PT1815247E - Uso terapêutico de inibidores de farnesiltransferase e métodos para monitorizar a eficácia do mesmo - Google Patents

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PT1815247E
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Description

DESCRIÇÃO
USO TERAPÊUTICO DE INIBIDORES DE FARNESILTRANSFERASE E MÉTODOS PARA MONITORIZAR A EFICÁCIA DO MESMO
DESCRIÇÃO A presente invenção relaciona-se com o uso de inibidores de farnesiltransferase para o tratamento de sépsis ou choque séptico. A descrição também se refere a métodos para determinar ou monitorizar a resposta de um paciente ao tratamento com um inibidor da farnesiltransferase.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
As estatinas inibem a atividade da 3-hidroxi-3-metilglutaril-coenzima A (HMG-CoA) redutase, a enzima limitante da velocidade na biossintese do colesterol (Brown, 1990), e são amplamente prescritos para reduzir o colesterol em pacientes com hiperlipemia. Observações recentes de ensaios clínicos sugerem que as estatinas fornecem benefício cardiovascular para além do seu efeito de baixar os lípidos. O reconhecimento de que a aterosclerose envolve um componente inflamatório sugere que alguns dos efeitos benéficos das estatinas podem estar relacionados com a sua modulação da imunidade e inflamação (Schõnbeck U 2004) . A inflamação é normalmente uma resposta aguda do sistema imune a agentes patogénicos microbianos, químicos ou traumas físicos, e é caracterizada por vermelhidão, calor, inchaço e dor. Estes sintomas são o resultado de uma cascata de eventos, incluindo citosinas e quimosinas a produção, a migração celular e acumulação, de coagulação, fibrinólise, dilatação dos vasos sanguíneos e aumento da permeabilidade, o extravasamento de plasma e proteínas. Se a resposta inflamatória não é apropriadamente regulada, pode evoluir para um estado crónico, e ser a causa de doenças inflamatórias, uma das principais causas de morbidade e mortalidade. A relação funcional entre a inflamação e cancro tem sido reconhecido desde há muito tempo, mas as vias moleculares subjacentes a esta ligação eram desconhecidas. Estudos recentes têm demonstrado que a inflamação induzida pelo crescimento do tumor é mediada através da ativação do fator de transcrição, NF-kB, e a produção do mediador inflamatório, TNF-a (Luo, Maeda et al.2004; Pikarsky, Porat et al. 2004). O tratamento dos animais com lipopolissacarídeo (LPS) de bactérias Gram-negativas é usada para induzir experimentalmente uma resposta inflamatória sistémica, incluindo os sintomas clássicos inflamatórios de calor, vermelhidão, inchaço e dor. Administração de LPS a animais serve como um modelo para a induzida por LPS sepsia e da inflamação induzida por crescimento de tumor, bem como um modelo mais geral para as respostas inflamatórias induzidas por outros agentes de doenças inflamatórias. O tratamento LPS de células ou animais tem sido amplamente utilizado como um modelo experimental para avaliar o papel de mediadores, tais como citosinas e quimosinas na inflamação, e para estudar agentes que podem modular a produção de tais mediadores.
Potenciais efeitos terapêuticos das estatinas em doenças inflamatórias têm sido apoiadas por estudos animais utilizando vários tratamentos LPS, bem como outros modelos animais de doenças inflamatórias. Cerivastatina foi mostrado para reduzir os níveis séricos de TNF-a, IL-ip, óxido nítrico, e aumentar a sobrevivência dos ratos num modelo de sepsia induzida por LPS (Ando, Takamura et al. 2000) . A atorvastatina e lovastatina foram relatadas para prevenir ou reverter a encefalomielite autoimune experimental (EAE) (Stanislaus, Pahan et al. 1999; Youssef, Stueve et al. 2002). A sinvastatina mostrou atividade anti-inflamatória na artrite induzida por colagénio (Leung, Sattar et al. 2003), e num modelo de asma alérgica (McKay A 2004) Verificou-se ainda que a pravastatina revelou caquexia, hematoquezia e permeabilidade epitelial intestinal em sulfato de dextrano - colite induzida (Sasaki M, et al. 2003. J Pharmacol Exp Ther 305 (1), 78-85). MCP-1, IL-lb, IL-6, MMP-9, MyD88 e TNF-a têm sido implicados na patologia da aterosclerose (Gu, Okada et ai. 1998; Aiello, Bourassa et al. 1999; Dawson, Kuziel et al. 1999; Ito, Ikeda et al. 2002; Haddy, Sass et al. 2003; Kirii, Niwa et al. 2003; Luttun, Lutgens et al. 2004; Michelsen, Wong et al. 2004) e sepse (Bossink, Paemen et al. 1995; Weighardt, Kaiser-Moore et ai. 2002; Das 2003; Lalu, Gao et al. 2003; Mancuso, Midiri et al. 2004) . As estatinas são utilizadas para o tratamento de aterosclerose, em que o seu efeito benéfico se acredita ser devido tanto à redução de lípidos-dependentes e independentes de efeitos. Rezaie-Majd et al. (2002. Arterioscler Thromb Vasc Biol 22, 1194-9) relataram que a simvastatina reduziu tanto a proteína e os níveis de RNA de citocinas, IL-6, IL-8 e proteína quimioatratante para monocitos 1 (MCP-1), em pacientes com hipercolesterolemia, após 6 semanas de tratamento. Em pacientes com doença arterial coronária (DAC), a expressão ΜΙΡ-1 ρ IL-8 e do gene das quimiocinas, MlP-la, recetores, CCR1 e CCR2, foi significativamente regulada após o tratamento com sinvastatina atorvastatina ou durante seis meses (Waehre T 2003) . O potencial terapêutico das estatinas para doenças inflamatórias tem sido destacado por descobertas recentes no Julgamento de atorvastatina na Artrite Reumatoide (Tara) , que mostraram que o indice de atividade da doença, hemossedimentação e proteína C-reativa foram significativamente melhorados em relação à terapia existente após 6 meses de tratamento com atorvastatina (McCarey DW 2004) . Sépsis e choque séptico são síndromes inflamatórios complexos. Dados recentes têm mostrado que a terapia com estatinas está associada a uma diminuição da taxa de sepsia grave (Almog, Shefer et al. 2004) e melhora a sobrevivência num modelo murino de sépsis (Ando, Takamura et al. 2000).
Muitas observações de efeitos anti-inflamatórios para estatinas em modelos animais têm sido em doses superiores às terapêuticas. No entanto, há evidências de efeitos anti-inf lamatórios de estatinas em ensaios clínicos em humanos, em doses terapêuticas (Rezaie-Majd, Maca et al. 2002; Waehre T 2003; McCarey DW 2004) . Enquanto modelos animais e observações clínicas em humanos demonstram que as estatinas têm propriedades anti-inflamatórias, o mecanismo subjacente a estas propriedades é ainda pouco claro. Estudos in vitro sobre as células têm mostrado que as estatinas afetam muitos processos diferentes e não se sabe que processos são necessários para produzir efeitos anti-inflamatórios in vivo. Por exemplo, sabe-se que a ativação de fatores de transcrição tais como NF-kB, AP-1 e hipoxia induzível fator-la, que regulam a transcrição de muitos genes inflamatórios, é regulada in vitro pela sinvastatina, atorvastatina e lovastatina (Ortego M 1999; Dichtl, Dulak et al.2003) .
As estatinas inibem a síntese de mevalonato, o passo limitante da velocidade na produção de colesterol (Brown, 1990) e também diminuem a síntese dos isoprenóides, pirofosfato de farnesilo (FPP) e pirofosfato de geranilgeranilo (GGPP) (ver Figura 1). GGPP e FPP são necessários para a ativação de prenilação e a localização subcelular de numerosas proteínas intracelulares (Casey PJ 1995; Zhang FL 1996) .
Estudos têm demonstrado que GGPP exógeno (ou geraniol) e/ou FPP (ou farnesol) podem reverter certas funções estatinas mediadas anti-inflamatórias incluindo: (1) a adesão de leucócitos ; (Liu L 1999), (2) a proliferação celular / apoptose (Guijarro C 1998; Wen-Bin Zhong 2003) , e (3) a atividade de NF-kB (Ortego M, 1999), e (4) a produção induzida por LPS de MMP-9 (Wong, Lumma et al.2001) . Em contraste, esqualestatina, um inibidor seletivo da sintaxe de esqualeno e da síntese do colesterol, não é capaz de imitar o efeito inibidor de uma estatina em leucócitos induzida por LPS de recrutamento e produção de quimiocina (Diomede L 2001) .
Tem sido relatado que as estatinas suprimem LPS-induzido secreção de MMP-9 por células THP-1, mas que a inibição da farnesiltransferase (FTase, também referida como a proteína farnesiltransferase ou FPTase) não tem nenhum efeito (Wong, B., et al. 2001. J Leukoc Biol 69, 959-62). FTIs foram originalmente desenvolvidos para evitar a pós-tradicional farnesilação e ativação das oncoproteínas Ras (Prendergast e Rane 2001). Estudos recentes demonstraram a inibição por um FTI do NF-kB ativação (Takada, Y., et al.2004. J Biol Chem 279, 26287-99) e regulação da expressão do gene inflamatório através da supressão de Ras-dependente de NF-kB ativação (Na et al.2004). Assim FTIs partilham algumas, mas não todas, propriedades com estatinas. É conhecida uma variedade de inibidores da FTase. Por exemplo, ver Patente US n° 6.451.812, que descreve determinados FTIs e a sua utilização no tratamento de artropatias, como artrite reumatoide, osteoartrite, artrite juvenil e gota. WO-97/21701 e Patente US n° 6.037.350, descrevem a formulação, preparação e propriedades farmacêuticas de certos produtos inibindo a transferase de farnesilo (imidazoly-5-il) metil-2-quinolinona de derivados de fórmulas (I), (II) e, bem como os intermediários de fórmula (II) e (III) que são metabolizados in vivo para os compostos de fórmula (I) . Os compostos de fórmulas (I) , (II) e (III) são representados por
0 ácido farmaceuticamente aceitável ou sais de adição de base e as suas formas estereoquimicamente isoméricas, em que a linha a tracejado representa uma ligação opcional, X é oxigénio ou enxofre, R1 é hidrogénio, C1-12 alquilo, Ar1, Ar2 C1-6 alquilo, quinolinilCi-6 alquilo, piridilCi-6 alquilo, hidroxialquiloi-6 alquilo, C1-6 alquiloxiCi-6 alquilo, mono-ou di (Ci_6 alquil) aminoCi-6 alquilo, aminoCi_6 alquilo, ou um radical de fórmula -Alk1-C (=0) -R9, -Alk1-S (0) -R9 ou-Alk1-S (0)2-R9, em que Alk é um C1-6 alcanodiilo, R9 representa um grupo hidroxi, Ci_6alquilo, Ci_6alquiloxi, amino, Ci-salquilamino ou Ci-salquilamino substituído com C1-6 alquiloxicarbonilo; R2' R3 e R16 cada um independentemente, são hidrogénio, hidroxilo, halo, ciano, Ci-6alquilo, Ci_6alquiloxi, hidroxiCi-6alquiloxi, Ci-6alquiloxiCi_6alquiloxi, aminoCi-6 alquiloxi, mono-ou di (C1-6 alquil) aminoCi-6alquiloxi, Ar1, Ar2 Ci_6alquilo, Ar2oxi, Ar2Ci_6alquiloxi, hidroxicarbonilo, Ci_6 alquiloxicarbonilo, tri-halometilo, tri-halometoxi, C2-6 alquenilo, 4,4-dimetiloxa-zolil, ou quando em posições adjacentes, R2 e R3 tomados em conjunto podem formar uma fórmula radical bivalente -O-CH2-O-(a-1), -O-CH2-CH2-O-(a-2) , -0-CH=CH-(a-3), -O-CH2-CH2- (a-4), -O-CH2-CH2-CH2- (a-5) ,
Ou -CH=CH-CH=CH-(a-6); R4 e R5 cada um independentemente, são hidrogénio, halo,
Ar1, Ci_6alquilo, hidroxialquiloi_6alquilo, Ci_6alquiloxiCi-6 alquilo, Ci_6alquiloxi, Ci_6alquiltio, amino, hidroxicarbonilo, Ci_6alquiloxicarbonilo, Ci_6alquilS (0) Ci_6 alquilo ou Ci_6alquilosS (0) 2Ci-6alquilo; R6 e R7 cada um independentemente, são hidrogénio, halo, ciano, C1-6 alquilo, C1-6 alquiloxi, Ar2-oxi' tri-halometilo, Ci_6alquiltio, di (Ci_6alquil) amino, ou quando em posições adjacentes, R6 e R7 tomados em conjunto podem formar um radical bivalente de fórmula -O-CH2-O- (c-1),
Ou -CH=CH-CH=CH- (c-2); R8é hidrogénio, Ci_6alquilo, ciano, hidroxicarbonilo, C1-6 alquiloxicarbonilo, Ci_6alquilcarbonilCi_6alquilo, cyanoCi-6 alquilo, Ci_6alquiloxicarbonilCi_6alquilo, carboxiCi_6alquilo, hidroxialquiloCi-6alquilo, aminoCi_6alquilo, mono- ou di (Ci_6 alquilo) aminoCi_6alquilo, imidazolilo, haloCi_6alquilo, Ci_6 alquiloxiCi_6alquilo, aminocarbonilCi-6alquilo, ou um radical de fórmula -O-R10 (b-1) , -S-R10 (b-2) , -N-R11R12 (b-3) , em que R10 é hidrogénio, Ci-6alquilo, Ci_6alquilcarbonilo, Ar1' Ar2 Ci_6alquilo, Ci_6alquiloxicarbonilCi-6alquilo, ou um radical de fórmula-Alk2-OR13 ou Alk-2-NR14 R15; R11 é hidrogénio, Ci_i2alquilo, Ar1 ou Ar2 Ci_6alquilo; R12 é hidrogénio, Ci_6alquilo, Ci-i6aquilcarbonil, Ci _6 alquiloxicarbonilo, Ci_6alquilaminocarbonilo, Ar1' Ar2 Ci_6 alquilo, Ci_6alkylcarbonylCi-6alquilo, um aminoácido natural, Ar carbonilo, Ar Ci_6alquilcarbonilo, aminocarbonilcarbonil, Ci_6alquiloxiCi_6alquilcarbonilo, hidroxi, alquiloxiCi-6, aminocarbonilo, di (Ci_6alquil) aminoCi_6alquilcarbonilo, amino, Ci_6alquilamino, Ci_6alquilcarbonilamino, ou um radical de fórmula-Alk2-OR13 ou -Alk2-NR14R15; em que
Alk2 é alcanodiiloCi-6; R13 é hidrogénio, Ci-6alquilo, Ci-6alquilcarbonilo, hidroxialquiloi_6alquilo, Ar1 ou Ar2 Ci_6alquilo; R14 é hidrogénio, Ci_6alquilo, Ar1 ou Ar2Ci_6alquilo; R15 é hidrogénio, Ci_6alquilo, Ci_6alquilcarbonilo, Ar1 ou Ar2 Ci_6alquilo; R17 é hidrogénio, halo, ciano, Ci_6alquilo, Ci_6 alquiloxicarbonilo, Ar1; R e hrdrogenro, Ci_6alquilo, Ci_6alquiloxi ou halo; R19 é hidrogénio ou alquilo Ci_6;
Ar1 é fenilo ou fenilo substituído com Ci_6alquilo, hidroxilo, amino, Ci_6 alquiloxi ou halo, e Ar2 é fenilo ou fenilo substituído com Ci_6alquilo, hidroxi, amino, alquiloxiCi-6 ou halo. WO-97/16443 e Patente US n° 5.968.952 descrevem a formulação, preparação e propriedades farmacêuticas de compostos inibidores da farnesiltransferase de fórmula geral (IV), bem como os intermediários de fórmula (V) e (VI) que são metabolizados in vivo para os compostos de fórmula (IV).Os compostos de fórmulas (IV), (V) e (VI) são representados por
R3
(VI) 0 ácido farmaceuticamente aceitável ou sais de adição de base e as suas formas estereoquimicamente isoméricas, em que a linha a tracejado representa uma ligação opcional; X é oxigénio ou enxofre; piridilCi_6alquilo, hidroxialquiloi_6 R1 é hidrogénio, Ci_i2alquilo, Ar1' Ar2Ci_6alquilo, quinolinilCi_6alquilo, alquilo, Ci_6alquiloxiCi_6alquilo, mono-ou di (Ci_6alquil) aminoCi_6alquilo, aminoCi_6alquilo, ou um radical de fórmula-Alk1-C (=0)-R1,-Alk1-S (0) 2-R1 ou-Alk1-S (0) 2_R9, em que Alk é um Cl-6 alcanodiilo, R 1 representa um grupo hidroxi, Cl-6 alquilo, Ci_6alquiloxi, amino, Ci-salquilamino ou Ci_8 alquilamino substituído com Ci_6alquiloxicarbonilo; R2 e R3 cada um, independentemente, são hidrogénio, hidroxilo, halo, ciano, Ci-6alquilo, Ci-6alquiloxi, hidroxii-6 alquiloxi, Ci_6alquiloxiCi_6alquiloxi, aminoCi-6alquiloxi, mono-ou di (Ci-6alquil) aminoCi_6alquiloxi, Ar1, Ar2Ci-6alquilo, Ar2-oxi, Ar2 3Ci_6alquiloxi, hidroxicarbonilo, Ci-6 alquiloxicarbonilo, tri-halometilo, trihalometoxilo, C alquenilo2-6, ou quando em posições adjacentes, R e R tomados em conjunto podem formar um radical bivalente de fórmula -0-CH2-0- (a-1), -0-CH2-CH2-0- (a-2), -0-CH=CH- (a-3), -0-CH2-CH2- (a-4), -0-CH2-CH2-CH2- (a-5), o -CH=CH-CH=CH- (a-6); 1 alquiloxicarbonilo, Ci_6alquilcarbonilCi_6alquilo, cianoCi-6 alquilo, Ci_6alquiloxicarbonilCi_6alquilo, hidroxicarbonilCi-6 alquilo, hidroxialquiloi-6alquilo, aminoCi_6alquilo, mono-ou 2 5 1 3 R e R cada um independentemente, são hidrogénio, Ar , Ci-6 alquilo, Ci_6alkyloxyCi_6alquilo, Ci_6alquiloxicarbonilo alquiloxi, Ci_6alquiltio, hidroxicarbonilo, amino, Ci-6 alquiloS (0) Ci_6alquilo ou Ci-6alquiloS (0) 2Ci_6alquilo; di (Ci_6alquil) aminoCi_6alquilo, haloCi_6alquilo, Ci_6alquiloxi Ci_6alquilo, um aminocarbonylCi-6alquilo, Ar1' Ar2Ci_6 alquiloxiCi_6alquilo, Ci_6alquiltioCi_6alquilo; R10 é hidrogénio, Ci_6alquilo, Ci_6alquiloxi ou halo; R11 é hidrogénio ou alquiloCi_6;
Ar1 é fenilo ou fenilo substituído com Ci_6alquilo, hidroxilo, amino, Ci_6alquiloxi ou halo;
Ar2 é fenilo ou fenilo substituído com Ci-6alquilo, hidroxi, alquiloxi, aminoCi-6 ou halo. WO-98/40383 e Patente US n° 6.187.786 descrevem a formulação, preparação e propriedades farmacêuticas de compostos inibidores da farnesiltransferase de fórmula geral (VII)
(VII) os sais ácidos de adição farmaceuticamente aceitáveis e as suas formas estereoquimicamente isoméricas, em que a linha a tracejado representa uma ligação opcional; X é oxigénio ou enxofre; -A- é um radical bivalente de fórmula -CH=CH- (a-1), -CH2-CH2-(a-2), -CH2-CH2-CH2- (a-3), -CH2-0- (a-4), -CH2-CH2-0- (a-5), -CH2-S- (a-6), -CH2-CH2-S- (a-7), -CH=N- (a-8), -N=N- (a-9), or -CO-NH- (a-10); em que, opcionalmente, um átomo de hidrogénio pode ser substituído por Ci-4alquilo ou Ar1; R1 e R2 cada um independentemente, são hidrogénio, hidroxilo, halo, ciano, Ci_6alquilo, tri-halometilo, tri-halometoxi, C2-6âlcenilo, Ci-galquiloxi, hidroxii_6alquiloxi, Ci-6alquiloxiCi-6alquiloxi, alquiloxicarboniloCi_6, aminoCi_6 alquiloxi, mono-ou di (Ci-ealquil) aminoCi-6alquiloxi, Ar2, Ar2-Ci_6alquilo, Ar2-oxi,
Ar2-Ci_6alquiloxi, ou quando em posições adjacentes, R1 e R2 tomados em conjunto podem formar uma fórmula radical bivalente -0-CH2-0- (b—1), -0-CH2-CH2-0- (b—2), -0-CH=CH- (b-3), -0-CH2-CH2- (b — 4), -0-CH2-CH2-CH2- (b-5), 0 -CH=CH-CH=CH- (b-6); 3 4 R e R são cada um mdependentemente hidrogénio, halo, ciano, Ci_6alquilo, Ci_6alquiloxi, Ar3-oxi, Ci_6alquiltio, di(Ci-6alquil)amino, tri-halometilo, tri-halometoxi , ou quando em posições adjacentes, R3 e R4 tomados em conjunto podem formar uma fórmula radical bivalente -0-CH2-0- (c-1), -0-CH2-CH2-0- (c-2), o -CH=CH-CH=CH- (c-3); R5 é um radical de fórmula
em que R13 é hidrogénio, halo, Ar4, Ci-6alquilo, hidroxiCi-6alquilo, Ci_6alkyloxyCi-6alquilo, Ci_6alquiloxi, Ci-6alquiltio, amino, Ci_6alquiloxicarbonilo, Ci_6alquilS (0) Ci_6alquilo ou Ci_6 alquiloS (0) 2Ci-6alquilo; R14 é hidrogénio, Ci_6alquilo ou di (Ci-4alquil) aminossulfonilo; R6 é hidrogénio, hidroxi, halo, Ci_6alquilo, ciano, haloCi_6 alquilo, hidroxialquiloi_6alquilo, cyanoCi_6alquilo, aminoCi_6 alquilo, Ci-6alquiloCi_6alquiloxi , Ci-6alquiltioCi-6alquilo, aminocarbonilCi-6alquilo, Ci-6alquiloxicarbonilCi-6alquilo, Ci-6alquilcarbonil-Ci-6alquilo, Ci-6alquiloxicarbonilo, mono-ou di-(Ci_6alquil) aminoCi-6alquilo, Ar5, Ar5-Ci-6alkyloxyCi-6alquilo, ou um radical de fórmula -0R7 (e-1) , -SR7 (e-2) , -NR8 R9 (e-3) , em que R7 é hidrogénio, Ci_6alquilo, Ci_6alquilcarbonilo, Ar6, Ars-Ci_ 6alquilo, Ci-6alquiloxicarbonilCi-6alquilo, ou um radical de fórmula-Alk-OR10 ou -Alk-NR11 R12; R8 é hidrogénio, Ci_6alquilo, Ar ou Ar7-Ci-6alquilo; R9 é hidrogénio, Ci_6alquilo, Ci-6alquilcarbonilo, Ci-6 alquiloxicarbonilo, Ci_6alquilaminocarbonilo, Ar8, Ar8-Ci-6 alquilo, Ci-6alquilcarbonil-Ci_6alquilo, Ar8-carbonil, Ar8-Ci- aminocarbonilcarbonil
Ci_6cilquiloxiCi-6 6alquil-carbonilo, alquilcarbonil, hidroxi, alquiloxiCi_6, aminocarbonilo, di (Ci_6alquil) aminoCi_6alquilcarbonilo, amino, Ci_6 alquilamino, Ci_6alquil-carbonilamino, ou um radical de fórmula-Alk-OR10 ou-Alk-NR11 R12; em que
Alk é alcanodiilo Ci_6; R10 é hidrogénio, Ci_6alquilo, Ci_6alquilcarbonilo, hidroxiaCi-6alquilo, Ar9 ou Ar9-Ci-6alquilo; R11 é hidrogénio, Ci_6alquilo, Ci-6alquilcarbonilo, Ar10 ou Ar10-Ci-6alquilo; R12 é hidrogénio, Ci_6 alquilo, Ar11 ou Ari:L-Ci-6alquilo, e
Ar1 a Ar11 são cada um independentemente selecionados de entre fenilo, ou fenilo substituído com halo, Ci_6alquilo, Ci_6alquiloxi ou trif luorometilo . WO-98/49157 e Patente US n° 6.117.432 referem-se à formulação, preparação e propriedades farmacêuticas de compostos inibidores da farnesiltransferase de fórmula geral (VIII)
(VIII) os sais ácidos de adição farmaceuticamente aceitáveis e as suas formas estereoquimicamente isoméricas, em que a linha a tracejado representa uma ligação opcional; X é oxigénio ou enxofre; R1 e R2 cada um independentemente, são hidrogénio, hidroxilo, halo, ciano, Ci_6alquilo, tri-halometilo, tri- halometoxi, C2-6alcenilo, Ci_6alquiloxi, hidroxiCi-6alquiloxi, Ci_6alkyloxyCi_6alquiloxi, alquiloxicarboniloCi-6, aminoCi_6 alquiloxi, mono-ou di (Ci_6alquil) aminoCi_6alquiloxi, Ar1, Ar1 Ci_6alquilo, Ar1 oxi ou Ar1Ci_6alquiloxi; R3 e R4 são cada um independentemente hidroqénio, halo, ciano, Ci_6alquilo, Ci_6alquiloxi, ΑΓ4οχί, Ci_6alquiltio, di (Ci_6alquil)amino, tri-halometilo ou tri-halometoxi; R5 é hidrogénio, halo, Ci_6alquilo, ciano, haloCi-ealquilo, hidroxialquiloCi_6alquilo, cyanoCi_6alquilo, aminoCi_6alquilo, Ci_6alquiloxi-Ci-6alquilo, Ci_6alquiltioCi-6alquilo, aminocarbonilCi-6alquilo, Ci-6alquiloxicarbonilCi-6alquilo, Ci_6alquilcarbonil-Ci-6alquilo, Ci-6alquiloxicarbonilo, mono-or di (Ci_6alquil) aminoCi_6alquilo, Ar1, Ar1Ci_6alkyloxyCi_6 alquilo, ou um radical de fórmula O-R10 (a-1) , S-R10 (a-2) , N-RnR12 (a-3) , em que R10 é hidrogénio, Ci_6alquilo, Ci_6alquilcarbonilo, Ar1' Ar1 Ci_6alquilo, Ci_6alquiloxicarbonilCi-6alquilo, ou um radical de fórmula-Alk-OR13 ou -alq-NR14 R15; R11 é hidrogénio, Ci-6alquilo, Ar1 ou Ar1Ci-6alquilo; R12 é hidrogénio, Ci_6alquilo, Ci-6alquilcarbonilo, Ci-6 alquiloxicarbonilo, Ci_6alquilaminocarbonilo, Ar1, Ar1Ci_6 alquilo, Ci_6alquilcarbonil-Ci_6alquilo, Ar4-carbonil, Ar1 Ci_ 6alquil-carbonilo, aminocarbonilcarbonil, Ci-6alquiloxiCi_6 alquilcarbonil-, hidroxi, alquiloxiCi_6, aminocarbonilo, di (Ci_6alquil) aminoCi_6alquilcarbonilo, amino, Ci_6alquilamino, Ci_6alquil-carboni lamino, ou um radical de fórmula-Alk-OR13 ou-Alk-NR14R15; em que Alk é Ci_6alcanodiilo; R13 é hidrogénio, Ci_6alquilo, Ci_6alquilcarbonilo, hidroxialquiloi-6alquilo, Ar1 ou Ar1Ci_6alquilo; R14 é hidrogénio, Ci_6alquilo, Ar1 ou Ar1Ci_6alquilo; R15 é hidrogénio, Ci_6alquilo, Ci_6alquilcarbonilo, Ar1 ou Ar1Ci_6alquilo ; R6 é um radical de fórmula
Λν W (b-2),
R 16 Ν' .17 em que R16 é hidrogénio, halo, Ar1, Ci-6alquilo, hidroxialquiloi-6 alquilo, Ci-6alkyloxyCi-6alquilo, Ci_6alquiloxi, Ci_6alquiltio, amino, Ci_6alquiloxicarbonilo, Ci_6alkylthioCi_6alquilo, Ci_6alquilS (0) Ci_6alquilo ou Ci_6alquilS (0) 2Ci_6alquilo; R17 é hidrogénio, Ci_6alquilo ou di (Ci_4alquil) aminossulfonilo; R7 é hidrogénio ou alquiloCi-6, em que a linha a tracejado não representa uma ligação; R8 é hidrogénio, Ci_6alquilo ou Ar2CH2 ou CH2Het1CH2; R9 é hidrogénio, Ci_6alquilo, Ci_6alquiloxi ou halo, ou R8 e R9 tomados em conjunto para formar um radical bivalente de fórmula -CH=CH-(c-1), -CH2_CH2- (c-2) , -CH2_CH2_CH2- (c-3) , -CH2-0- (c-4) , ou -CH2_CH2-0- (c-5) ;
Ar1 é fenilo, ou fenilo substituído com 1 ou 2 substituintes cada um selecionado independentemente de entre halo, Ci_6alquilo, Ci_6alquiloxi ou trifluorometilo;
Ar2 é fenilo, ou fenilo substituído com 1 ou 2 substituintes cada um selecionados independentemente de entre halo, Ci_6alquilo, Ci_6alquiloxi ou trif luorometilo; e Het1 é piridinilo; piridinilo substituído com 1 ou 2 substituintes cada um selecionados independentemente de entre halo, Ci_6alquilo, Ci_6alquiloxi ou trif luorometilo. WO-00/39082 e Patente US n° 6.458.800 descrevem a formulação, preparação e propriedades farmacêuticas de compostos inibidores da farnesiltransferase de fórmula geral (IX)
ou os sais de ácidos de adição farmaceuticamente aceitáveis e as suas formas estereoquimicamente isoméricas, em que =X1-X2-X3- é um radical trivalente de fórmula =CR6-CR7=CR8- (x-6) , =CR6-N=CR7- (x-7), =CR6-NH-C(=0)- (x-8), or =CR6-N=N- (x-9) ; =N-CRS=CR7- (x-1) , =N-N=CR6- (x-2), =N-NH-C(=0)- (x-3), =N-N=N- (x-4), =N-CRS=N- (x-5), em que cada R6' R7 e R8 são independentemente hidrogénio, Ci_4alquilo, hidroxi, Ci_4alquiloxi, ariloxi, C1-4 alquiloxicarbonilo, hidroxialquiloi_4alquilo, Ci_4alquiloxiCi- 4 um grupo alquilo, mono-ou di (Ci_4alquil) aminoCi_4alquilo, ciano, amino, tio, alquiltio C1-4, ariltio ou aril; > Y1-Y2 - é um radical trivalente de fórmula: > CH-CHR9- (y-1), > C=N- (y-2), > CH-NR9- (y— 3), ou > C=CR9- (y-4); em que cada R9 independentemente, é hidrogénio, halo, amino-carbonil halocarbonilo, hidroxialquiloi_4alquilo, ciano, carboxilo, Ci-4alquilo, Ci_4alquiloxi, Ci_4alkyloxyCi_4 alquilo, Ci_4alquiloxicarbonilo, mono-ou di (Ci-^alquil) amino, mono-ou di (Ci_4alquil) aminoCi_4alquilo, arilo; r e s são cada um independentemente 0, 1, 2, 3, 4 ou 5; t é 0, 1, 2 ou 3; cada R1 e R2' independentemente, hidroxi, halo, ciano, C1-6 alquilo, tri-halometilo, tri-halometoxi, C2_6alcenilo, C1-6 alquiloxi, hidroxii_6alquiloxi, Ci_6alquiltio, Ci_6alkyloxyCi_6 alquiloxi, Ci_6alquiloxicarbonilo, aminoCi_6alquiloxi, mono-ou di (Ci_6alquil amino, mono-ou di (Ci_6alquil) aminoCi_6 alquiloxi, arilo, arili_6alquilo, ariloxi ou aril-oxii-6, hidroxicarbonilo, Ci_6alquiloxicarbonilo, aminocarbonilo, aminoCi_6alquilo, aminocarbonilo mono-ou di (Ci_6alquilo) , mono-ou di-(Ci_6alquil) aminoCi_6alquilo, ou dois de R1 ou R2 substituintes adjacentes entre si no anel fenilo podem, independentemente formar em conjunto um radical bivalente de fórmula -O-CH2-O- (a-1), -O-CH2-CH2-O- (a-2) , -0=CH=CH- (a-3), -0-CH2-CH2- (a-4) , -0-CH2-CH2-CH2- (a-5), ou -CH=CH-CH=CH- (a-6); R3 é hidrogénio, halo, Ci_6alquilo, ciano, haloCi_6alquilo, hidroxialquiloi_6alquilo, cianoCi_6alquilo, aminoCi_6alquilo, Ci-6alquiloxiCi-6alquilo, Ci-galquiltioCi_6hidroxicarbonil, alquilo, aminocarbonilCi-6alquilo, hidroxicarbonilCi-6 alquilo, Ci-6alquiloxicarbonilCi_6alquilo, Ci_6 alquilcarbonilCi_6alquilo, Ci-6alquiloxicarbonilo, arilo, arilCi_6alquilo, ariloxi, mono- ou di (Ci_6alquil) aminoCi-6 alquilo, ou um radical de fórmula -0-R11 (b—1) , -S-R10 (b — 2) , -N-R11 R 12 (b-3) , em que R10 é hidrogénio, Ci_6alquilo, Ci_6alquilcarbonilo, arilo, arili_6alquilo, Ci_6alquiloxicarbonilCi-6alquilo, ou um radical de fórmula-Alk-OR13 ou-NR-Alk14R15; R11 é hidrogénio, Ci_6alquilo, arilo ou aril alquilOi_6; R12 é hidrogénio, Ci_6alquilo, arilo, hidroxi, amino, Ci_6 alquiloxi, Ci-6alkylcarbonylCi-6alquilo, arili_6alquilo, Ci_6 alquilcarbonilamino, mono- ou di-(Ci-6alquil) amino, Ci-e alquilcarbonilo, aminocarbonilo, arilcarbonilo, haloCl-6 alquilcarbonilo, arilCi_6alquilcarbonilo, Ci-6alquiloxicarbonilo,
Ci_6alkyloxyCi_6alquilcarbonilo, mono- ou di-aminocarbonil (Ci_6alquilo) , em que o radical alquilo pode ser opcionalmente substituído por um ou mais substituintes independentemente seleccionados de entre arilo ou Ci_3 alquiloxicarbonilo, aminocarbonilcar bonil, mono-ou di(Ci_6 alquil)aminoCi_6alquil-carbonilo, ou um radical de fórmula-Alk-OR13 ou-Alk-NR14R15; em que
Alk é alcanodiiloCi_6; R13 é hidrogénio, Ci_6alquilo, Ci-6alquilcarbonilo, hidroxialquiloCi_6alquilo, arilo ou arilalquiloCi_6; R14 é hidrogénio, Ci_6alquilo, arilo ou arilalquiloCi-6,- R15 é hidrogénio, Ci_6alquilo, Ci_6alquilcarbonilo, arilo ou arilCi_6alquilo; R4 é um radical de fórmula
em que R16 é hidrogénio, halo, arilo, Ci_6alquilo, hidroxialquiloCi-6alquilo, Ci-6alkyloxyCi-6alquilo, Ci_6alquiloxi, Ci-6 alquiltio, amino, mono- ou di- (Ci_4alquilo) amino hidroxicarbonilo, alquiloxicarboniloCi-6, Ci_6alkylthioCi-6 alquilo, Ci_6alquilos (0) Ci-6alquilo ou Ci-6alquilos (0) 2C1-6 alquilo; R16 pode também ser ligado a um dos átomos de azoto no anel de imidazol de fórmula (c-1) ou (c-2), caso em que o significado de R16' quando ligados ao azoto está limitado ao hidrogénio, arilo, Ci_6alquilo, hidroxialquiloCi_6alquilo, Ci_6alkyloxyCi-6alquilo, Ci_6alquiloxicarbonilo, Ci-6alquil (0) Ci_6alquilo ou Ci-6alquilos (0) 2Ci-6alquilo; R17 é hidrogénio, Ci_6alquilo, Ci-6alkyloxyCi_6alquilo, arilCi-6alquilo, trifluorometilo ou di-(Ci_4alquil)aminossulfonilo; R5 é Ci-6alquilo, Ci_6alquiloxi ou halo; arilo é fenilo, naftalenilo ou fenilo substituído com um ou mais substituintes cada um selecionado independentemente de entre halo, Ci_6alquilo, Ci_6alquiloxi ou trif luorometilo
Além disso, FTIs potentes, incluindo tipifarnib (também conhecido como R115777 ou ZARNESTRA ®) , foram descritas na literatura. Ver, por exemplo, Kurzrock, R. et al.(2003), WO 98/43629, e WO 02/40015. Outros inibidores conhecidos incluem farnesiltransferase Arglabin (i.e.1(R)-10-epoxi-5 (S),7(S)-guaia-3 (4),11 (13)-dien-6,12-olide descrito na WO-98 / 28303 (NuOncology Labs); álcool perrilil descrito na WO-99/45912 (Wisconsin Genetics), SCH-66336, ou seja, ( + )- (R)-piperidina-l-carboxamida, descritos na Patente dos EUA No. 5.874.442 (Schering); L778123, ou seja, 1—(3 — clorofenil)-4-[1-(4-cianobenzil)-5-imidazolilmetil]-2-Piperazinona, descrito em WO-00/01691 (Merck); composto 2(S)-[2(S)-[2(R)-ami-no-3-mercapto]propilamino-3(S)-metil]-pentiloxi-3-fenil-propionil-metionina sulfona descrita na WO-94/10138 (Merck) e BMS 214662, isto é, (descrito em WO 97/30992 (Bristol Myers Squibb), e compostos da Pfizer (A) e (B) descritos em WO-00/12498 e WO-OO/12499:
A utilização de algumas das FTIs tem sido estudada na área da terapia anti-cancro. Mais recentemente, o uso de certos FTIs como agentes terapêuticos para o tratamento de doenças inflamatórias, particularmente as que envolvem uma componente imunológica, e para o tratamento da dor associada com condições inflamatórias foi divulgado. Ver W098/43629, a qual descreve o uso de FTIs determinados para o tratamento de condições, incluindo a colite ulcerativa, doença de Crohn, rinite alérgica, doença do enxerto-versus-hospedeiro, conjuntivite, asma, artrite reumatoide, osteoartrite, ARDS, doença de Behcet, rejeição de transplantes, dermatite, urticária alérgica, alopecia areata, esclerodermia, exantema, eczema, dermatomiosite, acne, diabetes, lúpus eritematoso sistémico, doença de Kawasaki, esclerose múltipla, enfisema, fibrose cistica, bronquite crónica e psoriase. W09721701 divulga inibidores da farnesil transferase para o tratamento de choque endotóxico, que são as benzodiazepinas.
Embora vários FTIs sejam conhecidos, os seus efeitos biológicos em células e em animais, e, portanto, as suas aplicações terapêuticas, ainda não foram completamente elucidadas.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
Num aspeto geral, a invenção refere-se a inibidores de farnesiltransferase para uso no tratamento de sépsis ou choque séptico, tal como definido nas reivindicações. De preferência, o inibidor da farnesiltransferase é selecionado entre os compostos inibidores de farnesiltransferase aqui revelados. Mais preferivelmente, o inibidor de farnesiltransferase é tipifarnib.
Num outro aspeto geral, a revelação refere-se a métodos para a determinação da resposta de um sujeito ao tratamento com um inibidor da farnesiltransferase. Uma forma de realização geral de um tal método compreende: (a) tirar uma amostra de sangue não tratado do sujeito antes do tratamento com o inibidor da farnesiltransferase, e tirar uma amostra de sangue tratado a partir do sujeito, pelo menos, uma hora após o tratamento com o inibidor da farnesiltransferase ter iniciado, (b) opcionalmente, isolar as células, o plasma ou soro da amostra de sangue não tratado para se obter um extrato da amostra não tratada, e isolamento de células, de plasma ou de soro de cada amostra de sangue tratada para obter uma amostra de extrato tratado, (c) opcionalmente, uma medição de nivel de IL-8 na amostra de sangue não tratado ou extratos, a medição de um nivel de IL-8, em cada amostra de sangue tratado ou extrato, e comparando os niveis de IL-8 para se obter uma medição de controlo, e (d) medição de um nivel de pelo menos um de IL-6, MCP-1, IL-Ιβ, MMP-9, e TNF-α na amostra de sangue não tratado ou extratos, a medição de um nivel de pelo menos um de IL-6, MCP-1, IL-Ιβ, MMP-9, e TNF-α em cada amostra de sangue tratado ou extrato, e comparando os niveis medidos, em que uma diminuição indica uma resposta ao tratamento.
Numa divulgação, os extratos de amostras de plasma são isolados (por exemplo, por centrifugação do sangue). Em outra divulgação, os extratos são células mononucleares do sangue periférico isolados por, por exemplo, gradiente de Ficoll-Paque. Antes da medição, o sangue ou células podem ser estimuladas com LPS.
Outra revelação geral refere-se a um método para monitorizar a resposta de um sujeito ao tratamento com um inibidor da farnesiltransferase, que compreende: (a) tirar uma amostra de sangue não tratado do sujeito antes do tratamento com o inibidor da farnesiltransferase, e tirar uma amostra de sangue tratado a partir do sujeito, pelo menos, uma vez após o tratamento com o inibidor da farnesiltransferase ter iniciado, (b) opcionalmente, isolamento de células mononucleares de sangue periférico (PBMC) a partir da amostra de sangue não tratado para se obter uma amostra não tratada PBMC, e isolamento de células mononucleares de sangue periférico a partir de cada amostra de sangue tratado para obter um tratada amostra de PBMC, (c) estimular a amostra de sangue não tratado ou com PBMC para se obter um lipopolissacarídeo estimulada por LPS de sangue não tratado, ou da amostra de PBMC, e estimulando a cada amostra de sangue tratado ou PBMC com lipopolissacarídeo para obter um sangue estimulada por LPS tratada ou amostra de PBMC, (d) o isolamento de RNA do sangue estimulada por LPS não tratada ou amostra de PBMC, e isolamento de RNA de cada sangue tratado estimulada por LPS ou amostra de PBMC, (e) opcionalmente, medição da expressão de IL-8 no RNA do sangue estimuladas com LPS ou não tratado amostra de PBMC, medindo a expressão de IL-8 no RNA de cada tratado sangue estimulada por LPS ou amostra de PBMC, e comparar as medições do dito RNA a expressão de IL-8 como um controlo, (f) medição da expressão de pelo menos um de IL-Ιβ, MCP-1, MMP-9, MyD88, STAT1, e IL-6 nos RNA da amostra de sangue não tratado ou PBMC estimulados por LPS, medindo a expressão de pelo menos um de IL-Ιβ, MCP-1, MMP-9, MyD88, STAT1, e IL-6 no RNA de cada estimulada por LPS de sangue tratado ou amostra de PBMC, e comparar as medições de expressão, em que uma diminuição indica uma resposta ao tratamento.
Numa divulgação específica, várias amostras de sangue tratado do sujeito (por exemplo, um paciente num ensaio clínico) são tiradas em intervalos periódicos de tempo após o tratamento com o inibidor da farnesiltransferase ter começado.
Outras formas de realização, características, vantagens e aspetos da invenção serão evidentes a partir da descrição detalhada abaixo, em referência às figuras do desenho.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS A Figura 1 mostra a via do mevalonato para a síntese de isoprenóides e colesterol, indicando os locais para a inibição da HMG CoA redutase por simvastatina, e da atividade de farnesiltransferase por tipifarnib. A inibição da HMG CoA redutase por estatinas conduz à inibição da síntese do colesterol, e de produção de isoprenóides, necessário tanto para a farnesilação e geranilgeranilação de proteínas. A inibição da farnesiltransferase por FTIs inibe seletivamente a farnesilação de proteínas, tais como Ras.
As Figuras 2A-2G mostram o efeito da simvastatina e tipifarnib na transcrição induzida por LPS de IL-Ιβ(Figura 2.a), MCP-1(Figura 2.b), MMP-9(Figura 2.c), IL-8(Figura 2. d), STATl(Figura 2.e), MyD88(Figura 2.f) e IL-6(Figura 2. g) . As células THP-1 foram cultivadas na ausência (sem tratamento) ou na presença de LPS (100 ng/ml) , mais ou menos a simvastatina (ΙΟμΜ), ou tipifarnib (5μΜ). O ARN foi isolado nos tempos indicados para a preparação de cADN, como descrito em "Materiais e Métodos". Os níveis de ARNm relativos em comparação com GAPDH foram determinados por PCR em tempo real.
As Figuras 3a-3f mostram o efeito da simvastatina e tipifarnib sobre a secreção induzida por LPS de MCP-1 (Figura 3.a), IL-6 (Figura 3.b), IL-1 p (figura 3.c), IL- 8 (Figura 3.d), MMP-9 (Figura 3.e) e TNF-a. (Figura 3. f) THP-1 de células cultivadas na ausência (sem tratamento) ou presença de LPS lOOng/ml, mais ou menos a simvastatina (5 e ΙΟμΜ) ou tipifarnib (2 e 5μΜ) , respetivamente. Nos pontos de tempo indicados, sobrenadantes foram analisadas para citocinas, quimiocinas ou MMP-9 pelo método de ELISA. Os pontos de dados são médias de incubações em triplicado, para as quais os desvios padrão foram normalmente de 2 a 13% do valor médio. A Figura 4 mostra a inibição de LPS induzida pela libertação de IL-6 por tipifarnib. Células THP-1 a 3,4 x 105/ml foram cultivadas em placas de 96 poços em 0,5% de FBS / RPMI 1640, na ausência ou na presença de LPS lOOng/ml, mais ou menos tipifarnib (a partir de 5 μΜ, seguindo-se 3 - série dobra diluição).As concentrações de tipifarnib foram: 5 μΜ, 1,67 μΜ, 0,56 μΜ, 0,19 μΜ e 0,06 μΜ. Sobrenadantes foram coletados em 48hr.IL6 foi quantificada por ELISA kit de I & D Systems.
As figuras 5a-5e mostram o efeito da sinvastatina e tipifarnib em LPS induzida a produção de citocinas in vivo. Ratinhos BALB / c (n = 4 ou 5 por grupo) foram tratados por via oral com sinvastatina ou ciclodextrano tipifarnib em 20%, a uma dose de 50mg/kg, 24 horas, 17 horas e 1 hora antes da injeção de LPS. LPS (20 mg) foi administrada por via intraperitoneal. As amostras de plasma foram colhidas a 1 hora e 2 horas na primeira experiência, e 2 horas e 3 horas após a injeção de LPS na segunda experiência, e testados para TNF-a (Figura 5.a), IL-6 (figura 5.b), IL-1 p (Figura 5.c), ΜΙΡ-la (Figura 5.d) e MCP-1 (Figura 5.e), utilizando o método ELISA ou Luminex conforme descrito em "Materiais e Métodos" deste documento. Os dados são apresentados como os valores médios de quatro ou cinco ratos em cada grupo, e os desvios padrão das médias está indicado por barras de erro. Significância estatística para diferenças na produção de mediadores inflamatórios em animais sinvastatina ou tipifarnib versus tratados com o veiculo foi avaliado por meio do teste Student's t. As diferenças estatisticamente significativas estão indicadas por asteriscos na Figuras 5a 5e através da seguinte maneira: * significa valor de P inferior a 0,05; ** significa valor de P inferior a 0,01.Quanto menor o valor P, a mais significativa a diferença. A Figura 6 mostra a inibição de LPS induzida pela produção de IL-6 em PBMC humana por tipifarnib, mas não pelo enantiómero menos ativo de tipifarnib. PBMC humanos foram incubados a 37 ° C durante 1 hora, na ausência ou na presença de 5mm de tipifarnib (R115777) ou o seu
enantiómero menos ativo (100 vezes menos ativo para a inibição da farnesiltransferase), após o que LPS (ou apenas veiculo por nenhum tratamento) foi adicionado a uma concentração final de 10 mg/ml. Os sobrenadantes foram colhidos às 16 horas, 24 horas e 40 horas de tratamento com LPS, e a secreção de IL-6 foi quantificada por ELISA. A significância estatística de diferenças na produção de IL-6 em PBMC tratado com veículo versus tipifarnib foi avaliada utilizando o teste Student's t. As diferenças estatisticamente significativas estão indicadas por asteriscos ** valor P significa menos do que 0,01. Quanto menor o valor P, mais significativa a diferença.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO E CONCRETIZAÇÕES PREFERIDAS
Os termos "compreendendo", "incluindo" e "contendo" são aqui utilizados no seu sentido lato, não limitado.
Os efeitos biológicos de FTIs foram agora ainda mais elucidados, como discutido na secção de Experiências abaixo. A inibição da farnesiltransferase (FPTase), tem sido encontrada para regular os genes e proteínas identificadas nas Tabelas 2, 3, e 4. Assim, os níveis de tais genes e proteínas podem ser monitorizados como marcadores biológicos para determinar a resposta do paciente ao tratamento com um FTI. Por exemplo, vários subconjuntos de LPS induzida genes e/ou proteínas mostradas pela e, por estudos nas tabelas seguintes podem ser reprimidos administração de um inibidor da farnesiltransferase conseguinte, utilizados como marcadores em clinicos.
Tabela 2: Genes para o qual a transcrição induzida por LPS foi regulada por inibição da farnesiltransferase tal como medido por análise de chip de cADN Número de acesso Nome do Gene Descrição do Gene NM_002982 CCL2 Proteína quimiotática de monócitos 1 (MCP-1) NM_005623 CCL8 Proteína quimiotática de monócitos 2 (PQM-2) NM_002983 CCL3 A3 citocina pequena induzível (homóloga à do rato Mip-la) (SCYA3) NM_002984 CCL4 A4 citocina pequena induzível (homóloga à do rato Mip-lb) (SCYA4) NM_005409 CXCL11 Pequeno induzível citocina subfamília B, membro 11 (SCYB11) NM_000576 IL1B Interleucina-1, beta MM_000577 IL1RN Interleucina-1 receptor antagonista MM_002852 PTX3 Pentaxin gene relacionado, rapidamente induzido por IL-1B NM_007315 STAT1 Transdutor de sinal e ativador de transcrição 1 NM_0 0217 6 IFNB1 Interferon, beta 1, fibroblastos NM_005531 IFI16 Interferon, gamma proteína indutível-16 NM_001548 IFIT1 Interferon induzida pela proteína com repetições tetratricopeptide 1 MM_002462 MX1 Resistência myxovirus (influenza) 1 Número de acesso Nome do Gene Descrição do Gene NM 000598 IGFBP3 Insulina - Como fator de crescimento - proteina gene-3 NM 053056 CCND1 Ciclina Dl (PRAD1: paratireoide adenomatose D NM 002965 S100A9 S100 proteínas, cálcio vinculativo A9 (calgranulina B) NM 002468 MYD8 8 Mieloide diferenciação proteina resposta primária NM 000593 TAP1 Transportador 1, ATP-cassete de ligação, subfamilia B (MDR / TAP) MM 000544 TAP2 Transportador 2, ATP-cassete de ligação, subfamilia B (MDR/TAP) NM 007188 ABCB8 ATP-cassete de ligação, subfamilia B (MDR/TAP), membro 8 NM 031460 KCNK17 Canal de potássio, K subfamilia, membro 17 (TASK-4) NM 002659 PLAUR Ativador do plasminogênio, recetor uroquinase NM 004054 C3AR1 C3a recetor quimiotático anafilotoxina (c3a-R)
NM 004048 B2M Beta 2-microglobulina Número de acesso Nome do Gene Descrição do Gene MM_015907 LAP3 Leucina aminopeptidase NM_004994 MMP9 Colagénio tipo IV, metaloproteinase de matriz 9 NM_006074 TRIM22 Motivo Tripartite contendo 22 MM_144573 NEXN Nexilin (F proteína actina obrigatório) NM_021634 LGR7 Leucine-rich repetido-contendo recetor acoplado à proteína G-7 NM_198066 GNPNAT1 fosfato de glucosamina N-acetiltransferase 1 No_002346 LY6E Antigénio do linfócito 6 complexo, locus E
Tabela 3 - Os genes para os quais a transcrição induzida por LPS foi regulada por inibição da farnesiltransferase, tal como medido pela transcriptase reversa e análise em tempo real PCR Número de acesso Nome do Gene Descrição do Gene NM 000576 IL1B Interleucina-1, beta NM 002982 CCL2 Proteína quimiotática de monócitos 1 (MCP-1) NM 004994 MMP9 Colagénio tipo IV, Metaloproteinase de matriz 9 NM_0 07315 ST ATI Transdutor de sinal e ativador de transcrição 1 NM 002468 MYD8 8 Mieloide diferenciação proteína resposta primária NM 000600 IL6 Interleucina 6
Tabela 4 - As proteínas para as quais a produção induzida por LPS foi regulada por inibição da farnesiltransferase, tal como medido por ELISA ou análise Luminex Número de acesso Nome da proteína Descrição da proteína NP_000585 TNF-a Fator de necrose tumoral (TNF superfamília,membro 2) NP_000591 IL-6 Interleucina 6, o interferão beta 2 NP 000567 IL-1 p Interleucina-1, beta pro proteína NP_0 02 97 3 CCL2 MCP-1, pequeno induzível precursor A2 citocina NP_0 02 97 4 CCL3 A3 citocina pequena induzivel (homóloga à do rato Mip-la) AAG32620 IL12p4 0 Interleucina 12 subunidade p40 NP 004985 MMP-9 Colagénio tipo IV, metaloproteinase de matriz 9
Como descrito acima, um ou mais dos genes e proteínas acima identificadas podem ser utilizadas como um marcador para estudar a resposta de um sujeito ao tratamento com um FTI. A inibição da FPTase pode diminuir a transcrição induzida por LPS de, por exemplo, IL-Ιβ, MCP-1, MMP-9, MyD88, STAT1, ΜΙΡ-Ια, TNF-a ou IL-6. Consequentemente, a transcrição de IL-Ιβ, MCP-1, MMP-9, MyD8 8, STAT1, ΜΙΡ-Ια, TNF-a e IL-6 pode ser reduzida pela administração de um inibidor da farnesiltransferase e podem ser utilizados como um painel de marcadores para a monitorização de pacientes num estudo clinico. A inibição da FPTase pode também diminuir ou inibir a transcrição de IL-Ιβ, MCP-1, MMP-9, MyD88, STAT1, ΜΙΡ-Ια, TNF-a ou IL-6 induzida por outros agentes que não o LPS. Assim, a administração de um FTI a um paciente pode ser útil para o tratamento de doenças e condições médicas mediadas por meio de transcrição de IL-Ιβ, MCP-1, MMP-9, MyD88, STAT1, ΜΙΡ-Ια, TNF-a ou IL-6. A inibição de FPTase também pode diminuir a tradução da proteina induzida por LPS ou secreção de IL-Ιβ, MCP-1, MMP-9, MyD88, STAT1, MIP-1, TNF-α e IL-6. Assim, uma doença ou condição médica mediada por uma proteina induzida por LPS tradução ou secreção de IL-Ιβ, MCP-1, MMP-9, MyD88, STAT1, MIP-la, TNF-a IL-6 pode ser tratada através da administração de um inibidor de Farnesiltransferase, e o progresso do tratamento pode ser monitorizado medindo os niveis de tais marcadores. Além disso, uma vez que a inibição da FPTase pode servir para inibir a tradução de proteinas ou a secreção de IL-Ιβ, MCP-1, MMP-9, MyD88, STAT1, MIP-la, TNF-a ou IL-6 induzida por outros agentes de LPS, a administração de um FTI pode ser útil para o tratamento de doenças e condições médicas mediadas através da tradução de proteinas ou a secreção de IL-Ιβ, MCP-1, MMP-9, MyD88, STAT1, MIP-1 a, TNF-a e/ou IL-6. A inibição da FPTase pode também servir para inibir a transcrição ou tradução de MyD88 ou STAT1. A inibição da transcrição ou da tradução de proteinas ou a secreção de TNF-a, IL-Ιβ, MCP-1, IL-6, MMP-9, ou MIP-la pode também ser alcançada através da administração de um inibidor de Farnesiltransferase, e o progresso do tratamento pode ser monitorizado medindo os niveis deste conjunto de marcadores.
Por conseguinte, FTIs pode ser usada para tratar a inflamação e condições inflamatórias. Doenças e condições médicas que podem beneficiar com o tratamento com um FTI incluem: arteriosclerose e outras doenças vasculares, tais como reestenose, trombose após angioplastia e/ou colocação de stent, e veia-enxerto da doença após cirurgia de bypass, assim como a colite ulcerosa, doença de Crohn, rinite alérgica, doença do enxerto-versus-hospedeiro, conjuntivite, asma, artrite reumatoide, osteoartrite, ARDS, doença de Behcet, rejeição de transplantes, urticária, dermatite alérgica, alopecia areata, esclerodermia, exantema, eczema, dermatomiosite, acne, diabetes, lúpus eritematoso sistémico, doença de Kawasaki, esclerose múltipla, enfisema, fibrose cistica, bronquite crónica e psoriase. FTIs pode também ser utilizado para tratar a inflamação induzida por LPS, em particular. Assim, uma quantidade terapeuticamente eficaz de um FTI pode ser administrada para o tratamento de um paciente com necessidade de tratamento de uma das seguintes doenças ou condições médicas: sépsis, choque endotóxico, sindrome de disfunção orgânica múltipla, periodontite, peritonite, anorexia, leucocitose microvascular, inflamação pulmonar, hiperresponsividade das vias aéreas, lesão pulmonar aguda, sindrome da angústia respiratória aguda, doença crónica das vias aéreas, hiperplasia das células caliciformes, pancreatite, síndroma nefrótica, pirexia, dano hepático, parto prematuro, doença de Crohn, colite ulcerativa, edema cerebral, arteriosclerose, falência cardíaca, icterícia obstrutiva, neuro inflamação, isquemia cerebral, hiperalgesia, alodinia retal, sindrome de coagulação intravascular dissimulada, hiperglicemia, resistência à insulina, apneia obstrutiva do sono. FTIs pode também ser utilizado para tratar a aterosclerose. Assim, uma quantidade terapeuticamente eficaz de um FTI pode ser administrada a um sujeito diagnosticado com aterosclerose para tratar o individuo com necessidade de tal tratamento.
Além disso, FTIs podem ser utilizados para tratar a asma. Uma quantidade terapeuticamente eficaz de um FTI pode, portanto, ser administrada a um sujeito com necessidade de tratamento para a asma.
Além disso, uma quantidade terapeuticamente eficaz de um FTI pode ser administrada a um sujeito diagnosticado com esclerose múltipla (MS), para tratar o individuo com necessidade de tal tratamento.
Além disso, uma quantidade terapeuticamente eficaz de um FTI pode ser administrada a um sujeito diagnosticado com ou experimentando sépsis ou choque séptico para tratar o individuo com necessidade de tal tratamento.
Por conseguinte, os métodos de controlo são, portanto, úteis em ligação com a determinação da eficácia FTI no tratamento das indicações acima descritas.
Exemplos de compostos inibidores de farnesiltransferase úteis para tais tratamentos encontram-se descritos abaixo. Um FTI especialmente preferido é tipifarnib. A presente revelação proporciona vários métodos para a determinação da resposta de um sujeito ao tratamento, tal como para uma das doenças ou condições médicas acima descritas, com um inibidor da farnesiltransferase (FTI). Em tais métodos, uma amostra de sangue não tratado e uma amostra de sangue tratada com FTI são tiradas. Os seguintes podem ser usados como tipos de "amostras de sangue": o sangue total; plasma (por exemplo, separado por centrifugação), soro de plasma (por exemplo, obtido por tubos separadores de coagulação ou soro) , ou células totais ou subconjuntos isolados (por exemplo, PBMC).
Como uma medida de controlo útil com qualquer um dos tipos acima de amostras de sangue, IL-8, os niveis de proteina podem opcionalmente ser determinados antes e após o tratamento com um FTI (por exemplo, tipifarnib), por exemplo, através da utilização de coloração por imunofluorescência, citometria de fluxo, imunocitoquimica, imunohistoquimica, immunoblotting, ELISA, ou multiplex análise de matriz de citocinas. Como um especialista compreenderá, outras medições podem ser utilizadas, como um controlo, ou o método pode ser praticado sem a utilização de um controle. Por exemplo, no plasma ou no soro, os niveis da proteina de albumina pode ser utilizada como um controlo. Além disso, o método pode ser praticado sem um controlo interno, comparando as medições em uma amostra de sangue não tratado para uma amostra de sangue tratada com FTI . À medida que o marcador (s) úteis para monitorar o progresso do tratamento com qualquer uma das amostras de sangue, os niveis da proteina de um ou mais dos genes ou proteínas nas Tabelas 2, 3 e 4, podem ser medidos antes e depois do tratamento FTI, por exemplo, utilizando qualquer um dos métodos descritos acima, em que a diminuição é indicativa de uma resposta ao tratamento.
Alternativamente, com a totalidade do sangue ou de células ou subconjuntos específicos de células (por exemplo, PBMCs), IL-8, os níveis de ARN podem, opcionalmente, ser medidos como um controlo antes e depois do tratamento FTI (sob condições em que os níveis de IL-8 não se alteram com o tratamento, este gene serve como um controlo), por exemplo, através da realização de proteção de RNase, a transcriptase reversa (RT) de polímero reação em cadeia (PCR) , RT e em tempo real quantitativa de PCR, Northern blot e análise de chip de cADN ou de oligonucleótido. Como um especialista compreenderá, outras medições podem ser utilizados como um controlo, ou o método pode ser praticado sem a utilização de um controlo. Outras medições de controlo vulgarmente utilizadas incluem os niveis de mRNA de Glyc-eraldehyde-3-fosfato desidrogenase (GAPDH) ou beta-actina. Além disso, o método pode ser praticado sem um controlo interno, comparando as medições numa amostra de sangue não tratado com uma amostra de sangue tratada com FTI .
Para esta divulgação no geral utilizada com os tipos específicos de amostras de sangue, os níveis de ARN, de um ou mais dos genes ou proteínas listados nas Tabelas 2, 3 e 4 são medidos antes e depois do tratamento com um FTI (onde uma diminuição com tratamento reflete resposta).
Numa divulgação geral alternativa, a totalidade do sangue, a totalidade das células, ou subconjuntos de PBMC ou outras células são tratadas com LPS. Como um controlo, níveis de IL-8 são opcionalmente medidos em proteína ou RNA, ou de outro modo conhecidas na especialidade, como descrito acima. Os níveis de um ou mais marcadores das tabelas 2, 3 e 4 são medidos em amostras de LPS-tratadas com proteínas ou RNA como nas outras divulgações, com uma diminuição nos níveis de proteína/RNA, ao longo do tempo o tratamento com um FTI indicou uma resposta. Do mesmo modo, um agente que não seja LPS que também induz ARN ou proteína para o marcador (s) podem ser utilizados no lugar de LPS para o tratamento das amostras, e, em seguida, os níveis de proteínas ou ARN de, opcionalmente, IL-8 (ou outros controlos), e um ou mais marcadores podem ser medidos como antes para monitorizar a resposta ao tratamento FTI.
Numa divulgação, a resposta de um sujeito submetido a esse tratamento compreende os seguintes passos: (1) recolha de uma amostra de sangue do referido indivíduo, antes do tratamento e após o tratamento com FTI, e, opcionalmente, em momentos diferentes durante o tratamento FTI, (2) opcionalmente, separação de células e plasma (de preferência, por centrifugação), (3) opcionalmente, uma medição de nível de IL-8 ou outro controlo (de preferência por immunoblotting, ELISA ou análise de matriz multiplex citocina) no plasma, antes e depois do tratamento FTI como um controlo, e (4) de medição (de preferência por imunotransferência ou ELISA ou análise multiplex matriz de citocinas) um nível de um ou mais dos marcadores identificados nas Tabelas 2, 3 e 4, de preferência um ou mais de IL-6, MCP-1, IL-Ιβ, MMP -9, TNF-α no plasma, antes e depois do tratamento FTI, e (5) comparar os níveis dos ditos marcadores (s) medidos antes e após o tratamento com FTI. Numa divulgação particular, a diminuição dos níveis de IL-6, MCP-1, IL-Ιβ, MMP-9, a MIP-1 e / ou TNF-oí após, e, opcionalmente, durante o tratamento FTI, em relação ao pré-tratamento FTI, deveria indicar uma resposta ao tratamento FTI . A presente descrição apresenta um método para a determinação da resposta ao tratamento com um inibidor da farnesiltransferase (FTI) compreendendo: (1) recolha de uma amostra de sangue do sujeito, antes do tratamento e após o tratamento FTI, e, opcionalmente, em momentos diferentes durante o tratamento FTI, (2) opcionalmente, isolar as células mononucleares do sangue periférico (PBMC) de sangue (de preferência por separação gradiente Ficoll-Paque), (3) estimular a PBMC isolada com LPS (de preferência de 10 mg/ml de LPS), e (4) opcionalmente, a medição de um nivel de IL-8 ou outro controlo (de preferência por imunotransferência ou ELISA ou análise multiplex matriz citocina) no plasma, antes e depois do tratamento FTI como um controlo, e (4) de medição (de preferência por imunotransferência ou ELISA ou análise multiplex matriz de citocinas) um nivel de um ou mais dos marcadores das Tabelas 2, 3, e 4 (por exemplo, IL-6, MCP-1, IL-Ιβ, MMP-9, ΜΙΡ-Ια e / ou TNF-a) na PBMC antes e após o tratamento, e FTI (5) comparação dos niveis dos ditos marcadores (s) medidos antes e após o tratamento com FTI, em que a diminuição dos niveis de marcador (s) depois de, e, opcionalmente, durante o tratamento FTI, em relação ao pré- tratamento FTI, indicaria uma resposta ao tratamento com FTI. A presente descrição também proporciona um método para determinar a resposta ao tratamento com um inibidor da farnesiltransferase (FTI), num indivíduo com necessidade de tratamento com os mesmos, que compreende as seguintes etapas: (1) recolha de uma amostra de sangue do referido indivíduo, antes do tratamento FTI, após tratamento FTI e, opcionalmente, em momentos diferentes durante o tratamento FTI, (2) isolando as células mononucleares do sangue periférico (PBMC) de sangue (de preferência por separação gradiente Ficoll-Paque), (3) estimular a PBMC isolada com LPS (de preferência de 10 ng/ml de LPS) , (4) isolamento de ARN a partir do sangue ou amostras de PBMC, (5) medição da expressão de RNA (de preferência, por análise de transferência de Northern, ou cADN microarray oligonucleótido, ou transcriptase reversa e PCR em tempo real) em um ou mais marcadores (preferencialmente IL-Ιβ, MCP-1, MMP-9, MyD88, STAT1 e/ou IL-6) , nas amostras de ARN, (6) opcionalmente, medindo a expressão de ARN de IL-8 (ou outros) como um controlo, e (7) comparando-se os niveis do marcador (s) no RNA medida antes e após o tratamento com FTI, em que a redução induzida por LPS expressa do marcador (s) depois de, e, opcionalmente, durante o tratamento FTI, em relação ao pré-tratamento FTI, indicaria uma resposta a tratamento FTI.
Exemplos de inibidores de farnesiltransferase que podem ser empregues de acordo com a presente invenção são os compostos da reivindicação 1 de fórmula geral I. 0 âmbito das reivindicações é limitado pelas reivindicações em anexo. São também revelados os compostos de fórmula (II), (III), (IV), (V), (VI), (VII), (VIII) ou (IX). FTIs preferidos incluem compostos de fórmula (II) ou (III):
os sais ácidos de adição farmacêutica aceitáveis e as suas formas estereoquimicamente isoméricas, em que a linha a tracejado representa uma ligação opcional; X é oxigénio ou enxofre; R1 é hidrogénio, Ci-i2alquilo, Ar1, Ar2Cl-6alquilo, quinolinylCi_6alquilo, pyridylCi-Galquilo, hidroxialquiloi-G alquilo, Ci-6alkyloxyCi-6alquilo, mono- ou di (Ci-6alquil) aminoCi_6alquilo, aminoCi_6alquilo, ou um radical de fórmula-Alk1-C (= 0) -R9, -Alk1-S (0) -R9 ou-Alk^S (0) 2-R9' em que
Alk1 é alcanodiilo Cl-6, R9 representa um grupo hidroxi, Ci_6alquilo, Ci_6alquiloxi, amino, Ci-salquilamino ou Ci-salquilamino substituído com Ci_6 alquiloxicarbonilo; mono- R2' R3 e R16 cada um independentemente, são hidrogénio, hidroxilo, halo, ciano, Ci-6alquilo, Ci_6alquiloxi, hidroxi Ci_6alquiloxi, Ci-6alquiloxiCi-6alquiloxi, aminoCi_6alquiloxi, ou di (Ci_6alquil) aminoCi_6alquiloxi, Ar1, Ar2Ci_6 alquilo, Ar2-oxi, Ar2Ci_6 (alquiloxi) , hidroxicarbonilo, Ci_6 alquiloxicarbonilo, trihalometilo, trihalometoxi, C2-6 alquenilo, 4,4-dimetiloxa-zolil, ou quando em posições adjacentes, R2 e R3 tomados em conjunto podem formar um radical bivalente de fórmula -O-CH2-O- (a-1) , -O-CH2-CH2-O- (a-2) , -0-CH=CH- (a-3), -O-CH2-CH2- (a-4) , -O-CH2-CH2-CH2- (a-5) , ou -CH=CH-CH=CH- (a-6); R4 e R5' cada um independentemente, são hidrogénio, halo,
Ar1, Ci_6alquilo, hidroxialquiloCi_6alquilo, Ci_6alquilo alkyloxyCi-6, Ci_6alquiloxi, Ci-6alquí lio, amino, hidroxicarbonilo, Ci_6alquiloxicarbonilo, Ci_6alquil (0) Ci_6 alquilo ou Ci_6alquilos (0) 2Ci_6alquilo; R6 e R7' cada um independentemente, são hidrogénio, halo, ciano, Ci_6alquilo, Ci_6alquiloxi, Ar2-oxi, tri-halometilo, Ci_6alquilio, di (Ci_6alquil) amino, ou quando em posições adjacentes de R6 e R7 tomados em conjunto podem formar um radical bivalente de fórmula -O-CH2-O- (c-1), ou -CH=CH-CH=CH- (c-2); R8 é hidrogénio, Ci_6alquilo, ciano, hidroxicarbonilo, Ci-e alquiloxicarbonilo, Ci_6alquilcarbonilCi_6alquilo, cianoCi_6 alquilo, Ci_6alquiloxicarbonilCi_6alquilo, carboxiCi_6alquilo, hidroxialquiloCi_6alquilo, aminoCi_6alquilo, mono- ou di (Ci_6 alquil) aminoCi_6alquilo, imidazolilo, haloCi_6alquilo, Ci_6 alquiloxiCi_6alquilo, aminocarbonilCi_6alquilo, ou um radical de fórmula -OR10 (b—1) , -SR10 (b-2), -NR11R12 (b-3) , em que R10 é hidrogénio, Ci_6alquilo, Ci_6alquilcarbonilo, Ar1' Ar2 Ci_6alquilo, Ci-6alquiloxicarbonilCi_6alquilo, ou um radical de fórmula-Alk2-OR13 ou -Alk2-NR14R15; R11 é hidrogénio, Ci-i2alquilo, Ar1 ou Ar2Ci_6alquilo; R12 é hidrogénio, Ci_6alquilo, Ci_i6alquilcarbonilo, Ci_6 alquiloxicarbonilo, Ci_6alquilaminocarbonilo, Ar1, Ar2Ci_6 alquilo, Ci_6alkylcarbonylCi_6alquilo, um aminoácido natural, Ar1carbonilo, Ar2Ci-6alquilcarbonilo, aminocarbonilcarbonil, Ci-6alquiloxiCi_6alquilcarbonilo, hidroxi, Ci_6alquiloxi, aminocarbonilo, di (Ci_6alquil) aminoCi_6alquilcarbonilo, amino, Ci_6alquilamino, Ci_6alquilcarbonilamino, ou um radical de fórmula -Alk2-OR13 ou -Alk2-NR14R15; em que
Alk2 é alcanodiiloCi-6; R13 é hidrogénio, Ci_6alquilo, Ci_6alquilcarbonilo, hidroxialquiloCi_6alquilo, Ar1 ou Ar2Ci_6alquilo; R14 é hidrogénio, Ci_6alquilo, Ar1 ou Ar2Ci_6alquilo; R15 é hidrogénio, Ci_6alquilo, Ci_6alquilcarbonilo, Ar1 ou Ar2 Ci_6alquilo; R17 é hidrogénio, halo, ciano, Ci_6alquilo, Ci_6 alquiloxicarbonilo, Ar1, R18 é hidrogénio, Ci_6alquilo, Ci_6alquiloxi ou halo; R19 é hidrogénio ou alquilo Ci_6;
Ar1 é fenilo ou fenilo substituído com Ci_6alquilo, hidroxilo, amino, Ci_6 alquiloxi ou halo; e
Ar2 é fenilo ou fenilo substituído com Ci_6alquilo, hidroxi, alquiloxi, aminoCi-6 ou halo.
Nas fórmulas (b) , (II) e (III)' r4 ou R5 também podem estar ligados a um dos átomos de azoto no anel imidazol. Nesse caso, o hidrogénio no azoto é substituído por R4 ou R5 e o significado de R4 e R5 quando ligados ao azoto está limitado ao hidrogénio, Ar1, Ci_6alquilo, hidroxialquiloCi-6 alquilo, Ci-6alkyloxyCi-6alquilo, Ci_6alquiloxicarbonilo, Ci-6 al quilos (0) Ci-6al quilo, Ci-6al quilos (0)2Ci-6al quilo.
Na fórmula I, de preferência, o substituinte R18 está situado na posição 5 ou 7 da fração quinolinona e o substituinte R19 está situado na posição 8 quando R18 está na posição 7.
Os exemplos preferidos de FTIs são aqueles compostos de fórmula (I) em que X é oxigénio.
Além disso, exemplos de inibidores compostos da FPTase úteis são estes compostos de fórmula (I) onde a linha tracejada representa uma ligação, de modo a formar uma ligação dupla.
Um outro grupo de compostos ilustrativos são os compostos de fórmula (I) em que R1 é hidrogénio, Ci_6alquilo, Ch-galkyloxyCi-ealquilo, di (Ci_6alquil) aminoCi_6alquilo, ou um radical de fórmula-Alk1-C (=0) -R9' em que Alk é um metileno e R9 é Ci_8 alquilamino substituído com Ci_6 alquiloxicarbonilo.
Ainda outro grupo de compostos exemplares são os compostos de fórmula (I) em que R3 é hidrogénio ou halo e R2 é halo, Ci_6alquilo, C2-6alcenilo, Ci-6alquiloxi, trihalometoxi ou hidroxialquilo i _6 alquiloxi.
Um outro grupo de compostos ilustrativos são aqueles compostos de fórmula (I) em que R2 e R3 estão em posições adjacentes e tomados em conjunto para formar um radical bivalente de fórmula (a-1), (a-2) ou (a-3). são os e R4 é
Ainda um outro grupo de compostos exemplares compostos de fórmula (I) em que R5 é hidrogénio hidrogénio ou Ci-6alquilo. aqueles R6 é um cloro,
Ainda outro grupo de compostos ilustrativos são compostos de fórmula (I) em que R7 é hidrogénio e grupo alquiloCi-6 ou halo, preferivelmente especialmente 4-cloro.
Outro grupo exemplar de compostos são os compostos de fórmula (I) em que R8 é hidrogénio, hidroxi, haloCi_6 alquilo, hidroxialquiloCi_6alquilo, cianoCi_6alquilo, Ci_6 alkyloxycarbonylCi-6alquilo, imidazolilo, ou um radical de fórmula-NRnR12 em que R11 é hidrogénio ou alquiloCi-12 e R12 é hidrogénio, Ci_6alquilo, Ci_6alquiloxi, hidroxi, Ci_ 6alquiloxiCi-6alquilcarbonilo, ou um radical de fórmula-Alk 2-OR13 em que R13 é hidrogénio ou um grupo alquiloCi-6.
Os compostos preferidos são aqueles compostos em que R1 é hidrogénio, Ci_6alquilo, Ci_6alkyloxyCi-6alquilo, di (Ci_6alquil) aminoCi_6alquilo, ou um radical de fórmula-Alk1-C (= 0)-R9' em que Alk é um metileno e R9 é Ci-g alquilamino substituído comCi-6 alquiloxicarbonilo; R2 é halo, Ci_6alquilo, C2-6 alquenilo, Ci_60xi, tri-halometoxi, hidroxialquiloCi-6 alquiloxi ou Ar1, R3 é hidrogénio; R4 é metilo ligado ao azoto na posição 3 do imidazol; R5 é hidrogénio, R6 é cloro; R7 é hidrogénio; R8 é hidrogénio, hidroxi, haloCi_6 alquilo, hidroxialquiloCi_6alquilo, cyanoCi_6alquilo, Ci_6 alquiloxicarbonilCi_6alquilo, imidazolilo ou um radical de fórmula geral - NR11R12 em que R11 é hidrogénio ou alquilo Ci-12 e R12 é hidrogénio, Ci_6alquilo, Ci-6alquiloxi, Ci_6 alquiioxyCi-6alquilcarbonilo, ou um radical de fórmula-Alk2-OR13 em que R13 é um grupo alquilo Ci_6f R17 é hidrogénio e R 18 é hidrogénio.
Os compostos especialmente preferidos são os seguintes: 4-(3-clorofenil)-6-[(4-clorofenil)-hidroxi(1-metil-lH-midazol-5-il)metil]-l-metil-2-ΙΗ)-quinolinona; 6-[amino(4-clorofenil)-l-metil-lH-imidazol-5-ilmetil]-4-(3-clorofenil)-l-metil-2(1H)-quinolinona; 6-[(4-clorofenil)hidroxi(l-metil-lH-imidazol-5-il)metil]-4-(3-etoxifenil)-l-metil-2 (1H)-quinolinona; 6-[(4-clorofenil)(l-metil-lH-imidazol-5-il)metil]-4-(3-toxi fenil)-l-metil-2(1H)-quinolinona monohidrocloreto . mono-hidratado; 6-[amino(4-clorofenil) (l-metil-lH-imidazol-5-il)metil]-4 (3-etoxifenil)-l-metil-2(1H)-quinolinona; 6-amino(4-clorofenil)(l-metil-lH-imidazol-5-il)metil]-1 metil-4-(3-propilfenil)-2(1H)-quinolinona; uma forma estereoisomérica ou um farmaceuticamente ácido aceitável ou sal de adição de base, e(+)-6-[amino(4-clorofenil)(1-metil-lH-imidazol-5-il)metil]-4-(3-clorofenil)-l-metil-2(1H)-quinolinona (tipifarnib; Composto 75 na Tabela 1 do documento WO 97/21701), ou um seu sal de adição de ácido farmaceuticamente aceitável.
Tipifarnib ou ZARNESTRA ® é um FTI especialmente preferido. São também revelados os compostos de fórmula (IX) em que um ou mais dos seguintes se aplicam: =X1-X2-X3 é um radical trivalente de fórmula (x-1), (x-2), (x-3) , (x-4) ou (x-9) em que cada R6 é, independentemente, hidrogénio, C1-4 alquilo, Ci-4alquiloxicarbonilo, amino ou arilo e R7 é hidrogénio; > Y1-Y2- é um radical trivalente de fórmula (y-1), (y-2), (y— 3) ou (y— 4) em que cada R9 independentemente, um átomo de hidrogénio, halo, carboxilo, Ci_4alquilo ou C1-4 alquiloxicarbonilo; r é 0, 1 ou 2; s é 0 ou 1; t é 0; R1 é halo, alquiloCi-6 ou dois substituintes R1 entre si no anel fenilo podem, independentemente formar em conjunto um radical bivalente de fórmula (a-1); R2 é halo; R3 é halogéneo ou um radical de fórmula (b-1) ou (b-3) em que R10 é hidrogénio ou um radical de fórmula-Alk-OR 13' R11 é hidrogénio; R12 é hidrogénio, Ci_6alquilo, Ci_6alquilcarbonilo, hidroxi, Ci-6alquiloxi ou mono- ou di (Ci-6alquil) aminoCi-6 alquilcarbonilo; Alk é alcanodiiloCi-6 e R13 é hidrogénio; R4 é um radical de fórmula (c-1) ou (c-2) em que R16 é hidrogénio, halogénio ou mono- ou di (Ci_4alquil) amino; R17 é hidrogénio ou alquiloCi_6; arilo é fenilo.
Também é revelado um grupo de compostos que consiste nos compostos de fórmula (IX) em que =X4-X2-X3 é um radical trivalente de fórmula (x-1), (x-2), (x-3), (x-4) ou (x-9),> Y1-Y2 é um radical trivalente de fórmula (y-2), (y-3) ou (y-4) , r é 0 ou 1, s é 1, t é 0, R1 é halo, C(i-4)alquilo ou forma um radical bivalente de fórmula (a-1), R e halo ou
Ci-4 alquilo, R3 é hidrogénio ou um radical de fórmula (h — 1) ou (b-3) , R4 é um radical de fórmula (c-1) ou (c-2), R6 é hidrogénio, Ci_4alquilo ou fenilo, R7 é hidrogénio, R9 é hidrogénio ou Ci_4alquilo, R10 é hidrogénio ou-Alc-0 R13' R11 é hidrogénio e R12 é hidrogénio ou Ci_6alquilcarbonilo e R13 é hidrogénio; São também revelados os compostos de fórmula (IX) em que =X1-X2-X3 é um radical trivalente de fórmula (x-1) ou (x-4),> Y1-Y2 é um radical trivalente de fórmula (y- 4), r é 0 ou 1, s é 1, t é 0, R1 é halo, preferivelmente cloro, R2 é halo, preferivelmente 4-cloro ou 4-flúor, R3 é hidrogénio ou um radical de fórmula (b—1) ou (b-3), R4 é um radical de fórmula (c-1) ou (c-2), R6 é hidrogénio, R7 é hidrogénio, R9 é hidrogénio, R10 é hidrogénio, R11 é hidrogénio e R12 é hidrogénio.
Também são revelados os compostos de fórmula (IX) em que =X1-X2-X3 é um radical trivalente de fórmula (x-2), (x-3) ou (x-4),> Y1-Y2 é um radical trivalente de fórmula (y-2), (y- 3) ou (y-4), r e s são 1, t é 0, R1 é um grupo halo, de preferência cloro, e ainda mais preferivelmente de 3-cloro, ou R1 é Ci-4alquilo, de preferência, 3-metilo, R2 é halo, preferivelmente cloro, e mais preferivelmente cloro, R3 é um radical de fórmula (b—1) ou (b-3), R4 é um radical de fórmula (c-2), R6 é Ci_4alquilo, R9 é hidrogénio, R10 e R11 são hidrogénio e R12 é hidrogénio ou hidroxi. São também revelados os compostos de fórmula (IX) 7-[(4-fluorofenil)(lH-imidazol-l-il)metil]-5-phenylimida-zo[1,2— a] quinoleina; a- (4-clorofenil)-a-(l-metil-lH-imidazol-5-il)-5-enilimidazo [ 1,2 — a]quinolina-7-metanol; 5-(3-clorofenil)-α-(4-clorofenil)-α-(l-metil-lH-imidazol-5-yl)-imidazo[1,2-a]quinoline-7-metanol; 5-(3-clorofenil)-a-(4-clorofenil)-oí-(l-metil-lH-imidazol-5-yl)imidazo[1,2-a]quinoline-7-metenamina; 5-(3-clorofenil)-a-(4-clorofenil)-a-(l-metil-lH-imidazol-5-yl)tetrazolo[l,5-a]quinoline-7-metenamina; 5-(3-clorofenil)-a-(4-clorofenil)-1-metil-a-(1-metil-lH-imidazol-5-yl)-1,2,4-triazolo[4,3-a]quinoline-7-metanol; 5- (3-clorofenil)-a-(4-clorofenil)-a-(l-metil-lH-imidazol-5-yl)tetrazolo[l,5-a]quinoline-7-metenamina; 5-(3-clorofenil)-a-(4-clorofenil)-a-(l-metil-lH-imidazol-5-yl)tetrazolo[l,5-a]quinazoline-7-metanol ; 5-(3-clorofenil)-a-(4-clorofenil)-4,5-dihydro-a-(1-metil-lH-imidazol-5-yl)tetrazolo[1,5-a]quinazoline-7-metanol; 5-(3-clorofenil)-a-(4-clorofenil)-a-(l-metil-lH-imidazol-5-yl)tetrazolo[l,5-a]quinazoline-7-metenamina; 5-(3-clorofenil)-a-(4-clorofenil)-N-hydroxy-a-(1-metil-lH-imidazol-5-yl)tetrahydro[1,5-a]quinoline-7-metenamina; a- (4-clorofenil) -oí- (l-metil-lH-imidazol-5-yl) -5 (3-metilfenil)tetrazolo[1,5-a]quinoline-7-metenamina;os sais ácidos de adição farmaceuticamente aceitáveis e as suas formas estereoquimicamente isoméricas.
Também é revelado 5-(3-clorofenil)-a-(4-clorofenil)-oí-(l-metil-lH-imidazol-5-il)tetrazolo[1,5-a]quinazolinona-line-7-metanamina, seu (-) enantiómero, e seus sais de adição de ácido farmaceuticamente aceitáveis.
Tal como utilizado nas definições anteriores e daqui em diante "halo" engloba flúor, cloro, bromo e iodo; "Ci_ 6alquilo" inclui cadeia linear e ramificada de radicais de hidrocarbonetos saturados com 1 a 6 átomos de carbono, tais como, por exemplo, metilo, etilo, propilo, butilo, pentilo, hexilo e semelhantes; "Ci-galquilo" engloba a cadeia linear e ramificada de radicais de hidrocarbonetos saturados, tal bem como os como definidos para o grupo alquilo Ci_6, respetivos homólogos mais elevados contendo 7 ou 8 átomos de carbono, tal como heptilo ou octilo; "Ci-i2alquilo" compreende também um grupo Ci_8 alquilo e os seus homólogos superiores contendo 9 a 12 átomos de carbono, tais como nonilo, decilo, undecilo, dodecilo; "Ci_i6alquilo" similarmente compreende Ci_i2alquilo e os seus homólogos superiores contendo 13 a 16 átomos de carbono, tais como tridecilo, tetradecilo, hexadecilo e pentadecilo; "C2_ 6alcenilo" engloba radicais de hidrocarbonetos de cadeia linear e ramificada contendo uma ligação dupla e tendo desde 2 a 6 átomos de carbono, tal como etenilo, 2-propenilo, 3-butenilo, 2-pentenilo, 3-pentenilo, 3-metil-2-butenilo, e similares, e "Ci_6alcanodiilo" engloba força bivalente e cadeia linear e ramificada de radicais de hidrocarbonetos saturados com 1 a 6 átomos de carbono, tais como metileno, 1,2-etanodiilo, 1,3-propanodiilo, 1,4-bu-tanedilo, 1,5-pentanodiilo, 1,6-hexanodiilo e os seus isómeros ramificados. 0 termo "C(= 0)" refere-se a um grupo carbonilo, "S (0)" refere-se a um sulfóxido e "S(0) 2» refere-se a uma sulfona. 0 termo "aminoácido natural" refere-se a um aminoácido natural que está ligado via uma ligação amida covalente formada pela perda de uma molécula de água entre o grupo carboxilo do aminoácido e o grupo amino do restante da molécula (exemplos de aminoácidos naturais são glicina, alanina, valina, leucina, isoleucina, metionina, prolina, fenilalanina, triptofano, serina, treonina, cisteína, tirosina, asparagina, glutamina, ácido aspártico, ácido glutâmico, lisina, arginina e histidina). 0 ácido farmaceuticamente aceitável ou sais de adição de bases, como aqui mencionados acima pretendem compreender o ácido terapeuticamente ativo não tóxico e formas de sais de adição não-tóxicos que os compostos de fórmulas (I), (II), (III), (IV), (V), (VI), (VII), (VIII) ou (IX) são capazes de formar. Os compostos de fórmulas (I), (II), (III), (IV), (V) , (VI), (VII), (VIII) ou (IX), que têm propriedades básicas podem ser convertidos nos seus sais de adição de ácido farmaceuticamente aceitáveis, através do tratamento da forma base com um ácido apropriado. Os ácidos apropriados incluem, por exemplo, ácidos inorgânicos tais como ácidos hidrohálicos, ácido clorídrico ou ácido bromidrico, por exemplo, sulfúrico, nitrico, fosfórico e ácidos afins, ou ácidos orgânicos, tais como ácido acético, propanoico, hidroxiacético, láctico, pirúvico, oxálico, malónico, succinico (isto é, ácido butanodióico), maleico, fumárico, málico, tartárico, cítrico, metanossulfónico, etanossulfónico, benzenossulfónico, p-toluenossulf único, ciclâmico, salicílico, p-aminossalicílico, pamóico e ácidos afins.
Os compostos de fórmula (I) que têm propriedades acídicas podem ser convertidos nos seus sais de adição de bases farmaceuticamente aceitáveis capazes tratando a forma ácida com uma base orgânica ou inorgânica adequada. As formas de sais de base apropriadas compreendem, por exemplo, os sais de amónio, os sais alcalinos e de metais alcalino-terrosos, por exemplo, de lítio, sódio, potássio, magnésio, sais de cálcio e do género, sais com bases orgânicas, por exemplo, a benzatina, N-metil- D-glucamina, hidrabamina, e sais com aminoácidos, por exemplo, arginina, lisina e semelhantes.
Os sais de adição de ácido e de base, também compreendem os hidratos e as formas de adição de solvente que os compostos de fórmula (I) são capazes de formar. Exemplos de tais formas são por exemplo hidratos, alcoolatos e semelhantes.
Os compostos de fórmula (I) , tal como aqui utilizado, abrangem todas as formas estereoquimicamente isoméricas de fórmula estrutural (representando todos os compostos possiveis constituídos pelos mesmos átomos ligados pela mesma sequência de ligações mas tendo diferentes estruturas tridimensionais que não são intermutáveis) . A menos que de outro modo mencionado ou indicado, a designação quimica de um composto deva ser entendido como englobando a mistura de todas as possiveis formas estereoquimicamente isoméricas que o composto possa possuir. Tal mistura pode conter todos os diastereómeros e/ou enantiómeros da estrutura molecular básica do composto. Todas as formas estereoquimicamente isoméricas dos compostos de fórmula (I) quer na forma pura quer em mistura uns com os outros se destinam a ser englobadas dentro do âmbito da fórmula descrita.
Alguns dos compostos de fórmula (I) podem também existir nas suas formas tautoméricas. Tais formas, embora não explicitamente indicado na fórmula acima, destinam-se a ser incluídas dentro do âmbito da mesma.
Assim, a menos que indicado de outra forma a seguir, no termo "compostos de fórmula (1)" pretende-se incluir também o ácido farmaceuticamente aceitável ou sais de adição de base e todas as formas estereoisoméricas e tautoméricas. Outros inibidores de farnesiltransferase divulgados incluem Arglabin, álcool perrilyl, SCH-66336, 2 (S) — [2(S) — [2(R) — amino-3-mercapto]propilamino-3(S)-metil]-pentiloxi-3-fenil-propionil-metionina sulfona (Merck); L778123, BMS 214662,
Pfizer compostos A e B acima descrito. As dosagens adequadas ou quantidades terapeuticamente eficazes para o Arglabin compostos (WO98/28303), o álcool perrilil (WO 99/45712), SCH-66336 (EUA 5.874.442), L778123 (WO 00/01691), 2(S)-[2(S)-[2(R)-amino-3-mercapto] propilamino-3 (S)-metil]-pentiloxi-3-fenilpropionil-metioninasulfona (WO94/10138 BMS 214662 (WO 97/30992), os compostos A e Pfizer B (WO 00/12499 e WO 00/12498) são dados nas especificações de patente publicadas ou são conhecidos ou podem ser prontamente determinadas por um especialista.
Uma variedade de inibidores de farnesiltransferase podem ser preparados e formulados em composições farmacêuticas por métodos descritos na técnica, tais como as publicações citadas aqui. Por exemplo, para os compostos de fórmulas (I), e (III) os exemplos adequados podem ser encontrados em WO-97/21701. Os compostos de fórmulas (IV), (V) e (VI) podem ser preparados e formulados usando os métodos descritos em WO 97/16443, os compostos de fórmulas (VII) e (VIII), de acordo com os métodos descritos em WO 98/40383 e WO 98/49157 e os compostos de fórmula (IX) de acordo com métodos descritos em WO 00/39082, respetivamente. Tipifarnib (R115777) e o seu enantiómero menos ativo podem ser sintetizados por métodos descritos na WO 97/21701.
Para preparar as composições farmacêuticas acima mencionadas, uma quantidade terapeuticamente eficaz do composto particular, opcionalmente na forma de sal de adição, como ingrediente ativo é combinado ou misturado com um veiculo farmaceuticamente aceitável, veiculo ou diluente, o qual pode tomar uma larga variedade de formas dependendo na forma de preparação desejada para administração. Estas composições farmacêuticas estão desejavelmente na forma de dosagem unitária adequada, preferivelmente para administração sistémica, como administração oral, percutânea, ou parentérica, ou administração tópica, tal como por via de inalação, um spray nasal, gotas para os olhos ou via um creme, gel, champô ou semelhantes. Por exemplo, ao preparar as composições em forma de dosagem oral, qualquer um dos meios farmacêuticos usuais pode ser empregue, tal como, por exemplo, água, glicóis, óleos, álcoois e semelhantes no caso de preparações liquidas orais tais como suspensões, xaropes, elixires e soluções, ou veículos sólidos tais como amidos, açúcares, caulino, lubrificantes, ligantes, agentes de desintegração e semelhantes no caso de pós, pílulas, cápsulas e comprimidos.
Devido à sua facilidade de administração, os comprimidos e cápsulas representam a forma unitária de dosagem oral preferida, caso em que os veículos farmacêuticos sólidos são obviamente empregues. Para composições parentéricas, o agente veicular compreenderá usualmente água esterilizada, pelo menos em grande parte, embora outros ingredientes, por exemplo para auxiliar a solubilidade, possam ser incluídos. Soluções injetáveis, por exemplo, podem ser preparadas, nas quais o veículo compreende solução salina, solução de glucose ou uma mistura de solução salina e solução de glucose. As soluções injetáveis contendo compostos de fórmula (I) podem ser formuladas num óleo para ação prolongada. Os óleos apropriados para este fim são, por exemplo, óleo de amendoim, óleo de sésamo, óleo de semente de algodão, óleo de milho, óleo de soja, ésteres de glicerol sintéticos de ácidos gordos de cadeia longa e misturas destes óleos e outros.
Suspensões injetáveis também podem ser preparadas, caso em que podem ser empregues veículos líquidos apropriados, agentes de suspensão e similares. Nas composições adequadas para administração percutânea, o veículo compreende opcionalmente um agente potenciador da penetração e/ou um agente molhável apropriado, opcionalmente combinado com aditivos adequados de qualquer natureza em proporções menores, aditivos esses que não causam quaisquer efeitos prejudiciais significativos na pele. Os referidos aditivos podem facilitar a administração na pele e/ou podem ser úteis para preparar as composições desejadas. Estas composições podem ser administradas de várias maneiras, por exemplo, como um adesivo transdérmico, como um spot-on, como uma pomada. Conforme o caso, as composições para aplicação tópica podem incluir todas as composições habitualmente empregues para administrar fármacos topicamente, por exemplo cremes, geleias, pensos, champôs, tinturas, pastas, unguentos, pomadas, pós e afins. A aplicação das referidas composições pode ser por aerossol, por exemplo, com um propulsor tal como azoto, dióxido de carbono, um freon, ou sem um propulsor tal como uma bomba de pulverização, gotas, loções, ou um semissólido tal como uma composição espessa que pode ser aplicada com um cotonete. Em particular, as composições semissólidas tais como pomadas, cremes, geleias, unguentos e afins serão convenientemente utilizadas. É especialmente vantajoso formular as composições farmacêuticas acima mencionadas em formas de dosagem unitária para facilitar a administração e a uniformidade da dosagem. A forma de dosagem unitária, como aqui utilizada, refere-se a unidades discretas fisicamente adequadas como dosagens unitárias, cada unidade contendo uma quantidade predeterminada de ingrediente ativo, calculada para produzir o efeito terapêutico desejado, em associação com o veiculo farmacêutico necessário. Exemplos de tais formas unitárias de dosagem são comprimidos (incluindo comprimidos marcados ou revestidos), cápsulas, pílulas, saquetas de pó, hóstias, soluções ou suspensões injetáveis, colheres de chá, colheres de sopa e semelhantes, e seus múltiplos segregados.
Um composto inibidor de farnesiltransferase ou uma composição contendo um tal composto é usado numa utilização terapêutica do presente invento para o tratamento de um sujeito diagnosticado com, ou que sofre de um distúrbio ou condição mediada através da inibição da farnesiltransferase. Tratamentos de acordo com a presente invenção compreendem a administração a um sujeito de uma quantidade eficaz de um FTI ou composição contendo um FTI para tratar o distúrbio ou condição. 0 termo "tratar" ou "tratamento", tal como aqui utilizado pretende referir-se à administração de um composto ou composição a um indivíduo com necessidade de tratamento com o objetivo de efetuar um benefício terapêutico ou profilático desejado, através da inibição da atividade de farnesiltransferase. Tratar inclui inverter, melhorar, aliviar, inibir o progresso de, diminuir a severidade de, ou prevenção de uma desordem ou condição, ou de um ou mais sintomas de tal desordem ou condição. 0 termo "indivíduo" refere-se a um paciente mamífero, tal como um humano.
Num método de tratamento, de uma quantidade eficaz de um composto ou composição de TFI é administrada a um paciente que sofre de, ou diagnosticado como tendo a doença ou condição especificada. Uma "quantidade eficaz" significa uma quantidade ou dose geralmente suficiente para provocar o desejado benefício terapêutico ou profilático em indivíduos submetidos a tratamento.
Quantidades eficazes ou doses dos agentes do presente invento podem ser determinadas por métodos de rotina tais como a modelização, os estudos de escalonamento de dose ou ensaios clínicos, e tomando em consideração os fatores de rotina, por exemplo, o modo ou via de administração ou administração de medicamentos, a farmacocinética do agente, da gravidade e evolução da doença ou estado, terapia anterior ou em curso, o sujeito, o estado de saúde do indivíduo e da resposta a drogas, e o julgamento do médico assistente. Uma dose exemplar está num intervalo desde cerca de 0,001 até cerca de 200 mg por kg de peso do corpo do sujeito por dia, de preferência cerca de 0,05 a 100 mg/ kg/dia, ou cerca de 1 a 35 mg/kg/dia, em dose única ou unidades de dosagem parcelada (por exemplo, BID, TID, QID) . Para um humano de 7 0 kg, uma quantidade de dosagem ilustrativa é cerca de 0,05 a cerca de 7 g/dia, ou cerca de 0,2 a cerca de 2,5 g/dia.
Para compreender melhor e ilustrar a invenção e as suas formas de realização exemplares e vantagens, é feita referência à secção experimental que se segue.
EXPERIÊNCIAS
Nos estudos seguintes, os efeitos, in vitro e in vivo, de uma estatina (sinvastatina) são comparados com aqueles do FTI, tipifarnib (R115777, Zarnestra™), um inibidor potente e ativo por via oral. Os resultados confirmam que alguns, mas não todos, os efeitos anti-inflamatórios das estatinas são mediados através da inibição da farnesilação da proteína. Tipifarnib claramente demonstrou inibição global de LPS induzida pela inflamação in vitro e in vivo.
MATERIAIS E MÉTODOS
Materiais
Reagentes químicos foram adquiridos da Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) . Sinvastatina (forma ativa) foi adquirida a partir de Calbiochem (La Jolla, CA). Tipifarnib (R115777) e seu enantiómero menos ativo foram obtidos a partir de pesquisa farmacêutica Johnson & Johnson & Development, LLC. Células Humanas THP-1 foram obtidas a partir da American Type Culture Collection (Manassas, VA) . Cultura de células RPMI-1640 média e Penicilina-Estreptomicina foram adquiridas na Sigma-Aldrich, e soro fetal bovino (FBS) a partir de Gibco/Invitrogen (Carlsbad, CA). LPS foi a partir da Sigma-Aldrich.
Cultura de células Células THP-1 foram cultivadas em meio RPMI 1640, suplementado com 10% FBS/100 unidades/ml Estreptomicina
Penicilina/10yg / ml a 37°C, sob C02 a 5%. Os componentes do meio foram todos testados quanto à contaminação por endotoxinas e mostraram conter menos do que 0,3 unidades de endotoxina/ml. Para o isolamento de ARN, células THP-1 foram colhidas e lavadas duas vezes com PBS, em seguida ressuspensas a 4.5xl0sml/20ml em meio RPMI 1640 contendo FBS a 0,5%/LPS lOOng/ml e Sinvastatina (ΙΟμΜ), ou tipifarnib (5μΜ). Para o grupo de controlo não tratado (sem LPS, sem composto) e grupo de LPS sozinho, volumes equivalentes de DMSO foram adicionados ao meio. As células foram cultivadas a 37°C e pelotas foram coletadas em OHR, lh, 3h, 6h, 12h e 24h. Os sedimentos celulares foram armazenados a -80°C, para o caso do isolamento de ARN não ser realizado imediatamente. Para estudar a secreção de citocina em sobrenadantes de cultura nesta experiência, células THP-1 foram lavadas duas vezes com PBS, ressuspenderam-se em 3,4xl05/ml e foram cultivadas em placas de 96 poços a 250pL por poço a 37°C. As células foram cultivadas no meio contendo 0,5% de FBS/RPMI 1640, na ausência ou na presença de LPS lOOng/ml e simvastatina (5 μΜ e ΙΟμΜ), ou tipifarnib (2μΜ e 5μΜ). Os sobrenadantes foram recolhidos em pontos de tempo diferentes, tal como indicado nas figuras e foram mantidas a <-20°C até à análise da produção de citocinas.
Isolamento de ARN O ARN total foi isolado utilizando o kit de mini-RNeasy da Qiagen (Valência, CA) de acordo com as instruções do fabricante. As amostras de ARN foram armazenadas a -80°C.
Experiências de chip e análise de dados
Cinco pg de ARN total foi amplificado linearmente ao ADNc de cadeia dupla usando amplificação com base em T7. 0 ADNc foi purificado utilizando o kit QIAquick 96 kit de purificação PCR (QIAGEN Valência, CA) , e utilizado para gerar (a)ARN amplificado usando AmpliScribe T7 ™ Kit de Transcrição de Alto Rendimento (Epicentre, Madison, WI) . Dez pg de ARNA purificada foram transcritas de forma inversa em ADNc utilizando o SuperScript RTII kit (Invitrogen) e marcadas por incorporação direta de Cy3-dCTP. A sonda de ADNc gerada foi utilizada para hibridar com chips ADNc.
Os chips de ADNc humanos foram feitos como descrito anteriormente (KS Peterson, 2004), e continham cerca de 8000 genes humanos e ESTs. Cada clone foi flagrado em duplicado no chip. Preparação de ARN, síntese da sonda de ADNc e hibridação foram realizadas como descrito por Shaw et al. (Shaw KJ 2003) . A normalização de dados e a preparação foi realizada como descrito anteriormente (KS Peterson, 2004).
Genes foram selecionados como LPS-regulado se as razões entre LPS-tratadas e amostras não tratadas fossem maiores do que 1,5 vezes a mais do que dois pontos de tempo. Os genes que foram ainda regulados pela estatina ou FTI foram selecionados se a sua expressão fosse pelo menos 40% inferior, de um ou mais pontos de tempo, para o tratamento por LPS e estatina, ou LPS e FTI, versus LPS sozinho. Após a remoção da redundância, havia 22 genes selecionados como genes LPS-induzido que foram inibidos por tratamento com estatinas ou FTI.
Transcriptase reversa e quantitativo PCR em tempo real
Duas a três microgramas de ARN tratado com DNase-total foram transcritas reversamente em ADNc utilizando o transcritor Primeiro Strand Kit de Síntese de ADNc (Roche Diagnostics Corporation, Indianapolis, IN) de acordo com as instruções. PCR em tempo real foi realizado com o LightCycler FastStart DNA Masterplus SYBR Green I kit (Roche Diag nostics) de acordo com as instruções do fabricante. O volume final continha 20μ1: 4μΜ de MgC12, 0,5μΜ de cada iniciador, 2pL Master Mix e 2pL de ADNc. O perfil de PCR foi como se segue: (i) desnaturação a 95 ° C durante 10 min. (Ii) 45 ciclos de 0 s a 95°C, 5 s a 54-58°C (dependendo da Tm dos iniciadores), 6-16 s (determinado pelo comprimento do fragmento amplificado) a 72°C. (Iii) curvas de fusão para 0 s a 95°C, 15s a 65°C e 0 s a 95°C. (Iv) arrefecimento a 40°C durante 30 s. As taxas de transição foram: 20°C/s para todos os passos, exceto de 0,l°C/s para 95°C segmento 3 das curvas de fusão.
Para a análise dos dados, o ajuste de linha de base foi realizado no modo "aritmético", e a análise da curva de fluorescência foi realizada no "Second Derivative Maximum" modo do software LightCycler ™ (Versão 3.5).
Os iniciadores utilizados para a PCR em tempo real foram os seguintes (de 5 'para 3'): IL-Ιβ sentido, GGATAACGAGGCTTATGTGCACG (SEQ ID NO:1); anti sentido, GGACATGGAGAACACCACTTGTTG (SEQ ID NO:2). MCP-1 sentido, AGCCAGATGCAATCAATGCCC (SEQ ID NO:3); anti sentido, CCTTGGCCACAATGG'FCTTGAA (SEQ IDNO:4). MMP-9 sentido, ACCGCTATGGTTACACTCGG (SEQ ID NO:5); anti sentido, AGGGACCACAACTCGTCATC (SEQ ID NO:6). IL-8 sentido, CTGATTTCTGCAGCTCTGTGTGAA (SEQ IDNO:7); anti sentido, TGGCATCTTCACTGATTCTTGGA (SEQ ID NO:8). STATI sentido, TTCAGAGCTCGTTTGTGGTG (SEQ ID NO:9); anti sentido, AGAGGTCGTCTCGAGGTCAA (SEQ ID NO:10).
MyD88 sentido, TGGGACCCAGCAT TGAGGAGGAT T (SEQ ID NO:11); anti sentido, AAACTGGATGTCGCTGGGGCAA (SEQ ID NO:12). IL6 sentido, TGGATTCAATGAGGAGACTTGC (SEQ ID NO:13); anti sentido, CAGGAACTGGATCAGGACTT (SEQ ID NO:14).
Experiências in vivo
As experiências foram realizadas em fêmeas BALB/c (6-7 semanas de idade, Charles River Laboratories, Inc. MA). Simvastatina e tipifarnib foram dissolvidos em ciclodextrano a 20% a uma concentração de 10 mg/ml e administrado por via oral a ratos com uma dose de 50mg/kg, 24 horas, 17 horas e 1 hora antes da injeção de LPS. Os ratos do controlo receberam o veiculo (20% de ciclodextrano) apenas. 20yg de LPS (Sigma), diluído em PBS, foram injetados intraperitonealmente em cada rato. As amostras de sangue foram recolhidas, quer por sangramento dos olhos ou de punção cardíaca a 1 e 2 horas após a injeção de LPS de uma experiência, e depois de 2 e 3 horas após a injeção de LPS, numa segunda experiência. As amostras de plasma foram recolhidas por centrifugação e armazenadas a <-20°C antes de ser testado para as citocinas individuais, utilizando kits ELISA ou análise de Luminex (ver abaixo).
Ensaio de citocinas por ELISA
Humano IL-6, IL8, IL1 p, MCP-1, MMP-9, e do rato IL-β, IL8, TNFa, MCP-1 e IL-1 p foram medidos por ELISA kits (R & D Systems) de acordo com as instruções do fabricante.
Dosagem de citocinas por Luminex
As amostras foram testadas para citocinas usando o kit de ensaio Bio-plex de citocina (Bio-Rad Laboratories, Inc.) de acordo com as instruções do fabricante. Resumidamente, 50yL de pérolas anti citoquina conjugadas com anticorpos foram adicionadas aos poços de uma placa de filtro pré-equilibrada com tampão de ensaio. As esferas foram lavadas e, em seguida, 50yL de sobrenadante de cultura de células não diluído ou 4 vezes amostras de plasma diluídas foram adicionados e incubados durante 2 horas. Anticorpo anticitocina biotinilada (25μ1) foi adicionado a cada poço e a placa foi incubada com agitação durante 1,5 horas. Estreptavidina-PE (50yL) foi adicionada a cada poço e a placa foi incubada com agitação durante 45 min. entre lavagens, os poços foram lavados 3 vezes com 100yL de tampão de lavagem e os anelitos não ligados foram separados por filtração utilizando um coletor de vácuo. Após o passo de lavagem anterior, 125yL de tampão de ensaio foi adicionado a cada poço e a placa foi colocada num agitador durante 10 min. A placa foi lida num instrumento Luminex100 (Luminex Corporation, Austin, TX) de acordo com as instruções do fabricante. A concentração de citoquina foi determinada a partir de uma curva padrão ensaiada ao mesmo tempo.
Isolamento de células mononucleares de sangue periférico (PBMC)
Sangue humano heparinizado (25 ml) de um dador saudável foi revestido em 50 ml de tubos cónicos contendo 20 ml de Ficoll-Paque e centrifugou-se durante 20 min a 2000 rpm à temperatura ambiente e depois deixou-se parar sem utilizar o travão do centrifugador. A camada superior foi aspirada, deixando a camada de células mononucleares não perturbada na interface. As células foram cuidadosamente transferidas para um novo tubo cónico de 250 ml. O tubo cónico foi cheio com PBS, misturadas e centrifugadas a 1500 rpm durante 15 minutos à temperatura ambiente. O sobrenadante foi cuidadosa e completamente removido. O sedimento celular foi ressuspenso em 50 ml de PBS e centrifugado a 1500 rpm durante 5 minutos. Este passo de lavagem foi repetido mais uma vez. As células foram contadas e ressuspensas em células 1.7xlOsml/ de baixa endotoxina RPMI1 640/10% de FBS. LPS / Tratamento tipifarnib de PBMC humano PBMC humano (180μ1 a 1.7xl06/ml) foi pipetado para cada poço de uma placa de 96 poços. lOul de tipifarnib (R115777) ou o seu enantiómero menos ativo (100 vezes menos ativo para a inibição da farnesiltransferase) foram adicionados para perfazer concentrações finais de 5μΜ e 2μΜ. As células foram incubadas a 37°C, sob C02 a 5% durante 1 hora, em seguida, 10μ1 de LPS (diluído em meio) foram adicionados por cavidade para atingir uma concentração final de lOng/ml. As células foram cultivadas a 37°C, sob 5% de CO2. Os sobrenadantes foram colhidos às 16 horas, 24 horas e 40 horas de tratamento com LPS, e a secreção de IL-6 foi quantificada. NF-kB ensaios do gene repórter
As células HEK293 foram transfetadas com o plasmídeo NF-kB-LH (Biomyx) usando Lipofectamine 2000, e os clones estáveis foram selecionados por cultura de higromicina (176pg/ml). As células resultantes do NF-KB-LH-transfetadas foram semeadas em DMEM/10% FCS em placas de 96 poços para utilização em ensaios de repórter de luciferase. No dia seguinte, as células foram tratadas com tipifarnib, durante 18 horas, e depois estimuladas com TNF-α (lOng/ml) durante 4 horas, após o que a atividade de NF-kB foi medida utilizando o Steady-Glo ® luciferase sistema de ensaio de repórter (Promega). Ativação NF-kB foi calculada como a indução de dobragem por TNF-a sobre amostras de controlo não estimuladas. SDS-PAGE e análise Western blot
As células THP-1 em 0,5% de FBS / RPMI foram pré tratadas com ou sem tipifarnib, durante 18 horas, e, subsequentemente, estimulada com LPS (100 ng / ml), TNF-a (10 ng / ml) ou IL-la (5 ng / ml) durante 30 minutos. As células foram colhidas, lavadas três vezes em PBS gelado, e lizaram-se em tampão de lise (20 mM Tris (pH 7,5), NaCl 150 mM, EDTA I mM, EGTA IMM, 1% de Triton X-100, pirofosfato de sódio a 2,5 mM, 1 mM de β-glicerolfosfato, 1 mM NasVCh, 1 mg / ml de leupeptina, PMSF 1 mM) . Os lizados de células de cada amostra foram misturados com uma quantidade igual de 2x tampão de amostra de SDS-PAGE (Invitrogen), e as proteínas foram separadas por eletroforese em géis de Tris glicina gradiente de 10-20% (Novex), e transferido para nitro membranas de celulose (PROTRAN, Schleicher & Schuell). As membranas foram bloqueadas com BSA a 3% em PBS 0,05% de Tween-20, e sequencialmente incubadas com anticorpos primários e anticorpos conjugados com HRP secundário (anti IgG de coelho ou anti-rato IgG e IgM; PIERCE), seguido de deteção ECL (Amersham Biosciences). Os anticorpos primários utilizados foram policlonal de coelho anti-KBA, e-p38 (Santa Cruz), anticorpo monoclonal de rato anti-H-Ras (Chemicon), anticorpo monoclonal de rato antifosfo-p38 e anticorpo policlonal de coelho antifosfo-Erk (Cell Signaling Technology).
RESULTADOS
Efeito da sinvastatina e tipifarnib na transcrição do gene induzida por LPS. A análise inicial dos efeitos globais para a simvastatina e tipifarnib sobre a transcrição de genes inflamatórios foi formada por meio de análise por chip ADNc de amostras de ARN a partir de células THP-1, tratadas com LPS, na presença ou ausência de simvastatina ou tipifarnib, respetivamente. Dos 121 genes que mostram a indução de pelo menos 1,5 vezes por LPS em 2 pontos de tempo, 37 apresentaram pelo menos um decréscimo de 1,5 vezes na indução de uma ou ambas as drogas, em um ou mais pontos no tempo (ver Tabelas la, lb, le e ld abaixo) . Por estes critérios, a sinvastatina mostrou regulação de 15, e tipifarnib de 34, induzida por LPS transcrito. Incluidos nos genes regulados pelas drogas estavam quimiocinas (MCP-1 e -2), citocinas (IL-1 p) , genes da via de interferão, (STAT-1, interferão pl), receptores de uroquinase (recetor) e protéases (MMP-9).
Tabela 1.a Número de acesso Nome do Gene Descrição do Gene NM 002982 CCL2 Proteína quimiotática de monócitos 1 (MCP-1) NM 005623 CCL8 Proteína quimiotática de monócitos 2 (PQM-2) NM 002983 CCL3 A3 citocina pequena induzível (homóloga à do rato Mip-la)(SCYA3) NM_002984 CCL4 A4 citocina pequeno induzível (homólogo de rato Mip-lb) (SCYA4) NM 005409 CXCL11 Pequeno induzível citocina subfamília B, membro 11 (SCYB11) NM_000584 IL8 Interleucina 8 NM_0 0057 6 IL1B Interleucina-1, beta NM_+ 00057 7 IL1RN Interleucina-1 recetor antagonista NM_0 02 852 PTX3 Pentaxin gene relacionado, rapidamente induzido por IL-1B NM_007315 STAT1 Transdutor de sinal e ativador de transcrição 1 NM_002176 IFNB1 Interferon, beta 1, fibroblastos NM_0 05531 IF116 Interferon, gamma proteína indutível-16 NM_0 0154 8 IFIT1 Interferon induzido pela proteína com repetições tetratricopeptide 1 NM_0 024 62 MX1 Resistência mixovírus (influenza) 1 NM_000598 IGFBP3 Insulina -como fator de crescimento da proteína gene-3 NM_0 53056 CCND1 Ciclina Dl (PRAD1: paratireoide adenomatose 1) NM_0 02 965 S100A9 S100 proteínas, cálcio vinculativo A9 (calgranulina B) NM_0 038 97 IER3 Resposta inicial imediata 3 MM_0 024 68 MyD8 8 Mieloide diferenciação proteína resposta primária NM_0 02502 NFKB2 Fator nuclear kappa de luz polipeptídeo potenciador do gene em células-B 2 NM 000593 TAP1 Transportador 1, ATP-binding cassete, subfamília B (MDR / TAP) NM 000544 TAP2 Transportador 2, ATP-binding cassete, subfamília B (MDR / TAP)
NM 007188 ABCB8 ATP-binding cassete, subfamília B (MDR / TAP), membro 8 NM 031460 KCNK17 Canal de potássio, K subfamília, membro 17 (TASK-4) NM 002659 PLAUR Ativador do plasminogênio, recetor uroquinase NM_0 04 054 C3AR1 C3a recetor quimiotático anafilotoxina (C3a-R) NM 004048 B2M 2-beta-microqlobulin NM 015907 LAP3 Leucina aminopeptidase NM 004994 MMP9 Colagens tipo IV, metaloproteinase de matriz 9 NM_0 00362 TIMP3 Inibidor de tecido de metaloproteinase 3 NM_0 0 607 4 TRIM22 Tripartite motivo contendo 22 NM_004223 UBE2L6 Enzima de conjugação de ubi quitina E2L 6 NM_144573 NEXN Nexilin (F proteína actina obrigatório) NM_0 21634 LGR7 Leucine-rich repetido -contendo recetor acoplado à proteína G-7 NM_198066 GNPNAT1 -fosfato de glucosamina N-acetiltransferase 1 NM_0 0234 6 LY6E Antigénio do linfócito 6 complexo, locus E
Tabela l.b Número de acesso Nome do gene Mudança Fold (LPS vs controlo) lhr 3hr 6hr 2hr 24h NM 002982 CCL2 1,00 1,41 9,8 9,85 21,11 NM 005623 CCL8 1,00 1,00 3,48 2:30h 3,7 NM 002983 CCL3 1,32 4,92 6,06 4,29 7,46 NM 002984 CCL4 1,32 5,28 8,00 5,66 6,96 NM 005409 CXCL11 1,00 1,15 7,46 3,03 2:30h NM 000584 IL8 1,41 8,00 6,06 22,63 22,63 NM 000576 IL1B 1,41 5,66 8,00 6,96 8,00 NM 000577 IL1RN 1,07 1,00 3,25 1,87 4,29 NM 002852 PTX3 -1,07 2.00 4,00 3,03 3,48 NM 007315 STAT1 -1,23 1,15 4,29 3,73 4,29 NM 002176 IFNB1 1,07 1,23 3,25 6,06 1,87 NM 005531 IF116 -1,07 1,00 1,74 2.00 2,83 NM 001548 IFIT1 1,00 1,07 2,83 2,83 3,03 NM 002462 MX1 1,00 1,07 4,92 3,03 3,25 NM 000598 IGFBP3 1,00 1,15 1,62 4,00 7,46 NM 053056 CCND1 1,00 1,07 1,23 1,74 2.00 NM 002965 S100A9 -1,07 -1,07 1,00 1,52 1,74 NM 003897 IER3 1,23 1,41 1,87 2.00 2,14 NM 002468 MyD8 8 1,00 1,07 3,25 1,74 1.7 4 NM 002502 NFKB2 1,07 1,41 2,83 2,46 1,52 NM 000593 TAP1 1,23 1,32 4,92 2,14 1,74 NM 000544 TAP2 1,07 1,07 2.00 1,87 1,41 NM 007188 ABCB8 1,00 1,00 2:30h 1,52 1,52 NM 031460 KCNK17 1,07 1,23 3,03 1,52 2.00 NM 002659 PLAUR -1,07 1,15 1,62 1,87 3,25 NM 004054 C3AR1 -1,07 1,15 2.00 2:30h 3,48 NM 004048 B2M -1,07 1,07 1,62 1,52 2,14 NM 015907 LAP3 -1,07 1,00 2,46 2:30h 4,00 NM 004994 MMP9 -1,07 -1,07 1,52 3,48 13,93 NM 000362 TIMP3 NA NA 2,46 -1,41 2.00 NM 006074 TRIM22 1,00 1,00 2,83 3,03 2,83 NM 004223 UBE2L6 1,00 -1,07 5,28 5,28 4,59 NM 144573 NEXN 1,00 1,00 2.00 1,52 1,52 NM 021634 LGR7 1,07 -1,07 1,62 1,52 1,87 NM 198066 GNPNAT1 1,00 1,00 3,25 2,14 1,74 NM 002346 LY6E 1,15 1,00 3, 03 3,73 5,28
Tabela 1.c Número de Nome do Gene Mudança Fold (simvastatina/LPS vs LPS) acesso lhr 3hr 6hr 12h 2 4h NM 002982 CCL2 1,00 -1,23 -1,62 -2,14 NA NM 005623 CCL8 -1,07 -1, 07 -1,32 -1,52 -1,23 NM 002983 CCL3 1,15 1,00 -1,62 -1,15 1,41 NM 002984 CCL4 -1,07 1,74 -1,32 -1,15 1,41 NM 005409 CXCL11 1,00 1,00 -1,15 1,32 -1,32 NM 000584 IL8 -1,15 -1,23 -1,07 -1,74 1,23 NM 000576 IL1B 1,00 -1, 15 -1,62 -2,14 2.00 NM 000577 IL1RN -1,15 -1, 07 -1,15 -1,07 -1,62 NM 002852 PTX3 -1,07 -1, 07 -1,07 -1,23 1,23 NM 007315 STAT1 1,07 1,07 -1,32 1,07 -1,52 NM 002176 IFNB1 -1,15 -1, 15 1,23 -1,87 -1,23 NM 005531 IFI16 1,00 1,00 1,00 -1,07 -1,32 NM 001548 IFIT1 1,00 1,00 1,00 -1,07 -1,15 NM 002462 MX1 1,00 1,07 -1,15 1,23 -1,41 NM 000598 IGFBP3 1,00 1,07 1,00 1,15 1,07 NM 053056 CCND1 -1,07 1,00 -1,07 -1,62 -1,52 NM 002965 S100A9 -1,07 -1, 07 -1,07 -1,32 1,41 NM 003897 IER3 1,00 1,00 -1,23 -1, 62 1,23 NM 002468 MyD8 8 1,07 1,07 -1,07 1,00 1,00 NM 002502 NFKB2 -1,07 1,00 -1,74 -1,07 1,41 NM 000593 TAP1 -1,07 1,15 -1,41 1,00 1,15 NM 000544 TAP2 1,00 1,00 -1,23 1,00 -1,15 NM 007188 ABCB8 1,00 1,07 1,00 1,00 -1,07 NM 031460 KCNK17 1,00 1,00 1,07 1,00 -1,32 NM 002659 PLAUR 1,00 -1, 15 -1,23 -1,87 -1,41 NM 004054 C3AR1 -1,15 1,00 1,00 -1,32 1,32 NM 004048 B2M 1,07 1,00 1,07 -1,07 1,00 NM 015907 LAP3 1,00 1,00 1,15 1,07 -1,52 NM 004994 MMP9 1,00 1,00 -1,15 -1,32 -2,14 NM 000362 TIMP3 NA NA -2,64 -1,07 -1,07 NM 006074 TRIM22 1,00 1,07 1,07 1,07 -1,15 NM 004223 UBE2L6 -1,07 1,00 1,00 1,15 -1,62 NM 144573 NEXN -1,07 1,07 -1,07 1,15 -1,32 NM 021634 LGR7 1,07 1,15 -1,07 -1,41 -1,32 NM 198066 GNPNAT1 1,00 1,00 -1,07 1,15 -1,23 NM 002346 LY6E 1,15 1,00 -1,07 1,52 -1,15
Tabela 1.d Número de Nome do Mudança Fold (tipifarnib/LPS vs LPS) acesso gene lhr 3hr 6hr 12h 2 4h NM 002982 CCL2 -1,07 -1,32 -2,83 -3,25 -4,29 NM 005623 CCL8 -1,07 1,00 2:30h 2:30h 00 1 NM 002983 CCL3 -1,07 1,00 -1,07 1,23 -1,52 NM 002984 CCL4 1,07 1,87 1,07 - 1.52 -1,52 NM 005409 CXCL11 1,00 -1,07 -2,83 -1,52 2.00 NM 000584 IL8 -1,07 -1,23 -1,15 1,32 -1,07 NM 000576 IL1B 1,07 1,32 -1,87 -2,46 -1,23 NM 000577 IL1RN -1,15 -1,15 -1,62 -1,15 -3, 73 NM 002852 PTX3 1,15 -1,15 -1,32 -1,32 2.00 NM 007315 STAT1 1,23 -1,32 -2,14 1,00 -1,62 NM 002176 IFNB1 -1,23 -1,15 -1,62 -3,03 2,14 NM 005531 IFI16 1,07 1,00 -1,32 -1,23 -1,74 NM 001548 IFIT1 1,00 1,00 -1,41 -1,32 menor que 2.1 NM_002462 MX1 1,00 -1,07 - 2,74 1,32 -1,32 NM_000598 IGFBP3 1,00 -1,07 1,00 -2,52 2.00 NM_053056 CCND1 1,00 -1,07 -1,15 -2,52 -1,23 NM_002965 S100A9 1,00 -1,15 -1,07 2.00 -2,52 NM 003897 IER3 1,32 1,52 1,15 1,00 1,23 NM_002468 MyD8 8 1,07 -1,15 -2,24 -1,23 -1,32 NM_002502 NFKB2 -1,07 1,23 -1,07 -1,32 2,52 NM_000593 TAP1 -1,23 1,15 -2,74 -1,15 -1,23 NM_000544 TAP2 1,07 -1,15 -2,52 -1,32 -1,23 NM 007188 ABCB8 1,07 1,00 -2,52 -1,23 -1,23 NM 031460 KCNK17 -1,07 -1,15 -1,32 1,00 -1,74 NM 002659 PLAUR 1,00 -1,23 -2,52 -2,87 -1,62 NM 004054 C3AR1 1,00 1,07 -1,23 2.5 . -1,74 NM 004048 B2M 1,15 1,00 -1,23 -2,52 1, 15 NM 015907 LAP3 -1,07 -1,07 -2,52 -1,23 -2,83 NM 004994 MMP9 -1,07 -1,07 -1,41 -1,74 -1,41 NM 000362 TIMP3 NA -1,41 -1,23 -1,15 1, 15 NM 006074 TRIM22 1,00 1,00 -2,52 -1,07 -2,52 NM 004223 UBE2L6 1,00 -1,07 -1,41 -1,15 -1,41 NM 144573 NEXN 1,00 1,00 -1,41 -1,15 -2,52 NM 021634 LGR7 1,23 -1,15 -1,41 -2.52 -2,52 NM 198066 GNPNAT1 1,00 1,00 2.00 -1,41 -2,74 NM 002346 LY6E 2,52 -1,15 -1,52 1,15 -1,32
Tabelas la, lb, lc e ld mostram genes induzidos por LPS que foram inibidos pela sinvastatina ou tipifarnib. Genes foram selecionados (ver Tabela 1-A para a descrição de genes) como induzidos por LPS, se a relação entre LPS e tratados com amostras não tratadas foi maior do que 1,5 vezes a mais do que dois pontos de tempo. Estes são mostrados como números em negrito e em itálico na "mudança Fold (LPS versus controlo) " coluna (Tabela l.b). A expressão do gene durante o tratamento com LPS e a estatina (sinvastatina/LPS) (Tabela l.c) ou LPS e o FTI (tipifarnib / LPS) (Tabela l.d), foi comparada com LPS sozinho e a correspondência em pontos de tempo. Genes que mostraram pelo menos uma redução de 1,5 vezes na indução de uma ou ambas as drogas, em um ou mais pontos de tempo foram selecionados para inclusão na tabela. Genes em que a indução de LPS foi inibida de acordo com esses critérios são mostrados como números negativos, em negrito e itálico.
Os resultados da análise de chip foram confirmados por genes selecionados por análise em tempo real da PCR (Figura 2) . A transcrição de IL-1 p foi induzida por LPS nas primeiras 3 horas, e a indução não foi afetada por sinvastatina ou tipifarnib até este ponto do tempo. No entanto, ao fim de 6 horas, e em maior extensão, após 12 horas da indução de LPS induzido significativamente regulada por sinvastatina e tipifarnib (Figura 2.a). A MCP-1 foi induzida por LPS a partir de 6 horas, e esta indução foi inibida significativamente por simvastatina e tipifarnib (Figura 2.b). MMP-9 a indução por LPS aumentou até 12 horas, momento em que apontam uma diminuição de 50% na indução foi observado com a sinvastatina, e sem indução na presença de tipifarnib (Figura 2.c) . A indução de IL-8 por LPS foi evidente tão cedo quanto três horas e não foi afetada pelas drogas, neste ponto do tempo. Após 6 e 12 horas, a indução de IL-8 foi inibida pela sinvastatina, enquanto o FTI não mostrou nenhum efeito significativo (Figura 2.d). Indução STAT1 foi inibida por tipifarnib as 6 e 12 horas, enquanto a inibição pela estatina só foi observada às 12 horas (Figura 2.e) . Fator de diferenciação mieloide, MyD88, o adaptador para Toll-like receptor-respostas mediadas, foi significativamente sobre regulada por LPS às 6 e 12 horas, e esta foi marginalmente inibida pela sinvastatina menos 12 horas (Figura 2.f) . Em contraste, tipifarnib demonstrou inibição quase completa da indução de MyD88, para baixo e para niveis semelhantes aos de células indiscutíveis. Enquanto a transcrição de IL-6 não preenchia os critérios a partir da análise de chips para inclusão na Tabela 1, a análise quantitativa por PCR em tempo real mostraram inibição por sinvastatina, e particularmente tipifarnib, do pico de transcrição induzida por LPS de IL-6 em 6 horas (Figura 2G). Às 12 horas, apenas tipifarnib mostrou inibição.
Assim, tanto a sinvastatina e tipifarnib foram capazes de inibir a indução por LPS de numerosos genes inflamatórios e tipifarnib mostrou inibição mais forte na maioria dos casos. Tipifarnib também mostrou regular algumas transcrições não afetadas pela estatina.
Efeito da sinvastatina e tipifarnib na produção de citocinas induzida por LPS
Para investigar os efeitos da sinvastatina e tipifarnib no nivel de proteína citocina e a secreção de MMP-9 por células THP-1 em resposta a LPS foi examinada a diferentes pontos de tempo ao longo de 48 horas, na presença ou ausência de sinvastatina (5 e ΙΟμΜ) ou tipifarnib (2 e 5 μΜ), respetivamente. A secreção MCP-1 (Figura 3. a) foi, dependendo da dose, inibida pela sinvastatina a 22 e 30 h depois da adição de LPS, mas o efeito inibitório foi perdido às 48 horas. Tipifarnib mostrou inibição dependendo da dose da secreção de MCP-1 até 48 horas. Mesmo a 2μΜ, a extensão da inibição por tipifarnib era muito maior do que a observada para ΙΟμΜ a sinvastatina. Ambas as drogas mostraram a inibição da secreção de IL-6 (Figura 3.b), a extensão da qual foi novamente superior na presença de tipifarnib. Inibição por 5 μΜ sinvastatina foi apenas observada em 30 horas, e a 10 μΜ, foi observada em ambos às 30 e 48 horas. A extensão da inibição da libertação de IL-6 foi semelhante para 2 a 5 μΜ e inibição de tipifarnib foi observada em todos os pontos de tempo.
Um IC50 de cerca de 1 μΜ foi obtido para a inibição de tipifarnib induzida por LPS a secreção de IL-β, numa experiência separada (Figura 4). A IC 50 de cerca de 1 μΜ foi obtida para a inibição de LPS induzida pela libertação de IL-6 por tipifarnib da seguinte maneira: células THP-1 foram cultivadas em meio RPMI-1640, contendo 10% de FBS, 100 unidades / ml de penicilina, 10 mg / ml de estreptomicina, a 37 0 C, sob 5% de CO 2. Componentes do meio foram certificados para conter menos do que 0,3 unidades de endotoxina / ml. Células THP-1 a 3,4 x 10 5 / ml foram cultivadas em placas de 96 poços em 0,5% de FBS / RPMI 1640, na ausência ou na presença de LPS lOOng/ml de mais ou menos tipifarnib (a partir de 5uM, seguido de 3 vezes série de diluição). As concentrações de tipifarnib foram: 5 μΜ, 1.67μΜ, 0.56uM, 0,19 uM e 0,06 uM.
Sobrenadantes foram coletados em 48hr. IL6 foi testada usando kit ELISA de I & D Systems. Os resultados são mostrados na Figura 4.
Sinvastatina e tipifarnib mostraram inibição significativa da transcrição induzida por LPS IIL-lp (Figura 2. a) . No entanto, os resultados sobre a secreção de IL-1 p eram mais complexos (Figura 3.c). Enquanto tipifarnib mostrou inibição dependente da dose da secreção de IL-1 p, a sinvastatina, a 5 μΜ teve pouco efeito, e a 10 μΜ mostraram estimulação significativa da secreção de IL-1 p em 22 e 30 horas. Sinvastatina inibida induzida por LPS de IL-8 de produção a 22, 30 e 48 horas, mostrando a dose-dependência às 48h (Figura 3.d). Em contraste, tipifarnib, não mostrou inibição significativa da produção de IL-8, exceto para 5 μΜ em 22 horas. Estes resultados são consistentes com a ausência de efeito de tipifarnib na transcrição de IL-8 (Figura 2.d). Sinvastatina e tipifarnib dependendo da dose inibiram a secreção de μΜΡ-9 induzida por LPS a 30 e 48 horas (Figura 3.e). TNF-a por células THP-1 induzida por LPS atingiu o pico entre 5 e 10 horas, e, em seguida, mostraram uma indução secundária após 22h até 48 horas. O pico inicial de indução pareceu ser afetado pela presença de um ou outro inibidor, mas a segunda fase de indução mostrou inibição dependendo da dose por sinvastatina, e, mais significativamente, por tipifarnib (Figura 3.f). A 5 μΜ, tipifarnib totalmente inibida a segunda fase induzida por LPS TNF-a, enquanto μΜ tipifarnib mostrou um grau semelhante de inibição a 10 μΜ de sinvastatina.
Efeito de tipifarnib e o seu enantiómero menos ativo na produção induzida por LPS de IL-6 em células mononucleares de sangue periférico (PBMC)
Esta experiência foi realizada para testar o efeito de tipifarnib na produção induzida por LPS de IL-6 em células mononucleares de sangue periférico (PBMC), como um exemplo de como a resposta ao tratamento com tipifarnib poderia ser monitorizada em PBMC isoladas a partir de doentes tratados com tipifarnib. O enantiómero de tipifarnib é cerca de 100 vezes menos ativa do que tipifarnib (R 115777) para a inibição da farnesiltransferase (Venet M., "R115777 como inibidor da proteína farnesiltransferase: Synthesis and SAR" ACS Meeting 2001, 222: Chicago (Abs MEDI 5)). A IL-6 não pode ser detetada após a incubação de PBMC humana durante 4 0 horas. A incubação de PBMC humanos com LPS induziu fortemente a produção de IL-6 após 16 horas e a produção continuou a aumentar até 40 horas. Não houve diferença na produção e foi observado que o enantiómero
menos ativo foi adicionado à incubação a 2 ou 5 μΜ. A presença de tipifarnib a 2 μΜ durante a estimulação por LPS não teve efeito sobre a redução de IL-6, mas a 5 μΜ , a inibição altamente significativa da produção de IL-6 foi observada após 16 e 40 horas (P <0 , 01) . Às 24 horas r O valor médio, na presença de 5 μΜ tipifarnib foi de aproximadamente 40 % menor do que na sua ausência , mas os dados não atingiram significância estatistica (P=0,104) . Assim, tipifarnib mostrou inibição dependendo da dose de LPS induziu a produção de IL-6 em PBMC humanos. A concentração necessária para uma inibição de PBMC foi maior do que a necessária para a inibição em células THP-1 e esta diferença pode estar relacionada com as diferentes concentrações de soro de bovino fetal nestas duas experiências (10% de FBS e 0,5%, respetivamente) porque é tipifarnib conhecido por ser fortemente ligado às proteinas.
Efeito da sinvastatina e tipifarnib na produção de citocinas induzidas por LPS in vivo
Para acompanhar as nossas observações in vitro, os efeitos do pré-tratamento com sinvastatina e tipifarnib foram testados num modelo murino de inflamação induzida por LPS. Os compostos foram administrados por via oral 24 horas, 17 horas e 1 hora antes da injeção de LPS.
Efeitos especialmente marcantes da estatina e da FTI eram a sua inibição altamente significativa de TNF induzida por LPS, uma produção de 1 e 2 horas (Figura 5.a). Um resultado similar foi previamente obtido para outra estatina, cerivastatina, (Ando, Takamura et al. 2000). Este efeito já foi observado para um FTI.
Nenhum efeito significativo foi observado para a sinvastatina na produção de p em IL-6 e IL-Ιβ, enquanto aproximadamente 50% de inibição da produção de IL-6 (Figura 5.b), e inibição quase completa da produção de IL-Ιβ (Figura 5.c), foi observada em animais tratados com tipifarnib após 3 horas.
Cerca de 50% de inibição da produção de MIP-lcx, tanto pela estatina e o FTI foi observada em 2 horas na primeira experiência (Figura 5. d) . Na segunda experiência, a inibição semelhante para tipifarnib foi observada depois de 2 e 3 horas, e menos, mas a inibição significativa de sinvastatina em 2 horas. Não foram observados efeitos significativos para o tratamento de sinvastatina na produção de MCP-1, enquanto tipifarnib mostrou inibição significativa em 2 horas e uma diminuição que não alcançou significância estatística em 3 horas (Figura 5.e).
Na segunda experiência, indução por LPS IL12-p40 e -p70 foi inibida pelo tipifarnib em 3 horas, enquanto a sinvastatina não teve efeito significativo (resultados não mostrados). Nenhuns efeitos de sinvastatina ou de tipifarnib em IL-8 ou RANTES induzidos por LPS foram observados (resultados não mostrados).
No geral, os resultados mostram infra-regulação significativa de numerosas citocinas induzida por LPS in vivo por tipifarnib, e de TNF-α e MIP-lcx para a sinvastatina.
Efeito de tipifarnib em TNF-α, LPS e IL-1 induzida por sinalização
Recentemente, foi relatado que o TNF-α induzido por atividade de NF-kB foi inibido pelo outro FTI (SCH 66336) (Takada, Y., et al. 2004. J Biol Chem 279, 26287-99). Para comparar os efeitos de tipifarnib para esta descoberta, a activação de NF-kB foi testada em células HEK 293, transfectadas estavelmente com um indicador de luciferase do plasmideo NF-kB. As células foram tratadas com tipifarnib durante a noite, seguido de estimulação com TNF-a, durante 4 horas. Em contraste com os resultados relatados por SCH 66336, TNF-α induzida por actividade de NF-kB não foi inibida por tipifarnib a 2 ou 5 μΜ. 0 efeito de tipifarnib em diversas vias de sinalização foi também estudado em células THP-1. As células foram tratadas com μΜ 2 tipifarnib durante 18 horas, em seguida estimuladas com LPS ou TNF-a, durante 4 horas. Os lisados celulares foram testados quanto à expressão de p38 e a fosforilação de p38 por análise western blot. A fosforilação de p38 foi significativamente aumentada por estimulação de LPS e TNF-α, e apenas o aumento induzido por LPS foi parcialmente reduzido por tratamento com tipifarnib. Nenhuma inibição significativa foi observada para a fosforilação da p38 induzida por TNF-α. A expressão da proteína P38 não foi afetada por estimulação LPS ou TNF-a e/ou tratamento com tipifarnib.
Numa experiência separada, IL-Ια foi também incluída como um estímulo para além de LPS e o TNF-α, e estes três estímulos, todos significativamente aumentaram a degradação de kB-a. Curiosamente, tipifarnib inibiu significativamente a degradação de IkB induzida por LPS, mas não mostrou
qualquer inibição da degradação de IkB induzida por TNF-oí e IL-la. Resultados semelhantes foram observados em três experiências separadas. 0 nível de fosforilação de ERK foi semelhante no controlo e nas células estimuladas, e o pré-tratamento com tipifarnib reduziu a fosforilação de ERK de forma semelhante em todas as amostras. 0 efeito de tipifarnib na farnesilação de H-Ras foi também examinado. 0 nível de farnesilação de H-Ras, não foi significativamente alterado na ausência ou na presença de estímulos. Tipifarnib parcialmente inibiu a farnesilação de H-Ras no mesmo grau nos grupos de tratamento diferentes, e esta inibição correlacionada com a extensão da inibição da fosforilação de ERK
DISCUSSÃO
Alguns dos efeitos anti-inflamatórios das estatinas parecem ser mediados através da sua inibição da proteína de pré-nilação, incluindo farnesilação. Na comparação da estatina (sinvastatina) para o FTI (tipifarnib), o FTI mostrou semelhante, se não superior, atividade anti- inflamatória. Ambos os fármacos inibiram a transcrição e secreção de IL-6, MCP-1 e MMP-9, e da fase secundária da secreção de TNF-a in vitro.
Nas experiências da presente invenção, verificou-se que tanto a sinvastatina como o tipifarnib dependentemente da dose inibiu a secreção de MMP-9 induzida por LPS. A inibição da transcrição STAT1 induzida por LPS foi observada tanto para o tipifarnib e para a sinvastatina. Estudos anteriores mostraram inibição da fosforilação STAT1 pelas estatinas (Huang, KC, et al. 2003. Journal of
Biomedical Science (Basileia, Suíça) 10, 396-405; Chung, H. K., et al. 2002. Experimental and Molecular Medicine 34, 451-461, e Horiuchi, M., et al. 2003. Circulation 107, 106-112. Em contraste, a presente invenção fornece a primeira evidência para a inibição da transcrição de STAT1 por tipifarnib e, em menor extensão, a sinvastatina. A transcrição de MyD88 induzida por LPS foi significativamente inibida pelo tipifarnib, mas não por sinvastatina, sugerindo que a inibição seletiva da farnesilação pode inibir a sinalização através de receptores Toll-like.
Sinvastatina e tipifarnib tinham contrastantes efeitos sobre a inibição de IL-8 e IL-Ιβ induzidas por LPS. Sinvastatina inibiu a indução de IL-8 mRNA e a secreção IL-8 por células THP-1, como descrito anteriormente (Ito, T., et al. 2002. Atherosclerosis 165, 51-5; Takata, M., et al. 2001. Br J Pharmacol 134, 753-62; Terkeltaub, R., et al. 1994. J Leukoc Biol 55, 749-55) .
Em contraste, no entanto, nenhuma inibição de transcrição ou secreção de IL-8 induzida por LPS foi observada nos estudos do presente pedido para o FTI, tipifarnib, em concentrações que eram altamente eficazes na inibição da produção de IL-6, MCP-1 e MMP- 9. Estes resultados sugerem que a indução de IL-8 induzida por LPS não exige a farnesilação da proteína sob as condições nos estudos mostrados no presente pedido. No entanto, sob certas condições, por exemplo, a pré-incubação de PBMC humano com um FTI durante a noite, seguido por tratamento com LPS durante 24 horas, uma inibição da produção de IL-8 induzida por LPS pode ser observada.
Enquanto, tanto a estatina e como a transcrição de IL-Ιβ FTI inibida induzida por LPS, somente o FTI mostrou a inibição da secreção de IL-Ιβ. A sinvastatina não mostrou qualquer efeito sobre a secreção de IL-Ιβ a 5μΜ, e a indução a 10 μΜ. Potenciação semelhante de mediadores inflamatórios por meio de tratamento com estatina, foi observado anteriormente em numerosos estudos (Terkeltaub, R., et al. 1994 J Leukoc Biol 55, 749-55; Sadeghi, M.M., et al. 2000. J Immunol 165, 2712-8; Sun, D. et al. 2003. Cell Immunol 223, 52-62; Monick, M.M., et al. 2003. J Immunol 171, 2625-30; e Matsumoto, M., et al. 2004. J Immunol 172, 7377-84.) A diferença entre os efeitos da sinvastatina na transcrição e secreção de IL-Ιβ pode estar relacionada com o requisito para a clivagem da proteina precursora imatura por caspase-1 para a secreção. Uma estatina lipofílica, semelhante à sinvastatina, tem provado estimular a atividade da caspase-1 e secreção de IL-Ιβ em células mononucleares do sangue periférico (Montero, Hernandez et al. 2000). LPS foi mostrado para ativar caspase-1 em células THP-1, e esta activação contribui para a indução por LPS da secreção de IL-Ιβ (Schumann, Belka et al. 1998) A activação adicional de caspase-1 por sinvastatina pode, portanto, potenciar a secreção da proteina IL-1 madura induzida por LPS, embora a transcrição seja inibida.
Os efeitos do pré-tratamento por sinvastatina e tipifarnib na indução in vivo de citocinas em ratinhos por LPS foram também analisados. Os efeitos mais marcantes da estatina e do FTI foram a sua inibição altamente significativa da produção de TNF-a induzida por LPS. 0 pré-tratamento por sinvastatina deu inibição semelhante de TNFa e IL-Ιβ ao observado previamente para a cerivastatina (Ando, Takamura et al. 2000), embora, no presente estudo, a inibição da IL-Ιβ não alcançou significância estatística.
Os estudos de presente invenção mostram, adicionalmente infra-regulação de MIP-1 induzida por LPS por sinvastatina. Esta não foi previamente demonstrada in vivo, apesar de um estudo prévio ter relatado a diminuição da libertação espontânea de ΜΙΡ-Ια, em culturas de PBMCs criopreservadas de pacientes depois de seis meses de tratamento com atorvastatina (Waehre T, et al. 2003. J Am Coll Cardiol 41 (9), 1460-7).
Nos estudos da presente invenção, a inibição da produção de IL-8 in vivo por sinvastatina ou tipifarnib não foi observada, embora a infra-regulação desta citocina in vitro por simvastatina foi observada. Da mesma forma, Waehre et al. observou uma modesta diminuição na espontânea, e não revelou qualquer diminuição induzida por LPS de IL-8 a partir de PBMC antes e após o tratamento com atorvastatina. Em contraste, tem sido relatado que a sinvastatina reduziu os níveis séricos de IL-8, em pacientes com hipercolesterolemia, após 6 semanas de tratamento (Rezaie-Majd, A., et al. 2002. Arterioscler Thromb Vasc Biol 22, 1194-9.) As diferenças nos efeitos sobre a produção de IL-8 podem estar relacionadas com diferentes estatinas, as populações de pacientes diferentes (CAD contra hipercolesterolemia), e/ou in vivo contra as medições de cultura ex vivo.
Os estudos da presente invenção proporcionam evidências in vivo para efeitos anti-inflamatórios globais de FTIs,
tipifarnib, em particular, incluindo a infra-regulação de TNFa induzida por LPS, IL-6, IL-Ιβ e ΜΙΡ-Ια. Pesquisa anterior com tipifarnib demonstrou a inibição da caquexia (EUA Pedido de Patente Publicado N°. 2004/0157773 e WO 02/085364) e uma redução da pontuação da doença em colite induzida por sulfato de dextrano-sódio (WO 02/43733) e artrite induzida por colagénio (WO 00/01386), mas o mecanismo para estes efeitos não foi relatado. As funções mais importantes do TNF-cx, IL-6 e IL-Ιβ na patogénese destas doenças sugerem que a inibição pelo FTI pode ter sido responsável pela melhoria observada. É de interesse notar que em estudos de Fase I com tipifarnib em sindrome mielodisplásica, a única correlação com resposta positiva ao tratamento foi de uma diminuição dos niveis séricos de TNF-α (Kurzrock, Kantarjian et al. 2003).
As concentrações de sinvastatina usadas nos estudos in vitro e in vivo reportados da presente invenção eram mais elevadas do que as doses terapêuticas típicas, mas semelhantes aos anteriormente utilizados em outros estudos in vitro e modelos murinos de eficácia (Leung, Sattar et al. 2003; McKay A 2004). Numerosos estudos têm demonstrado actividade anti-inflamatória para as estatinas em doses terapêuticas em humanos (Rezaie-Majd, Maca et al. 2002;
Waehre T 2003; McCarey DW 2004), indicando que os resultados dos estudos in vitro e em animais têm importância clínica.
No caso do FTI, tipifarnib, 300 mg duas vezes por dia era a dose máxima tolerada em vários estudos (Head e Johnston, 2003). Nesta dose, os níveis de plasma atingem cerca de 2 μΜ (Karp, Lancet et al . 2001), em que os efeitos de concentração significativos foram obtidos in vitro nas experiências da presente invenção. As doses utilizadas no modelo de inflamação de murino induzida por LPS da presente invenção são semelhantes aos utilizados em relatos de efeitos tumoricidas em modelos de ratos (End, Smets et al. 2001).
Inibição de mediadores inflamatórios pela estatina e o FTI parecem exigir tempo para pré-tratamento. Por exemplo, citocinas, tais como IL-Ιβ e IL-8 demonstraram indução de transcrição significativa por LPS nas primeiras 3 horas in vitro. Quando o tratamento por fármaco in vitro foi iniciado ao mesmo tempo que o estimulo com LPS, os primeiros sinais de inibição da transcrição foram observados apenas após 6 horas, e de libertação de citocinas, após apenas 22 horas. 0 pico inicial de libertação de TNF- a induzida por LPS não foi afectada pela presença de um ou outro inibidor, mas a segunda fase, após 22 horas, mostrou inibição dependente da dose e do tempo por sinvastatina e tipifarnib. Em contraste, quando os animais foram pré-tratados com os fármacos durante 24 horas antes do desafio com LPS in vivo, a inibição da libertação de TNF-a pode ser observada tão cedo quanto uma hora após o desafio. O intervalo de tempo para a inibição de respostas inflamatórias pode indicar um requisito para esgotar os capitais intracelulares de determinadas proteínas preniladas.
Os efeitos anti-inflamatórios das estatinas e FTIs pode estar relacionada com a sua inibição de etapas comuns na via do mevalonato, e/ou a evidência recente que ambas as classes de fármacos inibem a ativação de NFkB (Ortego M 1999; Takada, Khuri et al. 2004, Na et al. 2004).
Para explorar o mecanismo subjacente para a actividade anti-inflamatória de tipifarnib, o efeito de tipifarnib em diferentes vias de sinalização pró-inflamatórias, foi examinada. 0 FTI, SCH 66336, foi demonstrado previamente para inibir a fosforilação de IkB induzida por TNF-a, degradação e atividade de NF-kB (Takada, Khuri et al. 2004). No entanto, nos estudos que suportam a presente invenção, o tipifarnib não afectou a atividade de NF-kB induzida por TNF-α (como medido por um ensaio de indicador de luciferase). Além disso, o tipifarnib não mostrou uma inibição da degradação de IkB induzida por TNF-a em células THP-1. A razão para tais resultados contrastantes não é clara, mas pode notar-se que estes dois FTIs também demonstraram eficácia diferente em ensaios clinicos para diferentes tipos de tumores. (Lancet e Karp, 2003) A via Ras/Raf/MAPK tem sido bem estudada. Os estudos da presente invenção demonstram que o tipifarnib inibe parcialmente a fosforilação de ERKl/2, e que a extensão da inibição correlaciona-se com a da inibição da farnesilação da proteína Ras, tanto na ausência ou na presença de estímulos inflamatórios. Estes dados confirmam que o tipifarnib suprime a fosforilação de ERKl/2 através da inibição da Ras. LPS, TNF-α e IL-1 interagem com os seus receptores próprios para desencadear as correspondentes cascatas de sinalização
inflamatórias. TNF-α (X elos de sinalização para IKK através TNFR/PIR (Aggarwal, B. Nat Rev Immunol 2003). IL- 1/IL-1R e LPS/TLR4 ambos elo de sinalização para IKK através da via MyD88/IRAK4/TRAF6/TAK compartilhada (Takeda, S. A. K. Nature Reviews Immunology2004). IKK fosforila IkB, o que leva a ubiquitinação e degradação de IkB, e, portanto, permite a translocação de NF-kB para o núcleo e a indução da expressão de genes alvo, tais como TNF-a, IL-1 p, IL-6,e outros. Nos estudos da presente invenção, o tipifarnib não inibiu o TNF-α e a degradação de IkB induzida por IL-1, o que sugere que a proteina alvo para tipifarnib não está envolvida nestas duas vias de sinalização. Além da via dependente MyD88 comum partilhada com a IL-1, a via LPS/TLR4 também induz a degradação de IkB através de vias MyD88-independentes, isto é, através e TRIF e TRAM (Takeda, S. A. K. Nature Reviews Immunology, 2004). A inibição especifica por tipifarnib apenas da degradação de IkB induzida por LPS sugere que a proteina afectada por tipifarnib ou está associada com TLR4 ou envolvida numa via exclusiva para LPS/TLR4, tal como a via de MyD8 8 -independente. Um estudo recente demonstrou que a Ras está envolvida na sinalização de oligonucleótido CpG como um evento precoce, através da associação com TLR9 e promovendo a formação de complexos IRAK/TRAF6 (Xu, Η. A, J Bio Chem. 2003) . Outro estudo demonstrou que Ras controla a indução TRAF-β-dependente de NF-kB (Caunt, C. J. J Bio Chem. 2001) Na presente invenção, a inibição da farnesilação da proteina Ras foi consistentemente observada no controlo, por LPS, IL-1 e células tratadas TNF-a, mas a inibição da degradação de IkB foi apenas observada em células tratadas com LPS. Esta falta de correlação indica que é improvável que a Ras seja a proteina alvo envolvida na mediação dos efeitos anti-inflamatórios de tipifarnib.
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Claims (2)

  1. REIVINDICAÇÕES 1. Inibidor da f arnesil-transf erase para o uso no tratamento de sépsis ou choque séptico, em que o inibidor da farnesil-transferase compreende um composto de fórmula (I) :
    uma forma estereoisomérica, de um ácido farmaceuticamente aceitável ou um sal base de adição do mesmo, em que a linha a tracejado representa uma ligação opcional; X é oxigénio ou enxofre; R1 é hidrogénio, Ci_i2alquilo, Ar1, Ar2Ci_6alquilo, quinoliniloCi_6alquilo, piridiloCi_6alquilo, hidroxiCi-6alquilo, Ci-6alquiloxiCi-6alquilo, mono- ou di (Ci_ 6alquilo) aminoCi_6alquilo, aminoCi_6alquilo, ou um radical de fórmula -Alq1-C (=0)-R9, -Alq1-S (0)-R9 ou -Alq1-S (0)2-R9, em que Alq1 é Ci-6alcanediilo, R9 representa um grupo hidroxi, Ci-6alquilo, Ci_6alquiloxi, amino, Ci-salquilamino ou Ci_ 8alquilamino substituído com Ci-6alquiloxicarbonilo; R2, R3 e R16 são cada um independentemente hidrogénio, hidroxilo, halo, ciano, Ci-6alquilo, Ci_6alquiloxi, hidroxiCi_6alquiloxi, Ci-6alquiloxiCi-6alquiloxi, amino-Ci-6alquiloxi, mono- ou di (Ci_6alquil) aminoCi_6alquiloxi, Ar1, Ar2Ci_6alquilo, Ar2oxi, Ar2Ci_6alquiloxi, hidroxicarbonilo, Ci-6alquiloxicarbonilo, tri-halometilo, tri-halometoxi, C2-6alcenilo, 4,4-dimetilo-oxazolilo; ou quando em posições adjacentes R2 e R3 tomados em conjunto podem formar um radical bivalente de fórmula -0--O-CH2-O-(a-1), -O-CH2-CH2-O- (a-2) , -0-CH=CH- (a-3), -O-CH2-CH2- (a-4) , -0-CH2-CH2-CH2- (a-5) , Ou -CH=CH-CH=CH- (a-6); R4 e R5 cada um independentemente são hidrogénio, halo, Ar1, Ci_6alquilo, hidroxi-Ci-6alquilo, Ci-6alquiloxiCi_6alquilo, Ci-6alquiloxi, Ci_6alquiltio, amino, hidroxicarbonilo, Ci_ 6alquiloxicarbonilo, Ci_6alquiloS (0) Ci_6alquilo ou Ci_ 6alquiloS (0) 2Ci_6 (alquilo; R6 e R7 são cada um independentemente hidrogénio, halo, ciano, Ci_6alquilo, Ci_6alquiloxi, Ar2oxi, tri-halometilo, Ci_ 6alquiltio, di (Ci_6) -amino, ou quando em posições adjacentes, R6 e R7, tomados em conjunto, podem formar um bivalente radical de fórmula -O-CH2-O-(c-1), ou -CH=CH-CH=CH- (c-2); R8 é hidrogénio, Ci_6alquilo, ciano, hidroxicarbonilo, Ci-6alquiloxicarbonilo, Ci_6alquilocarboniloCi-6alquilo, cianoCi-6alquilo, Ci-6alquiloxicarboniloCi_6alquilo, carboxiCi- 6alquilo, hidroxiCi_6alquilo, aminoCi_6alquilo, mono- ou di (C1-6) amino-Ci-6alquilo, imidazolilo, haloCi_6alquilo, Ci_ 6alquiloxiCi_6alquilo, aminocarboniloCi_6alquilo, ou um radical de fórmula 0 "oí 1 0 1 (b-1) -S-R10 (b-2) -n-r71r12 (b-3) em que R10 é hidrogénio, Ci_6alquilo, Ci_6alquilcarbonilo, 1
  2. 2 · Ar , Ar Ci_6alquilo, Ch-galquiloxicarboniloCi-galquilo, um radical ou fórmula -Alq2-OR13 ou -Alk2-NR14R15; R11 é hidrogénio, Ci_i2alquilo, Ar1 ou Ar2Ci_6alquilo; R12 é hidrogénio, Ci_6alquilo, Ci_i6alquilcarbonilo, Ci_ 6alquiloxicarbonilo, Ci-galquilaminocarbonilo, Ar1, Ar2Ci_ 6alquilo, Ci_6alquilcarboniloCi_6alquilo, um aminoácido natural, Ar1carbonilo, Ar2Ci_6alquilcarbonilo, aminocarbonilocarbonilo, Ci_6alquiloxiCi_6alquilcarbonilo, hidroxi, Ci_6alquiloxi, aminocarbonilo, di (Ci- 6alquilo) aminoCi-6alquilcarbonilo, amino, Ci_6alquilamino, Ci-6alquilcarbonilamino, ou um radical de fórmula -Alq2-OR13 ou -Alq2-NR14R15; em que Alq2 é Ci_6alcanediilo; R13 é hidrogénio, Ci_6alquilo, Ci_6alquilcarbonilo, hidroxiCi-6alquilo, Ar1 ou Ar2Ci_6alquilo; R14 é hidrogénio, Ci_6alquilo, Ar1 ou Ar2Ci_6alquilo; R15 é hidrogénio, Ci_6alquil, Ci_6alquilcarbonilo, Ar1 ou Ar2Ci_6alquilo; R17 é hidrogénio, halo, ciano, Ci_6alquilo, Ci_ galquiloxicarbonilo, Ar1; R é hidrogénio, Ci_6alquilo, Ci_6alquiloxi ou halo; R19 é hidrogénio ou Ci_6alquilo; Ar1 é fenilo ou fenilo substituído com Ci_6alquilo, hidroxi, amino, Ci_6alquiloxi ou halo; e Ar2 é fenilo ou fenilo substituído com Ci_6alquilo, hidroxi, amino, Ci_6alquiloxi ou halo.
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