PT100344B

PT100344B - Factores polipeptidicos mitogenicos gliais, e seu processo de preparacao, ensaio da actividade mitogenica, sequencias de adn que codificam os factores e construcoes de adn que as compreendem, celulas hospedeiras, formulacoes farmaceutica ou veterinaria, uso dos polipeptidos, anticorpo, e sequencia genetica codificando actividade mitogenica de celulas gliais.

Info

Publication number: PT100344B
Application number: PT100344A
Authority: PT
Inventors: Andrew David John Goodearl; Michael Derek Waterfield; Paul Stroobant; Luisa Minghetti; Mark A Marchionni
Original assignee: Cambridge Neuroscience Inc; Ludwig Inst Cancer Res
Priority date: 1991-04-10
Filing date: 1992-04-03
Publication date: 1999-08-31
Also published as: JPH06507544A; DK0579640T3; EP0579640A1; GB9107566D0; AU1450992A; EP0579640B1; DE69232693T2; CA2108119A1; KR100274305B1; ATE221083T1; DE69232693D1; AU6808396A; AU703772B2; WO1992018627A1; CA2108119C; IE921062A1; PT100344A; ZA922441B

Description

MEMÓRIA DESCRITIVA presente invento refere-se a novos polipéptidos encontrados em espécies de vertebrados, polipéptidos estes que são factores de crescimento mitogénicos, por exemplo, apresentando aetividade sobre células de Schwann cultivadas. 0 invento também se refere, inter alia, a um novo processo de isolamento capaz de produzir os referidos factores, e à aplicação terapêutica dos referidos factores. 0 invento ainda inclui péptidos úteis característicos dos referidos factores.

As células gliais dos vertebrados constituem o tecido conjuntivo especializado dos sistemas nervosos central e periférico. Entre as células gliais principais estão incluídas as células de Schwann, as quais fornecem a bainha de mielina em redor dos axónios dos neurónios, desse modo originando as fibras nervosas individuais. As células de Schwann fornecem um efeito de bainha por formação de camadas concêntricas de membrana em redor dos axónios dos neurónios adjacentes, retorcendo-se à medida que se desenvolvem em redor dos axónios. Estas bainhas de mielina são um elemento susceptível de muitas fibras nervosas, e a lesão das células de Schwann, ou a falha no crescimento e desenvolvimento, podem estar associadas com desmielinização ou degenerescência nervosa significativas, características de um certo número de doenças e desordens do sistema nervoso periférico. No desenvolvimento do sistema nervoso, tornou-se evidente que as células necessitam de vários factores para regularem a sua divisão e crescimento, e diversos desses factores foram identificados nos últimos anos, incluindo alguns que se verificou apresentarem um efeito sobre a divisão ou desenvolvimento das células de Schwann.

Assim, Brockes e colab., inter alia, em J. Neuroscience, 4 (1984), N^a 1, 75-83, descrevem um factor de crescimento proteico presente em extratos de tecido de pituitária e de cérebro de bovino, o qual foi denominado Factor de Crescimento Glial (GGF). Este factor estimulou células de Schwann de ratazana cultivadas a dividirem-se contra um meio de fundo contendo 10 % de soro de

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vitela fetal. Foi também descrito que o factor possuía um peso molecular de 31 000 e se dimerizava prontamente. Em Meth. Enz. , 147 (1987), 217-225, Brockes descreve um ensaio para este factor baseado em células de Schwann, e enfatiza que, na purificação do factor, se se deseja conservar a sua actividade biológica, deve ser evitada a utilização de HPLC de fase inversa utilizando ácido trifluoroacético como agente de emparelhamento iónico.

O artigo do J. Neuroscience de Brockes e colab., acima, descreve processos de purificação do GGF até à homogeneidade aparente. Em resumo, um processo de purificação em larga escala descrito envolve a extracção dos lobos anteriores de bovino liofilizados e a cromatografia do material assim obtido utilizando eluição com gradiente de NaCl a partir de CM-celulose. É então efectuada filtração em gel com uma coluna Ultrogel, seguida por eluição numa coluna de fosfocelulose, e finalmente, electroforese em SDS-gel em pequena escala. Alternativamente, o material de CM-celulose foi aplicado directamente a uma coluna de fosfocelulose, e as fracções da coluna foram reunidas e purificadas por electroforese em gel nativo preparativa, seguida por uma electroforese em SDS-gel final.

Brockes e colab. referem que nas experiências de filtração em gel anteriormente descritas (Brockes e colab., J. Biol. Chem.. 255 (1980), 8374-8377), se observou que o pico principal de actividade do factor de crescimento migrava com um peso molecular de 56 000, enquanto que no primeiro dos processos anteriormente descritos a actividade foi predominantemente observada a um peso molecular de 31 000. É descrito que, neste procedimento, o dímero de GGF é largamente removido em consequência da eluição com gradiente da CM-celulose.

Em PNAS, 82 (1985), 3930-3934, Benveniste e colab. descrevem um factor de promoção do crescimento glial derivado dos linfócitos T. Este factor, sob condições redutoras, exibe uma alteração no peso molecular aparente em SDS-geles.

Em Nature, 348 (1990), 257-260, Kimura e colab. descrevem

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FPPT92758 um factor, que denominam factor de crescimento derivado de Schwannoma (SDGF), obtido de um tumor da bainha do nervo ciático. Os autores estabelecem que o SDGF não estimula a incorporação de TdR marcado com trítio em células de Schwann cultivadas sob condições onde, em contraste, a fracção de pituitária parcialmente purificada contendo GGF está activa. 0 SDGF possui um peso molecular aparente entre 31 000 e 35 000.

Em J. Cell. Biol., 110 (1990), 1353-1360, Davis e colab. descrevem o rastreio de um certo número de mitogénios candidatos. Foram utilizadas células de Schwann de ratazana, e as substâncias candidatas escolhidas foram examinadas quanto à sua capacidade para estimularem a síntese de ADN nas células de Schwann na presença de 10 % de FCS (soro de vitela fetal), com e sem forscolina. Um dos factores testados foi uma fracção de GGF-carboximetil celulose (GGF-CM), a qual foi mitogénica na presença de FCS, com e sem forscolina. 0 trabalho revelou que na presença de forscolina, inter alia, o factor de crescimento derivado das plaquetas (PDGF) foi um mitogénio potente para as células de Schwann, tendo-se previamente pensado que o PDGF não apresentaria qualquer efeito sobre as células de Schwann.

Um aspecto do presente invento são os novos factores de crescimento gliais, os quais se distinguem dos factores conhecidos, incluindo os anteriores, sendo os referidos factores mitogénicos para células de Schwann contra um fundo de plasma de vitela fetal (FCP). 0 invento também fornece processos para a preparação destes factores, e um processo melhorado para a definição da actividade destes e doutros factores. A aplicação terapêutica destes factores é ainda um aspecto significativo do invento.

Assim, são aspectos importantes do invento:

(a) um factor polipeptídico básico possuindo actividade mitogénica estimuladora da divisão de células de Schwann na presença de plasma de vitela fetal, um peso molecular de cerca de 30 kD a cerca de 36 kD, e incluindo dentro da sua sequência de aminoácidos quaisquer uma ou mais das seguintes sequências

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- C/ £=>'

-5— peptídicas:

F	K	G	D	A	H	T	E
A	s	L	A	D	E	Y	E	Y	M	X	K
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E	Y	K	C	L	K	F	K	w	F	K	K A T V M
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K	L	E	F	L	X	A	K;	e
		(b;	)	um	f	ac	±or	P'	olipeptídico básico possuindo actividade

mitogénica estimuladora da divisão de células de Schwann na presença de plasma de vitela fetal, um peso molecular de cerca de kD a cerca de 63 kD, e incluindo dentro da sua sequência de aminoácidos quaisquer uma ou mais das seguintes sequências peptídicas:

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As novas sequências peptídicas anteriormente expostas, 12 derivadas do factor polipeptídico de peso molecular mais baixo, e 9 do factor polipeptídico de peso molecular mais elevado, também são aspectos deste invento por seu próprio direito. Estas sequências são úteis, inter alia, como fontes de sondas para os factores polipeptídicos do invento, para a investigação, isolamento ou preparação dos referidos factores (ou sequências de genes correspondentes) numa gama de espécies diferentes, ou na preparação dos referidos factores por tecnologia de recombinação,

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e na produção dos anticorpos correspondentes, por tecnologias convencionais, preferivelmente de anticorpos monoclonais, os quais são eles próprios ferramentas de investigação úteis, em relação aos presentes factores, e são possíveis medicamentos. Os referidos anticorpos estão incluídos dentro deste invento. 0 invento também inclui uma sequência de genes que codifica a actividade mitogénica de células gliais, isolada, ou um seu fragmento, obtenível pelo uso, anteriormente exposto, para as novas sequências peptídicas do invento.

A disponibilidade de péptidos curtos a partir dos factores altamente purificados do invento permitiu (tal como será visto em seguida) que a sequência adicional fosse determinada.

Assim, o invento ainda engloba um factor polipeptídico possuindo actividade mitogénica de células gliais e incluindo uma sequência de aminoácidos codificada por:

(a) uma sequência de ADN representada em qualquer uma das Figuras 28a, 28b ou 28c;

(b) uma sequência de ADN representada na Figura 22;

(c) a sequência de ADN representada pelos nucleótidos 281-557 da sequência representada na Figura 28a; ou (d) uma sequência de ADN hibridável com qualquer uma das sequências de ADN de acordo com (a), (b) ou (c).

Ainda que o presente invento não esteja limitado a uma série particular de condições de hibridação, o protocolo seguinte fornece um guia geral, o qual pode, se desejado, ser seguido:

Assim, as sondas de ADN podem ser marcadas para actividade específica elevada (aproximadamente 10⁸ a 10^{9 32}P.dmp/Mg) por tradução por corte ou por reacções PCR de acordo com Schowalter e Sourer (Anal. Bischen., 177, 90-94, 1989), e purificadas por dessalinização em colunas C-150 Sephadex. As sondas podem ser desnaturadas (10 minutos em água em ebulição, seguida por imersão em água gelada), de seguida adicionadas a soluções de hibridação de 80 % de tampão B (2 g de polivinilpirolidina, 2 g

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-Ί de Ficoll-400, 2 g de albumina de soro bovino, 50 ml de Tris HC1 1M (pH 7,5), 58 g de NaCl, 1 g de pirofosfato de sódio, 10 g de dodecil sulfato de sódio, 950 ml de H₂0) contendo 10 % dextrana-sulfato a 10⁶ dpm ³²P por ml, e incubadas durante a noite (digamos 16 horas) a 60°C. Os filtros podem então ser lavados a 60°C, primeiro em tampão durante 15 minutos, seguido por três lavagens de 20 minutos em 2 x SSC, 0,1 % de SDS, seguidas por uma de 20 minutos em 1 x SSC, 0,1 % de SDS.

Em outros aspectos, o invento proporciona:

(a) um factor polipeptídico básico, o qual possui, se obtido do material de pituitária de bovino, um peso molecular observado, em condições redutoras ou não, de cerca de 30 kD a cerca de 36 kD em electroforese em SDS-gel de poliacrilamida, usando os seguintes padrões de peso molecular:

Lisozima (clara de ovo de galinha) 14 400

Inibidor da tripsina de soja 21 500

Anidrase carbónica (bovina) 31 000

Ovalbumina (clara de ovo de galinha) 45 000

Albumina de soro bovino 66 200

Fosforilase B (músculo de coelho) 97 400;

possuindo o referido factor actividade mitogénica estimuladora da divisão de células de Schwann de ratazana na presença de plasma de vitela fetal e, quando isolado utilizando HPLC de fase inversa, retendo pelo menos 50 % da referida actividade após 10 semanas de incubação em ácido trifluoroacético a 0,1 % a 4°C; e (b) um factor polipeptídico básico, o qual possui, se obtido do material de pituitária de bovino, um peso molecular observado, sob condições não redutoras, de cerca de 55 kD a cerca de 63 kD em electroforese em SDS-gel de poliacrilamida, usando os seguintes padrões de peso molecular:

Lisozima (clara de ovo de galinha) 14 400

Inibidor da tripsina de soja 21 500

Anidrase carbónica (bovina) 31 000

Ovalbumina (clara de ovo de galinha) 45 000

Albumina de soro bovino 66 200

Fosforilase B (músculo de coelho) 97 400;

possuindo o referido factor actividade mitogénica estimuladora

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da divisão de células de Schwann de ratazana na presença de plasma de vitela fetal e, quando isolado utilizando HPLC de fase inversa, retendo pelo menos 50 % da referida actividade após 4 dias de incubação em ácido trifluoroacético a 0,1 % a 4°C.

Apenas por conveniência da descrição, os factores de peso molecular mais baixo e de peso molecular mais elevado deste invento serão aqui designados, de agora em diante, por GGF-I e ”GGF-II”, respectivamente.

Notar-se-à que os limites da gama de pesos moleculares citados não são exactos, mas estão sujeitos a uma ligeira variação dependendo, inter alia, da fonte do factor polipeptídico particular. Uma variação de, digamos, cerca de 10 % por exemplo, não seria impossível para o material proveniente de outra fonte.

Um outro aspecto importante do invento é uma sequência de ADN que codifica um polipéptido possuindo actividade mitogénica de células gliais e compreendendo:

(b) uma sequência de ADN representada na Figura 22;

O invento inclui quaisquer modificações ou equivalentes dos dois factores polipeptídicos anteriores, que não exibam uma actividade significativamente reduzida. Por exemplo, estão incluídas modificações nas quais a sequência ou o teor em aminoácidos está alterado sem afectar a actividade de forma substancialmente adversa. Como exemplo, estão descritas muteínas EP-A-109748 de proteínas nativas, nas quais a possibilidade de ligação -S-S- não desejada é evitada por substituição, na sequência nativa, de todas as cisteínas não necessárias para a actividade biológica por um aminoácido neutro. As declarações de efeito e uso aqui contidas devem ser, consequentemente,

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-9edifiçadas de acordo, sendo parte do invento os referidos usos e efeitos empregando factores modificados ou equivalentes tal como anteriormente descrito.

As novas sequências do invento aumentam os benefícios da tecnologia de recombinação. Assim, o invento também inclui os seguintes aspectos:

(a) uma construção de ADN compreendendo uma sequência de ADN como anteriormente definida em posição de estrutura de leitura operável num vector sob o controlo de uma sequência de controlo, de modo a permitir a expressão da referida sequência em células hospedeiras escolhidas após a transformação das mesmas pela referida construção (preferivelmente a referida sequência de controlo inclui um promotor regulável, por ex. Trp) - notar-se-à que a selecção de um promotor e de sequências reguladoras (se alguma) são matérias de escolha para os peritos na arte;

(b) células hospedeiras modificadas por incorporação de uma construção definida como em (a) imediatamente acima, de modo que a referida sequência de ADN possa ser expressa nas referidas células hospedeiras - a escolha do hospedeiro não é crítica, e as células escolhidas podem ser eucariotas ou procariotas e podem ser geneticamente modificadas para incorporarem a referida construção por processos bem conhecidos na arte; e (c) um processo para a preparação de um factor definido como anteriormente, compreendendo cultivar as referidas células hospedeiras modificadas sob condições que permitam a expressão da referida sequência de ADN, condições estas que, para qualquer concretização particular, podem ser prontamente determinadas pelos peritos na arte da tecnologia de recombinação do ADN. Os mitogénios das células gliais preparados deste modo estão incluídos no presente invento.

Nenhum dos factores descritos na arte possui a combinação de características apresentadas pelos presentes novos factores polipeptídicos.

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-ίοTal como indicado, o ensaio de células de Schwann em parte utilizado para caracterizar os presentes factores emprega um fundo de plasma de vitela fetal. Em todos os outros aspectos, o ensaio pode ser igual ao descrito por Brockes e colab. em Me th. Enz., acima, mas utilizando 10 % de FCP em substituição de 10 % de FCS. Esta diferença na técnica do ensaio é significativa, dado que a ausência de factores derivados das plaquetas no plasma de vitela fetal (em oposição ao soro) permite que seja obtida uma definição mais rigorosa da actividade nas células de Schwann por eliminação dos efeitos potencialmente espúrios de alguns outros factores.

Ainda um outro aspecto do presente invento é um processo para a preparação de um polipéptido definido como anteriormente, compreendendo extrair material de cérebro de vertebrado para se obter proteína, submeter o extrato resultante a purificação cromatográfica compreendendo HPLC com hidroxiapatite e, em seguida, a electroforese em SDS-gel de poliacrilamida, e recolher a fracção que possui um peso molecular observado de cerca de 30 kD a 36 kD e/ou a fracção que possui um peso molecular observado de cerca de 55 kD a 63 kD se, em qualquer dos casos, sujeitas a electroforese em SDS-gel de poliacrilamida usando os seguintes padrões de peso molecular:

Lisozima (clara de ovo de galinha) 14 400

Inibidor da tripsina de soja 21 500

Anidrase carbónica (bovina) 31 000

Ovalbumina (clara de ovo de galinha) 45 000

Albumina de soro bovino 66 200

Fosforilase B (músculo de coelho) 97 400;

no caso da fracção de peso molecular mais baixo, anteriormente mencionada, sob condições redutoras ou não, e no caso da fracção de peso molecular mais elevado, anteriormente mencionada, sob condições não redutoras, e exibindo a(s) fracção(ões) actividade mitogénica estimuladora da divisão de células de Schwann de ratazana contra um fundo de plasma de vitela fetal.

Preferivelmente, o processo anterior inicia-se pelo isolamento de uma fracção relevante obtida por cromatografia em

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carboximetilcelulose, por ex. de material de pituitária de bovino. Também é preferido que após a HPLC com hidroxiapatite, seja empregue cromatografia de permuta catiónica, filtração em gel e/ou HPLC de fase inversa, antes da electroforese em SDS-gel de poliacrilamida. Em cada estádio do processo, a actividade pode ser determinada utilizando como medida a incorporação de iododesoxiuridina radioactiva nas células de Schwann, num ensaio geralmente como descrito por Brockes em Meth, Enz., acima, mas modificado por substituição de 10 % de FCS por 10 % de FCP. Tal como anteriormente descrito, o referido ensaio é um aspecto do invento por seu próprio direito quando aplicado na generalidade ao ensaio de qualquer substância quanto aos efeitos mitogénicos sobre as células do SNC ou do SNP, por ex. sobre as células de Schwann.

Assim, o invento também inclui um ensaio da actividade mitogénica das células gliais, no qual é utilizado um fundo de plasma de vitela fetal contra o qual é avaliada a síntese de ADN em células gliais estimuladas (se o forem) por uma substância sob ensaio.

Um outro aspecto do invento é uma formulação farmacêutica ou veterinária compreendendo qualquer factor definido como anteriormente, formulado para uso farmacêutico ou veterinário, respectivamente, opcionalmente em conjunto com um diluente, transportador ou excipiente aceitável e/ou na forma de dosagem unitária. Na utilização dos factores do invento, podem ser empregues práticas farmacêuticas ou veterinárias convencionais para proporcionar formulações ou composições adequadas.

Assim, as formulações deste invento podem ser aplicadas por administração parentérica, por exemplo, intravenosa, subcutânea, intramuscular, intraorbital, oftálmica, intraventricular, intracraneana, intracapsular, intraespinhal, intracisternal, intraperitoneal, tópica, intranasal, por aerossol, por escarificação, e também por administração oral, bucal, rectal ou vaginal.

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As formulações parentéricas podem estar na forma de soluções ou suspensões líquidas; para administração oral, as formulações podem estar na forma de comprimidos ou cápsulas; e para as formulações intranasais, na forma de pós, gotas nasais ou aerossóis.

Os processos bem conhecidos na arte para a preparação de formulações podem ser encontrados, por exemplo, em Remington's Pharmaceutical Science”. As formulações para administração parentérica podem, por exemplo, conter como excipientes, água ou solução salina estéril, polialquilenoglicóis tais como polietilenoglicol, óleos de origem vegetal, ou naftalenos hidrogenados. Podem ser utilizados polímeros de lactido, copolímeros de lactido/glicolido, ou copolímeros de polioxietileno-polioxipropileno, biocompatíveis e biodegradáveis, para controlar a libertação dos presentes factores. Outros sistemas de distribuição parentérica potencialmente úteis para os factores incluem partículas de copolímero de etileno-acetato de vinilo, bombas osmóticas, sistemas de infusão implantáveis, e lipossomas. As formulações para inalação podem conter como excipientes, por exemplo, lactose, ou podem ser soluções aquosas contendo, por exemplo, éter polioxietileno-9-laurílico, glicocolato ou desoxicolato, ou podem ser soluções oleosas para administração na forma de gotas nasais, ou como um gel a ser aplicado intranasalmente. As formulações para administração não parentérica também podem incluir glicocolato para administração bucal, metoxi-salicilato para administração rectal, ou ácido cítrico para administração vaginal.

Os presentes factores podem ser utilizados como os únicos agentes activos, ou podem ser utilizados em combinação com outros ingredientes activos, por ex. , outros factores de crescimento que possam facilitar a sobrevivência dos neurónios em doenças neurológicas, ou inibidores da peptidase ou da protease.

A concentração dos presentes factores nas formulações do invento variará, dependendo de um certo número de questões,

J

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-13incluindo a dosagem a ser administrada, e a via de administração.

Em termos gerais, os factores deste invento podem ser proporcionados numa solução aquosa de tampão fisiológico contendo cerca de 0,1 a 10 % p/v do composto para administração parentérica. As gamas de doses situam-se, no geral, entre cerca de 1 ug/kg e cerca de 1 g/kg de peso corporal por dia; uma gama de doses preferida situa-se entre cerca de 0,01 mg/kg e 100 mg/kg de peso corporal por dia. A dosagem preferida a ser administrada dependerá provavelmente do tipo e da extensão da progressão da condição patofisiológica a ser tratada, do estado geral do doente, da preparação da formulação, e da via de administração.

Tal como anteriormente indicado, as células de Schwann (as células gliais do sistema nervoso periférico) são estimuladas a dividirem-se na presença dos factores do invento. As células de Schwann do sistema nervoso periférico estão envolvidas na formação da bainha de mielina em redor das fibras nervosas individuais, a qual é importante para a condução apropriada dos impulsos eléctricos aos músculos e a partir dos receptores sensitivos.

Existe uma variedade de neuropatias periféricas nas quais as células de Schwann e as fibras nervosas estão lesadas, quer primária quer secundariamente. Existem numerosas neuropatias de ambos os tipos de fibras, motoras e sensitivas (Adams e Victor, Principies of Neuroloav). As mais importantes dessas neuropatias são provavelmente as neuropatias associadas com a diabetes, a síndrome de Landry-Guillain-Barre, neuropatias causadas por carcinomas, e neuropatias causadas por agentes tóxicos (alguns dos quais são utilizados no tratamento dos carcinomas).

invento visa, no entanto, o tratamento e profilaxia de condições onde a lesão do sistema nervoso tenha sido provocada por qualquer causa básica, por ex. infecção ou traumatismo. Assim, para além do uso dos presentes factores no tratamento de desordens ou doenças do sistema nervoso onde a desmielinização ou

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a perda de células de Schwann esteja presente, os referidos factores de crescimento gliais podem ser valiosos no tratamento de doenças do sistema nervoso que tenham sido provocadas por dano dos nervos periféricos. Após o dano dos nervos periféricos, o processo de regeneração é conduzido pelo crescimento ou restabelecimento das células de Schwann, seguido pela progressão da fibra nervosa em direcção ao seu alvo. Por aceleração da divisão das células de Schwann poder-se-ia promover o processo regenerativo após o dano.

Para além disso, existe uma variedade de tumores das células gliais, sendo o mais comum provavelmente a neurofibromatose, a qual é um pequeno tumor variegado criado pelo sobrecrescimento das células gliais. Além disso, verificou-se que pode ser encontrada uma actividade muito semelhante à do GGF em alguns tumores de células de Schwann, e consequentemente, um inibidor da acção dos presentes factores nos seus receptores proporcionaria uma terapia para os tumores gliais. Assim, o invento inclui especificamente um processo para a profilaxia ou tratamento de um tumor glial, o qual compreende a administração duma quantidade eficaz duma substância que inibe a ligação de um factor definido como acima a um seu receptor.

Na generalidade, o invento inclui o uso dos presentes factores polipeptídicos na profilaxia ou tratamento de qualquer condição patofisiológica do sistema nervoso na qual esteja envolvido um tipo de células sensível ou responsivo aos factores.

Os factores polipeptídicos do invento também podem ser utilizados como imunogénios para produzir anticorpos, tais como anticorpos monoclonais, seguindo técnicas padrão. Os referidos anticorpos encontram-se incluídos no presente invento. Estes anticorpos podem, por sua vez, ser utilizados para fins diagnósticos. Assim, condições que possam eventualmente estar associadas com níveis anormais do factor podem ser pesquisadas pela utilização dos referidos anticorpos. Podem ser utilizadas técnicas in vitro empregando ensaios de amostras isoladas, utilizando técnicas padrão. Também podem ser empregues processos

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15de imagem, nos quais os anticorpos são, por exemplo, marcados com isótopos radioactivos, os quais podem ser visualizados do exterior do corpo utilizando técnicas empregues, por exemplo, na arte da imagiologia tumoral.

invento também inclui o uso, na generalidade, dos presentes factores como mitogénios de células gliais in vivo ou in vitro, e os factores para o referido uso. Uma concretização específica é assim um processo para produzir um efeito mitogénico de células gliais num vertebrado por administração de uma quantidade eficaz de um factor do invento. Uma concretização preferida é o uso do referido processo no tratamento ou profilaxia duma doença ou desordem do sistema nervoso.

Um outro aspecto geral do invento é o uso de um factor do invento no fabrico de um medicamento, preferivelmente para o tratamento duma doença ou desordem do sistema nervoso, ou para a regeneração ou reparação neural.

Também se encontra incluído no invento o uso dos factores do invento em ensaios competitivos para identificar ou quantificar moléculas possuindo características de ligação ao receptor correspondentes às dos referidos polipéptidos. Os polipéptidos podem ser marcados, opcionalmente com um radio-isótopo. Um ensaio competitivo pode identificar antagonistas e agonistas do receptor pertinente.

Num outro aspecto, o invento abrange o uso de cada um dos factores do invento num processo de isolamento por afinidade, opcionalmente cromatografia de afinidade, para a separação de um receptor correspondente respectivo. Os referidos processos para o isolamento de receptores correspondentes a proteínas particulares são conhecidos na arte, e estão disponíveis várias técnicas que se podem aplicar aos factores do presente invento. Por exemplo, relativamente à IL-6 e ao IFN-gama, o leitor é reportado a Novick, D. e colab., J. Chromatoqr.. 27 de Junho de 1990, 510, 331-7; relativamente à hormona de libertação da gonadotropina é feita referência a Hazum, E., J. Chromatoqr., 27

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-16de Junho de 1990, 510, 233-8; relativamente ao G-CSF é feita referência a Fukunaga, R. e colab., J. Biol. Chem.. 15 de Agosto de 1990, 265(23), 14008-15; relativamente ao péptido intestinal vasoactivo é feita referência a Couvineau, A. e colab., J. Biol. Chem.. 5 de Agosto de 1990, 265(22), 13386-90; relativamente à IL-2 é feita referência a Smart, J.E. e colab., J. Invest. Dermatol., Junho de 1990. 94(supl. 6), 158S-163S; e relativamente ao IFN-gama humano é feita referência a Stefanos, S. e colab., J. Interferon Res., Dezembro de 1989, 9(6), 719-30.

Os Exemplos seguintes não se destinam a limitar o invento, mas antes a ilustrá-lo de uma forma útil, e a proporcionar um guia específico das técnicas preparativas eficazes.

Tal como será observado no Exemplo 3, mais abaixo, os presentes factores exibem actividade mitogénica numa gama de tipos de células. A actividade em relação aos fibroblastos indica capacidade de reparar ferimentos, e o invento abrange este uso. As declarações gerais do invento relativamente a formulações e/ou medicamentos e ao seu fabrico devem ser claramente elaboradas para incluírem produtos e usos apropriados. Esta é claramente uma expectativa razoável para o presente invento tendo em conta, inter alia, descrições de actividades semelhantes para FGF. Pode, por exemplo, ser feita referência a Sporn e colab., Peptide Growth Factors and their Receptors I¹¹, pág.396 (Baird e Bohlen), na secção entitulada ”FGFs in Wound Healinq and Tissue Repair¹¹.

Nos desenhos acompanhantes:

as Figuras 1 a 8 referem-se ao Exemplo 1, abaixo, e são, em seguida, resumidamente descritas:

a Figura 1 é o perfil para o produto da cromatografia em carboximetilcelulose;

a Figura 2 é o perfil para o produto da HPLC em hidroxiapatite;

a Figura 3 é o perfil para o produto da Mono S FPLC;

a Figura 4 é o perfil para o produto da FPLC - filtração em gel;

as Figuras 5 e 6 são os perfis para os dois produtos polipeptídicos parcialmente purificados da HPLC de fase inversa;

827

FPPT92758

e as Figuras 7 e 8 são curvas de resposta à dose para as fracções GGF-I e GGF-II da HPLC de fase inversa, utilizando um fundo de soro de vitela fetal ou um plasma de vitela fetal;

as Figuras 9 a 12 representam péptidos derivados de GGF-I e GGF-II (ver Exemplo 2, abaixo), com as Figuras 10 e 12 a mostrarem especificamente novas sequências:

na Figura 10, Painel A, estão representadas as sequências dos péptidos de GGF-I utilizadas para projectar sondas de oligonucleótidos degeneradas e iniciadores de PCR degenerados. Algumas dessas sequências no Painel A também foram utilizadas para projectar péptidos sintéticos. 0 Painel B representa os novos péptidos que eram demasiado curtos (menos de 6 aminoácidos) para projectar sondas degeneradas ou iniciadores de PCR degenerados;

na Figura 12, Painel A, estão representadas as sequências dos péptidos de GGF-II utilizadas para projectar sondas de oligonucleótidos degeneradas e iniciadores de PCR degenerados. Algumas dessas sequências no Painel A também foram utilizadas para projectar péptidos sintéticos. O Painel B representa os novos péptidos que eram demasiado curtos (menos de 6 aminoácidos) para projectar sondas degeneradas ou iniciadores de PCR degenerados;

as figuras 13 a 20 referem-se ao Exemplo 3, abaixo, e representam os vários aspectos da actividade mitogénica dos factores do invento;

as Figuras 21 a 28 (a, b e c) referem-se ao Exemplo 4, abaixo, e são resumidamente descritas em seguida:

a Figura 21 cataloga as sondas de oligonucleótidos degeneradas que foram projectadas a partir das novas sequências peptidicas catalogadas na Figura 10, Painel A e na Figura 12, Painel A;

a Figura 22 representa uma cadeia da sequência do gene GGF-II de bovino putativo do fago genómico bovino recombinante GGF2BG1, o qual contém o local de ligação das sondas de oligonucleótidos degeneradas 609 e 650 (ver Figura 21). Estão representadas as cadeias codificadoras da sequência de ADN e a sequência de aminoácidos deduzida na terceira estrutura de

827

FPPT92758 .^7/-18leitura. A sequência do péptido 12 do factor 2 (a negrito) faz parte de uma estrutura de leitura aberta de 66 aminoácidos (nucleótidos 75-272);

a Figura 23 cataloga os iniciadores de PCR degenerados (Painel A) e os iniciadores de PCR únicos (Painel B) utilizados em experiências para isolar de segmentos das sequências codificadoras do GGF-II de bovino presentes no ARN da pituitária posterior;

a Figura 24 resume as nove estruturas do ADNc do GGF-II de bovino contíguas distintas e as sequências que foram obtidas em experiências de amplificação de PCR utilizando a lista de iniciadores da Figura 7, Painéis A e B, em ARN de pituitária posterior. A linha superior da Figura representa um esquema das sequências dos exões que contribuem para as estruturas do ADNc que foram caracterizadas;

a Figura 25 é um mapa físico do fago recombinante bovino de GGF2BG1. 0 fragmento bovino tem aproximadamente 20 kb de comprimento e contém dois exões (a negrito) do gene de GGF-II de bovino. Foram dispostos neste mapa físico os locais de restrição para os enzimas Xbal, Spe I, Ndel, EcoRl, Kpnl, e Sstl. As porções sombreadas correspondem aos fragmentos que foram subclonados para sequenciação;

a Figura 26 representa esquematicamente a estrutura de três produtos de genes alternativos do gene GGF-II de bovino putativo. Os exões são designados de A a E pela ordem em que se foram obtendo. Os padrões de união alternativos 1, 2 e 3 originam três estruturas proteicas deduzidas sobrepostas (GGG2BPP1, 2 e 3), as quais se encontram representadas nas diversas Figuras 28;

a Figura 27 compara as sequências de GGF-I e de GGF-II identificadas nas sequências proteicas deduzidas representadas nas Figuras 28a, 28b e 28c, com as novas sequências peptídicas representadas nas Figuras 10 e 12. A Figura mostra que seis das nove novas sequências peptídicas de GGF-II são consideradas nestas sequências proteicas deduzidas. Também são encontradas duas sequências peptídicas semelhantes às sequências de GGF-I;

a Figura 28a representa a sequência do ADN da cadeia codificadora e a sequência de aminoácidos deduzida do ADNc

827

FPPT92758 -19- L obtida a partir do padrão de união número 1, representado na Figura 26. Este ADNc parcial do gene GGF-II de bovino putativo codifica uma proteína de 207 aminoácidos de comprimento. Os péptidos representados a negrito foram aqueles identificados nas listas apresentadas nas Figuras 10 e 12. Os locais de glicosação potenciais encontram-se sublinhados (em conjunto com o sinal de poliadenilação AATAAA);

a Figura 28b representa a sequência do ADN da cadeia codificadora e a sequência de aminoácidos deduzida do ADNc obtida a partir do padrão de união número 2, representado na Figura 26. Este ADNc parcial do gene GGF-II de bovino putativo codifica uma proteína de 264 aminoácidos de comprimento. Os péptidos representados a negrito foram aqueles identificados nas listas apresentadas nas Figuras 10 e 12. Os locais de glicosação potenciais encontram-se sublinhados (em conjunto com o sinal de poliadenilação AATAAA);

a Figura 28c representa a sequência do ADN da cadeia codificadora e a sequência de aminoácidos deduzida do ADNc obtida a partir do padrão de união número 3, representado na Figura 26. Este ADNc parcial do gene GGF-II de bovino putativo codifica uma proteína de 258 aminoácidos de comprimento. Os péptidos representados a negrito foram aqueles identificados nas listas apresentadas nas Figuras 10 e 12. Os locais de glicosação potenciais encontram-se sublinhados (em conjunto com o sinal de poliadenilação AATAAA); e as sequências de ADN representadas nas Figuras 28a, 28b e 28c são, elas próprias, aspectos adicionais deste invento; e o invento ainda inclui os polipéptidos codificados pelas referidas sequências;

a Figura 29 refere-se ao Exemplo 6, abaixo, e representa um auto-radiograma de uma análise de hibridação cruzada das sequências do gene GGF-II de bovino putativo com diversos ADN de mamífero numa de transferência Southern. 0 filtro contém faixas de ADN digerido com Eco RI (5 /xg por faixa) das espécies registadas na Figura. A sonda detecta uma única banda forte em cada amostra de ADN, incluindo um fragmento de 4 kb no ADN de bovino, tal como previsto pelo mapa físico da Figura 25. Também são observadas bandas de relativamente menor densidade,

827

FPPT92758

-20as quais podem representar sequências de ADN relacionadas. A banda de hibridação forte de cada uma das outras amostras de ADN de mamífero representa presumivelmente o homólogo do GGF-II daquelas espécies.

No Exemplo 1, abaixo, excepto se indicado em contrário, todas as operações foram executadas a 4°C e, no que se refere às Figuras 1 a 6, a actividade de cada estádio foi determinada utilizando as técnicas de Brockes (Meth. Enz., acima) com as modificações seguintes. Assim, na preparação das células de Schwann, foi adicionada forscolina 5μΜ para além do DMEM (meio de Eagle modificado de Dulbecco), FCS e GGF. As células utilizadas no ensaio foram células de schwann isentas de fibroblastos a um número de passagens inferior a 10, e estas células foram removidas de balões com tripsina e colocadas em placas com 96 poços de fundo plano a 3,3 mil células por micropoço. Foi adicionada [¹²⁵l]IUdR para as últimas 24 horas após a adição da solução em teste. A incorporação de base (não estimulada) para cada ensaio foi inferior a 100 cpm, e a incorporação máxima foi 20 a 200 vezes superior à de base, dependendo do lote e número de passagens das células de Schwann.

No caso das fracções de GGF-I e de GGF-II da HPLC de fase inversa, tal como descrita abaixo no Exemplo 1, também foram produzidas duas curvas de resposta à dose para cada factor, utilizando exactamente o processo anterior para uma das curvas para cada factor, e o processo anterior modificado no procedimento de ensaio, apenas pela substituição do soro de vitela fetal por plasma de vitela fetal, para a obtenção da outra curva para cada factor. Os resultados estão representados nas Figuras 7 e 8.

EXEMPLO 1 (A) Preparação da Fraccão CM do Factor

Quatro mil pituitárias completas de bovino congeladas (cerca de 12 kg) foram descongeladas durante a noite, lavadas brevemente com água e, em seguida, homogeneizadas num volume igual de sulfato de amónio 0,15 M, em lotes, num misturador

-2173 827

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Waring. 0 homogeneizado foi levado até pH 4,5 com HC1 1,0 M, e centrifugado a 4 900 g durante 80 minutos. Todo o material gordo no sobrenadante foi removido por passagem através de lã de vidro. Após elevação do pH do sobrenadante até 6,5 utilizando NaOH 1,0 M, foi adicionado sulfato de amónio sólido para dar uma solução saturada a 36 %. Depois de várias horas de agitação, a suspensão foi centrifugada a 4 900 g durante 80 minutos, e o precipitado foi rejeitado. Após filtração através de lã de vidro, foi adicionado mais sulfato de amónio sólido ao sobrenadante para dar uma solução saturada a 75 %, a qual foi novamente centrifugada, uma vez, a 4 900 g durante 80 minutos, após várias horas de agitação. A pelota foi ressuspensa em cerca de 2 1 de fosfato de sódio 0,1 M, pH 6,0, e dialisada contra 3 x 40 1 do mesmo tampão. Depois da confirmação de que a condutividade do dialisado era inferior a 20,0 mSiemens, este foi carregado numa coluna Bioprocess (120 x 113 mm, Pharmacia) empacotada com carboximetilcelulose (CM-52, Whatman), a um caudal de 2 ml.min^-1. A coluna foi lavada com 2 volumes de fosfato de sódio 0,1 M, pH 6,0, seguidos por 2 volumes de NaCl 50 mM, e finalmente por 2 volumes de NaCl 0,2 M, ambos no mesmo tampão. Durante o passo final, foram recolhidas fracções de 10 ml (5 minutos). As fracções 73 a 118 inclusivé foram reunidas, dialisadas, duas vezes, contra os 10 volumes de fosfato de sódio 10 M, pH 6,0, e clarificadas por centrifugação a 100 000 g durante 60 minutos.

(B) HPLC em Hidroxiapatite

A HPLC em hidroxiapatite não é uma técnica, até agora, utilizada no isolamento dos factores de crescimento gliais, mas provou ser particularmente eficaz neste invento.

O material obtido a partir da cromatografia em CM-celulose anterior foi filtrado através de um filtro de 0,22 gm (Nalgene), carregado à temperatura ambiente numa coluna de hidroxiapatite de elevado rendimento (50 x 50 mm, Biorad) equipada com uma coluna protectora (15 x 25 mm, Biorad), e equilibrado com fosfato de potássio 10 mM, pH 6,0. A eluição à temperatura ambiente foi efectuada a um caudal de 2 ml.min”¹ utilizando o

827

FPPT92758 seguinte gradiente linear programado:

Solvente A:

Tempo(min)	% de B
0,0	0
5,0	0
7,0	20
70,0	20
150,0	100
180,0	100
185,0	0

fosfato de potássio 10 mM, pH 6,

Solvente B:

fosfato de potássio 1,0 M, pH 6,0

Durante a eluição com gradiente foram recolhidas fracções de 6,0 ml (3 minutos). As fracções 39-45 foram reunidas e dialisadas contra 10 volumes de fosfato de sódio 50 mM, pH 6,0.

(C) Mono S FPLC

A Mono S FPLC permitiu a preparação de um material mais concentrado para a filtração em gel subsequente.

Todo o material particulado no material reunido a partir da coluna de hidroxiapatite foi removido por uma rotação de clarificação a 100 000 g durante 60 minutos, antes de ser carregado numa coluna de permuta catiónica HR10/10 Mono S preparativa (100 x 10 mm, Pharmacia), a qual foi de seguida re-equilibrada com fosfato de sódio 50 mM, pH 6,0, à temperatura

ambiente, a um caudal de 1,0 ml.min^-1. Sob estas condições, a
proteína ligada foi linear programado:	eluida utilizando o seguinte gradiente
		Solvente A:
		fosfato de potássio 50 mM, pH 6,0
		Solvente B:
Tempo(min)	% de B	cloreto de sódio 1,2 M, fosfato de sódio 50 mM, pH 6,0
0,0	0
70,0	30
240,0	100
250,0	100
260,0	0

827

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-23- < Γ

Durante este programa de gradiente foram recolhidas fracções de 1 ml (1 minuto). As fracções 99 a 115 inclusivé foram reunidas.

(D) FPLC - Filtração em Gel

Este passo iniciou a separação dos dois factores do invento antes da purificação final, produzindo fracções enriquecidas.

Para os objectivos deste passo, uma coluna de FPLC Superose 12 preparativa (510 x 20 mm, Pharmacia) foi empacotada de acordo com as instruções do fabricante. A fim de padronizar esta coluna, foi efectuada uma medição teórica dos pratos de acordo com as instruções do fabricante, originando um valor teórico de 9 700 pratos.

material eluído da Mono S, reunido, foi aplicado, à temperatura ambiente, em alíquotas de 2,5 ml a esta coluna em fosfato de sódio 50 mM, NaCl 0,75 M, pH 6,0 (previamente passado através de uma coluna de fase inversa C18 (Sep-pak, Millipore)), a um caudal de 1,0 ml.min^-1. Foram recolhidas fracções de 1 ml (0,5 minuto) durante 35 minutos, depois de cada amostra ter sido aplicada à coluna. Foram reunidas as fracções 27 a 41 (GGF-II) e 42 a 57 (GGF-I) inclusivé de cada passagem.

(E) HPLC de Fase inversa

As reuniões de GGF-I e GGF-II das passagens em Superose 12 anteriores foram, cada um deles, divididos em três alíquotas iguais. Cada alíquota foi carregada numa coluna de fase inversa C8 (Aquapore RP-300 7 μ C8 220 x 4,6 mm, Applied Biosystems) protegida por um cartucho protector (RP-8, 15 x 3,2 mm, Applied Biosystems), e equilibrada a 40°C a 0,5 ml.min”·¹. A proteína foi eluída sob estas condições, utilizando o seguinte gradiente linear programado:

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-24Tempo(min) % de B

Solvente A:

ácido trifluoroacético a 0,1% (TFA)

Solvente B:

acetonitrilo a 90%, TFA a 0,1%

62,0

72,0

75,0

66,6

100

Foram recolhidas fracções de 200 μΐ (0,4 minuto) em tubos revestidos com silicone (siliconised) (tubos Multilube, Bioquote) a partir de 15,2 minutos após o início do gradiente programado.

(F) Electroforese em SDS-Gel de Poliacrilamida

Neste passo foram aplicados padrões de peso molecular proteicos, gama baixa, catálogo n² 161-0304, de Bio-Rad Laboratories Limited, Watford, Inglaterra. As proteínas reais utilizadas, e os seus padrões de peso molecular, foram aqui anteriormente catalogadas.

As fracções 47 a 53 (GGF-I) e as fracções 61 a 67 (GGF-II) inclusivé das passagens de fase inversa foram reunidas individualmente. Sete μΐ do material reunido foram colocados em ebulição num volume igual de Tris-Cl 0,0125 M, 4 % de SDS, 20 % de glicerol e 10 % de ρ-mercaptoetanol para o GGF-I, durante 5 minutos e carregados para um gel de Leammli de poliacrilamida com um gel de empilhamento a 4 %, e passados a uma voltagem constante de 50 V durante 16 horas. Este gel foi então fixado e corado utilizando um conjunto de coloração de prata (Amersham). Sob estas condições, os factores são, cada um deles, de alguma forma vistos como uma banda difusa a pesos moleculares relativos de 30 000 a 36 000 daltons (GGF-I) e de 55 000 a 63 000 daltons GGF-II), como definido pelos marcadores de peso molecular. Da coloração do gel, torna-se evidente que existe um pequeno número de outras espécies proteicas presentes a níveis equivalentes aos das espécies do GGF-I e do GGF-II no material reunido a partir

827

FPPT92758 das passagens de fasa inversa.

Estabilidade no Ácido Trifluoroacético

Os dados sobre a estabilidade foram obtidos, para os presentes factores, na presença de ácido trifluoroacético, como se segue:

GGF-I material da HPLC de fase inversa, na presença de TFA a 0,1 % e de acetonitrilo, foi analisado dentro de 12 horas após a conclusão da passagem pela coluna e, em seguida, após 10 semanas de incubação a 4°C. Depois da incubação, o GGF-I tinha pelo menos 50 % da actividade do material analisado directamente à saída da coluna.

GGF-II material da HPLC de fase inversa, na presença de TFA a 0,1 % e de acetonitrilo, e armazenado a -20°C, foi analisado após descongelação e, em seguida, após 4 dias de incubação a 4°C. Depois da incubação, o GGF-II tinha pelo menos 50 % da actividade do material recentemente descongelado.

Ter-se-à em conta que a concentração do ácido trifluoroacético utilizada nos estudos anteriores é aquela mais habitualmente utilizada para a cromatografia de fase inversa.

EXEMPLO 2

Os estudos de análise da sequência de aminoácidos foram executados utilizando GGF-I e GGF-II de pituitária de bovino altamente purificados. Para descrever as sequências foi utilizado o código convencional de letra única. Os péptidos foram obtidos por digeridos de lisil endopeptidases e protease V8, executados em amostras reduzidas e carboximetiladas, com o digerido de lisil endopeptidase de GGF-II executado sobre material eluído da região 55-65 kD de uma SDS-PAGE a 11 % (PM relativo aos marcadores anteriormente mencionados).

Foi obtido um total de 21 sequências peptídicas (ver Figura

827

FPPT92758

-269) para GGF-I, das quais 12 péptidos (ver Figura 10) não estão presentes nas bases de dados proteicas correntes e, consequentemente, representam sequências únicas. Foi obtido um total de 12 sequências peptídicas (ver Figura 11) para GGF-II, das quais 10 péptidos (ver Figura 12) não estão presentes nas bases de dados proteicas correntes e, consequentemente, representam sequências únicas (uma excepção é o péptido GGF-II 06, o qual apresenta sequências idênticas em muitas proteínas, as quais não têm provavelmente significado dado o pequeno número de resíduos). É extremamente provável que estas novas sequências correspondam a porções das verdadeiras sequências de aminoácidos de GGF-I e GGF-II.

Pode-se dar atenção particular às sequências de GGF-I 07 e GGF-II 12, as quais são de um modo claro altamente relacionadas. As semelhanças indicam que as sequências destes péptidos são quase certamente aquelas das espécies de GGF especificadas, e é muito improvável que sejam derivadas de proteínas contaminantes.

Além disso, no péptido GGF-II 02, a sequência X S S é consistente com a presença de uma porção de hidrato de carbono ligada ao N numa asparagina na posição designada por X.

Na generalidade, nas Figuras 9 e 11, X representa um resíduo desconhecido assinalando um ciclo de sequenciação onde uma posição simples não poderia ser chamada com certeza, porque existia mais de um sinal da mesma dimensão no ciclo, ou porque nenhum sinal estava presente. Um asterisco assinala aqueles péptidos onde o último aminoácido chamado corresponde ao último aminoácido presente nesse péptido. Nos péptidos restantes, a força do sinal depois do último aminoácido chamado foi insuficiente para continuar a chamada da sequência até ao fim desse péptido. A coluna do lado direito indica os resultados de uma pesquisa numa base de dados de computador utilizando os programas FASTA e TFASTA pacote GCG para analisar as bases de dados de sequências NBRF e EMBL. o nome de uma proteína nesta coluna indica identidade de uma porção da sua sequência com a sequência de aminoácidos do péptido chamado, sendo permitido um

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FPPT92758

-27máximo de dois erros. 0 ponto de interrogação assinala três erros permitidos. As abreviaturas utilizadas são como se segue:

HMG-1 Proteína 1 do Grupo de Elevada Mobilidade

HMG-2 Proteína 2 do Grupo de Elevada Mobilidade

LH-alfa subunidade alfa da Hormona Luteinizante

LH-beta subunidade beta da Hormona Luteinizante

EXEMPLO 3

Foi estudada a actividade mitogénica duma amostra altamente purificada contendo GGF-I e II utilizando um processo quantitativo, o qual permite o exame de uma única microcultura quanto à síntese de ADN, morfologia celular, número de células e expressão de antigénios celulares. Esta técnica foi modificada a partir de um processo anteriormente descrito por Muir, D. e colab., Analvtical Biochemistrv 185, 377-382, 1990. As modificações principais são: 1) a utilização de placas de microtitulação não revestidas, 2) o número de células por poço,

3) a utilização de plasma de bovino fetal (FBP) a 5 % em vez de soro de vitela fetal (FCS) a 10 %, e 4) o tempo de incubação na presença de mitogénios e bromodesoxiuridina (BrdU), adicionados simultaneamente às culturas. Além disso, a monocamada de células não foi lavada antes da fixação a fim de evitar a perda de células, e o tempo de incubação do anticorpo monoclonal anti-BrdU de ratinho e do anticorpo de cabra anti-imunoglobulina (Ig G) de ratinho conjugado com peroxidase, foi duplicado para aumentar a sensibilidade do ensaio. 0 ensaio, optimizado para as células de Schwann do nervo ciático de ratazana, também foi utilizado para diversas outras linhas de células, após as modificações apropriadas às condições de cultura das células.

Processos

No dia 1, as células de Schwann purificadas foram colocadas em placas de 96 poços não revestidas, em FBP a 5 % / Meio de Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM) (5 000 células/poço). No dia 2, os GGF, ou outros factores a serem testados, foram adicionados às culturas, bem como BrdU a uma concentração final

-28χ^

827

FPPT92758 de 10 mM. Após 48 horas (dia 4), a incorporação de BrdU foi interrompida pela aspiração do meio, e as células foram fixadas com 200 μΐ/poço de etanol a 70 %, durante 20 minutos à temperatura ambiente. Em seguida, as células foram lavadas com água, e o ADN foi desnaturado por incubação com 100 μΐ de HC1 2N durante 10 min a 37°C. A seguir à aspiração, o ácido residual foi neutralizado por enchimento dos poços com tampão borato 0,1 M, pH 9,0, e as células foram lavadas com solução salina tamponada com fosfato (PBS). As células foram então tratadas com 50 μΐ de tampão de bloqueio (PBS contendo 0,1 % de Triton X-100 e 2 % de soro de cabra normal) durante 15 min a 37°C. Após a aspiração, o anticorpo monoclonal anti-BrdU de ratinho (Dako Corp. Santa Barbara, CA) (50 μΐ/poço, 1,4 μg/ml diluído em tampão de bloqueio) foi adicionado e incubado durante 2 horas a 37°C. Os anticorpos não ligados foram removidos com três lavagens em PBS contendo 0,1 % de Triton X-100, e o anticorpo de cabra anti-IgG de ratinho conjugado com peroxidase (Dako Corp. Santa Barbara, CA) (50 μΐ/poço, 2 μg/ml diluído em tampão de bloqueio) foi adicionado e incubado durante uma hora a 37°C. Depois de três lavagens em PBS/Triton e um enxaguamento final em PBS, os poços receberam 100 μΐ/poço de tampão fosfato/citrato 50 μΜ, pH 5,0, contendo 0,05 % do cromogéneo solúvel o-fenilenodiamina (OPD) e 0,02 % de H₂O2· A reacção foi interrompida, após 5-20 minutos à temperatura ambiente, por pipetagem de 80 μΐ de cada poço para uma placa limpa contendo 40 μΐ/poço de ácido sulfúrico 2N. Foi registada a absorvância a 490 nm utilizando um leitor de placas (Dynatech Labs.). As placas de ensaio contendo as monocamadas de células foram lavadas, duas vezes, com PBS e foram imunocitoquimicamente coradas para BrdU-ADN pela adição de 100 μΐ/poço do substrato diaminobenzidina (DAB) e 0,02 % de H₂0₂ para originar um produto insolúvel. Depois de 10-20 minutos, a reacção de coloração foi interrompida por lavagem com água, e os núcleos positivos para a BrdU foram observados e contados utilizando um microscópio invertido. Ocasionalmente, os núcleos negativos foram contraçorados com azul de Toluidina a 0,001 %, e contados como anteriormente.

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FPPT92758 , ν

-29Linhas de Células

Fibroblastos Swiss 3T3

Células, de Flow Labs, foram mantidas em DMEM suplementado com FCS a 10 %, penicilina e estreptomicina, a 37°C numa atmosfera humidificada de C0₂ a 10 % em ar. As células foram nutridas ou subcultivadas de dois em dois dias. Para o ensaio mitogénico, as células foram colocadas a uma densidade de 5 000 células/poço em meio completo, e incubadas durante uma semana até as células se tornarem confluentes e quiescentes. 0 meio contendo o soro foi removido, e a monocamada de células foi lavada duas vezes com meio isento de soro. Foram adicionados 100 μΐ de meio isento de soro contendo mitogénios e BrdU 10 μΜ a cada poço, e incubados durante 48 horas. Foram efectuadas respostas à dose para os GGF e soro ou PDGF (como um controlo positivo).

Fibroblastos BHK (Rim de Hamster Bébé) 21 C13

Células, da Colecção Europeia de Culturas de Células de Animais (ECACC), foram mantidas em Meio de Eagle Modificado de Glasgow (GMEM) suplementado com caldo de triptose fosfato a 5 %, FCS a 5 %, penicilina e estreptomicina, a 37°C numa atmosfera humidificada de CO₂ a 5 % em ar. As células foram nutridas ou subcultivadas de dois em dois ou de três em três dias. Para o ensaio mitogénico, as células foram plaqueadas a uma densidade de 2 000 células/poço em meio completo durante 24 horas. 0 meio contendo o soro foi então removido, e após lavagem com meio isento de soro, substituído por 100 μΐ de FCS a 0,1 % contendo GMEM, ou GMEM sozinho. Foram adicionados GGF e FCS ou bFGF como controlos positivos, coincidente com BrdU 10 μΜ, e incubados durante 48 horas. As culturas de células foram então processadas tal como descrito para as células de Schwann.

Linha de Células de Glioma de Ratazana C6

Células, obtidas à passagem 39, foram mantidas em DMEM contendo FCS a 5 %, soro de cavalo (HS) a 5 %, penicilina e estreptomicina, a 37°C numa atmosfera humidificada de C0₂ a 10 % em ar. As células foram nutridas ou subcultivadas de três em três dias. Para o ensaio mitogénico, as células foram plaqueadas

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-30- é <;. ' a uma densidade de 2 000 células/poço em meio completo e incubadas durante 24 horas. Em seguida, o meio foi substituído por uma mistura de DMEM e meio F12 1:1 contendo FCS a 0,1 %, após lavagem em meio isento de soro. Foram então efectuadas respostas à dose para os GGF, FCS e aFGF, e as células foram processadas através de ELISA tal como anteriormente descrito para os outros tipos de células.

PC12 (Células de Feocromocitoma da Glândula Suprarrenal de Ratazana)

Células, da ECACC, foram mantidas em RPMI 1640 suplementado com HS a 10 %, FCS a 5 %, penicilina e estreptomicina, em balões revestidos com colagénio, a 37°C numa atmosfera humidificada de CO₂ a 5 % em ar. As células foram nutridas de três em três dias por substituição de 80 % do meio. Para o ensaio mitogénico, as células foram plaqueadas a uma densidade de 3 000 células/poço em meio completo, em placas revestidas com colagénio (50 μΐ de colagénio/poço, Vitrogen Collagen Corp., diluído a 1:50, 30 min a 37°C), e incubadas durante 24 horas. O meio foi então substituído por RPMI fresco, sozinho ou contendo insulina 1 μΜ ou FCS a 1 %. Foram efectuadas, como anteriormente, respostas à dose para FCS/HS (1:2) como controlo positivo, e para os GGF. Após 48 horas, as células foram fixadas e o ELISA foi executado tal como anteriormente descrito.

Resultados

Todas as experiências apresentadas neste Exemplo foram efectuadas utilizando uma amostra altamente purificada, obtida a partir dum passo de purificação por cromatografia em Superose 12 (ver Exemplo 1, secção D), contendo uma mistura de GGF-I e GGF-II.

Em primeiro lugar, os resultados obtidos do ensaio de incorporação da BrdU foram comparados com os do ensaio mitogénico clássico para as células de Schwann baseado na incorporação de [¹²⁵I]-UdR no ADN das células em divisão, descrito por J.P.Brockes (Methods Enzvmol., 147:217, 1987).

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-31- ^c'

A Figura 13 mostra a comparação dos dados obtidos com os dois ensaios, efectuados nas mesmas condições de cultura das células (5 000 células/poço, em FBP a 5 % / DMEM, incubadas na presença dos GGF durante 48 horas). Tal como é claramente demonstrado, os resultados são comparáveis, mas o ensaio de incorporação da BrdU parece ser ligeiramente mais sensível, tal como é sugerido pela deslocação da curva para a esquerda no gráfico, isto é, para concentrações mais baixas dos GGF.

Tal como descrito na secção Processos, depois do BrdU-ADN imunorreactivo ter sido quantificado por leitura da intensidade do produto solúvel da reacção de peroxidase com OPD, as placas de ensaio originais contendo as monocamadas de células podem ser submetidas à segunda reacção originando o produto de DAB insolúvel, o qual cora os núcleos positivos para a BrdU. As microculturas podem então ser examinadas sob um microscópio invertido, e podem ser observados a morfologia celular e os números de núcleos positivos e negativos para a BrdU.

Nas Figuras 14a e 14b, a imunorreactividade do BrdU-ADN, avaliada pela leitura da absorvancia a 490 nm, é comparada com o número de núcleos positivos para a BrdU e com a percentagem de núcleos positivos para a BrdU em relação ao número total de células por poço, contados nas mesmas culturas. Os desvios padrão foram inferiores a 10 %. Os dois processos de avaliação mostram uma correlação muito boa, e a discrepância entre os valores com a dose mais elevada dos GGF pode ser explicada pela diferente extensão da síntese de ADN nas células detectadas como positivas para a BrdU.

ensaio de incorporação da BrdU pode, consequentemente, propocionar uma informação útil adicional acerca da actividade biológica dos GGF sobre as células de Schwann quando comparado com o ensaio da incorporação da [¹²⁵I]-UdR. Por exemplo, os dados registados na Figura 15 mostram que os GGF podem actuar sobre as células de Schwann induzindo a síntese de ADN, mas que em doses mais baixas aumentam o número de células negativas presentes na microcultura após 48 horas.

ο

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-320 ensaio foi por conseguinte utilizado em diversas linhas de células de diferentes origens. Na Figura 16, foram comparadas as respostas mitogénicas das células de Schwann e dos fibroblastos Swiss 3T3 aos GGF; apesar da fraca resposta obtida nos fibroblastos 3T3, foram detectados nestas culturas alguns núcleos claramente positivos para a BrdU. As culturas de controlo foram passadas em paralelo na presença de diversas doses de FCS ou PDGF recombinante humano, mostrando que as células podem responder aos estímulos apropriados (não representados).

A capacidade dos fibroblastos para responderem aos GGF foi adicionalmente investigada utilizando a linha de células BHK 21 C13. Estes fibroblastos, derivados do rim, não exibem inibição de contacto ou atingem um estado quiescente quando confluentes. Por esse motivo, as condições experimentais foram projectadas de forma a apresentarem uma proliferação de fundo muito baixa sem compreender a viabilidade celular. Os GGF apresentam uma actividade mitogénica significativa sobre as células BHK 21 C13, tal como representado nas Figuras 17 e 18.

A Figura 17 representa a incorporação da BrdU no ADN das células BHK 21 C13 estimuladas pelos GGF na presença de FCS a 0,1 %. A resposta mitogénica boa ao FCS indica que as condições de cultura das células não foram limitantes. Na Figura 18, o efeito mitogénico dos GGF é expresso como os números de células positivas e negativas para a BrdU e como o número total de células contadas por poço. Os dados são representativos de duas experiências passadas em duplicado; foram contados pelo menos três campos por poço. Tal como observado para as células de Schwann, para além de um efeito proliferativo a doses baixas, os GGF também aumentam o número de células não responsivas sobreviventes. A percentagem de células positivas para a BrdU é proporcional às quantidades crescentes de GGF adicionadas às culturas. 0 número total de células após 48 horas na presença de doses elevadas de GGF é pelo menos duplo, confirmando que os GGF induzem a síntese de ADN e a proliferação nas células BHK 21 C13. Sob as mesmas condições, as células mantidas durante 48

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-33horas na presença de FCS a 2 % mostraram um aumento de cerca de seis vezes (não representado).

As células de glioma C6 proporcionaram um modelo útil para o estudo das propriedades das células gliais. 0 fenótipo expresso parece ser dependente da passagem das células, com as células assemelhando-se mais estreitamente a um fenótipo de astrócito num estágio precoce, e a um fenótipo de oligodendrócito em estágios mais tardios (para além da passagem 70). Foram utilizadas nestas experiências células C6 da passagem 39 até à passagem 52. As células C6 são uma população altamente proliferante, e em consequência as condições experimentais foram optimizadas para apresentarem um fundo muito baixo de incorporação da BrdU.Foi necessária a presença de soro a 0,1 % para manter a viabilidade celular sem afectar significativamente as respostas mitogénicas, tal como mostrado pelas respostas à dose para o FCS (Figura 19).

Na Figura 20, as respostas mitogénicas ao aFGF (Factor de Crescimento de Fibroblasto) e aos GGF são expressas como as percentagens de incorporação da BrdU máximas obtidas na presença de FCS (8 %). Os valores representam as médias de duas experiências, passadas em duplicado. O efeito dos GGF foi comparável ao de uma preparação pura de aFGF. O aFGF foi descrito como um factor de crescimento específico para as células C6 (Lim, R. e colab., Cell Regulation, 1:741-746, 1990), e por esse motivo foi utilizado como um controlo positivo. A contagem directa das células positivas e negativas para a BrdU não foi possível dada a elevada densidade celular nas microculturas.

Em contraste com as linhas de células até aqui descritas, as células PC12 não mostraram qualquer sensibilidade evidente aos GGF, quando tratadas sob condições de cultura nas quais as células PC12 poderiam responder aos soros (mistura de FCS e HS tal como rotineiramente utilizada para a manutenção de células). No entanto, o número de células plaqueadas por poço parece afectar o comportamento das células PC12, e por conseguinte

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-34tornam-se necessárias experiências adicionais.

EXEMPLO 4

O isolamento e a clonagem da sequência de nucleótidos de GGF-II foram executados tal como descrito abaixo, utilizando a informação e a pesquisa de biblioteca da sequência peptídica. Apreciar-se-à que os péptidos das Figuras 9 e 10 podem ser utilizados como o ponto de partida para isolamento e clonagem das sequências de GGF-I segundo as técnicas aqui descritas. Na realidade, a Figura 21 mostra sondas de oligonucleótidos degeneradas possíveis para este fim, e a Figura 23 cataloga os iniciadores de PCR possíveis. A sequência de ADN e a sequência polipeptídica devem ser obteníveis por este meio tal como com GGF-II, e também construções de ADN e vectores de expressão incorporando a referida sequência de ADN, células hospedeiras geneticamente alteradas por incorporação das referidas construções/vectores, e proteína obtenível por cultura das referidas células hospedeiras. O invento engloba a referida matéria objecto.

1. Desenho e Síntese de Sondas de Oligonucleótidos e de Iniciadores

As sondas oligoméricas de ADN degeneradas foram projectadas por retrotradução das sequências de aminoácidos (derivadas dos péptidos originados da proteína de GGF purificada) em sequências de nucleótidos. Os oligómeros representavam a cadeia codificadora ou a cadeia não codificadora da sequência de ADN. Quando a serina, a arginina ou a leucina se encontravam incluídas no projectodo oligómero, foram preparadas duas sínteses distintas para evitar ambiguidades. Por exemplo, a serina foi codificada por um de entre TCN e AGY, tal como em 537 e 538 ou 609 e 610. Foi efectuada uma divisão de codões semelhante para a arginina e a leucina ( por ex., 544, 545). Os oligómeros de ADN foram sintetizados num sintetizador de ADN de coluna Biosearch 8750 4, utilizando a química do /3-cianoetilo operada a uma escala de síntese de 0,2 micromole. Os oligómeros foram retirados por clivagem da coluna (resinas de CpG de 500 angstrom), e desprotegidos em hidróxido de amónio concentrado

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-35durante 6-24 horas a 55-60°C. Os oligómeros desprotegidos foram secos sob vácuo (Speedvac), e purificados por electroforese em geles de acrilamida a 15 % (20 mono : 1 bis), tampão de Tris-borato-EDTA 50 mM contendo ureia 7 M. Os oligómeros de comprimento total foram detectados nos geles por obscurecimento de UV, e em seguida as bandas foram excisadas e o ADN eluído para 1,5 ml de H₂O durante 4-16 horas com agitação. O eluente foi seco, redissolvido em 0,1 ml de H₂0, e foram efectuadas medições da absorvância a 260 nm. As concentrações foram determinadas de acordo com a seguinte fórmula:

(A₂₆o ^x unidades/ml) (60,6/comprimento = x μΜ)

Todos os oligómeros foram ajustados até uma concentração de 50 μΜ por adição de H₂O.

As sondas degeneradas projectadas como anteriormente estão representadas na Figura 21.

Os iniciadores de PCR foram preparados essencialmente pelos mesmos procedimentos que foram utilizados para as sondas, com as seguintes modificações. Os ligantes de treze nucleótidos contidos nos locais de restrição foram incluídos nas extremidades 5' dos oligómeros degenerados para utilização na clonagem em vectores. A síntese de ADN foi efectuada à escala de micromole utilizando resinas de CpG de 1 000 angstrom, e a inosina foi utilizada em posições onde todos os quatro nucleótidos foram normalmente incorporados nas sondas degeneradas. As purificações dos iniciadores de PCR incluíram uma precipitação em etanol seguida de purificação por electroforese em gel.

2. Construção e Pesquisa da Biblioteca

Uma biblioteca de ADN genómico de bovino foi adquirida a Stratagene (Número de Catálogo: 945701). A biblioteca continha x 10⁶ fragmentos de ADN de bovino de 15-20 kb de Sau3Al parcial clonados no vector lambda Dashll. Uma biblioteca de ADNc de cérebro total de bovino foi adquirida a Clonetech (Número de Catálogo: BL 10139). Foram construídas bibliotecas de ADN

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-36complementar (In Vitrogen; Stratagene) a partir de ARNm preparado a partir de cérebro total de bovino, de pituitária de bovino e de pituitária posterior de bovino. In Vitrogen preparou duas bibliotecas de ADNc: uma biblioteca encontrava-se no vector lambda gtlO, a outra no vector pCDNAI (uma biblioteca de plasmídeo). As bibliotecas stratagene foram preparadas no vector lambda unizap. Colectivamente, as bibliotecas de ADNc continham 14 milhões de fagos recombinantes primários.

A biblioteca genómica de bovino foi plaqueada na estirpe hospedeira de E. Coli K12, LE392, em placas de 23 x 23 cm (Nunc), a 150 000 a 200 000 placas (plaques) de fagos por placa. Cada placa representava aproximadamente um equivalente de genoma de bovino. Após uma incubação durante toda a noite a 37°C, as placas foram arrefecidas e foram preparados filtros repetidos de acordo com os processos de Grunstein e Hogness [PNAS (USA (1975) 72:3961)]. Foram preparados quatro levantamentos de placas (plaques), a partir de cada placa, para membranas de nylon não carregadas (Pall Biodyne A ou MSI Nitropure). 0 ADN foi imobilizado nas membranas por reticulação sob luz UV durante 5 minutos, ou por cozimento a 80°C sob vácuo durante duas horas.

As sondas de ADN foram marcados utilizando polinucleótido quinase T4 (New England Biolabs) com gama-³²P-ATP (New England Nuclear; 6500 Ci/mmol) de acordo com as especificações dos fornecedores. Resumidamente, 50 pmol de oligómero de ADN degenerado foram incubados na presença de 600 pCi de gama-³²P-ATP e de 5 unidades de polinucleótido quinase T4, durante 30 minutos a 37°C. As reacções foram concluídas, foi adicionado tampão de carregamento de electroforese em gel, e de seguida as sondas radiomarcadas foram purificadas por electroforese. As sondas marcadas com ³²P foram excisadas das fatias do gel e eluídas para água. Alternativamente, as sondas de ADN foram marcadas por meio de amplificação pcr por incorporação de a-³²P-dATP ou de a-³²P-dCTP de acordo com o protocolo de Schowalter e Sommer, Anal. Biochem., 177:90-94 (1989). As sondas marcadas nas reacções PCR foram purificadas por dessalinização em colunas de Sephadex G-150.

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-37A pré-hibridação e a hibridação foram executadas em tampão GMC (NaPi 0,52 M, SDS a 7 %, BSA a 1 %, EDTA 1,5 mM, NaCl 0,1 M, 10 mg/ml de ARNt). A lavagem foi efectuada em tampão A de oligobanho (160 ml de Na2HP0^ 1M, 200 ml de SDS a 20 %, 8,0 ml de EDTA 0,5 mM, 100 ml de NaCl 5M, 3632 ml de H₂0). Tipicamente, 20 filtros (de 400 cm² cada), representando cópias repetidas de dez equivalentes de genoma de bovino, foram incubados em 200 ml de solução de hibridação com 100 pmol de sonda de oligonucleótido degenerada (degenerada 128-512 vezes). Permitiu-se que a hibridação ocorresse durante a noite a 5°c abaixo da temperatura de fusão mínima calculada para a sonda degenerada. 0 cálculo da temperatura de fusão mínima assume 2°C para um par AT e 4°C para um par GC.

Os filtros foram lavados com repetidas mudanças de oligobanho às temperaturas de hibridação durante 4 a 5 horas, e finalmente, em cloreto de tetrametilamónio 3,2 M, SDS a 1 %, duas vezes durante 30 minutos a uma temperatura dependente do comprimento da sonda de ADN. Para os 20 meros, a temperatura de lavagem final foi de 60°C. Os filtros foram montados, e de seguida expostos a películas de raios X (Kodak XAR5) utilizando écrans intensificadores (Dupont Cronex Lightening Plus). Duma forma geral, foi suficiente uma exposição da película de 3 a 5 dias a menos 80°C para detectar sinais duplicados nestas pesquisas de biblioteca.

Após a análise dos resultados, os filtros podem ser desguarnecidos (stripped”) e novamente sondados. Os filtros foram desguarnecidos por incubação através de dois ciclos sucessivos de 15 minutos num forno de microondas, à potência máxima, numa solução de SDS a 1 % contendo EDTA 10 mM, pH 8. Os filtros foram conduzidos através de três a quatro ciclos de desguarnecimento, e foram novamente sondados com diversas sondas.

3. Isolamento, Crescimento e Preparação do ADN do Faqo Recombinante

Estes procedimentos seguiram um protocolo padrão, tal como o descrito em Recombinant DNA (Maniatis e colab., 2:60-2:81).

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4. Análise dos Clones Isolados Utilizando Digestão de

ADN e Transferências de Southern

As amostras de ADN do fago recombinante (2 microgramas) foram digeridas de acordo com as condições recomendadas pelo fornecedor da endonuclease de restrição (New England Biolabs). Após uma incubação de 4 horas a 37°C, os produtos reaccionais foram precipitados na presença de acetato de sódio 0,1 M e de 3 volumes de etanol. 0 ADN precipitado foi recolhido por centrifugação, enxaguado em etanol a 75 % e seco. Todas as amostras ressuspensas foram carregadas sobre geles de agarose (tipicamente a 1 % em tampão TAE; Tris-acetato 0,04 M, EDTA 0,002 M). As passagens no gel foram a 1 volt por centímetro, durante 4 a 20 horas. Os marcadores incluíam fragmentos de ADN de lambda Hind III e/ou fragmentos de ADN de </>X174Hae III (New England Biolabs). Os geles foram corados com 0,5 /zg/ml de brometo de etídio, e fotografados. Para a transferência de Southern, o ADN foi primeiro despurinado no gel por tratamento com HC1 0,125 N, desnaturado em NaOH 0,5 N, e transferido em 20 x SSC (cloreto de sódio 3 M, citrato de sódio 0,03 M) para membranas de nylon não carregadas. A transferência foi executada durante 6 até 24 horas; de seguida os filtros foram neutralizados em Tris NaOH 0,1 M, pH 7,5, cloreto de sódio 0,15 M e, em seguida, enxaguados rapidamente em Tris-borato EDTA 50 mM. Para a reticulação, os filtros foram primeiro envolvidos em película plástica transparente e, em seguida, o lado do ADN foi exposto durante 5 minutos a uma luz ultravioleta. A hibridação e a lavagem foram executadas como descrito para a pesquisa da biblioteca (ver secção 2 deste Exemplo). Quanto à análise de hibridação, foram feitas pequenas modificações a fim de determinar se existem genes semelhantes noutras espécies. 0 filtro de ADN foi adquirido a Clonetech (Número de Catálogo 7753-1), e contém 5 /xg de ADN digerido com EcoRI, de várias espécies, por faixa. A sonda foi marcada por reacções de amplificação PCR, tal como descrito na secção 2, acima, e as hibridações foram efectuadas em tampão B a 80 % (2 g de polivinilpirrolidina, 2 g de Ficoll-400, 2 g de albumina de soro bovino, 50 ml de Tris-HCl 1 M (pH 7,5), 58 g de NaCl, 1 g de pirofosfato de sódio, 10 g de dodecilsulfato de sódio, 950 ml de

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-39Η₂0) contendo 10 % de dextrana-sulfato. As sondas foram desnaturadas por ebulição durante 10 minutos e, de seguida, rapidamente arrefecidas em água gelada. A sonda foi adicionada ao tampão de hibridação a 10⁶ dpm ³²P por ml, e incubado durante a noite a 60°C. Os filtros foram lavados a 60°C, primeiro em tampão B seguido de 2 x SSC, SDS a 0,1 %, e depois por 1 x SSC, SDS a 0,1 %. Para elevado rigor das experiências, as lavagens finais foram efectuadas em 0,1 x SSC, SDS a 1 %, e a temperatura foi elevada para 65°C. Os dados da transferência Southern foram utilizados para preparar um mapa de restrição do clone genómico e para indicar quais os subfragmentos hibridados com as sondas do GGF (candidatos à subclonagem)

5. Subclonagem de Porções de ADN Homólogas às Sondas de Hibridação

Os digeridos de ADN (p.ex. 5 microgramas) foram carregados sobre geles de agarose a 1 % e, em seguida, os fragmentos apropriados foram excisados dos geles, após coloração. 0 ADN foi purificado por adsorção a pérolas de vidro, seguida por eluição utilizando o protocolo descrito pelo fornecedor (Bio 101). Os fragmentos de ADN recuperados (100-200 ng) foram ligados em vectores desfosforilados linearizados, por ex. pT3T7 (Ambion), o qual é um derivado do pUC18, utilizando ligase T4 (New England Biolabs). Este vector transporta o gene da 0-lactamase de E. Coli e, consequentemente, os transformantes podem ser seleccionados em placas contendo ampicilina. O vector também proporciona, à célula hospedeira, a complementação da j8-galactosidase e, por esse motivo, os não recombinantes (azul) podem ser detectados utilizando isopropiltiogalactosido e Bluogal (Bethesda Research Labs). Uma parte das reacções de ligação foi utilizada para transformar as células competentes azuis de E. Coli K12 XL1 (Número de Catálogo de Strtagene: 200236) e, em seguida, os transformantes foram seleccionados em placas LB contendo 50 /xg/ml de ampicilina. As colónias brancas foram seleccionadas, e foram preparadas mini-preparações de plasmídeo para digestão de ADN e para análise da sequência de ADN. Os clones seleccionados foram testados novamente a fim de determinar se a sua inserção de ADN hibridou com as sondas do

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-40- L

GGF.

6. Sequenciação do ADN

Foram preparados moldes do ADN do plasmídeo de cadeia dupla a partir de plasmídeos de cadeia dupla isolados de culturas de 5 ml, de acordo com protocolos padrão. A sequenciação foi efectuada pelo processo da terminação da cadeia de didesoxi utilizando Sequenase 2,0 e um conjunto de sequenciação de didesoxinucleótidos (US Biochemical), de acordo com o protocolo do fabricante [uma modificação de Sanger e colab., PNÃS; USA 74:5463 (1977)]. Alternativamente, a sequenciação foi efectuada num ciclizador termal de ADN (Perkin Elmer, modelo 4800) utilizando um conjunto de sequenciação de ciclo (New England Biolabs; Bethesda Research Laboratories), e foi executado de acordo com as instruções do fabricante utilizando um iniciador marcado na extremidade 5'. Os iniciadores de sequência foram os fornecidos com os conjuntos de sequenciação, ou foram sintetizados de acordo com a sequência determinada a partir dos clones. As reacções de sequenciação foram carregadas sobre, e resolvidas em geles de sequenciação de poliacrilamida a 6 % de 0,4 mm de espessura. Os geles foram secos e expostos à película de raios X. Tipicamente, o ³⁵S foi incorporado quando foram utilizados conjuntos de sequenciação padrão, e foi utilizado um iniciador marcado na extremidade com ³²P para as reacções de sequenciação de ciclo. As sequências foram lidas para um editor de sequências de ADN desde o fundo do gel para o cimo (direcção 5· para 3^Z), e os dados foram analisados utilizando programas fornecidos por Genetics Computer Group (GCG, Universidade de Wisconsin).

7. Preparação de ARN e Amplificação de PCR

As estruturas de leitura abertas detectadas no ADN genómico e que continham sequências codificadoras dos péptidos GGF foram alongadas por meio de amplificação de PCR do ARN de pituitária. O ARN foi preparado a partir de tecido de bovino congelado (Pelfreeze), de acordo com o processo de guanidina neutra-cloreto de CsCl [Chirgwin e colab., Biochemistry 18:5294 (1979)]. 0 ARN poliadenilado foi seleccionado por cromatografia

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-41em coluna de celulose de oligo-dT [Aviv e Leder, PNAS (USA) 69:1408 (1972)].

As sequências alvo de ADN específicas foram amplificadas começando com ARN total ou com amostras de ARN poliadenilado, que foram convertidas em ADNc utilizando o Conjunto de PCR/ARN de Perkin Elmer Número: N808-0017. As reacções de transcrição inversa da primeira cadeia utilizaram 1 μg de ARN molde e iniciadores de oligo-dT com ligantes do local de reconhecimento do enzima de restrição fixados, ou iniciadores anti-sentido específicos determinados a partir das sequências clonadas com locais de restrição fixados. Para produzir a segunda cadeia, os iniciadores foram sequências únicas da cadeia mais, como as utilizadas em reacções de RACE 3' [Frohman e colab., PNAS (USA) 85:8998 (1988)], ou foram iniciadores de oligo-dT com locais de restrição fixados, se o segundo local alvo tiver sido adicionado, formando caudas com transferase terminal, nos produtos da reacção da primeira cadeia com o dATP (por ex., reacções de RACE 5', Frohman e colab., acima). Alternativamente, tal como em reacções PCR ancoradas, os iniciadores da segunda cadeia foram degenerados, desse modo, representando sequências peptídicas particulares.

Os perfis de amplificação seguiram o seguinte esquema geral: 1) coluna (file) de impregnação de 5 minutos a 95°C; 2) coluna do ciclo térmico de 1 minuto, 95°C; diminuição em rampa de 1 minuto até uma temperatura de têmpera de 45°C, 50°C ou 55°C; manutenção da temperatura de têmpera durante 1 minuto; aumento em rampa até 72°C durante 1 minuto; extensão a 72°C durante 1 minuto ou durante 1 minuto mais uma auto-extensão de 10 segundos; 3) ciclo de extensão a 72°C, 5 minutos; e 4) coluna de impregnação a 4°C durante tempo infinito. As colunas do ciclo térmico (#2) foram geralmente passadas durante 30 ciclos. Foram analisados 16 μΐ de cada 100 μΐ de reacção de amplificação por electroforese em geles de agarose a 1 %, Nusiev a 2 %, passados em tampão TAE a 4 volts por centímetro durante 3 horas. Os geles foram corados, e de seguida transferidos para membranas de nylon não carregadas, as quais foram sondadas com sondas de

-4273 827

FPPT92758 sondas de ADN marcadas que eram internas aos iniciadores.

Séries específicas dos produtos da amplificação do ADN podem ser identificadas nas experiências de transferência e as suas posições utilizadas como um guia para a purificação e reamplificação. Quando apropriado, as porções restantes de amostras seleccionadas foram carregadas sobre geles preparativos e, em seguida, após a electroforese, quatro a cinco fatias de 0,5 mm de espessura (enquadrando a posição esperada do produto específico) foram obtidas a partir do gel. A agarose foi esmagada, em seguida macerada em 0,5 ml de tampão de electroforese durante 2-16 horas a 40°C. A agarose esmagada foi centrifugada durante 2 minutos, e a fase aquosa foi transferida para tubos novos. A reamplificação foi executada sobre 5 μΐ (grosseiramente 1 % do produto) do material eluído, utilizando as mesmas séries de iniciadores e perfis de reacção que nas reacções originais. Quando as reacções de reamplificação se completaram, as amostras foram extractadas com clorofórmio e transferidas para tubos novos. Tampões de enzima de restrição concentrados e enzimas foram adicionados às reacções a fim de clivar nos locais de restrição presentes nos ligantes. Os produtos de PCR digeridos foram purificados por electroforese em gel, e de seguida subclonados em vectores como descrito na secção de subclonagem, acima. A sequenciação do ADN foi efectuada como anteriormente descrito.

8. Análise da Sequência do ADN

As sequências do ADN foram montadas utilizando um programa de montagem de fragmentos e as sequências de aminiácidos deduzidas pelos programas do GCG, GelAssemble, Map e Translate. As sequências proteicas deduzidas foram pesquisadas utilizando o Word Search. A análise foi efectuada num posto de trabalho VAX Station 3100 operando sob VMS 5.1. A pesquisa da base de dados foi efectuada em SwissProt número de comunicado 21 utilizando GCG Version 7.0.

9. Resultados

Como indicado, para identificar a sequência de ADN

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FPPT92758 —43 — codificadora dos GGF-II de bovino, as sondas de oligonucleótido degeneradas foram designadas a partir das sequências peptídicas do GGF-II. O GGF-II 12, um péptido produzido por meio da digestão por lisil endopeptidase duma preparação de GGF-II purificado (ver Figuras 11 e 12), mostrou forte homologia de sequência de aminoácidos com o GGF-I 07, um péptido tríptico produzido a partir duma preparação de GGF-I purificado. Assim, o GGF-II 12 foi utilizado para criar dez sondas de oligonucleótidos degeneradas (ver oligos 609, 610 e 649 a 656 na Figura 21). Uma série duplicada de filtros foi sondada com duas séries (série 1 = 609, 610; série 2 = 649-656) de sondas codificando duas porções sobrepostas do GGF-II 12. Foram observados 46 sinais de hibridação; no entanto, apenas um clone hibridou com ambas as séries de sondas. 0 clone (designado GGF2BG1) foi purificado.

A análise de transferência Southern do ADN do clone do fago GGF2BG1 confirmou que ambas as séries de sondas hibridaram com aquela sequência de ADN de bovino, e mostrou ainda que ambas as sondas reagiram com a mesma série de fragmentos de ADN dentro do clone. Com base nessas experiências, um subfragmento de EcoRI de 4 kb do clone original foi identificado, subclonado e parcialmente sequenciado. A Figura 22 mostra a sequência de nucleótidos e a sequência de aminoácidos deduzida das leituras da sequência de ADN iniciais que incluiam os locais de hibridação das sondas 609 e 650, e confirmavam que uma porção deste ADN genómico de bovino codificava o péptido 12 (KASLADSGEYM).

A análise de sequência adicional demonstrou que o GGF-II 12 se localizava numa estrutura de leitura aberta de 66 aminoácidos (ver abaixo), que se tornou o ponto focal para o isolamento de sequências sobrepostas representando um gene do GGF-II de bovino putativo e um ADNc.

Foram utilizados diversos procedimentos de PCR para obter sequências de codificação adicionais para o gene do GGF-II de bovino putativo. Amostras de ARN total e de oligo dT-ARN seleccionado (contendo poli A) foram preparadas a partir de

J

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FPPT92758 r

-44pituitária total de bovino, pituitária anterior, pituitária posterior e hipotálamo. Utilizando iniciadores da lista representada na Figura 23, reacções PCR de uma extremidade (RACE) foram usadas para amplificar as extremidades do ADNc em ambas as direcções 3' e 5^z, e as reacções de PCR ancoradas foram executadas com iniciadores de oligonucleótidos degenerados representando péptidos de GGF-II adicionais. A Figura 24 resume as estruturas de ADN contíguas e as sequências obtidas nessas experiências. A partir das reacções de RACE 3 *, foram produzidas três sequências de ADNc alternativamente unidas, as quais foram clonadas e sequenciadas. Uma reacção de RACE 5' conduziu à obtenção de um exão adicional contendo a sequência codificadora para, pelo menos, 52 aminoácidos. A análise daquela sequência de aminoácidos deduzida revelou os péptidos GGF-II-6 e uma sequência semelhante ao GGF-I-18 (ver abaixo). As reacções de PCR ancoradas conduziram à identificação de sequências codificadoras (ADNc) dos péptidos GGF-II-1, 2, 3 e 10, contidos num segmento de ADNc adicional de 300 p.b.. Assim, este clone contém sequências de nucleótidos codificando seis do total existente de nove novas sequências peptidicas de GGF-II.

gene clonado foi caracterizado, primeiro, por construção de um mapa físico do GGF2BG1 que permitiu o posicionamento das sequências codificadoras à medida que elas foram obtidas (ver abaixo, Figura 25). As sondas de ADN das sequências codificadoras descritas acima foram utilizados para identificar adicionalmente fragmentos de ADN contendo os exões neste clone de fago e para identificar clones que se sobrepõem em ambas as direcções. 0 gene de GGF-II de bovino putativo encontra-se dividido em pelo menos 5 exões, mas apenas os exões A e B foram até agora mapeados. 0 resumo das sequências de codificação contíguas identificadas encontra-se representado na Figura 26. Os exões encontram-se catalogados (alfabeticamente) por ordem da sua obtenção. Torna-se evidente a partir dos limites intrão/exão, que o exão B pode ser incluído nos ADNc que fazem a conexão entre os exões E e A. Isto é, o exão B não pode ser separado sem comprometer a estrutura de leitura. Consequentemente, é sugerido que três padrões de união

-4573 827

FPPT92758 alternativos podem produzir as sequências de ADNc 1, 2 e 3 do GGF-II de bovino putativas. As suas sequências codificadoras, designadas GGF2BPP1.CDS, GGF2BPP2.CDS e GGF2BPP3.CDS, respectivamente, são dadas nas Figuras 28a, 28b e 28c, respectivamente. A sequência de aminoãcidos deduzida dos três ADNc também é dada nas Figuras 28a, 28b e 28c.

As três estruturas deduzidas codificam proteínas de 207, 258 e 264 aminoãcidos de comprimento. Os primeiros 183 resíduos da sequência proteica deduzida são idênticos nos três produtos do gene. Na posição 184 os clones diferem significativamente. Um codão para a glicina GGT na GGF2BPP1 também serve como dador de união para as GGF2BPP2 e GGF2BPP3, as quais se adicionam alternativamente nos exões CeDouC, c/deD, respectivamente. Como o transcrito da GGF2BPP1 termina adjacente a uma sequência de poliadenilação AATAAA canónica, foi sugerido que este produto genético truncado representa um transcrito maduro genuíno. Os outros dois produtos genéticos mais compridos compartilham a mesma sequência não traduzida 3' e o mesmo local de poliadenilação. Curiosamente, contudo, como o exão c/d apresenta 68 nucleótidos de comprimento, as GGF2BPP2 e GGF2BPP3 codificam duas sequências do terminal C distintas a partir da mesma sequência de ADN. Isto é, a porção final é codificada por duas estruturas de leitura sobrepostas.

Estas três moléculas contêm seis das nove novas sequências peptídicas do GGF-II (ver Figura 12) e um outro péptido é altamente homólogo de GGF-I-18 (ver Figura 27). Esta verificação confere uma probabilidade elevada a que esta molécula recombinante codifique pelo menos uma porção do GGF-II de bovino. Além disto, os pontos isoeléctricos calculados para os três péptidos são consistentes com as propriedades físicas dos GGF-I e II. Dado que o tamanho molecular do GGF-II é grosseiramente de 60 kD, o mais comprido dos três ADNc deve codificar uma proteína com aproximadamente metade do número previsto de aminoãcidos. Procedimentos semelhantes aos anteriormente descritos podem ser utilizados para obter a sequência restante no clone de comprimento completo.

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FPPT92758 _ζ

-46- ^L

EXEMPLO 5

Variantes de União do GGF

É possível que o produto genético mais curto representado pelo padrão de união 1 (ver Figura 28a e Exemplo 4) se possa ligar ao receptor de GGF e seja isento de aetividade mitogénica de célula de Schwann. Assim, pode representar um inibidor natural do GGF-I e do GGF-II. Recentemente, Chan e colab., Science, 254:1382 (1991), identificaram um antagonista competitivo do factor de crescimento do hepatócito codificado por um transcrito alternativo, o qual produz uma molécula truncada. Consequentemente, existe um precedente biológico para os factores de crescimento truncados actuando como antagonistas naturais. Uma tal molécula poderia ser terapêuticamente útil. Por exemplo, um inibidor natural poderia ser útil no tratamento de Schwannomas ou de outras doenças malignas provocadas pela sobre-expressão do GGF-I e/ou do GGF-II. Os dados preliminares da hibridação e da sequência do ADN indicam que pode existir alguma variação na união noutro local do gene; assim, podem existir mais variantes de união do GGF, colocando o número total em mais de três.

EXEMPLO 6

Sequências do GGF em Várias Espécies

A pesquisa das bases de dados não revelou quaisquer semelhanças significativas com sequências proteicas conhecidas. Isto sugere que o GGF-II é o primeiro membro de uma nova família ou superfamília de proteínas. Nos estudos de hibridação cruzada (experiências de transferência de ADN) com outros ADN de mamífero foi claramente demonstrado que as sondas de ADN desta molécula recombinante de bovino podem detectar rapidamente sequências específicas numa variedade de amostras testadas. Também é detectada uma sequência altamente homóloga no ADN genómico humano. 0 auto-radiograma encontra-se representado na Figura 29. Além disto, a experiência de transferência mostra que a sonda detecta bandas de menor intensidade que podem representar genes relacionados, outros membros potenciais de uma família de GGF.

827

FPPT92758 ·

-47EXEMPLO 7 Clonaqem do GGF-II Utilizando Informação da Sequência de Nucleótidos

O gene codificador do GGF-II pode ser prontamente clonado pelos peritos na arte a partir de uma biblioteca genómica de bovino ou de ADNc de pituitária, utilizando sondas únicas ou iniciadores idênticos a. porções.da sequência codificadora aqui descrita. Além disto, qualquer GGF-II de vertebrado (incluindo humano) pode ser clonado utilizando uma biblioteca genómica ou de pituitária preparada a partir de espécies apropriadas e utilizando a abordagem anteriormente descrita (para a sequência de bovino).

Assim, uma biblioteca de ADNc construída utilizando ARN poli A isolado a partir de pituitária posterior pode ser plaqueada (tal como descrito no Exemplo 4), e os levantamentos de placa sondados com qualquer um dos fragmentos radiomarcados de ADN de GGF-II (por ex., o fragmento de 4 kb libertado por uma digestão do ADN do GGF2BG1 clonado com EcoRI). Alternativamente, pode ser preparado um iniciador da sonda sintética única a partir de qualquer sequência do exão GGF2BG1, marcada na extremidade e utilizada para pesquisar uma biblioteca tal como descrito anteriormente no Exemplo 4. Uma terceira abordagem é a utilização de conjuntos iniciadores de PCR únicos (preparados duma forma semelhante à das sondas, descrita anteriormente) para amplificar produtos específicos a partir duma variedade de fontes de ácido nucleico (por ex., ARN poli A+, ADN de biblioteca genómica ou de ADNc). Estes produtos podem ser subclonados e montados para originar uma sequência de comprimento total codificadora do GGF-II.

EXEMPLO 8

Modificação Pós-Tradução do GGF

A sequência do GGF-II de bovino revela vários locais, os quais podem potencialmente ser utilizados por uma célula para adicionar hidratos de carbono à proteína depois da tradução do ARN mensageiro correspondente. A sequência de aminoácidos X (P excluído) NXT/SX (P excluído) é um sinal para a adição de uma

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-48porção de hidrato de carbono ligada a N, e pode ser potencialmente modificada na célula. Dentro da cadeia de aminoácido dos resíduos 1 a 183 (compartilhado pelas três sequências proteicas deduzidas), os locais de glicosação potenciais ocorrem quatro vezes, nos resíduos 50, 123, 170, 176. Existe um quinto local no resíduo 183 no GGF2BPP2.PEP e no GGF2BPP3.PEP. Este local é removido do GGF2BPP1.PEP por um acontecimento de união alternativo. Os locais de glicosação potenciais nos resíduos 50 e 123 são provavelmente glicosados na(s) proteína(s) do GGF-II. Esta conclusão é tirada a partir dos dados da sequência peptídica. Um exame das sequências peptídicas concretas englobando os resíduos 50 e 123 (péptidos GGF-II-2 e GGF-I-18) revela que o resíduo modificável de hidrato de carbono (N) em cada sequência não é identificável sugerindo ,na verdade, que estes resíduos estão na realidade glicosados e não são detectados no processo de sequenciação.

EXEMPLO 9

Preparação de Anti-Soros Dirigidos Contra uma Porção do

GGF-II

Os anticorpos dirigidos contra o GGF-II podem ser utilizados para caracterizar o GGF-II ao nível proteico. Para este fim, uma porção da sequência do GGF-II (nucleótidos 281 a 653 (Figura 28a)), a qual codifica uma sequência de 115 aminoácidos, foi expressa num sistema de expressão de proteína de fusão bacteriano. Os fragmentos de ADN codificadores deste péptido foram inseridos no vector pMAL-C2 (New England Biolabs), e o gene de fusão resultante foi expresso e a proteína foi processada de acordo com as instruções do fabricante.

A proteína de fusão resultante foi eluída da coluna de purificação, clivada com o enzima do factor Xa (o qual liberta a porção do GGF-II do péptido), e submetida a electroforese em gel de poliacrilamida, excisada do gel e utilizada para imunizar coelhos. Os soros obtidos destes coelhos, após cada reforço, podem ser testados por análise de transferência Western (Burnette, Anal. Biochem.. 112:195-203, 1983) dos extratos

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-49- ' ' preparados de bactérias abrigando os plasmídeos superprodutores. Esta análise pode revelar se foram produzidos anticorpos que reconheçam os imunogénios produzidos bacterianamente. Os animais podem ser reforçados até ser alcançada uma resposta positiva significativa tal como determinado neste ensaio. Estes anticorpos também podem ser úteis para fins diagnósticos.

EXEMPLO 10

Purificação dos GGF de Células Recombinantes

A fim de obter GGF de comprimento total ou porções dos mesmos para ensaio quanto à actividade biológica, as proteínas podem ser superproduzidas utilizando ADN clonado. Podem ser utilizadas várias abordagens. Pode ser construída uma célula de E. coli recombinante contendo as sequências anteriormente descritas no Exemplo 4 (Resultados), sistemas de expressão, tais como pNH8a ou pHH16a (Stratagene, Inc), podem ser utilizados para este fim seguindo as instruções dos fabricantes. Alternativamente, estas sequências podem ser inseridas num vector de expressão de mamífero, podendo ser construída uma linha de células superprodutoras. Como exemplo, para este fim, ADN codificando um GGF, com uma sequência homóloga ou de sinal de segregação estranho fixado, pode ser expresso em células de Ovário de Hamster Chinês utilizando o vector de expressão pMSXND (Lee e Nathans, J. Biol. Chem., 263:3521-3527, 1981). Este vector contendo a sequência de ADN do GGF pode ser transfectado para células de CHO utilizando os processos estabelecidos.

Os clones resistentes a G418 podem ser cultivados na presença de metotrexato para seleccionar as células que amplificam o gene dhfr (contido no vector pMSXND) e, no processo, co-amplificam a sequência codificadora da proteína do GGF adjacente. Dado que as células de CHO podem ser mantidas num meio totalmente isento de proteínas (Hamilton e Ham, In Vitro, 13:537-547, 1977), a proteína desejada pode ser purificada a partir do meio. A análise de Western utilizando os antissoros produzidos no Exemplo 8 pode ser utilizada para detectar a presença da proteína desejada no meio condicionado das células superprodutoras.

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FPPT92758 ^c C

-50A proteína desejada pode ser purificada a partir do lisado de E. coli ou do meio condicionado das células de CHO utilizando os processos descritos no Exemplo 1.

A proteína pode ser ensaiada em vários pontos do processo utilizando o ensaio de transferência Western descrito no Exemplo

9. Alternativamente, o ensaio mitogénico das células de Schwann aqui descrito pode ser utilizado para analisar o produto expresso pelo clone de comprimento total ou por qualquer das suas porções biologicamente activas.

827 '??.

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Claims

REIVINDICAÇÕES

1 - Factor polipeptídico caracterizado por possuir actividade mitogénica das células gliais e incluir uma sequência de aminoácidos codificada por:

(a) uma sequência de ADN escolhida de entre as seguintes:

*··-···*

CCTGCAGClTeArGTG7GCgCGQÇ5A*A.cCc5GGG5CTTGAAGAA5GAC7CGCTGCTCÁCCOT {CgcCTGGGCíCcTGGjjGCCACÚCCGCCTTCCCCICc 100 HevuAAKAGGLKKDSLLTVRLGAWGHPÀFFS

TSCGGGCGCCTCAAGGAGGACAGCAGGTACATCTTCTTCATGGAgcCCGAfiGCCAACACCAgcggCgfigcCiggccgccTtCcÈÁfiCCIcCtTcCCCCCT 200 CGRLKEOGRYIFFMEpEA » S S SGPGRLPSLLPPS

CTCfiAGACGGGCCGGAACCTcAAGAAGGAGgTCAGCCGGGTGCTGTGCÁACgfiTfiCÇÇCTTEC£TCCCCGcTTGA>aCACATGAAlÍAGTCÀGGA5TCTGT JQO

RDGPEPQéGG0P6AVqRCALPPRLKEMK$QE5V

- t

GGCAGGTTECAAACTAfiTGCTTCGGTGCGAGACCAGTTCTGAATACTCCTCTCTCAAGTTCAAâTGGtTCAAsAATGGGAGTGaaTTAAGCCGAAAGAAC 400 ACSKLVlKCETSSETGfiLlíPKWFK MC S E ζ S R ί K

AAACCA8*AAAGATCMGATACAGAAAAQGCCGGGGAAGTCAGAACTTCGCATTAGCAAAGCGTCACTGGCTGATTCTGGAÚÁÁTATáTGTGCAAAGTgÁ 500

KPÊM I KlQKRPGKScLRlSKASLADSGETlíCrVI

TCAGCÁAACTAGGAÂATGAeAeTGCi:TeTGCGAACAYCACCATTGTGGÁGTCAAACGGTAAGAGATGCCTACTGCGTGCTATTTCTCAGTCTCTAAGAGG 600 S K L G K D_ S A$A Μ I T IVÉSMGiíRcLLRAlSeSLRG

A3TGATCMGGTA7GTGGTÇACACTTGMTUCGCAGGTGTGTGAMT;TCATTGTGAACAAAm^TUTGAAAGcÃAAAAAAAAAÃAAAÀAAATCG 700

VICVCGHT» atgtcgactcgagatgtçgctgcaggtcgactctagaggatccc ou ·**·»*· <··

CCTGCAGCATcArGTGTGGgCGGCsAAAGCcgGGGGCTTGAAGAAQGACÍCGCTGCTCACCGTgCfleCTGGGOgCcTGGgGCCACCCCGCCTTCCCCTCG 100 HQVWÀAYAGGLIíKDSLlIViítGAWGBPAFPS

TgCGGGCGCCTCAAGGAGGACACCAGGTAÇÀWfCTTCÁTGÇAgcCeôAGCCCAACAGCAgcggCgGseCçggçcgccTtCcGAfiCCTeCtTcCCCCCT 200

CGRIKEOSRYIFFMÉPEA μ .S_§ GGPGRLP5LLPPS

CTCGAGACGMCÇGGAACOTCAÁGAAGGAGgTCAGCCGGGTGClSTGCMCSGTGCGCCTTGCCTCCCCGcTTfiAAaGAGATGÀAGAGTCAGGAGTCTGT 300 RCGPÊPOEGGQPGAVqRCALPPRlííeMICSOÊSV

GGCAGGTTCCAAACtAGTGCTTCGGTGCGAGACCAGTTCTGAATACTCCICYCTCAAOTTCÁAgTGCXTCÀÁjAATfiGGÁCTGMTTMfiCCGAAAGAAe 400 AGSKLVLECeTSSEYSSLtFKUFK M G_S E L S R K « , < » » · ’ · · *

AAACCAgAAAAÇATCAAGATACAGAAAAGGCCGGGGMGTCAGAACTTCGCATTAfiCAAAOCGTeA£TGGCTGATTCTGGAGAATATATGTGCAAAGTGA 500

KPEXIKIQKRPGKSeLRISKASLAPSGEYmCKVI

73 827

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-52TCAGCAAACTaGGAAATGACAG70CCTC7GCCMCATCACCA7TGTGGAGTCAAàCGCcÁcaTGÍACATCTacaGCTGGGACAACCCATCTTGTCAAGTG 600 S K L G H D_. $ ASA K 1 T 1 V E 5 W A T STSTAGTsHLVÍC

TGeA(UGAAqGAGAAÁACTTTC’GTCTGAiTGGACGCfiAÊTGC-nCÀTfiCTfiAAACACCTTTCAAATCCCTCAAGATACTTGTGCAAGTGCÇAACCTGGA 700

AÉKEtTFCV^GGGCFHVKPLSNPSRYLCKCOPG • · · · Í 1 » ·*

TTCACTGGAGCGAGÁTGTACTtiAGAA7GTGCCCATGAAAfiTCCAAACCCAAGAAAGTGççCAAA7GAGTTTAC7GGTGATCGCTGCCAAAAC7AefiTAAT 800

F764RCTENVPKKVÍ7a6SAaM$l,l_lVIAAKTT*

GGCCAGC77CTACAGTACGTCCACTCCCTTTCTG7CTCTGCCTGAATAGCGCATcTCAGTCGGTGCCGCtTTCTTGTTGcCGCATCTCCCCTCAG4TTCC 900 ····♦· 4 *· rectAGAGCTÁ0ATGCfiTTTTAÇCÀGfiTCTAAÇATTGACTGCCTÇ7GcCTGTC6CAT0AGAACAT7AACACAAGCGATIGTATGACT7CC7CTGTCtGTG 1000 • · · ·.< 4 « w q

AC7AG7GGGCTCTG*GCTACTCGTAGGTGCGTAAGGCTCeAGTGTTTCTGÀAATTGATCtTGAA7TACTGTGATaú«ACAT(lATAGTCCCTCTCACCCAG 1100

TGCAATGACAATA^JíGGCCTTGAAAAGTCAAAAAAAAAAAAAAAàAAAAAAATCGATG7CGACTCGAGATG7ÇGCTGCAG6TC5ACTCTAGAG ou

CCTGC*GCATcArGTGTGGgCGGCgâAAGCcâGGGGCT7GAAGAAaGACTCGCTGCTCAeCCTgCgcCTGGGCgeeTGG9GCCAeCCCGCCTTCCCCTCc 100

HQVUAaKAGGLEíC&SLLTVRLGAWCHPAFPS

ΑΤ»·«·τ*··

TSCGGGCGCCTCAAGGAGGACAGGAGGTAÇATÇTTÇTTCATGGAgcCCôAGGÇÍAAGAGCAsçggGgCgeCcgsccgccTtCcGAGCCTcGtTcCCCCCT 200 CGRLKEDSRYIFFMEPEA SS SGPGJttPSLLPPS

C7CGAGACGGGCCGGAACClcAAGAAGGAGsTCAGCCQGG7GCTGlGCAACgC7GC6CÇJ70CCTCCCCGcnGAA9W0A'GAAeASieAGGAGTCTGT 300 «OGPEPOEGGOPGAVQftCALPPRLKEMKGOÊSV

GGCAGGT7CCAAAC7AG7GCTTCGGTGCGÁfiACCAG77CTGAATACTCC7C7CTCAAGTTCAAg7GG^TçAAgAATGGGWjTGaaTTÀAfiCCGAÂAGAAc 400

Â 0 5 K L V L » S E T í S E Y S $ L I f ( V f ϊ M G S E L 5 8 K M

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AAACCA$AAAACATCAAGÂTACAGAJLAAGGCCGGGGAAfiTCAGAA0T7CGCAT7AGCAAAGCÇTCACTGGCTGATTÇTÇCACAATATATGTGCMAGTGA 500 kpejiikiokrpgkselrtskasladsgetmcevi rcAGCAAACTAGGAÁA7GACâGTGCCTCTGCGAACA7CAC0ATTGTGíiAGTCAAACGCCACA7CCACA7CTACAGC7gGgACAAGCCAT0TTeTCAA57G 700 s 1 L G N _t> _S ASA X I. T I V E s M_ a, T 5TSTA0TSHLVKC

TGCAGAtUAGGAâAÀAAC'1TCTGTGTGAAYGGAGGCGA3T6ClYCA7Gfi7fiÀAA&ACe777CAAATCCCTCAAGATACTTGTGOAAGTGaXAAA7fiAÚ S00 AEKE4TFCVMGC£CFMVKDLS Μ P S RYLCKCPuÊ » · t · a · ·

Í7TAC7GGTGATCGCTGCCAAMCTAC5TAATGGCCAfiCTTCTACAGTACGTCCÁCTCCCTTTCTGTCYC1GCÍTGAATAGCGCÁTc7eÂGTCGGTGCCG 900

FTGORCOHTVMA5FYST57pFLSI,Pê^w

CT7TCT7$775tíGCA70TíCcCTCACATTCCGCC7AGAGCTAfiA7GCG7T77ÁCCAGGTCTAACÀTTGACT5CCTeTGCCT37£GeATGAaAACATTAA 1000

ÇAMAGCGATTGTATCA0TTCCTCTGTecÓ7GAG7A6T05GGTÇTGAGeTAÇTCGTAGGTGCGTMGGCTeCAGT0TT7ÓT6AAATTGA7CTTGAATTAC 1100

TG7WTA0GA0AYGATAGTCççtCTCACCCAGTGCMTGACííI^GGCCT7GAAIUGTCAAAAÀAAAÁAAAAAAAAaAAAATCGAIG7CGACTCGAGA 1200

TÔTGGÇ7G

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-53- - ‘,Γ ....... (b) uma sequência de ADN como a seguinte:

. 100

TCTàAAAC7ACAGAGACTGTA7T7TCATGA7CATCA7ACTTCTGT!1AAATA7AC77AAACCGC7TTGÇTCÇTGATCTTGTAG&AAG7CAGAAC77CGCA7 * N T R D C I FMI IlV|,«»IILrpLU$’SCRKSeu»l

TAGCAAAGCGTCAC7GGCTGATTC7GGAGAA7A7ATGTCCAJUG7GATCAGCAW:7AEGÁAA7GACAG7GCC7C7GCCaAGA7CACCX7TG7GGAGTCA 200

GKÀSlÂPSGEYMCKVlSKLGMOSASAKlTlves • * · · · · * · > «

AACGG7AAfiAGA7âCCTAC7GCG7GC7A77TC7CAGTCTC7AAGAGGAGTGATCÁAGG7ATGTGG7CACACTTGAATGACGCÁGG7G7G7GAAA7C7CAT 300 NGKRÇLLRAlSGS(_rRGviKyCGHT*I7eVCEISi.

TCTGAACAAATAAAAA7CA7GftAÀGÊAAAACTCTA7G777GAAATA7C77A7GGfi7CCTtCTG7AMGCTC77CACTCCATAAGG7GAÁATAG4eCTGJU 40Ú •TMKNKÉBKTlCLtYLMGPPVKLFTP-GEtDLIt

A7AIÁ7A7AGA7TATTT

7 1*11 (c) uma sequência de ADN representada pelos nucleótidos 281-587 da primeira sequência de (a); ou (d) uma sequência de ADN hibridável com qualquer uma das sequências de ADN de acordo com (a), (b) ou (c).
2 - Factor polipeptidico básico caracterizado por possuir um peso molecular, em condições redutoras ou não, de cerca de 30 kD a cerca de 36 kD em electroforese SDS-gel de poliacrilamida, usando os seguintes padrões de peso molecular:

Lisozima (clara de ovo de galinha) 14 400

Inibidor da tripsina de soja 21 500

Anidrase carbónica (bovina) 31 000

Ovalbumina (clara de ovo de galinha) 45 000

Albumina de soro bovino 66 200

Fosforilase B (músculo de coelho) 97 400 e possuir actividade mitogénica estimuladora da divisão de células de Schwann de ratazana na presença de plasma de vitela fetal e, quando isolado usando HPLC de fase inversa, reter pelo menos 50% da referida actividade, após 10 semanas de incubação em ácido trifluoroacético a 0,1% a 4 ^aC.
3 - Factor polipeptidico básico caracterizado por possuir um peso molecular, em condições não redutoras, de cerca de 55 kD a cerca de 63 kD em electroforese SDS-gel de poliacrilamida, usando os seguintes padrões de peso molecular:

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-54Lisozima (clara de ovo de galinha) 14 400

Inibidor da tripsina de soja 21 500

Anidrase carbónica (bovina) 31 000

Ovalbumina (clara de ovo de galinha) 45 000

Albumina de soro bovino 66 200

Fosforilase B (músculo de coelho) 97 400 e possuir actividade mitogénica estimuladora da divisão de células de Schwann de ratazana na presença de plasma de vitela fetal e, quando isolado usando HPLC de fase inversa, reter pelo menos 50% da referida actividade, após 4 dias de incubação em ácido trifluoroacético a 0,1% a 4 ^aC.
4 - Processo de preparação de um polipéptido como definido na reivindicação 2 ou na reivindicação 3, caracterizado por compreender a extracção de cérebro de vertebrado para se obter uma proteína, submeter o extracto resultante a purificação cromatográfica compreendendo HPLC com hidroxiapatite e em seguida a electroforese em SDS-gel de poliacrilamida, e recolher a fracção que possui um peso molecular observado de cerca de 30 kD a cerca de 36 kD e/ou a fracção que possui um peso molecular observado de cerca de 55 kD a cerca de 63 kD se, em qualquer dos casos, sujeitas a electroforese em SDS-gel de poliacrilamida, usando os seguintes padrões de peso molecular:

Lisozima (clara de ovo de galinha) 14 400

Inibidor da tripsina de soja 21 500

Anidrase carbónica (bovina) 31 000

Ovalbumina (clara de ovo de galinha) 45 000

Albumina de soro bovino 66 200

Fosforilase B (músculo de coelho) 97 400 no caso da fracção de peso molecular mais baixo, anteriormente mencionada, em condições redutoras ou não, e no caso da fracção de peso molecular mais elevado, anteriormente mencionada, em condições não redutoras, exibindo a(s) fracção(ões) actividade mitogénica estimuladora da divisão de células de Schwann de ratazana contra um fundo de plasma de vitela fetal.
5 - Processo de acordo com a reivindicação 4, caracterizado

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-55por o material de cérebro ser material da pituitária.
6 - Processo de acordo com a reivindicação 5, caracterizado por a fonte de material da pituitária ser bovino.
7 - Processo de acordo com qualquer das reivindicações 4 a

6, caracterizado por a proteína inicialmente extractada do material de cérebro ser primeiro submetida a cromatografia em carboximetilcelulose.
8 - Processo de acordo com qualquer das reivindicações 4 a

7, caracterizado por incluir também, após HPLC em hidroxiapatite, cromatografia de permuta iónica, filtração em gel e/ou HPLC de fase inversa.
9 - Processo de acordo com a reivindicação 8, caracterizado por se empregar HPLC de fase inversa, usando ácido trifluoroacético como agente de emparelhamento iónico.
10 - Processo de acordo com qualquer das reivindicações 4 a 9, caracterizado por em cada etapa a actividade biológica do material ser avaliada como o nível de actividade mitogénica estimuladora da divisão de células de Schwann de ratazana contra um fundo de plasma de vitela fetal.
11 - Factor polipeptídico básico caracterizado por possuir actividade mitogénica estimuladora da divisão de células de Schwann na presença de plasma de vitela fetal, possuindo um peso molecular de cerca de 30 kD a cerca de 36 kD e incluir na sua sequência de aminoácidos qualquer uma ou mais das seguintes sequência peptídicas:

Phe Lys Gly Asp Ala His Thr Glu

Ala Ser Leu Ala Asp Glu Tyr Glu Tyr Met XLys

Thr Glu Thr Ser Ser Ser Gly Leu X Leu Lys

Ala Ser Leu Ala Asp Glu Tyr Glu Tyr Met ArgLys

Ala Gly Tyr Phe Ala Glu X Ala Arg

Thr Thr Glu Met Ala Ser Glu Gin Gly Ala

Ala Lys Glu Ala Leu Ala Ala LeuLys

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Phe Vai Leu Gin Ala Lys Lys Glu Thr Gin Pro Asp Pro Gly Gin Ile Leu Lys Lys Vai Pro Met Vai Ile Gly Ala Tyr Thr Glu Tyr Lys Cys Leu Lys Phe Lys Trp Phe Lys Lys Ala Thr Vai Met

Glu X Lys Phe Tyr Vai Pro

Lys Leu Glu Phe Leu X Ala Lys

12 - Factor polipeptidico básico caracterizado por possuir actividade mitogénica estimuladora da divisão de células de Schwann na presença de plasma de vitela fetal, possuindo um peso molecular de cerca de 55 kD a cerca de 63 kD e incluir na sua sequênciaaminoácidos qualquer sequência umamais seguintes

Vai His Gin Vai Trp Ala Ala Lys Tyr Ile Phe Phe Met Glu Pro Glu Ala X Ser Ser Gly Leu Gly Ala Trp Gly Pro Pro Ala Phe Pro Vai X Tyr Trp Phe Vai Vai Ile Glu Gly Lys Ala Ser Pro Vai Ser Vai Gly Ser Vai Gin Glu Leu Vai Vai Cys Leu Leu Thr Vai Ala Ala Pro Pro Thr Lys Vai His Gin Vai Trp Ala Ala Lys Lys Ala Ser Leu Ala Asp Ser Gly Glu Tyr Met X Lys Asp Leu Leu Leu X Vai

13 - Ensaio da actividade mitogénica de células gliais, caracterizado por se usar um fundo de plasma de vitela fetal contra o qual é avaliada a síntese de ADN em células gliais estimuladas (se o for) por uma substância sob ensaio.
14 - Ensaio de acordo com a reivindicação 12, caracterizado por as células gliais serem células de Schwann.
15 - Sequência de ADN caracterizada por codificar um polipéptido possuindo actividade mitogénica das células gliais e compreendendo:

(a) uma sequência de ADN escolhida de entre as apresentadas em (a) da reivindicação 1;

(b) uma sequência de ADN como a apresentada em (b) da reivindicação 1;

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-57— (c) uma sequência de ADN representada pelos nucleótidos 281-587 da primeira sequência de (a) da reivindicação 1; ou (d) uma sequência de ADN hibridável com qualquer uma das sequências de ADN de acordo com (a), (b) ou (c).
16 - Construção de ADN caracterizada por compreender uma sequência de ADN como definida na reivindicação 15 e em posição da estrutura de leitura operável num vector sob o controlo de uma sequência de controlo que permite a expressão da referida sequência em células hospedeiras escolhidas depois da transformação das referidas células pela referida construção.
17 - Células hospedeiras caracterizadas por estarem modificadas por incorporação de uma construção definida como na reivindicação 16 de modo que a referida sequência de ADN possa ser expressa nas referidas células hospedeiras.
18 - Processo de preparação de um factor mitogénico de células gliais caracterizado por se cultivarem células hospedeiras modificadas definidas como na reivindicação 17, sob condições que permitam a expressão da referida sequência de ADN.
19 - Polipéptido caracterizado por ser um mitogénio de células gliais e ser codificado por uma sequência de ADN definida como na reivindicação 15 e que é obtenível por um processo definido como na reivindicação 18.
20 - Formulação farmacêutica ou veterinária caracterizada por compreender um polipéptido definido como em qualquer das reivindicações 1, 2, 3, 11, 12 ou 19, formulada para uso farmacêutico ou veterinário, respectivamente, opcionalmente em conjunto com um diluente, transportador ou excipiente aceitável e/ou numa forma de dosagem unitária.
21 - Uso de um polipéptido definido como em qualquer das reivindicações 1, 2, 3, 11, 12 ou 19, como um mitogénio de células gliais.

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22 - Polipéptido definido como em qualquer das reivindicações 1, 2, 3, 11, 12 ou 19, para uso como um mitogénio de células gliais.
23 - Uso de um polipéptido definido como em qualquer das reivindicações 1, 2, 3, 11, 12 ou 19, no fabrico de um medicamento.
24 - Uso de um polipéptido definido como em qualquer das reivindicações 1, 2, 3, 11, 12 ou 19, como um imunogénio para gerar anticorpos, destinando-se opcionalmente os referidos anticorpos a fins de diagnóstico.
25 - Uso de um polipéptido definido como em qualquer das reivindicações 1, 2, 3, 11, 12 ou 19, num ensaio competitivo para identificar ou quantificar moléculas possuindo características de ligação ao receptor correspondentes ao referido polipéptido.
26 - Uso de acordo com a reivindicação 25, caracterizado por o referido polipéptido ser marcado, opcionalmente com um radio-isótopo.
27 - Uso de um polipéptido definido como em qualquer das reivindicações 1, 2, 3, 11, 12 ou 19, num processo de isolamento por afinidade, opcionalmente cromatografia de afinidade, para a separação de um receptor correspondente.

28 - Péptido caracterizado por ser seleccionado de entre os seguintes:

Phe Lys Gly Asp Ala His Thr Glu

Ala Ser Leu Ala Asp Glu Tyr Glu Tyr Met X Lys

Thr Glu Thr Ser Ser Ser Gly Leu x Leu Lys

Ala Ser Leu Ala Asp Glu Tyr Glu Tyr Met Arg Lys

Ala Gly Tyr Phe Ala Glu X Ala Arg

Thr Thr Glu Met Ala Ser Glu Gin Gly Ala

Ala Lys Glu Ala Leu Ala Ala Leu Lys

Phe Vai Leu Gin Ala Lys Lys

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Glu Thr Gin Pro Asp Pro Gly Gin Ile Leu Lys Lys Vai Pro Met Vai Ile Gly Ala Tyr Thr G1U Tyr Lys Cys Leu Lys Phe Lys Trp Phe Lys Lys Ala Thr Vai Met Glu X Lys Phe Tyr Vai Pro Lys Leu Glu Phe Leu X Ala Lys Vai His Gin Vai Trp Ala Ala Lys Tyr Ile Phe Phe Met Glu Pro Glu Ala X Ser Ser Gly Leu Gly Ala Trp Gly Pro Pro Ala Phe Pro Vai X Tyr Trp Phe Vai Vai Ile Glu Gly Lys Ala Ser Pro Vai Ser Vai Gly Ser Vai Gin Glu Leu Vai Gin Arg Vai Cys Leu Leu Thr Vai Ala Ala Pro Pro Thr Lys Vai His Gin Vai Trp Ala Ala Lys Lys Ala Ser Leu Ala Asp Ser Gly Glu Tyr Met X Lys Asp Leu Leu Leu X Vai.

29 - Uso de um polipéptido definido como na reivindicação 28, ou de uma sequência de ácido nucleico correspondente na investigação, isolamento ou preparação de um mitogénio de célula glial ou de uma sequência de gene correspondente, ou na produção de um anticorpo correspondente.
30 - Sequência de ADN caracterizada por ser escolhida de entre as apresentadas em (a) da reivindicação 1.
31 - Polipéptido caracterizado por ser codificado por uma sequência de ADN definida como na reivindicação 30.
32 - Anticorpo caracterizado por ser contra um polipéptido definido como em qualquer das reivindicações 1, 2, 3, 11, 12, 19 ou 31.
33 - Anticorpo caracterizado por ser contra um polipéptido definido como na reivindicação 28.
34 - Sequência genética codificando aetividade mitogénica de células gliais, isolada, ou seu fragmento, caracterizada por ser obtenível pelo uso definido na reivindicação 29.