PT1105467E - ''utilização de lisozima c modificada para preparar composições medicinais para o tratamento de algumas doenças graves'' - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO

"UTILIZAÇÃO DE LISOZIMA C MODIFICADA PARA PREPARAR COMPOSIÇÕES MEDICINAIS PARA O TRATAMENTO DE ALGUMAS DOENÇAS GRAVES"

Esta invenção relaciona-se com a utilização de um composto de lisozima c modificada ou seus sais de adição farmaceuticamente aceitáveis e com a sua produção industrial para a preparação de composições medicinais, mais particularmente oral, parentérica e tópica, para profilaxia e terapêutica de algumas doenças graves em mamíferos.

Sabe-se que a lisozima natural é uma enzima de origem peptídica, presente em muitas espécies do mundo animal e vegetal, possuindo nas diferentes espécies estruturas e mecanismos enzimáticos comparáveis mas não idênticos. A lisozima mais conhecida é a presente no ovo da galinha (lisozima c da clara do ovo da galinha) . A lisozima está amplamente distribuída no organismo de mamíferos; ela está presente, por exemplo, na saliva, nas lágrimas, no leite, em leucócitos, no muco cervical. Em 1922 Alexander Fleming descobriu uma substância presente no seu próprio muco nasal que era capaz de provocar a lise de algumas estirpes bacterianas. Esta substância foi identificada mais tarde como lisozima (hoje em dia melhor identificada como lisozima c) humana. Em 1963 Jolles e Canfield clarificaram independentemente a estrutura primária da lisozima purificada da clara de ovo de galinha. Em 1965 Phillips descreve a estrutura tridimensional da lisozima, com base na cristalografia de raios-X. Tal como na sua própria descoberta, a lisozima natural (mais precisamente a 2 lisozima c) da clara de ovo da galinha tem sido por vezes utilizada em medicina principalmente pelas suas propriedades antibacterianas, mas a análise retrospectiva dos estudos publicados ainda não esclareceu, mesmo hoje em dia, o seu mecanismo especifico de acção e nalguns casos os resultados experimentais parecem ser mesmo contraditórios (1,2,3) .

Actualmente os cientistas pensam que a acção biológica da lisozima c natural deveria ser dividida em dois modos distintos: uma acção directa e uma acção indirecta. A acção directa é determinada pela degradação da ligação (β, 1-^4) entre o ácido N-acetilmurâmico e a N-acetilglucosamina (4) de peptidoglicanos presentes na membrana celular de bactérias, determinando desse modo a lise da mesma (em consequência desta acção ela é frequentemente chamada de "muramidase") . Duma maneira geral, as bactérias Gram positivas são mais sensíveis à acção natural da lisozima do que as Gram negativas, provavelmente porque as últimas apresentam a membrana externa como uma barreira adicional. Esta acção directa da lisozima é potencialmente importante para a sua possível utilização terapêutica na profilaxia e tratamento de muitas doenças bacterianas, como faringite, conjuntivite, otite, sinusite, adenite, uretrite, vaginite, cistite, provocadas essencialmente por microrganismos da família Estreptococos. Pelo contrário, os fragmentos mucopeptídicos da membrana celular degradados, produzidos pela acção directa de lisozima nas bactérias, parecem ser capazes de induzir um processo de estimulação biológica não bem definido (acção indirecta da lisozima).

Alguns autores descreveram também recentemente a capacidade da lisozima c da clara de ovo da galinha e dos 3 seus derivados para estimular a produção de linfócitos T presentes no tecido linfático, associado ao intestino (GALT), e no baço (GALT-eixo esplénico).

No entanto, na literatura, alguns autores descreveram também a utilização de outros péptidos liticos específicos para o tratamento de muitas doenças. Nalgumas patentes recentes foi sugerida a combinação especifica da administração de Cecropinas e lisozima, para aumentar a acção dos dois compostos. Na realidade, alguns autores sugerem que as Cecropinas são muito mais activas na lise da célula, enquanto a lisozima é mais activa na sua degradação completa.

Os novos agentes quimioterapêuticos, como Cecropinas, Sarcotoxinas, Magaininas, Lepidopteranos, com as mesmas propriedades físicas, com uma estrutura em hélice α e carácter hidrófobo, são proteínas capazes de provocar a lise não só da membrana celular de bactérias (Listeria monocitogenes e Brucella abortus), mas também da membrana celular de protozoários (P. Falciparum) e vírus (Parainfluenza e Herpes Simplex), e de células eucariotas infectadas com bactérias. Utilizando um microscópio electrónico descobriu-se que os péptidos liticos produziam poros grandes na membrana das células, determinando a sua morte. Pelo contrário, as células saudáveis de mamíferos não são destruídas pelos péptidos liticos anteriores, devido provavelmente à presença de citoesqueleto, o qual está em contacto com vários pontos da membrana plasmática e, consequentemente, permite manter a integridades osmótica da célula. 4

Além disso, também a concentrações baixas os péptidos liticos poderiam ser utilizados como modificadores da resposta biológica, para estimular a proliferação de células do sistema imunológico e da pele. A acção anterior é provavelmente provocada pela produção de poros na membrana plasmática, determinando um fluxo de iões e de material nutritivo para as células, o qual estimula o crescimento da célula. ΑΝΤΙCÂNCER RESEARCH 16, 2559-2564 (1996); Pacor at al descreve os efeitos da Lisozima (lisozima da clara de ovo da galinha) e do seu derivado modificado mPEG-Lyso (página 2559, coluna 1, linhas 1-2). 0 composto utilizado por Pacor et al. foi preparado "por ligação covalente de monometoxipolietilenoglicol aos resíduos NH2 de Usinas da lisozima. Abreviadamente, activou-se M-PEG como descrito por Carnielli" (ver página 2560, coluna 1, linhas 1-3) .

Além disso Pacor et al. descreve os resultados seguintes (página 2560, coluna 2, parágrafo "Resultados", linhas 1-5): "mPEG-Lyso não modificou o crescimento do tumor primário mas provocou uma redução estatisticamente significativa na formação de metástases pulmonares espontâneas". IMMUNOLOGY LETTERS 49 (1996) 91-97; Takanori et al. avaliaram o efeito da "modificação de mPEG na capacidade da lisozima da clara de ovo da galinha (HEL) para estimular as células T" (página 91, parágrafo "Resumo", linha 2). 5 0 m-PEG-HEL utilizado por Takanori et ai. "foi preparado como descrito por Jackson" (parágrafo 2.3, linha D · 0 processo de pegilação realizado na molécula de HEL faz com que "mais do que seis de sete grupos aminoácidos de uma molécula de HEL fiquem acoplados a mPEG" (parágrafo 2.3, linhas 12-14).

Os resultados biológicos obtidos por Takanori estão resumidos na última página, coluna 1, linhas 16-23: "Os resultados na Fig. 58, que mostram que a mPEG-HEL não induz respostas anti-HEL nas células T em ratinhos H-2k, demonstram que as moléculas mPEG introduzidas a flanquear regiões epítopos para células T poderiam inibir a exposição do epítopo. Isto sugere que a modificação com mPEG é potente na redução das capacidades de estimulação das células T de proteínas...". Não obstante, embora muitas publicações evidenciem a acção positiva da lisozima natural (principalmente da lisozima c da clara de ovo de galinha) no tratamento de infecções de várias origens, a utilização potencial da lisozima de grupo c em medicina tem sido até à data muito limitada devido a três factores principais: a) a lisozima c humana (que é o tipo presente em seres humanos) é extremamente dificil de se obter em quantidades suficientemente grandes para aplicações terapêuticas; b) outros tipos de lisozima c, que podem ser obtidos de outras espécies, como bovinos e clara de ovo de galinha, podem apresentar alguns efeitos secundários negativos (o primeiro dos quais são as possíveis reacções alérgicas e o segundo o risco potencial de contaminação com 6 encefalopatias bovinas transmissíveis ou TBE), os quais limitam consideravelmente a sua utilização em medicina; c) tipos de lisozimas, diferentes do c, provenientes de outras espécies animais não são adequados para efeitos clínicos uma vez que apresentam uma homologia muito baixa com a lisozima c humana. É apresentado um quadro onde é indicada a homologia entre a lisozima humana e lisozimas de outros mamíferos, todas elas de tipo c: ORIGEM DA LISOZIMA HOMOLOGIA % Ovo (clara) de galinha 56,8% Ratazana 76,4% Vaca 82,3% Coelho 82,3% Cavalo 50,8%

Apesar da lisozima c bovina apresentar uma homologia mais elevada do que a da clara de ovo de galinha, a última é a mais utilizada na prática clínica devido a estar disponível correntemente em quantidades adequadas a preços convenientes. Com base na introdução anterior existe um interesse considerável em explorar novas possibilidades de utilização da lisozima natural c, dos seus derivados possíveis e para produzir preparados medicinais, que permitam alargar a sua utilização a algumas doenças graves em seres humanos e/ou utilizar vias de administração novas e anteriormente inexploradas.

Apesar das muitas investigações experimentais em animais e das recentes publicações versando a lisozima c, as aplicações medicinais deste composto, quando administrado por via oral, permanecem limitadas às 7 patologias tradicionais, já bem conhecidas dos especialistas.

No entanto estes estudos parecem ter obtido resultados muito limitados e por vezes contraditórios.

Por conseguinte, o objectivo principal da presente invenção é proporcionar composições medicinais contendo um composto modificado de lisozima c natural, mais particularmente um composto de monometoxipolietilenoglicol-lisozima c (daqui em diante definido como «MLc» para uma natureza prática da descrição) ou seus sais de adição com ácidos farmaceuticamente aceitáveis, com a seguinte fórmula geral (I) : [CH30- (CH2-CH2-0)n-CH2-CH2]x- (NH)y Lisozima c . (Z)m em que: y = número de grupos amino livres das moléculas de lisina presentes na molécula de lisozima c compreendido entre 5 e 30; x = número de moléculas de monometoxipolietileno glicol para cada molécula de lisozima c, em que o valor pode variar desde 1 até y; n = número de grau de polimerização da parte de polietileno glicol, compreendido entre 5 e 1000;

Lisozima c = lisozima c de seres humanos; Z = ácido orgânico ou inorgânico farmaceuticamente aceitável, monovalente ou polivalente, capaz de produzir sais de adição com a lisozima c considerada; m = número de moléculas de ácido farmaceuticamente aceitável utilizadas para a obtenção do sal de adição de MLc, o qual pode variar desde 1 até ao valor correspondente 8 ao número total de grupos amino presentes na molécula de lisozima c.

Este composto é surpreendente e particularmente útil e eficaz para o tratamento especifico de algumas doenças graves em mamíferos.

Mais particularmente no composto de lisozima c modificada, utilizado como substância activa para a preparação de composições medicinais úteis para o tratamento de algumas doenças graves em mamíferos, o número de radicais de monometoxipolietileno glicol (x) pode variar desde 1 até "y", o grau de polimerização (n) da parte de polietileno glicol do monometoxipolietileno glicol deverá estar compreendida entre 5 (P.M. cerca de 161) e 1000 (P.M. cerca de 32 206), mais preferencialmente entre 120 (P.M. 3865) e 200 (P.M. 6441), enquanto o número de moléculas do aminoácido lisina (y), possuindo um radical -NH- ligado a monometoxipolietileno glicol, na lisozima c humana pode variar desde 5 ou até mais, até um máximo de 30. Z significa qualquer ácido orgânico ou inorgânico farmaceuticamente aceitável, mono ou polivalente, farmaceuticamente aceitável, o qual pode ser combinado de modos diferentes, em que "m" é o número de moléculas do ácido farmaceuticamente aceitável, que pode ser necessário para produzir o sal de adição com a MLc e o qual pode variar desde 0 até ao valor correspondente ao número total de grupos amino presentes na molécula da lisozima c considerada, valor esse que deve ser dividido pela valência do mesmo ácido (Z). 9

Recentemente alguns autores publicaram que, duma maneira geral, as proteínas podem produzir, por reacções químicas muito simples já conhecidas dos especialistas na técnica, derivados de condensação com polietileno glicóis.

No estado actual da técnica os derivados pegilados de outras lisozimas do grupo c são desconhecidos e, por conseguinte, eles deverão ser considerados não descritos e novos, assim como as suas utilizações terapêuticas.

Foi também observado que estes derivados pegilados apresentam geralmente uma imunorreactividade reduzida e uma melhor estabilidade contra o aquecimento e a degradação durante a sua conservação. Alguns autores também formularam a hipótese de que estes derivados pegilados poderiam também mostrar, após a sua absorção, uma melhor resistência aos agentes proteolíticos e, por esse motivo, uma melhor semivida no plasma.

Estes derivados pegilados também podem ser obtidos por um processo de síntese, o qual determina uma ligação covalente da lisozima c natural seleccionada com os radicais de monometoxipolietileno glicol seleccionados depois de expor, à temperatura ambiente durante cerca de 2 horas, a lisozima c ao monometoxipolietileno glicol tresilado em PBS (Soro Fisiológico Tamponado com Fosfato) ou num tampão de borato a pH diferente (quase sempre em meio ligeiramente básico) e em proporções diferentes. 0 reagente de glicol tresilado pode ser geralmente obtido de monometoxipolietileno glicol activado com cloreto de tresilo. 0 monometoxipolietileno glicol é seleccionado para proporcionar uma extremidade reactiva em cada molécula, evitando assim produtos reticulados indesejados, e 10 produzindo apenas o composto seleccionado da MLc desejada. A purificação da MLc é realizada utilizando colunas de Shepadex G-50 (12 cm x 1,3 cm) estabilizado com PBS, ou por ultracentrifugação com membranas Amicon de porosidade desejada. No caso de se desejar obter os sais de adição de MLc, por exemplo cloridrato de MLc, é necessário realizar uma diálise com uma solução aquosa de HCl diluído (10-100 mM) durante toda a noite a 4°C ou mais preferencialmente durante 6-8 horas à temperatura ambiente, realizando em seguida a purificação com uma coluna de Sephadex G-50. O sal resultante deverá ser depois liofilizado e conservado a temperaturas inferiores a 0°C, até ser utilizado.

Um esquema geral de síntese possível de sais de adição de MLc é indicado abaixo, para uma melhor compreensão do seu processo de síntese (NOTE: os grupos amino da lisozima c são evidenciados para uma melhor compreensão) : CHjO-CC^-CHj-O}^ I -Η {A) i + Císomcfq (B)

CH1 - SOjOíj-CF, (Q | r (NH)y Lisozima c (D)

Lisozima c <E) I 4 (Ζ)Λ (F) [CH}OKCHfCH:4))sCH,CHl-(M3,Lisozimac .¾ (G) A = monometoxipolietileno glicol (MPEG) com apenas um grupo reactivo final; B = cloreto de tresilo (cloreto de 2,2,2-trifluoroetano-sulfonilo); C = monometoxipolietileno glicol tresilado (TMPEG); 11 D = lisozima c; E = lisozima c modificada (MLc); F = ácido farmaceuticamente aceitável; G = sal de adição de MLc.

As concentrações de proteína são depois medidas directamente determinando a absorvância a 280 nm e por titulação com "azul brilhante de Coomassie". Para a reacção colorimétrica transfere-se uma alíquota de 100 μΐ da mostra de proteína para placas microtítulo e adiciona-se 200 μΐ de reagente de "ensaio de proteína com Coomassie". Mede-se a absorvância a 555 nm por meio de um leitor microtítulo após 5 minutos de incubação à temperatura ambiente. Utilizando ambos os métodos descritos, determina-se a concentração da amostra por meio de uma curva de calibração obtida a partir de uma solução-mãe de lisozima c a uma concentração conhecida. A MLc obtida é depois testada determinando o teor utilizando três métodos diferentes: 1) electroforese em SDS-gel de poliacrilamida; 2) Cromatografia de filtração molecular; 3) Actividade enzimática segundo o método convencional. 1) Electroforese de SDS-Gel de poliacrilamida

Utiliza-se um gel de poliacrilamida a 15 %. O ensaio é geralmente realizado entre 100 e 150 V, durante cerca de 45 minutos.

Solução concentrada de acrilamida (30 %)/bisacrilamida: 12

Dissolver 29,2 g de acrilamida e 0,8 g de bisacrilamida em 70 ml de água desionizada. Depois da acrilamida se ter dissolvido, adicionar água para originar um volume de 100 ml. Filtrar a solução através de uma membrana de 0,4 5 μιη de tamanho de poro. A solução obtida é estável a 4°C durante 1 mês quando conservada num frasco escuro.

Tampão A (tampão de Tris-HCl 1,5 M, pH 8,80):

Dissolver 18,2 g de base Tris em cerca de 80 ml de água destilada. Ajustar o pH até 8,80 com HCl e produzir um volume de 100 ml adicionando água destilada. Conservar o Tampão A obtido a 4°C.

Tampão B (tampão de Tris-HCl 0,5 M, pH 6,80):

Dissolver 6,1 g de base Tris em 80 ml de água destilada. Ajustar o pH até 6,80 com HCl e aferir a 100 ml de volume adicionando água destilada. Conservar o Tampão B obtido a 4 °c.

Dodecilsulfato de sódio (SDS) 10% (p/v):

Dissolver 10 g de SDS em 60 ml de água. Perfazer o volume a 100 ml com água destilada.

Tampão de dissolução da amostra (Tris-HCl 0,06 M, pH 6,80, 2 % de SDS, 10 % de qlicerol, 0,025 % de azul de bromofenol): Água 4,80 ml Tampão B 1,20 ml SDS 10 % 2,00 ml Glicerol O O \—1 ml Azul de bromofenol a 0,5 % 0,50 ml 13

Conservar a solução anterior à temperatura ambiente. 0 tampão de redução de SDS é preparado adicionando 50 μΐ de 2-mercaptoetanol a cada 0,95 ml de solução tampão da amostra. Preparar esta solução no momento da sua utilização.

Catalisador (persulfato de amónio a 10 % p/v): Dissolver 100 mg de persulfato de amónio em 1 ml de água destilada. Preparar esta solução no momento da sua utilização. TEMED:

Usar directamente o produto presente no frasco. Conservar num local não húmido, proteger da luz.

Tampão de eluição (Tris 0,025 M, glicerol 0,192 M, 0,1 % (p/v) de SDS pH 8,30±0,20) :

Dissolver 0,3 g de base Tris, 1,4 g de glicerol, 1 ml de SDS a 10 % em 100 ml de água destilada. Conservar este tampão de eluição a 4°C.

Preparação de gel de poliacrilamida a 15 % (Tris 0, 375 M, pH 8,80): Água destilada 2,35 ml Tampão A 2, 50 ml SDS a 10 % (p/v) 0,10 ml Solução concentrada de: acrilamida / bisacrilamida a 30% 5,00 ml persulfato de amónio a 10 % (p/v) 0,05 ml TEME D 0, 005 ml Volume total 10,005 ml

Preparação de gel de poliacrilamida a 4 % (Tris 0,125 M, pH 6,80): 14 Água destilada 6,10 ml Tampão B 2,50 ml SDS a 10 % (p/v) 0,10 ml Solução concentrada de: acrilamida / bisacrilamida a 30 % 1,30 ml Persulfato de amónio a 10 % (p/v) 0,05 ml TEME D 0, 005 ml Volume total 10,055 ml

Preparação da amostra:

Diluir a amostra com 4 volumes de tampão de redução de SDS e aquecer até 95°C durante 4 minutos ( cada banda do gel deverá conter não menos do que 1 μρ de proteína) . A migração electroforética é realizada utilizando um equipamento MiniProtean II (BioRad, Califórnia), à temperatura ambiente. A voltagem aplicada é de 100 - 150 V durante cerca de 45 minutos.

Coloração do gel com azul brilhante de Coomassie R- 250:

Dissolver 0,2 g de azul brilhante de Coomassie R-250 em 1 litro de uma solução contendo 50 % (v/v) de metanol, 10 % (v/v) de ácido acético e 40 % (v/v) de água destilada. Filtrar a solução utilizando um filtro de papel e conservar a solução num frasco âmbar. Antes de utilizar a solução obtida é necessário verificar sempre se está presente um precipitado corado. No caso afirmativo voltar a filtrar.

Colocar o gel durante 10 minutos numa solução contendo 50 % (v/v) de metanol, 10 % (v/v) de ácido acético e 40 % (v/v) de água destilada para eliminar a presença de SDS.

Manter o gel na solução colorida sob agitação constante e lenta durante 30 minutos a 50°C ou alternativamente durante 2 horas à temperatura ambiente. 15

Conservar o gel num meio líquido consistindo de uma solução de ácido acético a 10 % (v/v).

Alternativamente, secar o gel utilizando uma solução de glicerol e uma película de celofane e proceder do seguinte modo: a) colocar o gel durante 10 - 15 minutos numa solução de glicerol a 10 % (v/v); b) humedecer a película de celofane na mesma solução; c) colocar o gel entre duas películas de celofane húmidas sem introduzir bolhas de ar; d) colocar o gel numa prateleira e deixá-lo à temperatura ambiente.

Avaliação dos resultados: A composição da amostra é determinada por densitometria a 595 nm no gel, utilizando um equipamento adequado, como por exemplo um equipamento de varrimento Shimadzu UV/VIS CS 930.

Limite de aceitabilidade: A amostra deverá conter uma única mancha, após coloração com azul brilhante de Coomassie R-250. O teor de MLc não deverá ser inferior a 95 %. 2) Cromatografia de filtração molecular

Submete-se a amostra a cromatografia utilizando uma coluna de Superose 12HR 10/30 e um equipamento para FPLC (Cromatografia Líquida de Desempenho Rápido) equilibrado com PBS. Diluiu-se a amostra com PBS antes de a transferir para a coluna. Injectar 200 μΐ da amostra e eluir com PBS a um caudal de 0,3 ml/min. Recolher fracções de 0,25 ml. O perfil de eluição é determinado por espectrofotometria a 16 280 nm. A concentração proteica é determinada quantitativamente utilizando azul brilhante de Coomassie.

Utilizar marcadores com peso molecular conhecido a uma concentração de 3 mg/ml, como por exemplo β-amilase (200 KDa) , álcool desidrogenase (150 KDa), albumina de soro bovino (66 KDa), anidrase carbónica (29 KDa), citocromo C (12,4 KDa), aprotinina (6.5 Kda). A MLc eluiu a cerca de 17,35 ml nas condições indicadas.

Limite de aceitabilidade: O teor de MLc não deverá ser inferior a 95 %. 3) Actividade enzimática

Este método é realizado segundo métodos convencionais já descritos na literatura (5, 6, 7) .

Condições de ensaio: A) Suspensão de Micrococcus luteus (Micrococcus lysodeikticus) a uma concentração de 0,3 mg/ml em tampão de fosfato 0,2 M (pH= 7,00) e 17 mM de NaCl. B) Solução de MLc (1 mg/ml) em água destilada. C) Espectrofotómetro adequado para determinar variações de absorvância a 450 nm.

Procedimento:

Colocar 2,9 ml de uma suspensão de Micrococcus luteus (Micrococcus lysodeikticus) numa cuvete espectrofotométrica. Deixar a suspensão durante 4-5 minutos a 25°C, para permitir que a suspensão atinja a temperatura de reacção. Adicionar 0,1 ml de solução enzimática e registar a variação de absorvância a cada minuto a 450 nm. 17 Cálculo da actividade enzimática da MLc:

Unidades/mg = _(AA450nm/min) x 103_ mg de enzima na mistura reaccional A unidade enzimática é definida como a quantidade de enzima que nas condições de ensaio (pH = 7,00 a 25°C) diminui de 0,001 a cada minuto a absorvância da suspensão de Micrococcus luteus. Desse modo, o anterior demonstra que a MLc mantém também a actividade enzimática principal, já conhecida na lisozima c natural.

Noutra forma de realização da presente invenção, os autores notaram surpreendentemente que a via de administração da MLc ou dos seus sais farmaceuticamente aceitáveis é fundamental e determinante para viabilizar efeitos terapêuticos desconhecidos e assinaláveis nalgumas doenças graves em mamíferos.

De facto os autores descobriram surpreendentemente que a administração oral de MLc pode induzir níveis plasmáticos elevados de TNF-α (Factor de Necrose Tumoral alfa) livre, biologicamente disponível, inibindo desse modo, por um mecanismo praticamente directo e de modo significativo, a velocidade de replicação do processo proliferativo tumoral em mamíferos (8, 9, 10) .

Na realidade, uma forma de realização particularmente preferida da presente invenção é a utilização de MLc para a preparação de composições medicinais para serem administradas por via oral ou que, de outro modo, a administração oral de MLc é adequada para induzir um 18 aumento plasmático significativo de TNF-α livre, resultando esta última substância, quando biologicamente disponível, particularmente útil pelo seu efeito protector e para o tratamento especifico de processos tumorais em geral, especialmente quando na fase inicial. É de facto conhecido das publicações mais recentes que o TNF-α é um factor especifico, como indicado pelo seu nome, capaz de induzir a inibição, e contudo também a necrose, do processo tumoral das células também quando multiplicadas in vitro.

Os processos tumorais são paradoxalmente acompanhados por niveis hemáticos elevados de TNF-α, o qual está ligado a formas solúveis de receptores e, por conseguinte, não está livre e biologicamente disponível. Pelo contrário é muito importante induzir níveis elevados de TNF-α livre (11, 12, 13). 0 mecanismo subjacente ao facto da MLc apenas por administração oral ser capaz de induzir extraordinariamente o aumento dos níveis plasmáticos de TNF-α livre é ainda desconhecido e constitui matéria de investigação pelos autores, mas pode estar hipoteticamente relacionado in vivo com uma possível estimulação activa do processo de biossíntese de TNF-α. 0 mecanismo pode ser explicado pelo facto da transcrição do gene do TNF e da tradução do ARNm serem ambos fortemente estimulados por peptidoglicanos, os quais são a expressão mais directa e significativa da actividade enzimática e lítica da MLc, administrada por via oral, nas paredes celulares de bactérias, normalmente constituintes da flora intestinal (14), demonstrando assim por contraste que a MLc manteve a sua actividade enzimática semelhante à correspondente à 19 lisozima c natural, o que está em clara contradição com a publicação de outros autores. No que se refere ao mecanismo é necessário considerar que um estudo recente indicou que homólogos da MAP cinase ficam fosforilados em células estimuladas por peptidoglicanos, sugerindo desse modo o seu possivel envolvimento na transdução de sinal. A maior parte das acções biológicas pliotrópicas do TNF podem ser atribuídas à sua capacidade para activar uma variedade de genes numa multiplicidade de células alvo. 0 TNF-α e a citocina IL-1 funcionalmente relacionada são as únicas substâncias naturais conhecidas como tendo um espectro lato de genes alvo. A lista parcial de proteínas induzidas pelo TNF inclui: IL-Ια e IL-Ιβ, IL-6, IL-8, IFN-β, cadeia α do receptor de IL-2 e muitas outras.

Surpreendentemente os autores notaram também na presente invenção que a administração oral de MLc também diminui os níveis plasmáticos de ácido siálico (total), o qual é um "marcador não específico", que aumenta patologicamente nalguns processos degenerativos graves, incluindo diferentes tipos de tumores. A constatação anterior sustenta ainda que a estimulação de TNF-α livre, obtida pela administração oral de MLc, determina, como reivindicado, os efeitos de inibição terapêutica de processos neoproliferativos, os quais são a expressão de células tumorais em animais. Por conseguinte pode concluir-se que o primeiro objectivo da presente invenção é a utilização de MLc ou dos seus sais farmaceuticamente aceitáveis para a preparação de composições medicinais para serem administradas apenas por via oral para se obter um aumento assinalável do nível plasmático de TNF-α livre, 20 biologicamente disponível desse modo e, consequentemente, particularmente útil na profilaxia e tratamento de processos tumorais em mamíferos, para os quais um aumento de TNF-α plasmático livre (não bloqueado por formas solúveis de receptores) é capaz de produzir efeitos benéficos e terapêuticos.

Outra forma de realização preferida e importante da presente invenção é a utilização de MLc ou dos seus sais farmacologicamente aceitáveis para a preparação de composições medicinais particularmente úteis para o tratamento de artrite reumatóide, Síndrome da Imunodeficiência Adquirida, mais habitualmente conhecida pela terminologia "SIDA", psoríase e choque séptico, onde a via de administração mais preferida, para viabilizar os efeitos farmacológicos e terapêuticos desejados, é a via parentérica, mais precisamente a via intravenosa. De facto foi experimentalmente demonstrado que, quando a MLc é administrada por via parentérica, mais preferencialmente por via intravenosa, ela inibe fortemente os níveis plasmáticos de TNF-α, induzindo desse modo surpreendentemente uma resposta farmacológica, que é precisamente oposta da conseguida quando a MLc é administrada por via oral. O alvo principal da resposta inflamatória crónica na artrite reumatóide (RA) é o sinóvio. Se bem que se desconheça a origem desta doença debilitadora incapacitante, a caracterização das células inflamatórias infiltradas e seus produtos é da maior importância para compreender a sua patogénese. 21

Existe evidência considerável que envolve o TNF-α na patogénese de RA. Esta evidência baseia-se não só na presença generalizada de TNF-α nas articulações artríticas, acompanhada de um aumento da resposta dos receptores de TNF-α, mas também nos efeitos de uma neutralização de TNF-α em culturas de células das articulações.

Assim a neutralização in vitro de TNF-α induz a inibição da produção de interleucina 1, como TNF-α, que se julga ser a causa determinante da inflamação e da erosão da articulação.

Na SIDA o TNF-α é um activador potente da replicaçâo do vírus HIV nas células infectadas. Em doentes sintomáticos, os níveis de TNF-α são maiores do que em doentes assintomáticos. Provavelmente, o TNF-α determina uma activação transcricional de pró-vírus HIV integrados no genoma da célula hospedeira, aumentando os níveis de ARN virai. Além disso o TNF-α contribui para a replicaçâo virai, a qual aumenta por sua vez a destruição de linfócitos CD4~ e reduz as funções imunológicas do organismo (15) .

Consequentemente em patologias, como a RA, mas especialmente a SIDA, em que os níveis de TNF-α são elevados, a administração de MLc por via oral não é adequada, mas absolutamente autodestruidora e contra-indicada porque pode provocar uma exacerbação da doença, aumentando os níveis de TNF-α que já são elevados. Pelo contrário, a presente invenção evidenciou de modo 22 surpreendente que a administração parentérica de MLc ou dos seus sais farmaceuticamente aceitáveis, mais particularmente por via intravenosa na SIDA e por via intra-articular na R.A, induz um diminuição terapêutica acentuada e favorável dos niveis de TNF-α nos fluidos (plasma na SIDA e fluido sinovial na R.A.). Este efeito terapêutico importante, matéria objecto da presente invenção, sustenta a hipótese de que a diminuição de TNF-a pode ser atribuída à acção inibidora reflectida (efeito de "repercussão") nos órgãos celulares ou no mecanismo na origem destas patologias.

Além disso observou-se uma redução significativa experimental de TNF-α no plasma e no fluido cerebrospinal (CSF) em estudos não controlados em seres humanos, e desse modo as indicações terapêuticas dos preparados medicinais parentéricos de MLc ou dos seus sais farmacologicamente aceitáveis, são também particularmente alargadas a debilitações graves inversas do Sistema Nervoso Central ("complexo de demência associada à SIDA" e outros distúrbios motores e cognitivos graves correlacionados).

Outra forma de realização particularmente preferida da presente invenção é a utilização de MLc ou dos seus sais farmacologicamente aceitáveis para a preparação de um medicamento tópico, capaz de induzir uma actividade anti-histamínica acentuada, quando a MLe ou os seus sais farmaceuticamente aceitáveis são aplicados localmente. Foi mostrado em estudos experimentais não controlados que estes preparados medicinais tópicos de MLc ou dos seus sais farmacologicamente aceitáveis previnem o aumento do fluxo 23 sanguíneo, permeabilidade vascular, edema, dor e irritação provocada pela acção de histamina.

Outra forma de realização particular da presente invenção é que os preparados medicinais tópicos de MLc ou dos seus sais farmacologicamente aceitáveis são particularmente activos para determinarem também por via transdérmica a redução dos níveis de TNF-α, sendo os produtos medicinais anteriores particularmente indicados para o tratamento de artrite reactiva, artrite reumatóide, artrite psoriática e, duma maneira geral, naquelas patologias cutâneas e subcutâneas em que é terapeuticamente necessária uma redução nos níveis de TNF-cc.

Outra forma de realização preferida da presente invenção é que os preparados tópicos de MLc ou dos seus sais farmacologicamente aceitáveis são particularmente activos no tratamento tópico de acne e na prevenção de dentes cariados.

Outra forma de realização preferida da invenção é a utilização de MLc ou seus sais farmaceuticamente aceitáveis para a preparação de produtos medicinais, em que eles podem estar associados, em quantidades e proporções variáveis, a outras substâncias com acção antibacteriana, de origem química e antibiótica, como penicilinas semi-sintéticas ou sintéticas, cafalosporinas, macrólidos, eritromicinas, derivados quinolónicos, apenas para mencionar alguns dos mais importantes. Estas associações, convenientemente formuladas em preparados galénicos adequados conhecidos dos especialistas na técnica, são particularmente úteis para vencer infecções ou patologias provocadas por bactérias, macrovírus, vírus ou priões, os quais são particularmente 24 sensíveis ao efeito terapêutico sinérgico destas associações de MLc ou seus derivados.

Outra forma de realização preferida da presente invenção é que em estudos não controlados, em que por razões éticas foi apenas admitido um número limitado de voluntários saudáveis para cada indicação, os preparados medicinais de MLc ou dos sais farmacologicamente aceitáveis mostraram efeitos terapêuticos surpreendentes, que não podem ser explicados pelo conhecimento biológico actual, mas que serão objecto de mais investigação, noutras patologias graves, como anorexia, esclerose múltipla, esclerose lateral amiotrófica, doença de Alzheimer, Parkinson, Encefalopatia Espongiforme Bovina (BSE), Encefalopatia Transmissível Bovina (TBE), doenças de Creutzfeldt-Jacob, enfarte do miocárdio, icto, todas as patologias em que hoje em dia se possa apenas supor o envolvimento de bactérias, agentes virais e/ou agente proteico infeccioso (priões) na sua etiopatogénese. A presente invenção também proporciona uma composição farmacêutica adequada contendo MLc ou os seus sais farmacologicamente aceitáveis, sozinhos ou associados a uma ou mais substâncias activas do mesmo grupo ou com qualquer outra substância medicinal diferente ou com uma mistura destas, preparadas utilizando veículos ou diluentes farmaceuticamente aceitáveis inertes, ou uma mistura destes, no estado sólido, líquido ou gasoso, à temperatura ambiente. A composição farmacêutica da invenção contendo MLc ou os seus sais farmacologicamente aceitáveis pode ser qualquer preparado adequado para via oral, como 25 comprimidos, de libertação imediata ou prolongada, cápsulas, granulado, pó, xarope, suspensão ou emulsão, gotas e também de modo adequado para administração parentérica, como soluções aquosas estéreis, pós condicionados ou liofilizados estéreis para preparação extemporânea de soluções ou dispersões injectáveis estéreis e, finalmente, também na forma de preparados tópicos, como cremes, pomadas, loções, geles e gaze medicada, e emplastros transdérmicos. A composição farmacêutica da invenção contendo MLc ou seus sais farmaceuticamente aceitáveis também podem ser compreendidos em sistemas para aplicação pela via endonasal, pulverização sob pressão ou por inalador, e supositórios rectais e vaginais, pasta de dentes, todos preparados segundo técnicas gerais bem conhecidas dos especialistas.

Nas composições medicinais da invenção, a serem administradas por via oral, a MLc ou seus sais farmaceuticamente aceitáveis são misturados sozinhos ou com outras substâncias activas, em quantidades e proporções adequadas, num veiculo farmaceuticamente aceitável conveniente, sólido ou liquido ou uma mistura destes de modo a produzir formas farmacêuticas adequadas contendo as doses desejadas. A unidade de dose oral contém preferencialmente desde 5 até 80 % da substância activa, mais preferencialmente entre 40 % e 60 %.

Alguns veículos sólidos inertes adequados, convencionais são por exemplo lactose, amido, talco, celulose microcristalina, fosfato de cálcio, estearato de magnésio, dextrinas e/ou outros excipientes, aglutinantes, desintegrantes, diluentes, lubrificantes, adoçantes e 26 aromatizantes, já conhecidos na técnica, com ou sem a utilização de água ou de outro solvente auxiliar adequado.

As soluções aquosas convencionais para utilização oral de MLc ou dos seus sais farmacologicamente aceitáveis podem ser preparadas dissolvendo a substância activa em água ou em qualquer outro solvente liquido adequado à temperatura ambiente e adicionando quantidades e proporções diferentes de corantes, adoçantes, aromas, estabilizantes, tensioactivos e espessantes adequados, consoante desejado.

As suspensões aquosas adequadas para utilização oral podem ser preparadas dispersando a MLc em pó fino ou seus sais farmaceuticamente aceitáveis em água ou em qualquer outro veiculo farmacêutico adequado com agentes de suspensão, como gomas naturais ou sintéticas, resinas, metilcelulose, carboximetilcelulose de sódio e outros bem conhecidos na técnica.

Os preparados parentéricos da invenção, contendo MLc ou seus sais farmaceuticamente aceitáveis, podem ser formulados segundo a técnica conhecida, utilizando solventes ou diluentes parentericamente aceitáveis, adequados, mais particularmente água com outros excipientes auxiliares como cloreto de sódio, açúcares, tampões, etanol, polióis (glicerol, propileno glicol), conservantes e agentes de retardamento da absorção. A utilização destes agentes para composições farmaceuticamente aceitáveis adequadas de MLc ou seus sais farmacologicamente aceitáveis, já é bem conhecida na técnica. De facto, nas composições medicinais da invenção pode ser incluído qualquer excipiente convencional ou uma 27 mistura destes, excepto quaisquer meios ou agente convencionais incompatíveis com a substância activa. É especialmente conveniente formular as composições parentéricas da invenção na forma de dose unitária para simplificar a sua administração e para garantir uniformidade da dosagem, como ampolas ou frascos a serem produzidos segundo técnicas já conhecidas dos especialistas, em condições estéreis e assépticas e embaladas na atmosfera de um gás inerte (azoto) para impedir eventuais processos de degradação. A concentração de substância activa, na forma de solução ou de um pó para reconstituição, pode variar desde 0,5 % até 10 %, preferencialmente desde 2 % até 4 %. Os preparados da invenção para utilização tópica ou local, são produzidos com técnicas convencionais já conhecidas dos especialistas, adequadas para a preparação destas formas farmacêuticas a serem aplicadas localmente à pele a doses terapeuticamente eficazes.

Quando os preparados medicinais da invenção são utilizados para administração oral, cada dose unitária oral pode conter uma quantidade de MLc ou seus sais que varia desde 50 mg até 2000 mg, preferencialmente desde 250 até 1000 mg (ou cada 5 ml no caso de formas líquidas), enquanto no caso de preparados para serem utilizados parentericamente a dose unitária pode conter desde 100 mg até 2000 mg em 50 ml, preferencialmente desde 500 mg até 1000 mg, independentemente de que a substância activa já esteja dissolvida numa solução ou pós liofilizado par reconstituição com 50 ml de solvente. Para os preparados tópicos da invenção, o teor do composto de fórmula (I) pode 28 ser utilizado a uma concentração variável compreendida entre 0,5 % e 10 %, preferencialmente entre 1 % e 5 % do teor total.

Quando é adoptada a administração oral é geralmente utilizada uma dose diária terapêutica de MLc ou seus sais compreende entre 150 mg e 6 g ao dia, mais preferencialmente compreende entre 500 mg e 2,5 g ao dia. Pela via parentérica as doses diárias totais de MLc ou seus sais pode variar desde 200 mg até 3 g por dia, preferencialmente entre 500 mg e 2 g por dia.

Estas dosagens podem ser aumentadas relativamente à patologia a ser tratada, ao seu nivel de gravidade e à resposta terapêutica desejada. De igual modo, a duração do tratamento pode variar consideravelmente, sempre em relação à doença a ser tratada, à sua gravidade e à resposta terapêutica que é obtida durante o tratamento.

No entanto subentende-se que a dosagem especifica, a frequência de dosagem, a dose diária total e sobretudo a duração do tratamento podem estar sujeitas a variações significativas em cada doente dependendo de uma diversidade de factores e critérios de avaliação, como actividade do composto especifico, gravidade e patologia a ser tratada, idade, peso corporal, estado geral de saúde, género, dieta, velocidade de excreção, associação farmacológica, condições gerais da pessoa submetida a terapia. 29

Referências e Fischel, transformed E. (1979). Clin. Res. (1) Ossermann, E.F., Klockars, M., Halper J. R.E. (1973) . "Effects of lysozyme on normal and mammalian cells". Nature 243; 331-335. (2) Rinehart, J., Jacobs, H. e Ossermann, "Lysozyme modulation of lymphocyte proliferation". 27: 305A. (3) Lemarbre, P., Rinehart, J.J., Kay, N.E., Vesella, R. e

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Avaliação dos niveis de citocinas, TNF-α, IL-Ia e IL-1β, IL-6 e IL-8, no soro em ratinhos CBA após administração oral de cloridrato de MLc (clara de ovo de galinha) durante 7 dias consecutivos. O tratamento dos ratinhos da linhagem CBA foi realizado por administração oral de dosagens diárias de cloridrato de MLc (clara de ovo de galinha) a 25-100 mg/Kg/dia durante 7 dias consecutivos (quantidade exprimida como equivalentes de lisozima c de clara de ovo de galinha). O composto sob ensaio foi cuidadosamente misturado com o alimento em pó. O nivel de TNF-α, IL-la, IL-Ιβ, IL-6, IL-8 foi determinado no dia 7 por imunoensaio enzimático (ELISA). O Quadro 1 mostra os resultados obtidos, evidenciando o maior nivel de TNF-α plasmático e, consequentemente, de outras citocinas após administração de MLc (clara de ovo de galinha): 31 QUADRO 1 NÍVEIS PLASMÁTICOS DE TNF-α E CITOCINAS (pg/ml) Após 7 dias de tratamento oral com MLc (clara de ovo de galinha) Pré-tratamento (mg/Kg/dia) TNF-a IL-Ia IL-Ιβ IL-6 IL-8 0 6,14 7,16 1,51 3,52 2,81 25 11,14 10,74 2,42 5,24 4,50 100 11,80 11,07 2,57 5,63 4,06 EXEMPLO 2 (não é de acordo com a Invenção)

Avaliação dos níveis de TNF-α e IFN-a (interferão alfa) no soro em doentes voluntários com SIDA após administração de cloridrato de MLc (clara de ovo de galinha) por via intravenosa (fleboclise). Confirmou-se que na SIDA, os TNF-α e TNF-a parecem desempenhar uma função crucial, intensificando a replicação do HIV, e induzindo a sua própria expressão e a de outras citocinas. Os niveis plasmáticos de TNF-α e IL-1 são substancialmente aumentados durante a progressão da SIDA. Consequentemente ganhando controlo na indução de TNF-α é possível estabelecer uma terapêutica eficaz para a SIDA. A MLc tal e qual ou na forma de sal inibe a síntese de TNF-α e estimula simultaneamente a síntese de IFN-a.

Tendo em atenção as considerações anteriores, administrou-se 20 mg/Kg/dia de cloridrato de MLc (quantidade exprimida como equivalente de lisozima c de clara de ovo de galinha) por via intravenosa lenta a controlos saudáveis, doentes infectados pelo HIV e doentes assintomáticos infectados pelo HIV durante "n" dias consecutivos (n = não inferior a 120 dias). O Quadro 2 mostra os resultados obtidos, confirmando uma redução dos 32 níveis plasmáticos de TNF-α e um aumento do IFN-α após administração de cloridrato de MLc (clara de ovo de galinha): QUADRO 2 Número TNF-a plasmático IFN-a plasmático Controlo 20 10,30 1,60 Doentes infectados pelo HIV sintomático 15 20,09 <1 assintomático 10 9,35 0,98 Doentes sintomáticos 9 11,30 3,57 infectados pelo HIV + cloridrato de MLc (clara de ovo de galinha) EXEMPLO 3 (não é de acordo com a Invenção)

Estudo do efeito de acetato de MLc (ratazana) administrado por via intravenosa em ratinhos DBA/1 com artrite induzida por colagénio. Escolheu-se ratinhos DBA/1 pelas suas muitas semelhanças imunológicas e patológicas com a RA (artrite reumatóide) humana. Injectou-se por via intravenosa acetato de MLc (ratazana) à dose de 20 mg/Kg de peso corporal (quantidade exprimida como equivalentes de lisozima c de ratazana) a ratinhos adultos antes da indução da artrite ou após o aparecimento da doença. O acetato de MLc (ratazana) administrado por via parentérica antes da indução da doença determina uma redução significativa da dor e da gravidade histológica da artrite. Comparando os alvos do estudo com a doença humana análoga, a capacidade do produto seleccionado para reduzir condições clínicas, tumefacção da articulação e gravidade histológica da doença, mesmo quando administrado após o aparecimento dos sinais clínicos de artrite, é de grande significado. Células mononucleares de articulações RA mantidas em cultura produziram muitas citocinas com actividade pró-inflamatória, incluindo TNF-α, medidas por ensaios Elisa. 33 0 acetato de MLc reduz a produção in vitro destas citocinas pró-inflamatórias. Activou-se células mononucleares (106 células por ensaio) com PHA à concentração de 1 μς/ιηΐ desde o primeiro dia até ao 5o. Lavou-se então as células três vezes com PBS e cultivou-se em meio completo (500 μΐ) na presença ou ausência de acetato de MLc (ratazana) . Após dois dias retirou-se o sobrenadante da cultura e testou-se em relação ao seu teor de citocinas. O Quadro 3 confirma a diminuição nos niveis de TNF-α após administração intravenosa nos lotes anteriormente tratados com acetato de MLc (ratazana). QUADRO 3 NÍVEIS DE CITOCINA (pg/ml) Tratamento TNF-a IFN-a iL-la sem MLc(*) 301,60 7,30 2,51 + MLc(*) 0,1 mg/ml 55,79 9,76 3,42 + MLc(*) 1 mg/ml 20, 60 18,07 3,57 EXEMPLO 4 (não é de acordo com a Invenção)

Preparação de 100 000 comprimidos contendo 300 mg de cloridrato de MLc (clara de ovo de galinha).

Cada comprimido contém:

Ingredientes Quantidade (por comprimido)

Cloridrato de MLc 300 mg (clara de ovo de galinha) Estearato de magnésio 25 mg Celulose microcristalina 250 mg Dióxido de silício 15 mg Policarboximetilcelulose de sódio 20 mg Peso total 610 mg 34 0 processo de manufactura é realizado por compressão directa da mistura em pó através dos passos já conhecidos dos especialistas para preparar comprimidos, utilizando salas e equipamentos adequados para este tipo de produção. 1) Coloca-se 30 Kg de cloridrato de MLc (clara de ovo de galinha) e 25 Kg de celulose microcristalina num misturador adequado, depois de passar através de um peneiro de malha 1,2 mm; 2) à mistura em pó anteriormente preparada adiciona-se 2,5 Kg de estearato de magnésio, 1,5 Kg de dióxido de silício e 2,0 Kg de policarboximetilcelulose de sódio no período de tempo mais curto possível para se obter a uniformidade do conteúdo; 3) conserva-se temporariamente a mistura obtida em recipientes adequados e, depois de aprovada por controlo da qualidade do teor de substância activa, transfere-se então para a unidade de compressão, onde se converte o pó em comprimidos por compressão directa, utilizando uma máquina rotativa com um cunho adequado com a medida adequada.

Obtém-se 97 931 comprimidos biconvexos contendo cada um a quantidade desejada de cloridrato de MLc. 97,93 % 100,0 %) 612,50 mg 610.00 mg) 301.60 mg de 300.00 mg de

Rendimento efectivo (97 931 comprimidos): (Rendimento teórico 100 000 comprimidos: Peso médio efectivo: (Peso médio teórico:

Teor médio efectivo para cada comprimido: cloridrato de MLc (Teor teórico para cada comprimido: cloridrato de MLc) EXEMPLO 5 (não é de acordo com a Invenção) 35

Preparação de 1 500 ampolas de 10 ml (15 000 ml) contendo cloridrato de MLc (clara de ovo de galinha) (concentração de 50 mg/ml de cloridrato de MLc) . 1 ml de solução contém 50 mg de cloridrato de MLc.

Ingredientes Quantidade (por ml) Cloridrato de MLc (clara de ovo de galinha) 50,0 mg Cloreto de sódio 8,0 mg Água para preparado injectável q.b. para 1,0 ml O processo de fabrico é realizado através de passos já conhecidos dos especialistas para a preparação de soluções estéreis e apirógenas, utilizando salas e equipamentos adequados para a produção de soluções injectáveis. 1) Num equipamento de dissolução em aço inoxidável introduz-se cerca de 12,0 Kg de água para injecções e adiciona-se, sob agitação constante e lenta, 120,0 g de cloreto de sódio; 2) separadamente em cerca de 4,0 Kg de solução, preparada no ponto anterior, dissolve-se 0,750 Kg de cloridrato de MLc; 3) adiciona-se a solução do ponto (2) à solução do (1) e produz-se um volume total de 15,0 litros através da adição de água para preparados injectáveis; 4) filtra-se então a solução resultante através de filtros de esterilização e introduz-se em salas estéreis adequadas (classe 100) para a sua repartição automática em ampolas de vidro sob atmosfera de azoto, utilizando as técnicas já bem conhecidas para o fabrico industrial de preparados inj ectáveis.

Após os controlos químicos e biológicos (esterilidade e pirógenos) submete-se as ampolas obtidas aos testes automáticos habituais para evidenciar partículas estranhas 36 e aos testes de integridade do vidro para ampolas, e embala-se depois individualmente em caixas de cartão para distribuição e utilização subsequente em medicina humana. Obtém-se 1421 ampolas de 10 ml (concentração de 50 mg/ml de cloridrato de MLc) com um rendimento eficaz de 94,73 % (rendimento teórico 1500).

Lisboa, 31 de Julho de 2007

Claims (11)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Composto de fórmula geral: [CH3O- (CH2-CH2-O)n-CH2-CH2]x- (NH)yLisozima c. (Z)m em que: y é o número de grupos amino livres das moléculas de lisina presentes na molécula de lisozima c e está compreendido entre 5 e 30; x está compreendido entre 1 e y; n está compreendido entre 5 e 1000; Z é um ácido farmaceuticamente aceitável; m está compreendido entre 1 e y, e lisozima c é de um ser humano.
2. 2. Composto de acordo com a reivindicação 1 em que n está compreendido entre 120 e 200.
3. 3. Composto de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes em que o referido ácido farmaceuticamente aceitável é ácido clorídrico.
4. 4. Utilização de um composto da reivindicação 1, para a preparação de uma composição farmacêutica para o tratamento de cancro, artrite reumatóide, SIDA, psoríase e choque séptico.
5. 5. Utilização de acordo com a reivindicação 4, em que a composição farmacêutica é para o tratamento de artrite reumatóide, SIDA, psoríase e choque séptico e para 2 administração por uma via parentérica, preferencialmente uma via intravenosa.
6. 6. Composição farmacêutica contendo, como substância activa, um composto de acordo com as reivindicações desde 1 até 3 opcionalmente em combinação com uma ou mais substâncias activas, formuladas com ingredientes e/ou adjuvantes farmaceuticamente aceitáveis.
7. 7. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 6, para ser administrada por via oral, contendo desde 5% até 80% em peso, preferencialmente desde 40% até 60% do composto.
8. 8. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 6, para ser administrada por via parentérica, contendo desde 0,5% até 10% em peso, preferencialmente desde 2% até 4% do composto.
9. 9. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 6, para ser administrada por via tópica, contendo desde 0. 5. até 10% em peso, preferencialmente desde 1% até 5% do composto.
10. 10. Processo de fabrico para a preparação de um composto de acordo com as reivindicações desde 1 até 3 compreendendo os passos seguintes: 1. faz-se reagir monometoxipolietileno glicol com cloreto de tresilo; 2. faz-se reagir o composto resultante com lisozima c em soro fisiológico tamponado com fosfato ou em tampão de borato num meio ligeiramente básico. 3
11. 11. Processo de fabrico de acordo com a reivindicação 10, em que a produção do sal de adição é obtida por diálise com uma solução aquosa de ácido Z, preferencialmente durante 6-8 horas à temperatura ambiente. Lisboa, 31 de Julho de 2007