PT100429B - Uso de derivados da xantina na preparacao de um medicamento para inibicao da producao de factor de necrose tumoral - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO

DA

PATENTE DE INVENÇÃO

N.° 100 429

REQUERENTE: SMITHKLINE BEECHAM CORPORATION, norte-americana (Estado de Pennsylvania), com sede em One Franklin Plaza, Philadelphia, Pennsylvania 19101, Estados Unidos da América

EPÍGRAFE: Uso de derivados da xantina na preparação de um medicamento para inibição da produção de factor de necrose tumoral

INVENTORES: Klaus Max Esser

Reivindicação do direito de prioridade ao abrigo do artigo 4.° da Convenção de Paris de 20 de Março de 1883.

INP1 MOQ 113 RF 1S732

PATENTE N^a 100 429

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Uso de derivados da xantina na preparação de um medicamento para inibição da produção de factor de necrose tumoral

RESUMO

O presente invento refere-se ao uso de xantinas

8-substituídas de Fórmula (I):

Õ

na qual ^R1 ^{e r}2 ^reP^resentam, cada um, independentemente do outro, alquilo ou -(CH₂)_m-A;

m representa zero ou um número inteiro 1, 2 ou 3;

A representa um radical hidrocarboneto cíclico, substituído ou não substituído;

R₃ representa um átomo de halogeneo, um grupo nitro ou um grupo -NR₄R₅;

R₄ e R₅ representam, cada um, independentemente do outro, hidrogénio, alquilo ou alquilcarbonilo; ou R₄ e R₅ em conjunto com o azoto ao qual estão ligados formam um grupo heterocíclico opcionalmente substituído; e os seus sais farmacêuticamente aceitáveis na preparação de um medicamento para a inibição da produção de factor de necrose tumoral (TNF).

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MEMÓRIA DESCRITIVA

Campo do Invento presente invento refere-se a compostos que são inibidores da produção in vivo do Factor de Necrose Tumoral (TNF), uma proteína do soro.

Antecedentes do Invento

A produção excessiva ou não regulada de TNF está implicada na mediação ou na exacerbação de um certo número de doenças que incluem a artrite reumatóide, espondilite reumatóide, osteoartrite, artrite gotosa e outras condições artríticas; sépsis, choque séptico, choque endotóxico, sépsis por gram-negativos, síndrome do choque tóxico, síndrome da dificuldade respiratória dos adultos, malária cerebral, doença inflamatória pulmonar crónica, silicose, sarcoidose pulmonar, doença de ressorção óssea, lesões por reperfusão, reacção enxerto-hospedeiro, rejeições a aloenxertos, febre e mialgias devidas a infecções como a gripe, caquexia secundária a infecção ou malignidade, caquexia secundária ao síndrome da imunodeficiência adquirida (SIDA), SIDA-ARC (complexo relacionado com a SIDA), formação de quelóides, formação de tecido de cicatriz, doença de Crohn, . colite ulcerosa ou piresis.

A SIDA resulta da infecção dos linfócitos T com o vírus da imunodeficiência humana (HIV). Foram identificados pelo menos três tipos ou estirpes de HIV, a saber, o HIV-1, o HIV-2 e o HIV-3. Como consequência da infecção com o HIV, a imunidade mediada pelas células T é diminuída e os indivíduos infectados contraiem graves infecções oportunistas e/ou neoplasmas raros. A entrada do HIV no linfócito T exige a activação do linfócito T. Outros vírus como o HIV-1 e HIV-2 infectam os linfócitos T depois da activação da célula T e esta expressão e/ou replicação proteica do vírus é mediada ou mantida por esta activação da célula T. Uma vez que o linfócito T activado esteja infectado com HIV, o linfócito T tem que continuar a ser mantido num estado activado para permitir a expressão genética do HIV e/ou a replicação do HIV. As monoquinas, especificamente o TNF, estão

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activada e/ou na replicação do vírus, desempenhando um papel na manutenção da activação do linfócito T. Portanto, interferências na actividade da monoquina, como a inibição da produção da monoquina, nomeadamente do TNF, em indivíduos infectados com o HIV, ajuda a limitar a manutenção da activação da célula T, reduzindo assim a progressão da infecciosidade do HIV para células previamente não infectadas, o que resulta no abrandamento ou eliminação da progressão da disfunção imunológica provocada pela infecção com HIV. Os monócitos, macrófagos e células relacionadas, tais como células de Kupffer e gliais, têm sido também implicados na manutenção da infecção com HIV. estas células, como as células T, são alvos para a replicação virai e o nível desta replicação virai depende do estado de activação das células, [ver Rosenberg e outros, The Immunopathogenesis of HIV Infection, Advances in Immunology, Vol. 57 (1989)]. Tem-se verificado que as monoquinas, como o TNF, activam a replicação do HIV em monócitos e/ou macrófagos [ver Poli e outros, Proc. Natl. Acad. Sei. 87:782-784 (1990)]. portanto a inibição da produção ou da actividade da monoquina ajuda a limitar a progressão do HIV, como acima se disse, em relação às células T. Estudos adicionais identificaram o TNF-a como um factor comum na activação do HIV in vitro e proporcionaram um claro mecanismo de acção através do factor nuclear kB, uma proteína reguladora nuclear obtida do citoplasma das células (Osborn e outros, PNAS (86) 2336-2340). Esta evidência sugere que uma redução da síntese do TNF pode ter um efeito antiviral nas infecções com HIV por redução da transcrição e, portanto, da produção do vírus.

O TNF também foi implicado em vários papéis com outras infecções virais como o citomegalovírus (CMV), o vírus da gripe, o adenovírus e a família de vírus do herpes por razões semelhantes às referidas.

A capacidade para controlar os efeitos adversos do TNF é ampliada por meio da utilização dos compostos que inibem o TNF nos mamíferos que precisam desta utilização. Permanece a neces-

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14548-1 sidade de compostos que sejam úteis no tratamento de estados de doença mediados pelo TNF que são exacerbados ou causados pela produção excessiva e/ou não regulada do TNF.

Sumário do Invento

Este invento refere-se à utilização dos compostos da fórmula (I) na inibição da produção de TNF em mamíferos, incluindo seres humanos, gue precisam deste tratamento, processo este que compreende a administração a estes mamíferos de uma quantidade inibidora do TNF, eficaz, de um composto de fórmula (I). Mais especificamente, a inibição da produção de TNF é útil para tratar, profilática ou terapeuticamente, qualquer estado de doença num mamífero que seja exacerbado ou provocado pela produção excessiva ou não regulada do TNF.

Os compostos de Fórmula (I) do presente invento são representados pela estrutura:

onde

R-L e R₂ são cada um, independentemente do outro, alquilo ou uma porção com a fórmula -(CH₂)_m-A;

m é um número de 0 a 3;

A é um radical hidrocarboneto cíclico não substituído ou substituído;

Rg é halogéneo, nitro ou -NR₄R₅;

R₄ e Rg são, independentemente um do outro, hidrogénio, alquilo, alquilcarbonilo ou, em conjunto com o azoto ao qual estão ligados, formam um anel heterocíclico opcionalmente substituído; e os seus sais farmaceuticamente aceitáveis.

Descrição Detalhada do Invento

Os compostos da fórmula (I) também são úteis no tratamento de infecções virais em que os vírus são sensíveis à regulação na

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14548-1 gama superior pelo TNF ou provocam a produção de TNF in vivo. Os vírus aqui contemplados para tratamento são os que produzem TNF como um resultado da infecção, ou os que são sensíveis à inibição, por replicação diminuída, directa ou indirectamente, por meio dos inibidores do TNF de fórmula (I). Estes vírus incluem, mas não se limitam a HIV-1, HIV-2 e HIV-3, citomegalovírus (CMV), gripe, adenovírus e os vírus do grupo Herpes, tais como o Herpes Zoster e o Herpes Simplex, mas não estão limitados a estes.

Mais especificamente, este invento refere-se a um processo para tratar um mamífero infectado com o vírus da imunodeficiência humana (HIV), que compreende a administração a este mamífero de uma quantidade inibidora do TNF eficaz de um composto de fórmula (I).

Os compostos da fórmula (I) também podem ser usados em associação com o tratamento veterinário de mamíferos, para além dos seres humanos, que necessitem da inibição da produção do TNF. As doenças mediadas pelo TNF a ser tratadas, profilática ou terapeuticamente, nos animais incluem estados de doença como os acima referidos mas, em particular, infecções virais. Exemplos destes vírus incluem, mas não se limitam ao vírus da imunodeficiência felina (FIV) ou outras infecções retrovirais como o vírus da anemia infecciosa dos equinos, o vírus da artrite caprina, o vírus visna, o vírus maedi e outros lentivírus.

Um processo preferido segundo este invento para tratar terapêutica ou profilaticamente, infecções virais em particular quando os vírus são sensíveis à regulação na gama superior pelo TNF ou irão provocar a produção do TNF in vivo. consiste em administrar uma quantidade eficaz de um composto da fórmula (I) ou, com maior preferência, o composto 1,3-di-ciclopropilmetil-8-amino xantina ou um seu sal farmaceuticamente aceitável.

Os compostos do presente invento com a fórmula (I) são representados pela estrutura:

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onde ^R1 ^{e r}2 ^sã° ^cad^& independentemente do outro, alquilo ou uma porção com a fórmula -(CH₂)_m~A;

m é um número de 0 a 3;

A é um radical hidrocarboneto cíclico não substituído ou substituído;

R₃ é halogéneo, nitro ou -NR₄R₅;

R₄ e R₅ são, independentemente um do outro, hidrogénio, alquilo, alquilcarbonilo ou, em conjunto com o azoto a que estão ligados, formam um anel heterocíclico opcionalmente substituído; e os seus sais farmaceuticamente aceitáveis.

De preferência, R_x e R₂ representam ambos -(CH₂)_m-A. De preferência, a porção A representa um grupo cicloalquilo C₃_₈, particularmente um cicloalquilo C₃_₆ de preferência não substituído. Com maior preferência, A é uma porção ciclopropilo ou ciclobutilo. De preferência, m é 0 ou 1. Os grupos substituintes opcionais apropriados para qualquer hidrocarboneto cíclico incluem uma porção alquilo ou um átomo de halogéneo.

Um grupo preferido para Rg_ ou R₂ é um grupo alquilo com 1 a 6 átomos de carbono, especificamente, metilo, etilo, propilo ou n-butilo. 0 mais preferido é o n-butilo.

Quando R₃ é halogéneo, o substituinte preferido é o bromo ou o cloro.

Quando R₃ é -NR₄R₅ e R₄ e R₅ representam alquilo ou alquilcarbonilo prefere-se que um de R₄ ou R₅ seja hidrogénio.

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Os grupos heterocíclicos apropriados incluem grupos heterocíclicos saturados ou não saturados possuindo anéis simples ou fundidos, tendo cada anel 5 a 7 átomos no anel e estes átomos do anel compreendem opcionalmente até dois heteroátomos adicionais escolhidos de entre 0, N ou S.

Os grupos heterocíclicos preferidos incluem anéis simples que compreendem 5 a 7 átomos de preferência 5 a 6 átomos e com maior preferência 6 átomos no anel. Os grupos heterocíclicos preferidos são os anéis pirrolidinilo, piperidinilo ou morfolinilo.

São exemplos específicos dos compostos da fórmula I:

1.3- di-n-butil-8-nitro xantina;

1.3- di-ciclopropilmetil-8-nitro xantina;

1.3- di-ciclobutilmetil-8-nitro xantina;

1.3- di-ciclopentilmetil-8-nitro xantina;

1.3- di-ciclo-hexilmetil-8-nitro xantina;

1.3- di-n-butil-8-amino xantina;

1.3- di-ciclopropilmetil-8-amino xantina;

1.3- di-ciclobutilmetil-8-amino xantina;

1.3- di-ciclopentilmetil-8-amino xantina;

1.3- di-ciclo-hexilmetil-8-amino xantina;

1.3- di-ciclopropil-8-amino xantina;

1.3- di-n-butil-8-acetamido xantina;

1.3- di-n-butil-8-cloro xantina;

1.3- di-n-butil-8-bromo xantina;

1.3- di-ciclopropilmetil-8-cloro xantina;

1.3- di-ciclo-hexil-8-cloro xantina;

1.3- di-n-butil-8-piperidino xantina;

1.3- di-ciclopropilmetil-8-morfolino xantina;

1.3- di-n-butil-8-pirrolidinil xantina;

1.3- di-ciclopropilmetil-8-pirrolidinil xantina;

1.3- di-ciclopropilmetil-8-piperidinil xantina;

1.3- di-ciclo-hexilmetil-8-piperidinil xantina;

1.3- di-ciclo-hexilmetil-8-bromo xantina; e

1.3- di-ciclo-hexil-8-nitro xantina; ou os seus sais farmaceuti camente aceitáveis.

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composto da fórmula (I) mais preferido para utilização no processo deste invento é a l,3-di-ciclopropilmetil-8-amino xantina ou um seu sal farmaceuticamente aceitável.

A expressão grupos alquilo¹¹ tal como aqui é usada, isolada ou como parte de outro grupo (por exemplo, em alquilcarbonilo) significa que inclui radicais tanto de cadeia linear como ramificada com 1 a 12 átomos de carbono, excepto se o comprimento da cadeia nele está limitado, incluindo mas não se limitando a metilo, etilo, n-propilo, isopropilo, n-butilo, sec-butilo, isobutilo, terc-butilo e análogos.

A expressão hidrocarboneto cíclico, excepto quando especificada de outro modo, tal como aqui é usada significa um anel simples ou anéis fundidos com 3 a 8 átomos de carbono. Os hidrocarbonetos cíclicos podem incluir até 8 átomos de carbono em cada anel. A expressão cicloalquilo ou cicloalquilalquilo tal como aqui é usada é permutável com a expressão hidrocarboneto cíclico. Os grupos cicloalquilo e cicloalquilalquilo incluem mas não se limitam a ciclopropilo, ciclopropilmetilo, ciclopentilo ou ciclo-hexilo.

A expressão halo tal como aqui é usada significa halogéneos, isto é, cloro, flúor, bromo e iodo.

A expressão inibindo a produção de IL-1 ou inibindo a produção de TNF significa

a) uma diminuição de níveis excessivos de IL-1 ou TNF in vivo respectivamente, num mamífero, especificamente seres humanos, para níveis normais ou níveis abaixo do normal por inibição da libertação in vivo de IL-1 por todas as células incluindo mas não se limitando a monócitos ou macrófagos;

b) uma regulação na gama inferior, ao nível da tradução ou da transcrição, de níveis excessivos de IL-1 ou TNF in vivo respectivamente, num mamífero, especificamente seres humanos, para níveis normais ou níveis abaixo do normal; ou

c) uma regulação na gama inferior, por meio da inibição da síntese directa, dos níveis de IL-1 ou de TNF, como um evento

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-9pós-tradução.

A expressão doença ou estados de doença mediados pelo TNF significa todo e qualquer estado de doença em que o TNF desempenhe um papel, quer pela produção do próprio TNF quer pelo facto do TNF provocar a libertação de outra citoquina como IL-1 ou IL-6 mas não se limitando a estas. Um estado de doença em que a IL-1, por exemplo, é um componente principal e cuja produção ou acção é exacerbada ou segregada em resposta ao TNF, terá portanto de ser considerada um estado de doença mediado pelo TNF. Como o TNF-β (também conhecido como linfotoxina) tem uma homologia estrutural muito semelhante à do TNF-α (também conhecido como caquectina) e dado que ambos induzem respostas e ligações biológicas semelhantes ao mesmo receptor celular, tanto o TNF-α como o TNF-β são inibidos pelos compostos do presente invento e, portanto, são aqui referidos colectivamente como TNF excepto quando especificamente definidos de outro modo. De preferência é inibido o TNF-a.

A expressão citoquina tal como aqui é usada significa qualquer polipéptido segregado que afecte as funções celulares e seja uma molécula que module as interacções entre células na resposta imunológica ou inflamatória. Uma citoquina inclui mas não se limita a monoquinas ou linfoquinas, quaisquer que sejam as células que as produzam. Por exemplo, uma monoquina é geralmente referida como sendo produzida e segregada por uma célula mononuclear, tal como um macrófago e/ou um monócito mas muitas outras células produzem monoquinas, tais como as células assassinas naturais, fibroblastos, basófilos, neutrófilos, células endoteliais, astrócitos cerebrais, células do estroma da medula óssea, queratinócitos epiderais e β-linfócitos. As linfoquinas são geralmente referidas como sendo produzidas pelas células linfócitas. Exemplos de citoquinas em relação ao presente invento incluem mas não se limitam a Interleucina-1 (IL-1), Interleucina-6 (IL-6), Interleucina-8 (IL-8), Factor-alfa de Necrose Tumoral (TNF-α) e Factor beta de Necrose Tumoral (TNF-β).

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A inibição de uma citoquina considerada pelo presente invento, para ser utilizada no tratamento de um ser humano infectado com HIV tem de ser feita sobre uma citoquina que esteja implicada (a) na iniciação e/ou manutenção da activação da célula T e/ou na expressão e/ou replicação do gene de HIV mediada pela célula T activada e/ou (b) em-qualquer doença mediada pela citoquina associada a problemas como a caquexia ou a degenerescência muscular. A citoquina que, especificamente, se quer inibir é o TNF a.

PROCESSOS DE PREPARAÇÃO

A preparação dos compostos da Fórmula (I) pode ser realizada por qualquer perito na arte seguindo os procedimentos aqui descritos.

Um processo para a preparação de um composto de fórmula (I) compreende a reacção de um composto de fórmula (II):

onde Rj_a representa R_lz como foi definido em relação à fórmula (I), ou um grupo convertível em R_x e R₂a representa R₂, como foi definido em relação à fórmula (I), ou um grupo nele convertível, com um reagente capaz de substituir o hidrogénio de C-8 do composto da fórmula (II) com um grupo R₃a onde R₃a representa R₃ como foi acima definido em relação à fórmula (I), ou um grupo nele convertível; e, depois, se necessário, realizando um ou mais dos seguintes passos opcionais:

(i) converter qualquer grupo Rj^a em Rj e/ou R₂a em R₂;

(ii) converter um composto da fórmula (I) noutro composto da fórmula (I);

(iii) converter um composto da fórmula (I) num sal farmaceuticamente aceitável.

Os reagentes adequados para substituir o hidrogénio de C-8

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14548-1 dO composto da fórmula (II) com um grupo R₃a são reagentes convencionais bem conhecidos. As condições da reacção para a substituição do hidrogénio de C-8 do composto.de fórmula (II) dependerão evidentemente do reagente particular escolhido e, em geral, as condições usadas serão as convencionais para o reagente utilizado. Um reagente particularmente adequado é um agente de nitração.

Numa forma conveniente do supramencionado processo, o composto da fórmula (II) reage com um agente de nitração adequado para dar um composto da fórmula (I) em que R₃ representa um grupo nitro, convertendo-se depois o grupo nitro num átomo de halogéneo ou num grupo com a fórmula -NR₄R₅, acima definida.

Um composto da fórmula (II) pode ser preparado pela ciclização desidratante de um composto da fórmula (III):

(ΠΙ) onde R-^a representa R-l, como foi definido em relação à fórmula (I), ou um grupo convertível em R-l e R₂a representa R₂, como foi definido em relação à fórmula (I) ou um grupo nele convertível, A]_ representa -NO ou -NHCHO e A₂ representa -NHCH₃ ou NH₂/ desde que, quando Aj for -NO, A₂ seja então -NHCHg e quando Aj for -NHCHO, A₂ seja então NH₂; e depois, caso seja necessário, convertendo qualquer grupo R^a em Rj^ e/ou R₂a em R₂· A ciclização desidratante de um composto da fórmula (III) pode ser realizada sob quaisquer condições apropriadas. Favoravelmente, as condições escolhidas são aquelas em que a água formada é removida da mistura reaccional, portanto a reacção é geralmente realizada a uma temperatura elevada, na gama de 100°C a 200’C, por exemplo na gama de 180°C a 190°C.

Num aspecto do processo, especialmente quando A! é -NO e A₂ é -NHCH₃, a reacção é realizada num solvente não miscível com a

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água tal como o tolueno, à temperatura de refluxo do solvente, sendo a água removida por meio de um separador de água.

Valores adequados para R_xa e R₂a incluem Rq_ e R₂, respectivamente ou grupos protectores de azoto, como os grupos benzilo.

Quando R^a e R₂a não representam R-^ ou R₂ respectivamente, as supramencionadas conversões de R^a em Rj e R₂a em R₂ podem ser realizadas utilizando o procedimento convencional apropriado. Por exemplo, quando R^a (ou R₂a) representa um grupo protector de azoto, como um grupo benzilo, o grupo protector pode ser removido usando o procedimento convencional apropriado, tal como a hidrogenação catalítica e faz-se reagir o produto resultante com um composto da fórmula (IV)

X-(CH₂)_m-A (IV) em que A e m são definidos como em relação à fórmula (I) e X representa um grupo que se despede apropriado, como um haleto, por exemplo, brometo ou iodeto.

A protecção de qualquer grupo ou átomo reactivo, como o átomo de azoto da xantina, pode ser realizada em qualquer passo apropriado do supramencionado processo. Os grupos protectores adequados incluem aqueles que são utilizados convencionalmente na arte para o grupo ou átomo particular a ser protegido por exemplo, os grupos protectores apropriados para os átomos de azoto da xantina são os grupos benzilo. Estes grupos protectores são conhecidos dos peritos na arte e já foram descritos por Green, T., Protective Groups in Orqanic Sinthesis, Wiley Publishers, NY (1981), cujo teor é aqui incorporado como referência. Os grupos protectores podem ser preparados e removidos utilizando os procedimentos apropriados convencionais como a seguir se ilustra.

Por exemplo, os grupos protectores N-benzilo podem ser preparados tratando o composto apropriado da fórmula (II) com cloreto de benzilo na presença de uma base como a trietilamina. Os grupos protectores N-benzilo podem ser removidos por hidrogena-

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14548-1 ção catalítica sobre um catalisador apropriado, tal como o paládio sobre carvão activadõ, num solvente apropriado tal como o etanol, convenientemente a uma temperatura elevada ou por meio de tratamento com cloreto de alumínio anidro em benzeno seco à temperatura ambiente.

Um composto da fórmula (III) em que A representa -NHCHO e

R₂ representa -NH₂ pode ser adequadamente preparado a partir de um 6-amino-uracilo de fórmula (A) de acordo com o esquema reaccional seguinte:

(A)

redução do NO a NH₂ com, por exemplo, ditioneto de sódio

(D)

(C) onde R^a e R₂a são definidos como em relação à fórmula (II).

Adequadamente, as condições reaccionais usadas no esquema reaccional supramencionado são condições convencionais apropriadas. Num aspecto preferido do processo, a conversão do 6-amino-uracilo(A), através de (B) e (C), no correspondente composto de fórmula (III) e a ciclização do composto de fórmula (III) para dar o composto de fórmula (II) são todas realizadas in situ. utilizando adequadamente um procedimento análogo ao de

Chem. Berichte, 98, 1306-1312

H. Bredereck e A. Edenhofer, (1955).

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Os 6-amino-uracilos de fórmula (A) podem, eles próprios, ser preparados pelo método de V. Papesch e E. F. Schroder, J. Orq. Chem., 16, 1879-90 (1951) ou Yozo Ohtsuka, Buli. Chem, Soc. Jap., 1973, 46 (2), 506-9.

Um composto da fórmula (III) onde A-l representa -NO e A₂ representa -NHCH₃ pode ser convenientemente preparado a partir de um 6-cloro-uracilo de fórmula (E) de acordo com o esquema reaccional seguinte:

(B) onde R^a e R₂a são definidos como em relação à fórmula (II).

Adequadamente, as condições reaccionais usadas no último esquema acima mencionado são as condições convencionais apropriadas, por exemplo, as usadas no método de H. Goldner, G. Dietz e E. Carstens, Liebiqs Annalen der Chemie. 691. 142-158 (1965). 0 6-cloro-uracilo de fórmula (D) também pode ser preparado de acordo com o procedimento de Dietz e outros.

Quando R₃ representa um grupo nitro, as conversões adequadas do grupo nitro noutro grupo R₃a incluem as seguintes:

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14548-1 (i) conversão do grupo nitro num átomo de (ii) conversão do grupo nitro num grupo amino;

(iii) conversão do grupo nitro num átomo de halogéneo seguida pela conversão do átomo de halogéneo num grupo -NR₄R₅ em que R₄ e R₅, juntamente com o átomo de azoto a que estão ligados, formam um grupo heterocíclico opcionalmente substituído; e (iv) conversão do grupo nitro num grupo amino e depois alquilação e/ou acilação do grupo amino para dar um grupo -NR₄R₅ em que R₄ representa hidrogénio, alquilo ou alguilcarbonilo e R^ representa alquilo ou alguilcarbonilo.

Um grupo nitro pode ser convertido num átomo de halogéneo usando qualquer agente de halogenação conveniente. Um agente de halogenação adequado é um haleto de hidrogénio que reaja adequadamente em condições aquosas usando, por exemplo, ácido clorídrico concentrado ou ácido bromidrico concentrado a uma temperatura elevada, por exemplo na gama de 50 a 150°C.

Um outro agente de halogenação adequado é um oxi-haleto fosforoso, como o oxicloreto fosforoso, que pode reagir em qualquer solvente adequado tal como a dimetilformamida, apropriadamente a uma temperatura elevada, por exemplo, na gama de 50°C a 150’C.

Um grupo nitro pode ser convenientemente convertido num grupo amino por métodos convencionais de redução utilizando, por exemplo, estanho em pó e ácido clorídrico concentrado à temperatura ambiente ou usando ditioneto de sódio em metanol aquoso à temperatura ambiente.

Quando R₃ no composto da fórmula (I) representa um átomo de halogéneo este pode ser convertido num grupo -NR₄Rg por meio de reacção com um reagente da fórmula (III):

-HNR₄aR₅a (III) onde R_4a e R_5a são definidos como anteriormente como R₄ e R₅ respectivamente na fórmula (I).

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A reacção entre o composto da fórmula (I) e o composto da fórmula (III) pode ser realizada em qualquer solvente adequado, como o tolueno, a qualquer temperatura que proporcione uma velocidade de formação do produto conveniente mas adequadamente a uma temperatura elevada, na gama de 50° a 180°C, à pressão atmosférica ou a uma pressão elevada.

Os métodos de alquilação adequados para se utilizarem nas conversões supramencionadas incluem os utilizados convencionalmente na arte, por exemplo, métodos que utilizam haletos, de preferência iodetos, na presença de uma base como o carbonato de potássio, em qualquer solvente conveniente como, por exemplo, o acetonitrilo ou o tolueno.

Os métodos de acilação adequados a utilizar nas supramencionadas conversões incluem os utilizados convencionalmente na arte, podendo assim um grupo amino ser convertido num grupo alquilcarbonilamino utilizando um agente acilante apropriado, por exemplo, um grupo amino pode ser convertido num grupo acetilamino empregando anidrido acético a uma temperatura elevada.

PROCESSOS DE TRATAMENTO

Os compostos da fórmula (I) ou um seu sal farmaceuticamente aceitável podem também ser usados no fabrico de um medicamento para o tratamento profilático ou terapêutico de qualquer estado de doença de um ser humano, ou outro mamífero, que seja exacerbado ou causado pela produção excessiva ou não regulada de TNF por células humanas tais como, mas não se limitando a monócitos e/ou macrófagos, especialmente causado por uma produção excessiva ou não regulada do TNF. Os compostos da fórmula (I) são administrados numa quantidade suficiente para inibir a produção do TNF de modo a que esta seja regulada na gama inferior até níveis normais ou, nalguns casos, até níveis subnormais, de modo a melhorar ou evitar o estado de doença. Os níveis anormais de TNF, para o presente invento, são os níveis de (1) TNF livre (não ligado a células) superiores ou iguais a um picograma por ml; (2) TNF associado a qualquer célula ou (3)

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presença de ARNm de TNF acima dos níveis básicos em células ou tecidos em que o TNF é produzido.

Existem vários estados de doença em que a produção excessiva ou não regulada do TNF por monócitos e/ou macrófagos está implicada na exacerbação e/ou na causa da doença. Estes incluem a endotoxémia e/ou o síndrome do choque tóxico [ver Tracey e outros, Nature. 330:662-664 (1987) e Hinshaw e outros, Circ. Shock, 30:279-292 (1990)]; caquexia [ver Dezube e outros, Lancet, 335 (8690): 662 (1990)]; Síndrome da dificuldade respiratória do adulto (ARDS) em que foi detectada uma concentração de TNF superior a 12 000 pg/ml em aspirados pulmonares de pacientes com ARDS [ver Millar e outros, Lancet 2 (8665): 712-714 (1989)]. A infusão sistémica de TNF recombinante deu lugar a alterações tipicamente observadas no ARDS [ver Ferrai-Baliviera e outros, Arch. Surg. 124 (12): 1400-1405 (1989)]; a replicação virai na SIDA do HIV latente na célula T e em linhas de macrófagos pode ser induzida pelo TNF [ver Folks e outros, PNAS 86: 2365-2368 (1989)]. Um mecanismo molecular para a actividade indutora do vírus é sugerido pela capacidade do TNF para activar uma proteína reguladora do gene (NF-kB) encontrado no citoplasma de células, o qual promove a replicação do HIV através da ligação a uma sequência virai reguladora do gene (LTR) [ver Osborne e outros, PNAS 86: 2336-2340 (1989)]. O TNF na caquexia associada à SIDA é sugerido pelo elevado TNF no soro e elevados níveis de produção espontânea de TNF nos monócitos do sangue periférico dos doentes [ver Wright e outros, J. Immunol. 141(1): 99-104 (1988)]. 0 TNF nas doenças de ressorção óssea incluindo a artrite na qual foi determinado que, quando activados, os leucócitos produzem uma actividade de ressorção óssea e os dados sugerem que o TNF-α e o TNF-β contribuem ambos para esta actividade [ver, por exemplo Bertolini e outros, Nature 319; 516-518 (1986) e Johnson e outros, Endocrinolocry 124 (3): 1424-1427 (1989)]. Determinou-se que o TNF estimula a ressorção óssea e inibe a formação dos ossos in vitro e in vivo através da estimulação da formação e activação de osteoclastos combinados com a inibição da função dos osteoblastos. Embora o TNF possa estar envolvido em muitas doenças de ressorção óssea inclu73 648

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indo a artrite, a mais forte ligação com a doença é a associação entre a produção de TNF pelos tecidos tumorais ou hospedeiros e a malignidade associada à hipercalcemia [ver, Calei. Tissue Int. (US) 46, Suppl: S3-10 (1990)]. Na reacção dos hospedeiros aos enxertos, os níveis aumentados de TNF no soro têm sido associados com as complicações principais que se seguem a transplantes de medula óssea alogénica agudos [ver Holler e outros, Blood, 75(4): 1011-1016 (1990)]; a malária cerebral, que é um síndrome neurológico hiper-agudo letal associado com elevados níveis de TNF no sangue e é a mais grave complicação que ocorre nos pacientes com malária. Uma forma de malária cerebral experimental (ECM) que reproduz algumas características da doença humana foi prevenida em ratinhos por meio da administração de um anticorpo anti-TNF [ver Grau e outros, Imm. Review 112: 49-70 (1989)]. Os níveis de TNF no soro estão directamente relacionados com a gravidade da doença e do prognóstico de doentes com ataques agudos de malária [ver Grau e outros, N. Enql. J. Med. 320(24): 1586-1591 (1989)]. Outro estado de doença em que o TNF desempenha um papel é a área das Doenças Inflamatórias Pulmonares crónicas. O depósito de partículas de sílica dá lugar à silicose, uma doença de deficiência respiratória progressiva causada por uma reacção fibrótica. Anticorpos para o TNF bloquearam completamente a fibrose pulmonar induzida nos ratinhos pela sílica [ver Piguet e outros, Nature, 344: 245-247 (1990)]. Foram obtidos níveis elevados de produção do TNF (no soro e em macrófagos isolados) em modelos animais com fibroses induzidas pela sílica e pelo amianto [ver Bissonnette e outros, Inflammation 13(3): 329-339 (1989)]. Verificou-se também que os macrófagos alveolares provenientes de doentes com sarcoidose pulmonar libertam espontaneamente quantidades maciças de TNF quando comparados com macrófagos provenientes de doadores normais [ver Baughman e outros, J. Lab. Clin. Med. 115(1): 36-42 (1990)]. 0 TNF também está implicado noutros estados de doença agudos tais como a resposta inflamatória que se segue à reperfusão, denominada Lesão de Reperfusão e é uma causa principal de danos nos tecidos depois da perda de fluxo sanguíneo [ver Vedder e outros, PNAS 87: 2643-2646 (1990)]. 0 TNF também altera as propriedades

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-19das células endoteliais e possui

pró-coagulantes, como a de produzir um aumento na actividade pró-coagulante do factor tissular e na supressão do percurso da proteína C anticoagulante, bem como na regulação na gama inferior da expressão da trombomodulina [ver Sherry e outros, J. Cell. Biol. 107:11269-1277 (1988)]. 0 TNF também possui actividades pró-inflamatórias que, juntamente com a sua produção precoce (durante o estádio inicial de um evento inflamatório) o torna um mediador plausível de lesões nos tecidos em diversas desordens importantes incluindo mas não se limitando ao enfarte do miocárdio, ataque e choque circulatório. De importância específica pode ser a expressão induzida pelo TNF de moléculas de adesão, tais como a molécula de adesão intercelular (ICAM) ou a molécula de adesão dos leucócitos endoteliais (ELAM) sobre as células endoteliais [ver Munro e outros Am. J. Path. 135(1): 121-132 (1989)].

Os compostos da fórmula (I) também podem ser usados topicamente no tratamento ou na profilaxia de estados de doença tópicos mediados ou exacerbados pela produção excessiva de TNF, respectivamente, como as infecções virais causadas pelos vírus do herpes ou a conj untivite virai, etc..

Em resumo, o tratamento de doenças mediadas pelo TNF inclui mas não se limita a doenças como a artrite reumatoide, a espondilite reumatoide, a osteoartrite, a artrite gotosa, e outras condições artríticas; a sépsis, o choque séptico, o choque endotóxico, a sépsis por gram-negativos, o síndrome de choque tóxico, o síndrome da dificuldade respiratória do adulto, a malária cerebral, doenças inflamatórias pulmonares crónicas, a silicose, a sarcoidose pulmonar, as doenças de ressorção óssea, as lesões de reperfusão, a reacção enxerto-hospedeiro, a rejeição aguda de enxertos, as rejeições a aloenxertos, febre e mialgias devidas a infecções como a gripe, a caquexia secundária a infecção ou malignidade, caquexia secundária ao síndrome da imunodeficiência adquirida (SIDA), SIDA-ARC (complexo relacionado com a SIDA), formação de queloides, formação de tecido de cicatriz, doença de Crohn, colite ulcerosa, piresis e

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infecções virais.

Todos os compostos da fórmula (I) são úteis no processo de acordo com o presente invento, isto é, processos para inibir a produção de TNF, de preferência por macrófagos, monócitos ou macrófagos e monócitos num mamífero, especificamente num ser humano, que necessite deste tratamento. O processo do invento é de preferência usado para tratar, profilática ou terapeuticamente, estados de doença mediados pelo TNF e que não são mediados pelo enzima fosfodiesterase (PDEIV). De preferência, o processo deste invento é usado em doenças não associadas com números aumentados de eosinófilos como os estados de doença da pele proliferante, isto é, a psoríase, a dermatite atópica, a dermatite não específica, a dermatite de contacto irritante primária, a dermatite de contacto alérgica, ou perturbações alérgicas tais como a atopia, urticária, eczema, rinite, dermatite seborreica e a sarna nos animais domésticos, tal como foi descrito por Maschler e outros no Pedido de Patente Britânica n^a. 8 906 792.0, depositado em 23 de Março de 1989 cuja descrição completa é aqui incorporada como referência. Os compostos da fórmula (I) podem, porém, ser administrados concorrentemente com outros agentes úteis para o tratamento de doenças associadas com a inibição ou a mediação de PDE IV ou associadas com um número aumentado de eosinófilos, com a degenerescência neuronal resultante de eventos isquémicos cerebrais, como cirurgia ou ataque, ou com as doenças associadas com a actividade broncodilatadora como a obstrução reversível das vias respiratórias ou a asma.

Além disso, o presente invento considera muitos dos estados de doença biológicos atribuíveis à actividade da interleucina-1 (IL-1) como sendo igualmente atribuíveis à actividade do TNF. Uma listagem compreensiva das actividades da IL-1 pode ser encontrada em Dinarello, J. Clinicai Immunolocrv, 5(5), 287-297 (1985). Deve notar-se que alguns destes efeitos foram descritos por outros como efeitos indirectos da IL-1.

Tem-se demonstrado que a interleucina-1 (IL-1) medeia uma

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14548-1 —21— variedade de actividades biológicas que se pensa serem importantes na regulação imunológica e em outras condições fisiológicas como a inflamação [ver, por exemplo, Dinarello e outros, Rev. Infect. Disease, 6_, 51 (1984)]. As inúmeras actividades biológicas conhecidas da IL-1 incluem a activação das células auxiliares T, a indução de febre, a estimulação da produção de prostaglandina ou colagenase, quimiotaxia de neutrófilos, indução de proteínas em fase aguda, e a supressão dos níveis de ferro no plasma. Estes estados de doença são também considerados estados de doença atribuídos à actividade do TNF e, portanto, os compostos da fórmula (I) são também igualmente úteis no seu tratamento e a utilização dos compostos da fórmula (I) não deve ser considerada limitada unicamente aos estados de doença mediados pelo TNF aqui especificamente descritos. Os compostos do presente invento são, portanto, eficazes no tratamento de um estado de doença mediado pela IL-1 visto que o TNF e a IL-1 actuam de uma maneira sinérgica. 0 TNF também medeia a libertação, nalguns casos, da monoquina IL-1 e, portanto, a redução dos níveis de TNF pode ser útil no tratamento de um estado de doença em que a IL-1 seja um componente principal .

presente invento, também se refere portanto a uma quantidade eficaz, inibidora da produção de TNF, de um composto de fórmula (I) ou de um seu sal farmaceuticamente aceitável, útil para tratar, profilática ou terapeuticamente, qualquer estado de doença num ser humano, que seja exarcebado ou causado pela produção excessiva ou não regulada de IL-1, por monócitos e/ou macrófagos humanos, isto é, quando IL-1 é um componente principal.

O processo para tratar e monitorizar um ser humano infectado com HIV que manifeste uma disfunção imunológica ou problemas associados a doenças mediadas pela citoquina é ensinado por Hanna, WO 90/15534, 27 de Dezembro de 1990. Em geral, pode ser copiado um regime de tratamento inicial que se sabe ser eficaz para interferir na actividade do TNF noutros estados de doença mediados pelo TNF, com os compostos da fórmula (I). Os

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14548-1 —22— indivíduos tratados serão examinados regularmente quanto ao número de células T e razões T4/T8 e/ou medições de viremia tais como os níveis de transcriptase inversa ou proteínas virais, e/ou quanto à progressão de problemas associados com a doença mediada pela monoquina como a caquexia ou a degenerescência muscular. Se não forem observados efeitos após o regime normal de tratamento, então aumenta-se a quantidade do agente administrado que interfere com a aetividade da monoquina, por exemplo, em cinquenta por cento por semana.

Num ser humano infectado com HIV manifestando problemas associados com a doença mediada pela monoquina como a caquexia, o tratamento com uma quantidade eficaz de um agente que interfere na aetividade da monoquina resultará inicialmente num abrandamento da velocidade de progressão do problema associado à doença, abrandando portanto a progressão da doença. Espera-se que a progressão do problema associado à doença eventualmente cesse e se inverta, melhorando assim a qualidade de vida do indivíduo infectado com HIV tratado desta maneira. Os compostos de fórmula (I) são úteis no processo de tratamento de todos os estados de doença associados à infecção com HIV, tais como as anormalidades imunológicas, a disfunção imunológica, o complexo relacionado com a SIDA (ARC) e que é denominado como o próprio síndrome da imunodeficiência adquirida (SIDA). Os compostos de fórmula (I) também serão úteis para reduzir ou eliminar a inflamação relacionada com o dano/patologia causado por uma infecção oportunista (secundária), tais como mas não se limitando à pneumonia pneumocística ou infecções com citomegalovírus.

Será reconhecido por um perito na arte que a quantidade real de um agente que interfere na aetividade da monoquina, necessária para obter efeito terapêutico variará, evidentemente, com o agente escolhido, a via de administração desejada, a natureza e a gravidade da infecção com HIV e com a condição particular do ser humano infectado com HIV submetido ao tratamento e, em última análise, fica à descrição do médico. Também será reconhecido por um perito na arte que a quantidade

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14548-1 —23—

óptima e os intervalos entre as dosagens individuais de um agente que interfere com a actividade da monoquina serão determinados pela natureza e extensão da condição em tratamento, pela forma, via e local da administração e pelo paciente em particular a tratar, e que estes óptimos podem ser determinados por técnicas convencionais. Também será apreciado por um perito na arte que o curso óptimo do tratamento, isto é, o número diário de doses do agente que interfere na actividade da monoquina e do TNF para um número definido de dias, pode ser determinado pelos peritos na arte usando testes de determinação do curso do tratamento convencionais.

Os compostos da fórmula (I) podem ser administrados oralmente (quando activos por esta via) topicamente, parentericamente ou por inalação em formas de dosagem convencionais preparadas combinando este agente com transportadores farmacêuticos normais, segundo procedimentos convencionais, numa quantidade suficiente para produzir actividade terapêutica que interfira com a actividade do TNF.

transportador farmacêutico empregue pode ser prontamente determinado por um perito na arte que reconheça que esta determinação depende de vários factores bem conhecidos, tais como a natureza, a quantidade e o carácter do agente particular que interfere com a actividade da monoquina a ser empregue e a forma e a via de administração desejadas. Os transportadores empregues podem ser os aqui descritos, noutro local.

Para usar um composto da fórmula (I) ou um seu sal farmaceuticamente aceitável no tratamento de seres humanos ou de outros mamíferos, ele é normalmente formulado de acordo com a prática farmacêutica normal como uma composição farmacêutica.

A composição farmacêutica do presente invento compreenderá uma quantidade eficaz, não tóxica, de um composto de fórmula (I) e um transportador ou diluente farmaceuticamente aceitável. Os compostos de fórmula (I) são administrados em formas convencionais de dosagem combinando um composto da fórmula (I)

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numa quantidade suficiente para produzir actividade inibidora da produção de TNF, respectivamente, com transportadores farmacêuticos normais segundo procedimentos convencionais. Estes procedimentos podem incluir mistura, granulação e compressão ou dissolução dos ingredientes conforme for apropriado para a preparação desejada.

transportador farmacêutico empregue pode ser, por exemplo, um sólido ou um líquido. São exemplos de suportes sólidos a lactose, a terra alba, a sacarose, o talco, a gelatina, o ágar, a pectina, a acácia, o estearato de magnésio, o ácido esteárico e análogos. São exemplos de transportadores líquidos o xarope, o óleo de amendoim, o azeite, o polietilenoglicol, o óleo de coco, a água e análogos. Analogamente, o transportador ou diluente pode incluir material retardador bem conhecido na arte, como o monoestearato de glicerilo ou o diestearato de glicerilo, isolado ou com uma cera.

Os compostos da fórmula (I) e os seus sais farmaceuticamente aceitáveis podem ser empregues numa grande variedade de formas farmacêuticas. A preparação de um sal farmaceuticamente aceitável será determinada pela natureza do próprio composto, e pode ser realizada por técnicas convencionais facilmente acessíveis a um perito na arte. Assim, se é utilizado um transportador sólido, a preparação pode ser comprimida, colocada em pó numa cápsula de gelatina dura ou na forma de pelota ou na forma de pastilhas ou trociscos. A quantidade de transportador sólido pode variar largamente mas, de preferência, será de cerca de 25 mg a cerca de 1 g. Quando é usado um transportador líquido, a preparação pode estar na forma de xarope, emulsão, cápsula de gelatina mole, líquido injectável estéril tal como uma ampola ou uma suspensão líquida não aquosa. Quando a composição está na forma de uma cápsula, qualquer forma rotineira de fazer as cápsulas é apropriada, por exemplo, usando os supramencionados transportadores numa cápsula de gelatina dura. Quando a composição está na forma de uma cápsula de gelatina mole qualquer transportador farmacêutico usado rotineiramente para preparar dispersões ou suspensões pode ser

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-25considerado, por exemplo, gomas aquosas óleos e são incorporados numa cápsula de gelatina mole. Uma formulação em xarope consistirá geralmente numa suspensão ou solução do composto ou sal num transportador líquido, por exemplo, etanol, polietilenoglicol, óleo de coco, glicerina ou água com um agente saborizante ou corante.

A quantidade de um composto da fórmula (I) necessária para um efeito terapêutico em aplicação tópica variará, evidentemente, com o composto escolhido, natureza e gravidade da condição inflamatória, e com o animal sujeito ao tratamento e, em última análise, com o critério do médico.

termo parentérico tal como aqui é usado inclui a administração intravenosa, intramuscular, subcutânea, intranasal, intra-rectal, intravaginal ou intraperitoneal. As formas subcutânea e intramuscular de administração parentérica são geralmente preferidas. As formas apropriadas de dosagem para esta administração podem ser preparadas por técnicas convencionais.

Composições parentéricas típicas são constituídas por uma solução ou suspensão do composto ou sal num transportador estéril aquoso ou não aquoso contendo opcionalmente um óleo parentericamente aceitável, por exemplo, polietilenoglicol, polivinilpirrolidona, lecitina, óleo de amendoim ou óleo de sésamo. 0 regime de dosagem diária para inibição da produção de TNF, por via de administração parentérica é adequadamente de cerca de 0,001 mg/kg a 40 mg/kg, de preferência de 0,01 mg/kg a 20 mg/kg de um composto da fórmula (I) ou de um seu sal farmaceuticamente aceitável,calculado na forma da base livre.

Os compostos de fórmula (I) podem ser administrados oralmente. 0 regime de dosagem diária para administração oral é adequadamente de cerca de 0,1 mg/kg a 1000 mg por dia. Para administração a dosagem é adequadamente de cerca de 0,001 mg/kg a 40 mg/kg, de preferência de cerca de 0,01 mg a 20 mg/kg de um composto de fórmula (I) ou de um seu sal farmaceuticamente

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aceitável, calculada na forma da base livre. 0 ingrediente activo pode ser administrado de 1 a 6 vezes por dia, o suficiente para exibir actividade.

Os compostos da fórmula (I) também podem ser admi níst.-rg.dos por inalação. Por inalação¹¹ entende-se administração por inalação intranasal ou oral. As formas apropriadas de dosagem para esta administração, como a formulação em aerossol ou em inalador de dose medida, podem ser preparadas por técnicas convencionais. 0 regime de dosagem diária para administração por inalação vai adequadamente de cerca de 0,001 mg/kg a 40 mg/kg, de preferência de 0,01 a 20 mg/kg de um composto da fórmula (I) ou de um seu sal farmaceuticamente aceitável, calculado na forma da base livre.

As composições típicas para inalação estão na forma de solução, suspensão ou emulsão que podem ser administradas como um pó seco ou na forma de um aerossol empregando um propulsor convencional como o diclorodifluorometano ou o triclorofluorometano.

De preferência, a composição é apresentada em forma de dosagem unitária, por exemplo, comprimido, cápsula ou dose medida de aerossol de modo que o doente possa administrar a si próprio uma dose única.

Os compostos de fórmula (I) também podem ser administrados topicamente. Por administração tópica entende-se a administração não sistémica e inclui a aplicação de um composto de fórmula (I) externamente na epiderme, na cavidade bucal e a instilação deste composto dentro do ouvido, olho e nariz e onde o composto não penetre significativamente na corrente sanguínea. Portanto, os compostos de fórmula (I) podem ser administrados topicamente para tratamento ou profilaxia de estados de doença tópicos inflamatórios mediados ou exacerbados respectivamente pela produção excessiva de TNF, como eczema, psoríase ou outras condições inflamatórias da pele, como queimaduras solares; as condições inflamatórias do olho incluindo a conjuntivite;

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14548-1 piresis, dor e outras condições associadas à inflamação, herpes ou outras infecções virais tópicas. O regime diário de dosagem para a administração tópica vai adequadamente de cerca de 0,001 mg/kg a 100 mg/kg, de preferência de 0,1 a 20 mg/kg de um composto de fórmula (I) ou de um seu sal farmaceuticamente aceitável, calculado na forma da base livre.

Por administração sistémica entende-se a administração oral, intravenosa, intraperitoneal e intramuscular.

Por administração tópica entende-se a administração não sistémica e inclui a aplicação de um composto da fórmula (I) externamente na epiderme e na cavidade bucal e a instilação de tais compostos dentro do ouvido, do olho e do nariz e onde o composto não penetre significativamente na corrente sanguínea.

Embora seja possível que o ingrediente activo seja administrado isolado na forma do produto químico bruto, é preferível apresentá-lo na forma de uma formulação farmacêutica. O ingrediente activo pode compreender, para administração tópica, de 0,001% a 10% p/p, por exemplo, de 1% a 2% em peso da formulação, embora possa compreender até 10% p/p mas, de preferência, não mais de 5% p/p e com maior preferência, de 0,1% a 1% p/p da formulação.

As formulações tópicas do presente invento compreendem um ingrediente activo juntamente com um ou mais transportadores aceitáveis e, opcionalmente, quaisquer outros ingredientes terapêuticos. Os transportadores devem ser aceitáveis” no sentido de serem compatíveis com os outros ingredientes da formulação e não serem prejudiciais para o seu receptor.

As formulações apropriadas para administração tópica incluem preparações líquidas ou semi-líquidas adequadas para a penetração através da pele no local da inflamação tais como linimentos, loções, cremes, unguentos ou pastas e gotas adequadas para administração ao olho, ouvido ou nariz.

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As gotas de acordo com o presente invento podem compreender soluções ou suspensões estéreis aquosas ou oleosas e podem ser preparadas dissolvendo o ingrediente activo numa solução aquosa adequada de um agente bactericida e/ou fungicida e/ou qualquer outro conservante adequado e, de preferência, que inclua um agente tensioactivo. A solução resultante pode ser depois clarificada por filtração e transferida para um recipiente adequado que depois é selado e esterilizado em autoclave ou man tendo-o a 98-100°C durante meia hora. Em alternativa, a solução pode ser esterilizada por filtração e transferida para o recipiente por meio de uma técnica asséptica. Exemplos de agentes bactericidas e fungicidas adequados para serem incluídos nas gotas são o nitrato ou acetato fenilmercúrico (0,002%) o cloreto de benzalcónio (0,01%) e o acetato de cloro-hexidina (0,01%). Os solventes adequados para a preparação de uma solução oleosa incluem glicerol, álcool diluído e propilenoglicol.

As loções de acordo com o presente invento incluem as adequadas para aplicação na pele ou no olho. Uma loção oftálmica pode compreender uma solução aquosa estéril contendo opcionalmente um bactericida e pode ser preparada por processos semelhantes aos da preparação das gotas. As loções ou linimentos para aplicação na pele podem incluir também um agente para acelerar a secagem e arrefecer a pele, como um álcool ou a acetona e/ou um humidificador como o glicerol ou um óleo como o óleo de rícino ou o óleo de amendoim.

Os cremes, unguentos ou pastas de acordo com o presente invento são formulações semi-sólidas do ingrediente activo para aplicação externa. Podem ser preparados misturando o ingrediente activo numa forma finamente dividida ou pulverizado, isolado ou em solução ou suspensão com um fluido aquoso ou não aquoso, com o auxílio de maquinaria adequada com uma base gordurosa ou não gordurosa. A base pode compreender hidrocarbonetos como a parafina dura, mole ou líquida, glicerol, cera virgem, um sabão metálico; uma mucilagem; um óleo de origem natural como o óleo de amêndoa, rícino, milho, amendoim, ou azeite; gordura de lã ou os seus derivados, ou um ácido gordo como os ácidos esteárico ou

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14548-1 oleico, juntamente com um álcool como o propilenoglicol ou macrogois. A fórmula pode incorporar qualquer agente tensioactivo adequado como tensioactivos aniónicos, catiónicos e não iónicos como os ésteres de sorbitano ou os seus derivados de polioxietileno. Agentes de suspensão como as gomas naturais, os derivados de celulose ou materiais inorgânicos como as sílicas siliciosas e outros ingredientes como a lanolina, também podem ser incluídos.

Um perito na arte reconhecerá que a forma e as características do transportador ou diluente farmaceuticamente aceitável são ditadas pela quantidade de ingrediente activo, pelo composto de fórmula (I), com o qual vai ser combinado, pela via de administração e por outras variáveis bem conhecidas.

Um perito na arte reconhecerá que a quantidade óptima e os intervalos entre as dosagens individuais de um composto de fórmula (I) ou de um seu sal farmaceuticamente aceitável serão determinados pela natureza e extensão da condição a ser tratada, pela forma, via e local de administração, e pelo doente particular a ser tratado, e que estes óptimos podem ser determinados por técnicas convencionais. Deve ser também apreciado por um perito na arte que o curso óptimo do tratamento, isto é, o número de doses de um composto de fórmula (I) ou de um seu sal farmaceuticamente aceitável, dado por dia durante um determinado número de dias, pode ser definido pelos peritos na arte usando os ensaios convencionais de determinação do curso do tratamento.

EXEMPLOS DE FORMULAÇÃO

As formulações para uso farmacêutico que contêm compostos do presente invento podem ser preparadas em várias formas e com numerosos excipientes. Exemplos de formulações líquidas são dados a seguir.

1. Uma solução que contém um composto de fórmula (I) é preparada dissolvendo o composto em água, ou noutro transportador adequado, com ou sem um conservante como o ácido benzóico, para

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14548-1 —30— libertar a desejada quantidade de droga por utilização. 0 composto está presente numa quantidade de cerca de 10 yg até cerca 30 pg por ml de transportador.

2. Uma solução que contém um composto de fórmula (I) é preparada dissolvendo o composto numa quantidade de cerca de 1 até cerca de 10 mg por ml de PEG 400 com ou sem conservantes BHA/BHT. A solução pode, em alternativa, encher uma cápsula de gelatina mole para preparar uma forma sólida de dosagem oral ou ser usada na forma de um xarope.

3. Uma forma sólida de dosagem que contém um composto de fórmula (I), como a l,3-diciclopropilmetil-8-amino xantina, foi preparada misturando 50 mg do composto com várias concentrações (mg) de manitol, hidroxipropilmetilcelulose, calipharm^{3 * * * * * * * 11}. amido

1500 e estearato de magnésio (como lubrificante) para encher cápsulas com um tamanho apropriado ou, caso se queira, a composição pode ser comprimida em comprimidos. Estão apresentadas várias formulações dos ingredientes na tabela 1, numeradas de 1 a 6.

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-31TABELA. 1

N^s Composto Manitol Explotab* H.P.M.C.* MG CLPVP* Lactose Calipharm Amido PEG 6000 Peso da

	(I)	(mg)	(mg)	(mg)	estearato (mg)	(mg)	(mg)	(mg) (mg) (mg)	Dose (mg)
1	50,0	78,0	8,0	12,5	1,5				150
2	50,0	78,0		12,5	1,5	8,0			150
3	50,0		8,0	12,5	1,5		78,0		150
4	50,0		8,0	12,5	1,5			78,0	250

50,0 180,0 230

50,0 300,0 350 *

EXPLOTAB - amidoglicolato de sódio

HPMC - hidroxipropilmetilcelulose *

CLPVP - polivinilpirrolidona reticulada *

CALIPHARM - difosfato de cálcio moído

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-32EXEMPLOS DE UTILIDADE

Exemplo A

Efeito Inibitório de Compostos de Fórmula (I) sobre a Produção in vitro do TNF por Monócitos Humanos

Secção I: Programação do Ensaio

Os efeitos dos compostos de fórmula (I) sobre a produção in vitro do TNF por monócitos humanos foi examinada usando o protocolo seguinte.

Monócitos de sangue periférico humano foram isolados e purificados dos resíduos acastanhados de banco de sangue (blood bank buffy coats) ou dos resíduos de plaquetaferese segundo o procedimento de R. Colotta e outros, J. Immunol.. 132(2): 936 (1984). Os monócitos foram plaqueados com uma densidade de 1 x 10⁶ células/ml de meio/poço em multi-placas de 24 poços. Deixaram-se as células aderir durante 1 hora e, após este tempo, o sobrenadante foi aspirado e adicionou-se 1 ml de meio fresco (RPMI-1640) (Whitaker Biomedical Products, Whitaker, CA) que contém 1% de soro de vitela fetal e penicilina e estreptomicina a 10 unidades/ml. As células foram incubadas durante 45 minutos na presença ou ausência dos compostos de teste com gamas de doses de 1 nM a 10 μΜ (os compostos foram solubilizados em dimetilsulfóxido/etanol de modo que a concentração final de solvente no meio de cultura era de 0,5% de dimetilsulfóxido/0,5% de etanol). Foi depois adicionado lipopolissacárido bacteriano (E. coli 0 55:B5 [LPS] da Sigma Chemicals Co.) a 100 ng/ml em 10 ml de solução salina tamponada com fosfato (PBS) e as culturas foram incubadas durante 16-18 horas a 37°C num incubador de C0₂ a 5%. Finalizado o período de incubação, os sobrenadantes da cultura foram removidos das células, centrifugados a 3000 rotações por minuto (rpm) para remover os restos das células e 0,05 ml do sobrenadante foram ensaiados quanto à actividade do TNF utilizando o radioimunoensaio a seguir descrito.

Secção II: Procedimento para o radioímunoensaio quanto à actividade do TNF tampão de ensaio consiste em NaP0₄ 0,01 M, NaCl 0,15 M,

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—33—

EDTA 0,025 M e azida de sódio 0,1% a pH 7,4. O TNF recombinante humano (rhTNF) obtido usando o procedimento de Chen e outros, Nature. 330:581-583 (1987) foi iodado por meio de um método modificado da Cloramina-T descrito na Secção III seguinte. A amostra (50 μΐ de sobrenadantes da cultura) ou a padrões de rhTNF adicionou-se uma diluição de 1/9000 de anti-rhTNF policlonal de coelho (Genzyme, Boston, MA) e 8000 cpm de ¹²⁵I-TNF num volume final de 400 μΐ de tampão e incubou-se durante a noite (18 horas) a 4°C. Soro de coelho normal e IgG de cabra anti-coelho (Calbiochem) foram titulados um contra o outro quanto à precipitação máxima de anti-rhTNF. Deixaram-se precipitar as diluições apropriadas de soro de coelho normal de transporte (1/200), IgG de cabra anti-coelho (1/4) e 25 Unidades de heparina (Calbiochem) e adicionou-se 200 μΐ deste complexo por tubo de ensaio e incubou-se durante a noite a 4°C. Os tubos foram centrifugados a 2000 rpm durante 30 minutos, os sobrenadantes foram cuidadosamente aspirados e a radioactividade associada às pelotas foi medida num contador Beckman Gamma 5000. A curva de transformação linear logit-log foi utilizada para os cálculos. As concentrações de TNF nas amostras foram lidas a partir da curva padrão do rhTNF que era linear na gama de 157 a 20 000 pg/ml.

Secção III: Radio-iodacão do rhTNF

A iodação do rhTNF foi realizada usando um método da cloramina-T modificado de Frolik e outros, J. Biol. Chem.. 259:10995-11000 (1984). Em resumo, 5 mg de rhTNF em 5 ml de Tris 20 MM a pH 7,5, foram diluídos com 15 ml de KPO₄ 0,5 Me 10 ml de ¹²⁵I (100 mCi/ml; ICN) isento de transportador. Para iniciar a reacção juntou-se uma parte alíquota de 5 ml de uma solução aquosa de cloramina-T a 100 mg/ml. Após 2 minutos à temperatura ambiente juntou-se uma parte alíquota adicional de 5 ml seguida,

1,5 minutos depois, por uma adição final de 5 ml de cloramina-T. A reacção foi interrompida 1 minuto depois por adição sequencial de 20 ml de metabissulfito de sódio 50 mM, 100 ml de iodeto de potássio 120 mM e 200 ml de ureia a 1,2 mg/ml. Os conteúdos foram misturados e a mistura reaccional foi passada por uma coluna pré-empacotada com Sephadex G-25 (PD 10 Pharmacia),

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14548-1 equilibrada e eluída com solução salina tamponada com fosfato a pH 7,4 contendo 0,25% de gelatina. As fracções que continham picos de radioactividade foram reunidas e armazenadas a -20°C. A actividade específica do ¹²⁵I-TNF era de 80-100 mCi/mg de proteína. A actividade biológica do TNF iodado foi medida por meio do ensaio de citotoxicidade L929 de M.L. Neal e outros, Eur. J. Can. Clin. Oncol. 25(1):133-137 (1989) e verificou-se ser de 80% da do TNF não marcado.

Seccão IV: Medida de TNF-ELISA

Os níveis de TNF foram também medidos usando uma modificação do método de ensaio ELISA sanduíche básico descrito por Winston e outros, Current Protocols in Molecular Bioloqy. página 11.2.1, Ed. Ausubel e outros, Ed. (1987) John Wiley and Sons, Nova Iorque, E.U.A.. No ELISA empregou-se um anticorpo monoclonal de murino anti-TNF humano, abaixo descrito, como o anticorpo captor e um anticorpo policlonal de coelho anti-TNF humano, abaixo descrito, como o segundo anticorpo. Para a detecção adicionou-se um anticorpo de cabra anti-coelho conjugado com peroxidase (Boehringer Mannheim, Indianapolis, Indiana, E.U.A., n². de catálogo 605222) seguido de um substrato para a peroxidase (1 mg/ml de orto-fenilenodiamina com peróxido de ureia a 0,1%). Os níveis de TNF nas amostras foram calculados a partir de uma curva padrão gerada com TNF humano recombinante produzido em E. coli (obtido na SmithKline Beecham Pharmaceuticals, King of Prussia, PA, EUA).

Seccão V: Produção de anticorpos anti-TNF humano

Os anticorpos monoclonais para o TNF humano foram preparados a partir de baços de ratinhos BALB/c imunizados com TNF humano recombinante empregando uma modificação do método de Kohler e Millstein, Nature 256: 495 (1975) cuja descrição completa é aqui incorporada como referência. Os anticorpos policlonais de coelho anti-TNF humano foram preparados por imunização repetida de coelhos brancos da Nova Zelândia (NZW) com TNF humano recombinante emulsionado em adjuvante de Freund completo (DIFCO, IL., E.U.A.).

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Resultados

Determinou-se que a l,3-di-ciclopropilmetil-8-amino xantina mostrava um IC₅₀ de cerca de 0,05 μΜ no sistema de ensaio de produção do TNF in vitro.

EXEMPLO DE UTILIDADE B

Choque de Endotoxina em Ratinhos Sensibilizados com D-gal protocolo utilizado para testar o composto do processo do presente invento era essencialmente como foi descrito por Galanos e outros Proc. Nat'l. Acad. SCI USA. 76: 5939-43 (1979), descrição esta que é aqui incorporada como referência. Em resumo, a D-gal (D(+) Galoctosidase) sensibiliza várias estirpes de ratinhos aos efeitos letais da endotoxina. A administração de D-gal (300-500 mg/kg) por via intravenosa (i.v.) sensibiliza o ratinho a doses de lipopolissacárido (LPS) tão baixas como 0,1 μg. Em resumo, ratinhos machos C57BL/6, obtidos nos Charles Ri ver Laboratories (Stone Ridge, Nova Iorque, EUA) com 6-12 semanas de idade foram injectados i.v. com 0,1 μg de LPS proveniente da Salmonella typhosa (Difco Laboratories, Detroit, Michigan, EUA) misturado com D(+)-gal (Sigma; 500 mg/kg) em 0,20-0,25 ml de solução salina isenta de pirogénios. Os compostos a testar foram administrados a vários tempos antes ou depois da injecção i.v. de LPS/D-gal. Neste modelo, os animais de controlo morriam habitualmente 5 a 6 horas depois da injecção de LPS embora, ocasionalmente, as mortes ocorressem depois de 24 e 48 horas.

Medida da Actividade do TNF

Os níveis de TNF no plasma foram medidos utilizando uma modificação do método ELISA sanduíche básico descrito por Winston e outros, Current Protocols in Molecular Bioloqy, Pag.

11.2.1, Ausubel e outros, Ed. (1987) John Wiley and Sons, Nova Iorque, E.U.A.). No ELISA empregou-se um anti-corpo monoclonal de criceto anti-TNF de ratinhos (Genzyma, Boston, MA, EUA) como anticorpo captor e um anticorpo policlonal de coelho anti-TNF de murínos (Genzyma, Boston, MA, EUA) como anticorpo detector. Os níveis de TNF nas amostras de ratinhos foram calculados a partir de uma curva-padrão gerada com TNF recombinante de

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14548-1 murinos (Genzyma, Boston, MA, EUA). Os níveis de TNF determinados por meio do ELISA relacionavam-se com os níveis detectados pelo bioensaio L929 de Ruff e outros, J. Immunol. 125:1671-1677 (1980) com 1 Unidade de actividade no bioensaio a corresponder a 70 picogramas (pg) de TNF no ELISA. Os níveis de TNF detectados no ELISA diminuem até 25 pg/ml.

Resultados:

Determinou-se que a l,3-di-ciclopropilmetil-8-amino xantina também apresentava uma resposta positiva in vivo no modelo de utilidade acima referido, tendo uma ED₅₀ para a redução do TNF do soro de cerca de 0,1 mg/kg, intraperitonealmente. 0 composto mostra uma sobrevivência de 100% dos animais com esta dose.

EXEMPLO DE UTILIDADE C

Ensaio de monócitos com HIV in vitro

Os efeitos dos compostos de fórmula (1) sobre a inibição da produção de HIV in vitro por células cronicamente infectadas são examinados usando o protocolo seguinte:

Isolamento das linhas de células infectadas com HIV

Linhas de células clonais infectadas com HIV foram obtidas infectando uma cultura da linha H9 de células T com a estirpe HTLVjujj do vírus da imunodeficiência humana (HIV_IIIB) e cultivando as células 5 semanas durante as quais se desenvolveu uma linha de células cronicamente infectadas. Foram derivados clones desta cultura limitando a diluição em placa numa mistura a 1:1 de RPMI 1640+ soro fetal bovino a 15% e meio condicionado de células H9. Os clones foram expandidos até aproximadamente 4x10⁷ células, partes aliquotas foram congeladas e as culturas subsequentes foram ensaiadas quanto à sua produção de HIV com e sem estimulação por TNF ou outras citoquinas recombinantes como abaixo se descreve.

Indução do HIV

A indução do HIV foi ensaiada cultivando linhas de células clonais infectadas com HIV durante quatro dias na presença do material a ser testado quanto à actividade indutora. Para

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14548-1 —37— medição da inibição da indução do HIV, monócitos humanos cultivados foram estimulados para produzir citoquinas por meio de tratamento com lipopolissacárido (LPS) na presença ou na ausência dos compostos de teste durante 18 horas. No fim da estimulação, o meio sobrenadante das culturas de monócitos foi recolhido, congelado em partes alíquotas a -80°C e as concentrações de TNF, ILl-jS e IL-6 foram determinadas numa parte aliquota por meio do ELISA. Os sobrenadantes dos monócitos foram então diluídos em meio de crescimento completo RPMI para dar uma concentração de TNF optimamente indutora no caso da amostra de monócito de controlo positivo (estimulada com LPS). A indução óptima foi conseguida entre 10 e 100 unidades de TNF/ml (0,5 a 5,0 ng/ml) dependendo da linha de células indicadora. Os sobrenadantes de culturas de monócitos tratadas experimentalmente foram diluídos pelo mesmo factor que foi usado para o controlo positivo em cada experiência.

Passado o quarto dia da experiência, o fluido sobrenadante de cultura (90 μΐ) foi removido da linha de células infectadas com HIV e adicionado a 5% (v/v) de Triton-X-100 (10 μΐ; Sigma Chemical Company) para libertar a transcriptase inversa das partículas de HIV e inactivar o vírus. Foram avaliadas oito culturas para cada tratamento em duas ou mais experiências. As amostras foram armazenadas a -80°C até serem ensaiadas quanto à actividade da transcriptase inversa.

Ensaio da transcriptase inversa

A transcriptase inversa do HIV foi ensaiada por meio de uma versão modificada do ensaio de microtitulação de Goff e outros (J. Virol. 38:239-248, 1981). A incorporação de ³²P-dTTP em polinucleótido sobre um oligo-A:padrão poli-dT:iniciador foi medida por meio de filtração dos produtos de reacção numa membrana filtrante NA45 (Schleicher e Scheull) num aparelho de transferência de pontos (dot-blot) e por auto-radiografia ou quantificação AMBIS, ou por ambas. Foram realizados ensaios de transcriptase inversa duplicados com todas as amostras.

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-38Métodos estatísticos

O significado estatístico dos resultados foi calculado usando as funções COMPARE da unidade de software RS/Explore.

RESULTADOS;

A maioria das linhas de células clonais infectadas com HIV expressam níveis aumentados de HIV em resposta ao TNF no meio de cultura. Dez linhas de células clonais H9 foram cultivadas em quadruplicado durante quatro dias com ou sem 5 ng de rTNF/ml de RPMI 1640+fbs a 10%. No fim da experiência, a transcriptase inversa no meio de cultura foi medida para determinar o nível de produção de HIV em cada cultura. Oito em cada dez linhas de células testadas produziam níveis aumentados de HIV quando cultivadas na presença de TNF. Um clone particular, a linha de células 3.7, respondeu ao TNF de uma maneira típica, conhecida dos peritos na arte. A linha de células 3.7 foi escolhida e usada para avaliar a indução em resposta aos sobrenadantes de monócitos.

As células clonais infectadas com HIV expressam níveis aumentados de HIV em resposta não só ao TNF mas também ao fluido sobrenadante de monócitos humanos cultivados estimulados com LPS, mas sem controlo. A linha de células 3.7 foi cultivada durante quatro dias num meio suplementado com TNF-α recombinante a 5 ng/ml, fluido proveniente dos monócitos humanos cultivados, ou fluido proveniente de monócitos humanos cultivados que foram estimulados com LPS, e os níveis de HIV produzidos foram medidos quatro dias depois determinando os níveis de transcriptase inversa no fluido sobrenadante.

A linha de células 3.7 foi escolhida porque induzia reprodutivamente o HIV em resposta ao TNF recombinante. Os resultados aqui foram também obtidos com as linhas de células 4, 7, 3, U-l e ACH-2. As linhas de células disponíveis no mercado também são úteis neste ensaio.

Os sobrenadantes provenientes de monócitos humanos cultivados estimulados com LPS na presença de inibidores da síntese do

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-39TNF têm uma reduzida actividade activadora do HIV quando comparados com os sobrenadantes provenientes de monócitos estimulados com LPS na ausência de inibidores. A linha de células clonais

3.7 infectada com HIV foi cultivada durante 4 dias num meio suplementado com sobrenadantes provenientes de monócitos humanos de controlo, monócitos humanos estimulados com LPS e monócitos humanos estimulados com LPS na presença de 10 μΜ de um composto de fórmula (I), a 1,3-di-ciclopropilmetil-8-amino xantina.

Este ensaio demonstra que os compostos da fórmula (I), como inibidores do TNF, inibem a indução do HIV pelos sobrenadantes de monócitos estimulados com LPS se presentes durante a estimulação com LPS. Em particular, a l,3-di-ciclopropilmetil-8-amino xantina mostrava uma inibição do HIV de (% +/-Erro)+/-(75-5)* a uma concentração de 10 μΜ.

A percentagem de inibição entre parêntesis provém de uma experiência representativa. A inibição real em qualquer experiência pode variar dependendo do dador dos monócitos, a curva de resposta à dose da linha de células T infectadas com HIV e a diluição do sobrenadante dos monócitos.

EXEMPLO DE UTILIDADE D

Inibição in vivo do vírus da crripe induzido pelo TNF

Os efeitos dos compostos de fórmula (I), sobre vírus, induzidos pela produção do TNF in vivo foram examinados usando o protocolo seguinte.

Ratinhos:

Ratinhos fêmeas, de idades equiparadas e isentos de factores patogénicos específicos (Balb/c x C57B/6)F, (CBõFj) foram comprados nos Charles Ri ver Laboratories. Os ratinhos tinham, à chegada, 4 a 10 semanas de idade. Os ratinhos usados para as determinações da LD₅₀ tinham entre 8 e 14 semanas de idade.

Produção do Vírus:

A estirpe do vírus da gripe tipo A, A/PR/8/34 (sub-tipo H1N1) foi propagada na cavidade alantoíde de ovos fertilizados

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de 10 dias de idade. Depois de incubados os ovos durante 48 horas, foram arrefecidos durante pelo menos duas horas e meia antes de se colher o fluido alantóide. O fluido alantóide reunido foi centrifugado (2000 rpm, 15 min, 4°C) para remover células e depois foi dividido em partes alíquotas para ser armazenado a -70°C.

Titulação do Vírus In Vitro vírus foi quantificado num microensaio in vitro usando células de rim de cão Madin-Darby (MDCK) para estabelecer a dose infecciosa a 50% da cultura de tecidos (TCID₅₀). Diluições seriadas de vírus ou homogeneizado de pulmão (em meio de cultura mais 2,5 /xg/ml de tripsina) foram adicionadas (em quadruplicado) em poços de fundo redondo do microtitulador contendo células MDCK aderentes. Após 5 dias de incubação a 37°C (C0₂ a 6%), adicionaram-se 50 μΐ de glóbulos vermelhos de sangue de galinha a 0,5% por poço e leu-se a aglutinação depois de 1 hora à temperatura ambiente. A dose TCID₅₀ foi calculada usando o programa SAS versão 5 para estimar a dose eficaz a 50% (ED₅₀) para um Ensaio Binário de Resposta à Dose (SAS/Statuser's Guide, Vol. 2, SAS Institute, Cary, NC, (1985) e Applied Categorical Data Analysis, Marcai Dekker Inc., Publishers, N.Y. N.Y.).

Desafio Virai In Vivo;

Virus recentemente descongelado foi diluído seriadamente em passos de dez vezes (10^-1-10^-8) em PSB estéril com 0,05 a 1% de albumina do soro bovino; as diluições foram mantidas em gelo até serem usadas. Ratinhos CB6F^ foram anestesiados por meio de uma breve exposição a toalhetes de papel embebidos em metoxifluorano (Metofano; Pittman Moore Co.) e desafiados intranasalmente com 50 μΐ de vírus. Foi usada nestas experiências uma dose equivalente a 2 LD₅₀.

Colheita de Amostras de Ratinhos Desafiados com Vírus:

Soros: os ratinhos foram sangrados a partir do plexo orbital venoso usando uma pipeta de Pasteur heparinizada. O sangue de 3-4 ratinhos foi reunido e centrifugado a 15K durante 15 minutos; o plasma foi dividido em partes alíquotas e congelado a

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Homogeneizados de pulmão: os pulmões de ratinhos que tinham sido infectados intranasalmente 3 dias antes foram removidos assepticamente e colocados em frascos (1 pulmão por frasco) contendo contas de vidro de 1 micron (Biospec Products, Bartlesville, OK) (cheios até cerca de 1/4) e 1 ml de meio essencial mínimo de Eagle com penicilina e estreptomicina. Os pulmões foram homogeneizados durante 1 minuto usando um batedor de minicontas (Biospec Products); os frascos foram então centrifugados a 3000 rpm durante 15 min a 4°C e os sobrenadantes do pulmão foram congelados a -20°C.

Lavagens Bronco-Alveolares:

Ratinhos foram mortos por deslocação cervical e humedecidos com álcool. O baço foi removido para expor o diafragma. 0 diafragma foi cortado para colapsar os pulmões e a caixa toráxica foi cortada para expor a traqueia. A traqueia foi seccionada cerca de 3 a 5 mm acima dos pulmões e 1 ml de PBS foi injectado nos pulmões através de uma agulha calibre 19 de ponta romba. O fluido foi recuperado numa seringa (de 60 a 80% do volume inicial) e centrifugado a 2000 rpm durante 15 min para eliminar células e fragmentos. Foram congeladas partes alíguotas dos sobrenadantes a -20°C antes do ensaio.

Doseamento com um composto de fórmula (I): um composto de fórmula (I), a 1,3-di-ciclopropilmetil-8-amino xantina (doravante aqui denominado composto (1) foi dissolvido inicialmente em DMSO/EtOH e aumentou-se o volume com FBS/solução salina até se obter uma concentração final de 1 mg/ml em 5% de DMSO, 5% de EtOH, 40% de FBS e 50% de solução salina normal. Foram administradas injecções intraperitonealmente (0,2 ml por ratinho) para dar 0,2 mg por 20 g do ratinho (10 mg/kg), ou outras doses como abaixo se refere.

Ensaio ELISA do TNF: o ensaio ELISA do TNF é o mesmo que foi descrito no anterior Exemplo de Utilidade B.

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-42Obiectivo Racional e Global: Existe a falta de um modelo animal com HIV para testar a actividade de inibidores do vírus HIV e, ainda mais, de um que possa ser facilmente monitorizado in vivo. Os relatórios iniciais na literatura demonstram que os monócitos infectados com gripe produzem TNF e, portanto, levam a escolher o modelo da gripe como um que é útil para a monitorização in vivo dos compostos de fórmula (I) como inibidores do TNF.

Modelo de Gripe no Ratinho: Breve Descrição: os vírus da gripe humana replicam nos pulmões do ratinho mas não causam uma doença declarada. Contudo, a virulência para os ratinhos pode ser aumentada por passagens em série nos pulmões do ratinho. Os vírus adaptados aos ratinhos provocam uma pneumonia mortal e não uma infecção no tracto respiratório superior como na gripe humana sem complicações. Na gripe dos murinos, a replicação do vírus fica restringida ao pulmão e é acompanhada por um infiltrado de células inflamatórias maciço. Está bem documentado que os níveis de interferão pulmonar sobem durante a gripe nos murinos (Wyde e outros) e um relatório recente documentava aumentos não quantitativos (por ensaio biológico) tanto nos níveis de IL-1 como de TNF nas lavagens bronco-alveolares de ratinhos infectados com gripe (Vacheron e outros).

RESULTADOS:

Produção de TNF in vivo

Num estudo inicial amostras de sangue e de lavagens bronco-alveolares (BAW) foram obtidas de ratinhos infectados intranasalmente com o vírus A/PR/8/34 (2LD₅₀), a 0,5, 1 e 6 horas e 1, 3, 5, 7, 9 e 14 dias após a infecção. A análise das amostras reunidas (3 ratinhos por grupo) pelo ensaio ELISA do TNF, confirmou que o TNF era produzido no pulmão, mas não foi detectado TNF no sangue em qualquer momento. Numa experiência de seguimento, as BAW foram ensaiadas individualmente (n = 5 ratinhos por grupo) e homogeneizados de pulmão foram também preparados para análise do TNF e titulações de vírus. Os resultados demonstram que os níveis de TNF aumentaram do 2 ^a ao 7^a dia após a infecção, ao passo que a replicação do vírus era evidente passadas 24 horas. Embora os títulos do vírus

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14548-1 começassem a declinar após o 3^a dia, os níveis de TNF permaneceram elevados. Os resultados sugerem que os eventos disparados pela replicação do vírus (isto é, infiltrado inflamatório das células) levam à produção local do TNF e que os níveis do TNF pulmonar se mantiveram à medida que o vírus desaparecia do pulmão.

Efeito do Composto (1) sobre a Produção de TNF Induzida pela Gripe

Um protocolo de tratamento foi concebido com base na cinética da produção de TNF verificada no pulmão, o tratamento foi iniciado no I^a. dia, o qual precedia qualquer subida detectável no TNF pulmonar. Foi administrado aos ratinhos intraperitonealmente, o composto (1) a 10 mg/kg diariamente, e as BAW foram realizadas 2 horas após a última injecção. As amostras foram tomadas nos 2^a e 3^a dias após a infecção. Os níveis de TNF nas BAW estavam significativamente reduzidos nos 2^a e 3^a dias em comparação com os controlos não tratados, com uma redução máxima de 67% (n=3de3 experiências). Os níveis de TNF estavam significativamente reduzidos nos homogeneizados de pulmão apenas no 3^a dia (η = 1 de 1 experiência) (não mostrada). Uma titulação de dose do composto (1) demonstrou que o composto era activo (-50% de redução do TNF nas BAW) a 1 mg/kg e nenhum efeito foi verificado a 0,1 mg/kg.

CONCLUSÕES:

Estes estudos demonstram que a administração terapêutica dos compostos da fórmula (I) pode reduzir a produção de TNF induzida pelo vírus in vivo. Os dados também sugerem que o composto será eficaz para reduzir os níveis do TNF nos tecidos bem como na circulação.

Efeito do Composto (1) sobre os Títulos do Vírus da Gripe no Pulmão dos Ratinhos

Os títulos do vírus eram significativamente reduzidos do 2^a ao 5^a dia em ratinhos tratados com 1-10 mg/kg do composto (1) nos I^a, 2^a e 3^a dias após a infecção.

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-44Conclusão: estes dados fornecem a prova de que o tratamento com os compostos da fórmula (I) reduz os títulos do vírus no pulmão e, portanto, pode ser directamente benéfico na infecção da gripe humana.

Efeito do Composto (1) na Sobrevivência num Modelo de Desafio Mortal da Gripe em Murinos

Em ratinhos inoculados intranasalmente com uma dose desafio mortal do vírus da gripe A/PR/8/34, verificou-se uma melhoria significativa na sobrevivência dos ratinhos tratados com 10 mg/kg do composto (1) diariamente, mas a sobrevivência em grupos de ratinhos tratados com doses menores, ou tratados com 0,1-10 mg/kg durante os I^a, 2^a e 3^a dias após a infecção não era significativamente diferente da dos controlos tratados com o veículo.

Conclusão: o tratamento de ratinhos desafiados com gripe com o composto (1) nas doses referidas para reduzir os níveis do TNF no pulmão resultou numa melhoria moderada na sobrevivência, a qual era significativa quando os ratinhos recebiam diariamente uma dose de 10 mg/kg. Portanto, a redução do TNF não era prejudicial nesta infecção. Embora os efeitos sobre a sobrevivência não sejam dramáticos, é possível que um benefício mais significativo possa ser demonstrado medindo eventos precoces como os sintomas clínicos, mas isto não se pode fazer facilmente no modelo dos ratinhos onde a infecção está confinada ao tracto respiratório inferior. O tratamento com os compostos da fórmula (I) sugere portanto morbidez e/ou mortalidade reduzidas na gripe humana onde os níveis de dispersão nasal do vírus geralmente estão relacionados com os sintomas clínicos.

A anterior descrição descreve completamente o invento incluindo as suas concretizações preferidas. Modificações e aperfeiçoamentos nas concretizações especificamente aqui descritas estão abrangidas no âmbito das reivindicações seguintes. Sem maior elaboração, julga-se que um perito na arte pode, utilizando a descrição precedente, utilizar o presente invento em toda a sua extensão. Portanto aqui os exemplos devem ser con73 648

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t, --

siderados meramente como ilustrativos e, de modo algum, como uma limitação do âmbito do presente invento. As concretizações do invento em que é reivindicada uma propriedade ou privilégio exclusivo são definidas como segue.

Claims (23)

1. REIVINDICAÇÕES

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   14548-1

   1 - Uso de um composto de Fórmula (I):

   na qual

   R-L e R₂ representam, cada um, independentemente do outro, alquilo ou -(CH₂)_m~A;

   m representa zero ou um número inteiro 1, 2 ou 3;

   A representa um radical hidrocarboneto cíclico, substituído ou não substituído;

   R₃ representa um átomo de halogéneo, um grupo nitro ou um grupo -NR₄R₅;

   R₄ e R₅ representam, cada um, independentemente do outro, hidrogénio, alquilo ou alquilcarbonilo; ou R₄ e Rg em conjunto com o azoto ao qual estão ligados formam um grupo heterocíclico opcionalmente substituído; e os seus sais farmacêuticamente aceitáveis na preparação de um medicamento para a inibição da produção de factor de necrose tumoral (TNF) em mamíferos.
2. 2 - Uso de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por pelo menos um de e R₂ representar -(CH₂)_m-A e m ser 1.
3. 3 - Uso de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por pelo R₃ representar o grupo -NR₄R₅.
4. 4 - Uso de acordo com a reivindicação 2 ou 3, caracterizado por A representar um grupo cicloalquilo C₃_₈ substituído ou não substituído.
5. 5 - Uso de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por ambos R_x e R₂ representarem -(CH₂)_m-A e m ser 1.
6. 6 - Uso de acordo com a reivindicação 5, caracterizado por

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   -47A representar um grupo ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo ou ciclo-hexilo, substituído ou não substituído.
7. 7 - Uso de acordo com a reivindicação 6, caracterizado por A representar um grupo ciclopropilo ou um grupo ciclobutilo.
8. 8 - Uso de acordo com a reivindicação 2 ou 7, caracterizado por R₃ ser nitro, ou -NR₄R₅ onde R₄ é hidrogénio e R₅ é hidrogénio ou alquilcarbonilo.
9. 9 - Uso de acordo com a reivindicação 2, 3 ou 8, caracterizado por R₄ ou R₅ serem hidrogénio.
10. 10 - Uso de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por o termo -NR₄R₅ de R₃ representar um grupo heterocíclico saturado possuindo anéis simples ou fundidos, e o anel heterocíclcico saturado é um anel simples com 5 a 7 átomos, anel este que compreende opcionalmente até mais dois heteroátomos seleccionados de entre 0, N ou S.
11. 11 - Uso de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o composto ser seleccionado de entre o grupo consistindo em:

    1.3- di-n-butil-8-nitro xantina;

    1.3- di-ciclopropilmetil-8-nitro xantina;

    1.3- di-ciclobutilmetil-8-nitro xantina;

    1.3- di-ciclopentilmetil-8-nitro xantina;

    1.3- di-ciclo-hexilmetil-8-nitro xantina;

    1.3- di-n-butil-8-amino xantina;

    1.3- di-ciclopropilmetil-8-amino xantina;

    1.3- di-ciclobutilmetil-8-amino xantina;

    1.3- di-ciclopentilmetil-8-amino xantina;

    1.3- di-ciclo-hexilmetil-8-amino xantina;

    1.3- di-ciclopropil-8-amino xantina;

    1.3- di-n-butil-8-acetamido xantina;

    1.3- di-n-butil-8-cloro xantina;

    1.3- di-n-butil-8-bromo xantina;

    1.3- di-ciclopropilmetil-8-cloro xantina;

    1.3- di-ciclo-hexil-8-cloro xantina;

    73 648

    14548-1

    1.3- di-n-butil-8-piperidino xantina;

    1_t3-di-ciclopropilmetil-8-morfolino xantina;

    1.3- di-n-butil-8-pirrolidinil xantina;

    1.3- di-ciclopropilmetil-8-pirrolidinil xantina;

    1.3- di-ciclopropilmetil-8-piperidinil xantina;

    1.3- di-ciclo-hexilmetil-8-piperidinil xantina;

    1.3- di-ciclo-hexilmetil-8-bromo xantina; e l,3-di-ciclo-hexil-8-nitro xantina; ou se adequado um seu sal farmaceuticamente aceitável.
12. 12 - Uso de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o composto inibidor de TNF ser 1,3-di-ciclopropilmetil-8-amino xantina ou um seu sal farmaceuticamente aceitável.
13. 13 - Uso de acordo com a reivindicação 1, na preparação de um medicamento para o tratamento do choque séptico, choque endotóxico, sépsis por gram-negativos ou síndrome do choque tóxico, em seres humanos.
14. 14 - Uso de acordo com a reivindicação 1, na preparação de um medicamento para o tratamento do síndrome da imunodeficiência adquirida (SIDA) agudo, do complexo relacionado com a SIDA (CRS) ou de qualquer outro estado de doença associado com uma infecção por HIV, em seres humanos.
15. 15 - Uso de acordo com a reivindicação 1, na preparação de um medicamento para o tratamento da caquexia, caquexia secundária à SIDA ou caquexia secundária ao cancro, em seres humanos.
16. 16 - Uso de acordo com a reivindicação 1, na preparação de um medicamento para o tratamento do síndrome da dificuldade respiratória do adulto, ressorção óssea, reacção enxerto-hospedeiro, rejeição aguda de enxertos, doença de Crohn e colite ulcerosa, em seres humanos.
17. 17 - Uso de 1,3-di-ciclopropilmetil-8-amino xantina ou um seu sal farmaceuticamente aceitável na preparação de um

    73 648

    14548-1 medicamento para o tratamento do síndrome da imunodeficiência adquirida (SIDA), do complexo relacionado com a SIDA (CRS) ou de qualquer outro estado de doença associado com uma infecção por

    HIV, em seres humanos.
18. 18 - Uso de l,3-di-ciclopropilmetil~8-amino xantina ou um seu sal farmaceuticamente aceitável na preparação de um medicamento para o tratamento de infecções virais em mamíferos por inibição da produção de TNF, num mamífero.
19. 19 - Uso de um composto de fórmula (I) ou um seu sal farmaceuticamente aceitável como anteriormente descritos na preparação de um medicamento para o tratamento de infecções virais por inibição da produção de TNF, num mamífero.
20. 20 - Uso de 1,3-di-ciclopropilmetil-8-amino xantina ou um seu sal farmaceuticamente aceitável na preparação de um medicamento para o tratamento do choque séptico por inibição da produção de TNF, num mamífero.
21. 21 - Uso de um composto de Fórmula (I):

    na qual ^R1 ^{e r}2 representam, cada um, independentemente do outro, alquilo ou -(CH₂)_m-A;

    m representa zero ou um número inteiro 1, 2 ou 3;

    A representa um radical hidrocarboneto cíclico, substituído ou não substituído;

    R₃ representa um átomo de halogéneo, um grupo nitro ou um grupo -NR₄R₅;

    R₄ e R₅ representam, cada um, independentemente do outro, hidrogénio, alquilo ou alquilcarbonilo; ou R₄ e R₅ em conjunto

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    14548-1 —50— com o azoto ao qual estão ligados formam um grupo heterocíclico opcionalmente substituído; e os seus sais farmacêuticamente aceitáveis na inibição da produção de factor de necrose tumoral (TNF) em animais que não os seres humanos.
22. 22 - Uso de acordo com a reivindicação 21 na preparação de um medicamento para o tratamento de estados de doença mediados por TNF, em animais, seleccionados de entre o vírus da imunodeficiência felina (FIV), vírus da anemia infecciosa dos equinos, vírus da artrite caprina, vírus visna, vírus maedi ou outros lentivírus.
23. 23 - Uso de acordo com as reivindicações 1 a 22, caracterizado por o TNF ser TNFa.