1. Produkt znajduje sie we frakcji o posredniej polarnosci, w drugim pasmie od linii startu. Na tej drodze otrzymuje sie 6,6 mg 4-hydroksymetylo-2'-O-,B-D-(4" O-metyloglukopiranozylo )-dihydrochalkonu (wydajnosc 7 ,3% ). Stopien konwersji substratu wedlug HPLC 99%. PL 440843 A1 6/10 Uzyskany produkt charakteryzuje sie nastepujacymi danymi spektralnymi. Opis sygnalów pochodzacych z widma 1 H NMR (601 MHz, Aceton-dB) Sygnaly pochodzace od protonów Sygnaly pochodzace od protonów szkieletu flawonoidowego jednostki cukrowej o [ppm] J [Hz] H o[ppm] J [Hz] H 3,41 (m) a 5,06 (d) 7,8 1" 2,97 (t) 7,5 ~ 3,50 (m) 2" 7,26 (d) 8,3 2 3,63 (td) 9,0; 4,3 3" 7,23 (d) 8,3 3 3,22 9,6; 9,1 4" (dd) 7,23 (d) 8,3 5 3,50 (m) 5" 7,26 (d) 8,3 6 3,84 11,6; 5,3; 6" (ddd) 2,2 3,68 (m) 7,29 (dd) 8,4; 0,7 3' 3,56 (s) C4"-OCH3 7,47 (ddd) 8,4; 7,3; 4' 4,60 (d) 4,2 2"-OH 1,8 7,10 (td) 7,6; 1,0 5' 4,39 (d) 4,4 3"-OH 7,57 (dd) 7,7; 1,8 6' 3,74 6,8; 5,4 6"-OH (dd) 4,58 (d) 5,7 C4-CH2- 4,08 (t) 5,8 C4-CH2-OH Symulacje komputerowe przy uzyciu platformy SwissADME, sluzacej do oceny farmakokinetyki i przydatnosci malych czasteczek jako leków, wykazaly wzrost rozpuszczalnosci w wodzie 4-hydroksymetylo-2'-O-,8-D (4" -O-metyloglukopiranozylo )-dihydrochalkonu wzgledem 2' -hydroksy-4- metylochalkonu. Ponadto zwiazek ten moze byc aktywnie transportowany w organizmie przez glikoproteine P w przeciwienstwie do swojego aglikonu w wysokim stopniu absorbowany w ukladzie pokarmowym czlowieka.Symulacje przeprowadzone z uzyciem programu PASS online PL 440843 A1 7/10 sluzacego do przewidywania m.in. biologicznej aktywnosci, efektów farmakologicznych i mechanizmu dzialania zwiazków chemicznych na podstawie ich struktury wykazaly, 4-hydroksym etylo-2' -O-/3-D-( 4" -O metyloglukopiranozylo )-d ihydrochalkon z 94% prawdopodobienstwem bedzie wykazywal dzialanie przeciwdrobnoustrojowe, na przyklad jako inhibitor glicerofosfotransferazy COP-glicerolu odpowiedzialnej za polimeryzacje lancuchów kwasów tejchojowych, które odrywaja kluczowa role w nadawaniu ksztaltu komórce bakteryjnej, integracji otoczki, tworzeniu biofilmu, a w konsekwencji patogenezie bakterii gram-dodatnich (Brown S., Meredith T., Swoboda J., Walker S. Staphylococcus aureus and Bacillus subtilis W23 make polyribitol wali teichoic acids using different enzymatic pathways. Chemistry & bio/ogy 201 O, 17 (1 O), 1101-111 O). Symulacje pokazuja równiez, ze 4-hydroksymetylo-2' -O-/3-D-(4"-O metyloglukopiranozylo)-dihydrochalkon moze dzialac przeciwbakteryjnie przeciwko miedzy innymi Clostridium cadaveris, Mycobacterium ulcerans, Acinetobacter pittii, czy opornemu szczepowi Staphylococcus aureus subsp. aureus RN4220. Zwiazek ten z 90% prawdopodobienstwem bedzie wykazywal aktywnosc antykancerogenna poprzez inhibicje monooksygenazy monofenolowej (tyrozynazy), której zwiekszona aktywnosc zwiazana jest z rozwojem czerniaka zlosliwego (James E. Talmadge, Kenneth H. Cowan. Gene Therapy in Oncology, Abeloff's Clinical Oncology (Fifth Edition), 2014 ), a takze ochronna na watrobe oraz uklad sercowo-naczyniowy (ze wzgledu na swoja aktywnosc przeciwna do aktywnosci cholesterolu). Symulacje wskazuja równiez, ze 4-hydroksymetylo-2'-0-/3-D-( 4" -0- metyloglukopiranozylo )-dihydrochalkon moze znalezc zastosowanie jako slodzik. PL 440843 A1 8/10 Zastrzezenia patentowe 1. 4-Hydroksymetylo-2' -O-,6-D-( 4" -O-metyloglukopiranozylo ) dihydrochalkon o wzorze 2. 2. Sposób otrzymywania 4-hydroksym etylo-2' -O-,6-D-( 4" -0- metyloglukopiranozylo)-dihydrochalkonu znamienny tym, ze do podloza odpowiedniego dla grzybów strzepkowych wprowadza sie szczep lsaria fumosorosea KCH J2, nastepnie po uplywie co najmniej 72 godzin do hodowli wprowadza sie substrat, którym jest 2'-hydroksy-4- metylochalkon o wzorze 1, rozpuszczony w rozpuszczalniku organicznym mieszajacym sie z woda, transformacje prowadzi sie w temperaturze od 20 do 30 stopni Celsjusza, przy ciaglym wstrzasaniu, co najmniej 96 godzin, po czym produkt ekstrahuje sie rozpuszczalnikiem organicznym niemieszajacym sie z woda oczyszcza chromatograficznie, przy czym 4-hydroksymetylo-2' -O-,6-D-( 4" -O metyloglukopiranozylo )-dihydrochalkon o wzorze 2 znajduje sie we frakcji o posredniej polarnosci, w drugim pasmie od linii startu. 3. Sposób wedlug zastrz. 2., znamienny tym, ze stosunek masy dodawanego substratu do objetosci hodowli wynosi O, 1 mg: 1 cm 3. 4. Sposób wedlug zastrz. 2., znamienny tym, ze proces prowadzi sie w temperaturze 25 stopni Celsjusza. . Sposób wedlug zastrz. 2., znamienny tym, ze transformacje prowadzi sie przez 9 dni. 6. Sposób wedlug zastrz. 2., znamienny tym, ze oczyszczanie prowadzi sie wykorzystujac cienkowarstwowa chromatografie preparatywna w ukladzie eluujacym chloroform:metanol w stosunku objetosciowym 9:1. PL 440843 A1 9/10 3 3 OH 4' 4' /saria fumosorosea KCH J2 3' o wzór1 wzór2 PL 440843 A1 /10 aL Niepodleglosci 188/192 00-950 Warszawa, skr. poczt. 203 URZAD PATENTOWY RZECZYPOSPOLITEJ POLSKIEJ teL: (+48) 22 579 05 SS I fax: (+48) 22 579 00 01 e-mail: kontakt@uprp.gov.pl I www.uprp.gov.pl SPRAWOZDANIE O STANIE TECHNIKI DO ZGLOSZENIA NR P.440843 Kl::isyfikacja zgloszenia: C07H 15/203 (2006.Cll) Cl 2P 19/44 (2006.01) CI 2R 1/645 (2006 O I) Pos,.-:ukiwania prowad,.-:onc w klasach: C07H Cl2P C 12R Ba,.-:y komputermYe w któ0 eh prowadzono poszuki\\ ania: EPODOC. WPL PATENTSCOPE. STNext: REGISTRY. ba7:· UPRP Kategoria dokumentu A A Dokumenty - z podana identyfikacja PL234085 Bl (UNIWERSYTET PRZYRODNICZY WE WROCLAWIU) 2020- 01-31 PL234086 B 1 (UNI\VERSYTET PRZYRODNICZY WE WROCLAWIU) 2020- 01-31 D Dalszy ciag ,:vykazn dokumentów na nastepnej stronie A - clok1nncnt okrcsl;1jacy o::;ólny ;;tan techniki, który nic jest 1n:v;17.any 7a posiaclaiac3· szc7.c~ólnc zn;1C7.c11ic, r - dokument stanowiacy \YC'/.csnicjsic '/.~los/.cnic lub patent, ale op11bliLon-;111: w lub po dacie /.glns'/c11i;1 Odniesienie do ,.-:astr,-:. 1-6 1-6 1 - clol-, .. umcnt, t.tór)' moze podda,.\ ac \\ ,., atpli\.\•OSC Lastrzcganc picr\\ szcli~twu(-,., a), lub prL)' tocwn)' w edu ustalenia dat: publiLacji im1q:o c: towancgo dol-,._umcntu lub z innego szczcgólnq:o po,.vodu. O - clol-,._umcut od110s4J:C) sic do uja\.V1Lic11ia ustnego przez Lastosuv\·a1Lie. w: stawienie lub ujaw11ie1Lic \\ iml)' ::iposób. P - clol-,.umcnt opublil.uv, au: pued dat4 zglo::iLeuia, ale póLnicj 111.i: zastILegana data picr\\ szclistwa. T - clul.,,.ument póz1Lie_1szy. opubh.towaH)' po cb.c1e zglrn,Lema lub \V dacie pien, sze1istwa 11Lieb9dac: "' l.,,.oul11kcie ze Lgloszcmem. ale C)' tov, ~w: w celu zrozumienia zasad lub teorii lczc!:c: eh u pod1:itav, w: nalaztu, X - dokument o SLczególny m z11acLe11w; Lastrzega11:· v, y 11.alazc.b. 11ie muLe byc u½azau)' La HU'v\: lub me mozc b: 0 uwaLa11: za posiadajac)' poz10m "': 11alazCL)'. jeLcli ten dokument bra11y jest pod U\11 age samodziel11ie, Y - dokument o szczególnym zuacLenw; Lastrzega11y v, ynalazek nie moLe byc: mvazany za posiada1ac: pot:iom \\ ynalazcz:, jel.eh ten dokument zostanie polaczun: z Jedm m lub k1!loma tego typu dokumentami, a takie polacLeme bedL1e ocz) w1ste dla Ltiawc,. & - dokument nalezacy do te.1 sameJ rodzmy patentowe]. Sprawozdanie wykonali-a: Agnieszka Ucinska Ekspert Koordynator Data: 06.12.2022 Uwagi do zgloszenia Sprawozdanie zostalo wykonane w oparciu o zastrz. z dnia 01.04.2022 r. Podpis: /podpisano kwalifikowanym podpisem elektronicznym/ Pismo wydane w formie dokumentu elektronicznego PL PL PL PL