PT1719528E - Composições e métodos para tratamento de angiogénese em lesões patológicas - Google Patents

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PT1719528E
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tumor
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fusion protein
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Barbara Carnemolla
Laura Borsi
Luciano Zardi
Dario Neri
Fredrik Nilsson
Lorenzo Tarli
Cornelia Halin
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Philogen Spa
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Description

ΕΡ 1 719 528/ΡΤ
DESCRIÇÃO "Composições e métodos para tratamento de angiogénese em lesões patológicas" A presente invenção refere-se ao tratamento de lesões de angiogénese patológica, especialmente tumores, artrite reumatóide, retinopatia diabética, degeneração macular relacionada com a idade e angiomas. Aspectos da presente invenção utilizam um conjugado ou fusão de uma molécula que exerce um efeito citotóxico ou biocida sobre células alvo nas lesões e um anticorpo dirigido contra um componente da matriz extracelular que está presente nestas lesões. 0 anticorpo é dirigido contra ED-B de fibronectina. A molécula citotóxica ou biocida é o Factor de Necrose Tumoral α (TNFa). Dirigindo moléculas bioactivas para um componente de matriz extracelular pode-se conseguir a morte de células alvo.
Os tumores não podem crescer para além de uma determinada massa sem a formação de novos vasos sanguíneos (angiogénese), e foi descrita uma correlação entre a densidade dos microvasos e a invasividade tumoral para uma variedade de tumores (1). As moléculas capazes de se direccionarem selectivamente para marcadores de angiogénese criam oportunidades clínicas para o diagnóstico e terapia de tumores e outras doenças caracterizadas por proliferação vascular, tais como a artrite reumatóide, a retinopatia diabética e a degeneração macular relacionada com a idade (2-8). 0 domínio ED-B da fibronectina, uma sequência de 91 aminoácidos idêntica em ratinhos, ratos e seres humanos, que é inserida através de splicing alternativo na molécula de fibronectina, acumula-se especificamente em torno de estruturas neovasculares e representa um alvo para intervenção molecular (9-11). Utilizando um anticorpo recombinante humano (L19) para o domínio ED-B foi demonstrada a possibilidade de direccionamento in vivo para a neovasculatura em diferentes modelos tumorais (12,13). A presente invenção é baseada no trabalho experimental dos inventores utilizando um anticorpo dirigido contra o domínio ED-B da fibronectina, observado na angiogénese em lesões patológicas, tais como tumores, conjugado com moléculas 2 ΕΡ 1 719 528/ΡΤ que exercem efeitos citotóxicos ou biocidas em células alvo Algumas destas moléculas podem interactuar com um receptor ligado à membrana na célula alvo ou perturbar o potencial electroquimico da membrana celular. Os exemplos de moléculas aqui demonstrados experimentalmente incluem interleucina-2 (IL-2), factor tecidular, doxorubicina, interleucina-12 (IL— 12), Interferão-γ (IFN-γ) e Factor de Necrose Tumoral α (TNFa) . A presente invenção refere-se a conjugados com TNFa. 0 Factor de Necrose Tumoral α (TNFa) é uma citoquina produzida por muitos tipos de células, principalmente monócitos e macrófagos activados. É expresso na forma de uma proteína precursora transmembranar integral de 26 kDa a partir da qual é libertada uma proteína madura de aproximadamente 17kDa por clivagem proteolítica. 0 TNFa solúvel bioactivo é um homotrímero que interactua com dois receptores da superfície celular diferentes (Tartaglia L.A., et al J. Biol. Chem., 268: 18542-18548, 1993), p55TNFR (50-60 kDa) e p75TNFR (75-80 kDa). 0 p75TNFR é específico da espécie; de facto, o TNFa humano não se liga a este receptor de ratinho. O TNFa pode induzir necrose hemorrágica de tumores sólidos transplantados, in vivo (Carswell E.A., et al, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 72: 3666-3670, 1975), e pode exercer actividade citotóxica in vitro contra algumas linhas de células tumorais (Helson L., et al, Nature, 258: 731-732. 1975). A eficiência antitumoral do TNFa em alguns modelos animais suscitou esperanças sobre a sua possível utilização como agente terapêutico no cancro humano. Ensaios clínicos realizados para demonstrar a eficácia antitumoral do TNFa, mostraram, contudo, que doses terapeuticamente eficazes administradas sistemicamente eram acompanhadas de níveis inaceitavelmente elevados de toxicidade sistémica, sendo a hipotensão o efeito tóxico mais comum limitante da dose. Adicionalmente, o TNFa possui uma depuração muito rápida a partir do sistema sanguíneo (semivida plasmática geralmente inferior a 30 minutos) (Blick M.M et al. Câncer Res., 47: 2989, 1987), que diminui a concentração hemática sob níveis terapêuticos, muito rapidamente. Conseguiram-se bons resultados clínicos em seres humanos apenas em tratamentos loco-regionais de tumores não disseminados (e.g., perfusão de 3 ΕΡ 1 719 528/ΡΤ membros isolados para sarcoma e melanoma) (Franker D. L., et al, Important Adv. Oncol. 179-192, 1994.) A actividade antitumoral do TNFa em muitos modelos animais parece ser devida a uma combinação de um efeito tóxico directo (em combinação com factores derivados do tumor que sinergizam com TNFa) em células endoteliais da vasculatura tumoral crescente (Clauss M., et al. J. Biol Chem., 265:7078-7083, 1990a), assim como a alterações das propriedades hemostáticas de células endoteliais proliferantes na angiogénese tumoral (Clauss., et al J. Exp. Med., 172:1535-1545, 1990b). Existem também evidências de um efeito citotóxico directo sobre células tumorais. Os efeitos indirectos (mediados pelo hospedeiro) do TNFa, tais como a indução de imunidade dependente de células T, podem contribuir para a regressão tumoral em modelos animais (Palladino Jr. M.A., et al. J Immunol., 138:4023-4032, 1987).
Nas experiências descritas abaixo, os inventores construíram e expressaram em células de mamífero uma proteína de fusão anticorpo-TNFa murino (mTNFa), sendo o anticorpo L19 dirigido contra um componente da matriz extracelular (ECM) presente na angiogénese em lesões patológicas (em particular B-FN) . Experiências de biodistribuição in vivo em ratinhos portadores de tumores demonstraram a acumulação da proteína de fusão em torno de novos vasos sanguíneos tumorais em formação. A proteína de fusão foi testada em experiências terapêuticas em animais portadores de tumores e verificou-se, surpreendentemente, que induz um efeito antitumoral e que é activa na redução do crescimento tumoral .
Breve Descrição das Figuras A Figura 1 mostra uma representação esquemática da construção de ADNc de scFv L19-mTNFa. ADNc de scFv L19 e de mTNFa foram fundidos geneticamente com um ligante de ADN que codifica para 15 aminoácidos (SSSSG)3 e clonados no vector de expressão de mamífero pcDNA3, utilizando os locais de restrição HindiII e NotI. A caixa sombreada com linhas representa a sequência do promotor de CMV, a caixa a cheio representa a sequência genómica do péptido de sinal de comando de secreção (intrão — dentro da sequência genómica) e as caixas a branco representam as sequências de mTNFa e de VH ou VL de scFV-Ll9. T7, BC679, BC742 e BC749 e iniciadores 4 ΕΡ 1 719 528/ΡΤ utilizados nas amplificações por PCR descritas em Materiais e Métodos. A Figura 2 mostra a actividade biológica da porção mTNFa da proteína de fusão () e de mTNFa recombinante (A) medida através de ensaio de toxicidade sobre fibroblastos L-M de ratinho (veja-se Materiais e Métodos no Exemplo 1). A Figura 3 é um gráfico (em função do tempo) do volume de carcinoma do cólon murino C51 implantado subcutaneamente em ratinhos Balb/C que foram injectados intravenosamente com scFV(L19)-mTNFa ou PBS (como controlo negativo). A injecção é indicada pela seta e realizada quando os tumores tinham aproximadamente 100-200mm3. Estão indicados os erros padrão. A invenção proporciona a utilização de um conjugado de (i) uma molécula que exerce um efeito citotóxico ou biocida sobre células alvo por interacção celular, nomeadamente Factor de Necrose Tumoral α (TNFa) , e (ii) um membro de ligação específica Fv de cadeia única específico para um componente da matriz extracelular que está presente na angiogénese em lesões patológicas, nomeadamente ED-B da fibronectina, no fabrico de um medicamento para tratamento de angiogénese patológica.
Num outro aspecto, a invenção proporciona um conjugado de (i) uma molécula que exerce um efeito citotóxico ou biocida sobre célula alvo por interacção celular, nomeadamente TFNa e (ii) um membro de ligação específica Fv de cadeia única específico para um componente da matriz extracelular que está presente na angiogénese em lesões patológicas, nomeadamente ED-B da fibronectina, para utilização num método de tratamento do corpo humano ou animal por terapia. Este tratamento pode ser de lesões patológicas compreendendo angiogénese.
Ainda um outro aspecto da invenção proporciona um conjugado de (i) uma molécula que exerce um efeito citotóxico ou biocida sobre célula alvo por interacção celular, nomeadamente TNFa, e (ii) um membro de ligação específica Fv de cadeia única específico para um componente da matriz extracelular que está presente na angiogénese em lesões patológicas, nomeadamente ED-B de fibronectina. Este conjugado compreende preferivelmente uma proteína de fusão compreendendo a molécula citotóxica ou biocida e um referido membro de ligação específica. 5 ΕΡ 1 719 528/ΡΤ Ο membro de ligação especifica é uma molécula de anticorpo Fv de cadeia única, i.e. scFv. Assim, um outro aspecto da presente invenção proporciona uma proteína de fusão compreendendo a molécula citotóxica ou biocida e uma molécula de anticorpo Fv de cadeia única específico um componente da matriz extracelular que está presente em lesões compreendendo angiogénese, especialmente um componente da matriz extracelular associado ao tumor. 0 componente que permite o direccionamento discriminado para a matriz extracelular de lesões patológicas relativamente à normal é ED-B da fibronectina. 0 membro de ligação específica é um anticorpo Fv de cadeia única. Isto permite a produção conveniente de uma proteína de fusão que compreende o anticorpo de cadeia única e a molécula citotóxica ou biocida. 0 membro de ligação específica é específico para ED-B da fibronectina.
Um local de ligação de um anticorpo ao antigénio utilizado num membro de ligação específica de acordo com a presente invenção pode incluir os domínios VH e/ou VL do anticorpo L19 ou um anticorpo que compita com L19 pela ligação a ED-B. As sequências dos domínios L19 VH e L19 VL são divulgadas em Pini et al. (1998) J. Biol. Chem. 273: 21769- 21776.
Como assinalado, preferivelmente, o membro de ligação específica é conjugado com a molécula citotóxica ou biocida através de uma ligação peptídica, i.e., dentro de um polipéptido de fusão que compreende a referida molécula e o membro de ligação específica ou um seu componente da cadeia polipeptídica. Outros meios para conjugação incluem conjugação química, especialmente reticulação utilizando um reagente bifuncional (e.g., utilizando o ADOUBLE-REAGENTS @ Cross-linking Reagents Selection Guide, Pierce).
Quando é desejável a libertação lenta, e.g. quando a molécula citotóxica ou biocida é a doxorubicina ou outra molécula que perturba o potencial electroquímico da membrana celular, a conjugação química pode ser efectuada através da 6 ΕΡ 1 719 528/ΡΤ formação de uma base de Schiff (imina) entre um grupo amino primário do membro de ligação especifica (um polipéptido tal como um anticorpo ou um fragmento de anticorpo) e uma porção de açúcar oxidado (daunosamina) da molécula citotóxica ou biocida tal como doxorubicina. A lesão tratada pode ser um tumor incluindo, sem limitação, qualquer um ou mais dos seguintes: melanoma, neuroblastoma, carcinoma colorrectal, carcinoma renal, carcinoma pulmonar, metástases pulmonares, carcinoma da mama, astrocitoma de grau elevado (grau III, grau IV), meningioma, angioma. A lesão pode ser ocular, e.g. , originária de degeneração macular relacionada com a idade, em que a angiogénese surge a partir de vasos coróides.
Membro de ligação específica
Esta expressão descreve um membro de um par de moléculas que têm especificidade de ligação entre si. Os membros de um par de ligação especifica podem ser derivados naturalmente ou, total ou parcialmente produzidos sinteticamente. Um membro do par de moléculas tem uma área na sua superfície, ou uma cavidade, que se liga especif icamente a, e é portanto complementar a, uma organização espacial e polar particular do outro membro do par de moléculas. Assim, os membros do par têm a propriedade de se ligarem especificamente entre si.
Anticorpo
Este termo descreve uma imunoglobulina, quer natural, quer total ou parcialmente produzida sinteticamente. 0 termo também cobre qualquer polipéptido ou proteína possuindo um domínio de ligação que é, ou é substancialmente, homólogo a um domínio de ligação do anticorpo ao antigénio. Estes podem ser derivados a partir de fontes naturais, ou podem ser total ou parcialmente produzidos sinteticamente. Os exemplos de anticorpos são os isotipos de imunoglobulina e as suas subclasses isotípicas; fragmentos que compreendem um domínio de ligação ao antigénio, tal como Fab, scFv, Fv, dAb, Fd; e diacorpos. 7 ΕΡ 1 719 528/ΡΤ É possível tomar anticorpos monoclonais e outros anticorpos e utilizar técnicas de tecnologia de ADN recombinante para produzir outros anticorpos ou moléculas quiméricas que retêm a especificidade do anticorpo original. Essas técnicas podem envolver a introdução de ADN que codifica a região variável da imunoglobulina, ou as regiões determinantes de complementaridade (CDR) , de um anticorpo nas regiões constantes, ou regiões constantes mais as regiões de estrutura, de uma imunoglobulina diferente. Ver, por exemplo, EP-A-184187, GB 2188638A ou EP-A-239400. Um hibridoma, ou outra célula produtora de um anticorpo, podem ser submetidos a mutação genética ou outras alterações, que podem ou não alterar a especificidade de ligação dos anticorpos produzidos.
Como os anticorpos podem ser modificados de várias formas, o termo "anticorpo" deve ser interpretado como cobrindo qualquer membro de ligação específica que tenha um domínio de ligação do anticorpo ao antigénio com a especificidade requerida. Assim, este termo cobre fragmentos, derivados, equivalentes funcionais e homólogos de anticorpos, incluindo qualquer polipéptido compreendendo um domínio de ligação de imunoglobulina, quer natural, quer total ou parcialmente sintético. Estão deste modo incluídas moléculas quiméricas compreendendo um domínio de ligação de imunoglobulina, ou equivalente, fundido com outro polipéptido. A clonagem e expressão de anticorpos quiméricos estão descritas em EP-A-0120694 e EP-A-0125023.
Foi demonstrado que fragmentos de um anticorpo completo podem realizar a função de ligação a antigénios. Os exemplos de fragmentos de ligação são (i) o fragmento Fab consistindo em domínios VL, VH, CL e CHI; (ii) o fragmento Fd consistindo em domínios VH e CHI; (iii) o fragmento Fv consistindo em domínios VL e VH de um anticorpo único; (iv) o fragmento cLAb (Ward, E.S. et al., Nature 341, 544-546 (1989)) que consiste num domínio VH; (v) regiões CDR isoladas; (vi) fragmentos F(ab')2, um fragmento bivalente que compreende dois fragmentos Fab ligados (vii) moléculas Fv de cadeia única (scFv), em que um domínio VH e um domínio VL estão ligados através de um ligante peptídico que permite que os dois domínios se associem para formar um local de ligação ao antigénio (Bird et al., Science, 242, 423-426, 1988; Huston et al. , PNAS USA, 85, 5879-5883, 1988); (viii) dímeros de Fv de cadeia única 8 ΕΡ 1 719 528/ΡΤ biespecíficos (PCT/US92/09965) e (ix) "diacorpos", fragmentos multivalentes ou multiespecíficos construídos através de fusão génica (WO94/13804; P. Holliger et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90 6444-6448, 1993) . As moléculas de Fv, scFv ou diacorpo podem ser estabilizadas através da incorporação de pontes de dissulfureto que ligam os domínios VH e VL (Y. Reiter et al. , Nature Biotech, 14, 1239-1245, 1996). Também podem ser produzidos minicorpos que compreendem um scFv ligado a um domínio CH3 (S. Hu et al. , Câncer Res., 56 , 3055-3061 , 1996).
Domínio de ligação ao antigénio
Esta expressão descreve a parte de um anticorpo que compreende a área que se liga especificamente a, e é complementar a, parte ou a totalidade de um antigénio. Quando um antigénio é grande, um anticorpo pode ligar-se apenas a uma parte particular do antigénio, parte esta denominada um epítopo. Um domínio de ligação ao antigénio pode ser proporcionado por um ou mais domínios variáveis de anticorpo (e.g., um denominado fragmento de anticorpo Fd consistindo num domínio VH). Preferivelmente, um domínio de ligação ao antigénio compreende uma região variável da cadeia leve de anticorpo (VL) e uma região variável da cadeia pesada de anticorpo (VH).
Específico
Este termo pode ser utilizado para referir a situação em que um membro de um par de ligação específica não irá apresentar qualquer ligação significativa a outras moléculas que não o(s) seu(s) parceiro(s) de ligação específica. O termo é também aplicável onde, e.g., um domínio de ligação ao antigénio é específico para um epítopo particular que está presente numa variedade de antigénios, caso em que o membro de ligação específica que contém o domínio de ligação ao antigénio será capaz de se ligar aos vários antigénios que contêm o epítopo.
Compreender
Este termo é geralmente utilizado no sentido de incluir, isto é, permitir, a presença de uma ou mais características ou componentes. 9 ΕΡ 1 719 528/ΡΤ
Isolado
Este termo refere-se ao estado em que membros de ligação especifica da invenção, ou ácidos nucleicos que codificam esses membros de ligação, serão geralmente utilizados de acordo com a presente invenção. Os membros e os ácidos nucleicos estarão livres, ou substancialmente livres, de material com o qual estão naturalmente associados, tal como outros polipéptidos ou ácidos nucleicos com os quais são encontrados no seu ambiente natural, ou no ambiente em que são preparados (e.g., cultura celular) quando essa preparação é através de tecnologia de ADN recombinante in vitro ou in vivo. Os membros e os ácidos nucleicos podem ser formulados com diluentes ou adjuvantes e ainda serem isolados para fins práticos, por exemplo, os membros serão normalmente misturados com gelatina ou outros transportadores se utilizados para revestir placas de microtitulação para utilização em imunoensaios, ou serão misturados com transportadores ou diluentes farmaceuticamente aceitáveis quando utilizados em diagnóstico ou terapia. Os membros de ligação especifica podem ser glicosilados, quer naturalmente, quer através de sistemas de células eucarióticas heterólogas (e.g.r células CHO ou NSO (ECACC 85110503), ou podem ser (por exemplo se produzidos por expressão numa célula procariótica) não glicosilados.
Como notado, quando se pretende utilizar em concretizações da presente invenção um domínio de ligação do anticorpo ao antigénio, dirigido contra ED-B da fibronectina, um tal domínio preferido compreende os domínios VH e VL do anticorpo L19. Podem ser utilizadas formas modificadas de um ou outro destes domínios em concretizações adicionais, e.g. , o domínio VH de L19 ou VL de L19 em que foram realizadas 1, 2, 3, 4 ou 5 substituições de aminoácidos numa CDR, e.g. , CDR3, e/ou FR, cujos membros de ligação específica retêm a capacidade para ligar ED-B da fibronectina. Essas substituições de aminoácidos são geralmente "conservativas", por exemplo, substituição de um resíduo hidrófobo tal como isoleucina, valina, leucina ou metionina por outro, ou a substituição de um resíduo polar por outro, tal como lisina por arginina, ácido aspártico por ácido glutâmico, ou asparagina por glutamina. Em determinadas posições são permitidas substituições não conservativas. 10 ΕΡ 1 719 528/ΡΤ A presente invenção estende-se adicionalmente à utilização de um membro de ligação especifica que compita com o anticorpo L19 pela ligação a ED-B da fibronectina. A competição entre membros de ligação pode ser ensaiada facilmente in vitro, por exemplo por marcação com uma molécula repórter especifica de um membro de ligação que possa ser detectada na presença de outro(s) membro(s) de ligação não marcado(s) , para permitir a identificação de membros de ligação especifica que se ligam ao mesmo epitopo ou a um epitopo sobreposto.
Para além de sequências de anticorpo, um membro de ligação especifica utilizado de acordo com a presente invenção pode compreender outros aminoácidos, e.g. , que formam um péptido ou polipéptido, tal como um domínio enrolado, ou para conferir à molécula outra caracteristica funcional para além da capacidade de ligar o antigénio. Os membros de ligação especifica da invenção podem possuir um marcador detectável.
Os membros de ligação especifica de acordo com a invenção podem ser utilizados num método de tratamento do corpo humano ou animal, tal como um método de tratamento (que pode incluir tratamento profiláctico) de uma doença ou desordem num paciente humano que compreenda a administração ao referido paciente de uma quantidade eficaz de um membro de ligação específica da invenção. As condições tratáveis de acordo com a presente invenção são aqui discutidas noutra parte.
Deste modo, aspectos adicionais da invenção proporcionam composições farmacêuticas que compreendendo o membro de ligação específica, e a utilização de tal membro de ligação específica no fabrico de um medicamento para administração, por exemplo, num método de preparação de um medicamento ou de uma composição farmacêutica compreendendo a formulação do membro de ligação especifica com um excipiente farmaceuticamente aceitável.
As composições proporcionadas podem ser administradas a indivíduos. A administração é preferivelmente numa "quantidade terapeuticamente eficaz", sendo esta suficiente para apresentar benefício a um paciente. Esse beneficio pode ser, pelo menos, a melhoria de pelo menos um sintoma. A quantidade efectiva administrada, e a taxa e decurso ao longo do tempo da administração, dependerão da natureza e da gravidade do que 11 ΕΡ 1 719 528/ΡΤ está a ser tratado. A prescrição do tratamento, e.g., decisões sobre dosagem, etc., faz parte da responsabilidade de médicos assistentes de clinica geral e outros médicos. As doses apropriadas de anticorpo são bem conhecidas na especialidade; ver Ledermann J.A. et al. (1991) Int J. Câncer 47: 659-664; Bagshawe K.D. et al. (1991) Antibody, Immunoconjugates and Radiopharmaceuticals 4: 915-922.
Uma composição pode ser administrada isoladamente ou em combinação com outros tratamentos, quer simultânea ou sequencialmente dependendo da condição a tratar.
Os membros de ligação especifica da presente invenção, incluindo aqueles que compreendem um domínio de ligação do anticorpo ao antigénio, podem ser administrados a um paciente com necessidade do tratamento através de qualquer via adequada, geralmente por injecção na corrente sanguínea e/ou directamente no sítio a tratar, e.g., tumor. A dose precisa irá depender de vários factores, da via de tratamento, do tamanho e localização da área a tratar (e.g., tumor), da natureza precisa do anticorpo (e.g. , anticorpo completo, molécula de scFv), e da natureza de qualquer marcador detectável ou outra molécula ligada ao anticorpo. Uma dose típica de anticorpo estará na gama de 10-50 mg. Esta é uma dose para um único tratamento de um doente adulto, que pode ser ajustada proporcionalmente para crianças e lactentes, e ajustada também para outros formatos de anticorpo em proporção do peso molecular. Os tratamentos podem ser repetidos em intervalos diários, bissemanais, semanais ou mensais, à discrição do médico.
Os membros de ligação específica da presente invenção serão geralmente administrados na forma de uma composição farmacêutica, que pode compreender, pelo menos, um componente para além do membro de ligação especifica.
Assim, as composições farmacêuticas de acordo com a presente invenção, e para utilização de acordo com a presente invenção, podem compreender, para além do ingrediente activo, um excipiente, um transportador, um tampão, um estabilizante ou outros materiais farmaceuticamente aceitáveis, bem conhecidos dos peritos na especialidade. Esses materiais não devem ser tóxicos e não devem interferir com a eficácia do ingrediente activo. A natureza precisa do transportador ou 12 ΕΡ 1 719 528/ΡΤ outro material irá depender da via de administração, que pode ser oral, ou por injecção, e.g., intravenosa.
Para injecção intravenosa ou injecção no sitio da afecção, o ingrediente activo estará na forma de uma solução aquosa parentericamente aceitável que é isenta de pirogénios e tem pH, isotonicidade e estabilidade adequados. Os peritos na especialidade são bem capazes de preparar soluções adequadas utilizando, por exemplo, veículos isotónicos, tais como Injecção de Cloreto de Sódio, Injecção de Ringer, Injecção de Ringer Lactada. Podem ser incluídos conservantes, estabilizantes, tampões, antioxidantes e/ou outros aditivos, conforme necessário.
Uma composição pode ser administrada isoladamente ou em combinação com outros tratamentos, quer simultânea ou sequencialmente dependendo da estado condição a tratar. Outros tratamentos podem incluir a administração de doses adequadas de fármacos que aliviam a dor, tais como fármacos anti-inflamatórios não esteróides (e.g., aspirina, paracetamol, ibuprofeno ou cetoprofeno) ou opiatos, tais como morfina, ou antieméticos. A presente invenção proporciona um método compreendendo provocar ou permitir a ligação de um membro de ligação específica, como aqui proporcionado, a um componente da matriz extracelular que está presente na angiogénese em lesões patológicas. Como notado, esta ligação pode ocorrer in vivo, e.g. após administração de um membro de ligação específica, ou de ácido nucleico que codifica um membro de ligação específica.
Outros aspectos e concretizações da presente invenção serão evidentes para os peritos na especialidade dada a presente divulgação. Aspectos e concretizações da invenção são ilustrados pela secção experimental que se segue.
SECÇÃO EXPERIMENTAL EXEMPLO 1
Construção e actividade antitumoral in vivo da fusão anticorpo-mTNFa. 13 ΕΡ 1 719 528/ΡΤ
Materiais e Métodos
Construção e expressão da proteína de fusão LI9-mTNFa. 0 ADNc de LI9-mTNFa foi construído por fusão de uma sequência sintética que codifica para mTNFa de ratinho (Pennica et al. , Proc. Natl. Acad. Sei. USA,. 82: 6060-6064, 1985) com a extremidade 3' da sequência que codifica para o scFv L19. A representação esquemática da construção de ADNc de LI9-mTNFa é mostrada na Figura 1. 0 ADNc de IL2 foi amplificado através de Reacção em Cadeia pela Polimerase (PCR) utilizando os iniciadores BC742 e BC749 e, como molde, o ADNc de mTNFa produzido por reacção em cadeia pela polimerase com transcritase inversa (RT-PCR) partindo de ARN obtido do baço de ratinhos imunizados. 0 iniciador de sentido directo (BC742) para TNFa (sequência: 5'CTCGAATTCTCTTCCTCATCGGGTAGTAGCTCTTCCGGCTCATCGTCC AGCGGCCTCAGATCATCTTCTCAAAAT3') continha a sequência da enzima de restrição EcoRI, uma porção de 45 pb que codifica para um ligante de 15 aminoácidos (Ser4-Gly)3 e 21 bases da sequência de TNFa madura de ratinho (Pennica et al., 1985). 0 iniciador de sentido inverso BC-749 (sequência: 5 ' CTCGCGGCCGCTCATCACAGAGCAATGACTCCAAAGTA3 ' ) continha 21 bases do TNFa maduro de ratinho (Pennica et al., 1985), dois codões de paragem (stop) e a sequência a sequência da enzima de restrição NotI. 0 scFv L19, que continha na sua extremidade 5' a sequência genómica do péptido de sinal de secreção, como descrito por Li et al. (Protein Engineering, 10:731, 1996 ou 1997 (19), foi amplificado por PCR utilizando o iniciador de T7 no vector pcDNA3.1 (Invitrogen, Croningen, Holanda) e o iniciador BC 679 (sequência: CTCGAATTCtttgatttccaccttggtccc) que contém 21 pb da extremidade 3' de LI9 e a sequência da enzima de restrição EcoRI. O gene fundido foi sequenciado, introduzido no vector pcDNA3.1 contendo o promotor de citomegalovírus (CMV) e foi expresso em células P3U1 na presença de G418 (750 pg/ml, Calbiochem, San Diego, CA). Os clones de células resistentes a G418 foram rastreados quanto a secreção da proteína de fusão LI9-mTNFa, por ELISA, utilizando o domínio ED-B recombinante 14 ΕΡ 1 719 528/ΡΤ da Fibronectina (FN) humana como antigénio para L19 e o anticorpo policlonal de coelho anti-TNFa murino (PeproTech, UK) como reagente específico para mTNFa imunorreactivo.
Fragmentos recombinantes de FN, imunoensaio ELISA e Purificação da proteína de fusão LI9-mTNFa 0 fragmento de ED-B de FN recombinante foi produzido como descrito por Carnemolla et ai. (Int. J. Câncer, 68:397, 1996). 0 imunoensaio ELISA foi realizado como descrito por Carnemolla et ai. 1996. A proteína de fusão L19-mTNFa foi purificada a partir do meio condicionado de um clone positivo, utilizando o fragmento ED-B da fibronectina humana recombinante conjugado com Sepharose, por cromatografia de afinidade, como descrito por Carnemolla et al. (1996) . 0 tamanho da proteína de fusão foi analisado em condições redutoras por SDS-PAGE e em condições nativas por FPLC numa coluna de cromatografia Superdex S-200 (Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Suécia).
Ensaio de cítotoxícídade em L-M A actividade biológica do TNFoí na proteína de fusão L19-TNFa foi determinada pelo ensaio de citotoxicidade utilizando fibroblastos L-M de ratinho como descrito por Corti et al (J. Immunol. Methods, 177: 191-194, 1994). Utilizaram-se diluições em série da proteína de fusão L19-TNFa e de um TNFa recombinante (2 x 107 unidades/mg) em concentrações de 1000 a 0,4 pg/ml no ensaio de citotóxico. Os resultados são expressos como percentagem de células viáveis em relação a controlos negativos.
Animais e linhas celulares
Obtiveram-se ratinhos machos e fêmeas 129 e Balb-C (8 semanas de idade) da Harlan Italy (Correzzana, Milano, Itália). F9, um carcinoma embrionário de ratinho, fibroblastos L-M de ratinho e células de mieloma de ratinho p3Ul, foram adquiridas à ATCC (American Type Culture Collection, Rockville, MD, EUA); utilizou-se C51, uma linha celular de adenocarcinoma do cólon de ratinho derivada de BALB/C (Colombo et al., Câncer Metastasis Ver., 16:421-432, 1997). 15 ΕΡ 1 719 528/ΡΤ
Biodistribuição da proteína de fusão LI9-mTNFa A L19-mTNFa purificada foi marcada radioactivamente com iodo-125 utilizando o método Iodogen (Salacinski et al., Anal. Biochem., 117: 136, 1981) (Pierce, Rockford, IL). Após a marcação, a imunorreactividade era superior a 90%. Ratinhos 129 com teratocarcinoma F9 murino subcutaneamente implantado foram injectados intravenosamente com 4 pg (2pCi) de proteína em 100 μΐ de solução salina. Utilizaram-se três animais para cada ponto de tempo. Os ratinhos foram sacrificados 3, 6 e 24 horas após a injecção. Os órgãos foram pesados e a radioactividade foi contada. Todos os órgãos e tumores foram colocados em fixador para análise histológica e microautorradiografia. Os resultados de direccionamento para órgãos representativos estão expressos como percentagem da dose injectada por grama de tecido (%DI/g).
Tratamento in vivo com proteína de fusão LI9-mTNFa O tratamento com proteína de fusão L19-mTNFa purificada foi realizado em grupos de 3 ratinhos Balb/C, cada um injectado subcutaneamente com 106 de células C51. No 12° dia após a injecção de células C51 inj ectaram-se 0,8 pg/g de proteína de fusão LI9-mTNFa na veia da cauda de cada animal. Um grupo similar de 3 animais foi injectado com Tampão Salino de Fosfato, pH 7,4 (PBS). Os animais foram seguidos quanto a toxicidade sistémica (perda de peso) e crescimento tumoral, diariamente, durante 6 dias. No final, os animais foram sacrificados e os tumores foram colocados em fixador para análise histológica e rapidamente congelados para análise imuno-histoquímica.
Análise por microautorradiografia e Imuno-histoquímica
Processaram-se espécimes de tumor e órgãos para microautorradiografia para avaliar o padrão da distribuição da proteína de fusão 125I-L19-TNFoí no interior dos tumores ou dos órgãos, como descrito por Tarli et al. 1999 (Blood, 94: 192-198, 1999) Os procedimentos imuno-histoquímicos foram realizados como descrito por Castellani et al. (Int. J. Câncer, 59: 612-618, 1994). 16 ΕΡ 1 719 528/ΡΤ
Resultados A construção L19-TNFa e a selecção de clones que expressam a proteína de fusão L19-TNFoí resistentes a proteína G418 foram rastreados quanto à especificidade de anticorpos dos sobrenadantes para a sequência de ED-B e quanto a TNFa imunorreactivos por ELISA, como descrito em Materiais e Métodos.
Os sobrenadantes de clones que apresentam especificidade imunolóqica para com a sequência de ED-B e TNFa imunorreactivo foram testados quanto a actividade biológica de TNFa no ensaio de citotoxicidade de L-M (veja-se Materiais e Métodos). A proteína de fusão Ll9-mTNFa foi purificada num procedimento de dois passos : a) por cromatografia de imunoafinidade, numa coluna de ED-B-Sepharose seguida por b) cromatografia de exclusão por tamanhos (Superdex 200, Pharmacia)
No SDS-PAGE, a proteína de fusão apresentou uma massa molecular aparente de cerca de 42 kDa, como esperado. Testaram-se tanto a actividade imunológica do componente scFv LI9 como a actividade biológica do componente mTNFa na proteína purificada.
Biodistribuição da proteína de fusão LI9-mTNFa marcada radioactivamente em ratinhos portadores de tumor
Para investigar se a proteína de fusão L19-mTNFa era capaz de se localizar eficientemente em vasos tumorais, como descrito para o scFv L19 por Tarli et al. (Blood, 94: 192-198, 1999), foram realizadas experiências de biodistribuição em ratinhos portadores de teratocarcinoma F9.
Foi mostrado imuno-histoquimicamente que a proteína de fusão L19-mTNFa corou fortemente vasos sanguíneos do tumor do glioblastoma. A proteína de fusão L19-mTNFa marcada radioactivamente com iodo foi injectada na veia da cauda de ratinhos com tumores F9 implantados subcutaneamente, e obteve-se a distribuição da proteína de fusão L19-mTNFa em diferentes pontos de tempo: 3, 6, 24 e 48 horas. Como reportado na 17 ΕΡ 1 719 528/ΡΤ
Tabela I, 22% da dose injectada por grama de tecido (%DI/g) localizaram-se no tumor 3 horas após a injecção, e após 48 horas, mais de 9% Dl/g ainda estavam no tumor. A localização da proteína de fusão L19-mTNFa na neovasculatura tumoral foi confirmada por análise microrradiográfica.
Demonstrou-se acumulação da proteína de fusão marcada radioactivamente nos vasos sanguíneos do tumor F9 no ratinho. Não foi detectada acumulação da proteína de fusão marcada radioactivamente nos vasos dos outros órgãos dos ratinhos portadores de tumor.
Tratamento de ratinhos portadores de tumor com proteína de fusão L19-mTNFoc A eficácia da proteína de fusão L19-mTNFa na supressão do crescimento tumoral foi num modelo experimental de adenocarcinoma de ratinho, C51. Para a indução de tumor, injectaram-se 106 células de C51 subcutaneamente em animais Balb/C. Após 12 dias (quando o tumor atinge aproximadamente 100-200 mm3), os animais receberam injecçóes intravenosas de PBS (3 animais) ou de proteína de fusão L19-mTNFa (3 animais). Os animais foram monitorados quanto ao peso e ao crescimento tumoral diariamente durante 6 dias. Os resultados, sumariados na Figura 3, mostram uma diminuição no crescimento tumoral no grupo de animais tratados com proteína de fusão L19-mTNFa, relativamente aos animais injectados com PBS (as barras representam o EP). A perda de peso foi sempre inferior a 6% ao longo de todo o tempo da experiência.
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Tabela 1 - Biodistribuição da proteína de fusão L19-TNFa marcada radioactivamente em ratinhos portadores de tumor %DI/q
Tempo (h) Tumor Sangue Pele Fígado Baço Rim Bexiga Tiróide Coração Pulmão Músculo 22,0242,3 8,39+5,0 2,83+1,3 8,42+1,9 9,08+2,0 7,96+3,0 37,52+26,7 3,21+0,8 2,69+0,7 6,56+1,7 1,33+0,3 6 11,5742,7 2,13+0,9 1,68+0,9 2,39+0,9 3,29+0,9 6,06+5,2 18,14+9,1 2,91+1,8 1,32+0,5 2,79+1,4 0,76+0,2 24 9,77±1,4 0,09+0,0 0,03+0,0 0,15+0,0 0,13+0,0 0,18+0.0 2,9+2,2 1,93+0,5 0,06+0,0 0,198+0,1 0,05+0,0 48 9,55±1,7 0,01+0,0 0,01+0,0 0,02+0,0 0,01+0,0 0,05+0,0 0,08+0,0 0,0+0,0 0,01+0,0 0,02+0,0 0,010,0
Os estudos de biodistribuição foram realizados como descrito em Materiais e Métodos. Abreviaturas: %ID/g, percentagem da dose injectada de proteína de fusão Ll9-TNFa por grama de tecido
Lisboa, 2011-12-20

Claims (11)

  1. ΕΡ 1 719 528/ΡΤ 1/2 REIVINDICAÇÕES 1. Conjugado de (i) um membro de ligação específica, específico para ED-B da fibronectina, Fv de cadeia única (scFv), e (ii) Factor de Necrose Tumoral α (TNFa) .
  2. 2. Conjugado da reivindicação 1, em que o membro de ligação específica está conjugado com TNFa através de uma ligação peptídica.
  3. 3. Conjugado de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que 0 membro de ligação específica compete com o anticorpo L19 pela ligação a ED-B de fibronectina, estando a sequência de aminoácidos de L19 divulgada em Pini et al (1998) J. Biol. Chem. 273: 21769-21776.
  4. 4. Conjugado de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que o membro de ligação específica compreende um ou mais domínios VH e/ou VL de anticorpo L19, estando as sequências de aminoácidos dos domínios VH e VL do anticorpo L19 divulgadas em Pini et al (1998) J. Biol. Chem. 273: 21769-21776.
  5. 5. Conjugado de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, em que o membro de ligação específica compreende o os domínios VH e VL do anticorpo LI9.
  6. 6. Conjugado de acordo com a reivindicação 1 que compreende uma proteína de fusão de (a) o referido membro de ligação específica e (b) TNFa ou uma cadeia polipeptídica de TNFa que se associa com uma segunda cadeia polipeptídica de TNFa.
  7. 7. Conjugado de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6 para utilização num método de tratamento do corpo humano ou animal por terapia.
  8. 8. Conjugado de acordo com a reivindicação 7 para utilização num método de tratamento de angiogénese em lesões patológicas. ΕΡ 1 719 528/ΡΤ 2/2
  9. 9. Conjugado de acordo com a reivindicação 8 para utilização num método de tratamento de um tumor.
  10. 10. Utilização de um conjugado de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, no fabrico de um medicamento para tratamento de angiogénese em lesões patológicas.
  11. 11. Utilização de acordo com a reivindicação 10 em que o referido medicamento se destina ao tratamento de um tumor. Lisboa, 2011-12-20
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