PT1017713E - Antagonistas cíclicos de receptores de c5a e de receptores acoplados à proteína g - Google Patents

Description

Λ?: AM!MQmjTM CÍC&.XÇOS B1EECBFTOEES DE CS a E BE lECIFfCMIi ACOPLADOS 1 MQT1ÍM& d A presente invenção tem por objecto novos compostos cíclicos capazes de regular a actividade dos receptores acoplados à proteína G, quer os agonistas, quer os antagonistas. Em particular, a presente invenção tem por objecto antagonistas cíclicos pépticos e não pépticos de C5a. Os compostos da presente invenção são simultaneamente potentes e selectivos e são úteis para o tratamento de uma variedade de estados inflamatórios. A activação do complemento humano, um sistema de proteínas plasmáticas, envolvido na defesa imunológica em resposta à infecção e à lesão, contribui de forma significativa para a patogénese de numerosas doenças agudas e crónicas. Em particular a proteína do complemento C5a tem sido largamente investigada. Para revisão, ver Whaley (1987) e Sim (1993) . 0 quadro 1 apresenta um resumo dos papéis conhecidos da C5a nas doenças.

Durante a defesa do hospedeiro, o sistema do complemento das proteínas do plasma inicia respostas inflamatórias e respostas imuno-celulares a estímulos, tais como a organismos infecciosos (bactérias, vírus, parasitas), a lesões químicas ou físicas, à radiação ou a neoplasias. 0 complemento ê activado através de uma cascata complexa de eventos proteolíticos interligados que produz múltiplos péptidos bioactivos, alguns dos quais (por exemplo, as anafilatoxinas C3a e C5a) interagem com os componentes celulares para propagar os processos Inflamatórios. A àOtJuBÇéo do complemento, quer pela via clássica, após o ligação antigénio-anticorpo (Ag/Ao·, quer pela via alterna- ' do anticorpo, termina com urra sequência terminal de eventos em que o C5 da proteína § clivado ror clivagem proteolítica pela C5-convertase formando C5a e C5b. Esta facilita a formação de um "complexo de ataque à membrana" que perfura as membranas das células-alvo, tal como as bactérias, levando a dispersão, h lise e a morte das células. As etapas em cascata são rigorosamente reguladas para evitar a amplificação gradual da proteólise induzida pelas proteases formadas sequencialmente. Se estes mecanismos reguladores se tornarem ineficazes, pode resultar uma actívação prolongada do complemento, provocando melhores respostas inflamatórias como nas doenças auto-imunes.

Embora sejam conhecidas as características principais do sistema do complemento e a sua actívação, os detalhes do seu mecanismo são ainda muito pouco conhecidos. Um dos principais mediadores e muito potente das respostas inflamatórias é a gllcoproteína do plasma C5a, que interage com os receptores de superfície específicos (C5aR) nos mastócitos, nos neutrófilos, nos monócitos, nos macrófagos, nas células não mielóides e nas células endoteliais vasculares (Gerard e Gerard, 1994). 0 C5aR é um receptor acoplado à proteína G com sete hélices da transmembrana (Gerard e Gerard, 1991). Este receptor pertence â super-família da rodopsina, das proteínas de ligação ligadas a-o GTP (trífosfato de guanosína), mas difere dos receptores de já ortare antes ::Mn

Os receptores acoplados à proteína G são prevalentes em todo o corpo humano, constituindo 80 % dos tipos de receptores celulares conhecidos e medeiam a transdução de sinal através da membrana celular para uma vasta gama de ligandos endógenos. Fatticiptm em diversas matrizes dos processos fisiológicos e que incluem, mas não se limitam aos associaaos aos distúrbios cardiovasculares, aos do sistema nervoso central e periférico aos reprodutivos, aos metabólicos, acs digestivos, aos imano-inflamatôríos e aos de crescimento, bem como outros distúrbios da regulação e proliferação celular. Os agentes, quer agonistas quer antagonistas, que de forma selectiva regulam as funções dos receptores acoplados a proteína G têm importantes aplicações terapêuticas. 0 C5a e vn dos mais potentes agentes icot conhecidos que atrai neutrófilos e macrófagos para os locais da lesão, alterando a sua morfologia; induz a desgranulação; aumenta a mobilização do cálcio, a permeabilidade vascular (edema) e a adesão de neutrófilos; contrai o músculo liso; estimula a libertação de mediadores inflamatórios (incluindo histaminas, FNT-α (factor de necrose tumoral-alfa)5 IL-I, IL-6, IL-8 (interleucinas), prostaglandinas e leucotrienos) e enzimas lisossomais; promove a formação de radicais de oxigénio e intensifica a produção de anticorpos (Gerard e Gerard, 1994) . A sobre-expressão ou a sub-regulaçâo de C5a está envolvida na patogénese de estados ímuno-inflamatorios, tais corno artrite reumatóide, síndroma de dificuldade respiratória do adtflSS AB.DS na terminologia inglesa), lúpus eritematoso sistémico, rsitòóic de de tecido, doença ικΐίβίηί do coração, lesão de ronoufavie, dnnros séptico, psoríase, gengivítes, ateroscierose, OOÇúÇS slt ::-0>:· nindurt::'.:' viá Ί i s o a ·· corpórea e ainda numa variedade de outros estados resumidos no quadro 1.

Quadro 1 0 papel de C5a na doença Níveis Expressão

Estado/doença Detalhes

de C5a de C5aR o estimulo por aler-genos leva a sintc- alergia -h- mas nasais e ao au mento dos níveis de C5a sobre-regulação do receptor nos astro- eitos reactivos, na microglia e nas cé- lulas endoteliais do SNC, no sistema do complemento activado por β-amílóíde SDRA/dificuldade respiratória níveis mais elevados doença de Bechet ++ logo antes da crise ocular síndroma de permeabilidade capilar dos níveis de os efluentes crónicas fluídos pulmonares de crianças com do-enças pulmonares crónicas, ventila-das mecanicamente

Churg-Strauss hipersensibilidade dos granuiócitos ao C5a fíbrose quística produção de C5a/e-feitos nas PMNs ícê-lulas polimcrfonu- cleares) stress da descom- níveis de C5a aumenta tados durante o mer- pressão gulho de saturação diabetes tipo I C5a produzido no início da doença; são activados os mora nócitos em circulação em pacientes com diagnóstico recente de diabetes do tipo I febre mediterrânica deficiência de familiar inactivador de C5a O t i í Imicr-Baros aumento do fluído η-, ύ cerebroespinal (FCE) tam-se com sCRl íre-ceptor 1 do complemento solúvel) o factox humoral so-doença de Kímura breregula a resposta das PMNs ao C5a do receptor nos ma-crófagos espumosos na Esclercse múltipla t-t PM aguda e cróni-sa e nos astrócítos fibrosos na EM crónica ç Cúd impta rsStiingl·'·'·· te experimental; ϊ ''Vp tp ·, V Λ· V ,· m .·.· d '-V ·-- -··

acumulação de PMN vista no FCE pancreatite ++

Os níveis de C5a gerado pela activa- síndroma após diálise ção do complemento por meio do material de entubação, níveis de CtaR diminuíram nas PMN e nos monó- citos em estados crónicos

dos durante o parto elevados níveis de C5a nas escamas leolo de mopur + + inibida pelo ê; corpo C5 Pt ++ detectado C5a no mor vítreo hu- elevada concentração de C5a ζά·:'ϊά rio fluido sinovial (5 vezes) e no plasma {3 vezes) artrite reumatóide +-t neutropénia congénita grave rejeição de trans-plante/enxerto os anticorpos mono-clonaiç bloqueiam os danos que acompanham o transplante xeno-genico; níveis aumentados de C5a encontrados no plasma e na urina de pacientes com rejeição de enxerto renal

Os novos agentes que Limitam as acções pró-inflamatórias de C5a têm potencial para inibir a inflamação crónica, bem como a dor que a acompanha e os danos dos tecidos. Por estas razões, as moléculas que evitam a ligação de G5a aos cous receptores sáo úteis potu o íiraLM-Puts de diPtúlbivP inflamatórios crónicos desencadeados pela e iCímooomio do E impor cante que estes compostos vêm vivvvv.;:) novos e válidos conhecimentos

Num outro contexto, os agonistas dos receptores de C5a ou de outros receptores acoplados à proteína G podem também ter propriedades terapêuticas ias situações em que quer o receptor acoplado à proteína G pode ser utilizado como um sitio de reconhecimento para a libertação de idasma.ccsç quer em situações em que a activação desses receptores pode ser utilizada para estimular algum aspecto do sistema imunitário dos seres humanos, por exemplo, no tratamento de cancros e de infecções virais ou parasíticas.

Uma abordagem para o desenvolvimento de agonistas ou de antagonistas do L5a ê através da preparação à base de receptores, utilizando os conhecimentos das estruturas tridimensionais do C5a, do seu receptor C5aR e das interacções entre eles. A estrutura do receptor e desconhecida. Determinou-se a estrutura da solução do C5a dos seres humanos, um péptido de 74 aminoácidos, fortemente catiónico e N-glicosilado com um hidrato de carbono de 3 kDa em Asn64 tratando-se essencialmente de um feixe de 4 hélices. Verificou-se que a extremidade C-terminal (65-74 resíduos, fôiín-nJ não era estruturada (Zuiderweg e outros, 1989) e esta flexibilidade conformacional nos terminais-C tem tornado extremamente difícil a interpretação de estudos sobre a relação função-estrutura. 0 C5a tem um núcleo central do N-terminal extremamente ordenado (1-64 resíduos; CtlU-nb , que consiste num feixe compacto de 4 bêllc-aa anti-paralelas (resíduos 4-12, 18-26, 32-39, 46-63) ligadas por anéis (13-17, 27-31, 40-45) e mté&iX:&zâá® posteriormente por 3 pontes de di-sulfureto ϊαηα :.:¾¾ daa:\:aasí::;a íu? làáã a d-dsat:ii:'la.ddií. ηΚί'ιΚηίί. ,* tnvaruf nta da daaaariitcadâ, a ®afe~ubidMlr ak xa ida a a aa y: Γα.αααηαα α,'αα:ά a Ç n;;·;· .Síid ff':: (Gerard e Gerard, 1991) . As livra rmcçõnn;;; entre C5a e C5aR têm sido objecto de muitas investigações que, en resumo, sugerem que C5a se liga por meio de un mecanismo de duplo sitio em que o domínio nuclear do N-terminal de C5a está envolvido no reconhecimento e na sua , do receptor, enquanto o C-terminal é responsável pela activa-ção do receptor. Este mecanismo está na figura 1. A região "efectora" do C-terminal contém em si toda a informação necessária para a transdução de sinal, e pensa-se que se liga na região inter-hélices do receptor (Sicilianoe outros, 1994; deMartino e outros, 1995).

Um região entre hélices, carregada positivamente, do N-terminal o Coo s responsável pelo reconhecimento do receptor e pela sua ligação e vai ligar-se a un domínio extracelular, carregado negativamente, de CStR (sítio l }', enquanto se pensa que a região "efectora" do C-rerminal se vai ligar a região inter-hélices do receptor (sítio 2) e e responsável pela activação do receptor conduzindo à transdução de sinal (Sicilianoe outros, 1994).

Descobriu-se que vários péptidos curtos derivados do C-terminal do C5a eram agonistas de C5a (Kawai e outros, 1991; Kawai e outros, 1992; Kohl e outros, 1993; Drapeau e outros, 1993; Ember e outros, 1992; Sanderson e outros, 1994 ; Sanderson e outros, 1995; Finch e outros, 1997; Tempero e outros, 1997; Konteatis e outros, 1994; DeMartino e outros, 1995). As estruturas de alguns destes agonistas estão representadas no quadro 2 a seguir, (compostos 1-6). Também se conhecem polípéptidos de elevado peso molecular ' í .'· ! da , do C5a no seu receptor, tal como se conhecem anticorpos monoclonaís do receptor de C5a ΚόΑίΑΑ:;:·:; e outros, 1932). posto 7, MAb··· K-P-dCha-W-r), é um antagonista completo do receptor de C5a sem nenhuma actividade agonista quando ensaiada em membranas celulares isoladas (Konteatis e outros, 1994) ou em célulM completas intactas. Este hexapéptido fci desenvolvido por modificações do agonista NMe-F-K-P-dCha-L-r, em que a foi proçressivamente substituída nos resíduos de leucína por substituintes de tamanho crescente (Cha, F, Nph e Wj. Isto teve como efeito a redução da actividade do agonista. Os ensaios de ligação ao receptor, realizados em membranas de neutrófilos isolados de seres humanos, mostraram que o antagonista tinha apenas 0,04 8 de afinidade relativa de C5a para o receptor (Konteatis e outros, 1994). A característica chave destes relatórios i a definição da ligação do antagonista 7 ao receptor de C5a. Estes autcres dizem que a arginina do C-terminal é essencial para a ligação do receptor e para a actividade antagonista. Este é também o caso em todos os relatórios sobre a activiáade agonista pelos análogos dos péptidos pequenos do C-terminal de C5a. Contudo, para o antagonista 7, os autores fcram mais longe e declararam que "o c^xbs-ãilâio do C-terminal é um requisito essencial para a actividade antagonista e para a ligação ao receptor"

Eles propõem que a necessidade do carboxilato é provavelmente o resultado da sua interacção especifica com uma arginina (Arg 206) no receptor (De Martino e outros, 1995). Esta ideia foi suportada por uma grande redução da afinidade do receptor para un analcgo do antagonista 7 em que a D-arginína ()¾-bui tCObd - dCdvbòtçcu: ddm nh2) foi subs-td.boiobí pela agmatína (bd-r^dir·' íCfd) diod (:NH) dH·· ) . dm irea5,0:00,

Ete Martino e outros reivindicam que a D-argínina interage,

Pensa-se . que ocorre uma interacção o carboxilato ot? C-terminal carregado negativamente do antagonista 7 e um resíduo da cadeia lateral carregado no receptor.

Os requerentes determinaram agora a estrutura da solução deste hexapéptido 7 e de vários análogos e verificaram, com surpresa, que de facto o grupo carboxiiato όο terminal não é um requisito para a ligação ao C5aR o para a actividade antagonista e que, em vez disso, mm invulgar característica estrutural não reconhecida até agora, uma conformação com ligação entre folhas çsittd conformation) , é responsável pela ligação e pela actividade do antagonista ou do agonista de C5a. 0 hexapéptido e vários novos antagonistas, relacionados sob o ponto de vista estrutural, foram examinados tanto em relação às afinidades de ligação ao receptor como em relaçáo à antagonista, utilizando células polimorfonucleares (PMN) intactas. Os resultados obtidos pelos requerentes mostram o requisito estrutural especifico, desconhecido até aqui, para a ligação dos antagonistas ou dos agonistas ou antagonistas de C5a ao receptor de C5a, que se acredita ser oornurn aos ligandos para a família dos receptores acoplados à proteína G. 0 estabelecimento deste requisito estrutural especifico permitiu aos requerentes desenhar e desenvolver sondas moleculares melhoradas do sistema do complemente e fármacos a base de CM e desenhar moléculas pequenas que atinjam outros receptores acoplados a proteína G, que têm vindo a ser reconhecidos de forma crescente como importantes alvos terapêuticos devido ao sou papel crucial na transdução de sinal (G protein-coupled Receptors, IBC Biomedical Library Series, 1996). âsséíín dsíS&nh&f B:à de grupos os rhhdluadõs rid:«::s estruturais hidrofóbicos à receptor íw xsil v: i r i ,-v d çXw n: , matriz ::·,ηΧ O: J .· hidrofébica sart ό;:::οΐη1;ΐ0 G, hqi i exemplo no sitio 2 do receptor de C5a apresentado na tigorâ 1. Tais matrizes ou que podem ser cíclicas ou acíclicas, não foram referidas até agora como modulado-res da actividade dos téapptór s* de C5a ou de ontrós receptores acoplados a proteína G. A patente de invenção norte-americana N° US A-5.386.011 descreve agonistas cíclicos de C5a e a sua utilização no tratamento de situações de doenças inflamatórias. A patente de invenção WO N° 95/25957 relata um ensaio para identificar compostos úteis como antagonistas de C5a e como antagonistas lineares de C5a e a sua utilização como agentes anti-inflamatórios e como reguladores imunológicos. A presente invenção tem por objecto moduiadores cíclicos da actividade dos receptores acoplados I proteína G.

Os compostos da presente invenção têm actividade antagonista contra o CSaSq não têm nenhuma actividade agonista de C5a e têtá a seguinte fórmula geral:

Estrutura II

A representa un átomo de H, em grupo alquilo, arilo, - a (N (alquilo)NH-arilo ou NH-acilo; OH, O-alquílo ou O-arilo; B represenra un grupo Slqld/lo,· fenilo, dmuiileç rxilillo ou índole, ou uma írsdndx lateral do um d- o-o L- attdôi-Dácido a^cõlhíéò ont ro fenilalanina, homo-fenilalanina, triptoftano, homo-triptofano, tirosina e C representa a cadeia lateral de um D- L- ou horno- amincácido escolhido no grupo constituído por prcli-na, alanina, ioHxrino:, valina, isoleucina, arginina, his-tidina, aspartato, glutamato, glutamina, asparagi-na, lisi-na, tirosina, iord.L iluniuu, ciclo-hexil-ala-nina, norleu-cina, triptofano, cisteína e metionina; D representa a cadeia lateral de un 3- ou L-arninoácido escolhido no grupo constituído por ciclo-hexil-ala-a , homo-ciclo-hexil-alanina, leucina, norleucina, homo-leucina, homo-norleucina e triptofano; E representa a cadeia lateral de un D- ou L-arninoácido escolhido no grupo constituído por triptofano e pomo-· triptofano; F representa a cadeia lateral de um D- ou L-aminoácido escolhido no grupo M' p _ por arginina, homo- arginina, lisina e homo-lisma; e fd representa o grupo - iCh-fdiH™ ou (CH2}n--S-, em que o siíídíòlo n. representa um número inteiro entre 1 e 4, - rÇíi;-d;:·-· f - (C1¾'} 4"· ou -CH2COCHRNH-, em que d repre- míyía :s ρρΡριρ lateral do qdmlqiisr aminoácido comom ou os fins desta memória o termo "alquilo" é para ser compreendido com-o 0.0 cadeia de alquilo linear, ramificada ou cíclica substituída ou não :·ηό ο-:::i·ícom 1 a 6 átomos de carbono, preferencial-mente 1 a 4 .»·. de carbono. Mais preferencialmente, o grupo alquilo representa um grupo metílo. 0 termo "acilo" significa u;i acilo substituído ou não substituído de 1 a 6, preferencialmente de 1 a 4 átomos de carbono. Mais preferencialmente o grupo acilo rerpesenta acetilo. 0 termo "arilo" deve entender-se como um grupo arilo, homo-cíclico ou hetero-cíclico, substituído ou insubstituído, em que o anel tem preferencialmente 5 ou 6 elementos.

Um aminoácido "comum" e um L-arninoácido escolhido no grupo constituído por glicina, leucina, isoleucina, valina, alanina, fenílalanina, tirosina, triptofano, aspartato, asparagina, glutamato, glutamina, cisteína, metionina, arginina, lisina, proiina, serína, treonina e histidina. um arninoácido "incomum" inclui, mas não se restringe aos D-aminoácidos, homo-aminoácidos, N-alquil-aminoácidos, desidro-aminoácidos, aminoácidos aromáticos (salvo fenil-alanina, tirosina e triptofano), ácidos orto-, meta- ou para-aminobenzóícos, ornitina, citrulina, norleucina, ácido γ-glutâmicc, ácido aminobutírico e os aminoácidos té-nli-substituídos.

Para os fins desta memória descritiva, deve ser claramente entendido que a palavra "compreendendo" significa "incluindo mas não se limitando a" e que a palavra ' . '! ' um significado correspondente.

De ácardb com ao: outro aspecto, a presente iiivoabíolb tem per objecoo uma que compreende um composto do acordo com a presente invenção em cbibj PPirtc;: eom osn veiculo ou um excipiente aceitáveis sob o ponto de vista farmacêutico.

As composições da presente invenção podem ser formuladas para utilização por via oral ou parentérica, mas as formulações orais são as preferidas. Espera-se que a maior parte, senão todos os compostos da presente invenção, sejam estáveis na presença das enzimas digestivas. Essa estabilidade pode ser rapidamente ensaiada por processos de rotina conhecidos dos especialistas desta técnica.

As formulações apropriadas para administração por qualquer via desejada podem ser preparadas por processos padrão, por exemplo, tendo como referência manuais bem conhecidos como Remington; The Science and Practice of Pharmacy, Vol. II, 1995 íl:â;3S edição), A. R. Gennaro (ed), Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania, ou Australian Prescription Products Guide, Vol. 1, 1995 (24a edição) J. Thomas (ed), Australian Pharmaceutical Publishhng Company Ltd, Victoria, Australia.

Num outro enquadramento, a presente invenção tem por objecto a utilização dos compostos de acordo com a presente invenção, no fabrico de um fármaco para ser utilizado num processo de tratamento de estados patológicos mediados por um receptor acoplado a proteína G, que compreende a etapa de administração de uma quantidade eficaz de um composto da presente invenção a um mamífero com necessidade desse tratamento. do adulto

Preferencialmente o estado mediado pelo receptor acoplado I. proteína G é um estado mediado por um receptor do C5a e rrtaís preferencíalmente envolve a scbre-expressac ou a iPviu':ragul-sçaCi do C5a. Estes estados incluem, nas nóo ssítiò livitioiPt s: artrite :::^euv:oiéid·ã^ síndroma d-e dificuldade respiratória do adulto tdDddç IddPJ vritoPui" toso sistémico, rejeição de enxerto de tecido, doença isquémica do on;:om5l;::p lesão de reperfusâc, choque séptico, psoriase, gengivites, aterosclerose, doença de Alzheimer, lesão pulmonar, síndroma após díálise extracorpórea.

Embora a presente invenção alio se restrinj a ao tratamento da norcoit animai ou espécie específicos, considera-se em particular que os nís da presente invenção serão ilidis no tratamento médico de seres humanos e podem também ser úteis no tratamento veterinário, em particular de animais de companhia, como cães e gatos, animais de quinta como vacas, cavalos e ovelhas e animais de jardim zoológico, incluindo bovídeos de grande porte, felídeos, ungulados e canídeos.

Estes compostos podem ser administrados em qualquer dose apropriada e por qualquer via. A administração oral e preferida devido à maior facilidade e aceitabilidade. dose eficaz irá depender da natureza da doença a ser tratada e da idade, peso e estado de saúde subjacente do indivíduo a ser tratado. Isto ficara à descrição do médico assistente ou do veterinário. Os níveis de dosagem apropriados podem ser determinados facilmente por un processo experimental de tentativa e erro, utilizando processos que sáo conhecidos nesta técnica. A i ;: r 1 mostra uma representação em diagrama do modelo do duplo sítio para a ligação áo loa ao sau receptor acoplado ê proteína G, o sEnll As bastes pretas representam as regiões das hélices-a e os cilindros abertos representam as da sítios transmembrana. Os sítios I ·.·: 2 estão no figura. A figura 2 mostra uma série de gráficos do espectro de Ressonância Magnética Nuclear do protão, iH-RMN, mostrando ã degradação, dependente do tempo, das ressonâncias de IH oá amida para cs resíduos de Trp , ppm) e de D-Cha (7,90 ppm) do composco 7 em de" DMSO (dimetilsulfóxido hexadeuterado) contendo D2O ( i de deutério) passados 10 minutos (gráfico de baixo) e depois de 25, 40, 55, 70, 130, 190, 250, 385 e 520 minutos. A figura 3 mostra os átomos C, N, 0 da estrutura das 20 estruturas de RMN minimizadas para a energia maxs baixa do antagonista 7 em dè-DMSO, a temperatura de 24 °C. A figura 4 mostra uma representação esquemática da ponte de hidrogénio na estrutura do antagonista 7 a partir do espectro de RMN do protão em dg-DMSO. A figura 5a mostra (a) a ligação do receptor, como indicado pela inibição da ligação do 1/5I-C5a às células PMNs humanas por 7 s>t ; 8 (A); 9 (A); 12 (O). A figura 5b mostra a potência do antagonista de C5a na inibição da libertação de mieloperoxidase (MPO) das células PMNs dos seres humanos pelo composto 7 (H, r. -9) e 12 (A, n=4). A figura 5c mostra a iigaçáo de C5aR e as potências antagonistas de 7, 15 e 17. A-C mostra o efeito das concentrações crescentes (de cima para baixo) antagonistas de C5a que inibem a libertação da mieloperoxidase nos PMNs dos seres humanos (n=3 em A-C). A: 7 a G, 0,1, 0,3, 1,0 μΜ (de cima para baixo) B: 15 a 0, 0,1, C, 0?, 0, i cm (de cima para baixo) c 17 ·····. .>' ···:·· 5 v ··· !· ··:;·· UM - Ο β '0ΐ. :'Ϊ!ί::: Ό&ϊίΧ ' 0: Afinidades comparati-ias para o receptor C5aR das PMN. Inibição da ligação do i25l-C5a aos PMNs de seres humanos pelo compos~o 1 (em cima) , pelo 15 (no meio) e pelo 17 (embaixo). Todos os dados são apresentados sob a forma de nédia ± DPM (desvia padrão da média) figura 6 mostra a ligação do receptor dos anta- gonistas de C5a cíclico, conforme demonstrado pela inibição da ligação do :v-C5a aos PMNs de seres humanos (n=5) . A figura 7 mostra as estruturas sobrepostas do composto 7 (claro, estrutura RMN) e dc 12 (escuro, estrutura simulada no computador). As cadeias laterais de Fen e Trp estão omissas em 12 para maior clareza. A figura 8 mostra a inibição da neutropénia induzida pelo C5a em ratos Wistar pelo antagonista cíclico F-[OPdChaWR] dado por i.v. (via intravenosa) a 1 mg/kg. Os resultados mostram a partir de n = 3, em cada grupo, P * Q,\5 comparado com o grupo tratado apenas com C5a. Os resultados são apresentados sob a forma de média I: desvio padrão da média. A figura 9 mostra a inibição da neutropénia induzida por LPS (lipopclissacáridos) e as alterações induzidas nos hematócritos pelo antagonista cíclico F-[0PdChaWR] (0,03-10 mg/kg, i.v., 10 minutos antes do lipo- políssacárido [LPS]) nos ratos Wistar. Abcissas: tempo depois do LPS (1 mg/kg, injecção i . j Ordenadas: alteração em perctsHcataãi do valor ou nível dos 30 de 1 ing/kg, dada por injecção via parentérica, minutos antes da carragena) . Os resultados apresenta-dos provêm de 4 ratos/grupo, e são médias ± DPM. Ordenadas: alteração em percentagem do volume da pata. Abcissas: tempo ;id5?) depois da injecção de carragena. A presente invenção será agora descrita apenas através do referências aos processos gerais e exemplos experimentais e as figuras que se seguem. As abreviaturas utilizadas aqui são as seguintes: Sôd hexafluorfosfato de benzotriazol-l-il-oxi-tris- ídimeti lamina) -Ά.. ο L;,

Invlu:; ·> ciclír-hé pi 1---00:1 rv; DIPEA di-iso-propiletilamina DMF dimetilformamida DMSO dimetilsulfóxido HBTU hexafluorfosfato de O-benzotriazole- Ν',Ν',Ν',N'- tetrametilurónio;

PMN DMRQ granulócito polimorfonuclear Desvio médio da raiz quadrada ooív-r.·. (dito em i^glâs; RF--BPLC) Cromatografia Liquida de Elevada Resolução de Fase Inversa

TA í.0-0 vgx.oxοροί!®çs: çúTTcg/doví .Χ'Χίί: iAnni. S<i:: ό -X Ç: x à Ç.í: :¾ g: g-; :r;; % gi ::-:5:: - g,«g çpç 1 :¾¾ ¢:

Processos Gerais

Os aminoácídos protegidos e as resinas foram obtidos na Novablochem. TFA, DIPEA e DMF (grau de síntese de péptidos) foram comprados na Auspep. Todos os outros materiais eram do a de reagentes a não ser que seja indicado de outro modo. As separações por CLER de fase inversa à escala preparativa foram realizadas numa coluna de fase inversa (2,2 x 25 cm) Vydac C18 e as separações analíticas por CLER de fase inversa foram realizadas numa coluna de fase inversa (0,8 x 10 cm) PrepPak C18 da Waters Delta-Pak, utilizando misturas em gradiente do dissolvente A = água/TFA a 0,1 % e do dissolvente B - 10 % de igus/iS % de acetonitrilo, TFA a 0,09 %. O peso molecular dos péptidos foi determinado por espectrometria de massa utilizando ionização por electropulverização registado num espectro-metro de massa triplo quádruplo (PE SCIEX API 111), como descrito noutro sítio (Havíland e outros, 1995) . Os espectros de RMN do foi obtido quer num espectrómetro de ARX com frequência 500 MHz da Bruker ou num espectrómetro Unity de 400 MHz da Varian. As atribuições do protão foram determinadas por análise RMN 2D (Programas CFCOSY, TOCSY, NOESY).

Os compostos não pépticos foram sintetizados utilizando processos convencionais da química orgânica. Os compostos foram analisados por espectroscopia de RMN do e por espectrometria de massa. Síntese dos péptidos

Apresentam-se a seguir sínteses represen tativas de péptidos. As sequências lineares dos pé^tí/áús foram reunidas por síntese om fase sólida, em várias etapas, som a activação do HBTU e a nmtsrsllin Min de DIEA. Utilizou-se a química do Boc (réft-bui:o:KÍqa:í:bo····· nilo) para a protecção temporária de Na dos aminoácidos com dois tratamentos de 1 minuto com TFA para eliminar c grupo

Boc. Os péptidos foram completamente desprotegidos e p.vrfados por tratamento tom HF líquido (10 ml; (1 ml); -50°C; 1-2 hr). Análise por CLER (gradiente; 0% B a 50% R durante 40 min) : 7, T. (tempo de rmtmftpiò) = 32,0 min, [M+H]' (abundância da molécula protonada) tcpjrlomadp) = 100, tf [M+H]+ (experimental) = 900,7; 8, Tr = 32,2 min, [M+H]+(calc.) = 899,6, [0+01+ (exper.) = 899,7; 9, Tr = 30,0 min, [mH]'1' (calc.) = CECy 0f [M+H]+ (exper.) » 900,7; 10, Tr = 23,8 min, )0'+ΒΓ' (calc.) = 860,5, :]++);] v (exper.) = 860,5.

As estruturas para os péptidos estão apresentadas no quadro 4 a seguir. a) Síntese do antagonista cíclico 11

Este é um processo geral utilizado para a síntese de uma vasta gama de antagonistas cíclicos abrangidos pelo presente pedido de patente de invenção. Por exemplo, no caso do antagonista cíclico 11, o seu pépiido precursor linear foi sintetizado pela química de Fmoc (fluoren-9-il-metoxi-carbonilo), utilizando a activação HBTU/DIEA numa resina Fmoc-D-Arg(Mtr)-Wang. Eliminou-se o grupo Fmoc utilizando dois tratamentos de 1 minuto cada com piperidina a 50 %/DMF. Efectuou-se a clivagem e a desprotecção utilizando TFA a 615 %/TIPS (tri-iso-propii-silano) a 2,5 .! . a 2,5 8 e obteve-se o péptido protegido com Mtr (metoxitritilo) que foi purificado por CLER-FI. Realizou-se a oípIIi+çIo do péptido purificado e protegido utilizando BOP (3 eq) e DIEA : . a uma concentração de 1 :β DMF, agitando-se durante 15 horas para se οό:ύ.+;:· c produto o+ç+l ááíii, Pse foi ycsal-stâss-KCR d&sprs+e-gído irm Buli 8. ifcroiip+l i+; Cil m+r + .I--:+ i 11(1++ 1 M ++: C+CL uma puBifipppAo

OruC por CLER-FI +--+ origéL ao pép+idò C+++Í++::L: ¢:::::-+: :m rendimento Λ 50 % para a ciclizaçao. Tr = 37,7 min, [m&Y' (cale.) = [ifabr (exper.) - 910,7.

Realizou-se a ciclizaçao do péptido completamente desprotegido e agitando uma solução 1 mi em DMF com BOP (3 eq) e pirídina corno base 110 eq), durante 15 h. Uma purificação Final por CLER-FI deu origem ao péptido desejado com um rendimento de 22 % para a ciclização. Tr = 37,3 min., Ρ01\ΗΓ' (cale.) = 896,5, [tb-ΗΓ' (exper. j = 896,5.

Determinação da estrutura por 11¾

Obteve-se o espectro de RMN do 'H para o composto 7 o mg em 750 yL de 6 2,50) referenciado as solvente num espectrometro Unity 400 da Varian, a temperatura de 24 "C. As experiências para obtenção do espectro RMN do 1H a duas dimensões pelas técnicas NOESY (Nuclear Overhauser Enhancement SpectroscopY) (intervalo de relaxação 2,0 s, tempo de mistura 50-300 ms), pelas técnicas DFQ-COSY (Double Quantum Filter-CosY) e pela técnica TOCSY (Total Correlation Spectroscopy) (tempo de mistura 75 ms) foram obtidas e registadas no modo de fase sensitivo. Tempos de aquisição = 0,186 s, largura do espectro = 5.500 Hz, pontos de complexo (dimensão tx) = 1024 para todas as experiências. Cs 5 foram completados com zeros (zero-filled) e a transformada de Fourrier para os 1024 pontos em ambas as dimensões. ,·;·* dados da RMN foram tratados utilizando c programa TRIAD (Tripas Assoe.) num de trabalho do modeio da Mliccti a i s Os picos cruzados NCE (efeito

distancias superiores e in iaviaagsa utilizando o programa Diíina 2.8 (69 restrições de distância, incluindo 27 para os resíduos auldcttu/te e 6 para os mais afastados) com a ennraiégia nòl-iC das restrições redundantes do ângulo dird As restrições das distáveis* superiores e inferiores foram calculadas com precisão utilizando o . Nesta fase, c péptido foi observado para verificar as possíveis pentes de hidrogénio e estas foram adicionadas como de distância. As 50 estruturas obtidas por Diana com a energia mais baixa foram submetidas a processos de dinâmica molecular restritas (DMR, RMD na terminologia inglesa) e de minimização da energia (REM). Inicialmente, a REM consistiu num gradiente descendente de 50 etapas seguido de 100 etapas de minimização por gradiente conjugado. A DMR foi realizada pelo aquecimento simulado das estruturas até 300 :·Ί·-, durante 1 ps, seguido de 500 A-i durante 1 ps. Baixou-se gradualmente a temperatura até 300 °K durante 2 ps e finalmente durante 2 pç para 200 "K. A REM foi realizada de novo com uri gradiente descendente em 50 etapas, com um gradiente conjugado em 200 etapas seguido por uma minimização de Powell em 300 etapas. Examinaram-se as estruturas finais para se obter uma diferença de dmrq da média entre pares nos átomos pesados (N, Ca e C) da estrutura. Vinte das 50 estruturas tinham um dmrq da media < Ο,Α Â para todos os átomos da estrutura ·Ό.> N, C) .

Criou-se um modelo do composto h2 cíclico, apresentado m tm-ãXã 7, a partir da estrutura de RMN de 7, eliminando todas aa raalriçdaa Hiad fundindo a amina da cadeia lateral da ornifína com o aaraa-adíava do C-terminal da d-hrg para aaaoaaa amida e acame.:.-venço a v:aaa' -v- v: a>.iiav-aao -- (1.000 se depois as estruturas do modelo às estrutuss da RMN com um dmrq de 0,224 Â.

Ensaio de ligação do receptor

Realizaram-se os ensaios com células PMNs de seres m:o:anaed frescas, isoladas conforme descrito (Sanderson e outros, 1935;, utilizando um tampão de HEPES 11: mM, 11:1¾ 1 mM, 8¾¾¾ 5 mM, albumina de soro bovino a 0,5 %, bacitrina a 0,1 % e fluoreoo de fenilmetilsulfonilo (FFMS) 100 μΜ. Nos ensaios, realizados a temperatura de 4 °C, adicionou-se sequencialmente tampãro·# C5a recombinante não marcado de seres humanos /digoa·) ou o péptido. Adicio-nou-se sequencialmente 125I-C5a marcado da Hunter/Bolton (-20 pM) (New England Nuclear, A ) e PMNs (0,2 x 10*:!., a uma placa de ensaio Millipore Multiscreen (HV, poros 0,45 qMl atingindo-se um volume final de 200 pL /cavidade. Depois da incubação, durante 6 0 min, a temperatura de 4 °C, filtraram-se as amostras e lavaram-se as placas, uma vez, com o tampão. Secaram-se os filtras, perfuraram-se e contaram-se num contador de cintilação para radiação gama da LKB. Avaliou-se a ligação não especifica pela inclusão do péptido 1 ou de C5a 100 nM, o que normalmente resultou em 10 - 15 % de ligação total.

Analisaram-se os dados utilizando modelos de regressão não linear e modelos estatísticos com o teste posterior de Dunnett.

Libertação de mieloperoxidase

Isolaram-se as células como descrito anteriormente (Sanderson e outros, 1995), ircubaiam-se com citocalasina 3 (5 pg/mL, 15 min, 37 'd:;: , dd.0:.::00a -ao uma ard.ioáa salina oípálideodo de Hank, contendo ge.: ,0:d.a a , IS I e adiadaíoní-oo o aóáí :x:d a uma placa de 96 ooadcdads: : -a: ηγ::".; 5 .··. S i 10v i e a aag:ni;:: MdadOYoa-aa 25 2 oa c-ídealsa (4 x iaddíd .. Sisaa aa:atiar a caoaoidada azed péptido para antagonizar com C5a, incubaram-se as células, durante 5 minutos, a 37 !::d com cada péptido, adicionando-se a seguir o C5a (100 nM) e voltando a incubar durante mais 5 minutos. Adicionou-se depois, a cada cavidade, 50 pl de fosfato de (0,1 d, pH 6,8), arrefeceu-se n placa para a temperatura ambiente e adicionou-se a cada cavidade 25 pL de uma mistura acabada de fazer de dimetoxibenzidina (5,7 mg/mL) e de (0,51%) em volumes iguais. Parou-se a reaccão ao fim de 10 minutos adicionando azida de sódio a 2 Mediram-se as absorções a 450 nm m:sa leitor de placas 450 da Bioscan, corrigiram-se para os valores de controlo (nenhum péptido) e analisaram-se por modelos de regressão não-linear.

Ensaios in Vivo da Actividade èjxli-IniXmmtòzim

Podem-se utilizar os bem conhecidos sisremas de ensaio in vivo que se seguem para avaliar a actividade anti-inflamatória dos compostos da presente invenção. Todos os dados do ensaio foram analisados por análise de regressão não linear e teste t de Student, análise da variância com p < 0,05 como nível liííd.tr da significâncía. a) Edema de pata induzido por carragena

Injectaram-se raios Wistar ou murganhos anestesiados (cetamina e xilazina i.p) com ar esterilizado (20 mL no Io dia, 10 L no 4o dia; ;s tecido subcutâneo das costas. Pode-se a cavidade passados 6 dias, imediatamente após a carragena ter sido injectada ndad:> 1¾ p/p em solução stliÁu a 0., li '· nái bolsa de· ar e recolhe-se o exsudado pddd&óis 10 horas. diariamente os compostos 0;ó ensaio deróíió dó 6° dia o os sous edeitóó vv.·-·:·:·:·-·: ::· x-;1 e:·. γ,·:·. ·;···:· ·; 'r ;·· : ::: ç ; :· ... . ..· '·...· v.' ·;. Ç; X·.· >.;/ ·.·.·. ..s. 0- '· ·' '· N ·'. r se SXiól:·" ó" νόόόόΟόΖ ó:ótun::rc:ó da bolsa de ar, yy όίόΐόϊόό. t ty.:r*y όόόΧόό no yyypy ."ίΐ.·.r ined-eóSó 'Ο :ót ii rrzv:.;· :>!· P óól ;de íósv eólPçdiç· salina a 0,9 % para lavagem da cavidade, transferiram-se os fluidos de lavagem para um tubo heparinizado e contaram-se as células com um hemocitómetro e a preparação cítocentrífugada, corada da Diff-Quik.

Em alternativa, drsiersvódv&orroí por uma rotina um edema pata, induzido por carragena, em ratos Wistar, administrando uma injecção podai de carragena para provocar o edema que é visível ao fim de 2 horas e atinge o máximo em 4 h. Os compostos de ensaio foram dados 40 minutos antes da inflamação e avaliou-se por medições micro-calibradas da pata depois de 2 horas e depois de 4 horas. Ver Fairlie, D. i. e outros (1987). Ver também Wa1ker e Whitehouse (1978). b) Artrite Adjuvante

Induziu-se a artrite adjuvante em ratos (3 estirpes), quer por via microbiana (injecção de ariUss ftihittintitaia inactivado pelo calcr), quer por via química (com avridina), inoculando, na base da cauda, cíh o adjuvante artritogénico administrado conjuntamente apenas com veículo oleoso (adjuvantes de Freund). (Ver Whitehouse, M. W., Handbook tf Animal Models for the Rheumatíc Diseases, Eds. Greenwald, R. A.; Diamond, H. S.; Vol. 1, pág. 3-16, CRC Press).

No prazo de 13 dias, a artrite adjuvante manifesta-se através por inflamação local e ulceração da cauda, inchaços grandes nas 4 patas, lesões inflamatórias nas patas e nas orelhas, perda de peso e febre. Estes sintomas, que são semelhantes aos das doenças inflamatórias nos seres humanos (Winier e icn·.; 1966), podem ser rlivírfe por agentes, tais como it;dor;ri7àc.tnà ou cícloesporina, que também produzem efeitos benéficos no homem iwr Ward e Clcud, 1966) . No 11 com fiiiríiiotí os ratos com artrite t r ars;:;· 11 c-t th to .o ii. t iras patas, o o i.: · uvao w o tr; h;·™ o s ro ino o: estavam aumentadas no soro as proteínas us resposta da fase açuda e diminuído o metabolismo hepático dos taíadaidoloo-a como indicado pelos tempos prolongados de sono induzido por barbitúricos.

Para avaliar a actividade, administraram-se os compostos por via oral, durante 4 dias {<10 mg/kg/dia) ou i.p., a partir do 10" - 13° dia nc seguimento da inoculação com artritogénio (Dia L)). S inflamação ou não era visível ou estava muito significativamente reduzida, nas patas traseiras ou nas da frente, corno verificado pelas medições com um micro-calibrador da espessura da pata e do volume da cauda, bem como pela inspecção alargada das lesões inflamatórias. Os animais foram sacrificados por deslocação da cervical no 18° dia, a não ser que não existissem sinais de artrite, imediatamente após o que as observações contincaram com uma autorização especial dos Comités de Ética. As experiências são escalonadas para maximizar o rendimento e permitir comparações precoces entre os compostos. Este ensaio de rotina é bem aceite para identificar os agentes anti-inflamtórios a serem utilizados em seres humanos.

Exemplo 2: Estrutura de RMN do antagonista do tua

Os requerentes utilizaram duas espectroscopias de ressonância magnética nuclear bidimensional para determinar as estruturas tri-dimensionais de 7 e verificaram que embora não haja nenhuma estrutura observável na água, há evidências de uma estrutura com ligações esráveis de folhas-gama, em d.iuut1 1$u 11 éxld:o„ hidrogénio intramo1ecu1ares, realizou-se aa experiência rrcca de deutério, adicionando à solução um excesso de aez v-acív:·.; mais D2O. Dois dos dubletos do -NH da amida desapareceram imediatamente, conjuntamente ©0® as ressonâncias atribuíveis aos protões da metilamina efc N-terminal. No encanto, as outras duas ressonâncias do da amida* bssi como uma ressonância de banda larga a 8,05 ppm, persistiram mais de β·, 5 horas lligora 2) . Estes três protões que se permutam de forma lenta estão atribuídos aos -NHs da amida da Trp e de d-Cha e a íõói.ui da cadeia lateral de Lis, sendo este comportamento de troca lenta caracte-rístico das ligações por ponte de hidrogénio. Estabeleceu-se a atribuição à am.ina por um espectro TOCSY em que os picos cruzados foram observados entre a amina protonada e os protões 6 e γ de CH2. Um estudo da das alterações químicas do -NH da amida dependentes da temperatura (20 -60 "Ο (Δδ/Τ = 2,5 ppb/grau, dlV-n-Mí; 6 ppb/gooiu Trp-NH; 6,5 ppb, Lís-NH; 8,7 ppb, Arg-NH) confirmou sem ambiguidade 0 envolvimento da ligação dChã~:MH apenas na formação de pontes de hidrogénio intramoleculares.

Quadro 3

Indicações3 do espectro NMK do ΧΗ para 7 em d6-DMSO

Resíduo Ha Ηβ KV MeFen - 4,06 2,09 3,06 - c2. 1 29; ;> 6 Lis 8, 83 4, 54 1,74 1,55 1,32 VA . s:: · j *·? v'y;. Pro 4,30 2, 084 1,74 1 1,78 v;> . ·'·:'·;ζ.:·< d-Cha 7,91 A U ti ; -o-' 1 1 9 1,06 0,76 Ιί,ίΡ 1,08; fl, 61,1,58; 0,73 4, 65 5 í 1 2, 94 - c6,97,7, 06, 7,13,7, 32,7, 65; Up 80 8,44 4, 2C 1,42 " 3,08; 9 7,60

Mediu-se uma série de espectros de RMN do H a 2D para 7, a temperatura de 24 °C, em d6-DMSO, para determinar a estrutura tri-dimensional. Utilizaram-se ma técnicas TOCSY e DFQ-COSY para identificar os tipos de resíduos, enquanto c ittnutspm de atribuições de sequências foi feito a partir da análise dos dados NOESY. De « série de 100 estruturas criadas a partir dos dados NOESY, submeteram-se 50 das estruturas com energia mais baixa a uma simulação de dinâmicas moleculares restritas (200 K - 500 K) e a minimi-íuiscjc da energia. Um conjunto de 20 estruturas calculadas com um desvio da média da raiz quadrada (dmrq) < 0,0 A (átomos da estrutura) estão sobrepostas na figura 3 e mostram claramente uma conformação com ligações entre folhas.

Combinado com isto, os dados da restrição da RMN, os valores a troca de deutério e os dados da dependência da temperatura estabelecem uma estrutura com ligações entre folhas pouco habitual para o hexapéptido 7 que e restringida por mais de três pontes de hidrogénio, como se mostra na figura 4. A evidência é muito forte para uma ponte de hidrogénio intramolecular de dCha-NH . . . 0C-Lis (2,72 A, N-H ... 0 , ângulo C=0 ... H, ângulo j, formando um anel com 7 elementos no núcleo que define uma estrutura Inversa com ligações entre folhas-y. O ângulo da ligação dChaNH-O-TrpNH é de SI6>4% Os dados da troca de deucério e os dados de restrição da RMN em conjunto apontam para uma segunda ponte de hidrogénio intramolecular Trp-NH ...OC-Lis (3,31 Â, N-H ... O ângulo 1571% 00 ... H Impilo 130(0.3'Ips formando um anel com 10 átomos no núcleo caracterísLico de uma nonfurrmânãd com ligações entre

Os -OocO ··'· o o 0 as;·: =-58,4°, 3o -3(3,0% ο^ϋΟ,Οο 3.:: =16, coincidem de muito perto com uma . com ligoouOoo; 0:000 O-oOiooo-- 3 3o tipo II 30 o 00.:(00,:. o;:, 3333;

Mittchinoco e Thornton, 1994) que está :3itio.oo:i.3p pela presença da estrutura com ligAça-M entre folhas-y completamente dentro da estrutura cm:; liiye;:;:·:?·;;:;: entre folhas-B.

Daquilo que se conhece até agora este é o primeiro exemplo de ;.m ponte de Mdrugániu íntramolecular entre resíduos dentro de uma estrutura com ligações entre folhas-β, embora haja muitos exemplos ae pontes de hidrogénio dentro de um resíduo num "anel com 10 átomos no núcleo" de uma estrutura com ligações entre folhas-β e um resíduo exterior a ela. Uma terceira ponte de hidrogénio (2,76 m N-H...0 ângulo de H;Cb ubh ^ entre a amina da cadeia Lateral de Lis e o carbcxilato do C-terminal, é sugerida pelos dados da restrição da RMN, pela permuta lenta NH/ND e pela detecção de uma NOE fraca entre Lis- Mi * <?rp-~a£ib * Isto pode restringir mais a molécula na conformação de ligações entre folhas observada. Este emparelhamento de iões é vulgar em dissolventes aprótícos dipolares como o dimetilsulfóxido e pode também ser relevante num meio de proteínas hidrofóbicas.

Determinaram-se também as estruturas da solução por RMN para vários antagonistas cíclicos descritos nos exemples seguintes e mostra-se, em cada caso, que a estrutura com ligações entre folhsaHI do tipo II está preservada e estabil.i zacia pela estrutura cíclica.

As estruturas com ligações entre felhbsHl e de restrição propostas para o péptido linear 7 têm paralelo em péptidos cíclicos. Os requerentes detectaram antes estruturas com lèhávRht entre oííIMp --:3 ο γ sobrepostas em octapéptídos cíclicos da idíacíclamidc (Abbenante

OditilXhib 1996). Encontraram-se também combinações ite estrururas com ligações entre toXh3$--% e γ em estruturas de em gomi oro :;:":οο;.;Ρ ο ο: 1995 1995; Kessler e 1990] . Por exemplo, identificou-se uma

ligações entre £:oÍsçs--u do tipo II e -ima tffrQtíltS

Coles e outros, 1993; Ihara e 00000?:;;«, 1992; Dean e opí:õo®:, 1994) e ns c-(D-Asp-Pro-D-Val-Leu-D-Trp) (Bean e outros, 1994) para os rar;epmou:'e« endotelíaís e em membros da família da rodopsina dos receptores acoplados á proteína P com sete domínios de (X.-M.Chenç e outros, 1994) . Neste último caso, tal como em 7, forma-se uma estrutura com ligísç:·!#!; entre folhas-γ inversa entre os resíduos :Asp-mÁ-Vaí Nil, Lis-CO. . ..dCha-NH) que flanqueiam a prolina.

Exemplo 3: Relações Actividade-Estrutura in Vitro

Os requerentes examinaram a ligação do receptor e a actividade antagonista do hexapéptido 7 para comparação com os novos compostos da presente invenção. O relatório anterior de Konteatis e outros (1994) refere-se a capacidade de 7 para competir com a ligação de C5a com os receptores nas membranas dos PMNs isolados í-CIjo* 70 nM), o que não I necessariamente relevante sob o ponto de vista fisiológico. Os requerentes examinaram a concorrência entre o 7 e C5a, utilizando células intactas e veriíicou-se que, nestas tmrellçõlõ, 7 iiga-se com uma afinidade muito menor do receptor de Cl:??:; 1,8 μΜ. Confirmaram ââsiis que 7 é um MítMzMniBt* (/umplffo sem propriedades sgí5;nista.su Estes resultados estão resumidos na figú.fa 5a e no quadro 4. A alr :;?i?:f?:çkf mIjos (ratio) de 7 em cpIpçPò ao 5 em foi similar á reportada para ur Po

Verificou-se também que 7 exibe actividade antagonista quer contra o C5a (figura 5b) τr contra o análogo 4 íYSFKPMPLaR) (Finch e outros, 1997) do decapéptido do agonista do do C-terrilimal, sugerindo que actua no sírio 2 do receptor. Cs compostos 7 e 4 têm afinidade μΜ similar para o receptor C5aR em Xtoeécltdá polimorfo-nueleares íntactos, como se mostra no quadro 4. A partir dos dados apresentados no quadro 4, descobriu-se ainda a existência de uma correlação ):u; n r entre o log das afinidades de ligação e o log das potências dos antagonistas para estes antagonistas do sitio 2 (compostos 7-12, quadro 4) , A importância desta relação linear é que, uma vez que a afinidade para o receptor e a actividade antagonista são directamente proporcionais, a abordagem mais simples, sob o ponto de vista experimental, da medição da ligação ao receptor pode ser utilizada para estimar a actividade antagonista para compostos tão pequenos, pressupondo que não há nenhuma evidência de actividade agonista.

Quadro 4

Afinidades3 de Ligação ao receptor e Actividadesh Antagonistas nos PMN de seres humanos

Composto Afinidade3 ÁdmPxiP do receptor do antagonista íípsdss. pP ;i ívvx i MvFUi>:í::!:u;Wk t H i i)j (; ||5 p) Nenhuma Η Η : P p) hcsjpsíA * ÍPiPlpMpVR í ! · ·· ! ÍU rq \ \S . .. F> Ι44.β|· m i \ μ iteFuiywyi >2 pp p: : « t y> ; ;5 Aí: í' 0 í;VJ>' As AíA; ipp ÓF 4 ΥΜΚί'Μ?':.'!: €:k: » ··· ·· Sim 0 número de experiências está indicado entre parêntesis.

Foi proposto anteriormente que o C-terminal do CBm e dos péptidos agonistas era essencial para a actividade devido á sua interacção com uma Arg206 do receptor carregada positivamente (DeMartino e outros, 1995). Os requerentes confirmaram que o carboxilato do C-terminal é na verdade importante para a actividade (8 vs 7), mas questionaram-se se a origem deste efeito não poderia ser devido à ponte de hidrogénio entre o anião carboxilato e a cadeia lateral de amina, carregada positivamente, da Lis. A conversão em amida (8) reduz certamente quer a afinidade do receptor quer a actividade antagonista em aproximadamente 5 vezes. A alteração da quiralidade da Arg-Ca (9 vs 7) provoca uma redução similar na actividade e a substituição de dCha por um resíduo de Leu menos volumoso (10) e também prejudicial para a ligação do receptor. No entanto, a potência e recuperada para os compostos cíclicos 11 e 12, nos quais uma ligação amida é tolerada no C-terminal, consistente com a interpretação estrutural anterior em que a vantagem do carboxilato em 7 pode estar associada com a ponte de hidrogénio intramolecular. A substituição desta ponte de hidrogénio em 7 por uma ligação covslente de amida em 11 e 12 estabiliza de forma mais eficaz a conformação ccm ligação entre folhas. A figura 5c compara a ligação de ORaR e e potência antagonista in vitro nas PMNs dos seres humanos para os compostos 15 e 17 com as do composto 7. as compostos 15 e 17 são ioiM-dorns potentes, em concentrações nM, da ~ ~ ~ doã.jda e da ligapãH dõ at -por wXéítpiõm 4, Rb = 1,4 nM). A sua aa tuia os «g .:T g ip.; * e a acetilação na fenílamína do N-terminal protegem ambas contra a degradação proteolítíca orvtottradii normalmente nos péptidos, fazendo com que estes compostos cíclicos sejam mais apropriados como candidatos a dc que os péptidos acícliccs. Apresentam-se os resultados no quadro 5.

Ligação do receptor e actividade antagonista da. moléculas cíclicas •Sv >5 vi; 1 1. I Ί: &

:S Λ # \V. ) / V^V 3 * -v* n R Isómero* Afinidade do receptor μΜ

Actividade agonista R- 34

Nenhuma 0,3

Nenhuma

Nenhuma Λ ·:·: Ά;!':· ρ:;···· ç;ϊ’: : Ιόν ;á *Refere-se a estereoquímica da cadeia lateral da Arg

Exemplo 4: Antagonistas cíclicos do RSa

Alguns exemplos destes antagonistas cíclicos e das suas afinidades aparentes de ligação do receptor e das potências antagonistas estão apresentadas nos quadros 4, 5 e 6, bem como nas figuras 5 e 6. Nos quadros utiliza-se o código da Letra driica para os amincácidos.

Quadro 6

Efeito da ciclização sobre a afinidade de ligação do antagonista e a potência do antagonista d ·.··· viÀ·.·. ICdudí. (íà Nl/uSlv" H Css 5..-3-R 4 ··;.43 4,3 3. :%ϋ7 ± 15,.39 <3.<p> s 0.4 34 4 7 7 Pt 4 ROO 403 d [ã^:WMOPW?l td7;í:ipss 33 3 $íí 3? AddKsot»:d 471 * 034 pPi ú 4* íd 3 413 '1 M 4M 1d í Efeito do comprimento do ligando no ciclo sobre afinidade de ligação do antagonista e sobre a potência antagonista 44Í k 0.07 iiy -i: AdfiÍãp;) :ÉÍ P dl Mtpd tíSCihíiWsí ' ·' ,y 43 i 4pín> 4|‘;d 4433¾ Ui 'ΐ'ν,ίΐ 3 .14 l! 4.4444i|i P 3 5; 74 ç-iPMnraaPi PdSs 3.1-:4 $ : 3: 4! j 4-4:: sib ó,f 4 4.73::: |M. W .·· iS PíôNtivjdld Spj s 334 U % ; 4 4 :í 4>.t M i 2<? 4-:401 7n\Vtj ' ' «d .....y.,„. 5 PSr Sp7<· 3 J . ·- SíósidP- PP L-l 44 Vt-k-tP d P iduiPiaú do li i; &:'*;y:td df-; Xv *:*· A pj .·\·:-·: ·:· .·*;· 4 · ' ·' pid aaitagókij. ···. i' d·: Γ AkF-:-4lb4 bkdTb •;V·χ-·ί S: ;· Vt ('·. i íiíd p

TdbC O:\vt: f piNtt&WX; ívív -í ;:,ou Íp '· ?J* * Μ > 0,04 f x? PI®x:iswi:r *m 28 F-[KPdChaWR] 6,50 pm* 0.3 4 6,69 i 0,04 0.2 3 ° p:D2/!CS#::í concentração do péptido resultando na inibiçáo de 50 % na ligação do I]C5a às células PMNs intactas. 0 IC5o é o ar.tilogaritmo do valor de PD2 médio. 0 p-fè/lOSCs-i concentração do péptido resultando na inibição de 50 % na capacidade do C5a :;:1ϋϋ nM) causar a libertação do MPO (míeloperoxidase) das células PMNs. X = » NH, X1 2 3 4 5 tcms ~ NH2 os valores de pD2 são expressos como a media ± SE 0 símbolo n representa c número de experiências realizadas * alteração significativa na afinidade/potência comparada ao NMeFKPdChaWR (p <0,05) jj indica o número de isómeros 1

Estes resultados demonstram: 2 que as moléculas cíciicas têm uma afinidade aparente do receptor mais elevada e podem ser antagonistas mais potentes do que os péptidos (lineares) aciclicos, 3 que um dos dois possíveis diastereómeros cíclicos é favorável, de forma consistente, para a ligação ao receptor de C5a e surpreendentemente é a estereoquímica oposta (L-arginina) aqueia que favorece nos compostos lineares (D-argínina) 4 que os ciclos têm uma dimensão óptima do anel para a ligação do receptcr, 5 que há uma relação pseudo-linear entre 0 log (potência antagonista) e o iog (afinidade do receptor) . :¾ φΡΙύόόη·: 5 % 6 listam as afinidades do receptor de C5a de alguns exemplos dos antagonistas cíclicos de C5a e na o.p.rt:. t tatá & noa capcdPtsP paro ar IPwrsm: «: n iánúram n ligação de C5a ro células rbbr de rorcc humanos, Estes dados mostram, de forma surpreendente, que a L-arginina é preferível í D-arginina, em contraste com o composto litioa:·:' 7 em que a a r confere uma maior ofioidiSd-a para o receptor do que a L-arginina. Os dados também mostram que a dimensão do macrociclo é óptima quando n = 2 ou 3, sendo c ciclo menor quando η = I e maior quando n = 4 sendo claramente menos activo. Este requisite para um ciclo fortemente restrito é devido provavelmente a necessidade de posicionar correctamente os resíduos da cadeia lateral ligados, por exemplo os de Trp, Arg e Fen para interaeção com o receptor.

Exemplo 5: Modelação Computacional de estruturas do antagonista A figura 7 compara a estrutura modelada por computador do antagonista cíclico 12 com a estrutura encontrada por RMN na solução para o antagonista acíclico 7. Estas estruturas da infra-estrutura principal são extraordinariamente semelhantes e sugerem vivamente que as conformações de ligação ao receptor destas moléculas envolvem a mesma estrutura de ligação das folhas. 0 composto 12, um antagonista mais potente do que o 11, tem também um ligante mais curto, que aproxima a ligação entre as folhas e altera ligeiramente o espaço da conformação acessível as vadeias laterais principais de Fen, dCha, Trp e Arg. As limitações conformaclonais, impostas ao derivado do haxapéptldo 12 pelo ciclo, são responsáveis por um aumento 104 da afinidade de llgaçSa do receptcr em relação à conformação flexível do terminal C do decapéptido de L5a (1, quadro 2) .

Existe uma correlação entre as afinidades Ά ligação ç ò""ur.po-:í ^ ou 7-12, quadro 2) . Parece assim que a pqiènuià ç/Iiic 2. Sem estar HmitmúúÈ por gea ΙφίΛΐ mecanismo proposto, os requerentes acreditam que isto pode acontecer porque o de antagonismo está relacionado com a alteração conformacional conformação de ligação de folhas induzida por 7 no sitio 2 do receptor.

Exemplo 6: Caracterização dos Cuailu em células diferentes

Normalmente não há informação sobre os diferentes tipos de CSaRs. Os requerentes mostraram anteriormente as diferenças nítidas na capacidade de resposta das diferentes células que contêm os receptores funcionais CSaRs aos agonistas (Sanderson e outros, 1994, 1995; Finch e outros, 1997) e agora podem dar mais informação através do exame da potência e da eficácia de agonistas e antagonistas selsctívos relativamente ao C5a recombinante de seres humanos. Para os agonistas, a selectividade dos tecidos ou das células pode revelar receptores diferentes sob o ponto de vista funcional. Os ensaios de ligação utilizando PMNs de seres humanos, células U937 ou monócitos em circulaçãosão utilizados para determinar as afinidades para os CSaRs. A selectividade para os diferentes C5aRs é verificada pelo antagonismo diferencial. Esta abordagem combinada permite a caracterização farmacológica de novos agonistas ou antagonistas e pode levar a uma classificação funcional do potencial dos CSaRs nas diferentes células.

Exemplo 7(a): Ncutropénia e Antagonismo de C5a in Vivo

Avaliaram-se os compostos num modelo de estado agrido de neutropénia induzida por CSa. A neutropénia transitória * máxMí.a. 5 nín depois da introdução -.1-.: Cvô i.v. e é

Pvftn-:® da circulação com v.uou eficazes de C5a, cosí; dos neutrórilos em vascular. Os dados preliminares mostram que a neutropénia causada por C5a i.v. é bloqueada por um antagonista de C5a. Por exemplo, F- [OPdChaWR]5 (1 mg/kg), dado antes de C5a (2 pg) i.v., inibe a neutropécia induzida por C5a in timo (figura 3).

Exemplo (7b): Inibição dos efeitos induzidos pelo llpo- pollssacáridos ILfS) por meio de antagonistas de C5a

Os LPSs causam neutropénia rápida em ratos. Se este efeito do EPS for bloqueado pelas antagonistas de C5a, então o C5a pode ser da maior importância nos efeitos agudos do S e os resultados apresentados na figura 9 estão de acordo com esta hipótese. Injectaram-se os antagonistas de C5a (bolus v . 10 mín antes do reforço com LPS. Anestesiaram-se os ratos e recolheram-se amostras de sangue (0,3 mL) para as medições de PMNs. Isolaram-se as células PMNs e quantificaram-se. Os resultados preliminares mostram que F-[OPdChaWR], (1 mg/kg), dado antes da adminis tração i.v. de LPS, inibe a neutropénia.

Os resultados indicam também que os antagonistas de C5a inibem o aumento no hematrócrito causado pelo LPS, o que que a dispersão vascular do soro causada pelo LPS é também inibida.

Estes resultados demonstram que os antagonistas do receptor de C5a, tal como os descritos na presente invenção, podem ter utilidade terapêutica em indivíduos com septícémia. A capacidade para inibir a aderência dos FMhã ao síidstiiio vascular e para inibir a dispersão vascular com o LPS, como verificado pela redução dos valores do hematócríto, indica os poderosos efeitos anti-inflamatórios destes compostos contra . pró-infiamatórías aue como Ú g:flUV;;s O btatiSBiS: do CDCVii VtiViVl: U t t:.3:i como V eíidcfíldíhm ΟΏ

Exemplo 8: A·:. ·. i uimidr in Vivo dos antagonistas cíclicos de C5a

Experiências preliminares em raios revelaram que os antagonistas cíclicos, resumidos no quadro 5, sáo activos como agentes anti-inflamatórios, numa dosagem inferior a 20 mg/kg, na eliminação do início do edema da pata induzido por carragena mi da poli-artrite induzida por adjuvante. As dosagens que maximizam a eficácia, mesmo para antagonistas moderadamente eficazes são de i3 mg/kg ou menos, dadas por i.p. ou p.o. Forain avaliados inicialmente nesses ensaios muitos fármacos anti-inflamatórios utilizados correntemente em seres humanos e também mostraram actividade nestes modelos de Inflamação em ratos. Estas indicações preliminares da eficácia in vivo indicam que os antagonistas de C5a têm potencial terapêutico em estados inflamatórios em seres humanos.

Utilizando o ensaio do edema da pata induzido por carragena em ratos, verificou-se que um composto, AcF-[O-P-dCha-W-r], que é 100 vezes menos activo do que 17 in viíro, como antagonista de C5a em células PMNs, tem alguma actividade in vivo em ratos quando se dá i.p. 1 mg/kg ao composto, 33 minutos antes da injecção de carraçena. Mediu-se o inchaço da pata até 4,5 h. Os resultados, apresentados na figura 10, sugerem que mesmo esse antagonista fraco de C5a inibe de forma significativa o desenvolvimento do edema depois passados 180 e 270 minutos. Esta actividade anti-inf lamatóría sugere que os antagonistas dos receptores de C5a, tal como os descritos na presente invenção, podem ter actividade Terapêutica em doenças que envolvem a dispersão vascular depois de um estímulo inflamatório. dor MXi mim anos tom hodlrò; moitas tentativas para aissÍtlor os péptídos rim motsiria rr com 1 ΐνίτν/οϊ! entre roídas o superfícies o:r όνοοΟΙΟΟΟΐ idU/ocfir-fim resultando numa imitação notável dos péptidos RGD (argini- í péptidos de somastatina e opióides, para nomear apenas tototos derivados, através das relações estrutura-actividade (ver, por exemplo, Marraud e Aubry, 1996; Fairlie e outros, 1995) . A maior parte destes exemplos conservam uma estrutura com ligações entre folhas devido à ciclirapto do péptidc. Por outro lado, to comparativamente, poucos péptidos curtos acíclicos onde se tenha verificado haver, em soluçãc, uma verdadeira estrutura com ligações de folhas (Dyson e outros, 1988; toto e Gíerasch, 1992; Ptoctotr e outros, 1994). Discute-se habitualmente que ss péptidos acíclicos curtos adoptam rm grande número de estruturas em solução que podem incluir pequenas populações de estruturas com ligações de folhas que são responsáveis pela bicactividsde. A presente invenção descreve uma série de moléculas contendo estruturas com ligações de folhas com restrições conforrnacionais que estão pre-organizadas para a ligação ao(s) mesmo(s) receptore(s) acoplados à proteína G das cilulas humanas que são o alvo de C5a humano. A presente invenção aplica-se a outros receptores acoplados à proteína A principal característica dos compostos da presente invenção é o arranjo pré-organizado, que coloca pelo menos três grupos hidrofóbicos e un grupo carregado num espaço vizinho, criando toa remendo" de ; to hidrofóbica.

Estes fúttl :;.nto.·/; permitem o desenlio e c dato-to vto to tototot de antagonistas de C5a to moléculas PtoUtoM com conformações restritas q\-.% são ainda mais potentes. A Luz do mencionado na téctoitoa anterior, ter 1 :ítctt-se ::.. to.toto : - to. . "to to que o " · --to to to % ;..... .. to t nista. Os antagonistas cíclicos t:ê& uma ligação de amida na posição da arginina do "C-terminal". Ã substituição do carboxilato em 7 por uma ligação covalente de amida estabilizo de forma eficaz a necessária conformação com Ligações de folhas.

Os antagonistas cíclicos e nãc pépticos têm cúrias e importantes vantagens como fármacos, em relação aos pépti-dos, Os ciclos descritos na presente invenção são estáveis à degradação proteolítica durante pelo menos várias horas, a temperatura de 37 "C, no sangue ou no plasma humanos ou. nos sacos gástricos dos ratos e de seres humanos ou ainda na presença de enzimas digestivas, tais como pepsina, tripsína e quimotripsina. Ao contrário, os péptidos curtos compostos por L-arninoácidos são degradados rapidamente nos seus arninoácidos componentes, em poucos minutos, nestas condições. Uma segunda vantagem reside nas conformações com uma única restriçáo adoptadas pelas moléculas cíclicas e não . ' ' . . enquanto os péptidos acíclicos ·η; lineares são suficientemente flexíveis para adoptar várias estruturas em solução para além da requerida estrutura de ligação do receptor. Em terceiro lugar, os compostos cíclicos e não pépticos, tal como os descritos na presente invenção, são normalmente mais solúveis em lípidos e mais biodisponíveis, sob o ponto de vista farmacológico, como fármacos, do que os péptidos, que raramente podem ser administrados por via oral. Em quarto lugar, os semi-períodos de vida das moléculas cíclicas e não pépticas no plasma são habitualmente mais longos do que os dos péptidos.

As referências citadas na IççttcãD v t enumeradas a

miAS G., Fairlíe, D. P., Gahan, L.R., Hanscn, G.R., MMíMM,· G.K. e van de π Brenk, A.L. J. Mu Cheia. Soe., 1996 1M 10334-10388 BMRMMíR J. ( 1993 5 143-173 Bean, J.W., Peishoff, C.E. and Kopple, K.D.

Int. J. Protein Res., 1994 44 223 Cheng, X. M., Doherty, A, M., Nikam, S. S.

Curr. Chem. 1994 1 271-312 Coles, M., Sowemino, V,,

Scanlon, D* , Murro, S.L.A., Craík, D.J.

Med. Chem., 1993 36 2658 DeMartino, J.A. , Konteatis, Z. D., Siciliano, S.J., Van Ríper, G., Underwood, D.J., Fischer, P.A., Springer, M.S. J. Biol. Chem., 1995 270 15966-15969 DáMrtiíhlu J.A., Van Riper, S., Siciliano, S.J., Molineaux, C.J., Konteatis, Z.D., Rosen, H. Springer, M.S. J. Biol. Chem., 1994 269 14446-14450

Drapeau, G., Brochu, S., Godin, D., Levesque, L., Rioux, F. and Marcsau, F.

Biochem. f 1993 45 1289- 12 99 Dyson, H. J., Rance, M. ,

Hougten, R.A., Lerner, R.A. e Wright, P.E. J» Mol. Biol., 1988 201 161-200 Ember, J.A., Sanderson, S.D., Taylor, S.M., Kawahara, M. e Hugli, T.E.

Sanderson, S.D. J. Med Chem., 1BT! 40 877 Gerard, N e Gerard, L.

Nature, 1991 349 614-617 Gerard, C e Gerard, N.P.

Ann. Rev. Immunol., 1994 12 775-808 BarIGiiad, C.L., BllllRe, R.L., Whítehead, . , Akama, H., feG.mf oti, E.P., Brown, A. , Haviland, J.C., Parks, W.C., Perlmutter, D.H. e Wetsel, R. A. J. Immunol., 1995 154 1861-1869 Hutchinson, E.G. e

Thornton, J.M.

Protein Sei., 1994 3 2207-2215 Ihara, I, , Fukuroda, T., Saeki, T., Nishíkibe, M., Kojiri, K., Suda, H, e Yano, M.

Biochem. Biophys. Reç. Ccmm., 1991 178 132-137 Ihara, M., Noguchi, K., Saeki, T., Fukuroda, T., Tsuchida, S., Kimura, S. , Fukami, L., Ishikawa, K., Nishíkibe, M., and Yano, M.

Life Sciences, 1992 50 247 Kawai, I,, Quincv, D. A., Lane, B. , doldlliddf K.W., Luly, J.R., Cárter, G.W. J. Med. Chem., 1991 34 2068-71 Kawai, M., Quincy, D.A., Lane, B., Mollison, K.W., Or, Y.-S., Luly, R . e Cárter, G.W. J. Med. Chem., 1992 35 220-223 Kessler, H., Diefenbach, B., Fínsinger, D., Geyer, A., Gurrath, M., Goodman, S.L.,

Hoelzemann, G., Haubner, R., Jonczyk, A. e outros Letr.

Pept. Sei., 1995 2 155-160 Kohl, J., Lubbers, B., Klos, A., e outros.

Eur. J. Immiiol.f 1993 23 646-652 Konteatis, 11. .0,1, Síciliano, S.J., Van Riper, G., Molineaux, C.J., Pandya, S., Fischer, P., e , Mumford, R.A., e Springer, M.S.

Biopolymers, 1996 40 45-53 Morgan, E.L., Sanderson, S.D., Scholz, W., Noonal, D.J., Weigle, W.O. e Hugli, T.E. J. Iminunol. , 1992 48 3937-3942 Pracheur, Bossus, M. , Gras-Masse, H., Quiniou, 0., Tartar, A. e Craescu, C.T. J. Brochem., 1994 220 415-425 Rizo, J. e L.M.

Rev. Brochem., 1992 61 387 Sanderson, S.D., Ember, J.A., Kirnarsky, L., Sherman, S.A., Finch, A.M., Taylor, 2.. :'i, J. Med. Chem. , 1994 37 3171-3180 Sanderson, S.D.,

Kirnarsky, L., Sherman, 3-A ->7 Vogen, S . . Prakesh, O., Ember, J.A., Finch, A.M. e Taylor, S.M. J. M&d, Chem., 1995 38 3669-3675 Siciliano, S.J., Rollins, T.E., DeMariinc, J., Konteatis, Z., Malkowitz, L.,

VanRiper, G., Bondy, S., Rosen, H. e Springer, M.S.

Proc. Nat. Acad. Sei. USA, 1994 91 1214-1218.

The Natural Iirmune System. Humoral Factors., 1993, IRL Press, Oxford University Press, Oxford..

Tempero, R.M., Hoilingsworth, M.A., Burdick, M.D., Finch, P . . , Taylor S.M., Vogen, S.M., Morgan, E.L., e Sanderson, S.D. , 1997 153 1377-1382 Stradley, S.. , J.,

Bruch, M., Stroup, A. e Gierasch, L. :í í-:·:..·>· : ·..·?···.... :···. ·:·χ ·:· ·:·· ··:· r·. .·>·.· -·-··. ···.·· (· .·;··_ ·;··· v ç::* Ά ã R; v .K , ;kh çç ::à 5 h:: CR , ··:':· hç A::;t içrrs, A« Oh C M' and Medicine

Complernent in Health and Dísease. icMaannlogc Series, Ed. W. G., 1987, MTP Press Ltd, I.ancaster

Whitehouse, M.W.

HanidhhoR of liniícsi Models for the Rheumatic Diseases, Eds

Gf ébf;5>?:3IcU R.A., Diamond, R.S., Vol. I, pp 3-16 CRC Press Winter, Chim e Nuss, G.W.

Ar th. & Rheuinatísm, 1966 9 394 Zhang, X., Boyar, W., . N. e Goneiia, N.C.

Protein Sei., 1997 6 65-72 Zuiderweg, L.R.P., Nettesheim, D.G., Molison, K.W., Cárter, G.W.

Lisboa, 7 de Dezembro de 2007

Claims (11)

1. I. facto de ter Composto caracterizado peio actividade antagonista contra o receptor de C5a e não nenhuma actividade agonista de C5a que tem a seguinte fórmula geral:

   em que: A representa um átomo de H, um grupo alquilo, srilo, NH2, NH-alquilo, N(alquilo)^ NH-arilo ou NH-acilo; B representa un grupo alquilo, arilo, fenilo, benzilo, naftilo ou indoie ou a cadeia lateral de um D- ou L- amínoácido escolhido no grupo que consiste em fenilalanina, homo-fenilalanina, triptoftano, homo-triptofano, tirosina e hoirio-tirosina; á pÃrisi®. iàtcrsl PA : ':r

   *71 atsiss. s íddtitcirpa.' D representa a cadeia lateral de um D- ou L- aminoácido escolhido no grupo constituíco por ciclo-hexil-alanina, homo-ciclo-hexil-alanina, leucina, norleucina, homo-leucina, homo-norleu- cina e triptofano; E representa a cadeia lateral de um D- ou L- aminoácído escolhido no grupo constituído por triptofano e hp&dr-t/fip i. £?X.MíCí} r representa a cadeia lateral dt um D- ou L- aminoácido escolhido no grupo constituído por âr<iinlí:o.:í homo-arginina, lísina e homo-lisina; em que o símbolo X1 representa íCHjj ou (CH2) " '^2! 20“f "dClód j'v-f .·- ou ---ΟΡ,-ίίίίΡΡηΗ" em que R representa a cadeia lateral de qualquer aminoácido comum ou incomum; "alquilo" refere-ss a uma cadeia de alquilo linear, ramificada ou cíclica de 1 a 6 átomos de carbono, "ariio" refere-se a um grupo homo-cíciico ou hetero-cíclico em que o anel tem 5 ou 6 átomos de carbono e "acilo" refere-se a um grupo acilo de 1 a 6 átomos de carbono. Composto, de acordo com a reivindicação I, caracteri-zado pelo facto de F representar a cadeia lateral de um L-aminoácido. Composto, da acordo com a ru UUíí :: :V. t ::í Y. tUC PC.iO £-:.:-..,1 0 ÍO .V ÚiJpr íP 2 .• V ·.' .·'·' ·. J ;.<· í.dv.vxí; y::v.\.: ^ f ; -7 a C údt.l 4. Γ··"·'·' ':f de acordo com qualquer uma das reivindica ções i a 3, caracterizado peio facto de A representar H ou NH-acetílo. I. Composto, de acordo eo® qualquer uma das reivindica ções 1 a 4, caracterizado pelo facto de B representar índole, benziic, fenilo, ou naftilo.
2. 6. Composto, de acordo com qualquer uma das reivindi cações 1 a 4, caracterizado pelo facto de B representar a cadeia lateral da fenilalanina.
3. 7. Composto, de acordo com qualquer uma das reivindica ções de 1 a 6, caracterizado pelo facto de C representar D- ou L-ciclo-hexil-alanina (Cha), leucina, valina, isoleucina, fenilalanina, triptofano ou metionina.
4. 8. Composto, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, carâcterizado pelo facto de C representar a cadeia lateral de prolina, metionina ou lisina.
5. 9. Composto, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo facto de D representar a cadeia lateral da D-ciclo-hexil-alanina.
6. 10. Composto, de acorde com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo facto de E representar a cadela lateral do triptofano. 11. ooopo·de acordo c·o· qualquer uma )·»« reivindicações 1 a ú; caracterizado pislõ facto de F representar o cadeia lateral da arginina. 7;'. Composto, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado pelo facto de ít; representar - Cji:;.,íík· em que n representa 3 ou 4.
7. 13. Composto, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizado oelo facto de ser escolhido no grupo constituído pelos compostos Ac-F-[KP(dCh2)Wr], Ac-F-[CP(dCha)Wr], R [NH(CH2NH)C0- PdlldaiB:.;] , F- [NH [ ( (CH2) I1B) CO-PdChaWR] , AcF- [CPd (dCha) WR], [FWPdChaWR], AcF - ídMdehcfdr.] , AFF~ [KKdChaWr], ACF-[NH[((CH2)2NH)CO-PdChaWr], AcKF- [OPdChaWr] , F-[OP(dCha)WR] e F-[KP(dCha)WR].
8. 14. Composto, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo facto de ter a seguinte estrutura: 1 H A Λ uç ....- N i ξ — m · |t \ 1 1 V V· I s è 1 IX .;U S-·” u#· i à' i Π ' w I n 15. caracterizada pelo facto de compreender um composto de acordo com uma adcldo/df das reivindicações 1 a 14, em conjunto rao um oc um mxiiyiMiXÃ;. aceitáveis sob o de vista se destinar ao fabrico de um medicamento para o tratamento de um estado patológico mediado pelo receptor de C5a.
9. 17. Utilização de acordo com a reivindicação 16, caracte- rizada pelo facto de as condições mediadas pelos receptores de C5a envolverem a sobre-expressão e a sub-regulação de C5a.
10. 18. Utilização de um composto, de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 14, caracterizada pelo facto de se destinar ao fabrico de um medicamento para o tratamento de um estado inflamatório.
11. 19. Utilização, de acordo com a reivindicação 18, caracterizada pelo facto de o estado inflamatório ser a artrite inflamatória. 2(í:. Utilização, de acordo com a reivindicação 18, caracterizada pelo facto de o estado inflamatório poder ser seleccionado no grupo constituído por artrite reuma-tóide, síndroma de dificuldade respiratória do adulto (SDRA), lúpus eritematoso sistémico, rejeição de enxerto de tecido, doença isquémica do coração, lesão de reperfusão, choque séptico, psoríase, gengivite, aterosclerose, doença de Alzheimer, esclerose múltipla, lesão pulmonar e síndroma após diãlise extracor-pórea. Lisboa, 7 de Dezembro de 2007