PT1108060E - Diferenças moleculares entre espécies do complexo m. tuberculosis - Google Patents
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Description
ΕΡ 1 108 060/ΡΤ DESCRIÇÃO "Diferenças moleculares entre espécies do complexo M. tuberculosis" A tuberculose é uma calamidade humana antiga que continua a ser um problema de saúde pública importante a nivel mundial. Continua a ser epidémica de proporções impressionantes. Aproximadamente uma em cada três pessoas no mundo está infectada com Mycobacterium tuberculosis e tem um risco de 10% de ao longo do seu tempo de vida ocorrer progressão de infecção para doença clinica. Embora a tuberculose possa ser tratada, estima-se que 2,9 milhões de pessoas tenham morrido desta doença no ano transacto.
Existem problemas significativos com a fiabilidade do tratamento com fármacos para controlar infecções com M. tuberculosis activas. A maior parte das regiões com taxas de infecção elevada são em paises menos desenvolvidos, que sofrem de falta de serviços de saúde facilmente acessíveis, meios de diagnóstico e antibióticos contra M. tuberculosis adequados. Mesmo onde estes estão disponíveis, a adesão dos pacientes ao tratamento é frequentemente fraca devido ao regime prolongado necessário para tratamento completo e as estirpes multi-resistentes a fármacos são cada vez mais comuns. A prevenção da infecção evitaria os problemas de tratamento e portanto a vacinação contra tuberculose é vastamente efectuada em regiões endémicas. São vacinadas cerca de 100 milhões de pessoas por ano com a vacina de bacilo vivo Calmette-Guerin (BCG). A BCG tem a grande vantagem de ser barata e de fácil administração em condições longe das óptimas, com muito poucas reacções indesejáveis. Infelizmente, a vacina tem uma grande variabilidade em termos de eficácia, proporcionando qualquer valor entre 0 a 80% de protecção contra infecção com M. tuberculosis.
A BCG tem uma história interessante. É uma estirpe atenuada de M. bovis, uma espécie muito estreitamente relacionada com M. tuberculosis. A estirpe de M. bovis que se tornou em BCG foi isolada de uma vaca no final do século XIX 2 ΕΡ 1 108 060/ΡΤ por um bacteriólogo chamado Nocard, e portanto foi denominada bacilo de Nocard. A atenuação do bacilo de Nocard ocorreu de 1908 a 1921, no decurso de 230 passagens in vitro. A partir dai, foi amplamente cultivada em todo o mundo, resultando em centenas e por vezes milhares de passagens in vitro adicionais. Ao longo dos seus muitos anos no laboratório, houve uma selecção para reacção cruzada com o teste cutâneo de tuberculina e para diminuição de efeitos secundários. O resultado final foi um patogénio substancialmente enfraquecido, que pode ser ineficaz a desencadear uma resposta imunitária adequada. São urgentemente necessárias novas vacinas anti-tuberculose para a população em geral em regiões endémicas, para indivíduos infectados com VIH, bem como para profissionais de saúde com probabilidade de exposição a bacilos de tuberculose. Estão a ser desenvolvidas vacinas de ADN recombinante com genes protectores de M. tuberculosis virulento utilizando plasmideos vaivém para transferir o material genético de uma espécie de micobactéria para outra, consultar por exemplo patente U.S. n° 5 776 465. Deve ser dada uma elevada prioridade ao desenvolvimento de vacinas para a tuberculose nos objectivos de investigação médica actuais.
Literatura relevante
Mahairas et al. (1995) J Bacteriol 178(5):1274-1282 proporcionam uma análise molecular das diferenças genéticas entre Mycobacterium bovis BCG e M. bovis virulento. Utilizou-se hibridação genómica subtractiva para identificar diferenças genéticas entre M. bovis virulento e M. tuberculosis e BCG não virulento, a patente U.S. n° 5 700 683 é dirigida para tais diferenças genéticas.
Cole et al. (1998) Nature 393:537-544 descreveram o genoma completo de M. tuberculosis. Para a obtenção da sequência genómica contígua utilizou-se uma abordagem combinada que envolveu a análise de sequência sistemática de clones de inserção grandes seleccionados, bem como clones de inserção pequenos aleatórios de uma biblioteca de genoma completo obtida por disparos ("shotgun"). Tal culminou numa 3 ΕΡ 1 108 060/ΡΤ sequência compósita por 4 411 529 pares de bases, com um teor de G + C de 65,6%. Identificaram-se 3 924 quadros de leitura aberta no genoma, que contabilizam -91% da capacidade de codificação potencial. A sequência genómica de Mycobacterium tuberculosis (M.tb.) está disponível em vários locais da internet, incluindo http://www.cric.com/htdocs/tuberculosis/index.html e http://www.sanger.ac.uk/pathogen. 0 pedido de patente internacional WO 96/25519 revela deleções genéticas que atenuam a virulência.
SUMÁRIO DO INVENTO 0 presente invento proporciona métodos de diagnóstico, em particular de tuberculose, envolvendo a utilização de um polipéptido codificado por pelo menos 25 nucleótidos do quadro de leitura aberta Rv2654c e composições que o compreendem.
Proporcionam-se marcadores genéticos que distinguem entre estirpes do complexo Mycobacterium tuberculosis, em particular entre estirpes não virulentas e virulentas. As estirpes de interesse incluem M. bovis, estirpes M. bovis BCG, isolados de M. tuberculosis (M.tb.) e bacteriófagos que infectam micobactérias. Os marcadores genéticos são utilizados para ensaios, e.g. imunoensaios, que distinguem entre estirpes, tal como diferenciam entre imunização com BCG e infecção por M.tb. Os produtos proteicos podem ser produzidos e utilizados como um imunogénio, em rastreio de fármacos, etc. Os marcadores são úteis na construção de células de M.tb. ou M. bovis modificadas geneticamente com caracteristicas de vacina melhoradas.
DESCRIÇÃO DETALHADA DAS CONCRETIZAÇÕES
Identificam-se deleções genéticas especificas, e especificamente Rv2654c, que servem como marcadores para distinguir entre estirpes de micobactérias não virulentas e virulentas, incluindo M. bovis, estirpes de M. bovis BCG, isolados de M. tuberculosis (M. tb) e bacteriófagos que 4 ΕΡ 1 108 060/ΡΤ infectam micobactérias. Esta deleção é utilizada como um marcador genético para distinguir entre diferentes micobactérias. A deleção pode ser introduzida em M. tb. ou M. bovis por métodos recombinantes para tornar uma estirpe patogénica em não virulenta. Alternativamente, identifica-se o gene deletado na sequência do genoma de M. tb. e é então reintroduzido por métodos recombinantes em BCG ou noutras estirpes de vacina, de modo a melhorar a eficácia da vacinação. A deleção do invento é identificada por hibridações de ADN comparativas a partir de sequências genómicas de micobactéria para uma micromatriz de ADN compreendendo sequências representativas das sequências de codificação de M. tb. A deleção é então mapeada na sequência genómica conhecida de M. tb. de modo a identificar especificamente o(s) gene(s) deletado(s) e para caracterizar a sequência de nucleótidos da região deletada.
Utilizam-se ácidos nucleicos compreendendo a deleção proporcionada e junções numa variedade de aplicações. Podem obter-se sondas de hibridação da sequência conhecida de M. tb. que correspondem às sequências deletadas. Tais sondas são úteis para distinguir entre micobactérias. Por exemplo, existe uma probabilidade de 10% que uma pessoa infectada com M. tb. progrida para doença clinica, mas essa probabilidade pode variar dependendo da estirpe infecciosa especifica. A análise da presença ou ausência das deleções proporcionadas em seguida como "M. tb viáveis" é utilizada para distinguir entre estirpes de M. tb diferentes. As deleções são também úteis para identificar se um paciente que é positivo num teste cutâneo de tuberculina foi infectado com M. tb ou com BCG.
Noutra revelação do pedido, modificam-se geneticamente micobactérias para deletar sequências aqui identificadas como ausentes em estirpes atenuadas, mas presentes em estirpes patogénicas, e.g. deleções encontradas em BCG mas presentes em M. tb H37Rv. Tais estirpes modificadas por engenharia genética podem proporcionar vacinas superiores aos isolados de BCG presentemente em utilização. Alternativamente, podem "reconstruir-se" estirpes de BCG para serem mais semelhantes 5 ΕΡ 1 108 060/ΡΤ a Μ. tb de tipo selvagem por inserção de determinadas sequências deletadas de volta ao genoma. Dado que os produtos proteicos das sequências deletadas são expressos em espécies de micobactérias virulentas, as proteínas codificadas são úteis como imunogénios para vacinação. A atenuação (perda de virulência) em BCG é atribuída à perda de material genético de vários locais ao longo do genoma. A selecção ao longo do tempo para menos efeitos secundários resultantes da vacinação com BCG, mantendo reactividade cruzada com o teste cutâneo de tuberculina, proporcionou um rastreio excelente para as sequências que produzem efeitos secundários. A identificação de deleções que variam entre isolados de BCG identifica tais sequências, que podem ser utilizadas em rastreio de fármacos e análise biológica para o papel dos genes deletados no desenvolvimento de efeitos secundários indesejáveis e patogenicidade.
Identificação de marcadores de deleção do complexo M. Tuberculosis O presente invento proporciona sequências de ácido nucleico que são marcadores para micobactérias específicas, incluindo M. tb., M. bovis, BCG e bacteriófagos e refere-se especificamente a um polipéptido codificado por pelo menos 25 nucleótidos do quadro de leitura aberta de Rv 2654c. Apresentam-se deleções adicionais na tabela 1. A ausência ou presença destas sequências marcadoras é característica do isolado ou estirpe indicada. Como tal, elas proporcionam uma característica única para a identificação da micobactéria indicada. As deleções são identificadas pelo seu quadro de leitura aberta de M. tb. (nomenclatura "Rv"), que corresponde a uma sequência genética conhecida e pode ser acedida como previamente mencionado. Apresentam-se as junções das deleções pela designação de posição na sequência M. tb. disponível ao público. 6 ΕΡ 1 108 060/ΡΤ
Tabela 1
Rd Rv num orf id Ponto de quebra RD 01 Rv3871 MTV027. 06 "H37Rv, segmento 160 : 7534, 16989" RD 01 Rv3872 MTV027. 07 "H37Rv, segmento 160 : 7534, 16989" RD 01 Rv3873 MTV027. 08 "H37Rv, segmento 160 : 7534, 16989" RD 01 Rv3874 MTV027. 09 "H37Rv, segmento 160 : 7534, 16989" RD 01 Rv3875 MTV027. 10 "H37Rv, segmento 160 : 7534, 16989" RD 01 Rv3876 MTV027. 11 "H37Rv, segmento 160 : 7534, 16989" RD 01 Rv3877 MTV027. 12 "H37Rv, segmento 160 : 7534, 16989" RD 01 Rv387 8 MTV027. 13 "H37Rv, segmento 160 : 7534, 16989" RD 01 Rv3879c MTV027. 14c "H37Rv, segmento 160 : 7534, 16989" RD 02 Rvl988 MTCY39. 31c "H37Rv segmento 88 : 14211, segmento 89 : 8598" RD 02 Rvl987 MTCY39. 32c "H37Rv segmento 88 : 14211, segmento 89 : 8598" RD 02 Rvl986 MTCY39. 33c "H37Rv segmento 88: 14211, segmento 89:8598" RD 02 Rvl985c MTCY39. 34 "H37Rv segmento 88 : 14211, segmento 89 : 8598" RD 02 Rvl984c MTCY39. 35 "H37Rv segmento 88 : 14211, segmento 89 : 8598" RD 02 Rvl983 MTCY39. 36c "H37Rv segmento 88: 14211, segmento 89:8598" RD 02 Rvl982c MTCY39. 37 "H37Rv segmento 88 : 14211, segmento 89 : 8598" RD 02 Rvl981c MTCY39. 38 "H37Rv segmento 88 : 14211, segmento 89 : 8598" RD 02 Rvl980c MTCY39. 39 "H37Rv segmento 88: 14211, segmento 89:8598" RD 02 Rvl97 9c MTCY39. 40 "H37Rv segmento 88 : 14211, segmento 89 : 8598" RD 02 Rvl97 8 MTV051. 16 "H37Rv segmento 88 : 14211, segmento 89 : 8598" RD 03 Rvl586c MTCY336 co τ—1 "H37Rv, segmento 70: 7677, 16923" RD 03 Rvl585c MTCY336 .19 "H37Rv, segmento 70 : 7677, 16923" RD 03 Rvl584c MTCY336 .20 "H37Rv, segmento 70 : 7677, 16923" RD 03 Rvl583c MTCY336 .21 "H37Rv, segmento 70 : 7677, 16923" RD 03 Rvl582c MTCY336 .22 "H37Rv, segmento 70 : 7677, 16923" RD 03 Rvl581c MTCY336 .23 "H37Rv, segmento 70 : 7677, 16923" RD 03 Rvl580c MTCY336 .24 "H37Rv, segmento 70 : 7677, 16923" RD 03 Rvl57 9c MTCY336 .25 "H37Rv, segmento 70 : 7677, 16923" RD 03 Rvl57 8c MTCY336 .26 "H37Rv, segmento 70 : 7677, 16923" RD 03 Rvl577c MTCY336 .27 "H37Rv, segmento 70 : 7677, 16923" RD 03 Rvl57 6c MTCY336 .28 "H37Rv, segmento 70 : 7677, 16923" RD 03 Rvl575 MTCY336 .29c "H37Rv, segmento 70 : 7677, 16923" 7 ΕΡ 1 108 060/ΡΤ
Rd Rv num orf id Ponto de quebra RD 03 Rvl574 MTCY336 .30c "H37Rv, segmento 70: 7677, 16923" RD 03 Rvl573 MTCY336 .31c "H 3 7 Rv, segmento 70 : 7677, 16923" RD 04 Rv0221 MTCY08D5.16 "H 3 7 Rv, segmento 12 : 17432,19335" RD 04 Rv0222 MTCY08D5.17 "H37Rv, segmento 12 : 17432,19335" RD 04 Rv0223c MTCY08D5.18 "H 3 7 Rv, segmento 12 : 17432,19335" RD 05 Rv3117 MTCY164 .27 "H 3 7 Rv, segmento 135 : 27437,30212" RD 05 Rv3118 MTCY164 .28 "H37Rv, segmento 135 : 27437,30212" RD 05 Rv3119 MTCY164 .29 "H 3 7 Rv, segmento 135 : 27437,30212" RD 05 Rv3120 MTCY164 .30 "H 3 7 Rv, segmento 135 : 27437,30212" RD 05 Rv3121 MTCY164 .31 "H37Rv, segmento 135 : 27437,30212" RD 06 Rvl506c MTCY277 .28c "H 3 7 Rv, segmento 65 : 23614, 36347" RD 06 Rvl507c MTCY277 .29c "H 3 7 Rv, segmento 65 : 23614, 36347" RD 06 Rvl508c MTCY277 .30c "H37Rv, segmento 65: 23614, 36347" RD 06 Rvl509 MTCY277 .31 "H 3 7 Rv, segmento 65 : 23614, 36347" RD 06 Rvl510 MTCY277 .32 "H 3 7 Rv, segmento 65 : 23614, 36347" RD 06 Rvl511 MTCY277 .33 "H37Rv, segmento 65: 23614, 36347" RD 06 Rvl512 MTCY277 .34 "H 3 7 Rv, segmento 65 : 23614, 36347" RD 06 Rvl513 MTCY277 .35 "H 3 7 Rv, segmento 65 : 23614, 36347" RD 06 Rvl514c MTCY277 .36c "H37Rv, segmento 65: 23614, 36347" RD 06 Rvl515c MTCY277 .37c "H 3 7 Rv, segmento 65 : 23614, 36347" RD 06 Rvl516c MTCY277 .38c "H 3 7 Rv, segmento 65 : 23614, 36347" RD 07 Rv2346c MTCY98. 15c "H37Rv, segmento 103 : 17622, 26584" RD 07 Rv2 34 7c MTCY98. 16c "H 3 7 Rv, segmento 103 : 17622, 26584" RD 07 Rv2348c MTCY98. 17c "H 3 7 Rv, segmento 103 : 17622, 26584" RD 07 Rv2349c MTCY98. 18c "H37Rv, segmento 103 : 17622, 26584" RD 07 Rv2350c MTCY98. 19c "H 3 7 Rv, segmento 103 : 17622, 26584" RD 07 Rv2 351c MTCY98. 20c "H 3 7 Rv, segmento 103 : 17622, 26584" RD 07 Rv2352c MTCY98. 21c "H37Rv, segmento 103 : 17622, 26584" RD 07 Rv2353c MTCY98. 22c "H 3 7 Rv, segmento 103 : 17622, 26584" RD 08 Rv0309 MTCY63. 14 "H 3 7 Rv, segmento 16: 17018, 20446" RD 08 Rv0310c MTCY63. 15c "H 3 7 Rv, segmento 16: 17018, 20446" RD 08 Rv0311 MTCY63. 16 "H 3 7 Rv, segmento 16: 17018, 20446" RD 08 Rv0312 MTCY63. 17 "H 3 7 Rv, segmento 16: 17018, 20446" RD 09 Rv3623 MTCY15C10.29c "H 3 7 Rv, 2832" segmento 153 : 21131, segmento 154: 8 ΕΡ 1 108 060/ΡΤ
Rd Rv num orf id Ponto de quebra RD 09 Rv3622c MTCY15C10.30 "H37Rv, segmento 153: 21131, segmento 154: 2832" RD 09 Rv3621c MTCY15C10.31 "H37Rv, segmento 15.3: 21131, segmento 154: 2832" RD 09 Rv3620c MTCY15C10.32 "H37Rv, segmento 153: 21131, segmento 154: 2832" RD 09 Rv3619c MTCY15C10.33 "H37Rv, segmento 153: 21131, segmento 154: 2832" RD 09 Rv3618 MTCY15C10.34c "H37Rv, segmento 153: 21131, segmento 154: 2832" RD 09 Rv3617 MTCY15C10.35c "H37Rv, segmento 153: 21131, segmento 154: 2832" RD10 Rvl257c MTCY50.25 "H37Rv segmento 55: 3689, 6696" RD10 Rvl256c MTCY50.26 "H37Rv segmento 55: 3689, 6696" RD10 Rvl255c MTCY50.27 "H37Rv segmento 55: 3689, 6696" RD11 Rv342 9 MTCY77.01 "H37Rv, segmento 145: 30303 a segmento 146: 1475" RD11 Rv3428c MTCY78.01 "H37Rv, segmento 145: 30303 a segmento 146: 1475" RD11 Rv3427c MTCY78.02 "H37Rv, segmento 145: 30303 a segmento 146: 1475" RD11 Rv342 6 MTCY78.03c "H37Rv, segmento 145: 30303 a segmento 146: 1475" RD11 Rv3425 MTCY78.04c "H37Rv, segmento 145: 30303 a segmento 146: 1475" RD 12 Rv2 072c MTCY49.11c "H37Rv segmento 93: 9301, 11331" RD 12 Rv2 073c MTCY49.12c "H37Rv segmento 93: 9301, 11331" RD 12 Rv2 074 MTCY49.13 "H37Rv segmento 93: 9301, 11331" RD 12 Rv2 07 5c MTCY49.14c "H37Rv segmento 93: 9301, 11331" RD13bis Rv2645 MTCY441.15 "H37Rv, segmento 118: 12475, 23455" RD13bis Rv2 64 6 MTCY441.16 "H37Rv, segmento 118: 12475,23455" RD13bis Rv2647 MTCY441.17 "H37Rv, segmento 118: 12475, 23455" RD13bis Rv2 64 8 MTCY441.17A "H37Rv, segmento 118: 12475, 23455" RD13bis Rv2 64 9 MTCY441.18 "H37Rv, segmento 118: 12475, 23455" RD13bis Rv2650c MTCY441.19 "H37Rv, segmento 118: 12475, 23455" RD13bis Rv2651c MTCY441,20c "H37Rv, segmento 118: 12475, 23455" RD13bis Rv2652c MTCY441.21c "H37Rv, segmento 118: 12475, 23455" RD13bis Rv2 653c MTCY441,22c "H37Rv, segmento 118: 12475, 23455" 9 ΕΡ 1 108 060/ΡΤ
Rd Rv num orf id Ponto de quebra RD13bis Rv2 654 c MTCY441.23c "H37Rv, segmento 118 : 12475, 23455" RD13bis Rv2 655c MTCY441,24c "H 3 7 Rv, segmento 118 : 12475, 23455" RD13bis Rv2656c MTCY441,25c "H 3 7 Rv, segmento 118 : 12475, 23455" RD13bis Rv2657c MTCY441.26c "H37Rv, segmento 118 : 12475,23455" RD13bis Rv2658c MTCY441,27c "H 3 7 Rv, segmento 118 : 12475,23455" RD13bis Rv2659c MTCY441,28c "H 3 7 Rv, segmento 118 : 12475,23455" RD13bis Rv2 660c MTCY441.29c "H37Rv, segmento 118 : 12475, 23455" RD14 Rv1766 MTCY28.32 "H 3 7 Rv segmento 79 : 30573, 39642" RD14 Rvl7 67 MTCY28.33 "H 3 7 Rv segmento 79 : 30573, 39642" RD 14 Rvl768 MTCY28.34 "H37Rv segmento 79: 30573, 39642" RD14 Rvl7 69 MTCY28.35 "H 3 7 Rv segmento 79 : 30573, 39642" RD14 Rvl7 7 0 MTCY28.36 "H 3 7 Rv segmento 79 : 30573, 39642" RD 14 Rvl771 MTCY28.37 "H37Rv segmento 79: 30573, 39642" RD14 Rvl772 MTCY28.38 "H 3 7 Rv segmento 79 : 30573, 39642" RD14 Rvl773c MTCY28.39 "H 3 7 Rv segmento 79 : 30573, 39642" RD 15 Rvl963c MTV051.01c "H37Rv segmento 88: 1153, 13873" RD 15 Rvl964 MTV051.02 "H 3 7 Rv segmento 88 : 1153, 13873" RD 15 Rvl965 MTV051.03 "H 3 7 Rv segmento 88 : 1153, 13873" RD 15 Rvl966 MTV051.04 "H37Rv segmento 88: 1153, 13873" RD 15 Rvl967 MTV051.05 "H 3 7 Rv segmento 88 : 1153, 13873" RD 15 Rvl968 MTV051.06 "H 3 7 Rv segmento 88 : 1153, 13873" RD 15 Rvl969 MTV051.07 "H37Rv segmento 88: 1153, 13873" RD 15 Rvl97 0 MTV051.08 "H 3 7 Rv segmento 88 : 1153, 13873" RD 15 Rvl971 MTV051.09 "H 3 7 Rv segmento 88 : 1153, 13873" RD 15 Rvl972 MTV051.10 "H37Rv segmento 88: 1153,13873" RD 15 Rvl973 MTV051.11 "H 3 7 Rv segmento 88 : 1153, 13873" RD 15 Rvl974 MTV051.12 "H 3 7 Rv segmento 88 : 1153, 13873" RD 15 Rvl975 MTV051.13 "H37Rv segmento 88: 1153, 13873" RD 15 Rvl97 6c MTV051.14 "H 3 7 Rv segmento 88 : 1153, 13873" RD 15 Rvl977 MTV051.15 "H 3 7 Rv segmento 88 : 1153, 13873" RD16 Rv34 05c MTCY78.23 "H 3 7 Rv, segmento 145 : 5012 , 12621" RD16 Rv34 04c MTCY78.24 "H 3 7 Rv, segmento 145 : 5012 , 12621" RD16 Rv34 03c MTCY78.25 "H 3 7 Rv, segmento 145 : 5012 , 12621" RD16 Rv34 02 c MTCY78.26 "H 3 7 Rv, segmento 145 : 5012 , 12621" RD16 Rv3401 MTCY78.27c "H 3 7 Rv, segmento 145 : 5012 , 12621" 10 ΕΡ 1 108 060/ΡΤ
Rd Rv num orf id Ponto de quebra RD16 Rv3400 MTCY78.28c "H37Rv, segmento 145: 5012, 12621" A coluna "Rv" indica ο quadro de leitura aberta da sequência de M. tb pública. As estirpes BCG foram obtidas da seguinte forma:
Tabela 2. Estirpes utilizadas no estudo de filogenia de BCG
Nome da estirpe Sinónimo Fonte Descriptores BCG-Rússia Moscovo ATCC # 35740 BCG-Moreau Brasil ATCC # 35736 BCG-Moreau Brasil IAF datada de 1958 BCG-Moreau Brasil IAF datada de 1961 BCG-Japão Tóquio ATCC # 35737 BCG- Japão Tóquio IAF datada de 1961 BCG-Japão Tóquio JATA Estirpe de vacina BCG-Japão Tóquio JATA Estirpe do cancro da bexiga BCG-Japão Tóquio JATA isolado clinico- adenite BCG- Suécia Gotenburgo ATCC # 35732 BCG-Suécia Gotenburgo IAF datada de 1958 BCG-Suécia Gotenburgo SSI lote de produção, Copenhaga BCG-Phipps Filadélfia ATCC # 35744 BCG-Dinamarca Dinamarquesa 1331 ATCC # 35733 BCG-Copenhaga ATCC #27290 BCG-Copenhaga IAF datada de 1961 BCG-Tice Chicago Vaccine datada de 1973 BCG-Tice Chicago ATCC # 35743 BCG-Frappier Montreal IAF lote primário, 1973 BCG-Frappier, INH-resistente Montreal-R IAF lote primário, 1973 BCG-Frappier Montreal IAF passagem 946 BCG-Connaught Toronto CL treatmento de cancro da bexiga BCG-Birkhaug ATCC # 35731 BCG-Praga Checa SSI liofilizado de 1968 BCG-Glaxo Vaccine datada de 1973 EP 1 108 060/PT 11 BCG-Glaxo ATCC # 35741 BCG-Pasteur IAF passagem 888 BCG-Pasteur IAF datada de 1961 BCG-Pasteur IP 1173P2-B BCG-Pasteur IP 1173P2-C BCG-Pasteur IP isolado clínico# BCG-Pasteur IP isolado clínico# BCG-Pasteur ATCC # 35734
Abreviaturas: IP= Institut Pasteur, Paris, França; IAF= Institut Armand Frappier, Lavai, Canadá; ATCC= American Type Culture Collection, Rockville, Md, EUA; SSI=Statens Serum Institute, Copenhaga, Dinamarca; CL=Connaught Laboratories, Willowdale, Canadá, JATA= Japãoese AntiTuberculosis Association; INH =isoniazida. BCG de Canadá refere-se a BCG de Montreal e BCG de Toronto, sendo este último derivado do primeiro.
Na execução do método de rastreio inicial, isola-se ADN genómico de duas culturas de células microbianas de micobactérias. Marcam-se as duas preparações de ADN, utilizando-se um marcador diferente para a primeira e para a segunda cultura microbiana, tipicamente utilizando nucleótidos conjugados a um fluorocromo que emite a um comprimento de onda substancialmente diferente dos nucleótidos marcados com fluorocromo utilizados para marcar a sonda seleccionada. As estirpes utilizadas foram a estirpe de referência de Mycobacterium tuberculosis (H37Rv), outras estirpes laboratoriais de M. tb. , tais como H37Ra, a estirpe 0, isolados clinicos de M. tb., a estirpe de referência de Mycobacterium bovis e diferentes estirpes de Mycobacterium bovis BCG.
Misturam-se as duas preparações de ADN e efectua-se hibridação competitiva para uma micromatriz representativa de todos os quadros de leitura aberta no genoma do micróbio de ensaio, usualmente H37Rv. A hibridação das sequências marcadas é efectuada de acordo com métodos bem conhecidos na especialidade. Numa concretização preferida, combinam-se as duas sondas para proporcionar uma hibridação competitiva para uma única micromatriz. A hibridação pode ser efectuada em condições de rigor variáveis, de preferência em condições altamente rigorosas (e.g., 4 x SSC, SDS a 10%, 65 °C) para permitir hibridação de sequências complementares com homologia alargada (e.g., com pelo menos 85% de identidade de 12 ΕΡ 1 108 060/ΡΤ sequência, de preferência pelo menos 90% de identidade de sequência, com maior preferência com pelo menos 95% de identidade de sequência). Nos casos em que as sequências alvo são sequências nativas, a hibridação é efectuada de preferência em condições que apenas permitem hibridação de sequências altamente homólogas (e.g., de pelo menos 95% a 100% de identidade de sequência).
Utiliza-se hibridação com duas cores fluorescentes para ensaiar a representação da biblioteca não seleccionada em relação à biblioteca seleccionada (i.e., para detectar hibridação da sonda não seleccionada relativamente à sonda seleccionada). A partir da razão entre uma cor e a outra para qualquer elemento especifico da matriz, pode determinar-se a abundância relativa dessa sequência na biblioteca não seleccionada e seleccionada. Além disso, a comparação da hibridação das sondas seleccionada e não seleccionada proporciona um controlo interno para o ensaio. Uma ausência de sinal da estirpe de referência, comparativamente a H37Rv, é indicativa de que o quadro de leitura aberta está deletado na estirpe de ensaio. A deleção pode ser mapeada adicionalmente por análise de transferência "Southern" e por sequenciação das regiões flanqueadoras da deleção.
Podem rastrear-se as micromatrizes para detectar hibridação das sequências seleccionadas e não seleccionadas utilizando um microscópio de varrimento laser construído à medida, tal como descrito em Shalon et al., Genome Res. 6:639 (1996). Efectua-se um rastreio independente, utilizando a linha de excitação adequada, para cada um dos dois fluoróforos utilizados. As imagens digitais geradas pelo varrimento são então combinadas para análise subsequente. Para qualquer determinado elemento da matriz, a razão do sinal fluorescente do ADN amplificado da população celular seleccionada, associado, é comparado com o sinal fluorescente do ADN da população celular não seleccionada e determina-se a abundância relativa dessa sequência na biblioteca seleccionada e seleccionada.
Composições de ácidos nucleicos
Tal como aqui utilizada, a expressão "marcador de deleção" ou "marcador" é utilizada para referir as sequências 13 ΕΡ 1 108 060/ΡΤ dos genomas do complexo M. tuberculosis que são deletadas numa ou mais das estirpes ou espécies, tal como indicado na tabela 1 e especificamente Rv2654c. As bactérias do complexo M. tuberculosis incluem M. tuberculosis, M. bovis e BCG, incluindo os vários isolados e estirpes de entre cada espécie. Os ácidos nucleicos de interesse incluem toda ou uma parte da região deletada, em particular quadros de leitura aberta completos, iniciadores de hibridação, regiões de promotor, etc. A expressão "junção" ou "junção de deleção" é utilizada para referir ácidos nucleicos que compreendem as regiões tanto na sequência a 3', como na sequência a 5', que flanqueiam imediatamente a deleção. Tais sequências de junção são utilizadas de preferência como iniciadores curtos, e.g. desde cerca de 15 nt a cerca de 30 nt, que hibridam especif icamente com a junção, mas não com um ácido nucleico compreendendo a sequência genómica não deletada. Por exemplo, a deleção encontrada em M. bovis, em Rv0221, corresponde à sequência de nucleótidos do genoma H37Rv de M. tuberculosis, segmento 12: 17432,19335. A junção compreende as regiões a montante da posição 17342 e a jusante de 19335, e.g. um ácido nucleico de 20 nucleótidos compreendendo a sequência de H37Rv 17332-17342 ligada a 19335-19345.
Tipicamente, tais ácidos nucleicos compreendendo uma junção incluirão pelo menos cerca de 7 nucleótidos de cada região flanqueadora, i.e. da sequência a 3' e a 5' adjacentes à deleção, e pode ter cerca de 10 nucleótidos de cada região flanqueadora, até cerca de 15 nucleótidos ou mais. Os iniciadores de amplificação que hibridam com a sequência de junção, para a sequência deletada, e para as regiões flanqueadoras não deletadas têm várias utilizações, tal como detalhado em seguida.
As presentes composições de ácido nucleico codificam toda ou parte dos marcadores de deleção. Os fragmentos podem ser obtidos a partir da sequência de ADN, sintetizando quimicamente oligonucleótidos de acordo com métodos convencionais, por digestão com enzimas de restrição, por amplificação por PCR, etc. Na maioria, os fragmentos de ADN terão pelo menos cerca de 25 nt de comprimento, usualmente 14 ΕΡ 1 108 060/ΡΤ pelo menos cerca de 30 nt, mais usualmente pelo menos cerca de 50 nt. Para utilização nas reacções de amplificação, tal como PCR, utilizar-se-á um par de iniciadores. A composição exacta das sequências iniciadoras não é critica para o invento, mas para a maioria das aplicações os iniciadores hibridarão com a sequência em questão em condições rigorosas, tal como conhecido na especialidade. É preferível seleccionar um par de iniciadores que gerarão um produto de amplificação de pelo menos cerca de 50 nt, de preferência pelo menos cerca de 100 nt. São em geral conhecidos algoritmos para a selecção de sequências iniciadoras e estão disponíveis em pacotes de suporte lógico ("software packages"). Os iniciadores de amplificação hibridam com cadeias complementares de ADN e funcionarão como iniciadores um relativamente ao outro.
Usualmente, o ADN será obtido substancialmente isento de outras sequências de ácido nucleico que não incluem uma sequência marcadora de deleção ou seu fragmento, em geral pelo menos cerca de 50%, usualmente pelo menos cerca de 90% puro e é tipicamente "recombinante", i.e. flanqueado por um ou mais nucleótidos com os quais não está normalmente associado num cromossoma de ocorrência natural.
Para objectivos de rastreio, podem utilizar-se sondas de hibridação de uma ou mais sequências de deleção em reacções independentes ou separadas espacialmente numa matriz em fase sólida ou marcadas de forma a ser possível distinguirem-se entre si. Os ensaios podem utilizar ácidos nucleicos que hibridam com uma ou mais das deleções descritas.
Uma matriz pode incluir todos ou um subconjunto dos marcadores de deleção listados na tabela 1. Usualmente tal matriz incluirá pelo menos 2 sequências marcadoras de deleção diferentes, i.e. deleções localizadas em posições únicas dentro do local e podem incluir todos os marcadores de deleção proporcionados. As matrizes de interesse podem compreender adicionalmente outras sequências genéticas, em particular outras sequências de interesse para rastreio de tuberculose. A sequência de oligonucleótidos na matriz terá usualmente pelo menos cerca de 12 nt de comprimento, pode ter o comprimento das sequências de marcação de deleção proporcionadas ou pode estender-se para as regiões 15 ΕΡ 1 108 060/ΡΤ flanqueadoras para gerar fragmentos de 100 a 200 nt de comprimento. Para exemplos de matrizes, consultar Ramsay (1998) Nat. Biotech. 16:40-44; Hacia et al. (1996) Nature Genetics 14:441-447; Lockhart et al . (1996) Nature Biotechnol. 14:1675-1680; e De Genetics 14:457-460. Risi et al. (1996) Nature
Os ácidos nucleicos podem ser de ocorrência natural, e.g. ADN ou ARN, ou podem ser análogos sintéticos, tal como conhecido na especialidade. Tais análogos podem ser preferidos para utilização como sondas devido à sua maior estabilidade nas condições de ensaio. Demonstrou-se que modificações da estrutura nativa, incluindo alterações do esqueleto, açúcares ou bases heterociclicas, aumentam a estabilidade intracelular e a afinidade de ligação. Incluem-se entre as alterações úteis da quimica do esqueleto os fosforotiolatos; fosforoditiolatos, em que ambos os oxigénios que não fazem ligação em ponte são substituídos por enxofre; fosforoamidites; alquilfosfotriésteres e boranofosfatos. Os derivados de fosfato aquirais incluem 3'-0'-5'-S-fosforotiolato, 3'-S-5'-0- fosforotiolato, 3'-CH2-5'-0-fosfonato e 3'-NH-5'-0-fosforoamidato. Os ácidos nucleicos peptídicos substituem o esqueleto completo de ribose fosfodiéster por uma ligação peptídica.
Também se utilizam modificações de açúcar para melhorar a estabilidade e afinidade. Pode utilizar-se o D-anomero de desoxirribose, em que a base é invertida relativamente ao anomero b natural. 0 grupo 2'-OH do açúcar ribose pode ser alterado para formar açúcares 2'-0-metilo ou 2'-0-alilo, que proporcionam resistência à degradação sem comprometer a afinidade. A modificação das bases heterociclicas deve manter o emparelhamento de bases adequado. Algumas substituições úteis incluem desoxiuridina em substituição de desoxitimidina; 5-etil-2-desoxicitidina e 5-bromo-2'-desoxicitidina em substituição de desoxicitidina. Demonstrou-se que 5-propinil-2'-desoxiuridina e 5-propinil-2'-desoxicitidina aumentam a afinidade e actividade biológica quando em substituição de desoxitimidina e desoxicitidina, respectivamente. 16 ΕΡ 1 108 060/ΡΤ
Composições de polipéptidos
Os marcadores de deleção específicos na tabela 1 e em particular Rv2654c correspondem a quadros de leitura aberta do genoma de M. tb e consequentemente codificam um polipéptido. Os marcadores em causa podem ser utilizados para a síntese de uma proteína completa ou seus fragmentos de polipéptido, em particular fragmentos correspondentes a domínios funcionais; locais de ligação; etc.; e incluindo fusões dos polipéptidos em causa com outras proteínas ou suas partes. Para expressão, pode utilizar-se uma cassete de expressão, que proporciona uma região de iniciação de transcrição e tradução, que pode ser indutível ou constitutiva, em que a região de codificação está ligada operacionalmente sob controlo de transcrição da região de iniciação de transcrição, e uma região de terminação de transcrição e tradução. Podem utilizar-se várias regiões de iniciação de transcrição que são funcionais no organismo hospedeiro.
Os polipéptidos podem ser expressos em procariotas ou eucariotas, de acordo com meios convencionais, dependendo do objectivo da expressão. Para produção de proteína em grande escala, podem ser utilizadas como células hospedeiras para expressão um organismo unicelular, tal como E. coli, B. subtilis, S. cerevisiae, ou células de um organismo superior tal como vertebrados, em particular mamíferos, e.g. células COS 7. Os péptidos pequenos também podem ser sintetizados no laboratório.
Tendo os polipéptidos disponíveis em grandes quantidades, através de utilização de um hospedeiro de expressão, os polipéptidos podem ser isolados e purificados de acordo com meios convencionais. Pode preparar-se um lisado do hospedeiro de expressão e o lisado pode ser purificado utilizando HPLC, cromatografia de exclusão, electroforese em gel, cromatografia de afinidade ou outras técnicas de purificação. O polipéptido purificado será em geral pelo menos cerca de 80% puro, de preferência pelo menos cerca de 90% puro e pode ser até e inclusivamente 100% puro. Pretende-se que puro signifique isento de outras proteínas, bem como de resíduos celulares. 17 ΕΡ 1 108 060/ΡΤ Ο polipéptido é utilizado para a produção de anticorpos, em que os fragmentos mais curtos proporcionam anticorpos específicos para o polipéptido em particular e os fragmentos maiores ou a proteína completa permitem a produção de anticorpos ao longo da superfície do polipéptido. Podem desenvolver-se anticorpos para péptidos isolados correspondentes a domínios específicos ou para a proteína nativa.
Os anticorpos são preparados de acordo com meios convencionais, em que o polipéptido ou proteína expressos são utilizados como um imunogénio, sozinhos ou conjugados com transportadores imunogénicos conhecidos, e.g. KLH, pre-S HBsAg, outras proteínas víricas ou eucarióticas ou semelhantes. Podem ser utilizados vários adjuvantes, com uma série de injecções, como adequado. Para anticorpos monoclonais, após uma ou mais injecções de reforço, isola-se o baço, imortalizam-se os linfócitos por fusão celular e seguidamente rastreiam-se para ligação de anticorpo com elevada afinidade. As células imortalizadas, i.e. hibridomas, que produzem os anticorpos pretendidos podem então ser expandidas. Para uma descrição adicional, consultar Monoclonal Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow e Lane eds., Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, New York, 1988 . Caso se pretenda, pode isolar-se o ARNm que codifica as cadeias pesadas e leves e sujeitar-se a mutagénese por clonagem em E. coli e podem misturar-se as cadeias pesadas e leves para melhorar adicionalmente a afinidade do anticorpo. As alternativas a imunização in vivo como um método de desenvolver anticorpos incluem ligação a bibliotecas de "disposição" de fagos, usualmente em conjunção com maturação por afinidade in vitro. 0 anticorpo pode ser produzido como uma cadeia simples, em vez da estrutura multimérica normal. Descrevem-se anticorpos em cadeia simples em Jost et al. (1994) J.B.C. 269:26267-73 e outros. As sequências de ADN que codificam a região variável da cadeia pesada e a região variável da cadeia leve estão ligadas a um espaçador que codifica pelo menos cerca de 4 aminoácidos neutros pequenos, incluindo glicina e/ou serina. A proteína codificada por esta fusão 18 ΕΡ 1 108 060/ΡΤ permite a montagem de uma região variável funcional que mantém a especificidade e afinidade do anticorpo original.
Utilização de marcadores de deleção na identificação de micobactérias A deleção Rv2654c, proporcionada na tabela 1, é útil para a identificação de uma micobactéria como (a) variantes de M. tb. (b) isolados de BCG (c) estirpes de M. bovis ou (d) contendo o bacteriófago micobacteriano identificado, dependendo do marcador especifico que é seleccionado. Tal rastreio é particularmente útil para determinar se uma determinada infecção ou isolado é patogénico. A expressão micobactéria pode referir-se a qualquer membro da família de micobacteriaceas, incluindo M. tuberculosis, complexo M. avium, M. kansasii, M. scrofulaceum, M. bovis e M. leprae. São conhecidos na especialidade meios de detectar deleções. As deleções podem ser identificadas através da ausência ou presença das sequências em ARNm ou ADN genómico, através de análise das regiões de junção que flanqueiam a deleção ou detecção do produto génico ou, em particular em relação ao ensaio cutâneo de tuberculina, por identificação de anticorpos que reagem com o produto génico codificado.
Embora as deleções possam ser facilmente determinadas pela ausência de hibridação, em muitos casos é desejável ter um sinal positivo, de modo a minimizar leituras negativas que são artefactos. Em tais casos, as deleções podem ser detectadas pela concepção de iniciadores que flanqueiam a junção formada pela deleção. Quando a deleção está presente, forma-se uma nova sequência entre as regiões flanqueadoras, que pode ser detectada por hibridação. De preferência, tal iniciador será suficientemente curto para hibridar apenas com a junção e não será capaz de formar híbridos estáveis com qualquer uma das partes da junção separadamente. O diagnóstico é efectuado por análise de proteína, sequência de ADN ou de ARN e/ou hibridação de uma amostra adequada, e.g. micobactérias em cultura, material de biopsia, amostra de sangue, etc. 0 rastreio também se pode basear nas características funcionais ou antigénicas da proteína. Podem 19 ΕΡ 1 108 060/ΡΤ utilizar-se para rastreio, imunoensaios concebidos para detectar as proteinas codificadas a partir das sequências deletadas.
Estão disponíveis vários métodos para analisar ácidos nucleicos para a presença de uma sequência específica. Quando estão disponíveis quantidades elevadas de ADN, utiliza-se directamente ADN genómico. Alternativamente, clona-se a região de interesse para um vector adequado e cultiva-se em quantidade suficiente para análise. O ácido nucleico pode ser amplificado por técnicas convencionais, tais como reacção de polimerização em cadeia (PCR), para proporcionar quantidades suficientes para análise. A utilização da reacção de polimerização em cadeia é descrita em Saiki, et al. (1985) Science 239:487 e pode encontrar-se uma revisão dos métodos actuais em Sambrook, et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, CSH Press 1989, p. 14.2-14.33. Pode também utilizar-se amplificação para determinar a presença de um polimorfismo, por utilização de um iniciador que é específico para o polimorfismo. Alternativamente, conhecem-se vários métodos na especialidade que utilizam ligação de oligonucleótidos, consultar para exemplos Riley et al. (1990) N.A.R. 18:2887-28 90; e Delahunty et al. (1996) Am. J. Hum. Genet. 58:1239-1246.
Pode incluir-se um marcador detectável numa reacção de amplificação. Os marcadores adequados incluem fluorocromos, e.g. isotiocianato de fluoresceína (FITC), rodamina, vermelho do Texas, ficeritrina, aloficocianina, 6-carboxifluoresceína (6-FAM), 2,7-dimetoxi-4',5'-dicloro-6-carboxifluoresceína (JOE), 6-carboxi-X-rodamina (ROX), 6-carboxi-2',4',7',4,7-hexaclorofluoresceína (HEX), 5-carboxifluoresceína (5-FAM) ou Ν,Ν,Ν',N'-tetrametil-6-carboxirrodamina (TAMRA), marcadores radioactivos, e.g. 32P, 35S, 3H: etc. O marcador pode ser um sistema de dois estágios, em que o ADN amplificado é conjugado com biotina, haptenos, etc. com um parceiro de ligação de elevada afinidade, e.g. avidina, anticorpos específicos, etc., em que o parceiro de ligação está conjugado a um marcador detectável. 0 marcador pode ser conjugado a um ou ambos os iniciadores. Alternativamente, o conjunto de nucleótidos utilizados na amplificação está 20 ΕΡ 1 108 060/ΡΤ marcado, de modo a incorporar o marcador no produto de amplificação. O ácido nucleico da amostra, e.g. amplificado ou fragmento clonado, é analisado por um de vários métodos conhecidos na especialidade. O ácido nucleico pode ser sequenciado pelo método de didesoxi ou outros métodos e pode comparar-se a sequência de bases com a sequência deletada. A hibridação com a sequência variante pode também ser utilizada para determinar a sua presença, por transferências "Southern", transferências "dot", etc. Também se pode utilizar o padrão de hibridação de uma sequência de controlo ou variante com uma matriz de sondas de oligonucleótidos imobilizada num suporte sólido, tal como descrito em US 5 445 934 ou em WO95/35505, como um meio para detectar a presença de sequências variáveis. Utiliza-se análise de polimorfismos conformacionais em cadeia simples (SSCP), electroforese em gradiente de gel desnaturante (DGGE), detecção por clivagem de erros de emparelhamento e análise de cadeias duplas heterogéneas em matrizes de gel para detectar alterações conformacionais criadas pela variação da sequência de ADN como alterações da mobilidade electroforética.
Alternativamente, quando um polimorfismo cria ou destrói um local de reconhecimento para uma endonuclease de restrição (polimorfismos dos fragmentos de restrição, RFLP), a amostra é digerida com essa endonuclease e os produtos são fraccionados por tamanho para determinar se o fragmento foi digerido. A fraccionação é efectuada por electroforese em gel ou capilar, em particular em géis de acrilamida ou agarose.
Pode utilizar-se o padrão de hibridação de uma sequência de controlo e variante com uma matriz de sondas de oligonucleótidos imobilizadas num suporte sólido, tal como descrito em US 5 445 934 ou em WO95/35505, como um meio de detectar a presença das sequências deletadas. Numa concretização do invento, proporciona-se uma matriz de oligonucleótidos, em que as posições individuais na matriz são complementares a pelo menos uma parte do ADN genómico de M. tb., usualmente compreendendo pelo menos uma parte dos quadros de leitura aberta identificados. Tal matriz pode compreender uma série de oligonucleótidos, em que cada um dos 21 ΕΡ 1 108 060/ΡΤ quais pode hibridar especificamente com um ácido nucleico e.g. ARNm, ADNc, ADN genómico, etc.
Também se podem detectar deleções por amplificação. Numa concretização do invento, amplificam-se sequências que incluem uma junção de deleção, i.e. em que os iniciadores de amplificação hibridam com uma sequência de junção. Numa amostra de ácido nucleico em que a sequência marcadora está deletada, formar-se-á uma junção e o iniciador hibridará, permitindo assim amplificação de uma sequência detectável. Numa amostra de ácido nucleico em que está presente a sequência marcadora, o iniciador não hibridará e não ocorrerá qualquer amplificação. Alternativamente, podem escolher-se iniciadores de amplificação de modo que apenas ocorra amplificação da sequência alvo quando está presente a sequência marcadora. Os produtos de amplificação podem ser separados por tamanho utilizando qualquer método conveniente, tal como conhecido na especialidade, incluindo electroforese em gel, cromatografia, electroforese capilar, fraccionação por gradiente de densidade, etc.
Além da detecção de deleções pela detecção de sequências de junções ou detecção das próprias sequências marcadoras, pode determinar-se a presença ou ausência do produto proteico codificado. As deleções específicas na tabela 1 correspondem a quadros de leitura aberta do genoma de M. th e portanto codificam um polipéptido. Os polipéptidos são detectados por meios conhecidos na especialidade, incluindo determinar a presença do polipéptido específico numa amostra através de caracterização bioquímica, funcional ou imunológica. A detecção de anticorpos no soro de um paciente que reagem especificamente com um polipéptido é de particular interesse. A imunização com BCG leva tipicamente a uma resposta positiva contra antigénios de tuberculina num ensaio cutâneo. Nas pessoas que foram imunizadas, que inclui uma proporção significativa da população mundial, é assim difícil determinar se um ensaio positivo é o resultado de uma reacção imunitária à vacina de BCG ou à ocorrência de infecção por M. th. O objecto do invento proporciona a sequência do quadro de leitura aberta Rv2654c que está presente em M. tb isolada, mas ausente em BCG. Como método de rastreio primário ou 22 ΕΡ 1 108 060/ΡΤ secundário, pode ensaiar-se a imunorreactividade do paciente com os polipéptidos codificados por tal marcador de deleção. O diagnóstico pode ser efectuado por vários métodos. Os diferentes métodos determinam todos a presença de uma resposta imunitária ao polipéptido num paciente, em que a resposta positiva é indicativa de uma infecção com M. tb. A resposta imunitária pode ser determinada por determinação de ligação de anticorpo ou pela presença de uma resposta a provocação intradérmica com o polipéptido.
Num método, injecta-se subcutaneamente no paciente uma dose do polipéptido marcador de deleção, formulado como uma mistura de proteínas ou como uma espécie de proteína individual, num meio adequado. A dose será usualmente pelo menos cerca de 0,05 yg de proteína e usualmente não mais do que cerca de 5 yg de proteína. Injectar-se-á ao mesmo tempo, num local próximo, um controlo compreendendo apenas meio ou uma proteína não relacionada. O local de injecção é analisado após um intervalo de tempo para a presença de pápula. A pápula no local de injecção do polipéptido é comparada com o local de injecção de controlo, usualmente por medição do tamanho da pápula. As leituras do ensaio cutâneo podem ser avaliadas por vários sistemas de classificação objectiva. Um resultado positivo para a presença de uma condição alérgica mostrará um diâmetro aumentado no local de injecção de polipéptido comparativamente ao controlo, usualmente pelo menos cerca de 50% de aumento de tamanho, mais usualmente pelo menos 100% de aumento de tamanho.
Um método alternativo para diagnóstico depende da detecção in vitro da ligação entre anticorpos numa amostra de paciente e os polipéptidos em causa, quer como uma mistura, quer como espécie de proteína individual, em que a presença de ligação específica é indicativa de uma infecção. A medição da concentração de anticorpos específicos de polipéptido numa amostra ou sua fracção pode ser efectuada por vários ensaios específicos. Em geral, o ensaio medirá a reactividade entre uma amostra do paciente, usualmente derivada de sangue, em geral sob a forma de plasma ou soro. A amostra do paciente será utilizada directamente ou diluída como adequado, usualmente cerca de 1:10 e usualmente não mais do que cerca de 1:10 000. Os imunoensaios podem ser efectuados em qualquer 23 ΕΡ 1 108 060/ΡΤ tampão fisiológico, e.g. PBS, solução salina normal, HBSS, dPBS, etc.
Numa concretização preferida, utiliza-se um ensaio do tipo sanduíche convencional. Um ensaio em sanduíche é efectuado primeiramente ligando o polipéptido a uma superfície ou suporte insolúveis. O polipéptido pode ser ligado à superfície por guaisquer meios adequados, dependendo da natureza da superfície, quer directamente, quer através de anticorpos específicos. O modo particular de ligação não é crucial desde que seja compatível com os reagentes e métodos globais do invento. Podem ligar-se às placas covalente ou não covalentemente, de preferência não covalentemente. Adicionam-se então amostras, suas fracções ou alíquotas a suportes ensaiáveis separadamente (por exemplo, poços separados de uma placa de microtitulação) contendo polipéptido ligado à superfície. De preferência, ensaia-se uma série de padrões, contendo concentrações conhecidas de anticorpos, em paralelo com as amostras ou suas alíquotas para servirem como controlos.
Os receptores específicos imunitários podem ser marcados para facilitar quantificação directa ou indirecta da ligação. Os exemplos de marcadores que permitem ligação directa da ligação de um segundo receptor incluem marcadores radioquímicos, tais como 3H ou 125I, fluoróforos, corantes, pérolas, agentes quimioluminescentes, partículas coloidais e semelhantes. Os exemplos de marcadores que permitem medição indirecta de ligação incluem enzimas, em que o substrato pode proporcionar um produto corado ou fluorescente, numa concretização preferida, os segundos receptores são anticorpos marcados com uma enzima ligada covalentemente capaz de proporcionar um sinal de produto detectável após adição de substrato adequado. Os exemplos de enzimas adequadas para utilização em conjugados incluem peroxidase de rábano, fosfatase alcalina, malato desidrogenase e semelhantes. Quando não houver comercialmente disponível, tais conjugados anticorpo-enzima são facilmente produzidos por técnicas conhecidas dos peritos na especialidade.
Em alguns casos, utilizar-se-á um ensaio competitivo. Além da amostra do paciente, adiciona-se um competidor para o 24 ΕΡ 1 108 060/ΡΤ anticorpo à mistura reaccional. O competidor e o anticorpo competem para ligação ao polipéptido. Usualmente, a molécula competidora será marcada e detectada tal como descrito previamente, em que a quantidade de ligação de competidor será proporcional à quantidade de imunitário presente. A concentração de molécula competidora será de cerca de 10 vezes a concentração máxima antecipada de imunitário a cerca de uma concentração igual, de modo a tornar a gama de detecção mais sensivel e linear.
Alternativamente, podem utilizar-se anticorpos para a determinação directa da presença do polipéptido marcador de deleção. Podem utilizar-se anticorpos específicos para os marcadores de deleção em causa, tal como previamente descrito, em imunoensaios de rastreio. As amostras, tal como aqui utilizadas, incluem culturas microbianas, fluidos biológicos tais como lavagens de traqueia, sangue, etc. Também se incluem na expressão os derivados e fracções de tais fluidos. O diagnóstico pode ser efectuado por vários métodos. Os diferentes métodos determinam todos a ausência ou presença dos polipéptidos codificados pelos marcadores de deleção em causa. Por exemplo, a detecção pode utilizar coloração de células de micobactérias ou secções histológicas, efectuadas de acordo com métodos convencionais. Adicionam-se os anticorpos de interesse à amostra celular e incubam-se durante um período de tempo suficiente para permitir ligação ao epítopo, usualmente durante pelo menos 10 minutos. O anticorpo pode ser marcado com radioisótopos, enzimas, fluoróforos, agentes quimioluminescentes ou outros marcadores para detecção directa. Alternativamente, utiliza-se um anticorpo ou reagente de segundo estágio para amplificar o sinal. Tais reagentes são bem conhecidos na especialidade. Por exemplo, o anticorpo primário pode ser conjugado com biotina, e adiciona-se peroxidase de rábano conjugada com avidina como um reagente de segundo estágio. A detecção final utiliza um substrato que sofre uma mudança de cor na presença de peroxidase. A ausência ou presença de ligação de anticorpo pode ser determinada por vários métodos, incluindo microscopia, radiografia, contagem de cintilações, etc. 25 ΕΡ 1 108 060/ΡΤ
Um método alternativo para diagnóstico depende da detecção in vitro da ligação entre anticorpos e os polipéptidos em causa em solução, e.g. num lisado celular. Pode medir-se a concentração de ligação numa sua amostra ou fracção através de vários ensaios específicos. Pode utilizar-se um ensaio convencional de tipo sanduíche. Por exemplo, num ensaio em sanduíche pode primeiramente ligar-se anticorpos específicos a uma superfície ou suporte insolúveis. O modo específico de ligação não é crítico desde que seja compatível com os reagentes e métodos gerais do invento. Aqueles podem ligar-se a placas de forma covalente ou não covalente, de preferência de forma não covalente. Os suportes insolúveis podem ser quaisquer composições às quais se possam ligar polipéptidos, que são facilmente separados do material solúvel e que são sob outros aspectos compatíveis com o método global. A superfície de tais suportes pode ser maciça ou porosa e pode ter qualquer formato conveniente. Exemplos de tais suportes insolúveis adequados ao qual o receptor está ligado incluem pérolas, e.g. pérolas magnéticas, membranas e placas de microtitulação. Estas são tipicamente feitas de vidro, plástico (e.g. poliestireno), polissacáridos, nylon ou nitrocelulose. As placas de microtitulação são especialmente convenientes porque pode efectuar-se um grande número de ensaios simultaneamente utilizando pequenas quantidades de reagentes e amostras.
Adicionam-se então as amostras a suportes que permitam ensaios independentes (por exemplo, poços independentes de uma placa de microtitulação) contendo anticorpos. Preferentemente, ensaiam-se uma série de padrões contendo concentrações conhecidas dos polipéptidos paralelamente com as suas amostras ou alíquotas para servir como controlos. Preferentemente, adicionar-se-á cada amostra e padrão a poços múltiplos de modo a se obterem valores médios. O tempo de incubação deve ser suficiente para ligação, geralmente, desde cerca de 0,1 a 3 h é suficiente. Após incubação, removem-se geralmente as componentes não ligadas por lavagem do suporte insolúvel. Geralmente, utiliza-se um meio de detergente não iónico diluído a um pH apropriado, geralmente 7-8, como meio de lavagem. Podem utilizar-se entre uma e seis lavagens com volume suficiente para lavar exaustivamente proteínas ligadas não especificamente que estejam presentes na amostra. 26 ΕΡ 1 108 060/ΡΤ
Após lavagem, aplica-se uma solução contendo um segundo anticorpo. O anticorpo ligar-se-á com especificidade suficiente de modo a se poder distinguir de outras componentes presentes. Os segundos anticorpos podem ser marcados para facilitar quantificação de ligação directa ou indirecta. Exemplos de marcadores que permitem medição directa da ligação de um segundo receptor incluem marcadores radioactivos, tais como H ou I, fluoroforos, corantes, pérolas, agentes quimioluminescentes, partículas coloidais e semelhantes. Exemplos de marcadores que permitem medição indirecta de ligação incluem enzimas nas quais o substrato pode proporcionar um produto corado ou fluorescente. Numa concretização preferida, marcam-se os anticorpos com uma enzima ligada covalentemente capaz de proporcionar um sinal de produto detectável após adição do substrato adequado. Exemplos de enzimas adequadas para utilização em conjugados incluem peroxidase de rábano, fosfatase alcalina, malato desidrogenase e semelhantes. Quando não se encontrarem disponíveis comercialmente, tais conjugados anticorpo-enzima são produzidos facilmente por técnicas conhecidas dos peritos na especialidade. 0 tempo de incubação deve ser suficiente para que o ligando marcado se ligue a moléculas disponíveis. Geralmente, desde cerca de 0,1 a 3 h é suficiente, 1 h é habitualmente suficiente.
Após a segunda etapa de ligação, remove-se novamente o material ligado não especificamente do suporte insolúvel por lavagem deste. O sinal produzido pelo conjugado ligado é detectado por meios convencionais. Quando se utiliza um conjugado de enzima, proporciona-se um substrato enzimático adequado de modo a formar um produto detectável. São conhecidos na especialidade outros imunoensaios e podem ser utilizados em diagnóstico. As placas de Ouchterlony proporcionam uma determinação simples de ligação de anticorpo. Podem efectuar-se hibridações "Western" em géis de proteína ou manchas de proteína em filtros, utilizando um sistema de detecção específico para o polipéptido, utilizando convenientemente um método de marcação tal como descrito para o ensaio em sanduíche. 27 ΕΡ 1 108 060/ΡΤ
Micobactérias recombinantes
As micobactérias, nomeadamente as do complexo M. tuberculosis, são modificadas por engenharia genética para conter deleções ou inserções especificas correspondentes aos marcadores genéticos identificados. Modificam-se nomeadamente as estirpes de BCG atenuadas para introduzir genes deletados que codificam sequências importantes no estabelecimento de imunidade eficaz. Alternativamente, modificam-se M. bovis ou M. tuberculosis por recombinação homóloga para criar deleções especificas em sequências que determinam virulência, i.e. as bactérias são atenuadas através de técnicas recombinantes.
De modo a introduzir estavelmente sequências em BCG, insere-se o quadro de leitura aberta de M. tb correspondente a Rv2654c num vector que se mantém em estirpes M. bovis. Preferentemente, incluem-se as sequências flanqueadoras a 5' e a 3' nativas de modo a proporcionar regulação adequada de transcrição e tradução. Contudo, em circunstâncias especiais, podem incluir-se promotores exógenos e outras regiões de regulação. Conhecem-se na especialidade vectores e métodos de transfecção para BCG. Por exemplo, patente U.S. n° 5 776 465 descreve a introdução de genes exógenos em BCG.
Numa concretização do invento, a região deletada completa é substituída em BCG. Determinam-se as junções da deleção comparativamente com uma sequência de tipo selvagem de M. tb. ou M. bovis, por exemplo tal como estabelecido na secção experimental. Clona-se a região deletada por qualquer método conveniente tal como conhecido na especialidade, e.g. amplificação por PCR da região, digestão por endonuclease de restrição, síntese química, etc. Preferentemente, a região clonada compreenderá adicionalmente sequências flanqueadoras com um comprimento suficiente para induzir recombinação homóloga, habitualmente pelo menos cerca de 25 nt, mais habitualmente pelo menos cerca de 100 nt ou mais. Conhecem-se na especialidade vectores e métodos adequados, consultar por exemplo, Norman et al. (1995) Mol. Microbiol. 16:755-760.
Numa concretização alternativa introduz-se Rv2654c numa estirpe de M. tuberculosis ou M. bovis. Preferentemente, tal estirpe tem virulência reduzida, e.g. H37Ra, etc. Conhecem-se 28 ΕΡ 1 108 060/ΡΤ na especialidade métodos de recombinação homóloga de modo a efectuar deleções em micobactérias, consultar por exemplo Norman et al., supra.; Ganjam et al. (1991) P.N.A.S. 88:5433- 5437; e Aldovini et al. (1993) J. Bacteriol. 175:7282-7289.
As deleções podem compreender um quadro de leitura aberta identificado na tabela 1 ou podem alargar-se até deleção completa, i.e. alargar-se até regiões flanqueadoras e podem incluir quadros de leitura aberta múltiplos. A capacidade da micobactéria geneticamente modificada provocar doença pode ser ensaiada num ou mais modelos experimentais. Por exemplo, sabe-se que M. tb. infecta vários animais e células em cultura. Num ensaio, infectam-se macrófagos de mamífero, preferentemente macrófagos humanos. Numa comparação de estirpes virulentas, não virulentas e atenuadas do complexo M. tuberculosis, infectam-se monócitos de sangue alveolar ou periférico a uma razão de 1:1 (Silver et al. (1998) Infect Immun 66(3):1190-1199; Paul et al (1996) J Infect Dis 174(1) 105-112). As percentagens de células infectadas pelas estirpes e os números iniciais de organismos intracelulares são equivalentes, bem como os níveis de viabilidade de monócitos até 7 dias após a infecção. Contudo, o crescimento intracelular reflecte a virulência ao longo de um período de uma ou mais semanas. O crescimento de micobactérias pode ser avaliado por coloração resistente a ácido, microscopia electrónica e ensaio de unidades formadoras de colónias (cfu). A produção pelos monócitos de factor alfa de necrose de tumor pode também ser monitorizada como um marcador para virulência.
Outros ensaios para virulência utilizam modelos animais. As bactérias do complexo M. tb. são capazes de infectar uma grande variedade de hospedeiros animais. Um modelo de especial interesse é a tuberculose com cavidades em coelhos utilizando aerossol de bacilos de tuberculose virulentos (Converse et al. (1996) Infect Immun 64(11):4776-4787). Em caseum liquefeito, os bacilos de tuberculose crescem extracelularmente pela primeira vez desde os primeiros sintomas da doença e podem atingir números tão elevados que se podem desenvolver mutantes com resistência antimicrobiana. Partindo de uma cavidade, os bacilos entram na árvore brônquica e propagam-se a outras regiões do pulmão e também a 29 ΕΡ 1 108 060/ΡΤ outras pessoas. Dos animais de laboratório habitualmente utilizados, o coelho é o único no qual se pode produzir rapidamente tuberculose com cavidades.
Podem formular-se vacinas de acordo com métodos conhecidos na especialidade. Administram-se vacinas das bactérias modificadas a um hospedeiro que pode ser exposto a tuberculose virulenta. Em muitos paises nos quais a tuberculose é endémica, pode efectuar-se vacinação à nascença com vacinações adicionais tal como necessárias. Administraram-se os compostos do presente invento numa dosaqem que se mostrou ser eficaz e minimizar quaisquer efeitos secundários. Considera-se que a composição será obtida e utilizada sob a orientação do médico assistente.
Podem formular-se estirpes de vacina de BCG convencionais numa combinação de vacina com polipéptidos identificados no presente invento e produzidos como anteriormente descrito, de modo a melhorar a eficácia da vacina.
Podem utilizar-se vários métodos para administração. A formulação pode ser injectada pelas vias intramuscular, intravascular, subcutânea, etc. A dosaqem será a convencional. As bactérias podem ser formuladas em composições farmacêuticas pela combinação com transportadores ou diluentes apropriados e farmaceuticamente aceitáveis e podem ser formuladas em preparações nas formas semi-sólida ou liquida, tais como soluções, injecções, etc. Os métodos e excipientes sequintes são meramente exemplificativos e não são restritivos.
Podem formular-se as bactérias modificadas em preparações para injecções pela sua dissolução, suspensão ou emulsificação num solvente aquoso ou não aquoso tal como óleos veqetais ou outros óleos semelhantes, glicéridos ácidos alifáticos sintéticos, ésteres de ácidos alifáticos de peso molecular elevado ou propilenoglicol; e caso pretendido com aditivos convencionais tais como solubilizantes, agentes isotónicos, agentes de suspensão, agentes emulsionantes, estabilizadores e conservantes. As formas de dosagem unitária para injecção ou administração intravenosa podem compreender 30 ΕΡ 1 108 060/ΡΤ as bactérias do presente invento numa composição como uma solução em água estéril, solução salina normal ou outro transportador farmaceuticamente aceitável. A expressão "forma de dosagem unitária" tal como aqui utilizada refere-se a unidades fisicamente discretas adequadas como dosagens unitárias para indivíduos humanos e animais, contendo cada unidade uma quantidade predeterminada de vacina calculada numa quantidade suficiente para produzir o efeito pretendido em associação com um diluente, transportador ou veículo farmaceuticamente aceitável. As especificações para as formas de dosagem unitária do presente invento dependem da bactéria especificamente utilizada e do efeito a obter e da farmacodinâmica associada a cada complexo no hospedeiro.
Os excipientes farmaceuticamente aceitáveis, tais como veículos, adjuvantes, transportadores ou diluentes estão facilmente disponíveis ao público. Além disso, estão facilmente disponíveis ao público substâncias auxiliares farmaceuticamente aceitáveis tais como agentes de ajuste e tamponamento de pH, agentes de ajuste de tonicidade, estabilizadores, agentes de molhagem e semelhantes.
Os exemplos seguintes são apresentados de modo a proporcionar aos peritos na especialidade uma revelação e descrição completas de como produzir e utilizar o invento em causa e não se pretende que limitem o âmbito do que é considerado o invento. Foi feito um esforço para assegurar rigor no respeitante aos valores apresentados (e.g. quantidades, temperatura, concentrações, etc.) mas devem permitir-se alguns erros e desvios experimentais. Salvo indicação em contrário, as partes são partes em peso, os pesos moleculares são pesos moleculares médios, a temperatura é em graus centígrados; e a pressão é a pressão atmosférica ou perto desta. 31 ΕΡ 1 108 060/ΡΤ PARTE EXPERIMENTAL Métodos :
Os métodos técnicos utilizados iniciam-se com extracção de ADN genómico completo a partir de bactérias crescidas em cultura.
Dia 1
Inocular o meio de cultura escolhido (LJ/7H9) e incubar a 35 °C até se obter crescimento abundante. Introduzir 500 μΐ de lx TE em cada tubo. (Caso o ADN esteja num meio liquido não é necessário TE.) Transferir 100 pfu (sedimento) de células para um tubo de microcentrifuga contendo 500 μΐ de lxTE. Caso se retire ADN de meio liquido, deixar que as células se depositem no fundo do frasco. Pipetar as células (cerca de 1 ml) para o tubo. Aquecer 20 min a 80 °C para matar as células, centrifugar, ressuspender em 500 μΐ de lxTE. Adicionar 50 μΐ de lisozima a 10 mg/ml, aplicar vortex, incubar durante a noite a 37 °C.
Dia 2
Adicionar 70 μΐ de SDS a 10% e 10 μΐ de proteínase K, aplicar vortex e incubar 20 min. a 65 °C. Adicionar 100 μΐ de NaCl 5 M. Adicionar 100 μΐ de solução de CTAB/NaCl, pré-aquecida a 65 °C. Aplicar vortex até o conteúdo liquido se tornar branco ("leitoso") . Incubar 10 min a 65 °C. Fora da hotte, preparar novos tubos de microcentrifuga marcados no topo com o número de cultura e na lateral com o número de cultura, número de tubo e data. Adicionar 550 μΐ de isopropanol a cada tubo e fechar a tampa. De volta à hotte, adicionar 750 μΐ de clorofórmio/álcool isoamilico, aplicar vortex durante 10 s. Centrifugar à temperatura ambiente durante 5 min. a 12 000 g. Transferir o sobrenadante aquoso em quantidades de 180 μΐ para um tubo novo utilizando um pipetador e tendo cuidado para não pipetar sólidos nem liquido não aquoso. Colocar 30 min a -20 °C. Centrifugar 15 min à temperatura ambiente numa microcentrifuga a 12 000 g. Rejeitar o sobrenadante; deixar cerca de 20 μΐ por cima do sedimento. Adicionar 1 ml de etanol a 70% frio e virar o tubo 32 ΕΡ 1 108 060/ΡΤ ao contrário algumas vezes. Centrifugar 5 min à temperatura ambiente numa microcentrifuga. Rejeitar o sobrenadante; deixar cerca de 20 μΐ por cima do sedimento. Centrifugar 1 min numa microcentrifuga e rejeitar cuidadosamente os últimos 20 μΐ de sobrenadante por cima do sedimento utilizando um pipetador (P-20). Assegurar-se que se removem quaisquer vestigios de etanol. Deixar o sedimento secar à temperatura ambiente durante 10 min ou no liofilizador "speed vac" 2-3 min. (Colocar os tubos abertos no "speed vac", fechar a tampa, iniciar o motor, ligar o vácuo. Após 3 min. carregar no botão vermelho, desligar o vácuo, desligar o motor. Verificar se os sedimentos estão secos dando pequenas pancadas no tubo e verificando se o sedimento se solta das paredes do tubo.) Redissolver o sedimento em 20-50 μΐ de água duplamente destilada. 20 para sedimentos pequenos, 30 para sedimentos de tamanho normal e 50 para sedimentos muito grandes. Pode armazenar-se o ADN a 4o C para utilização adicional.
Matriz de ADN: produziu-se fazendo manchas de fragmentos de ADN em lâminas de vidro de microscópio previamente tratadas com poli-L-lisina. A colocação de manchas na matriz foi efectuada por um robot para deposições em matriz. Reticulou-se o ADN ao vidro por aplicação de radiação ultravioleta e bloquearam-se os grupos livres de poli-L-lisina por tratamento com anidrido succinico a 0,05%, 1-metil-2-pirrolidinona a 50% e tampão de borato a 50%. A maioria das manchas na matriz foi de produtos derivados de PCR produzidos por selecção de entre 9000 pares de iniciadores concebidos para amplificar os quadros de leitura aberta previstos das sequências da estirpe H37Rv (ftp.sanger.ac.uk/pub/TB.seq). Incluiram-se também na matriz algumas manchas de padrões internos e de controlos negativos incluindo vectores de plasmideo e ADN não pertencente a M.tb.
Assim, com a preparação para uma matriz que continha o genoma completo de Mycobacterium tuberculosis, comparamos BCG-Connaught com Mycobacterium tuberculosis utilizando a matriz para hibridação competitiva. Segue-se o protocolo: 33 ΕΡ 1 108 060/ΡΤ
Protocolo de marcação de ADN. Adicionar 4 yg de ADN em 20 μΐ de H20, 2 ml de dN10N6 e 36 μΐ H20. Adicionar 2 ml de ADN de referência para cada amostra de ADN para um total de 60 μΐ. Ferver 3 minutos para desnaturar o ADN, seguidamente arrefecer rapidamente num banho de água gelada. Adicionar 1 μΐ de dNTP (ACG 5mM) , 10 μΐ de tampão 10, 4 μΐ de Klenow, 22 μΐ de H20 a cada tubo. Adicionar 3 μΐ de dUTP marcado com Cy3 ou Cy5 para um total de 100 μΐ. Incubar 3 horas a 37 °C.
Adicionar 11 μΐ de NaAc 3M, 250 μΐ de EtOH a 100% para precipitar, armazenar durante a noite a -20 °C. Centrifugar as amostras genómicas 30 minutos a 13K para sedimentar o precipitado. Rejeitar o sobrenadante, adicionar EtOH a 70%, centrifugar 15 minutos, rejeitar o sobrenadante e aplicar o "speed-vac" para secar. Tal proporciona ADN para duas experiências.
Protocolo de hibridação de ADN à micromatriz.
Ressuspender o ADN marcado em 11 μΐ de dH20 (para 2 matrizes). Correr 1 μΐ de ADN num gel de agarose a 1,5% para documentar a amostra a hibridar. Dos restantes 10 μΐ da solução, metade utilizar-se-á para esta hibridação e metade deixar-se-á para utilização posterior. Tirar 5μ1 de solução de Cy3 e adicionar a mesma quantidade de solução de Cy5 para um volume total de 10 μΐ de ADN marcado misturado. Adicionar 1 μΐ de ARNt, 2,75 μΐ de 20x SSC, 0,4 μΐ de SDS para um volume total de 14,1 μΐ. Colocar na lâmina no local da matriz, cobrir com lamela de 22 mm, cobrir com lâmina de vidro e apertar sobre dispositivos de borracha e seguidamente hibridar 4 horas a 65 °C. Após 4 horas, remover as lâminas de matriz dos dispositivos, deixar a lamela posta e mergulhar numa travessa de lâminas com tampão de lavagem consistindo de lx SSC com SDS a 0,05% durante cerca de 2 minutos. A lamela deve sair no banho. Após 2 minutos no tampão de lavagem, mergulhar uma vez num banho com 0,06x SSC, enxaguar novamente em 0,06x SSC num banho separado. Secar as lâminas numa centrifuga a cerca de 600 rpm. Estão agora prontas para análise de varrimento.
Análise de varrimento de fluorescência e aquisição de dados. Estabeleceu-se análise de varrimento de fluorescência 34 ΕΡ 1 108 060/ΡΤ para 20 micra/pixel e obtiveram-se duas leituras por pixel. Os dados para o canal 1 foram estabelecidos para ler fluorescência de Cy3 com excitação a 520 nm e emissão a 550-600 nm. 0 canal 2 recolheu sinais excitados a 647 nm e emitindo a 660-705 nm adequado para Cy5. Não se aplicaram filtros de densidade neutra ao sinal de qualquer dos canais e estabeleceu-se o qanho do tubo fotomultiplicador a 5. Efectuaram-se então ajustes mais finos ao qanho do fotomultiplicador de modo a que os sinais recolhidos das duas manchas contendo ADN genómico fossem equivalentes.
Para analisar o sinal de cada mancha da matriz, aplicou-se uma grelha com 14X14 caixas aos dados recolhidos da matriz de modo a que os sinais do interior de cada caixa fossem integrados e atribuiu-se um valor à mancha correspondente. Obteve-se um valor de base para cada mancha por integração dos sinais medidos 2 pixels fora do perimetro da caixa correspondente. Importaram-se os valores do sinal e o valor de base para cada mancha para um programa de folha de cálculo para análise posterior. Subtrairam-se os valores de base dos sinais e aplicou-se um factor de 1,025 a cada valor no canal 2 para normalizar os dados relativamente aos sinais provenientes das manchas de ADN genómico.
Dado que as duas amostras estão marcadas com corantes fluorescente diferentes, é possivel determinar se uma mancha de ADN de uma matriz hibridou com Mycobacterium tuberculosis (corante verde) mas não com BCG (corante vermelho), demonstrando assim uma deleção provável do genoma de BCG.
Contudo, devido à matriz agora conter manchas que representam 4000 manchas, pode esperar-se até 100 manchas com hibridação com dois desvios padrão acima ou abaixo da média. Consequentemente, concebemos um protocolo de rastreio segundo o qual se procura hibridação com desemparelhamentos em dois genes consecutivos do genoma. Consequentemente, estamos agora essencialmente à procura de deleções de genes múltiplos.
Para confirmar que um gene ou grupo de genes está deletado, efectuamos hibridação "Southern" utilizando uma 35 ΕΡ 1 108 060/ΡΤ sonda independente para o ADN na matriz. Aplicam-se digestões de diferentes ADN de micobactérias num gel de agarose e transferem-se para membranas. Podem utilizar-se repetidamente as membranas para sondar diferentes sequências de ADN. Para os objectivos deste projecto incluimos ADN da estirpe de referência de Mycobacterium tuberculosis (H37Rv), de outras estirpes de laboratório tal como H37Ra, da estirpe 0 de isolados clinicos, da estirpe de referência de Mycobacterium bovis e de diferentes estirpes de Mycobacterium bovis BCG.
Após confirmação da deleção por hibridação "Southern" seguimos para a caracterização da localização genómica exacta. Tal efectua-se por utilização da reacção de polimerização em cadeia com iniciadores concebidos para se situarem perto dos limites da deleção, consultar Talbot (1997) J Clin Micro. 35: 566-9
Escolheram-se iniciadores para amplificação ao longo da região deletada. Apenas se obtém um produto de amplificação na ausência desta região. Analisaram-se os produtos de PCR por electroforese (agarose a 1,5%) e coloração por brometo de etidio.
Após obtenção de um produto de amplificação curto sequencia-se então este produto de amplificação. Efectua-se uma busca na base de dados do genoma para determinar se a sequência é exactamente idêntica a uma parte do genoma de Mycobacterium tuberculosis e se a próxima parte do produto de amplificação é exactamente idêntica a outra parte do genoma de Mycobacterium tuberculosis. Tal permite uma identificação precisa do local da deleção.
Segue-se um exemplo do tipo de relatório obtido: rd6 por PCR em ponte, busca de sequências blast 36 ΕΡ 1 108 060/ΡΤ emb|Z7970l|MTCY277 Mycobacterium tuberculosis cosmid Y277 Length = 38,908 Plus Strand HSPs:
Score = G43 (177.7 bits), Expect = 1.6e-54, Sum P(2> = l.6e-54 Identities = 129/131 (98%), Positives = 129/131 (98%), Strand = Plus /
Plus
Query: 12 ANTAGTAATGTGCGAGCTGAGCGATGTCGCCGCTCCCAAAAATTACCAATGGTTNGGTCA 71
I i 11II!!! I! 11IIII Μ 11 i II111! Μ Μ 11! III!! 1111II11! IIII MIM
Sbj ct: 24784 AGTAGTAATGTGCGAGCTGAGCGATGTCGCCGCTCCCAAAAATTACCAATGGTTTGGTCA Query: 72 TGACGCCTTCCTAACCAGAATTGTGAATTCATACAAGCCGTAGTCGTGCAGAAGCGCAAC
Sbj ct: 24844 TGACGCCTTCCTAACCAGAATTGTGAATTCATACAAGCCGTAGTCGTGCAGAAGCGCAAC Query: 132 ACTCTTGGAGT 142 lllllllllll
Sbjct: 24904 ACTCTTGGAGT 24914
Score = 224 (61,9 bits), Expect a l;6e-S4, Sum P(2) a l.6e-54 Identities = 46/49 (93%), Positives = 46/49 (93%), Strand = Plus / Plus Query: 141 GTGGCCTACAACGGNGCTCTCCGNGGCGCGGGCGTACCGGATATC7TAG 189 ! miimiMi mimi 1111111111111111111111111
Sbjct: 37645 GCGGCCTACAACGGCGCTCTCCGCGGCGCGGGCGTACCGGATATCTTAG 37693
Repete-se este processo com cada deleção sugerida, com início nas três deleções anteriormente descritas que servem como controlos. Identificaram-se dezasseis deleções com estes métodos e apresentam-se na tabela 1.
Considera-se que este invento não está limitado a esta metodologia, protocolos, formulações e reagentes descritos em particular, dado que estes podem obviamente variar. Considera-se também que a terminologia aqui utilizada tem o objectivo de descrever apenas concretizações específicas e não se pretende que limite o âmbito do presente invento que será apenas limitado pelas reivindicações anexas. 37 ΕΡ 1 108 060/ΡΤ
Note-se que tal como aqui utilizado e nas reivindicações anexas, as formas singulares "um/uma", "e" e "o/a" incluem os respectivos plurais salvo se o contexto indicar claramente o contrário. Assim, por exemplo, a referência a "um complexo" inclui uma pluralidade de tais complexos e a referência a "a formulação" inclui referência a uma ou mais formulações e seus equivalentes conhecidos dos peritos na especialidade e assim sucessivamente.
Salvo definição em contrário, todas as expressões técnicas e cientificas aqui utilizadas têm o mesmo significado tal como habitualmente considerado pela pessoa pessoa competente na matéria à qual este invento pertence. Apesar de quaisquer métodos, dispositivos e materiais semelhantes ou equivalentes aos aqui descritos poderem ser utilizados na prática ou ensaio do invento, descrevem-se agora os métodos, dispositivos e materiais preferidos.
As publicações discutidas anteriormente e ao longo do texto são proporcionadas apenas quanto à sua divulgação antes da data de apresentação do presente pedido. Nada aqui deve ser interpretado como um reconhecimento de que os inventores não têm direito a reivindicar precedência sobre tal divulgação em virtude da invenção anterior.
Lisboa, 2010-07-28
Claims (13)
- ΕΡ 1 108 060/ΡΤ 1/3 REIVINDICAÇÕES 1. Polipéptido codificado por pelo menos 25 nucleótidos do quadro de leitura aberta Rv2654c atgagcggcc acgcgttggc tgctcggacg ttgctggccg ccgcggacga gcttgtcggc ggcccgccag tcgaggcttc ggccgccgcg ctggccggcg acgccgcggg cgcatggcgg accgcggccg tcgagcttgc gcgagcgttg gtccgcgctg tggcggagtc gcacggcgtc gcggccgttt tgttcgccgc gacggccgcc gcggcggcgg ccgtcgaccg gggtgatccg ccgtg para utilização num método de diagnóstico in vivo.
- 2. Polipéptido tal como definido na reivindicação 1, codificado pelo quadro de leitura aberta Rv2654c para utilização, de acordo com a reivindicação 1, no diagnóstico in vivo de tuberculose provocada por um membro do complexo de tuberculose.
- 3. Utilização de um polipéptido tal como definido na reivindicação 1, codificado pelo quadro de leitura aberta Rv2654c, no fabrico de uma composição para o diagnóstico in vivo de tuberculose provocada por um membro do complexo de tuberculose.
- 4. Polipéptido tal como definido na reivindicação 1, para utilização de acordo com a reivindicação 1, em que o polipéptido está fundido com um parceiro de fusão.
- 5. Polipéptido tal como definido na reivindicação 1, para a utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 ou 3 em que o membro do complexo de tuberculose é Mycobacterium tuberculosis.
- 6. Polipéptido tal como definido na reivindicação 1, para a utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 ou 3 em que o membro do complexo de tuberculose é Mycobacterium bovis.
- 7. Método para determinar se um paciente foi exposto a um membro do complexo de tuberculose, compreendendo o método pôr em contacto uma amostra do paciente com um polipéptido ΕΡ 1 108 060/ΡΤ 2/3 codificado por pelo menos 25 nucleótidos do quadro de leitura aberta Rv2654c. atgagcggcc acgcgttggc tgctcggacg ttgctggccg ccgcggacga gcttgtcggc ggcccgccag tcgaggcttc ggccgccgcg ctggccggcg acgccgcggg cgcatggcgg accgcggccg tcgagcttgc gcgagcgttg gtccgcgctg tggcggagtc gcacggcgtc gcggccgttt tgttcgccgc gacggccgcc gcggcggcgg ccgtcgaccg gggtgatccg ccgtg cujo polipéptido não tem reactividade cruzada para exposição a BCG; e determinar a presença de uma reacção imunitária ao referido polipéptido, em que uma resposta positiva é indicativa de exposição ao complexo de tuberculose.
- 8. Método de acordo com a reivindicação 7 em que o membro do complexo de tuberculose é Mycobacterium tuberculosis.
- 9. Método de acordo com a reivindicação 7 em que o membro do complexo de tuberculose é Mycobacterium bovis.
- 10. Método da reivindicação 7, em que a referida amostra compreende uma amostra de sangue ou seu derivado.
- 11. Método de acordo com a reivindicação 10, em que a referida etapa de determinação compreende: detectar ligação de um anticorpo ao referido polipéptido, sendo a referida ligação uma indicação de que o referido indivíduo está infectado com Mycobacterium tuberculosis ou está doente com Mycobacterium tuberculosis.
- 12. Composição de diagnóstico compreendendo o polipéptido codificado por pelo menos 25 nucleótidos do quadro de leitura aberta Rv2654c: atgagcggcc acgcgttggc tgctcggacg ttgctggccg ccgcggacga gcttgtcggc ggcccgccag tcgaggcttc ggccgccgcg ctggccggcg acgccgcggg cgcatggcgg accgcggccg tcgagcttgc gcgagcgttg gtccgcgctg tggcggagtc gcacggcgtc gcggccgttt tgttcgccgc gacggccgcc gcggcggcgg ccgtcgaccg gggtgatccg ccgtg em combinação com um meio, adequado para injecção subcutânea. ΕΡ 1 108 060/ΡΤ 3/3
- 13. Composição compreendendo ο polipéptido codificado por pelo menos 25 nucleótidos do quadro de leitura aberta Rv2 654c; atgagcggcc . acgcgttggc tgctcggacg ttgctggccg ccgcggacga gcttgtcggc ggcccgccag tcgaggcttc ggccgccgcg ctggccggcg acgccgcggg cgcatggcgg accgcggccg tcgagcttgc gcgagcgttg gtccgcgctg tggcggagtc gcacggcgtc gcggccgttt tgttcgccgc gacggccgcc gcggcggcgg ccgtcgaccg gggtgatccg ccgtg em combinação com uma amostra de sangue humano ou seu derivado para análise. Lisboa, 2010-07-28
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