ES2292244T3 - Empleo de la lisozima c modificada para preparar composiciones medicinales para tratar ciertas enfermedades graves. - Google Patents
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Abstract
Un compuesto de fórmula general: [CH3O-(CH2-CH2-O)n-CH2-CH2]x-(NH)y lisozima c . (Z)m en la que: y es el número de grupos aminoácido libres de moléculas de lisina presentes en la molécula de lisozima c y está comprendido entre 5 y 30; x está comprendido entre 1 e y; n está comprendido entre 5 y 1000; Z es un ácido farmacéuticamente aceptable; m está comprendido entre 1 e y, y la lisozima c es una lisozima de ser humano.
Description
Empleo de la lisozima c modificada para preparar
composiciones medicinales para tratar ciertas enfermedades
graves.
Esta invención se refiere al uso de compuesto
lisozima c modificado o a sus sales de adición farmacéuticamente
aceptables y a su producción industrial para la preparación de
composiciones medicinales, de forma más particular orales,
parenterales y tópicas, para la profilaxis y terapia de algunas
enfermedades graves en mamíferos.
Se sabe que la lisozima natural es un enzima de
origen peptídico, ampliamente presente en muchas especies del mundo
animal y vegetal, que tiene en las distintas especies una estructura
y un mecanismo enzimático comparable pero no idéntico. La lisozima
más conocida es la que está presente en el huevo de gallina
(lisozima c de clara de huevo de gallina). La lisozima está
ampliamente distribuida en el cuerpo de mamíferos; está presente por
ejemplo en saliva, en lágrimas, en leche, en leucocitos, en mucus
de cuello uterino. En 1922 Alexander Fleming descubrió una
sustancia presente en su propio mucus nasal capaz de lisar algunas
cepas bacterianas. Esta sustancia se identificó más tarde como
lisozima (hoy identificada mejor como lisozima c humana). En 1963
Jolles y Canfield aclararon independientemente la estructura
primaria de la lisozima purificada de clara de huevo de gallina. En
1965 Phillips describe la estructura tridimensional de la lisozima
basándose en cristalografía de rayos X. A partir de este
descubrimiento se ha usado a veces lisozima natural (de forma más
concreta la lisozima c de clara de huevo de gallina), en medicina
principalmente por sus propiedades anti-bacterianas,
pero el análisis retrospectivo de los estudios publicados aún no
han aclarado completamente hoy en día su mecanismo específico de
acción y en algunos casos los resultados experimentales parecen ser
incluso contradictorios (1,2,3).
En la actualidad los científicos creen que la
acción biológica de la lisozima c natural debería dividirse en dos
líneas distintas: una acción directa y una acción indirecta. La
acción directa está determinada por la degradación de la unión
(\beta, 1 \rightarrow 4) entre el ácido
N-acetilmurámico y la
N-acetilglucosamina (4) de peptidoglicanos
presentes en la membrana celular de la bacteria, determinando así la
lisis de la misma (como consecuencia de esta acción se denomina
frecuentemente "muramidasa"). Por lo general las bacterias Gram
positivas son más sensibles a la acción de la lisozima natural que
las Gram negativas, probablemente debido a que estas últimas
presentan la membrana externa como barrera adicional. Esta acción
directa de la lisozima es potencialmente importante por su posible
uso terapéutico en la profilaxis y tratamiento de muchas
enfermedades bacterianas, al igual que faringitis, conjuntivitis,
otitis, sinusitis, adenitis, uretritis, vaginitis, cistitis,
sustancialmente provocados por microorganismos de la familia de
estreptococos. Por el contrario, los fragmentos mucopeptídicos
degradados de la membrana celular, producidos por la acción directa
de la lisozima en la bacteria, parece ser capaz de educir un
proceso no bien definido de estimulación inmunológica (acción
indirecta de la lisozima).
Algunos autores han descrito también
recientemente la capacidad de la lisozima de clara de huevo de
gallina y de sus derivados para estimular la producción de
linfocitos T presentes en el tejido linfático, asociado con el
intestino (GALT), y en bazo (eje GALT-bazo).
Sin embargo en la bibliografía algunos autores
han descrito también el uso de otros péptidos líticos específicos
para el tratamiento de muchas enfermedades. En algunas patentes
recientes se ha sugerido la combinación específica de la
administración de cecropinas y lisozima con el fin de aumentar la
acción de los dos compuestos. De hecho algunos autores sugieren que
las cecropinas son mucho más activas en la lisis de la célula,
mientras que la lisozima es más activa en su degradación
completa.
Los nuevos agentes quimioterapéuticos, como
cecropinas, sarcotoxinas, magaininas, lepidopteranos, que presentan
las mismas propiedades físicas con una estructura
\alpha-hélice y carácter hidrófobo, son proteínas
capaces de lisar no sólo la membrana celular de bacterias
(Listeria monocitogenes y Brucella abortus), sino
también la membrana celular de protozoos (P. falciparum) y
virus (Parainfluenza y Herpes Simplex), y de células eucarióticas
infectadas con bacterias. Con uso de un microscopio electrónico se
ha descubierto que los péptidos líticos producen poros de gran
tamaño en membranas de células, determinando su muerte. Por el
contrario, las células de mamíferos sanos no son destruidas por los
anteriores péptidos líticos, debido probablemente a la presencia de
citoesqueleto, que está en contacto con distintos puntos de la
membrana plasmática y en consecuencia permite mantener la integridad
osmótica de la célula.
Además, también a bajas concentraciones los
péptidos líticos se deben usar como modificadores de respuesta
biológica, con el fin de estimular la proliferación celular del
sistema inmunológico y de la piel. La anterior acción es provocada
probablemente por la producción de poros en la membrana plasmática,
determinando un flujo de iones y de material nutritivo a las
células, que estimula el crecimiento de la célula.
ANTICANCER RESEARCH 16,
2559-2564 (1996); Pacor y col
describen los efectos de lisozima (lisozima de clara de huevo de
ave) y su derivado mPEG-Lyso modificado (página
2559, columna 1, líneas 1 a 2).
El compuesto usado por Pacor y col. se preparó
"por enlace covalente de monometoxipolietielenglicol a los
residuos NH_{2} de lisinas del lisozima. Brevemente,
M-PEG se activó como describió Carnielli"
(véase página 2560, columna 1, líneas 1 a 3).
\newpage
Además Pacor y col. describe los siguientes
resultados (página 2560, columna 2, párrafo "Resultados",
líneas 1 a 5''):
"mPEG-Lyso no modificó el
crecimiento del tumor primario pero provocó una reducción
estadísticamente significativa en la formación de metástasis de
pulmón espontánea"
IMMUNOLOGY LETTERS 49
(1996) 91-97; Takanori y
col., evaluaron el efecto de "modificación de mPEG en
cuanto a la capacidad de lisozima de clara de huevo de ave (HEL)
para estimular las células T" (página 91, párrafo
"Resumen", línea 2).
La m-PEG-HEL
usada por Takanori y col. "se preparó como describió
Jackson" (párrafo 2.3, línea 1).
El procedimiento de pegilación llevado a cabo en
la molécula HEL provoca que "se encontrase que más de seis de
siete grupos amino de una molécula HEL estén acoplados con
mPEG" (párrafo 2.3, líneas 12 a 14).
Los resultados biológicos obtenidos por Takanori
se resumen en la última página, columna 1, líneas 16 a 23:
"los resultados de la figura 5B, que muestran que
mPEG-HEL no indujo respuesta de célula T
anti-HEL en ratones H-2k,
demuestran que las moléculas mPEG introducidas en regiones que
flanquean un epítope de célula T podrían inhibir que se presente el
epítope. Esto sugiere que la modificación de mPEG es potente en
cuanto a la reducción de las capacidades de estimulación de
proteínas de célula T...".
Sin embargo, aunque muchas publicaciones prueban
la acción positiva de la lisozima natural (principalmente lisozima c
de clara de huevo de gallina) en el tratamiento de infecciones de
origen diverso, el uso potencial de la lisozima de grupo c en ámbito
clínico ha estado muy limitado hasta la actualidad debido a tres
factores princi-
pales:
pales:
a) la lisozima c humana (que es el tipo presente
en humanos) es extremadamente difícil de obtener en cantidades
suficientemente grandes para aplicaciones terapéuticas;
b) otros tipos de lisozima c, que se pueden
obtener de otras especies, tal como bovinos y clara de huevo de
gallina, pueden presentar algunos efectos secundarios negativos (el
primero de ellos es posiblemente reacciones alérgicas y el segundo
es el riesgo potencial de contaminación de encefalopatías bovinas
transmisibles o TBE), que limitan de forma considerable su uso en
medicina;
c) tipos de lisozima, distintos de c, que se
originan de otras especies animales no son adecuados para fines
medicinales debido a que presentan una homología muy baja con la
lisozima c humana.
Se reseña una tabla en la que se indica la
homología entre la lisozima humana y lisozimas de otros mamíferos,
todas ellas no obstante del tipo c natural:
Si bien la lisozima c bovina muestra una
homología mayor que la de clara de huevo de gallina, esta última es
la más usada en la práctica clínica debido a que está habitualmente
disponible en cantidades adecuadas a precios convenientes. Según la
anterior introducción, hay un interés considerable para explorar
adicionalmente nuevas posibilidades de uso de la lisozima c
natural, de sus posibles derivados y para producir preparaciones
medicinales, que permite ampliar su uso para algunas enfermedades
graves en humanos y/o usar nuevas vías de administración y no
exploradas con anterioridad.
A pesar de los muchos estudios experimentales en
animales y publicaciones recientes sobre lisozima c, las
aplicaciones medicinales de este compuesto cuando se administra por
vía oral se mantuvieron limitadas a patologías tradicionales, ya
bien conocidas por los expertos.
Sin embargo, estos estudios parecen haber
alcanzado resultados muy limitados y a veces contrastantes.
\newpage
Por lo tanto, el fin principal de la presente
invención es proporcionar composiciones medicinales que contienen un
compuesto de lisozima c natural modificado, de forma más particular
un compuesto de monometoxipolietilenglicol lisozima c (en lo
sucesivo definido como "MLc" a efectos prácticos de la
descripción) o sus sales de adición de ácidos farmacéuticamente
aceptables, que presenta la siguiente fórmula general (I):
[CH_{3}O-(CH_{2}-CH_{2}-O)_{n}-CH_{2}-CH_{2}]_{x}-(NH)_{y}
lisozima c .
(Z)_{m}
en la
que:
y = número de grupos amino libres de moléculas
de lisina presentes en la molécula de lisozima c, comprendido entre
5 y 30;
x = número de moléculas de
monometoxipolietilenglicol por cada molécula de lisozima c, donde el
valor puede variar de 1 a y;
n = número de grado de polimerización de la
porción de polietilenglicol, comprendido entre 5 y 1000;
Lisozima c = lisozima c de origen humano;
Z = ácido farmacéuticamente aceptable orgánico o
inorgánico, monovalente o polivalente, capaz de dar lugar a sales de
adición de la lisozima c considerada;
m = número de moléculas de ácido
farmacéuticamente aceptable usado para la obtención de sal de
adición de MLc, que puede variar de 1 al valor correspondiente al
número total de grupos amino presentes en la molécula de lisozima
c.
Este compuesto es sorprendentemente y
particularmente útil y efectivo para el tratamiento específico de
algunas enfermedades graves en mamíferos.
De forma más particular en el compuesto de
lisozima c modificado, usado como ingrediente activo para la
preparación de composiciones medicinales útiles para el tratamiento
de algunas enfermedades graves en mamíferos, el número de radicales
de monometoxipolietilenglicol (x) puede variar de 1 a "y", el
grado de polimerización (n) de la porción de polietilenglicol del
monometoxipolietilenglicol debe estar comprendida entre 5 (peso
molecular aproximadamente 161) y 1.000 (peso molecular
aproximadamente 32.206), más preferiblemente entre 120 (peso
molecular 3.865) y 200 (peso molecular 6.441), mientras que el
número de moléculas del aminoácido lisina (y), que tiene un radical
-NH- unido con monometoxipolietilenglicol, en lisozima c humana
puede variar de 5 o incluso más, hasta un máximo de 30.
Z significa cualquier ácido orgánico o
inorgánico farmacéuticamente aceptable, mono o polivalente,
farmacéuticamente aceptable, que puede estar combinado de forma
diferente, siendo "m" el número de moléculas del ácido
farmacéuticamente aceptable que puede requerirse para dar la sal de
adición de MLc y que puede variar de 0 al valor correspondiente del
número total de grupos amino presentes en la molécula de la lisozima
c considerada, valor que se deberá dividir por la valencia del mismo
ácido (Z).
Recientemente algunos autores han publicado que
en general las proteínas pueden producir, mediante reacciones
químicas bastante simples ya conocidas por los expertos en la
materia derivados de condensación con polietilenglicoles.
En el presente estado de la técnica se
desconocen derivados pegilados de otras lisozimas del grupo c, y por
tanto se deberán considerar no descritas y nuevas, así como también
su uso terapéutico.
Se ha observado también que estos derivados
pegilados presentan por lo general una inmunoreactividad reducida y
una mejor estabilidad frente al calentamiento y degradación durante
su almacenamiento. Algunos autores han formulado también la
hipótesis que estos derivados pegilados podrían mostrar, tras su
absorción, también una mejor resistencia a agentes proteolíticos y
por tanto una mejor vida media en plasma.
Estos derivados pegilados se pueden obtener
también mediante un procedimiento de síntesis, que determina un
enlace covalente de la lisozima c natural seleccionada con los
radicales monometoxipolietileno seleccionados, después de exponer a
temperatura ambiente durante aproximadamente 2 horas la lisozima c a
monometoxipolietilenglicol tresilado en PBS (solución salina
tamponada con fosfato) o en un tampón borato a diferente pH (casi
siempre en medio ligeramente básico) y en diferentes proporciones.
El reactivo de glicol tresilado se puede obtener habitualmente a
partir de monometoxipolietilenglicol activado con cloruro de
tresilo. El monometoxipolietilenglicol se selecciona para
proporcionar sólo un extremo reactivo en cada molécula, evitando así
productos reticulados no deseados, pero dando sólo el compuesto
seleccionado de MLc deseado. La purificación de MLc se lleva a cabo
usando columnas de Shepadex G-50 (12 cm x 1,3 cm)
estabilizadas con PBS, o mediante ultracentrifugación con membranas
Amicon de porosidad deseada. En caso que se desee obtener las sales
de adición de MLc, por ejemplo clorhidrato de MLc, es necesario
llevar a cabo una diálisis con una solución acuosa de HCl diluido
(10 a 100 mM) durante toda la noche a 4ºC o más preferiblemente
durante 6 a 8 horas a temperatura ambiente, llevando a cabo luego
la purificación mediante columna de Sephadex G-50.
La sal resultante se deberá liofilizar luego y conservar a
temperaturas por debajo de 0ºC hasta que se vaya a usar.
Se indica a continuación un posible esquema de
síntesis general de sales de adición de MLc, para un mejor
entendimiento de su procedimiento de síntesis (NOTA: se muestran los
grupos amino de la lisozima c para un mejor entendimiento):
- A =
- monometoxipolietienglicol (MPEG) con sólo un grupo reactivo final
- B =
- cloruro de tresilo (cloruro de 2,2,2-trifluoroetano-sulfonilo);
- C =
- monometoxipolietilenglicol (TMPEG) trefilada;
- D =
- lisozima c;
- E =
- lisozima c modificada (MLc);
- F =
- ácido farmacéuticamente aceptable;
- G =
- sal de adición de MLc.
\vskip1.000000\baselineskip
Las concentraciones de proteínas se miden luego
directamente mediante determinación de la absorbancia a 280 nm y
mediante valoración con "azul brillante de Coomassie". Para la
reacción colorimétrica se toman alícuotas de 100 \mul de la
muestra de proteína en placas de microvaloración y se añaden 200
\mul de reactivo para "ensayo de proteína de Coomassie". Se
mide la absorbancia a 555 nm por medio de un lector de
microvaloración después de 5 minutos de incubación a temperatura
ambiente. Usando los dos procedimientos descritos, la concentración
de las muestras se establece por medio de una curva de calibración
obtenida de una solución madre de lisozima c a una concentración
conocida.
El MLc obtenido se ensaya luego con
determinación del ensayo usando tres procedimientos diferentes: 1)
electroforesis en gel de poliacrilamida con SDS; 2) cromatografía de
filtración molecular; 3) actividad enzimática de acuerdo con el
procedimiento convencional.
Se usa un gel de poliacrilamida al 15%. Se lleva
a cabo el experimento normalmente entre 100 y 150 v, durante
aproximadamente 45 minutos.
\vskip1.000000\baselineskip
Disolver 29,2 g de acrilamida y 0,8 g de
bisacrilamida en 70 ml de agua desionizada. Una vez disuelta la
acrilamida, añadir agua hasta dar un volumen de 100 ml. Filtrar la
solución a través de una membrana de tamaño de poro de 0,45 \mum.
La solución obtenida es estable a 4ºC durante 1 mes cuando se
conserva en una botella oscura.
\vskip1.000000\baselineskip
Disolver 18,2 g de base Tris en aproximadamente
80 ml de agua destilada. Ajustar el pH hasta 8,80 con HCl y llegar
al volumen de 100 ml añadiendo agua destilada. Conservar el tampón A
obtenido a 4ºC.
Disolver 6,1 g de base Tris en 80 ml de agua
destilada. Ajustar el pH hasta 6,80 con HCl y llegar al volumen de
100 ml añadiendo agua destilada. Conservar el tampón B obtenido a
4ºC.
\vskip1.000000\baselineskip
Disolver 10 g de SDS en 60 ml de agua. Llevar
hasta volumen de 100 ml con agua destilada.
\vskip1.000000\baselineskip
Conservar la solución anterior a temperatura
ambiente. El tampón de reducción de SDS se prepara añadiendo 50
\mul de 2-mercaptoetanol a cada 0,95 ml de
solución tampón de la muestra. Preparar esta solución en el momento
de su uso.
\vskip1.000000\baselineskip
Disolver 100 mg de persulfato de amonio en 1 ml
de agua destilada. Preparar esta solución en el momento de su
uso.
\vskip1.000000\baselineskip
Usar directamente el presente producto de la
botella. Conservar en un lugar no húmedo, proteger de la luz.
\vskip1.000000\baselineskip
Disolver 0,3 g de base Tris, 1,4 g de glicerol,
1 ml de SDS al 10% en 100 ml de agua destilada. Conservar este
tampón para elución a 4ºC.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Diluir la muestra con 4 volúmenes de tampón SDS
de reducción y calentar hasta 95ºC durante 4 minutos (cada banda
del gel no contendrá menos de 1 \mug de proteína). La migración
electroforética se lleva a cabo usando un equipo MiniProtean II
(BioRad, California), a temperatura ambiente. El voltaje aplicado es
de 100 a 150 v durante aproximadamente 45 minutos.
\vskip1.000000\baselineskip
Disolver 0,2 g de azul brillante de Coomassie
R-250 en 1 litro de una solución que contiene 50%
(v/v) de metanol, 10% (v/v) de ácido acético y 40% (v/v) de agua
destilada. Filtrar la solución usando un papel filtrante y
conservar la solución en una botella ámbar. Antes de usar la
solución obtenida es necesario comprobar siempre si se encuentra
presente un precipitado coloreado. En caso afirmativo filtrar de
nuevo.
Colocar el gel durante 10 minutos en una
solución que contiene 50% (v/v) de metanol, 10% (v/v) de ácido
acético y 40% (v/v) de agua destilada con el fin de eliminar la
presencia de SDS.
Mantener el gel en la solución coloreada con
agitación constante y lenta durante 30 minutos a 50ºC o
alternativamente durante dos horas a temperatura ambiente.
Conservar el gel en un medio líquido constituido
por una solución de ácido acético al 10% (v/v). De forma alternativa
secar el gel usando una solución de glicerol y una película de
celofán y proceder de la siguiente forma:
a) colocar el gel durante 10 a 15 minutos en una
solución de glicerol al 10% (v/v); b) humedecer la película de
celofán en la misma solución; c) colocar el gel entre dos películas
de celofán humedecidas sin introducir burbujas de aire; d) colocar
el gel en un estante y dejarlo a temperatura ambiente.
\vskip1.000000\baselineskip
Se determina la composición de la muestra
mediante densitometría a 595 nm sobre el gel, usando un equipo
adecuado como, por ejemplo, escáner UV/VIS CS 930 de Shimadzu.
\vskip1.000000\baselineskip
La muestra contendrá una única traza, tras
coloración con azul brillante de Coomassie
R-250.
El contenido en MLc no deberá ser inferior al
95%.
\vskip1.000000\baselineskip
Se somete la muestra a cromatografía usando una
columna Superose 121HR 10/30 y un equipo para FPLC (cromatografía
líquida para separación rápida de proteínas) equilibrada con PBS. Se
diluye la muestra con PBS antes de cargarla a la columna. Inyectar
200 \mul de la muestra y eluir con PBS a una velocidad de flujo de
0,3 ml/min. Recoger fracciones de 0,25 ml. Se determina el perfil
de elución mediante espectrofotometría a 280 nm. Se determina de
forma cuantitativa la concentración proteica usando azul brillante
de Coomassie.
Usar marcadores con peso molecular conocido a
una concentración de 3 mg/ml como, por ejemplo,
\beta-amilasa (200 KDa), alcohol deshidrogenasa
(150 KDa), albúmina de suero bovino (66 KDa), anhidrasa carbónica
(29 KDa), citocromo C (12,4 KDa), aprotinina (6,5 KDa). El MLc
eluye a aproximadamente 17,35 ml en las condiciones indicadas.
\vskip1.000000\baselineskip
El contenido en MLc no deberá ser inferior al
95%.
\vskip1.000000\baselineskip
Este procedimiento se lleva a cabo de acuerdo
con los procedimientos convencionales ya descritos en la
bibliografía (5, 6, 7).
\vskip1.000000\baselineskip
- A)
- Suspensión de Micrococcus luteus (Micrococcus lysodeikticus) a una concentración de 0,3 mg/ml en tampón fosfato 0,2 M (pH = 7,00) y NaCl 17 mM.
- B)
- Solución de MLc (1 mg/ml) en agua destilada.
- C)
- Espectrofotómetro adecuado para determinar las variaciones de absorbancia a 450 nm.
\vskip1.000000\baselineskip
Colocar 2,9 ml de una suspensión de
Micrococcus luteus (Micrococcus lysodeikticus) en una
cubeta espectrofotométrica. Dejar la suspensión durante 4 a 5
minutos a 25ºC, con el fin de permitir que la suspensión alcance la
temperatura de reacción. Añadir 0,1 ml de solución enzimática y
registrar la variación de absorbancia cada minuto a 450 nm.
\vskip1.000000\baselineskip
Unidades/mg =
\frac{(\Delta A_{450 \ nm})/min \ x \ 10^{3}}{\text{mg de enzima en
la mezcla de
reacción}}
Unidad enzimática se define como la cantidad de
enzima que en las condiciones de ensayo (pH = 7,00 a 25ºC) reduce en
0,001 cada minuto la absorbancia de la suspensión de Micrococcus
luteus. Con lo anterior se demuestra que el MLc también mantiene
la actividad enzimática principal, ya conocida en lisozima c
natural.
En otra realización de la presente invención los
autores han observado de forma sorprendente que la vía de
administración de MLc o sus sales farmacéuticamente aceptables es
fundamental y determinante para educir efectos terapéuticos
desconocidos y reseñables en algunas enfermedades graves en
mamíferos.
De hecho los autores han descubierto de forma
sorprendente que la administración por vía oral de MLc puede
inducir altos niveles en plasma de TNF-\alpha
libre (factor de necrosis tumoral alfa), biológicamente disponible,
inhibiendo así mediante un mecanismo prácticamente directo y de
forma significativa la velocidad de replicación del proceso
proliferativo tumoral en mamíferos (8, 9, 10).
De hecho, una realización particularmente
preferida de la presente invención es el uso de MLc para la
preparación de composiciones medicinales que se van a administrar
por vía oral o, que por otro lado, la administración por vía oral
de MLc es adecuada para inducir un aumento significativo en plasma
de TNF-\alpha libre, resultando esta última
sustancia, cuando es encuentra biológicamente disponible,
particularmente útil por su efecto protector y para el tratamiento
específico de procesos tumorales en general, especialmente cuando se
encuentra todo en la fase inicial.
De hecho se sabe de las publicaciones más
recientes que el TNF-\alpha es un factor
específico, como indica su propio nombre, capaz de inducir la
inhibición, también la necrosis, del proceso tumoral de las células
también cuando crecen in vitro.
Los procesos tumorales van acompañados
paradójicamente de altos niveles hemáticos de
TNF-\alpha, que está unido a formas solubles de
receptores y por tanto no está libre ni biológicamente disponible.
Por el contrario es muy importante inducir altos niveles de
TNF-\alpha (11, 12, 13). El mecanismo por el que
MLc sólo es capaz por administración por vía oral de inducir de
forma reseñable el aumento de los niveles plasmáticos de
TNF-\alpha libre aún se desconoce, siendo aún
objeto de investigación por los autores, pero este puede estar
relacionado hipotéticamente in vivo con una posible
estimulación activa del proceso de biosíntesis de
TNF-\alpha. El mecanismo se puede explicar de modo
que la transcripción génica de TNF y la traducción de ARNm son
ambos fuertemente estimulados por peptidoglicanos, que son la
expresión más directa y significativa de la actividad enzimática y
lítica de MLc, administrados por vía oral, sobre paredes celulares
de bacterias, normalmente componentes de la flora intestinal (14),
demostrando así por comparación que MLc ha mantenido su actividad
enzimática similar a la correspondiente a la lisozima c natural, lo
que se encuentra en clara contradicción con la publicación de otros
autores. En lo relativo al mecanismo es necesario considerar que un
reciente estudio ha indicado que los homólogos de quinasa MAP se han
llegado a fosforilar en células estimuladas con peptidoglicanos,
sugiriendo así su posible implicación en transducción de
señales.
La mayor parte de las acciones biológicas
pleiotrópicas de TNF se pueden atribuir a su capacidad para activar
una variedad de genes en una multitud de células diana. El
TNF-\alpha y la citocina IL-1
funcionalmente relacionada son las únicas sustancias naturales
conocidas por tener un espectro tan grande de genes diana. La lista
parcial de proteínas inducidas por TNF incluye: cadena de receptor
\alpha de IL-1\alpha e
IL-1\beta, IL-6,
IL-8, IFN-\beta,
IL-2 y muchos otros.
De forma sorprendente los autores han observado
también en la presente invención que la administración por vía oral
de MLc disminuye también los niveles en plasma de ácido siálico
(total), que es un "marcador inespecífico", que aumenta
patológicamente en algunos procesos degenerativos graves, incluyendo
diferentes tipos de tumores. El anterior hallazgo fundamenta además
que la estimulación de TNF-\alpha libre, obtenido
a partir de administración por vía oral de MLc, determina, como se
reivindica, los efectos de inhibición terapéuticos de procesos
neoproliferativos, que son expresión de células tumorales en
animales. Por tanto, se puede concluir que el primer objetivo de la
presente invención es el uso de MLc o sus sales farmacéuticamente
aceptables para la preparación de composiciones medicinales que se
van a administrar únicamente por vía oral con el fin de obtener un
aumento reseñable de nivel en plasma de
TNF-\alpha libre, por tanto biológicamente
disponible, y en consecuencia particularmente útil en la profilaxis
y tratamiento de procesos tumorales en mamíferos, para los que un
aumento de TNF-\alpha libre en plasma (no
bloqueado por formas solubles de receptores) es capaz de producir
beneficios y efectos terapéuticos.
Otra realización preferida e importante de la
presente invención es el uso de MLc o de sus sales farmacéuticamente
aceptables para la preparación de composiciones medicinales
particularmente útiles para el tratamiento de artritis reumatoide,
síndrome de inmunodeficiencia adquirida, más comúnmente conocida con
el terminología anglosajona "AIDS" (SIDA), psoriasis y choque
séptico, donde la vía de administración más preferida, para educir
los efectos farmacológicos y terapéuticos deseados, es la vía
parenteral, de forma más precisa la vía intravenosa. De hecho se ha
fundamentado experimentalmente que, cuando se administra MLc por vía
parenteral, más preferiblemente por vía intravenosa, se inhibe
fuertemente los niveles en plasma de TNF-\alpha,
induciendo así de forma sorprendente una respuesta farmacológica,
que es justamente opuesta a la conseguida cuando se administra MLc
por vía oral.
El objetivo principal de la respuesta
inflamatoria crónica en artritis reumatoide (AR) es el líquido
sinovial. Incluso a pesar de que se desconoce qué provoca esta
enfermedad discapacitante, la caracterización de las células
inflamatorias infiltradas y de sus productos es de gran importancia
para entender su patogénesis.
Hay importantes evidencias de la implicación del
TNF-\alpha en la patogénesis de AR. Esta evidencia
se basa no sólo en la presencia generalizada de
TNF-\alpha en articulaciones artríticas,
acompañado de una respuesta mayor de receptores de
TNF-\alpha, sino también en los efectos de una
neutralización de TNF-\alpha en cultivos de
células de articulación.
Por tanto la neutralización in vitro de
TNF-\alpha educe la inhibición de la producción de
interleucina 1, como TNF-\alpha, que se cree que
es la causa que determina la inflamación y la erosión de la
articulación.
En la enfermedad de SIDA, el
TNF-\alpha es un activador potente de la
replicación del virus VIH en las células infectadas. En pacientes
sintomáticos los niveles de TNF-\alpha son mayores
que en pacientes asintomáticos. Probablemente el
TNF-\alpha determina una activación
transcripcional del provirus VIH integrado en el genoma de la
célula huésped, aumentando los niveles de ARN viral. Además el
TNF-\alpha contribuye a la replicación viral, lo
que en cambio aumenta la destrucción de linfocitos CD_{4}^{-} y
reduce las funciones inmunológicas del cuerpo (15).
Como consecuencia, en las patologías como AR
pero especialmente SIDA, en las que los niveles de
TNF-\alpha son altos, la administración de MLc
por vía oral no es adecuada, sino absolutamente contraproducente y
contraindicada debido a que provoca una exacerbación de la
enfermedad, aumentando los niveles de TNF-\alpha
que ya son muy elevados. Por el contrario la presente invención ha
demostrado de forma sorprendente que la administración por vía
parenteral de MLc o de sus sales farmacéuticamente aceptables, de
forma más particular por vía intravenosa en SIDA e
intra-articular en AR, induce una reducción
terapéutica reseñable y favorable de los niveles de
TNF-\alpha en fluidos (plasma en SIDA y líquido
sinovial en AR). Este efecto terapéutico importante, objeto de la
presente invención, fundamenta la hipótesis de que la reducción de
TNF-\alpha se puede atribuir a la acción
inhibitoria reflejada (efecto "rebote") en órganos celulares o
en el mecanismo en el origen de estas patologías.
Además se observaron una reducción
experimentalmente significativa de TNF-\alpha en
plasma y en fluido cerebroespinal (CSF) en estudios no controlados
en humanos, y por tanto las indicaciones terapéuticas de las
preparaciones para vía parenteral medicinales de MLc o sus sales
farmacológicamente aceptables, se encuentran también particularmente
extendidas a disfunción del sistema nervioso central grave inversa
("complejo de demencia en SIDA" y otros trastornos motores y
cognitivos graves correlacionados).
Otra realización particularmente preferida de la
presente invención es el uso de MLc o de sus sales
farmacológicamente aceptables para la preparación de un medicamento
para vía tópica, capaz de educir una actividad antihistamínica
reseñable, cuando MLc o sus sales farmacéuticamente aceptables se
aplican localmente. Estas preparaciones medicinales para vía tópica
de MLc o sus sales farmacológicamente aceptables han demostrado en
estudios no controlados experimentales que evitan el aumento del
flujo sanguíneo, la permeabilidad vascular, edema, dolor e
irritación provocados por la acción de histamina.
Otra realización particular de la presente
invención es que las preparaciones medicinales para vía tópica de
MLc o de sus sales farmacológicamente aceptables resultan
particularmente activas para determinar también por vía
transdérmica la reducción de niveles de
TNF-\alpha, resultando los anteriores productos
medicinales particularmente indicados para el tratamiento de
artritis reactiva, artritis reumatoide, artritis psoriática y por
lo general en aquellas afecciones cutáneas o subcutáneas en las que
se requiere terapéuticamente una reducción de niveles de
TNF-\alpha.
Otra realización preferida de la presente
invención es que las preparaciones para vía tópica de MLc o sus
sales farmacológicamente aceptables son particularmente activas en
el tratamiento por vía tópica de acné y en la prevención de dientes
cariados.
Otra realización preferida de la invención es el
uso de MLc o sus sales farmacéuticamente aceptables para la
preparación de productos medicinales, en los que estos pueden estar
asociados, en diferentes cantidades y proporciones, con otras
sustancias con acción antibacteriana, de origen químico y
antibiótico, tal como penicilinas semi-sintéticas o
sintéticas, cefalosporinas, macrolidas, etritromicinas, derivados
quinolónicos, por citar sólo algunos de los más importantes. Estas
asociaciones, formuladas de forma conveniente en preparaciones
galénicas adecuadas conocidas por el experto en la materia, son
particularmente útiles para superar infecciones o patologías
provocadas por bacterias, macrovirus, virus o priones, que son
particularmente sensibles al efecto terapéutico sinérgico de estas
asociaciones de MLc o sus derivados.
Otra realización preferida de la presente
invención es que en estudios no controlados, en los que por razones
éticas sólo se ha admitido un número limitado de voluntarios sanos
para cada indicación, las preparaciones medicinales de MLc o sus
sales farmacológicamente aceptables mostraron efectos terapéuticos
sorprendentes, que no se pueden explicar con el conocimiento
biológico actual, pero que serán objeto de más investigación, en
otras patologías graves, tal como anorexia, esclerosis múltiple,
esclerosis lateral amiotrófica, enfermedad de Alzheimer, Parkinson,
encefalopatía espongiforme bovina (EEB), encefalopatía transmisible
bovina (ETB), enfermedades de Creuzfeld-Jacob,
infarto de miocardio, ictus, todas las patologías en las que en la
actualidad se puede suponer sólo una posible implicación de
bacterias, agentes virales y/o agentes proteicos infecciosos
(priones) en sus etiopatogénesis.
La presente invención también proporciona una
composición farmacéutica adecuada que contiene MLc o sus sales
farmacológicamente aceptables, sola o asociada con uno o más
ingredientes activos del mismo grupo o con cualquier otra sustancia
medicinal diferente o con una mezcla de las mismas, preparada usando
vehículos o diluyentes farmacéuticamente aceptables inertes, o una
mezcla de los mismos, en estado sólido, líquido o gaseoso, a
temperatura ambiente.
La composición farmacéutica de la invención que
contiene MLc o sus sales farmacéuticamente puede ser cualquier
preparación adecuada para vía oral, tal como comprimidos, con
liberación inmediata o sostenida, cápsulas, granulado, polvo,
jarabe, suspensión o emulsión, gotas, y también adecuada para
administración por vía parenteral, como soluciones acuosas
estériles, polvo acondicionado o liofilizado estéril para
preparación extemporánea de soluciones o dispersiones inyectables
estériles y finalmente también en la forma de preparaciones para
vía tópica, tal como crema, ungüento, loción, gel y gasa medicinal,
y emplaste para vía transdérmica. La composición farmacéutica de la
invención que contiene MLc o sus sales farmacéuticamente aceptables
puede estar comprendida también por sistemas para aplicación por
ruta endonasal, pulverización a presión o inhalador, y supositorios
para vía rectal y vaginal, pasta dentífrica, todos ellas preparados
de acuerdo con técnicas generales bien conocidas por los expertos en
la
materia.
materia.
En las composiciones medicinales de la
invención, para administrar por vía oral, MLc o sus sales
farmacéuticamente aceptables se mezclan solas o con otros
ingredientes activos, en cantidades y proporciones adecuadas, en un
vehículo conveniente farmacéuticamente aceptable, sólido o líquido o
una mezcla de los mismos de modo que se obtengan formas
farmacéuticas adecuadas que contienen las dosis deseadas. La unidad
de dosis para vía oral contiene preferiblemente de 5% a 80% del
ingrediente activo, más preferiblemente entre 40% y 60%.
Algunos vehículos sólidos inertes adecuados
convencionales son, por ejemplo, lactosa, almidón, talco, celulosa
microcristalina, fosfato de calcio, estearato de magnesio, dextrinas
y/o otros excipientes, aglutinantes, disgregantes, diluyentes,
lubricantes, edulcorantes y agentes aromatizantes, ya conocidos en
la técnica, con o sin el uso de agua o de otro disolvente auxiliar
adecuado.
Se pueden preparar soluciones acuosas
convencionales adecuadas para uso por vía oral de MLc o sus sales
farmacológicamente aceptables mediante disolución del ingrediente
activo en agua o en cualquier disolvente líquido adecuado a
temperatura ambiente y adición de cantidades diferentes y
proporciones de colorantes, edulcorantes, aromas, estabilizantes,
tensioactivos y agentes espesantes adecuados, según se desee.
Se pueden preparar suspensiones acuosas
adecuadas para uso por vía oral mediante dispersión del MLc
finamente pulverizado o sus sales farmacéuticamente aceptables en
agua o en cualquier otro vehículo farmacéuticamente adecuado con
agentes de suspensión, como gomas naturales o sintéticas, resinas,
metilcelulosa, carboximetilcelulosa sódica y otros bien conocidos en
la técnica.
Se pueden formular las preparaciones para vía
parenteral de la invención, que contienen MLc o sus sales
farmacéuticamente aceptables, de acuerdo con la técnica conocida,
usando disolventes o diluyentes parenteralmente aceptables,
adecuados, de forma más particular agua con otros excipientes
auxiliares tal como cloruro de sodio, azúcares, tampones, etanol,
polioles (glicerol, propilenglicol), agentes conservantes y agentes
que retardan la absorción.
El uso de estos agentes para composiciones
farmacéuticamente aceptables adecuadas de MLc o sus sales
farmacológicamente aceptables ya es bien conocido en la técnica. De
hecho, en las composiciones medicinales de la invención se puede
incluir cualquier excipiente convencional o una mezcla del mismo,
excepto cualquier medio convencional o agente incompatible con el
ingrediente activo.
Es especialmente conveniente formular las
composiciones para vía parenteral de la invención en forma de dosis
unitaria para simplificar sus administración y para conseguir la
uniformidad de la dosificación, tal como ampollas o viales que se
producen de acuerdo con las técnicas ya conocidas por los expertos
en la materia, en condiciones estériles y asépticas y envasados en
atmósfera de un gas inerte (nitrógeno) para evitar posibles procesos
de degradación.
La concentración de ingrediente activo, como
solución o como polvo que se va a reconstituir, puede variar de
0,5% a 10%, preferiblemente de 2% a 4%. Las preparaciones de la
invención para uso tópico o local, se producen con técnicas
convencionales ya conocidas por los expertos en la materia,
adecuadas para la preparación de estas formas farmacéuticas que se
van a aplicar localmente a la piel en dosificaciones
terapéuticamente efectivas.
Cuando se usan preparaciones medicinales de la
invención para administración por vía oral, cada dosis unidad para
vía oral puede contener una cantidad de MLc o sus sales que varía de
50 mg a 2000 mg, preferiblemente de 250 a 1000 mg (o cada 5 ml en
caso de formas líquidas), mientras que en el caso de preparaciones
que se van a usar por vía parenteral la dosis unidad puede contener
de 100 mg a 2000 mg en 50 ml, preferiblemente de 500 mg a 1000 mg,
independientemente de que el ingrediente activo esté ya disuelto en
una solución o polvo acondicionado o liofilizado para ser
reconstituido con 50 ml de disolvente. Para preparaciones para vía
tópica de la invención el contenido del compuesto de fórmula (I) se
puede usar a una concentración variable comprendida entre 0,5% y
10%, preferiblemente entre 1% y 5% del contenido total.
Cuando se adopta la administración por vía oral,
se usan por lo general dosis diarias terapéuticas de MLc o sus
sales comprendidas entre 150 mg y 6 g al día, más preferiblemente
comprendidas entre 500 mg y 2,5 g al día. Por vía parenteral las
dosis diarias totales de MLc o sus sales pueden variar de 200 mg a 3
g al día, preferiblemente entre 500 mg y 2 g al día.
Estas dosificaciones se pueden ver aumentadas en
relación a la patología que se va a tratar, respecto a su nivel de
gravedad y en relación a la respuesta terapéutica deseada. También
la duración del tratamiento puede variar de forma considerable,
siempre en relación con la enfermedad que se que va a tratar, en
relación a su gravedad y en relación a la respuesta terapéutica que
se obtiene durante el tratamiento.
Sin embargo se entiende que la dosificación
específica, la frecuencia de dosificación, la dosis diaria total, y
sobre todo la duración de tratamiento, se pueden someter a
variaciones significativas en cada paciente en función de una
variedad de factores y criterios de evaluación, tal como la
actividad del compuesto específico, gravedad y patología que se va
a tratar, edad, peso corporal, salud general, sexo, dieta, tasa de
excreción, combinación de fármacos, estado general de la persona que
se somete a terapia.
\vskip1.000000\baselineskip
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La invención se describe además para un mejor
entendimiento en los siguientes ejemplos.
\vskip1.000000\baselineskip
(No de acuerdo con la
invención)
Evaluación de niveles en suero de citocinas,
TNF-\alpha, IL-1\alpha e
IL-1\beta, IL-6 e
IL-8, en ratones CBA tras administración por vía
oral de clorhidrato de MLc (clara de huevo de gallina) durante 7
días consecutivos.
El tratamiento de ratones de la familia CBA se
realizó mediante administración por vía oral de dosificaciones
diarias de clorhidrato de MLc (clara de huevo de gallina) a
25-100 mg/kg/día durante 7 días consecutivos
(cantidad expresada como equivalente de lisozima c de clara de
huevo de gallina). El compuesto en ensayo se mezcló cuidadosamente
con el alimento en polvo. El nivel de TNF-\alpha,
IL-\alpha, IL-1\beta,
IL-6, IL-8 se ha determinado en el
día 7 mediante inmunoensayo del enzima (ELISA). La tabla 1 muestra
los resultados obtenidos, demostrando el nivel elevado de
TNF-\alpha plasmático y en consecuencia de otras
citocinas tras administración de MLc (clara de huevo de
gallina):
\vskip1.000000\baselineskip
(No de acuerdo con la
invención)
Evaluación de niveles en suero de
TNF-\alpha e IFN-\alpha
(interferona alfa) en pacientes voluntarios con SIDA tras
administración de clorhidrato de MLc (clara de huevo de gallina) por
vía intravenosa (fleboclisis). Se ha confirmado que en SIDA,
TNF-\alpha y TNF-\beta parecen
jugar un papel crucial, aumentando la replicación de VIH, así como
también induciendo su propia expresión y la de otras citocinas. Los
niveles en plasma de TNF-\alpha e
IL-1 se ven aumentados sustancialmente durante la
progresión del SIDA. Como consecuencia adquiriendo un control sobre
la inducción de TNF-\alpha es posible establecer
una terapia efectiva para el SIDA.
La MLc como tal o como sal inhibe la síntesis de
TNF-\alpha y estimula de forma simultánea la
síntesis de IFN-\alpha.
En vista de las anteriores consideraciones se
administró 20 mg/kg/día de clorhidrato de MLc (cantidad expresada
como equivalente de lisozima c de clara de huevo de gallina) por vía
intravenosa lentamente a controles sanos, pacientes infectados con
VIH y pacientes asintomáticos infectados con VIH durante "n"
días consecutivos (n = no menos de 120 días). La tabla 2 muestra
los resultados obtenidos, confirmando una reducción del nivel en
plasma de TNF-\alpha y un aumento de
IFN-\alpha tras administración de clorhidrato de
MLc (clara de huevo de gallina):
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(No de acuerdo con la
invención)
Estudio del efecto de acetato de MLc (rata)
administrado por vía intravenosa en ratones DBA/l con artritis
inducida por colágeno. Se seleccionaron ratones DBA/l debido a sus
muchas similitudes inmunológicas y patológicas con AR (artritis
reumatoide) humana. Se inyectó por vía intravenosa acetato de MLc
(rata) a dosis de 20 mg/kg de peso corporal (cantidad expresada
como equivalente de lisozima c de rata) a ratones adultos bien antes
de la inducción de la artritis o tras el comienzo de la enfermedad.
El acetato de MLc (rata), administrado por vía parenteral antes de
la inducción de la enfermedad, determina una reducción significativa
del dolor y de la gravedad histológica de la artritis. Mediante la
comparación de los objetivos del estudio con la enfermedad humana
análoga, es muy significativa la capacidad del producto seleccionado
para reducir las afecciones clínicas, hinchamiento de articulación
y gravedad histológica de la enfermedad, incluso cuando se
administra tras el comienzo de los signos de artritis clínica.
Células mononucleares de articulaciones con AR mantenidas en cultivo
producen muchas citocinas con actividad
pro-inflamatoria, incluyendo
TNF-\alpha, medida por ensayos Elisa. El acetato
de MLc in vitro reduce la producción de esta citocina
inflamatoria. Se activaron células mononucleares (106 células por
ensayo) con PHA a la concentración de 1 \mug/ml desde el primer
día al quinto. Luego se lavaron las células tres veces con PBS y se
cultivaron en medio completo (500 \mul) en presencia o ausencia
de acetato de MLc (rata). Después de dos días se retiró el
sobrenadante del cultivo y se ensayó en cuanto a su contenido en
citocinas. La tabla 3 confirma la reducción de los niveles de
TNF-\alpha tras administración por vía
intravenosa a aquellos lotes tratados previamente con acetato de MLc
(rata).
\vskip1.000000\baselineskip
(No de acuerdo con la
invención)
Preparación de 100.000 comprimidos que contienen
300 mg de clorhidrato de MLc (clara de huevo de gallina).
Cada comprimido contiene:
El procedimiento de fabricación se lleva a cabo
mediante compresión directa de la mezcla de polvo en las etapas ya
conocidas por los expertos en la materia para preparar comprimidos,
usando habitáculos y equipos adecuados para este tipo de
producción.
1) Se disponen 30 kg de clorhidrato de MLc
(clara de huevo de gallina) y 25 kg de celulosa microcristalina en
un mezclador adecuado, se pasa después a través de un tamiz de malla
de 1,2 mm; 2) se añaden a la mezcla de polvo preparada previamente
2,5 kg de estearato de magnesio, 1,5 kg de dióxido de silicio y 2,0
kg de policarboxi-metilcelulosa de sodio en el
menor tiempo posible con el fin de obtener la uniformidad de
contenido; 3) se conserva la mezcla obtenida temporalmente en
recipientes adecuados, y tras aprobación por el control de calidad
del contenido de ingrediente activo, se transfiere luego a la
unidad de compresión, en la que se transforma el polvo en
comprimidos por compresión directa, usando máquina rotatoria con un
troquel adecuado de la medida deseada.
Se obtienen 97.931 comprimidos biconvexos que
contienen cada uno la cantidad deseada de clorhidrato de MLc.
(No de acuerdo con la
invención)
Preparación de 1.500 ampollas de 10 ml (15.000
ml) que contienen clorhidrato de MLc (clara de huevo de pollo)
(concentración de 50 mg/ml de clorhidrato de MLc).
1 ml de solución contiene 50 mg de clorhidrato
de MLc.
El procedimiento de fabricación se lleva a cabo
en etapas ya conocidas por los expertos en la materia para la
preparación de soluciones estériles y no pirógenas, usando
habitáculos y equipos adecuados para la producción de soluciones
inyectables.
1) En un equipo de disolución de acero
inoxidable se introducen aproximadamente 12,0 kg de agua para
inyecciones y se añaden con agitación constante y lenta 120,0 g de
cloruro de sodio; 2) se disuelven por separado en aproximadamente
4,0 kg de solución, preparada justo previamente, 0,750 kg de
clorhidrato de MLc; 3) se añade la solución del punto (2) a la
solución (1) y se obtiene el peso total de 15,0 litros con la
adición de agua para preparaciones inyectables; 4) se filtra luego
la solución resultante a través de filtros de esterilización y se
introduce en habitáculos estériles adecuados (clase 100) para su
reparto automático en ampollas de vidrio en atmósfera de nitrógeno,
usando las técnicas ya conocidas en la técnica para la fabricación
industrial de preparaciones inyectables.
Después de los controles químicos y biológicos
(esterilidad y pirógenos), se someten las ampollas obtenidas a los
ensayos automáticos habituales con el fin de comprobar la presencia
de partículas extrañas y la integridad del vidrio para ampollas, y
luego se envasan de forma adecuada de forma individual en cajas de
cartón para la distribución y su subsiguiente uso en medicina
humana. Se obtienen 1.421 ampollas de 10 ml (concentración de 50
mg/ml de clorhidrato de MLc) con un rendimiento efectivo de 94,73%
(rendimiento teórico 1.500).
Claims (12)
1. Un compuesto de fórmula general:
[CH_{3}O-(CH_{2}-CH_{2}-O)_{n}-CH_{2}-CH_{2}]_{x}-(NH)_{y}
lisozima c .
(Z)_{m}
en la
que:
y es el número de grupos aminoácido libres de
moléculas de lisina presentes en la molécula de lisozima c y está
comprendido entre 5 y 30;
x está comprendido entre 1 e y;
n está comprendido entre 5 y 1000;
Z es un ácido farmacéuticamente aceptable;
m está comprendido entre 1 e y,
y la lisozima c es una lisozima de ser
humano.
2. Un compuesto de acuerdo con la reivindicación
1, en el que n está comprendido entre 120 y 200.
3. Un compuesto de acuerdo con alguna de las
reivindicaciones precedentes, en el que dicho ácido
farmacéuticamente aceptable es ácido clorhídrico.
4. Uso de un compuesto de la reivindicación 1,
para la preparación de una composición farmacéutica para el
tratamiento de cáncer, artritis reumatoide, SIDA, psoriasis y choque
séptico.
5. Uso de acuerdo con la reivindicación 4, en el
que la composición farmacéutica es para el tratamiento de artritis
reumatoide, SIDA, psoriasis y choque séptico y para la
administración por una vía parenteral, preferiblemente una vía
intravenosa.
6. Composición farmacéutica que contiene, como
ingrediente activo, un compuesto de acuerdo con las reivindicaciones
1 a 3, opcionalmente en combinación con uno o más ingredientes
activos diferentes, formulados con ingredientes y/o adyuvantes
farmacéuticamente aceptables.
7. Composición farmacéutica de acuerdo con la
reivindicación 6, para ser administrada por vía oral, que contiene
de 5% a 80% en peso, preferiblemente de 40% a 60% del compuesto.
8. Composición farmacéutica de acuerdo con la
reivindicación 6, para ser administrada por vía parenteral, que
contiene de 0,5% a 10% en peso, preferiblemente de 2% a 4% del
compuesto.
9. Composición farmacéutica de acuerdo con la
reivindicación 6, para ser administrada por vía tópica, que contiene
de 0,5% a 10% en peso, preferiblemente de 1% a 5% del compuesto.
10. Procedimiento de fabricación para la
preparación de un compuesto de acuerdo con las reivindicaciones 1 a
3, que comprende las siguientes etapas:
- 1.
- se hace reaccionar monometoxipolietilenglicol con cloruro tresilado;
- 2.
- el compuesto resultante se hace reaccionar con lisozima c en la solución salina tamponada con fosfato o en el tampón borato en un medio ligeramente básico.
11. Procedimiento de fabricación de acuerdo con
la reivindicación 10, en el que la producción de la sal de adición
se obtiene mediante una diálisis con una solución acuosa de ácido Z,
preferiblemente durante 6 a 8 horas a temperatura ambiente.
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