PT101040B

PT101040B - Vector seguro para a terapia com genes

Info

Publication number: PT101040B
Application number: PT101040A
Authority: PT
Inventors: Arun Srivastava
Original assignee: Res Corp Technologies Inc
Priority date: 1991-11-08
Filing date: 1992-11-06
Publication date: 2003-06-30
Also published as: IL103677A0; DE69232983T2; EP0566732A1; US5252479A; CA2098483A1; AU657829B2; WO1993009239A1; EP0566732B1; PT101040A; KR930703453A; JP2003174896A; AU3134093A; ES2192555T3; DE69232983D1; JPH06504680A; ATE236263T1; CA2098483C; DK0566732T3

Description

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A terapia com genes envolve a transferência e inserção estável de nova informação genética nas células. 0 presente invento é dirigido a um vector seguro para a terapia com genes e proporciona vectores híbridos de parvovírus que sejam capazes de integração específica de sítio num cromossoma de mamífero sem citotoxicidade substancial e que possam dirigir a expressão específica de célula de um produto de um gene com interesse. Os vectores híbridos são úteis na terapia com genes, particularmente no tratamento de hemoglobinopatias. É também proporcionado um método de libertação de um produto farmacêutico. 0 presente invento também proporciona um método para conferir resistência a várias drogas específica de sítio. 0 tratamento terapêutico de doenças e perturbações por terapia com genes envolve a tranasferência e inserção estável de nova informação genética nas células. A correcção de um defeito genético por reintrodução do alelo normal de um gene codificador da função pretendida demonstrou que este conceito é clinicamente praticável [Rosenberg et al. (1990) New Eng. J. Med. 323. 570].

As células de suporte hematopoiéticas ou células progenitoras pluripotentes são particularmente úteis para os estudos de terapias com genes uma vez que, apesar de serem células somáticas, elas diferenciam-se para produzir todas as linhagens de células do sangue. Portanto, a introdução de um gene estranho numa célula de suporte ou progenitora resulta na produção de várias linhagens que podem potencialmente expressar o gene estranho ou alterar o controle dos produtos dos genes nativos. A introdução de um gene estranho numa célula progenitora ou noutra célula qualquer adequada requere um método de transferência de genes para integrar o gene estranho no genoma celular. Se bem que tenha sido desenvolvida uma variedade de métodos físicos e químicos para a introdução de DNA exógeno em células 3

eucarióticas, os vírus provaram ser de uma maneira geral mais eficientes para esta finalidade. Vários vírus de DNA tais como parvovírus, adenovírus, herpesvírus e poxvírus e vírus contendo RNA tais como retrovírus foram usados para desenvolver vectores de clonagem e expressão eucarióticos. 0 problema fundamental com retrovírus é que eles são os agentes etiológicos ou estão intima-mente associados ao cancro. Os retrovírus integram-se ao acaso no genoma celular e portanto podem activar proto-oncogenes celulares ou podem destruir sequências críticas para as funções celulares. Assim, a utilização de vectores retrovirais na transferência de genes representa um problema por haver uma probabilidade finita de tais vectores poderem induzir neoplasia. Assim, existe a necessidade de mais vectores com melhores características para a transferência de genes.

Enquanto os retrovírus são frequentemente os agentes etiológicos de doenças malignas, os parvovírus constituem o único grupo de vírus de DNA que não foi associado a qualquer doença maligna. Ainda que os parvovírus sejam frequentemente patogénicos para os animais, um parvovírus de origem humana, o vírus adeno associado 2 (AAV) até agora não foi relacionado com qualquer doença humana conhecida, apesar de até 90% da população humana ter sido exposta a AAV. [Blackblow, N.R. (1988) em: Parvovírus and Human Disease, CRC Press, Boda Raton]. Em adição, a maior parte dos retrovírus usados na transferência de genes são de origem murina, enquanto que AAV, um vírus humano, é fisiologica-mente mais importante para a transferência de genes em humanos. No entanto, os retrovírus são susceptíveis à inactivação pelo calor e solventes orgânicos, enquanto que AAV é estável ao calor, extremamente resistente a solventes lipidicos e estável entre pH 3,0 e 9,0. Assim como veículos para a transferência de genes os parvovírus proporcionam muitas vantagens relativamente aos retrovírus. 4

Os retrovírus recombinantes têm títulos virais muito 5 6 baixos (1' -10 viriões/ml) (Rosenberg) ao contrário dos títulos elevados de AAv recombinante (10 -10 viriões/ml) [Strivastava et al. (1990) Blood 76, 1997]. Consequentemente, de um modo geral não é possível conseguir uma eficiência de infecção com retrovírus recombinante para além de 10-50% da população de células alvo, sendo necessário células em replicação activa para uma infecção com êxito. Pelo contrário, uma eficiência de infecção de 70% foi descrita para um AAV recombinante [Samulski et al. (1989) J. Virol. 63., 3822] e é possível conseguir uma infecciosidade de 100% das células alvo com AAV tipo selvagem [Nahreini et al. (1989) Intervirol. 30, 74]. Ainda, mesmo apesar dos vectores retrovirais recombinantes terem sido tornados incompetentes para a replicação, permanece uma baixa probabilidade de recombinação entre o vector sequências retrovirais endógenas. Pelo contrário, 60-90% da população é seropositiva relativamente aos parvovírus humanos e não foram ainda detectadas sequências virais endógenas em dadores voluntários. Nos vectores AAV recombinantes todas as sequências codificadoras de AAV foram no entanto eliminadas.

Talvez as vantagens mais significativas dos vectores baseados em AAV seja eles mediarem a integração no DNA cromossó-mico do hospedeiro de uma forma específica de sítio e estável. Os genomas de retrovírus, após transcrição reversa, sofrem integração no DNA cromossómico do hospedeiro com um padrão de integração totalmente ao acaso. AAV estabelece uma infecção latente que é específica de sítio. O sítio de integração foi mapeado no cromossoma humano 19. (Kotin et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 87, 2211). Tornou-se pois possível conseguir uma libertação específica de sítio do DNA exógeno em células de mamífero. Se bem que os vectores retrovirais medeiem a integração de sequências não virais no cromossoma hospedeiro, o padrão de integração nem sempre é estável. Frequentemente o provírus retroviral integrado 5

é retirado da célula. AAV, por outro lado, estabelece uma integração estável.

Apesar das vantagens potenciais descritas atrás, os vectores baseados em parvovírus sofrem de uma limitação que é o tamanho da sequência de DNA que pode ser empacotada nos viriões maduros. Por exemplo, enquanto nos vectores retrovirais podem ser encapsidados fragmentos de DNA até 8,0-9,0 kilopares de bases (Kpb), no AAV pode ser encapsidado um máximo de cerca de 5,0 Kpb. Esta limitação do tamanho, no entanto, não evita a clonagem e a encapsidação da maior parte das moléculas de cDNA.

Assim os vectores baseados em parvpvirus oferecem uma alternativa útil aos vectores retrovirais para a terapia com genes em humanos. Se bem que os vectores baseados em AAV permitam uma integração específica de sítio estável dos genes transferidos, a expressão indiscriminada do gene transferidos em todas as linhagens apresenta problemas significativos. Assim, existe a necessidade de vectores AAV que efectuem a expressão específica de tecidos do gene transferido. De acordo com o presente invento, um método, por exemplo, para resolver este problema é por combinação das características de AAV e de um outro parvovírus humano, B19.

Se bem que AAV não provoque doença conhecida, sabe-se que B19 é o agente etiolígico de uma variedade de perturbações clínicas era humanos. B19 é o agente causador da crise aplástica transitória associada a várias anemias hemolíticas, eritema infeccioso ou a "quinta doença", poliartralgia pós-infecção e trombocitopenia em adultos e alguns casos de deficiência crónica da medula óssea e hvdrops fetalis. 6

AAV é dependente de um vírus auxiliar, como seja adenovírus, herpesvírus ou vírus da vacina para uma replicação óptima. Na ausência de um vírus auxiliar, AAV estabelece uma infecção latente em que o genoma virai se integra no DNA cromos-sõmica de uma forma específica de sitio. B19, por outro lado, é um vírus de replicação autónoma que se sabe replicar-se apenas em células hematopoiéticas humanas na linhagem eritróide. Tanto AAV como B19 contêm genomas de DNA de cadeia simples linear, mas os seus genomas não apresentam homologia ao nível da sequência de nucleótidos. A sequência de nucleótidos de ambos os genomas são conhecidas. [Lueby et al.. (1980), J. Virol. 34. 402, Srivastava et al. (1983) J. Virol. 45, 555; Shade et al. (1986) J. Virol. 58, 921]. O genoma de AAV contem repetições terminais invertidas (ITRs) de 145 nucleótidos, 125 nucleótidos dos quais formam um gancho palindrómico que desempenha um papel crítico durante a replicação do AAV. As sequências de ITR estão apresentadas na Fig. 1 e como SEQ ID P:l. Em células lantentemente infectadas, os extremos de AAV estão na junção das sequências celulares e portanto os extremos também facilitam a integração e recuperação.

As características importantes dos dois parvovírus humanos podem ser combinadas, por exemplo, num vector híbrido AAV-B19, para proporcionar vectores de acordo com o presente invento. Os vectores deste invento são particularmente úteis para a transferência de genes em células da medula óssea e noutras células hematopoiéticas. Estes vectores virais híbridos medeiam a integração específica de sítios assim como a expressão específica de tecido dos genes heterólogos em células hematopoiéticas. O presente invento é dirigido a vectores parvovírus híbridos capazes de integração específica de sítio num cromossoma de mamífero sem citotoxicidade substancial e que pode dirigir a expressão específica de tecido de um gene heterõlogo, i.e. um \ 7 \ 7

gene que não seja de parvovírus. Mais particularmente, o presente invento proporciona vectores compreendendo duas repetições terminais invertidas de virus adeno-associado 2 e pelo menos uma cassete genética compreendendo um promotor capaz de efectuar a expressão específica de célula operacionalmente ligada a um gene heterólogo em que a cassete reside entre as duas repetições terminais invertidas. Numa realização preferida, o promotor é o promotor p6 do parvovirus B19 e dirige a expressão específica de células eritróides do gene heterólogo.

Num outro aspecto deste invento, são proporcionadas células hospedeiras transduzidas pelos vectores híbridos do presente invento.

Um outro aspecto do presente invento proporciona um método de tratamento para doenças hematopoiéticas, em particular hemoglobinopatias, por transdução de células de suporte hematopoiéticas ou progenitoras com um vector do presente invento e introdução das células transduzidas num doente, onde o gene heterólogo é expresso.

Um outro aspecto deste invento proporciona um método para a libertação de um produto farmacêutico num mamífero pela transdução de células de suporte hematopoiéticas ou progenitoras com um vector híbrido do presente invento e introdução das células transduzidas no mamífero. 0 gene heterólogo é expresso e os glóbulos vermelhos maduros proporcionam um veículo para a libertação do produto do gene heterólogo ao longo da corrente sanguínea ou para o fígado ou para o baço.

Ainda um outro aspecto do presente invento proporciona um método para conferir resistência a várias drogas específica de células por transdução das células com um vector híbrido do 8

presente invento em que o gene heterólogo é um gene de resistência a multidrogas e introdução das células transduzidas num mamífero. Numa realização preferida, o vector híbrido contem o promotor B19p6 e portanto o fenótipo de resistência a multidrogas é conferido a células eritróides.

Como aqui é usado, a transdução refere-se a um processo pelo qual as células internalização DNA estranho e integram esse DNA estranho nos seus cromossomas. A transdução pode ser conseguida por exemplo por transfecção, a qual se refere a várias técnicas descritas abaixo pela qual as células internalização DNA ou infecção pela qual os vírus são usados para transferir DNA para as células.

Fig. 1 descreve a sequência de nucleótidos de uma ITR do genoma de AAV 2.

Fig. 2 descreve a sequência de nucleótidos de B19 a partir do nucleótidos 200 até ao nucleótido número 424 conforme numerado por Shade et al. (1986).

Fig. 3 esquematiza a construção de um vector híbrido do presente invento.

Fig. 4 demonstra a integração específica de sítio do genoma AAV tipo selvagem em DNA cromossómico diplóide humano normal por análise de transferência Southern.

Fig. 5 demonstra a integração específica de sítio do genoma de AAV recombinante em células da medula óssea humana normal por análise de transferência Southern. 9

Fig. 6 é um diagrama da construção dos plasmídeos recombinantes pWP-7A (Painel A) e pWP-19 (Painel B).

Fig. 7 é um esquema da construção do plasmídeo recombi-nante pWN-1.

Fig. 8 é um esquema da construção de plasmídeos recombinantes pWP-21 e pWP-22 (Painel A) e pWP-16 e WP-17 (Painel B).

Fig. 9 demonstra a análise de transferência Southern de pescagem e replicação do gene neor em células humanas. Painel A: Pescagem do plasmídeo pWP-8A; Painel B: Pescagem do plasmídeo pWP-21, Painel C: Pescagem do plasmídeo pWP-22; Painel D: Pescagem do plasmídeo pWP-16, Painel E: Pescagem do plasmídeo pWP-17. Plasmídeos recombinantes foram transfectados separadamente em células humanas KB infectadas com adenovírus (Faixas 1, 3, 5, 7, 9) ou cotransfectadas com o plasmídeo auxiliar pAAV/Ad (Faixas 2, 4, 6, 8, 10), me d significam formas monoméricas e diméricas respectivamente, dos intermediários replicativos do DNA de AAV recombinante.

Fig. 10 é um esquema da construção de um vector híbrido em que o gene da resistência à neomicina (Neor) está sob o controle do promotor B19p6.

Fig. 11 é um gráfico descrevendo a viabilidade celular após transferência mediada por AAV de Neo para células de suporte hematopoiéticas humanas. O painel A ilustra a expressão do gene Neo sob o controle do promotor TK. O painel B ilustra a expressão do gene Neor sob o controle do promotor B19p6.

Fig. 12 descreve os vectores AAV recombinantes do presente invento contendo genes seleccionáveis sob o controle do 10 10

promotor B19p6 e um potenciador específico de células eritróides humanas (HS-2).

Fig. 13 descreve os vectores AAV recombinantes do presente invento que expressam o gene da β-globina humana e o gene Neor.

Fig. 14 proporciona uma transferência Southern de DNA isolado a partir de células K562 infectadas com vHS2/B-globina--Neo.

Fig. 15 proporciona uma transferência Northern de RNA de células K562 infectadas com vHS2/B-globina-Neo e vHS2/B19-glo-bina-Neo. O presente invento está relacionado com vectores híbridos de parvovírus os quais compreendem um par de repetições terminais invertidas de AAV (ITRs) que delimitam pelo menos uma cassete contendo um promotor que dirige a expressão específica celular operacionalmente ligada a um gene heterõlogo. Heterõlogo neste contexto refere-se a qualquer sequência de nucleótidos ou gene que não seja nativo para o parvovírus AAV ou B19. De acordo com o presente invento, as regiões codificadoras de AAV e B19 foram eliminadas, resultando num vector não citotóxico seguro. Estão descritos abaixo genes heterõlogos representativos. As ITRs de AAV ou suas modificações conferem infecciosidade e integração específica de sítio, mas não citotoxicidade e o promotor dirige a expressão específica de célula e preferencialmente a expressão de células eritróides usando o promotor p6 do parvovírus B19. Os vectores híbridos do presente invento proporciona assim moléculas de DNA que são capazes de se integrar num cromossoma de mamífero sem toxicidade substancial. Estes vectores híbridos permitem a integração segura do DNA no genoma celular, uma vez que as 11 fracções do DNA responsáveis pela replicaçao do parvovírus foi eliminada e portanto estes vectores não fazem auto-replicação.

De acordo com o presente invento, o vector híbrido compreende uma primeira e uma segunda repetição terminal que flanqueiam um promotor ligado a um gene heterólogo. As repetições terminais podem compreender todas ou parte das ITRs de AAV. As repetições terminais medeiam a integração estável da sequência de DNA num sítio específico num cromossoma particular, e.g. cromossoma humano 19. Toda a sequência de DNA incluindo as ITRs, o promotor e o gene heterólogo podem ser integrados no genoma celular.

As repetições terminais do vector híbrido do presente invento podem ser obtidas por corte com endonuclease de restrição do AAV ou de um plasmídeo como seja 0sub201. o qual contem um genoma AAV modificado [Samulski et al. (1987) J. Virol. 61. 3096] ou por outros métodos conhecidos dos familiarizados com a matéria, incluindo mas não estando limitados a síntese química ou enzimática das repetições terminais baseado na sequência publicada de AAV. Os familiarizados com a matéria poderão determinar, por métodos bem conhecidos, como seja análise de deleções, a sequência mínima ou parte das ITRs de AAV que é necessária para permitir a função, i.e. integração estável específica de sítio. Os familiarizados com a área poderão também determinar quais as pequenas modificações da sequência que podem ser toleradas mantendo ao mesmo tempo a capacidade das repetições terminais para dirigir integração estável específica de sítio. A integração específica de sítio pode ser avaliada, por exemplo, por análise de transferência Southern. O DNA foi isolado a partir de células transduzidas pelos vectores do presente invento, digerido com uma variedade de enzimas de restrição e analisado em transferências Southern com uma sonda específica de AAV. Uma única banda de 12

hibridação evindencia a integração específica de sítio. Outros métodos conhecidos dos familiarizados com a matéria, tais como análise de reacção em cadeia com polimerase (PCR) de DNA cromos-sómico podem ser usados para avaliar a integração.

Os vectores do presente invento contêm um promotor que dirige a expressão específica de tecido. Por exemplo, o parvoví-rus selvagem B19 tem uma gama de hospedeiros limitada e apresenta um tropismo de tecido acentuado para elementos eritróides da medula õssea. Numa realização preferida os vectores preferidos do presente invento utiliza um promotor transcricional de B19 para efectuar a expressão específica de tecido de sequências heterólo-gas. Numa realização mais preferida o promotor ê o promotor p6 de B19, o qual é activo em células progenitoras eritróides. A sequência de nucleótidos de B19 do nucleótido número 200 até ao nucleótido número 424 conforme numerado por Shade et al. (1986) contem o promotor p6 e está descrito na Fig. 2 e como SEQ ID NO: 2. A sequência consensus tipo promotor TATATATA está presente no nucleótido 320 em B19 (conforme numerado por Shade et al.) e portanto a transcrição provavelmente originará cerca de 30 nucleótidos a jusante. Descobriu-se que de acordo com o presente invento fragmentos de B19 contendo estas sequências dirigem expressão que é específica de células progenitoras eritróides e que a deleção de sequências codificadoras de B19 a jusante do promotor evita a replicação de B19. Conforme explicado atrás, alguém familiarizado com a matéria poderá determinar a sequência mínima e modificações do promotor p6 que proporcionam expressão específica de sítio e não citotóxica. Isto pode ser determinado infectando células eritróides e não eritróides com vectores contendo o promotor B19p6 e testando a expressão do gene heteró-logo. A sequência do promotor pode ser derivada por digestão com 13 13

endonucleases de restrição de B19 ou de um plasmídeo B19 clonado como seja pYT107 [Cotmore et al. (1984) Science 226, 1161] ou por quaisquer outros métodos conhecidos dos familliarizados com a matéria, incluindo mas não estando limitado a síntese química ou enzimãtica baseado na sequência publicada de B19. Outros promotores específicos de célula podem ser obtidos por métodos análogos e a especificidade destes promotores é determinada avaliando a expressão no tipo de célula adequado. O promotor do vector híbrido está operacionalmente ligado ao gene heterólogo. Qualquer gene que possa ser transcrito numa tal construção está incluído no presente invento. Numa realização preferida, o gene heterólogo codifica uma proteína biologicamente funcional, i.e. um polipeptídeo ou proteína que afecte o mecanismo celular de uma célula na qual a proteína biologicamente funcional é expressa. Por exemplo, a proteína biologicamente funcional pode ser uma proteína que seja essencial para o crescimento normal da célula ou para a manutenção da saúde de um mamífero. A proteína biologicamente funcional pode também ser uma proteína que melhore a saúde de um mamífero ao fornecer--se uma proteína que falte, ao dar-se maiores quantidades de uma proteína que é subproduzida no mamífero ou fornecendo uma proteína que iniba ou contrarie uma molécula indesejável que possa estar presente no mamífero. A proteína biologicamente funcional pode também ser uma proteína que seja útil em estudos de investigação sobre o desenvolvimento de novas terapias com genes ou no estudo de mecanismos celulares. A proteína biologicamente funcional pode ser uma proteína que seja essencial para o crescimento normal ou reparação do corpo humano. A proteína biologicamente funcional pode também ser uma que seja útil no combate de doenças tais como cancro, arteriosclerose, anemia de células falsiformese 14 14

talassémias. Exemplos de tais proteínas biologicamente funcionais são hemoglobina (α, β ou gama-globina), factores de crescimento hamatopoiéticos tais como factor estimulador de colónias de granulócitos-macrófagos (GM-CSF), factor estimulador de macrófa-gos (M-CSF), factor estimulador de colónias de granulócitos (G-CSF) e eritropoietina (EPO). Um outro exemplo é o factor de necrose tumoral (TNF) que é uma molécula que pode ser usada para tratar o cancro e em particular tumores. Os supressores de tumores p53 e retinoblastoma (RB) estão também incluídos. Várias citocinas tais como factor de crescimento de mastócitos (MGS) e interleuquina 1-11 são também proteínas abrangidas pelo presente invento. A proteína biologicamente funcional pode também ser uma marca selectiva para a resistência a antibióticos como seja uma marca seleccionável para a resistência à neomicina em eucariotas. Outros tipos de marcas seleccionáveis tais como adenina-fosforri-bosiltransferase (APRT) em células deficientes em APRT ou o gene da luciferase estão também incluídos. Os genes heterólogos codificadores destas proteínas podem ser proporcionados por qualquer um de uma variedade de métodos, como sejam processos de clonagem de rotina (Sambrook et al.), excisão de um vector contendo o gene de interesse, ou síntese química ou enzimática baseada na informação da sequência publicada. Em muitos casos o DNA codificador da proteína com interesse pode ser adquirido comercialraente. A proteína biologicamente funcional pode afectar o mecanismo celular proporcionando à célula uma nova função ou uma função alterada. Por exemplo, o gene heterólogo pode ser um gene de resistência a várias drogas (mdr) o qual codifica a P-glico-proteína. A P-glicoproteína é uma glicoproteína da membrana celular que afecta a acumulação de drogas intracelulares e é responsável pelo fenómeno de resistência a várias drogas. (Para uma revisão ver Biedler [1992] Câncer 70. 1799). 15

Numa outra realização o gene heterólogo pode codificar uma proteína não biologicamente funcional. Por exemplo, um gene híbrido compreendendo vários domínios e funções de uma variedade de fontes pode ser projectado e produzido por tecnologia recombi-nante ou enzimãtica ou síntese química.

Numa outra realização preferida o gene heterólogo é capaz de ser transcrito numa molécula de RNA que é suficientemente complementar para hibridar com um mRNA ou DNA de interesse. Tal molécula de RNA é daqui em diante referida como RNA anticodão e tem utilidade na prevenção ou limitação da expressão de moléculas produzidas em grande quantidade, defectivas ou de outra forma indesejáveis. 0 vector do presente invento pode compreender, como gene heterólogo, uma sequência codificadora de um RNA anti-codão que é suficientemente complementar de uma sequência alvo de forma a ligar-se à sequência alvo. Por exemplo, a sequência alvo pode ser parte do mRNA codificador de um polipeptídeo tal que se ligue ao mRNA codificador do polipeptídeo e evite a sua tradução. Numa outra realização a sequência alvo é um segmento de um gene que é essencial para a transcrição de forma que o RNA anti-codão se liga ao segmento (e.g. um promotor ou uma região codificadora) e evita ou limita a transcrição. Portanto, o RNA anti-codão deve ter tamanho e complementaridade suficientes para evitar a tradução do seu mRNA alvo ou transcrição do seu DNA alvo.

Numa realização preferida o RNA anti-codão é um 15mero e apresenta 100% de complementaridade com a sequência alvo. Os familiarizados com a matéria poderão determinar moléculas anti-codão maiores ou menores tendo complementaridade suficiente com a molécula anti-codão de forma a que a molécula anti-codão seja capaz de se ligar ao alvo e assim inibir a tradução ou transcrição. 0 gene heterólogo pode ser proporcionado por exemplo, por síntese química ou enzimãtica, ou a partir de fontes comerciais. 16 É preferível que o comprimento do gene heterólogo seja tal que o tamanho global do vector híbrido seja cerca de 5 Kilobases (Kb, uma vez que o limite de empacotamento dos viriões de AAV e cerca de 5 Kb (Hermonat et al. (1984) Proc. Natl Acad. Sei. USA 81, 6466).

Os vectores híbridos do presente invento podem ser obtidos inserindo o gene heterólogo e o promotor específico de célula entre um par de repetições terminais derivadas de AAV. A combinação de um promotor e de um gene heterólogo é também referida aqui como uma cassete. Assim, o invento proporciona um vector em que: 1) as repetições terminais medeiam a integração estável específica de sítio no genoma celular; e 2) o promotor medeia a expressão específica de célula de um gene heterólogo, e.g. em células eritróides ou o promotor medeia a transcrição de um RNA anti-codão ou um RNA codificador de um polipeptídeo de interesse. A sequência do promotor está operacionalmente ligada ao gene heterólogo de forma a efectuar a expressão do gene. Portanto, a sequência do promotor pode estar num ou em ambos os extremos da sequência heteróloga ou da região codificadora. Ainda, mais de um promotor e gene heterólogo pode estar presente num vector, i.e. pode haver duas ou mais cassetes entre as ITRs. Assim, mais de um gene heterólogo pode ser expresso por um vector. Técnicas convencionais para a construção de tais vectores híbridos são bem conhecidas dos familiarizados com a matéria e podem ser encontradas em referências tais como Sambrook et al. (1989) em Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York ou qualquer um de uma série de manuais de laboratório sobre tecnologia de DNA recombinante existentes. Estão disponíveis várias estratégias para ligação de fragmentos de DNA, a escolha dos quais depende da natureza dos extremos dos fragmentos de DNA e pode ser facilmente determinado pelos familiarizados com a matéria. É ainda contemplado pelo presente invento a inclusão nos vectores híbridos de outros elementos de sequências de nucleõtidos que facilitem a integração do DNA nos cromossomas, expressão do DNA e clonagem do vector. Por exemplo, a presença de potenciadores a montante do promotor ou terminadores a jusante da região codificadora pode facilitar a expressão. Num outro exemplo, estudos recentes identificaram um sítio hipersensível à DNAse I (HS-2) a montante do conjunto de genes da globina humana que significativamente aumenta a expressão específica de células eritróides dos genes da globina. [Tuan et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 82., 6384). Nos vectores híbridos do presente invento, a presença de HS-2 a montante do promotor B19p6 aumenta a expressão específica de tecido.

Como aqui descrito atrás, os vectores do presente invento podem ser construidos por uma variedade de métodos bem conhecidos e a ordem da ligação dos elementos pode variar. Numa realização preferida o promotor específico de célula e o gene heterólogo são ligados um ao outro para proporcionar uma cassete que possa ser inserida entre as duas ITRs de AAV. Por exemplo, para proporcionar uma cassete contendo o promotor B19p6 e um gene heterólogo, um fragmento contendo o promotor p6 é inserido num plasmídeo pUC19, após o que o plasmídeo contendo p6 é linearizado por clivagem com enzimas de restrição a jusante do promotor p6. 0 gene heterólogo é então inserido imediatamente a jusante do promotor p6. Um fragmento contendo o promotor p6 e o gene heterólogo foi retirado do plasmídeo e inserido entre as ITRs de AAV num plasmídeo AAV do qual foram eliminadas as regiões codificadoras de AAV. 0 plasmídeo resultante compreende o promotor p6 e um gene heterólogo flanqueado por um par de ITRs de AAV. Esta 18

construção está descrita mais especificamente a seguir e está esquematizada na Fig. 3. Para gerar um plasmídeo contendo p6, um fragmento contendo o promotor p6 de B19 foi isolado a partir de DNA de B19 ou de DNA clonado de B19 [ver, por exemplo, Cotmore et al. (1984); Shade et al. (1986)]. Numa realização preferida este fragmento B19 corresponde aos nucleótidos 200 a 480 conforme numerado por Shade et al. (1986) e contem toda a região não codificadora 5' e o promotor p6 de B19. Este fragmento de 280 pb está flanqueado por sítios de restrição EcoRI e Xbal e pode ser gerado por clivagem com estas enzimas de restrição. Este fragmento foi clonado nos sítios EcoRI-Xbal do pUC19 para gerar o plasmídeo pB19p6. Os familiarizados com a matéria reconhecerão que podem ser utilizados outros plasmídeos e sítios de restrição para gerar um vector compreendendo um promotor B19p6. Como alternativa o promotor B19p6 pode ser sintetizado quimicamente ou enzimaticamente baseado na sequência publicada e ligado ao gene heterólogo.

Um gene heterólogo pode ser operacionalmente ligado a jusante do fragmento do promotor B19p6 como se segue. O plasmídeo pB19p6 foi clivado com HincII, a qual corta o DNA de B19 a jusante do promotor p6 (i.e. no nucleótido 424) e também no sítio de clonagem múltipla do pUC19. O gene heterólogo com interesse é dotado de extremos cerses, ligado a jusante do promotor B19p6 entre os dois sítios HincII para gerar um plasmídeo pB19p6-in-serção. Os familiarizados com a matéria reconhecerão uma variedade de métodos, conforme exemplificado, e.g. em Sabrook et al. (1989), para ligar um fragmento contendo um promotor específico de célula com um fragmento contendo o gene heterólogo. De acordo com o presente invento a sequência codificadora de GM-CSF, APRT neo , o gen do retinoblastoma, a-globina, β-globina e gama-glo-bina foram empregues como gene heterólogo, resultando na construção de vectores híbridos, designados AAV-B19-GM-CSF, 19

AAV-B19-APRT, AAV-B19-neor, AAV-B19-RB, AAV-B19-a-globina, AAV-B19-B-globina e AAV-B19-globina, respectivamente. Um gene de resistência a várias drogas codificador de P-glicoproteína também é especificamente contemplado como gene heterólogo. As sequências codificadoras dos respectivos genes são conhecidas [Lee et ai. (1985) Proc. Natl. Acad. Sei. USAM, 4360 (GM-CSF) ; Broderick et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sei. USAM, 3349 (APRT); Traschin et al. (1985) Mol. Cell. Biol. 5, 3251 (Neor); Huang et al. (1980) Proc. Natl Acad. Sei. USA 77, 7054 (α-globina); Lawn et al. (1980) Cell 21, 647 (B-globina); Enver et al♦ (1989) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 86, 7033 (gama-globina) Roninson et al. (1986) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 83., 4538; Roninson et al. (1991) em Molecular and Cellular Biology of Multidrug Resistance in Tumor Cells (ed. Roninson, Plenum Press, NY) 91-106; Schinkel et al. (1991) Câncer Res.M, 2628; Chen et al. (1990) J. Biol. Chem.265, 506; (mdr)] e portanto pode ser facilmente conseguido como descrito atrás. 0 plasmídeo pB19p6-inserção exemplifica uma cassete promotor-gene heterólogo que pode ser isolado por digestão do plasmídeo por exemplo com EcoRI e HindIII ou outras enzimas de restrição adequadas e depois ligado entre duas ITRs de AAV. As ITRs de AAV foram proporcionadas por exemplo por digestão do DNA de AAV ou de DNA de AAV clonado com enzimas de restrição, ou por síntese química ou enzimãtica baseado na sequência publicada dos ITRs de AAV [Lusby et al. (1980)]. Numa realização preferida as ITRs de AAV compreendem os 145 nucleótidos mostrados na Fig. 1. Os fragmentos que contêm os 125 nucleótidos que formam a estrutura em gancho palindrómica (nucleótido 1-125 da Fig.l) ou fragmentos mais longos que contêm os 191 nucleótidos terminais do cromossoma virai são também úteis. Sequências endógenas adicionais, por exemplo adaptadores para facilitar clonagem e ligação, podem também ser usados nas construções. Numa realização 20 preferida as ITRs de AAV são proporcionadas por um plasmídeo, e.g. psub201 [Samulski et al. (1987)] que é um derivado no qual os sítios de clivagem Xbal foram introduzidos nas posições da sequência 190 e 4484 e os 191 pares de bases terminais direitos do genoma virai foram substituir o domínio de 190 pares de bases do extremo esquerdo normais. Esta modificação resulta na extensão das repetições terminais de psub201 até 191 pares de bases. Os sítios de clivagem Xbal permitem a substituição da região codificadora de AAV com sequências exógenas, i.e. o promotor B19 e o gene heterólogo, de tal forma que as sequências exógenas foram flanqueadas pelas ITRs de AAV. Os derivados de psub201 manipulados de forma a conterem outros sítios de restrição, conforme demonstrado nos Exemplos 2 e 3, são também úteis para proporcionar as ITRs de AAV.

Para substituir a região codificadora de AAV por B19p6-inserção, i.e. a cassete, psub201 foi digerido com Xbal para eliminar as regiões codificadoras de AAV. 0 DNA do plasmídeo vector contendo as ITRs de AAV foi isolado e ligado à construção B19p6-inserção. A ligação pode ser facilitada pela adição de adaptadores às ITRs de AAV e de adaptadores a B19-p6-inserção.

Por exemplo, numa outra realização preferida os vecto-res do presente invento são construídos por modificação dos sítios Xbal alterados do psub201 para proporcionar sítios de restrição adicionais, eliminação das regiões codificadoras de AAV por digestão com a enzima de restrição adequada e ligação da cassete B19p6-inserção no DNA do plasmídeo contendo as ITRs de AAV. A construção dos plasmídeos vectores protótipos contendo as ITRs de AAV mas não as regiões codificadoras de AAV e que ainda contêm sítios de clonagem para facilitar a inserção das cassetes de promotor-gene heterólogo, está exemplificada nos Exemplos 2 e 3. 21

O plasmídeo resultante compreende um promotor especifico de célula a montante de uma sequência heteróloga, ambos flanqueados pelas ITRs de AAV. A ordem das ligações, a natureza dos extremos complementares, a utilização de sequências de ligação e de adaptadores e outros detalhes podem ser alterados conforme necessário pelos familiarizados com a matéria para proporcionar o vector híbrido AAV-B19 do presente invento.

Para estabelecer a integração do DNA vector no cromossoma de uma célula hospedeira, as células hospedeiras são trans-fectadas com o vector ou infectadas com os viriões maduros contendo os vectores híbridos. Os métodos de transfecção de DNA são bem conhecidos dos que estão dentro do campo e incluem, por exemplo, transfecção de DNA nu, microinjecção e fusão celular. A integração mais eficaz é conseguida pela infecção com viriões contendo os vectores híbridos.

Os viriões podem ser produzidos por coinfecção com um vírus auxiliar tal como adenovírus, herpesvírus ou vírus da vacina. A seguir à coinfecção das células hospedeiras com o vector em causa e um vírus auxiliar, os viriões são isolados e o vírus auxiliar é inactivado. Os lotes de viriões resultantes sem vírus auxiliar são usados para infectar células hospedeiras. Numa outra realização, os viriões são produzidos por cotransfecção de células infectadas com vírus auxiliar com o vector do presente invento e um plasmídeo auxiliar. Por exemplo, a construção híbrida do presente invento pode ser encapsidada nos viriões maduros de AAV por cotransfecção de células infectadas por adenovírus com o vector do presente invento e um plasmídeo que proporciona o gene rep do parvovírus e os extremos de adenovírus. Um exemplo de tal plasmídeo é AAV/Ad, o qual contem toda a sequência codificadora de AAV e as sequências terminais do adenovírus tipo 5 em lugar dos extremos normais AAV. [Samulski et 22 22

al. (1989)]. Apôs cotransfecção, os viriões maduros são isolados por métodos convencionais, e.g. centrifugação em cloreto de césio e aquecidos a 56°C durante uma hora para inactivar qualquer adenovírus contarainante. Os viriões maduros resultantes contêm o vector do presente invento e são usados para infectar células hospedeiras na ausência de vírus auxiliar. A função dos vectroes híbridos do presente invento, i.e. a capacidade para mediar a transferência e expressão do gene heterólogo num tipo celular específico, pode ser avaliada por controle da expressão do gene heterólogo em células transduzidas. Por exemplo, as células da medula óssea são isoladas e enriquecidas em células de suporte hematopoiéticas (HSC), e.g. por separação das células activadas por fluorescência como descrito em Srivastava et al. (1988) J. Virol. 62., 3059. HSC são capazes de se auto-renovarem assim como iniciação de hematopoiese a longo prazo e diferenciação em linhagens heamatopoiéticas múltiplas in vitro. HSC foram transfectadas com o vector do presente invento ou infectadas com várias concentrações de viriões contendo um vector híbrido e depois avaliado quanto à expressão do gene heterólogo. 0 ensaio da expressão depende da natureza do gene heterólogo. A expressão pode ser controlada por uma variedade de métodos incluindo ensaios imunológicos, histoquímicos ou de actividade. Por exemplo, a análise Northern pode ser usada para avaliar a trnascrição usando as sondas de DNA ou RNA adequadas. Se existirem anticorpos contra o polipeptídeo codificados pelo gene heterólogo pode-se usar a análise de transferência Western, imuno-histoquímica ou outras técnicas imunológicas para avaliar a produção do polipeptídeo. Podem ser também usados ensaios bioquímicos adequados se o gene heterólogo for uma enzima. Por exemplo, se o gene heterólogo codificar resistência a antibióticos, a 23 determinação da resistência de células infectadas ao antibiótico pode ser usada para avaliar a expressão do gene de resistência a antibióticos.

Para além de avaliar se o gen heterólogo é expresso nas células adequadas, a especificidade correcta do promotor dos vectores híbridos pode ser avaliada controlando a expressão do gene heterólogo ou a ausência de expressão, em células nas quais não se espera que o promotor seja activo. Por exemplo, quando as células de uma linha celular naso-faringeal, KB, são transduzidas com um vector híbrido contendo o promotor B19p6, o gene heterólogo não é expresso, uma vez que o promotor B19p6 é específico de células eritrõides. A detecção do produto do gene heterólogo aos mesmos níveis ou em níveis mais baixos do que as células não transduzidas conforma que o promotor B19p6 do vector híbrido não dirige a expressão do gene heterólogo em células não hematopoié-ticas.

Os vectores híbridos do presente invento são úteis na terapia com genes. Em particular, os vectores do presente invento pode dirigir a expressão específica de células eritrõides de um gene com interesse e portanto, são úteis no tratamento de hemo-globinopatias.

Está contemplado de acordo com o presente invento usar o vector híbrido no tratamento de uma variedade de doenças, incluindo talassémia, anemia de células falsiformes, diabetes e cancro. 0 gene heterólogo pode ser a contraparte normal de um que é anormalmente produzido no estado de doença, por exemplo B-glo-bina para o tratamento de anemia falsiforme e α-globina, B-glo-bina ou gama-globina no tratamento de talassémia. 0 gene heterólogo pode codificar RNA anti-codão como descrito abaixo. Por exemplo, α-globina é produzida em excesso relativamente à 24 24

β-globina em β-talassémia. Assim, β-talassémia pode ser tratada de acordo com o presente invento por terapia com genes com um vector no qual o gene heterólogo codifica um RNA anti-codão. 0 RNA anti-codão é seleccionado de forma a ligar-se a uma sequência alvo do mRNA da α-globina para evitar a tradução de α-globina ou a uma sequência alvo do DNA da α-globina de forma a que a ligação evite a transcrição do DNA de α-globina. No tratamento do cancro gene heterólogo pode ser um gene associado à supressão de tumores, como seja um gene de retinoblastoma, o anti-oncogene p53 ou o gene codificador do factor de necrose tumoral. A utilização dos vectores híbridos do presente invento para o tratamento de doenças envolve a transdução de HSC ou células progenitoras com o vector híbrido. A transdução é conseguida por transfecção com o vector ou preparação de viriões maduros contendo os vectores híbridos e infecção de HSC ou células progenitoras com os viriões maduros. As células transdu-zidas são introduzidas enm doentes, e.g. por transfusão intravenosa (ver, por exemplo Rosenberg, 1990). HSC ou células progenitoras são obtidas a partir de células de medula óssea e facultativamente enriquecendo a população de células da medula óssea para HSC. HSC pode ser transduzida por métodos convencionais de transfecção ou infectadas com viriões maduros durante uma ou mais horas a cerca de 37°C. A integração estável do genoma virai é conseguida por incubação de HSC a cerca de 37°C durante cerca de uma semana até cerca de um mês. A integração estável específica de sítio e a expressão específica de células eritróides é avaliada como descrito atrás. Após as células transduzidas terem sido introduzidas num doente, a presença do produto do gene heterólogo pode ser controlada ou avaliada por um ensaio adequado para o produto do gene no doente, por exemplo nos eritrócitos periféricos ou medula óssea do doente quando a expressão é específica de células eritróides. Como descrito atrás, o ensaio específico está 25

dependente da natureza do produto do gene heterólogo e pode ser facilmente determinado por alguém familiarizado com a matéria.

Por exemplo, a β-talassémia representa um grupo heterólogo de sindroma clínicos que são herdados como alelos mutageni-zados de genes que codificam a cadeia da β-globina humana. Estas mutações afectam todos os aspectos da expressão do gene da β-globina incluindo transcrição, '•splicing", poliadenilação, tradução e estabilidade proteica. A característica essencial da β-talassémia é a redução marcada ou ausência total da síntese de hemoglobina normal adulta (Hba; “2β2^ * APesar úos avanços significativos na compreensão dos mecanismos moleculares básicos sobjacentes da β-talassémia, o tratamento é limitado a transfusões regulares de eritrócitos e terapia de quelatação com ferro. 0 tratamento por transplante de medula óssea também foi tentado [Thomas et al. (1982) Lancet, ii, 227] mas não se encontrou uma cura eficaz.

Assim, os vectores do presente invento são úteis no tratamento de β-talassémia. Construiu-se um vector AAV-B19 em que o gene heterólogo é o gene normal de β-globina humana, com o vector resultante AAV-B19-B-globina permitindo a transferência mediada por parvovírus, integração específica de sítio e expressão específica de células eritróides do gene β-globina humana normal em células hematopiéticas humanas. A expressão anormal de β-globina na β-talassémia pode resultar numa super-abundância de mRNA da α-globina relativamente ao m-RNA de β-globina. 0 presente invento não pode proporcionar apenas um gene de β-globina normal, como descrito aqui, mas pode também ser utilizado para regular negativamente a produção do excesso de α-globina ao arranjar-se um vector com um RNA antico-dão como gene heterólogo. Um vector híbrido AAV-B19 foi 26 26

construído em que a sequência heteróloga codifica um RNA anti-co-dão que é suficientemente complementar de uma região do mRNA codificador da cadeia a, de tal forma que ele se liga ao mRNA da α-globina e evita a sua tradução ou a uma região do DNA codificador de α-globina de forma que ele se liga ao gene da α-globina e evita a sua transcrição. Portanto, o presente invento contempla a terapia com genes da β-talassémia compreendendo a transdução de células de suporte hematopoiéticas ou progenitoras com um vector híbrido codificador das cadeias normais da β-globina e um vector codificador de um RNA anticodão complementar de mRNA ou DNA de α-globina. Como alternativa, uma construção com mais de um promotor B19p6, como descrito atrás, permite a expressão coincidente de β-globina e do anticodão de α-globina. Assim, a transdução com um único vector satisfaz a necessidade de um gene normal da β-globina e a regulação negativa do excesso das cadeias a. Mais especificamente, as células de medula óssea são transfec-tadas com os vectores aqui tratados e as células transduzidas são introduzidas, e.g. por transfusão intravenosa num doente. A integração estável do vector pode ser avaliada por PCR ou por análise de transferência Southern e a expressão do gene heteró-logo pode ser avaliada testando o produto do gene heterólogo nas células do sangue periférico ou nas células de medula óssea. Como descrito anteriormente, o ensaio particular depende da natureza do produto do gene heterólogo.

Os vectores do presente invento são também úteis no sentido de conferirem resistência a várias drogas específica de célula. Construiu-se um vector AAV para conter um promotor específico de célula e um gene de resistência a multidrogas, com o vector resultante permitindo a transferência mediada por parvovírus, integração específica de sítio e expressão específica de célula do gene mdr num tipo de célula seleccionado. Numa 27 27

realização preferida, o vector é AAV-B19-mdr e confere o fenótipo de resistência a várias drogas a células eritrôides.

Qualquer um dos numerosos genes mdr que se sabe conferirem o fenótipo mdr é útil como geen heterólogo. Os genes mdr são conhecidos dos familiarizados com a matéria e estão descritos, por exemplo, por Roninson et al. (1991) em Molecular and Cellular Biology of Multidrug Resistance in Tumor Cells (ed. Roninson, Plenum Press, NY) 91-106. Assim o presente invento proporciona um método para conferir a resistência a várias drogas específica de célula a qual compreende transdução das células com o vector híbrido do presente invento o qual contem um promotor específico de célula e um gene mdr. Numa realização preferida, o presente invento proporciona um método para conferir resistência a várias drogas em células eritrôides de um doente que se carac-teriza pela obtenção de células de medula óssea ou de células de suporte a partir de um doente, transdução das células de medula óssea ou de suporte com o vector híbrido AAV-B19 do presente invento o qual contem um gene mdr como gene heterólogo e reintro-dução das células transduzidas num doente. A expressão do gene mdr pode ser avaliada testando o produto do gene mdr, i.e., a P-glicoproteína, nas células do sangue periférico do doente ou nas células da medula óssea. Por exemplo, a P-glicoproteína pode ser detectada por ensaios imunológicos conhecidos com um anticorpo contra a P-glicoproteina. Tais anticorpos são conhecidos e disponíveis para os envolvidos neste campo e estão descritos, por exemplo, por Meyers et al. (1989) Câncer Res. 49., 3209 e Georges et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 87, 152. 0 presente método é particularmente útil como um aditivo para a quimioterapia do cancro por resultar eficazmente na protecção de células eritrôides contra os efeitos dos efeitos quimioterapêuticos dirigidos para outros tecidos. 28

Ainda um outro aspecto do presente invento proporciona um método para a libertação de um produto farmacêutico, uma proteína ou um RNA anticodão num mamífero. Uma vez que a diferenciação normal destas células de suporte resulta na produção de eritrócitos maduros, a transdução das·células de suporte com o vector em questão dá uma população de vesículas enucleadas circulantes contendo o produto do gene. Este método compreende a transdução de células de suporte hematopoiéticas ou progenitoras com o vector híbrido do presente invento e introdução, e.g. por transfusão intravenosa ou injecção, das células transduzidas num mamífero. A transdução pode ser conseguida por transfecção das células com o vector híbrido seguindo métodos convencionais de infecção de células com viriões de AAV maduros contendo o vector híbrido a cerca de 37°C durante cerca de uma a duas horas. A integração estável do genoma virai recombinante é conseguida por incubação das células a cerca de 37°C durante cerca de uma semana a um mês. As células transduzidas foram reconhecidas testando a expressão do gen heterólogo, como descrito abaixo. Nesta realização, o produto farmacêutico é codificado pelo gene heterólogo do vector híbrido e pode ser qualquer produto farmacêutico capaz de ser expresso pelo vector híbrido. Tais produtos incluem a, fie gama-globina, insulina, GM-CSF, M-CSF, EPO, TNF, MGF, interleu-quinas, o produto do gene do retinoblastoma, p53 ou adenosina-de-saminase. Portanto, o presente invento pode oferecer a produção de níveis constitutivos de produtos de genes heterólogos dentro de vesículas membranares, especificamente eritrócitos, para o tratamento in situ de doenças. Facultativamente, o vector híbrido pode ainda compreender uma sequência que codifica um peptídeo sinal ou outra fracção que facilita a secreção do produto do gene pelas células eritrõides. Tais sequências são bem conhecidas dos familiarizados com a matéria [ver por exemplo, Michaelis et al. (1982) Ann. Rev. Microbiol. .36, 435] e pode ser inserido nos presentes vectores entre o promotor e a região codificadora pelos 29 métodos aqui descritos. Este método pode ser usado para tratar uma variedade de doenças e perturbações e não está limitado ao tratamento de hemoglobinopatias, uma vez que o gene heterólogo é expresso constitutivamente e pode ser libertado pelos eritrócitos devido a uma sequência secretora ou libertado quando os eritrõ-citos são lisados no fígado e baço.

Os exemplos que se seguem ilustram melhor o presente invento. EXEMPLO 1

Integração Específica de Sítio do Genoma de AAV Recombinante A integração específica de sítio do genoma de AAV foi confirmada por uma abordagem em que fibroblastos diplóides humanos normais (HDF) foram sujeitos a uma infecção simulada ou infectados com uma multiplicidade de infecção (moi) crescente de AAV selvagem. Após múltiplas passagens seriadas destas células em cultura, o seu DNA genómico total foi sioaldo, digerido com uma variedade de endonucleases de restrição e analisado por transferências Southern usando uma sonda de DNA específica de AAV. Uma transferência Southern representativa está apresentada na Fig. 4. As enzimas de restrição estão indicadas no topo da figura. A moi está indicada no topo de cada uma das faixas, com 0,0 indicando a infecção simulada. A banda isolada predominante da hibridação é evidência de que o genoma de AAV selvagem integra-se no DNA cromossómico de células diplóides humanas normais numa forma específica de sítio. 0 sítio alvo foi saturado apenas a uma moi muito alta de AAV e não foi empregue qualquer processo de selec-ção para seleccionar populações de células que integraram o provírus. A integração específica de sítio do genoma de AAV recombinante foi demonstrada usando células de medula óssea humana, as quais são as células alvo para a terapia de hemoglobi-nopatias.

As células de medula óssea foram obtidas a partir de dadores voluntários normais e células de medula óssea mononuclea-das de baixa densidade (LDBM) foram isoladas ou centrifugação em gradientes de densidade com Ficoll-Hypaque. As células infectadas com LDBM foram infectadas com os viriões recombinantes AAV-Neo 31 (vSV40-Neo), em que o gene Neo, sob o controle do promotor precoce do SV40 é encapsidado em partículas de AAV e incubadas na presença de várias citocquinas tais como GM-CSF (1 ng/ml) e IL-3 (1 ng/ml) durante 48 horas. As células foram incubadas em culturas líquidas na presença de G418 a 37°C durante 10 dias, o seu DNA total genómico foi sioaldo, clivado com BamHI e analisado numa transferência Southern usando uma sonda de DNA específica de Neo como se mostra na Fig. 5. A concentração de G418 esta indicada no topo de cada faixa. A obtenção de uma só banda de hibridação indicada pela seta demonstra que o genoma virai de AAV recombinante sofre integração específica de sítio no DNA cromossõmico de células de medula óssea humana. EXEMPLO 2

Construção dos Plasmídeos Recombinantes PWP-7A e oWP-19 A estratégia geral usada para construir os vectores plasmídeo protótipos, designados pWP-7A e pWP-19, respectivamente está descrito na Figura 6, Os sítios Xbal no plasmídeo psub201 foram convertidos em sítios EcoRI por ligação de adaptadores sintéticos Xbal-EcoRI-Xbal como descrito por Srivastava et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 86, 8078. A região codificadora de AAV foi removida após digestão com EcoRI e o DNA vector contendo as duas ITRs de AAV foi isolado a partir de géis de agarose preparativos (Seth [1984] Gene Anal. Tech. 1, 99) e tratados com Pollk para gerar extremos cerses. De forma semelhante, o DNA de pBR322 foi clivado com EcoRI e PvuII e um fragmento de 2066 pb contendo toda a região codificadora de um gene da resistência à tetraciclina (Tcr) foi também dotado de extremos cerses com Pollk. Estes dois fragmentos foram ligados e usados para transformar células competentes de E. coli HB101 pelos métodos convencionais descritos em Sambrook et al. (1989) para 32 gerar um plasmídeo, designado pWP-7A. Uma vez que a ligação de extremos cerses de fragmentos de DNA contendo extremos EcoRI e Pvul reparados e regenera um sítio EcoRI, o plasmídeo pWP-7A pode ser clivado com EcoRI a jusante do gene Tc para clonagem de um gene ou cassete de interesse. 0 gene neor sob o controle do promotor da timidina-cinase (TK) de herpesvírus foi isolado a partir do plasmídeo pHSL-172 (Tratschin et al. [1985] Mol. Cell. Biol. 5, 3251) por digestão parcial com PvuII e ligados os extremos cerses a DNA d pWP-7A tratado com PolIK. O plasmídeo recombinante resultante, designado pWP-8A, está apresentado na Figura 6-A. O plasmídeo pWP-19 foi construido como se segue. O plasmídeo pWP-8A foi linearizado com HindIII, o qual cliva no extremo 5' do gene Tc e parcialmente digerido com Xmnl para remover o gene Tcr. Um plasmídeo pGBOR que contem um gene para a resistência à ampicilina (Apr) e sequências do operador do bacteriofago lambda (0R1/0R2; lambda o) (Samulski et al. [1991] EMBO J. JLO, 3941) foi clivado com EcoRI e Xbal e o fragmento contendo a sequência lambda o foi ligada nos extremos cerces a DNA de pWP-8A tratado com Pollk descrito atrás. O plasmídeo recombinante resultante pWP-19 está apresentado na Figura 6-B.

Os vectores de plasmídeo pWP-7A e pWP-19 são úteis na construção de genomas de AAV recombinante porque é possível a inserção directa de uma sequência com interesse em ambos e a presença do gene neor em pWP-19 proporciona uma marca seleccioná-vel forte em células humanas. Vector plasmídeo pWN-1 é particularmente útil pois tem várias características com interesse. Em células bacterianas, estas incluem: 1) A disponibilidade de uma variedade de sítios de clonagem (EcoRI, Saci, Kpnl, Xbal, Sall, Accl, HincII, PstI, Sphl e HindIII) incluindo o sítio Ndel; 2) As ITRs de AAV são bem separadas dos sítios de clonagem; e 3) a . . V* utilização de Tc assim como de Ap como marcas selectivas. Nas células de mamífero, após transfecção na presença do plasmídeo 33

auxiliar AAV e de Ad, a inserção com interesse, a qual está agora flanqueada pelas duas ITRs de AAV na sua orientação correcta (ver Figura 7), pode ser eficazmente pescada a partir do gene Tcr seguido de replicação de DNA e encapsidação nos viriões da progénie de AAV.

Se bem que o plasmídeo pWP-7A seja útil na clonagem de inserções até 2,5 Kb de tamanho no sítio único EcoRI, o plasmídeo pWP-19 oferece um gene marcador neor assim como uma série de sítios de clonagem tais como BamHI, Saci e Kpnl e inserem até 2,6 Kb entre as duas ITRs de AAV. EXEMPLO 3

Construção do Plasmídeo Recombinante pWN-1 A estratégia para construir o plasmídeo recombinante pWN-1 está apresentada na Figura 7. Resumidamente, o DNA do plasmídeo psub201 foi digerido totalmente com Xbal e PvuII e um fragmento Xbal-PvuII de 191 pb contendo toda a sequência das ITRs de AAV foi isolada como descrito no Exemplo 2. De forma semelhante, o DNA do plasmídeo pBR322 foi clivado com EcoRI e Aval para £ isolar um fragmento de 1425 pb que contem o gene Tc mas que não contem a sequência da origem de replicação do DNA ("ori"). Este fragmento foi tratado com PolIK para gerar extremos cerses. 0 fragmento EcoRI-Aval de extremos cerses foi misturado com um grande excesso do fragmento Xbal-PvuII contendo a ITR de AAV, ligada nos extremos cerses usando DNA-ligase de T4 e depois digerido exaustivamente com Xbal. Isto resultou na produção do gene Tcr flanqueado por uma ITR de AAV em cada extremo mas na orientação oposta (ver as setas pequenas nas ITRs dentro de caixas). Este fragmento foi subsequentemente ligado no sítio 34 34

• Τ* único Xbal no plasmídeo pGBOR descrito atrás e Tc foi usado para seleccionar o plasmídeo recombinante pWN-1. EXEMPLO 4

Pescagem e Replicacão de uma Inserpao Clonada a partir de Plasmí-deos Baseados em AAV Recombinante

As sequências de DNA flanqueadas pelas duas ITRs de AAV podem ser pescadas dos plasmídeos recombinantes dos Exemplos 2 e 3 após transfecção de células humanas na presença de AAV e de proteínas Ad como indicio de uma encapsidação com êxito destes genes em viriões AAV maduros. O tamanho da inserção entre as duas ITRs de AAV no plasmídeo pWP-8A é semelhante ao do genoma de AAV selvagem. AAV-gene rep, o plasmídeo parental psub201, assim como as sequências 0R1/0R2 de lambda derivadas do plasmídeo pGBOR foram isoladas e inseridas no plasmídeo pWP-19 pela estratégia mostrada na Fig. 8-A. Obtiveram-se os dois plasmídeos recombinantes, pWP-21 e pWP-22 contendo o gene AAV-rep em orientações

• . 1C diferentes relativamente ao gen neo . Estes plasmídeos estão descritos na Fig. 8A. De forma semelhante, o tamanho da inserção entre as duas ITRs de AAV no plasmídeo pWN-1 foi aumentado pela • T* , ^ , inserção do gene neo no sitio Ndel ou no sitio PstI para gerar dois plasmídeos recombinantes, pWP-16 e pWP-17, respectivamente, os quais estão apresentados na Figura 8-B.

Os plasmídeos pWP-8A, pWP-21, pWP-22, pWP-16 e pWP-17 foram transfectados sozinhos ou cotransfectados com o plasmídeo auxiliar AAV (pAAV/Ad) separadamente, em células KB humanas infectadas com Ad (Samulski et al. [1989] J. Virol. 63, 3822; Srivastava et al. [1989]; Srivastava [1990] Blood 76, 1997). Amostras de DNA de Mr baixa isoladas pelo método descrito por Hirt (1967) J. Mol. Biol. 26, 365, foram digeridas com Dpnl e 35 analisados em transferências Southern (Southern [1975] J. Mol. Biol. 98., 503) usando uma sonda de DNA específica de neo como anteriormente descrito (Samulski et al.. 1989). Os resultados estão apresentados na Figura 9. Não houve pescagem/replicação do gene recombinante neor a partir do plasmídeo pWP-8A na ausência do plasmídeo auxiliar pAAV/Ad (Faixa 1); A pescagem com êxito e replicação de facto ocorreu quando as proteínas AAV-Rep foram fornecidas in trans (Faixa 2), como detectado pela presença dos intermediários replicativos monoméricos e diméricos característi-cos do genoma de AAV recombinante. De forma semelhante, a pescagem e replicação ocorreu a partir dos plasmídeos pWP-21 (Faixas 3 e 4) e pWP-22 (Faixas 5 e 6) mesmo na ausência do plasmídeo auxiliar devido a estes plasmídeos conterem o gene AAV-rep in cis. A pescagem e replicação a partir dos plasmídeos pWP-16 e pWP-17 também ocorreu, mas apenas na presença do plasmídeo auxiliar AAV (Faixas 8 e 10). , y*

Apos pescagem e replicação, o gene neo pode também ser encapsidado nos viriões maduros da progénie na presença das proteínas AAV-Cap, os viriões da progénie de AAV recombinante eram biologicamente activos e infecciosos. Por exemplo, os viriões recombinantes AAV-neo foram usados para transduzir e integrar estavelmente o gene neo numa variedade de células humanas diplóides e poliplóides. 0 gene neor transduzido estava biologicamente activo, conforme determinado pelas análises de expressão de genes em transferências Northern, assim como por isolamento rápido de populações clonais de células humanas que eram resistentes à geneticina. •‘V' 36 EXEMPLO 5

Construção de um Vector de Expressão e Clonaqem do Parvovírus Híbrido AAV-B19

Construiu-se, como se segue, um vector híbrido contendo as ITRs de AAV, o promotor B19p6 e o gene neor como gene heteró-logo. A estratégia geral para a construção deste vector, designado pB19-p6-Neor-AAV-ITR, está apresentado na Fig. 10.

Um clone de DNA de B19 de tamanho quase completo (por exemplo pVT104v em que B19 está a jusante do promotor SP6 de bacteriófago) foi clivado com Saci e Dral e o fragmento pequeno de DNA que contem a ITR esquerda foi rejeitado. Após religação de extremos cerses do fragmento maior, o DNA de plasmídeo foi clivado com EcoRI e Xbal para isolar o fragmento de 280 pb que contem toda a região não codificadora 5' e o promotor p6 de B19. Este fragmento foi clonado nos sítios EcoRI-Xbal do pUC19 para gerar um plasmídeo pB19p6. Este plasmídeo foi clivado com HincII a qual digere o fragmento B19 a jusante do promotor p6 e também o DNA de pUC19 no sítio de clonagem múltipla. 0 gene bacteriano Neo (Tratschm et al.. 1985) foi ligado nos extremos cerses a jusante do promotor de B19p6 entre os dois sítios HincII para gerar o plasmídeo pB19p6-Neor. Este plasmídeo foi digerido com EcoRI e HindIII e a inserção Bl9p6-Neo foi isolado e ligado entre as duas ITRs de AAV do psub201 digerido com Xbal. 0 vector foi encapsidado nos viriões maduros (vB19-Neo) por cotransfecção de células infectadas com adenovírus com pAAV/Ad, o qual contem a sequência codificadora de AAV e as sequências terminais do adenovírus tipo 5 (Samulski et al.. 1989). EXEMPLO 6

Transferência Mediada por Parvovírus Recombinante do Gene Neor Bacteriano em Células de Suporte Hematopoiéticas

As células de suporte hematopoiéticas humanas foram isoladas a partir de dadores voluntários seguido de escolha com anticorpos monoclonais contra os antigénios CD34 e DR humanos de acordo com o método de Lu et al. (1987) J. Immunol. 139. 1823 para produzir uma população de células CD34+DR . Sabe-se que esta população de células contem várias classes de células progenitoras hematopoiéticas humanas primitivas incluindo as blastõcitos formadores de colónias (CFU-B1), células formadoras de colónias com potencial proliferativo elevado (HPP-CFC) e as células responsáveis pela iniciação de hematopoiese a longo prazo in vitro (LTBMIC).

Aproximadamente 1 x 10 células CD34 DR isoladas a partir de dois dadores diferentes sofreram infecção simulada ou foram infectadas com várias moi com viriões vTK-Neo ou vB19-Neo. (vTK-Neo é o virião AAV recombinante contendo o gene Neor sob o controle do promotor da timidina-cinase (TK)). As células foram incubadas a 37°C durante uma semana na presença das citocinas interleuquina-3 (1 ng/ml), factor estimulador de colónias de granulócitos e macrófagos (1 ng/ml) e um factor designado factor de crescimento de mastõcitos (50 ng/ml). G418 foi adicionado numa concentração final de 250 μg/ml. O número total de células viáveis foi contado após uma semana de exposição à droga. A concentração de G418 foi então aumentada para 500 jug/ml e as contagens de células viáveis foram obtidas após duas semanas para as células infectadas com vTK-Neo e após uma semana para as células infectadas com vB19-Neo. Estes resultados estão apresentados na Fig. 11. 38 38

A exposição a viriões vTK-Neo resultou num aumento de quase 10 vezes na população de células hematopoiéticas resistentes a G418 comparado com as células sujeitas a infecção simulada, enquanto que a exposição a viriões vB19-Neo resultou num aumento de aproximadamente 4 vezes na mais alta dos viriões comparado com as células sujeitas a infecção simulada. Estes resultados sugerem que o promotor B19p6 está activo nas populações de células enriquecidas em HSC, se bem que num nível mais baixo comparado com o promotor TK. EXEMPLO 7

Avaliação da Especificidade de Tecido do Promotor B19p6 Células não eritrôides foram infectadas para determinar se o promotor B19p6 nas construções híbridas se tornou indiscriminado ou manteve a sua especificidade eritróide. Células humanas KB foram sujeitas a infecção simulada ou infectadas separadamente com moi equivalente de vTK-Neo e vB19-Neo. Às 48 horas pós-infecção as células foram expostas a várias concentrações de G418. Após um período de incubação a 37°C, os números aproximados de colónias resistentes a G418 foram contados. Uma colónia foi definida como um grupo de oito ou mais células. Estes resultados estão apresentados na Tabela 1 e demonstram que sob condições de infecção virai, o promotor B19p6 mantém a sua especificidade eritróide. 39 TABELA 1 Números Aproximados de Colónias Resistentes a G418 em Células KB Transduzidas com Viriões AAV-Neo 1 |Vírus Recombinante 1- |G418 200 I -!- jLtg/ml | G418 400 I 1 μg/ml|G418 600 I 1 jLtçf/ml | |1.Nenhum 1 110-20 I 1 1 0 1 1 0 |2. vTK-Neo 1 1TMTC* I 1 1100-200 1 | 50-100 |3. VB19-Neo l 1 110-20 J_ 1 1 0 _1_ 1 10 1 _1 *TMTC = Demasiadas para se fazer contagem EXEMPLO 8

Construção de Vectores Parvovírus com um Potenciador Específico de Células Eritróides

Para aumentar mais a expressão específica de tecido dirigida pelo promotor B19p6, o sítio Hipersensível 2 (HS-2) â DNAsel da Região de Controle do Locus (LCR), (Tuan et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 82, 6384), um potenciador específico de células eritróides, foi inserido nos vectores híbridos do presente invento. Conforme esquematizado na Fig. 12, o gene HS-2 foi inserido a montante do promotor B19p6 e do gene da luciferase para proporcionar o vector vHS2/Luc. Os sítios de restrição usados para facilitar a construção do vector estão apresentados na Fig. 12. Estas construções foram encapsidadas em viriões maduros de AAV. EXEMPLO 9

Construção dos Vectores de Parvovírus Contendo o Gene Normal da β-Globina Humana

Para proporcionar vectores para a transferência de genes em casos clínicos de β-talassémia e de anemia de células falsiformes, os dois vectores plasmídeo que contêm o gene normal da β-globina humana foram construidos e encapsidados nos viriões recombinantes de AAV. A construção pHS2/B-globina-Neo contem o promotor da β-globina e o potenciador a montante HS-2, juntamente V* com o gene Neo sob o controle do promotor de Tk e a construção pHS2/B19-globina-Neo também contem o promotor B19p6. Estas construções estão apresentadas na Fig. 13.

Construiu-se o vector pHS2/fi-globina-Neo como se segue. Um plasmídeo (pWP19) foi construido contendo o gene Neor sob o controle do promotor TK entre as duas ITRs de AAV. pW19 foi linearizado com Saci. Um fragmento SnaBl-Pstl contendo o clone genómico do gene da β-globina humana foi ligado, na orientação contrária, a montante do promotor TK. 0 plasmídeo resultante foi linearizado por digestão com Kpnl e um fragmento HindIII-Xbal contendo o potenciador HS2 foi ligado a montante do promotor da β-globina.

Construiu-se o vector pHS-2/B-19-globina-Neo como se segue. Primeiro o fragmento HindIII-Xbal contendo o potenciador HS2 foi clonado a montante do promotor B19p6 no plasmídeo pB19p6 linearizando-o com EcoRl. o fragmento HS2-B19p6 foi isolado por digestão deste plasmídeo com pvull e HincII. 0 fragmento pvull--HincII foi ligado ao plasmídeo pWP19 linearizado com Saci. Segundo a região codificadora da β-globina sem o promotor da β-globina foi retirado por digestão do plasmídeo com Ncol e PstI. 41

Este fragmento NcoI-PstI foi ligado ao plasmídeo descrito atrás por linearização com Kpnl.

De forma semelhante, os vectores contendo o gene da α-globina humana em ambas as orientações foram construídos e encapsidados em viriões AAV recombinantes. 0 fragmento Hinfll- -PvuII do gene da α-globina clonado (Liebhaber, 1980) foi ligado a jusante do promotor B19p6 após linearização do DNA de plasmídeo pB19p6. 0 plasmídeo resultante foi linearizado com Fspl e ligado ao plasmídeo pWP19 no sítio Saci antes da encapsidação em viriões de AAV. EXEMPLO 10

Transducão por AAV de Células Humanas com o Gene de Resistência a Multidrogas

Para avaliar a capacidade dos vectores AAV para conferirem o fenótipo de resistência a multidrogas a células humanas sensíveis a drogas, células humanas KB sensíveis a drogas foram transduzidas com o vector AAV contendo o gene mdr sob o controle do promotor da timidina-cinase. A expressão do fenótipo mdr foi avaliada por detecção da P-glicoproteína com um anticorpo específico desta proteína. Ainda, a capacidade das células transduzidas em reduzirem a acumulação intracelular de certas drogas anti-tu-morais foi avaliada pela cultura das células transduzidas numa série de meios de cultura de tecidos contendo concentrações crescentes da droga seleccionada. Um aumento na viabilidade das células transduzidas relativamente às células testemunha (não transduzidas) indica expressão do gene mdr.

Para avaliar a capacidade dos vectores AAV do presente invento em conferirem resistência a multidrogas específica de 42 42

célula, células eritróides e não eritróides (e.;g. KB sensíveis a drogas) foram transduzidas com o vector AAV contendo o gene mdr sob o controle do promotor B19p6 (AAV-B19p6-mdr). As células KB foram transduzidas e testadas como descrito atrás. Uma vez que o promotor B19p6 dirige a expressão específica de células eritróides, o gene mdr não é expresso por transdução de células KB com AAV-B19p6-mdr. A capacidade de AAV-B19p6-mdr para conferir resistência a multidrogas específica de células eritróides foi avaliado como se segue. Removeu-se medula óssea de um doente, enriqueceu-se em células CD34+ e transduziu-se com AAV-B19p6-mdr. Estabeleceram-se então culturas primárias e mantiveram-se até colónias focais poderem ser transferidas para placas de cultura de tecidos. 0 crescimento de tais colónias permite a avaliação da resistência a uma gama de drogas anti-tumorais. 0 vector AAV-B19p6-mdr é útil na quimioterapia do cancro. Por exemplo, a medula óssea foi removida da cristã ilíaca de um doente com cancro e enriquecida em células CD34+. As células enriquecidas foram transduzidas por AAV-B19p6-mdr e novamente introduzidas por infusão no doente. 0 promotor Bl9p6 pode ser substituído por outros elementos de promotores específicos de células para permitir a expressão do fenótipo de resistência a multidrogas em outras células. EXEMPLO 11 Células de uma linha celular humana de eritroleucémia, K526 (ATCC CCL-243) foram infectadas com vHS2/B19-globina-Neo 43 43

(ver Exemplo 9 e Fig. 13) para avaliar a capacidade do vector em proporcionar a expressão do gene da β-globina numa célula hospedeira a qual não apresenta expressão do gene da β-globina. Células K562 foram sujeitas a infecção simulada ou infectadas separadamente com moí equivalentes de vHS2/B19-globi-na-Neo e vHS/B-globina-Neo. 0 DNA das células infectadas foi isolado digerido com Ncol e sujeito a análise de transferência Southern. A Fig. 14 proporciona uma transferência Southern na qual a faixa 1 corresponde a DNA isolado a partir de células sujeitas a infecção simulada e a faixa 2 corresponde a DNA isolado a partir de células infectadas com vHS/fi-globina-Neo. As transferências foram despistadas com uma sonda de gama-globina (painel esquerdo) e uma sonda da β-globina (painel direito). A seta indica o alelo transduzido do gene da β-globina em células K562 infectadas com vHS2/B-globina-Neo. Resultados semelhantes foram obtidos a partir de células K562 infectadas com VHS2/B19--globina-Neo. 0 gene da β-globina está presente mas não é expresso em células K562. As transferências Northern de RNA total derivado de células infectadas e não infectadas descritas atrás foram despistadas com uma sonda da neomicina (Fig. 15, painel esquerdo) e uma sonda da β-globina (Fig. 15, painel esquerdo). 0 painel central da Figura 15 apresenta um gel corado com brometo de etídio. A faixa 1 em cada um dos painéis representa RNA derivado de células não infectadas; as faixas 2 e 3 correspondem a RNA derivado de células infectadas com vHS2/fi-globina-Neo; as faixas 4 e 5 correspondem a RNA derivado de células infectadas com vHS2/B19-globina-Neo. Os sinais de mais e menos indicam a presença ou ausência. 44 44

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS (1) INFORMAÇÃO GERAL: (i) REQUERENTE: Srivastava, Arun

(ii) TÍTULO DO INVENTO: VECTOR SEGURO PARA A TERAPIA COM GENES (iii) NÚMERO DE SEQUÊNCIAS: 2 (iv) ENDEREÇO PARA CORRESPONDÊNCIA: (A) DESTINATÁRIO: Scully, Scott, Murphy Presser (B) RUA: 400 Garden City Plaza (C) CIDADE: Garden City (D) ESTADO: New York

(E) PAÍS: USA (F) CÓDIGO: 11530 (V) FORMA LEGÍVEL EM COMPUTADOR: (A) TIPO DE MEIO: Disco flexível

(B) COMPUTADOR: PC compatível com IBM

(C) SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS (D) SOFTWARE: Patentln Release q.O, Versão q.25 (vi) DADOS CONVENCIONAIS DO PEDIDO DE PATENTE: (A) NÚMERO DO PEDIDO DE PATENTE: (B) DATA DE ENTREGA: (C) CLASSIFICAÇÃO: (vii) PROCURADOR/INFORMAÇÃO DO AGENTE: — X / X / (A) NOME: Mc Nulty, William E. (B) NUMERO DE REGISTO: 22,606 (C) REFERÊNCIA/NÚMERO DO DOCUMENTO: 8361 (ÍX) INFORMAÇÃO PARA TELECOMUNICAÇÃO: (A) TELEFONE: (516) 742-4343 (B) TELEFAX: (516) 742-4366

(C) TELEX: 230 901 SANS UR (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:l: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 145 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (li) TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:l: 50 100 145

TTGGCCACTC CCTCTCTGCG CGCTCGCTCG CTCACTGAGG CCGGGCGACC AAAGGTCGCC CGACGCCCGG GCTTTGCCCG GGCGGCCTCA GTGAGCGAGC GAGCGCGCAG AGAGGGAGTG GCCAACTCCA TCACTAGGGG TTCCT (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:2: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 225 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear 46 (ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genõmico) (XÍ) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:2:

TTTTAGCGGG CTTTTTTCCC GTTTTACTAT AATTTTATTG GCGTAGGCGG GGACTACAGT CTTTCTGGGC TGCTTTTTCC CTAACAGGTA TTTATACTAC

GCCTTATGCA AATGGGCAGC GTTAGTTTTG TAACGGTTAA ATATATAGCA CGGTACTGCC TGGACTTTCT TGCTGTTTTT TTGTT CATTTTAAGT 50 AATGGGCGGA 100 GCAGCTCTTT 150 TGTGAGCTAA 200 225 de 1992

Lisboa, 6 de Novembro

J. PEREIRA DA CRUZ

Agente Oficial da Propriedade Industrial RUA VICTOR CORDON, 10 -A 3.» 1200 US0OA

Claims

REIVINDICAÇÕES ia. - vector de expressão para integração especifica de sítio e expressão de genes específica de célula, caracterizado por compreender duas repetições terminais invertidas do vírus 2 associado a adeno e pelo menos uma cassete compreendendo um promotor capaz de efectuar a expressão específica de célula em que o referido promotor está operacionalmente ligado a um gene heterólogo e em que a referida cassete fica entre as referidas repetições terminais invertidas. 2§. - Vector de acordo com a Reivindicação 1, caracterizado por cada uma das referidas repetições terminais invertidas compreender os nucleótidos de SEQ ID N0:1.
32. - Vector de acordo com a Reivindicação 1, caracterizado por cada uma das referidas repetições terminais invertidas compreender os nucleótidos 1 a 125 da SEQ ID NO:l. 4¾. - Vector de acordo com a Reivindicação 1, caracterizado por o referido promotor ser um promotor do parvovírus B19. 5â. - Vector de acordo com a Reivindicação 4, caracterizado por o referido promotor do parvovírus B19 ser o promotor p6. 62. - vector de acordo com a Reivindicação 4, caracterizado por o referido promotor do parvovírus B19 compreender os nucleótidos da SEQ ID NO:2. 2 2

7 2. - Vector de acordo com a Reivindicação 1, rizado por o referido gene heterólogo codificar uma biologicamente funcional. caracte- proteína
82. - Vector de acordo com a Reivindicação 1, caracte-rizado por o referido gene heterólogo codificar uma proteína biologicamente não funcional.
92. - Vector de acordo com a Reivindicação 1, caracte-rizado por o referido gene heterólogo codificar um RNA anticodão.
102. - Vector de acordo com a Reivindicação 1, caracte-rizado por o referido gene heterólogo ser seleccionado a partir do grupo constituído por um gene codificador de a-globina, β-globina, gama-globina, factor estimulador das colónias de granulõcitos e roacrófagos (GM-CSF), factor de necrose tumoral (TNF), qualquer uma das interleuquinas 1-11, resistência ã neomicina, luciferase, adenina-fosforribosil-transferase (APRT), retinoblastoma, insulina, factor de crescimento de mastócitos, p53, adenosina-desaminase.
112. - Vector de acordo com a Reivindicação 1, caracte-rizado por o referido gene heterólogo codificar p-glicoproteína. 12®. - Vector de acordo com a Reivindicação 9, caracte-rizado por o referido RNA anticodão ser complementar de um segmento do DNA ou RNA codificador da a-globina. 13 a. - Vector de acordo com a Reivindicação 5, caracte-rizado por o referido vector ser AAV-B19-GM-CSF, AAV-B19-APRT, AAV-B19-neor, AAV-B19-RB,. AAV-B19-B-globina, AAV-B19-a-globina, AAV-B19-gama-globina. 3
8. - Vector de acordo com a Reivindicação 5, caracte-rizado por o referido vector ser AAV-B19-mdr. 8. - vector de acordo com qualquer uma das Reivindicações 1-14 caracterizado por o referido vector está contido numa célula hospedeira.
168. - Vector de acordo com qualquer uma das Reivindicações 1-12, caracterizado por o referido vector estar contido num virião.
178. - Vector de acordo com a Reivindicação 16, caracterizado por o referido vector estar contido numa célula hospedeira. 8. - Vector de acordo com a Reivindicação 15 ou 17,caracterizado por a referido célula hospedeira ser uma célula hematopoiética de suporte ou progenitora. 8. - Método de utilização do vector de acordo com a Reivindicação 1, para a terapia com genes, caracterizado por compreender : a) a obtenção de células da medula óssea partir de um doente; b) a transdução das referidas células da medula óssea com o vector de acordo com a Reivindicação 1; e c) a reintrodução das referidas células de medula óssea transduzidas no referido doente.
208. - Método de acordo com a Reivindicação 19, caracterizado por a referida transdução ser conseguida por transfecção com o referido vector ou por infecção com viriões contendo o referido vector. 4
222. - Método de acordo com a Reivindicação 19, carac-terizado por a referida terapia com genes compreender o tratamento de anemia de células falciformes ou diabetes. 2. - Método de acordo com a Reivindicação 19, carac-terizado por a referida terapia com genes compreender o tratamento de talassémia. 24s. - Método de acordo com a Reivindicação 23, carac-terizado por o referido vector ser AAV-B19-a-globina ou AAV-B19--β-globina. 2. - Método de acordo com a Reivindicação 19, carac-terizado por a referida terapia com genes compreender o tratamento de doenças hematopoiéticas. 2 6s. - Método de acordo com a Reivindicação 25, carac-terizado por o referido vector ser AAV-B19-GM-CSF. 2. - Método de acordo com a Reivindicação 25, carac-terizado por a referida terapia com genes compreender tratamento de cancro. 2. - Método de acordo com a Reivindicação 27, carácter izado por o referido vector ser AAV-B19-RB.
292. - Método de acordo com avincação 19, caracterisado por a referida terapia com genes compreender o tratamento de hemoglobinopatias.
302. - Método de acordo com a Reivindicação 29, carac-terizado por o referido vector ser AAV-B19-B-globina, AAV-B19-a--globina ou AAV-B19-gama-globina. 5
312. - Método de utilização do vector de acordo com a Reivindicação 1, para a administração de um produto farmacêutico num mamífero caracterizado por compreender: a) a obtenção de células da medula óssea a partir do referido mamífero; b) a transdução das referidas células de medula óssea com o vector de acordo com a Reivindicação 1 e c) a reintrodução das referidas células de medula óssea transduzidas no referido mamífero. 32s. - Método de acordo com a Reivindicação 31, caracterizado por a referida transdução ser conseguida por transfecção ou por infecção com viriões contendo o referido vector.
332. - Método de acordo com a Reivindicação 31, caracterizado por o referido produto ser gama-globina, insulina, factor estimulador das colónias de macrófagos, factor estimulador das colónias de granulócitos, eritropoietina, factor de necrose tumoral, factor de crescimento de mastócitos, qualquer uma das interleuquinas 1-11, p53, adenosina-desaminase ou uma molécula de RNA anticodão. 2. - Método de acordo com a Reivindicação 31, caracterizado por o referido produto ser o factor estimulador das colónias de granulócitos e macrófagos. 35s. - Método de acordo com a Reivindicação 34, caracterizado por o referido vector ser AAV-B19-GM-CSF. carac-
62. - Método de acordo com a Reivindicação 31, terizado por o referido produto ser a-globina. 6

3. - Método de acordo com a Reivindicação 31, carac-terizado por o referido vector ser AAV-Bl9-a-globina. 38^. - Método de acordo com a Reivindicação 31, carac-terizado por o referido produto ser β-globina.
393. - Método de acordo com a Reivindicação 38, carac-terizado por o referido vector ser AAV-B19-B-globina.
403. - Método de acordo com a Reivindicação 31, carac-terizado por o referido produto ser retinoblastoma.
413. - Método de acordo com a Reivindicação 40, carac-terizado por o referido vector ser AAV-B19-RB.
423. - Método de utilização do vector de acordo com a Reivindicação 11 para conferir resistência a várias drogas específica de célula a um doente, caracterizado por compreender: a) a obtenção de células da medula óssea a partir de um -doente; b) a transdução das referidas células da medula óssea com o vector de acordo com a Reivindicação 11; e c) a reintrodução das referidas células de medula óssea no referido doente.
433. - Método de utilização do vector de acordo com a Reivindicação 14 para conferir resistência a várias drogas a células eritróides de um doente, caracterizado por compreender: a) a obtenção de células de medula óssea a partir de um doente; b) a transdução das referidas células de medula óssea com o vector de acordo com a Reivindicação 14; e 7 c) a reintrodução das referidas células de medula óssea transduzidas no referido doente. 44®. - Método de acordo com a Reivindicação 42 ou 43, caracterizado por a referida transdução ser conseguida por transfecção com o referido vector ou por infecção com viriões contendo o referido vector. 45®. - Método de a cordo com qualquer uma das Reivindicações 19, 31, 42 ou 43, caracterizado por as referidas células de medula óssea serem enriquecidas em células de suporte antes da transdução. Lisboa, 6 de Novembro de 1992

J. PEREIRA DA CRUZ Agente Oficial da Propriedade Industrial RUA VICTOR CORDON, 10-A 3.» 1200 LISBOA