PT100922B - Processo para a preparacao de derivados de 5-c-hidroximetil-hexose de esterois que baixam o teor de colesterol no sangue - Google Patents

Description

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Case :4491 X "PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE DERIVADOS DE 5-C-HIDROXIMETIL-HEXOSE- DE 1 ESTEROIS QUE BAIXAM 0 TEOR DE COLESTEROL NO SANGUE" CAMPO TéCNICO 5 A presente? invenção reftire-se a novos deri--v a d o s d e 5 ···· C—h :i. (d r o x i rn e t i I -h o x o s e d e e s t e róis e A s u a u t i 1 :i. -zaçuo para baixar os níveis tanto de colesterol no soro 10 como de trig lecéridos no soro» Estas novas saponinas sa'o resistentes A absorção e ao metabolismo,.

ENQUADRAMENTO GERAL DA INVENÇÃO 15

MuJ. /1 -20.000 í». ·Μ|Οβ 20 25 30

As saponinas sáVo um tipo de gli cós idos que se encontram na Natureza.. Uma saponina é constituída por uma sapogenina e um açúcar. O açúcar pode ser um mono— sacárido ou um oiiqo—sacárido.. A sapogenina é um esteróide ou um triterpeno.

As sa pon i nas en con t radas na soja, 1u ze rn a e ginseng foram extensivamente estudadas relativamente ao seu efeito de abaixamento do teor do? colesterol no soro. Redu— zem~se tanto a capacidade do animal poder observar colesterol como também o nível de colesterol no seu soro.. 0 trabalho sobre as saponinas de soja e o metabolismo -dos i£ pi d os fo:i. realizado por Ohominami e coL. ,, na School of Medicine.. Ehime University do Japâb, em 1991. Este trabalho esta resumido em CA9ó-· 21072··}X.. Q trabalho sobre o ginseng estÁ resumido em CA:1.0:1.204131(3.. Este trabalho foi realizado por Moon e co i. ·. .. University of Seul, Coreia.. O efeito da dieta de rebentos de luzerna e de saponinas de luzerna tema de uma dissertação de David I..... Stone, University of Califor- 35

Case:4491 X o::ons :i. s to·:·? <:"*m espiro::· s tanó isd :i.cso:ieii :i.na „ :o !. es ::3r" L to - esíercl erqoes tero i. Lj-íiiipes "sro.!. ,, estiiiiiií.sl.eroJ. li aocan i iί.. hcicíq ο I. cano =..;c:·:sai:K/cenóis do:·/ ao : o·. ·, pro toascicien ina., p ί- o t o p ara :< a d :i. à :i. o::· e p r o t o p anaxa o:l :i. ó i o::· :l. 5$.. - Composto de acordo com as rei vind i ca-çfifes 13 ou 14„ caracterizado por a citada hexose ser 5-C-h i d r o x i m e t11 -- L—a r a í:j i η o — h o? x o p i r a n ó s :i. d o e o r e ΐ e r i d o e s t e r o 1 ser d:i.osqenina,, tiqoqenina ou colesterol.. βο/μ »» oooor. 1/ τη\ν

VASCO MAieOfS IfTW Agove Ot;elol

I -.di,· ..·Γ,βΙ 5erl*fl· Af®0 A* ConceiÇA·. 3, 149VA 25 4 30

Ó5.343 Case :4491 X "PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE DERIVADOS DE 5-C-HIDROXIMETIL-HEXOSE DE ESTEROIS QUE BAIXAM 0 TEOR DE COLESTEROL NO SANGUE"

CAMPO TÉCNICO 10

A presente invençíío refere-se a novos deri — v a d o s d e 5—C—h .i d r o x :i. rn e t .i I-hexose d e e s ter ó i s e A s u a ut i 1 i -zaçáo para baixar os níveis tanto de colesterol no soro corno de triglecéridos no soro- Estas novas saponinas sao resistentes à absorçâ'o e ao metabοI ismo

ENQUADRAMENTO GERAL DA INVENÇÃO 15

MuJ. ?l 20.000 o«. 20/00 20 25 30

As saponinas sâ'o um tipo de q 1 i cós i d os que se encontram na Natureza.. Uma saponina é constituída por uma sapogenina e um açúcar. (3 açúcar pode ser um mono— sacárido ou um ol igo—sacárido.. A sapoqenina é um esteróide ou u rn t r i t e r p en o -

As saponinas encontradas na soja, luzerna e ginsenq foram extensivamente estudadas relativarnente ao seu efeito de abaixamento do teor de colesterol no soro. Reduzem— se tanto a capacidade do animal poder observar colesterol como também o nível de colesterol no seu soro.. 0 trabalho sobre as saponinas de soja e o metabolismo dos .Lípides fo:i. realizado por Uhorninami e co.l... „ na School of Medicine, Ehirne Un ivers:i. ty do Japáo, efn 1991. Este trabalho está resumido em CA96:: V':l.072-T.X- Q trabalho sobre o qinseng está resumido em CA:1.01;; 20A131G.. Este t.rabalho foi realizado por ΙΊ!-Όη e co.l. - , University ot 'Seul., Coreia.. 0 efei to da dieta de rebentos- de luzerna e de saponinas de luzerna é tema de uma cl :i. ssert.açíío de Davi d I..... Stons, University of Cal.i. for— 35 10 15

Mo d. 71 · 20.000 4«. · 90(00 20 25 30

Case :4491 X i*!i V'. ., Berkci.·:·;/ ( CA .1.0 -:1 ;ι 16575/1) ) .. Uin mec-."u"r!. smo iολra a -ícu · v:i...!.:v,.f-.> hipcco1osfero1émica das suí::·ιί ias to i. publicado ooí·" S.i.dhu o co.i no bb i.::: Ιο upuioral. οτ Nu ϊ.r i ci9!:-t·11 i. 98o .. A ρΛ'ΐ'.ΰπ ttí de .!.ri v·;·'!i c VCo -.0-Vví:>csioc::·tr:-36/.3401 ·ι;:··Ϊ con cscl :i. d a a Os a!<a Yakuhin Kenky , descreve a uti 1 :i. zaçÁb de saponxná de soja para evi tar a trombose.. A pa ten te cl e Enven ç «ío Norte—Ame r :i. c:an a Núrne r o 4 242 5 O 2c o n c e d :i. d a a lTl a 1 inow e col ( c e d :i. d a η o s E s t. a dos

Unidos da América,, 1980),, refere-se à u t i 1 i z a ç'ã o de saponi-nas para inibir a absorçâ'o de colesterol., De acordo com esta referência,, a modif:i.caçã'o da parte doe oliqo-sacárido da saponina por hidrólise em condiçfítos Ácidas suaves atecta a capacidade da saponina para afectar a absorção cio? colesterol .. A patente? do? InvençSo Norte—Americana Número 4 524 067., concedida a Arichi e col„ (Osaka Chemical Labo-ratory., 198 5 ) refere-se Á utilização de saponina*» de feijão p a ι- a b a ixar o t e o r d o? c o 1 e *s t. e r o 1 .. UI los o? col., B i o c h :i, m „ Biophys. A c t a (1985),, 337 (2),, PAGINAS; 1S1 - 139., resumido em Index íTled 1 cus descreve ex peri en cias em que diferen tes; esteroides de plantas., incluindo saponinas., aumentam a secreção biliar de colesterol„ A pa tento? de Invenção Norte—Ameri cana Número 4 602 003., concedida a Mal inow (1936),, descreve sapogenina sintética e compostos do? esterol que inibem a absorção de colesterol o? que sã'o utilizados para tratar a hi per colesterol em ia.. Estes compostos sã'o q li cós idos sintéticos de tiqoqen ina „ d iosgen ina ., smi lagen ina o? semel han tes .. Celobia— se—ticicjgenina o? celobi ose—d iosgen ina suo também fabri caclos bem como os derivados de éster.. A paten te de Invençíío Norte—Ameri ca Número 4 602 005., concedida a Mal inow (1936)., está relacionada com a Patente de InvencOío 4 602 003.. ϋ tiqogen:i.na — celobiésido é d e s c r i t o c o m o s e n d o p a r t :i. c u 1 a r m e n t e e f :i.c az no t r a t a m e n t o d e 35 15 10 15

MoJ. /[ 20.000 «*. - 90J08 20 25 30 35

Case :4491 X hí:í c· i'· c o1 0 s t. 01'1 (!) 1 0 m 1 a 0 de λ r ter o s c.!. r 0 3 0 Π í: :í. ci a cl c d esem i:?en ha m 001:)0]. "entrai. na ·;·:··:ι >x i. 00 Ac da con cen I'. ra ç'Ao 0 do fluxo do coi es ter o 1 no sanque.. Re con hecou -se ,;i á há mui to tempo eme 0 man :i. du.Iaçáo da c:i. rcuIaçáb en tero--hepát:i. ca do colesterol e/ou dos ácidos b :i. .1 iares é u m meio para m o d i f i c ar os níve :i. s d o c o 1 esteroi do sanai.»·?, part:i. cuIarrnen te os níveis de colesterol de I i poproteínas de pequena densidade (L.DI... --C) ,, devido As suas :i.nflu§nc:i.as sobre o metabolismo hepático., Aqent.es que se ligam ao colesterol ou de outra forma evitam a absorçáo do colesterol e dos ácidos biliares através da parede dos :i. n t e s t :i. η o s, s e f o r e m a d m :i. n :i. s t r a d o s n um a d o s e s u f :i. c :i. e n t e , faxem com que o fígado regule para cima o teor de receptor de LDL» A queda resul tan te das con cen traçÕ'es de LDL acredita-se qeralmente que proporcione benefícios terapêuticos siqn :i.f i cativos.. Embora se saiba que as saponinas possuem o benefício de baixar o colesterol, também se sabe que estes materiais se hidrolisam no sistema digestivo. Quando o agrupamento de açúcar é eliminado, isto é, a liaaçao. cjl:i.co-sídica é clivada, o colesterol, deixa de ser removido.. Por consequência, um derivado de saponina que náo se h:i.drol:i.se no estômago nem nos intestinos será muito desejável.. Este composto poderia mesmo ser derivado do colesterol.. Surpreendentemente, a Requerente descobriu que, derivati zando um estero.l. com um açúcar substi tuído por 5-C-*hidroximeti 1 o, se obtém um derivado de saponina que náo se h:i.<:lrol :i.sa no estomago nem nos in testinos, mas que mesmo assim ainda funciona de forma a fazer baixar colesterol 0 os triglicéridos no soro.. 0s 5-C-hidroximetil-açúcares sáo o assun to de Paten te de InvençSfo Norte—Ameri cana Número 5 041 541 (1991),. 1··: um objectivo da presente i.nvençfío propoi..... cionar novas saponina'» que se hidrolisam muito pou<::o n<.) tubo digestivo., é ainda outro objectivo da presen te inverv" 4

Case :4491 X

O / cOao proporeionoar novos ¢::¢31ni::·oi-> que foacem baixai"' ¢:: co.l.es··-' .:· i··· :> I. citisorviclo qc- lo :: ar. í. s.io ··:·· ·: ue ·. ::·. n :> :·: rt baixam os n :í. vh :i. :.:i 0 ;;:c:= .1. es V.'-:í i. no soro »íii orcioan :i. smos .::1 os animais os humanos.. I:!.'st os is o·? outras ob :i os ativos serâ'o ov:i. danei ados na cl iscussao descrita na presente memória descritiva.. 10 á um objectívo da prossosn tos invenciTo proporcionar um processo para a prosparaçiVo destas novas saponi— nas., tt ainda outro objectívo da presente invenção oropor-cionar osst.es novos compostos por meio dos um processo osconó— mico e eficiente., liistes os outros objiectivos tornar-se-So evidentes a partir d a d :i.scussóà'o ciue sos realiza na presente rnosrnó r :i. a d escr i t i va »

Todas as percentagens s?(o em peso, a n'c(o ser q u os s os i n d i c| u e d os o u t r a m a n os :i. r a .. 15

SUMÁRIO DA INVENÇftO

Mod. 71 20.001] o«. yOjOã 20 25 30

As novas saponinas de acordo com a presento» invosnÇiTo abrangosm ‘ã-C -hidroximeti 1-hexose—mono-sacáridos, <:l i—sacAridos ou tri-sacAridos que estSo ligados a esteróis por meio dos uma liqaçcYo q I :i. cosi d i ca - Também se podem utili-z a I"· d os r :i. v a d o s d os s t os b - C ··· h i d r o x :i. rn e t i 1 - c a r bo - h i d r a t o., i n — ciuindo d :i.-sacár:i. dos e trl--sacár:i.dos que contem pelo menos uma ligaçSfo simples açúcar dos novos carbo— hid ratos acima amosn cion ados 1 igoadras por uma liqaçSo cjlicosídica a um ossterral .. Os estero:;.s s<To escolhidos do grupo que (.consiste em ossp:i.ro—oss i.enóis·, toais como diosgenina e tigoqenina, oassim como outros que incluem colesterol, alfa-si tosterol. beta -s:i. tosterol,, osstosgmasterol., si tostanol ., ergosterol e compósterrol .. Estas» novas saponinas quando s'<ao ingeridas p(sr vioa oral por pacientes humanos ou oanimais tem como resu.l. toado oa obt.ençVao de menores» níveis de colossterol no soro... TamboSm se espera que protejam contra a arterosclerose e as suas sequelas.. 5 35 1 10

IS

PO/PÍ >» 000 « W TOW 20 25 30 35

Case:4491 X

Na presente i n ven eá'o , também se incluem as !ini::>f:;·;:i· i. ·Ji·; Tarmaceu i;:; iiiϊί i.o' acex távwi a CDiTtendo estes cler::.va':iosÍ de esteral. sob a forma de dosagens m :i. tárias.. As novas sanonxnas de acordo com a oresente :i. n v e n c a o a b r a n ci em Iii ·- 0 - h :i. d r ο χ χ rn a t :i. 1 - h e x o s e m ο η o - s a c á r i d o s di-sacáridos ou tr x-sacáridos que est«o ligados a este róis por meio de uma IxciaçSo glicosidica. Eis tas 5~C-hidroximeti 1—saponinas preparam-se pelo seguinte processo, que compreende as operaçftes que consistem 1) na aciiaçáo de 5--C-hidroximetil-hexose realizada em duas fases que compreendem a) fazer-se reagir um anidrido de ácido com a referida hexose na presença de uma base;; b) fazer-se reagir o produto da operaçao a) com um anidrido de ácido e uma quantidade catalítica de um ácido forte;; e 2) na reacçâb da hexose acilada com um fluoreto na presença de oteraio de trifluoreto de boro, fazendo reagir a hexose .acilada com um brometo na presença de cianeto de mercúrio e em seguida fazendo reagir o derivado fluorato ou bromado com o esterol. Como variante, a operaçSo 2) compreende a reacçâb da hidroximeti1-hexose axilada com esterol em condiçGfcs anidras, na presença de trimetil~s;i. 1 i 1-trif luor— me tan o-su1fon ato~ Os grupos acilo s <X o hid rol isados na presença de um catalisador de alcoolato de metal alcalino para se obter o esterol-5—C-h:i.d rox ima ti 1—arabino—hexapi ranósido..

DESCRIÇÃO PORMENORIZADA DA INVENTO

DEFINIÇÕES O termo do na presente memória "comnreendendo", tal descr i ti va, com nreen como de as é utiliza— es p ressGTes 6 1 5 10 15' BOfOA · »· i 3 20 25 30 35

Case :4491 X ι» cyv " '"CinsiijT.indo :»:·ιίί" e "consistindo 03000 c:i. a.i.men ''.0 em" 'V::· í?xi! r^SíSfíl"'::! :li"lQV'ib ::: Λ D (I"l 1'Ί <·. " 0 ' l'Ui:i Ι'ΌΧ '1. Ί10 f:.:i. !!.- s!ϊ>.ι.)οη :i.η λ·::; " tal 1:01110 suo ui.; i.:·.· i ·'.·;·. na or^serrhí memóri3 descri t:i. vã„ referem—se 003 00r::. vacl03 de b—C—hidro···· :i.mos t:i.1o de hexoses 0 aos seus estério-·:i.sOmeros ciue s«ío 1 i g a d o 3 a um est.er ο I para proporcionar uma s a p o n :i. n a .. A ligação faz-se por intermédio de uma liqaç«ío q 1 i cosíd i ca. P a r a d 0 r :i. v a t i zar o e s t e r o 1, p o d e m u t i 1 i z a r - s e d e r i v a d o s d e (nono-sacáridos,, di-sacáridos e tri-sacáridos das hexoses.. (D te r m o "0 s t erol" , t a 1 c o m o é u t i 1 i z a do n a presente memória descritiva,. refere-se a esteróis naturais ou sintéticos de origem vegetal ou animal ou a triterpenos. 0 termo inclui os -fitos te róis e os inicosteróis, bem como o colesterol „ Para um estudo ma is pormenorizado dos esteróis., ve..i,:i a-sepor exemplo, UJ„ D» Nes, E, E„ J„ Parish Ed, "Ana 1 y&:i. s o-f S tero 1 s and 01her Bio 1 og i ca 11 y Si gn if i cant S t e r o :i. d s " ,, Ac a d e m i c P r e s s, I n c „ (1989) .. Os esteróis preferidos sS'o escolhidos do grupo que consiste em diosqenina, estigmastanol, tigogeni— na, colesterol, alf a—si tosterol, beta—sitosterol, st tornaste rol, ergosterol, campesterol, ácidos oleanóicos, sapoge— nóis de soja, proto—ascigen.ina, toqenóis, protoparaxodióis e protopanaxadióis. A expressão "qalactose—oxidase", tal como é utilizada na presente memória descritiva, refere-se a D-qa 1 actose:oxiçiénio ó—oxido—redutase, que é iden titi cada como E, C- 1,1,3.9 ou sob o número de registo 9028-79-9 de Chemicai Abstracts.. O termo "catalase"., tal como é utilizado na presente memória descritiva, refere-se a 0=-óxido- redutase, que é identificada como E, C. Ι,ΙΙ.Ι,ό, A catalase é uma (enzima que <:!ecompC5e o peróxido de hidrogénio.. Estas enzimas ocorrem tanto em células vegetais como 0 c é 1 u 1 a s a n i m a :i. s, □ termo "hexose” significa um hidrato de 7 FEV.Í3S3

Case :4491 X cirbunn aue contém ;e:i. s átomos cio carbono.. Este termo 1 ubrance tanto as hexoses que contém a.l.de Ido ( ateio — hexosss ) como a.'::: hexos-os que son c...-λ·ιΐ'ι ce toina oo tc'; "ηes-es j .. O termo ‘‘aldo-hexoses" re1:9re"-3e ao grupo cie açúcares cuja molécula contém seis átomos cie carbono., um 5 grupo aldeído e cinco grupos álcool.. Os dezasseis estéreo— isoméros da série das aldo—hexoses sá'o D-aiose., D—altrose, D—glucose, D—manose, 0—gulose, D— idose,, .0—galactose, D-talose, L-alose, L-altrose, L—glucose., L-rnanose., L—guio— se, L-:idose, L-qalactose e L-talose- Estes açúcares existem 10 em ão 1 uctío sob uma forma de mistura em equilíbrio de diversas "formas tautornéri cas" :: uma forma de anel de pi rano:; uma forma de anel de furano; ou uma forma de aldeído de cadeia linear,, As aldo-hexoses podem também ocorrer na configura-Çao anumérica alfa ou beta.. dependendo da posicá'o do qrupo 15 C-:l.-h;i.d roxi lo ..

MoJ. 71 20.000 et. - yOjOd 20 25 30 0 termo "D-ceto—hexose" refere-se ao grupo de açúcares que contem seis átomos de carbono., um grupo cetona e cinco grupos álcool- Os oito estéreo-isómeros sSío D- e L—isómeros de psicose, frutose, sorbose e taqatese_ Tal como as aldo-hexoses., estas ceto—hexoses podem existir em soluçíVo sob a forma de uma mistura em equilíbrio de diversas "formas tautornéti cas" :: a forma de anel de pirano; a forma de anel de furano; e a forma de cetona de cadeia 1 i near..

Os compostos específicos e as cnmposi çííes a serem utilizadas nestes processos devem, por conseguí?ncia., ser f armaceuti camen te aceitáveis.. Tal como ê utilizada na presente memória descritiva, a expressiVo componente " f armaceuti camente aceitável" é um componente apropriado para ser utilizado em seres humanos e/ou animais sem efeitos secundários adversos (tais como toxicidade, irritação e resposta alérgica), compatíveis com uma proporção razoável de bene— í 1 c i o / r is c o , Além d i s s o „ tal c o m o ol' utiliza d a na pre s ente memória descritiva, a expressão "quantidade segura e efi- 3 35

I Case :4491 X

ο 10 15 r e f e r e · s e A quantidade <:i :->:· um componente aue >!? sufi ::: :.:;irte para Droporcicn-ir a '·.··.···:;:t a cee Λρη· > ci:>r- =>x·>.::>?nci :i.ci sem e réi tos secundários adversos ( tais u:;ιίtox :l c:i.dado irri i'.tíÇ«Q ou resposta alérg:i. ca ; compative:i.s com uri:a propor— izSa razoável de benefí cio/rioco ciuando é ut:i.j.:i.:£ada da maneira de acordo com a presente invenção.. A "quantidade segura e eficaz" específica varia com factores tais como o estado particular do paciente a tratar., o estado físico do paciente, a duração do tratamento., a natureza da terapia simultânea (se se fizer alguma) e as formuIações específicas u t i 1 i z ad as..

DESCRIÇÃO DOS NOVDS COMPOSTOS muj. η - μ.oco ο>. yjjoa 20 25 30 35

Para preparar os esteróis de acordo com a presente invençlío, podem utilizar—se mono—sacáridos., di — sacáridos ou tri-sacár idos de b~C-hid rox imeti 1-aldo-hexose.. Os derivados de 5-C-hid rox irneti l--a.'l.do-hexose ureferidos sâ'o os derivados de qalactose, glucose o? manose» Devido A rei a t i v a f a c i I i d a d e d e s i n t <e t :i. z a r c o m p o s t o s A b a s e d e qalactose., os derivados de .0—galactose s<A'o os compostos ma is preferidos.. Estes podem existir sob a forma de aldo-h e x o p :i. r a η o s e a e d e aldo-hexofur a η o s e s .. As formas de realizaçSfo preferidas sAo os derivados de 3-C-hidroximeti1 de frutos e sorbose, devido A facilidade cie obtenção destes açúcares naturais» Os d:i.-sacAr:i.d os preferidos compreendem pelo menos uma b—C — hidi"DXimeti I—aldo—hexose ou uma b—C — hidroxi — m e t :i. 1 - c e t o — he x o s e,. Gs derivados de esterol de acordo com a presente :Ln ven cA'o contem pelo menos um grupo de b~L— hid r οχ imeti 1-açúcar ( :i.sto é., mono-sacáridos, derivados de mono— sacAri dos) dos mono—sacár idos acima referidos (.1 ou II) covalen temen te I i ciados? por intermédio de .Ligações; de ci I i cosido.. Os esteróis contiem um grupo álcool que reage com 9 1

Case :4491 X ,.-, .·,ι'ι r;/λγ para Tormar -.una .!. πaçiío α 1 :i. cosid :i. ca .. 3 ι ::: :i. η Ί.e s0 t! os eç ter0 i — <1'!. ;j. coi d o0 c o 1 ιί n r ® ®n d 0 ;.· ro a c ο'λΟ d® ! una 5—U—h:j.d rox :i.met 1 .!. í'ixos® aci .i.ada ou prote -n:i. da de qual quer outra manei ra com um esteroi na presença de um catalisador ou de um dissolvente? inerte.. 0 qrupo de pro tecç3'o é eliminado e o derivado de esteroi preparado..

Também se pode fazer reaqir com o esteroi o correspondente derivado fluorado ou bromado do açúcar.. 10

O processo para transformar uma hexose num c: o m p o s t o à b a s e d e '5 - h i d r o x i m e t i I - D - a I d o — h e x o s e r e a I i z a—s e utilizando as seguintes operações·: 1. Oxidação Enzimática de D-Aldo-Hexose Baseado com

Composto com D-A1do—Hexose: Oxigénio 6—Oxido-Redutase οχ. - WJOtí

15 A reduçíTo real i z a—se num vaso limpo, agita- to» Prefere-se um misturador com uma velocidade da ponta compreendida entre cerca de 30,5 a 122 metros por minuto ((.100 e 400 pés por minuto). As condiçfifes de esterilização (evitam a desactivaçao da enzima por contaminação microbia-20 na. 25 30

Prepara—se uma solução aquosa com uma concentração compreendida entre cerca de 1 e cerca de 50“·», preferivelmente entre cerca de 10 e cerca de 20“·» de um composto à base de D-aldo—hexose.. Ajusta—se o pM da solução para reforçar a cinética da reacçíVo- Pretende—se um pll da solução compreendido entre cerca de 6 e cerca de 3 quando se utiliza qalactose—oxidase como enxima» A transf ormaça'o enzimática com qalactose—oxidase necessita de uma temperatura compreendida entre cerca de 1. e cerca de 50Qfj„ a reacçíVo pode realizai·—se a temperaturas até a temperatura de desactivaç.To da enzima» Mo entanto, a temperaturas maiores, pode veriricar-se o desenvolvimento de mi crébios. Uma temperatura compreendida entre cerca de 3 e cerca de 2 5 y C p r o p o r :i. o n a uma b o a e s t a b i 1 :i. d a d e d a e n z i m a , ρ ο π s 10 35 1 5 10 15

Moj. η m.coo ««. · wjoa 20 25 30

Case :4491 X

ί. ο re ! · :· sa i:.ura ciVo do α r: :i. a or^síSíc norma. i ο .:: :. η é όc a. da. :··· · ··· 0..0:.4 .. ,- · ,ο ··'.··:·..·! oura a cialacto·;;; e ο/, :i.:::ase .. Ga como os; ·::!ia r e ac: cáo 1.::. o:i. ¢:::::::: es;. 1:/..-1 o 000ργ ::-011::1 ;. dos; rien iro :ιο i.n terv-si.o do cerca de :.:.:11 -·. x cerca do vince o '.n.!;i i;ra hora;·;.. > i-:; :::-o ! a cá o tipicamente a d1 c::i. ona~s;e entro cerca de I... 000 e cerca. ¢:1 e :1,..000..000 de uni d a de cie activ idade cie enzima por mole de D-alclo~hexos;e ou cie compostos á base de D-aldo-hexose„ Preferivelmente„ utiliza-se uma a c t :i. v :i. d a d e c o m p r e e n d i ¢:1 a e n t. r e c: e r c: a d e 10 0 .. 0 O 0 o 300.. 000 un idades.. 0 nível de oxiqénio disponível em solução também afecta a operaçíVo de oxidacáo:; prefere-se unia solu-çéfo saturada com oxiqénio. Pode fazer borbulhar-se continuam ente ar e/ou oxigénio através da solucáo pai"a manter a saturacuo de o x 1 α én :i. o.. Pode insuflar-se cont:i.nuainent.e 2 ou 3 volumes de ar por volume de solucuo por minuto utii:i.zanclo anéis de espal harnen to com elevada área cie contacto o que proporciona bons resultados.. Os aqentes an ti—espumif i can tes apropriados incluem d imeti 1-s.i. 1 i cone ., 01.1 tr os; compostos; cie orqano—si 1 i cone e o si li cone Ι-Ό—10 (da firma Dow Chemical ) .. 0 nível de agente an ti-espumi f :i. can te está compreendido entre 10 e 100 ppm.. d: também vantajoso reduzir ou eliminar a quantidade de peróxido livre no vaso de reacçáb. Pode utilizai—se a adiçSo de cerca cie 10.000 a cerca cie 2,.000,.000 de unidades; cie actividade de ca tal ase por mole de composto de D—a 1 d o— he x ose. Podem empregar-se ou t ros proce-dimentos para a remocSo do peróx :i. ele:· „ Verificou-se que catiíiYes; cobre presen tes na soluçaci de oxidacuo melhoram a estabilidade da enzima.. Utiliza—se en tre cerca de 0.. 1 mH a cerca de 2 mH cie CuSO». A albumina do soro é também um bom e s t a b i 1 :i. z a ¢:1 o r ¢:1 a e n z i m a .. FinaLnen ts., a cata.!, ose e a D—a 1 d o— he x ose .·: οχ :i.qén i.o ó-ó x :i. cl o - red u tase :: á'o so?paradas; '.:1a :: c i. s.·. c .1 o ¢:10 produto., Is;to pode fazer-se utilizando métodos; convencionais;.. A 35 pofw - ·»· poo re -\t ροιν

Condensação do Produto da Oxidação com Aldeído Fórmi— co de Maneira a Obter—se Derivados de 5—C-Hidroxime-tilo do D—Galactose Composto Baseado em

Ad :i. cionam-se en tre . cerca de 4 e cerca de 40 10 15 20 25 30 equivalentes molares de aldeído fórmi co (diais preferível— rnen te en tre cer ca de 4 e cer ca de 3 equi va 1 en tes mo 1 ares ) e entre cerca de 1 e cerca de 13 equivalentes,, entre cerca de 1 e cerca de 3 equivalentes molares) A solução filtrada proveniente da operaçA'o 1 (substrato).. Prefere-se uma concentração resultante compreendida entre cerca de de 10 e cerca de 30", de substrato,. Prefere-se um valor de pl-l compreendido entre cerca de 12 e cerca de 13.. A solução de reacçaíu é mantida a uma temperatura compreendida entre cerca de 15 e cerca de 409C até se completar a reacçSò. Pode ser necessário arrefecimento até a reacçío exotérmxca ter cessado (tipicamente» cerca de uma hora).. Aqi ta—se a solução até a reàCÇdO de condensação ter atinqido o qrau de completamento pretendido (cerca de uma a cerca de vinte e quatro horas., tipicamente, dezasseis horas)- A fim de se controlar a temperatura e o p|-| durante a ro?acçuO de·; condensação (evitando—se desta forma a destruição do aldeído), prefere-se fazer reagir previamente o a 1 d e í d o fórm :i. c o c o m o h i d r ó x i d o d e s ó d :i. o nu m a o p e r a ç S'q separada. As soluçffes de aldeído fórmico aquoso s de hidróxido de sódio síVo combinadas e aqitadas a uma temperatura compreendida entre cerca de 15 e cerca de 35Í.3C até a reac— ção exotérrnica terminar (tipicamente, cerca de trinta minutos). Aquece-se en+.A'o a solução até uma temperatura compreendida entre cerca de 15 e cerca cie 409C e adiciona— se rapidamente A solução de filtrado obtida na operação :l. „ 35 1 10

Mod. 71 20.000 «<. W/Oò 20 25 30

Case:4491 X

ei",quan to se man Uérn uma remoer ·,.ιι· compreend ida sntr!; · :or e.·< :! e 'V1 e cerca ..! iv? '4C .ί i.í :i. c λ.....se u so i. u.e ao a 1;. 4; λ i''GiíCCác ele • der, o a ato ter atinciido o ; r ';· <; ·:!·· = t.7 le tamen to r-¢::- tend :i. -· d ¢::... ié DossíveJ. :ar outras bases (por exem plo, Ca (OH) =,, KOH o as suas iiústuras) em vez de todo ou p a r I.·. o? d o h :i. d r ó x :i. d o d e s ó d :i. o.. Um outro processo para realizar a reacçSo de condensação com o aldeído fórrnico é por intermédio da reacçáo do aldeído de aaçúcar que é produzido por intermédio da reacçáo de oxidação com qalactose-oxidase e aldeído f ó r rn i c o n u ma r e s i n a f o r t e m e nt e la  s :i. c a.. 0 p r o d u t o d a o x i d a— çáo (:·? o aldeído fórrnico sáo •feitos contactar com uma resina que tem um valor de pl-l pelo menos igual a :1.:1.,,5., a temperaturas compreendidas entre cerca de 20 e cerca de 50QC, durante 0,5 a 24 horas- Utiliza-se uma proporção de aldeído 'fórrnico para aldeído de açúcar compreendida entre 4 :: :l. e 3 :: 1,. Preferivelmente, a proporção est.i compreendida entre cerca de 4 :: 1 e cerca de 5 :: 1 Na rn i s t ura d a r ea c çã o d e o x i d a çã o, encon-tranv-se presentes sais e tampifes» suficientes para formar e manter as condiçffes fortemente básicas necessárias para realizar a reacçâb de condensação, A medida que a reacçáo progride,, forrnam-se sa:i.s adicionais a partir do ácido fórrnico 'formado e estes sá o absorvidos pelas resinas, A utilizaçáo de aldeído fórrnico isento de metanol e de óxido cúprico como catalisador facilita a reacçáo.. 0 produto desta reacçáo pode ser purificado ut i1izan do a d e st i1a çáo f ra ccion a d a para e1imin a r o excesso de aldeído -fórrnico e/ou técnicas de adsorçáo de uma maneira seme 1 han te à outra reacçáo de condensação. o. Purificação

Da solução cie reacçáo resultante, elevem ser 35 1 5 10 15 roiw · ·>» ooo ot 1/ r°w 20 25 30 35

Case :4491 X

eim:i. nados .:}:. ées :i. ndesej ados 11:101- exem o lo .. Ha'.. OH” „ H” ) 1:? ο λ .]. c! o i.:l o fH;:·:-iíi co . os :i. ;:i t >J... A ::mr::.f::.cã(;Su d o d o realizar·-· ·: o ::joi- mecos -:::-:..:ιν-η ci o na :1-=5 . tais como o i1. x a cão do resinas de adsorção·. d :i. A.!. :i. s eprecipitação ou cima combinação cie diversas técnicas., A clest:i.lação fraccionacla pode também ser utilizada para remover efectivamente o aldeído fórmico» A solução resultante da operação de purificação acima mencionada contém geralmente entre cerca de 1 e 50"! de produto de 5-C-hidroximetilo. A solução que contém o produto aquoso purificado pode ser utilizada directamente ou con cen trad a até níveis maiores (por exemplo., até entre cerca de 90"! e cerca de 95"! de açúcar). d: desejável concentrar a solução a baixas t e m p e r a tur a s par a e vi ta r a d e c o rn p o s i ç S'o t é r m i c a do com d o s t o de 5-C-hidrox imeti Io.. Prefere-se a osmose inversa empregando membrana com cerca de .1.00 HUI CG e uma rejeição cie 99"! de NaCl a temperaturas compreendidas entre cerca de 10 e cerca de 38Í.2C,. Os exemplos destas membranas incluem membranas compósitas de película fina de poli-sulfona/poliamida IHR-9S ou l-IR-99, fabricadas por Niro Corporation. □ processo fitais directo para cristalizar os compostos á base de 5—C-hidroximetil-aldo—hexose consiste em saturar uma solução aquosa a uma temperatura elevada e arrefecS-la para precipitar os cristais de produto.. No entanto, esta técnica pode ser prejudicada pela presença de impurezas e de subprodutos nas solução. A seguinte técnica é ruais eficaz- para precipitar o produto e reduzir o nível de impurezas e de subprodutos. Prepara—se uma solução a 90—95?! do composto produzido.. Elimina—se a água usando ad:i.çô'es cie etanol í:!. :·. IJ/evaporaçffes (qeralmen te s-ão suficientes uma ou duas destas maneiras de proceder). Q resíduo sólido resultante da evaporação dinal cio etanmol é dissolvido em metanol sob refluxo:: utiliza-se uma proporção de 1 2 1 a cerca de 3 :: 1 de 14 15 10 15

BOÍW··»· ΟΟΟ’Κ· U P°W 20 25 30

Case :4491 X

,j,ΐ'.,.',π·::· i. Λ ra -::(:).1.::.1:10,, 1.:: ra oneracáo e soou::.'.:1a pe.i.o arref oc::;j. mento d .¾ »o.!. u çtú:; até '-.ima t em oe r a t*.i r a romnrecnd :i. d a desde cerca de -.I.O ·:·. .:·::··- ο a oe -?.09C, dur-inte ,·:·· rro cerca de uma a cerca de doce hora:::·.. Os cristais s..Xo enteio filtrados a lavados com metanol frio (cerca OQC), 0 metanol residual pode ser removido por secagem e/ou por reoristalizaçao em água,. Os cristais podem ser lavados com acetona para retirar ainda ruais impurezas,. Os dissolventes utilizados na cristalização podem ser eliminados por secagem em vácuo,, em leito fluidi — zado ou por outras técnicas conhecidas.. Uma descri ç3to pormenorizada da síntese destes compostos está referida no pedido de patente de Nazur e col„„ EP 0 34:1. 063 (1989),. 4. AcilacSo de 5-C-Hidroximeti1-hesoxe llm primeiro lugar., a 5-C-h.idrox:i.metiI—hexose é? transformada numa 5-C-hidroximeti 1—hexose acilada para proteger o açúcar durante as reacçOes subsequentes e para controlar os produtos da reacçSTo quando o açúcar reage com o este··?rol.. A 3 ·-· C - h :i. d r o x .i m e t i 1 - h e x o s e é t r a n s f o r m a d a η o derivado acilado por meio de urna reacçíVo de esterificaç«ío em duas fases.. Para produzir os ésteres, pode utilizar-se qualquer anidrido do ácido carbox í. 1 i on .. Preferi velmen te, utilizam-se os anidridos de ácidos que tem dois a sezs átomos de carbono.. liais preferi velmen té „ utiliza-se o anidrido acético para proteger os grupos h:i. d rox i lo.. Faz-se reagi r a 'ã-C-hid rox :i. meti 1-hexose com um a n i d r i d o d e á c :i. d o n a pres e n ç a d e u rn a b a s e, A p i r :i. d :i. n a uti .1. :i. z.ada como d i ssol ven te funciona bem nesta reacçao, A reacçíto realiza—se cieraJ.mente ás temperaturas ambientes;. Nesta rceacçííTo inicial, esterif:i.c:am-se quatro radicais hidroxi lo de um mono—sacárido e aci Iam-se ate sei::; 15 35 1 1 /

Case :4491 X 10 ou : ο ό o i ca :i. o h u rox !. o cie um d':, "uuuo i'!. do .. ;.)u ran t o t '1 i '.Vitoi :Tlcv O O i.í »’ r:i.v.:U lo ii<.:J . i O i. r; (χ ; < r ‘ J CÚ. Γ; jj·: !” o :í. .1. inπ v.t· '* -1. i 1 a·: ο η em se ci ui cl a :i. Vo i·'* *.:i :i. í com o an :i. d r :i. d < '> d e a e :i. d o ’ O O >í . .1. i. . :o :i. o. iona !l. i.Ulia ei i.iari : d ac!e ca t a .1. :í. Ϊ. :l. Ci i d e a i.c i cl o su: . fú r: ¢:: o c: o n c e n t r a. cl o ou anidro. Esta operação abre a ponte anidra o atlicionam-se m a :i. s d o :i. s g r u p o s a c :i. 1 o .. A b - C - h i d r o :< :i. fri e t i 1 - h e x o s e es t A agora comple tamen te acilada. Gs derivados acilados s«ío gerrai men te cristalinos e ‘formam—se com bom rendimento. A acilaçao pode realizar-se numa única fase utilizando um excesso de anidrido de Acido e ácidos anidros ou mui to con cen trados., preferivelmen te ácido sulfúr:i. co ., como catalisador. No entanto., este processo nS'o é o prefe-r i cl o .. 15

MuJ. 71 · 20.000 4». · V0|0a 20 25 30 A titulo de exemplo,, as seguintes condições de reali zaçíYo da reaccao originam bons resul tados:: T e i n p e r a t. u r a :: a m b i e n t e .. D i ss o 1 v e n t e :: p i r i d :i. n a ..

Duraçíío :: uma a vinte e quatro horas.

Proporção de anidrido de ácido/substrato de hidrato de carbono :: 1 a 2 equivalen tes por cada grupo h:i.droxlo.. □ derivado de a calcar parcialmente a estilado ou a 5-C- h i d ro x i me til — he x ose pod em ser esterif içados utilizando um (catalisador ácido nas seguintes com:l i çcííes :: Temperatura :: 0 a 20QC»

Dissolvente :: anidrido acéticlo..

Duraçâb :: uma a vinte e quatro horas..

Catalisador :: ácido sulfúrico concentrado, ácido fosfórl — co ou á c: i d o tr :i. ‘flúor me tano—su lf án i co .. 5

Condensação com Esterol μ hexose hexa-acilada é acoplada com o esterol pejr meio de uma das «seguintes vias :: 1. reaccao com esterol utilizando tr i rn et i 1 —si i :i. 1 — tr i — 35 16 i 10 15

Mod. ;i · 20.000 c«. 90J0<J 20 25 30 35

Case :4491 X i Fi / r i** r.<:.· tano-íui ronato :: 2. · ' ι» In .<..· >::i í:-> t-"vado : ·: 1 bromo e em ·ν.··< mu. ·:; - i :·.'ac:;o:á.j com o (ísísrcl :: e 3. v. r u) sfo rma çílío do derivado de .1.--flúor e roaoc úo com o estsrol Na opç'áo 1., mistura-se oe s te rol coto a hexa— a c :i. .1 - 5—C - h i d r o x i 111 e t. :i. 1 - h e x o s e e t. r :L f .1. u o r m e t. a η o ·· s u 1 f o n a t. o d e trimeti l-s:i. 1 i lo no seio de um dissolvente inerte. Preferi-ve 1 rnen te ., como d i sso .1. ven tes. u t i I i z arn—se 11 i d ro ca r bon e tos clorados.. Emprega—se uma proporçJío compreendida entre 1 :: 1 e 2 :: 1 de hexose para este rol.. Esta reacçáo proporcionai o peri ta-aci 1 —'ã-C-hid rox ime ti 1 —hexose—es te rol com rend .imen tos iguais a cerca de 20",:,. Ho caso da opç&o 2, forma-se uma 1 — bromo— pen ta-aei 1 — 5—C-hidroximeti 1 -hexose ins tável fazendo reagir brometo de hidrogénio no seio de ácido acético com o derivado de açúcar acilado.. G derivado de bromo é geralmente instável e deve -ser feito reagir imediatamente com o este— rol e um catalisador,, A reacçâ'o realiza-se em pequenas quantidades utilizando h.idrocarbonetos clorados como dissolvente,, Obtém—se um rend imen to de 30": ou menor. Nesta reaceS'0., o cianeto de mercúrio act.ua bera como catalisador.. No caso da opçuo 3.. forma—se uma 1—flúor— pen taci 1 — 5—C -h:i.d rox ime t :i. 1 —hexose es tável, fazendo reag xr a hexose ac:i.lada com piridina o? fluoreto de hidrogénio.. Uma possível reacçáo secundária compreende a cl:ivacjem do grupo aoetilo da posicáo 2 da hexose.. Este grupo hidroxilo é facilmente reacilado fazendo reagir o composto fluorado na posição :l. com um anidrido' de acilo, como se descreveu acima.. Gs derivados fluoradas na posição 1 preparados por este processo são cristalinos e estáveis,. Podem ser cristalizados com etand. ou outros álcoois de alquilo e armazenado!::·Estes materiais constituem boa!::· fontes de 5-C-hid rox ime ti i —hexose pai·· a a deriva t i z a çá'o de certo número de 17 1 r v kuk

Case :4491 X

i a 10 15

MjJ. 71 20.000 οι. · W/Od 20 25 30 mater :.a s.. 8?λο ίΐη,α ΐο resciivos η ,. reacctíes de ácooIemen to com ?s ‘.o ró i. s .. ;:i : *·.··.·::'i.·.:·:'?· cies tas I —- ΐ:úor—oen !'.aci ro-·· : imetil •hexose com o esterol resiJã-se melhor quáiiclo o esterol tenha o:i.do transformado no seu derivado de tr:i. me— ti 1 ··<·> 11 i .Lo (TIVIS).. Λ reacçao com o TPIS—esterol rea.l. i z<*·-·· ss u t :i..!. :i. z a n d o h :i. d r o c a r b o n e t. o s c I o r a d o s c o m o d i s s o 1 v e n t e s e os te ratos de tri f luoreto de boro corno catalisadores.. 0 produto resul tante é urn derivado de pen tacil-•b--C--h:i.drox irne— til-hexose do esterol. Qs derivados de pentacilo de hidroxi/neti 1 — saponinas sâta cristalinos e facilmente purificados por meio de técnicas convencionais.. Os grupos acilo síío agora hidro— 1 isados para preparar es teri l-h-C-hid rox imeti 1-hexósido .. Para hi d rol :i.sai" os compostos de pentacilo., eles sã'o suspensos em metanol ou outro álcool de alquilo inferior e adiciona—se um alcoolato de metal alcalino (por exemplo., metóxido de sódio).. Agita—se a mistura durante cerca de quatro a vinte e quatro horas à temperatura de refluxo ou á temperatura ambiente. Filtra-se o produto e leva-se com álcool.. 0 produto é uma substancia sólida. G álcool reagente e de lavagem contém derivados adicionais de S-C-hidroximetil-hexose—esterol, que? podem ser recuperar o álcool através de uma coluna de resina da forma ácida de Amberly e RI20 (da firma Aldrich) até que o álcool (metanol) seja neutro.. A sa pon i n a é re cu pe r ad a a pa r t i r d o e 1 uen te a 1 coó 1 i co .. 0 derivado de esterol pode ser seco sob vácuo para eliminar quaisquer vesticiios de dissolvente.. Verificou—se que as condições reaccionais acima mencionadas proporcionam bons rendimentos de hidroxi— me t i 1 — sa pon i n a s.. 18 35 1 o 10 15

90fW · ·'· ΟΟΟ'ΟΣ 1/ POIV 20 25 30

Case :4491 X Método de Tratamento Ί Μϊ

Urtid ín.iantidade seoi.;ra etic.i· ::l::· iiidroxiíite--!"i I ·:·; <j pon :i. na é f o rnecxd a a anima is ou. a seres humanos.. Geraimente, utiliza—se uma dose compreendida entre 5 e 600 mq por quilograma de peso corporal. Preferivelmente, esta dose está compreendida entre 5 a 200 rnq/kg e é administrada uma a quatro vezes por dia- As formas de dosagem sólidas incluem comprimidos, cápsulas, grânulos, pós e granei, bolos ou bolachas e produtos do tipo de rebuçados. Os comprimidos podem conter agentes apropriados como ligantes, lubrificantes, dilaent.es., d es integrantes, corantes, apaladantes, que provoquem o fácil escorregamento e que auxiliem a derreter. As formas de dosagem líquidas por via oral incluem soluções aquosas, emulsões, suspensões, soluçBes e/ou suspensões reconstituídas a partir de grânulos n<?ío efervescentes e preparações afervescent.es reconstituídas a partir de grânulos afervescentes. Estas formas de dosagem por via oral líquidas podem conter, por exemplo, dissolventes apropriados, agentes preservantes, agentes emuIsionantes, agentes de suspensão, diluentes, agentes eduleorant.es, agentes para derreter e agentes corantes e apaladantes. Uma forma de dosagem Líquida preferida é constituída por uma bebida que contém sumo ou outro tipo de bebida. Exemplos específicos de aqentes veiculares e ex c:i.olentes farmaceuti camen te acei táveis que podem ser utilizados para formular as formas de dosagem por via oral de acordo com a presente invenção sá'o descri tos na patente de Inevnçáo Norte—Ameri cana Número 3 309 297, concedida a Kobert em 2 de Setembro de 1975» Técnicas e composições para formas de dosagem úteis nos métodos de acordo com a presente invenção sá o descritos nas seguintes referências Mo d e ι-n P ha rma ceu t :i. cs.. capítulos 9 o 1.0 t Banker &. Thodes, Editores, 1975)5 Lieberman e col., Pharma ceu 11 ca1 Dosaqe 19 35 1 5 10

Case :4491 X / II·::;·· i 1 I (.*.· T :: \ 1 '·> Í*:í' 1 o An sei Λ DOS,': .Cl «v? "’ϋΓ'ίΙΙβ 1.976) .. □ <:» 5—C— h:i. d rox ime tii-hexose-es· ' 0 Γ ô ί 2:· [. •Odl •/iií

também ser uti 1 :i. ZAdos em combinações com agen tes 1 iqan tes d os A c :i. d os b i 1 i a res ou :i. n :i. b i d o res d a s í n tese d o <:o les tero 1, por exemplo., ps:í. .1 :i. o., celulose ou coles ti ramina.. A preparação dos 5-C- hid rox :L meti l-hexose-esteróis é descrita nos Exemplos seguintes- Os Exemplos sSTo apenas ilustrativos da invenção e nao se pretende que a 1imi tem.EXEMPLO I moj. η - 20.000 ««. w/oa 20 25 30

Preparação de meti1—5—C—hidroximeti1—alfa—L—arabino—hexopi.— ranósido a partir de metil—beta—D—qalactósido1. Qxidante de meti1-toeta—D-galactooiranósido com oalac-tose—oxidase

Reagen tss Massa mo1ecu1ar Moles Quantidade Metil B--D- 194.13 o o 200 q -q a.lacto pi ·, "anósido í:.' i q m a L h em i c a .1. Co« (No.. M---67 57) 35 20 1 5 10 15

Case:4491 X

Tampão de fosfato., 100 mlvl Ca ta 1 ase ;1 16900 unidades/mg Sigma Chemical Co - , (Mo.. 0-40 ) Ga1ac tose-o x i d ase 412.

Q m / , d mg 9000 unidades

MoJ. 71 · 20.000 t«. - 70/00 20 25 30 35 A reacção realiza-se num vaso de um litro equipado com um distribuidor de ar e agitador suave- Utiliza—se condiçEíes estéreis para evitar a desactivação da enzima por contaminação do micróbios. A reacção efectua-se a 4S2C para minimizar a desactivação da qalactose—oxidase. D i s solve-se me t i1-be ta-D-g a1a c to pi ran ós i d o (81) no tampão de fosfato arejado.. 0 caudal volumétrico do ar descarregado pelo arejador é regulado para se obter uma solução saturada com oxigénio, enquanto se evita a formação de espuma na solução.. A 42C, adicionam-se galactose—oxidase e cai a 1 a s e e a r e j a -se a s o 1 ução dur a n t e vin t e h o r a s.. As enzimas são separadas da solução obtida como produto por ultrafi.1 tração usando uma membrana de 10.000 IjWOO (Diaflo 13242, fabricada por Arnicon).. 0 filtrado resultante contém o produto de oxidação, rnetil—beta—D— galacto-hexo—dialo-1, 5-piranósido ( (2) ., ->

Condensação do produto da oxidação com aldeído fórmi— co para obtenção de meti1—5—C-hidroximeti1—alfa—L— -arabino—hexaoiranósido (3) 21

Case :4491 X

Reaaentes 90ÍM · >· § 3

Soluçao 'í::i.ltrad<a contendo o pro— 15 dato de o x :i. d a çao da 'fase 1 metil B X- D—q a 1 a c to— he x ad i a 1 d o-15- p i — ranósido So.LuçaO (aquosa) a 37".: de aldeído fórmi co 20 Soluça o (aquosa) a 50“.: de hidróxido de sódi o

Quantidade 400 ml 400 m 1 144 ml 25 30

Combina—se a solução -filtrada proveniente d a operação 1 com a soluçSo de aldeído -fórmico num vaso de um litro.. Adiciona-se a solução cie hidróxido de sódio A solu— Cao do f i 1 trado/aldeído 'fórmi co durante? o intervalo de? tempo de uma hora enquanto se mantém a temperatura da solução compreendida entre 20 e 25Í3C com banho de qelo— água- Depois de a reacçJo exotérmica ter terminado,, retira-se o banho cie qelo-água e aqita-se a mistura reaccional A temperatura ambiente durante dezasseis horas. Aquece-se a mistura reacc.i.ona 1 a 55QC e desioni za—se utilizando colunas cie permuta de :i.ues r. primeiro, com Amberlite IR—120 ((1--1+)., •·ϊ'·ϊ -ii. /.i. 35

Case :4491 X depois com Am lie i" !. i. to .[ RA.....100 ( 0H ) ,, meneio ambos os en c: li i. men tos fabr i caci os por Rohm ‘k lia·::/. i··.... i * ·...« i "fim, a v:í 1 u ç* des i on .!. cada do produto é elulcía -:V·. través de uma co.!. Lin con i:.endo resina permutadora de :i.Ses de Amberl :i. te IRA—400 í 1--180.-=-) para remover o aldeído fórmico restante A evaporação lenia à temperatura ambiente até à secura., sequyida de secagem do resíduo a temperatura ambiente sob vácuo d u i" a n t e a π o i t e o r i q :í. n a 18 ,, 5 q r a m a s ( S 0 ) d o pro d u t ο ι o ) ..

EXEMPLO II 10

Preparação de 1,6—anidro-5-C—hidroximeti1-beta-L—altropira- nose Μοϋ. ?| · 20.000 ί«. · MJ0Í

25 D:i.ssolve-se meti 1 -.1--0-11 :i. d rox ime t:i. 1-alT a-L- a r a li i η o — h e x a p i r a η o s e ( 3 ) ( 5 9 g r a m a s.. 0 2 6 3 m o .1. e ) e m À c i d o sulfúri co 0,70 11 (260 ml) e agita—se a 1009C durante noventa minutos.. Arrefece-se a solução até à temperatura ambien — t e e n e u t r a l:i. z a - s e u t :i. 1 i z a n d o u m a r e s :i. n a p e r m u t a d o r a cl e 30 i?.5es (Amberl :i. te IRA—400 (0H-)- Separa—se a resina por filtração e aquece-se o filtrado a refluxo durante quinze minutos com carvão aetivaclo (4,0 (gramas).. Separa-se o carvao por melo de um filtro de fibra de vidro e evapora-se o -fi 1 trado a té à secura com etanol „ Aquece-se a refluxo o 35

Case:4491 X !" ! s :í. d uo branco com a i"or ma d ο oo r a duran ír. <-» í.i u :i. π ;;; o io:i. nu too COlll ίΠΘ Ι'.ί'.ποί í. -jO íli i. .. I -I. - |— ":1 ·:Ϊ1 l-? B O i. U C. IaCí d U I'· -.:111"I Ί.'. 0 ,Yl rtoi ts a. Q9.C .· F.i. I tra'"se o produto para ís obterem 20 aramas (39.,611) do 1 ,, 6-an:i.d ro-a-C-hid rox imo t.:i. i-hota-L-ai tropi ranoso (4) ..

Poivfco do fusSío -WJ=3 = +145.1

D 166,5 - 168,5I2C.. (<:: 7 ,,2 em água)

EXEMPLO III 10 Preparação de 5—C-acetpximeti 1— 1.2,3,, 4,6-pen ta—0— aceti 1 —L-arabino—hexapiranose (6)

Mo J. ?l 20.000 «». · wjoa

35 1 5 10 15

Mo J. ?l · 20.000 c«. · W/08 20 25 30

Case :4491 X

h temperatura am b j. an v.e dur-sirte Irei·; horas,, a qt a - s e urn a s o 1. u ç '&<::> d e 1. ., o -· --ι n :i. d r o — 3 -· ι Z — i'i :i. d r o x :i. m (·:·: t :i. J. -- b e t a—i... — .1. t'.piran000 bru ta (4) (1.0 oramos,, 32 mi I :i.moles 1 nuiπίολ íii :i. s tu r a de a n :í. d r :i. d o acético (100 m 1) e pi r :i. diria (100 ml).. Despeja-se a mistura reaccional em água com cjeio (300 rnl) e ex t ra i -se o p roduto com cl o re to d e rne t i 1 eη o ( 300 m 1 ) .. Lava-se a fase orqanica com HC1 1 molar (3 x 400 ml)., bicarbonato de sódio (300 ml) e água (300 ml). A e v a p oraçSo d o disso 1 v e n t e o r i q :i. n a 19 g ramas do? 3—C—aco? tox ime t1-1., 6~an id ro-2,, 3— tri~0~acet i l~beta— L - a 1t r o p i r a η o se b r u t a ( 3) ., que,, se m s o f r e r q u a 1. c| u e r p o s t e— rior purificação, é dissolvida em anidrido acético (300 ml) e a soluçiVo é arrefecida a □ - 32C. Enquanto se man t.ém esta temperatura,, adiciona-se lentamente ácido sulfúri co (30 gramas) .. Depois» de se ter completado a adiç/áo., retira-se o banho de gelo e agita-se a solução á temperatura ambiente durante duas horas» Nesse mornento, o ensaio de cromatografia em camada fina (placas de Analtech GF„ tolue— no :: cetona, 2 :: 1) mostra a presença de um produto único principal com uma pequena quantidade de impurezas mais polares,. Destrói-se o excesso de anidrido acético por adiçao lenta de áciua (43 ml) com arrefecimento a temperaturas inferiores a 30Í2C. Subdivide—se a soluçáVo resul tan te entre cloreto de meti leno (300 ml) e solução aquosa de bicarbonato de sódio (300 ml)., lava-se a fase orgânica repetidamente com bicarbonato de sódio (3 x 300 ml) e água (300 ml).. A evaporaçòVo do dissolvente origina 1.7,,0 gramas (70-·.: de rendimento) de (6) .. i:®n 2Ó..2 » -+-39.,3° (C 8.3 em CHCI3) .. D Análise calculada para Ci»H=4>013 :: C 49.,33¾ l-l 3,,37 Valores determinados :: C 49,,16:: l-l 3.,60 ·’ x“i v.‘ 35

Case :6491 X

EXEMPLO IV Síntese de 5-C-acetáxi-metil— 1 — f lúor—2,o,4,6-tetra—Q—ace— ti 1-L-arabino—hexopiranose (7)

Dissolve-se 1 ., 2., 3,, 46,6' -hexa-O-acetil-5-C-h i d r o x :i. m e t i 1 — a 11 a / b e t a—L-arabino-hex a pira η o s e ( 7 d q r a mas) em complexo de HF—p:i. ri d ina •frio (020) (200 gramas) » Retira-se o banho de arrefecimento e continua-se a aqitaçãb até que a anAlise do? croma toq r afia em camada fina mostra o completo clesaparecimen tot do material de? partida (cerca de? tr@s a quatro horas) Dilui-se a mistura reaccional com cloreto de meti leno (1,5 li tros) e lava-se a solução com solução aquosa saturada de Nal-ICO.3 (2 x 300 m.l.) e com sal moura (300 rnl ) .. Seca-se a solução sobro? Wa^SO», filtra-se e concentram-se os d i sso 1 ven tes até cerca de '500 ml.. Em seguida,, ad:i.c:iona-se trietilamina (22 mi) e anidrido acético (115 ml)., seguidos de 4-d í me ti lamino-pi r id in a (150 mq) e agita—sce a mistura á temperatura ambiente durante cerca de? uma hora- Em seguida., dilui-se a mistura -com cloreto de meti leno (1 litro)., lava-se com solução aquosa saturada cie HaHCOrs (2 x 300 ml) e salmoura (300 ml ) seca-se sobre l'la=30« <:? f:i. 1 tra—se.. EI :i. minam—se os dissolventes in v<y.::uo * cr is tal :i. za-se o produto bruto (etanol > para se obter 5-C— acetox i me ti 1 -l-f i úor-2., 3., 4, ώ—te trace ti 1-L -arab ino — hexapi ra—

I Case:4491 X

EXEMPLO V

Diosqenina-5-C-aceto>:imeti 1—2,5,4. ά— tetra—Q-aceti 1—beta—D— arabinp-hexopiranúsido (?)

MoJ. ΊI · 20.000 ί«. yo/oa 20 25 30 35

OH 1 5 10 15 BOfPé 20 25

Case :4491 X / Λ ι.ι.ιτι-.:ΐ solução fr:i.a (090 de '5-(>cetox :i. me-!.·. :i.1 — 2 „ 3 ,, 6 — te t r a co to; x :i. - !. -f 1 úo r—i... -ara b .i. n o — he x o p i. rari ósid o 02,,7 ramas > e tri i n t :i. ]. --s :i. I :i. ].-dosgen :i. η a ( Íj gramas) ern 2 -d i c ioro—etano ('300 m.l.) isento de água adiciona-se complexo de BF3 Et30 (17.,5 ml ) .. Retira-se o banho de arrefecimento e ag:i.ta-se a mistura durante uma hora™ depois do que a análise de cromatoqrafia em camada fina mostra o complexo desaparecimento do fluoreto.. Dilui-se a mistura reaccional com cloreto de meti leno (300 ml), transfere—se para uma ampola de decanta çá o e lava—se com soluçíío aquosa saturada de Mal-lOO» (2 x 100 ml) e com salmoura (100 ml).. Seca-se a soluçáo sobre !Ίλ=30λ,, riltra-se e concentra-se o dissolvente até se obter um volume de cerca de 100 ml.. Adiciona-se entíVo trietilamina (4 ml) e anidrido acético (2.. 5 ml) ., seguidos de 4-d i meti lamino-pirid iria (10 mg) e agita-se a mistura á temperatura ambiente durante cerca de uma hora- Em seguida., dilui-se a mistura com cloreto de meti leno (200 ml).. lava-se com soluçáo aquosa saturada de WaHC03 (2 x 100 ml) e com salmoura (100 ml)., seca-se sobre Na=30e e filtra-se.. Em seguida., elimina—se os dissolventes em vácuo e purifica-se o produto bruto por cromatoq raf ia em gel cie sílica para se obter diosgen ina—5—C-acetóxi—meti 1-2,3,4 ™6—tetra—Q—acetil— beta-Darabino—hexapiranósido (11-8 gramas) sob a forma de s ó 1 i d o b r a n c o ..

Hidrólise oara obtenção de diosaenina—5—C—hidróxi—meti1— beta—D—arabino—hexapiranósido

Suspende-se este produto em metanol (400 ml) e a d i c i o n a - s e m e t ó x i d o d e s ó d i o (2 m 1 d e u m a s o 1. u ç 3fo a 2 5 "» em metanol),. Depois de se agitar durante vinte horas á temperatura ambiente,, filtra-se a mistura e lava-se cuidado s a m e n t e com metanol. Neutra1i za—se as 1ix1vias de 1 avagem metanol, i cas depois de combinadas com Amber 1 :i. teR IE--120 e 35

I

I

Case :4491 X ·.·:···· r. oo r .v -so o cisso !.^en to::.. Ccdibinam.....:::e os s6 1. :.-::1os ::om <:: r i. i-;·.ι ί ” :· ::·.·: :·......-ο :··ιί /ácuo <;:·.r ··. ob roro"; 3,32 ciraínas d'.·:; • i 1 osq en :.10,-5-3 ··;··,j. ι ii ri ···'·:;,,·> i\a —0—a ra í::·;. no - hexaiyir a. nos i.do

EXEMPLO VI 5 10 15

BOfM § 3 20 25 Síntese de diosqenina-5—C—hidroximeti1—L-arabino-hexapira-násido

30

Misturou-se 23 ., 4, ó—tet.raceti 1—5-C-acetoxi — meti 1--:1. -bromo-L-arabino-hexapi ranósido , preparado a parti r d e p er-0 - a c e t. i 1 — 5—C - h i clro x i — 1 n e 111 - L - a r a ia in (.a— h e x a p i r a n ó s i d o (13 aramas) de acordo com o método corrente., com d iosgen ina (12.,3 çramas) ,, cianeto mercúrio (14.,5 gramas) em í. ,,2-di cio— ro—elano (250 ml) isento de água, a 502C durante vinte horas.. Lavou—se a mistura reaccional sucessivamente com agua (1 .. 000 mi), solução aquosa a :1.02 de hidreío de sódio 29 35

Case :4491 X V.' ml;., soIucXo tií"= :;í <ϊ· “latur-scla cie bicarbonato de sódio (200 m i.) e agua (200 mi.;. Lm íeçm:i. da secou.....se a fase orciãnicd s evaporou—se.. Purif:i.cou-se o resíduo bruto e b:i.d i/-o.'l. :i.5ou -se como se descreveu no Exemplo '·/..

Avaliacao como agentes hipocolesterolémicos

Compararam-se quatro materiais utilizando celulose como controlo negativo e colesteramina como controlo positivo. As saponinas ensaiadas foram diosqenina-qalactósido (DG ) , d iosgen ina-5-C-hid rox imeti I-L-arabino— hexapiranósido (DI-IG), coIestero.L-galactósido (CG) e 5-C-hid rox i me t i1-a ra bi n o-hexap i ran ôs i d o-co1este ro1 (CHG).

Dieta 15

Mod. ?l - Μ.000 »«. · WiOa A dieta de base consistiu em 0,2¾ (em peso/— peso) de colesterol (Byron Chemical Co.., Lonq Island City, NY, Estados Unidos da América), misturado com uma mistura c o n t e n d o 10d e g ordu r a d e comi d a mo í d a ( Μ1II - 0 7 ) , pr e p a r a d a 20 por Research Diets., In Utilizaram-se resina de coleste— ramina (Sigma ChernicalCo.) e celulose micro cristalina Avicel PH—101 (FTIC Corp.). A concentração final de cada um dos produtos de ensaio das dietas era igual a 0,75¾ em peso. 25

Animais e Concepção do Estudo 30

Cricetos "hamsters" do sexo masculino da espécie Golden Syrian com cerca de sessenta dias de idade (90 a 100 gramas) foram obtidos em Charles River Breedinq Laboratories, Wil.nington, HA, estados Unidos da América.. 0s animais foram guardados aos pares em gaiolas de plÁsstico com o fundo elevado paira evitar a coprof aqia.. Depois da chegada, os animais foram alimentados com uma comida comer— 30 35 1 o 10 15

Mod. /1 2Q.UQ0 o<. W/Od 20 25 30 35

Case :4491 X

,|. iiu::·:i'.<:fa (Pur:i.n-¾ Roden t Laboratory Chow NQ„ 500:1. ) e foram .··: ·..ri.·* l· :·,,·Λ ·ciclo -Je J.u:; de doze horas .i.n( Lu.z •Jau 12::30 p..m.. ;\s 12::30 a.. m.. Os animais foram distri buído·:::. aleatoriamen te por seis grupos de estudo com o:i. to an ima :i.s cada um e foram colocados em dietas de ensaio.. Um animal do grupo de ensaio de DG foi subsequentemente utilizado para estudo.. Reqistou--se o consumo de alimentos e de áqua e os pesos corporais pelo menos duas vezes por semana durante a real:i.zaç«ío do estudo.. A aleatorizaçao designou duas datas .> sucessivas de inicio (sete a oito dias de adaptaçao ao local) e datas de necropsia.. In i ciou-se a recolha das fezes durante sete dias depois de dois dias a seguir ao inicio das dietas de ensaio- Depois de catorze dias do? dieta, os ericetos foram individualmente anestesiados por ordem aleatória numa camara de dióxido do? carbono?, Recolheu—se sangue da veia cava para realizar ensaios d os teores dos 11 pidos do sangue.. Estas amostras de sangue foram comserva-das em f rigor ifi oos durante η '3 o ma is de uma hora antes de se isolar o plasma.. Isolou-se o plasma por centr.ifugaçã'o em o o n d i ç Gfe s mu:i. t o f r :i. a s „ Determinação dos Lipidos do Plasma o co les ter o 1 η o plasma e o ) e o t.r i q 1 i cé r i d o do plasma g 1 .i ce rol 1 ivr 0? ) por ensaios U Π J. i s ado r de q u .1 m:i. ca cl In :i. ca Cal CU lou -se o co lesterol de η'ίίο—Η.ΌΙ... po r d i fe ren ça .. Determinação do Esterol Neutro na Fezes Momogeneizaram-se aos fazes recolhidas acumuladas durante sete dias em cada gaiola em áqua fria por meio de dum homogeneizador Polytron., congelou-se., liofili — 31 10 15"

Múd. 71 20.0UQ o». 90/M 20 25 30

Case:4491 X

λ ;;···:·; e puiverríou-Sê. A seaui.r λ ex traccSo com cloroTór- iii i.,.j :: metanol. no. d io::uío rooC;;, de 2 :ί. (Soxhlet)·, recuperAram- se os líoicloíii da fase elorofèrmi casecaram-se até peso constan te e em seguida red issoiveram—se em clorofórmio.. Repicaram--se alíquotas dos extractos com 5—alfa—colestarto (padróYo interno) e secaram-se sob atmosfera de azoto. Transformaram—se os os te ró:i. s em derivados de éter trimet.il-silílico (TI1S) (Syion BTZ., Suelco,, Bellefonte, pA., Estados Unidos da América) e quantificaram—se por GC/FID. Confirmou— se a identificação do colesterol,, do coprostanol e da diosgenina nos extractos das fazes por espectrometria de massa. A coprostanona foi um metaból i t.o mínimo do colesterol con si s ten temen te e por tan to ná'o f oi quan tif i cado.. A excreçíto de este?rol neutro total portanto refere-se á soma de coles terol das fezes e cio? coprostanol „Análises Estatísticas R e a i i z a r a m - s e a η á 1 i s e s est a t í s t i c a s u t i 1 i -zando sof tware SAS» Os dados foram analisados como bloco completo aleatório usando o dia cia necropsia como um fautor de bloqueio. 0 ensaio da diferença mínima significativa de I-isc:her (I...3D) foi empregado para comparaçfóes múltiplas quando se observaram efeitos do tratamento significativos (alfa - 0,,05)„ As reiaçílíes estrutura da saponina/actividade foram exploradas por análise de duas vias de variância (dxosqenina-saponIna em comparação com colesterol-saponina e hidrox imet:i. 1—saponina em comparação com saponina). Gs i'· e s u .1. t a d os :j. n g a g o no <=. Q u a d r o s s á'o e x p r e s s o s c o m o v a .1. o r médio 2 desvio padrSo.Resultados Em todos os tratamentos, os cri cotos tinham uma aparência saudável e ganharam peso. M3.'o houve diferen — 35 1 1 5 10 (

Case:4491 X -:¾;"i O COnSUittO de :.!. !Í.ιΙΗν/ΙΊ 1'.Ο3 OU.de f:i. c:i. i-Sncia de al imen taçab nos cAr foί. .i.qual ώ00 mq/kg/dia.. G teor do colesterai do d Ias ma foi sci n :i. f :i. -caLivamenle menor em todos os quatro grupos tratados con sapon inas rei ativa mente a ambos os controlos (Quadro I ) .. Enquanto o tratamento com colestiramina baixou significativamente os níveis de colesterol no plasma em 12¾ em compa-raiyío com a celulose., o efeito das saponinas fo:i. maior., estando compreendido entre 31.,6¾ do? diminuição (para CG) e 57¾ (para DHG)., D DI-IG foi ma is efectivo do que todos os outros tratamen tos» na diminuiç«ío do colesterol do plasma e de n«fo HDLCHG foi mais eficaz do que CG» CG era a saponi-na rnenos ef i caz .. 15 moj. η 20.000 «*. - w/oa 20 25 30

As saponinas aumentaram siçinifi cativamente a excreção dos esteróis neutros derivados de colesterol nas fezes, enquanto a colestiramina . nuo teve qualquer efeito sobre a excreção doe? s te rol rela ti vamen te A celulose (Quadro 2)., G DHG causou uma excreçíto de colesterol significa— tivamente maior em comparação com todos os outros qrupos de tratamento.. A excreçAo total neutra de esterol era direc-cionalmente maior com DHG relativamente a DG, embora a diferença nao atingisse sicinif i cSncia estatística. Estudou-se a estabilidade conferida A liga— çao qlicosídica pela presença do grupo 5—hidróxi—meti lo no açúcar medindo a diosgenina livre nas fezes» A quantidade de d.iosqenina livre foi determinada nas preparaçSes de saponina e nos sxtractos de lípidos neutros das fezes provenientes de todos os qrupos de tratamento- ΙΊΆ'ο se detectou diosqenina livre nas preparações de saponina que foram incorporadas nas dietas.. A absorçâ'o de saponina foi calculada a parti r do consumo de comida,, A hidrólise aparente ÍIL...E.Í.E.G foi enCAo calculada dividindo a excreção molar da d iosgen ina livre das fezes pela absorçSfo molar ¢:1 e s a p o n :i. n a ,. C o m e x ce p ç 3íb d o s q u a t r o ex t r a c t. o s d a s f e z e s d o

35 ·. j \J 1 5 10 15

Moii. 71 20.000 «λ. - W/Oâ 20 25 30 35

Case :4491 X

qrupo de Dl [/.' e de ί,ι.ιΐι ex tructo ido ci ri. ujo de a nο η ι η a d o» i-" ;i. v a t i --·- zadâ., as a ::?i) o en í\>::õe;:;. de dl osqo»n:i . n a η o s e ;í t r a c 't o s e s t a v a i n abaixo da t::ur '·./ ^'4 d O „ A analiso» c ::om pio» ta cio varrimentCÍ do espectro,, < Cl· etsrm :i. naq IVo da purezc: i posi tiva dos picos cie d i osgen i na d a fazes si ó -foram pos:: iivei s p a r a o s e x t r a c t o s das fezes do ci ru po de DG, Supondo que . as pequenas concen- trações de diosgenina encontradas nas tres saponinas dife— rentes de D(3 representam diosgenina e s3To rigorosas e usando o va.lor médio da excreçSVo de diosgenina observado nos grupos de CG e de CHG corno linha de base., a hidrólise aparente in_ vivo foi em média igual a 12.,5--.1 para I)G e?m cornparaç;ã'o com 0,5"; para D HG - Pela análise de duas vias de variância, verificou-se que as 5-C-hidroximetil-saponinas foram siqni-ficativamente mais eficazes do que as saponinas nSo derivati zadas para baixar o colesterol do plasma Cp < 0,0001) e colesterol de n'áo—l-IDL (p < 0.,002), As saponinas contendo diosgenina foram também mais eficazes do que as saponinas contendo colesterol, A superior estabilidade da 1 :i.qaç'á'o d 1 :i. cos í d i ca con fe r i d a pe 1 o q ru po 5-C··- In i d ro :< i me t i 1 o pod i a razoavelmente supor-se que contribuísse para o superior c ompor t a me n t o d a d i o s q e n :i. η a—s a p o n i n a e m com p a r a c 3To com c o 1 e s t. e r o 1 - s a p o n i n a d evido a o f a c t a d e a h i d r ó 1 i s e d e C (3 devei'- libertar coles terol,

Em conclusão, as 5—C—hidroximeti1 apresen taram superior eficácia em comparaçâTo com nas correspondentes n,ío derivati zadasCom base •“Cfes da diosgenina livre nas fezes, o grupo 5--C— —saponinas as saponinas medi — h :i.d roxime- 111 o m e .1. hor a s u b s t a n c i a 1 m e n t e a e s t a b :i. 1 i d a d e d a 1 i q a ç á'o g .1. i cosi d :i. ca , Esta (estabilidade aumentada tem como resultado a descoberta da eficácia superior das saponinas derivatiza das

3 A

Case:449L X Lípidoa do Plasma

m CM vO <r i—J CM CM i—l <r Ξ + 1 + 1 + 1 + o Γ- vo CM CM cn cn O <T CM t—< 1—1 \JD co un í—4 Ό ec >1 + 1 + 1 + 1 + £-1 CT3 co <r <r CM O o r—4 cr» \Q CM r—4 r-^ o \D t—4 σ\ cn o + 1 + 1 + 1 + km « u <T LT\ CM cn <r co 1-^ Γ—4 1—4 to co <T i—1 CT\ <r + 1 + 1 + 1 + o o CM o CM r—4 vO O <r p—4 i—4 <r <T r** cn o + 1 + 1 + 1 + Q CM vO o LT> o CM r-*- O 1—* CO CM r—< to CM 1—4 O Q + 1 + 1 + 1 + LO <T r-» cn CM <r CO CM r—4 i—4 /—N /—N iJ o T3 Q 00 /—s 00 £ \ s Ό J S—' Ό cn O 00 \ o 1 £ 00 <u r J S^· £ > ca Q V_' scc £ cn a *H cn 1 00 U ca c hJ •H ca r“4 o a u > Cl, 2: CS H 35 1 ..1 5 10 15

3 S § s o 20 25 30

Case :4491 X

O G * * \0 O vO CM co r-» o ·* •k .. o O i-h O o O o + l + l + 1 + 1 + 1 + 1 <r <r CM >- o o LA ·. - *> uo 1-H co o H i-H *-H O * * CM O co o r-. vO t-H a •s ·» ·» o 1—H r-H co -cr O + l H + 1 + 1 + 1 + 1 03 co OS CM CM <r LA Λ - « r-H CM co vO - H ^H t-H »-H o * * co co CM co <r O o O «s «s •s «» o o O t-H t-H O -H + l + 1 + 1 + 1 + 1 CM in o \o 03 o \Q CM - vO a CM CO CTv - r-H t—H T-H o

01 o 03 •iH <u > 'CO u cO > i—H O CM trs irs T-H vO •k * «k o O O t-H t-H O + 1 + 1 + 1 + 1 +1 + 1 CO t-H ao CM o co ir\ ** 00 - CM <r Os <r - 1-H t-H t—H uo * * <T \Q CO CO r-- co O o «·* ·» -> «*« O O O O t-H o + 1 + l + 1 + 1 +1 + 1 i-H . ca ca co o i-H -o* ~ CM co ca O CO •O i-H o * * os co CM co ca CO <r O O o o O o O + 1 + l + 1 + 1 + 1 + 1 Γ*- ca o o H u~\ lt\ - 1—» co ca i“H CO - ι—H O 1 cu I CD O 1 1 1 03 u cm la *M •H CU CO -rH '-N. m la rH ÇJ Ό la 03 o Μ O O 3 O •rH Cl CO 03 Ο μ rH X-) CU CO u O "» Ό 03 C 0) O cu C OO'-' c u o oo Q. CO U U O £ cu •H CU .__' .—V 03 Μ -M CU -H r-H ’—' *H c QO*—\ CT3 CO O 03 la XJ S-i O X) <u S CO 03 -H Ό vm v ο o co α la f—l — 00^ -M O 03 Ί0 •Η O la—. ^ (U ^ (13 CU O CQ U N-v ano o. ao co h oo n Μ Μ M O cu ^ cu 0) O SH (13 CU O s -H O g -Μ 03 O 03 *H u o cu c-ι i_> iJ N 03 O wO «MO Q > XJ * Para uma caixa do grupo de DG, as medições por dia baseiam-se em dez cricetos por dias em com paração com catorze para todas as outras caixas dos animais.** Estes valores para a diosgenina são estimados visto aue os seus valores são inferiores à curva padrão. 36 35

Case :4491 X

Nos Quadros I e II, utilizam-se as seguintes abreviaturas CSTYR = colestiramina CELL = celulose DG = diosgenina-galactósio DHG = diosgenina-5-C-hidroximetil-L-arabino-hexapiranósido CG = colesterol-galactósio CHG =* colesterol-5-C-hidroximetil-L-arabino-hexapiranósido

Lisboa-,;-! m.fflZ

Por, THE PROCTER & GAMBLE COMPANY

Oficiei

Industriei

Cartérl* - Arca 4· C*nc«lç*·, 3, I4HU 37

Claims (1)

1. 5 ÍO 15 Mod. ?ι ao.ooo ««. - w;oa 20 25 30 65.343Case :4491 X -DESCRIÇÃO-REI V INDICAÇÕES X«J. — Processo oara a oreparacíío de derivados de 5—C~hidroximetiI—hexose de esteróis., caracterizado por compreender as operaçííes que consistem em (1) acilar-se uma 5—C-hidroximetil-hexose segundo um método de acilaçao em duas fases que compreende (a) a reaccSTo de um anídrido de ácido com a referida hexose na presença de uma base, em que preferivelmente o mencionado anidrido do? ácido é um anidrido de ácido carboxílico que tem 2 a 6 átomos do? carbono; (b) a reacçãto do produto obtido na fase (a) com um anidrido de ácido e uma quantidade catalítica de um ácido forte para se formar um derivado hexa-c.ilado de hexose; e (2) preparai-—se o derivado —fluorado da 5—C—hidroximetil— “hexose he.xac.i,lada fazendo reagir a hexose acilada com x'<(o fluoreto na presença de eterato de trifluore— to de boro;: e C 3) f a 7. e i— s e r e a q i r o p r o d u t o o b t i d o n a f a s e ( 2 ) c o m u m o? s t e rol, 2.<3, - Processo de acordo com a reivind :i. caç«ío 1., c a I- a c t e r i z a d o p o r o s q r u p o s acilo s e r ra m s u b s t a η o i a I men t e h:i.d rol isados usan d o um catalisador de alcoolato de metal a 1 ca 1 :i. η o 3*3- - Processo de acordo com a reivind i caçuío 1 ou 2, caracterizado por a citada base» soer pirídina e o referido ácido sei- escolhido do grupo formado por' ácido su I f tlr í co , ácido fosfórico e ácido trif luor o metanos sulfón ίο: o '••ísí— Processo de acordo com a rei vinoli caç«ío 1 .. 2 ou 3, caracteri zado por em primeiro lugar se transfor- 1 35 1 5 10 15 MoJ. 7| - 20.000 c«. - W/0fl 20 25 30 Caseí4491 X 1.1991 mar o estero !. no der::.vaco d vi* í* r io f*>? í':!. -í i :i. L s .. a ai.. *"* i"’:~ o c e s O d O Γ d O ο 1 o !' e ;i. v :i. n dc a çV5 c 4., oarac leri zado cor se es -·'-···- ner a b-G - h :i. c! r o :* i m e t :i. 1 — h e x o s e do grupo que consiste em de rivados de 5 C — 1’i :i. d i" o x i m e t i i. o d e q a .1. a c i o s e., ·::ι i. u cose.. man ose, frutose, so ' b o ··::· o., e t a q a t o s e e o m e n c i o n a d o esterrol ser escolhido do q rupo que con s :i. ste em co1estero 1. diosqenina., si tosterol, e rq os te ro 1 ., cain pes— t e r o 1e s t i q m a s t a η o 1 e t i q o q e n i n a .. óí?. - -- Processo Dar a a preparação cie derivados de 5-C-hidroximetil-hexose de esteróis, caracterizado por compreender as operaçBes que consistem em (1) acilar-se urna 5—C—hidroximetil—hexose segundo um método de acilaç^o em duas fases que compreende (a) a reaccâta de um anidrido de ácido com a citada hexose na presneça de uma base em que preferivelmente o referido anidrido de ácido é um anidrido de ácido carboxílico que tem 2 a 6 Átomos de carbono; e (b) a reacçíVo do produto obtido na fase (a) com um anidrido de ácido e uma quantidade catalítica de um ácido forte para se formar um derivado de hexose hexacilada:; e (2) preparar-se o derivado 1-bromado da S-C-hidroximeti1--hexose hexacilada fazendo reagir a hexose acilada com o iao brometo na presença de ácido acético:; e (3) fazer-se reagir o produto obtido na fase (2) com um esterol na presença de cianeto de mercúrio,. 7:¾.. ··· Processo de acordo com a reivindicação ó, caracterizado por os grupos a ei.Lo serem subsequen temente hidrolisados usando um catalisador de álcoolato de metal al ca 1 ino .. B.é.. — Processo de acordo comi a re:i. v:i.nd i caç«ío á ou /., caracterzado por a mencionada base ser .oxridina e o citado ácido ser escolhido do grupo formado por ácido su 1 íúri co., ácido tosfór::. o o e á ci do t r:i. f 1 uorome tanossu 1 f ón i — 2 35 \ 5 10 15 Case:4491 X 90ÍM ·*· 000 re · U P"VV 20 25 30 VíA. -· ProceSSO ΟΛΓΑ Ά DFSíiíràCdO ‘.1C: d 0 Γ1V A " dos do S—C—hidr'ox imeti 1. hcíiosf? de eisteró.i.3„ caracterizadc por compreeiidef as operacffes que consistem em (;i. 'i (jcilar-se uma 5—C—h:i.d rox :i.met:i. I ~h<·:?xos© segundo um método de aci laçao em duas fases que compreende (a) a reacçíío de anidrido Acido com a referida hexose na presença de uma base:; © (b) a reacçIXo do produto da fase (a) com um anidrido de ácido e uma quantidade catalítica de um Acido forte5 e (2) fazer-se reagir a hexose acilada com um esterol sob condiçffes anidras na presença de trimeti .Lsi 1 iI tri f 1 uormetan ossuIfon ato. lOà. - Processo de acordo com as reivindica— çífes anteriores, caracteri zado por se obter esterol-S-C-acilox imeti 1-2., 3 ,4, 6~ te t ra ci 1-a rabino— hexopiranósi dos. llâ„ - Processo de acordo com as reivindicações anteriores, caracterizado por se obter, d:i.osqenina-5— —C- h .i. d r o x ;i. me t i 1 —a rabi n o— hexooir an ósi d o ou t. i g og en i n a- 5—ΟΙ"» i d rox imeti1—arabino—hexapiranõsido ou colesterol —5-C— h i d ro x i met i1—ara b i no— he x a puranósido. 12£. - Processo de acordo com as reivindicações anteriores, caracterizado por se obter haloqeno—5—C— a c i 1 o x i me t .i 1 —2,3,4,6— te t r a c i 1 -a r a b i n o— he x o p .i r an ós i dos, · em que preferivelmente o haloqéneo é bromo ou flúor. :l3â- - Processo de acordo com as reivindicações anteriores, caracteri zado por se obterem derivados de 5—C—hidroximeti 1 —hexose de esteróis. 14â. - Composto de acordo com a reivindicação .13, caracterizado por o grupo de hexose ser escolhido do grupo que consiste nos isómeros I) ou L de qalactose, glucose, manose, frutas,?, sorbose e tagatose em que prefe— ri velmen te o grupo qalactose é α.Λ^Λ<τΙ·.ο—pi ranose e qa.lajrto— furanos, mencionado esterol ser escolhido do grupo que 3 35 Case :4491 X consiste · μιί r<: ro.....astc.nóx :: diosaeniria,, co.Ísírvhsrn.L , oí to-· 1 os terol „ erqoesteroi. campes te ro.!. sst xçmas tero.'i. „ tiaocen i — r*tii ácido o.lenó:i. ca sapouenóis de ·,·;ο ι λ proíc-ascitienifia,, p r o t o p a r a x a d :i. ú :i. s e p r o t o p a n a x a d :i. ó i s :l. 5â - -· Composto de acordo com as reivindica-^ ç <je s 13 ou 14 „ c a r a c t e r i z a d o p o r a c :i. t a d a hexo s e s e r 5 - C -h :L d ro x i rne t i 1 -L--a r a b :i. n o— he x o p i ran ós :i. d o e o refe r i d o es te ro I ser d iosqen .i.na ,, ti qoqenina ou colesterol. Mod. /1 20.DOO «. · wjoa

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