PT1854809E

PT1854809E - Ácido nucleico e proteína correspondente, designada por 158p1d7, úteis para o tratamento e detecção de cancro da bexiga e de outros cancros

Info

Publication number: PT1854809E
Application number: PT71016935T
Authority: PT
Inventors: Arthur B Raitano; Mary Faris; Rene S Hubert; Aya Jakobovits; Pia M Challita-Eid; Daniel E H Afar; Elana Levin
Original assignee: Agensys Inc
Priority date: 2000-08-22
Filing date: 2001-08-22
Publication date: 2012-12-26
Also published as: CA2420543C; US20030017466A1; EP1854809B1; US20050227253A1; AU2001286699A1; US20030207835A1; WO2002016593A3; US6863892B2; WO2002016598A2; EP1311675A2; EP1854809A1; DE60126495T2; US20060018917A1; ATE353366T1; ES2395524T3; AU2001285210A1; EP1311675B1; ES2281437T3; DE60126495D1; WO2002016598A3

Description

1 DESCRIÇÃO "ÁCIDO NUCLEICO E PROTEÍNA CORRESPONDENTE, DESIGNADA POR 158P1D7, ÚTEIS PARA O TRATAMENTO E DETECÇÃO DE CANCRO DA BEXIGA E DE OUTROS CANCROS"

CAMPO DA INVENÇÃO A presente invenção diz respeito a uma nova sequência de ácido nucleico e à correspondente proteina por ela codificada, designada por 158P1D7, e a processos de diagnóstico e terapêuticos e a composições úteis para o tratamento de diversos cancros que exprimem a 158P1D7.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO 0 cancro é a segunda causa principal de morte em seres humanos, logo a seguir às doenças coronárias. Em todo o mundo morrem, anualmente, milhões de pessoas com cancro. Só nos Estados Unidos da América, conforme indicado pela Sociedade Americana do Cancro, esta patologia é responsável pela morte de mais de meio milhão de pessoas anualmente, havendo mais de 1,2 milhões de casos novos diagnosticados em cada ano. Apesar de as mortes provocadas por doenças cardíacas terem vindo a diminuir significativamente, em termos gerais, as provocadas pelo cancro têm vindo a aumentar. Admite-se que nos primeiros anos do próximo século o cancro venha a ser a principal causa de morte.

Entre todos os novos casos de cancro nos Estados Unidos da América do Norte, o cancro da bexiga representa aproximadamente 5% nos homens (é o quinto neoplasma mais 2 frequente) e 3% nas mulheres (é o oitavo neoplasma mais frequente). A incidência está a aumentar lentamente, concomitantemente com um aumento da população mais idosa. Em 1998 foram estimados 54 500 casos, sendo 39 500 nos homens e 15 000 nas mulheres. A incidência ajustada à idade é de 32 por 100 000 no caso dos homens e 8 por 100 0000 no caso das mulheres, nos Estados Unidos da América. A proporção histórica de 3:1 entre homens/mulheres pode estar a diminuir, devido aos comportamentos das mulheres enquanto fumadoras. Houve cerca de 11 000 óbitos estimados, provocados pelo cancro da bexiga em 1998 (7 800 entre homens e 3 900 entre mulheres). A incidência do cancro da bexiga e a correspondente mortalidade aumentam fortemente com a idade e irão passar a ser um problema cada vez maior, à medida que a população se vai tornando mais idosa.

Os cancros da bexiga compreendem um grupo heterogéneo de doenças. Os determinantes principais do combate à patologia e de sobrevivência são a histologia e a gravidade da doença. Os códigos principais para estes factores abrangem a classificação patológica, a classificação internacional de doenças para oncologia (CID-O) e o estadiamento da extensão da doença, a classificação TXM. (Quadro XXI). Para um estudo geral sobre cancros da bexiga e outros cancros urogenitais ver, v.gr., Volgelzang, et al., Eds. Comprehensive Textbook of Genitourinary Oncology, (Williams & Wilkins, Baltimore 1996), em particular as páginas 295-556. Há três tipos primários de tumores que foram observados na bexiga. O tipo mais frequente de cancro da bexiga é o carcinoma das células transicionais (TCC); é responsável por cerca de 90% de todos os cancros da bexiga. 3 A segunda forma de cancro da bexiga é o carcinoma das células escamosas, que é responsável por cerca de 8% de todos os cancros da bexiga em que a esquistosomiase não é endémica e aproximadamente 75% dos carcinomas da bexiga em que a esquitosomiase é endémica. Os carcinomas das células escamosas têm tendência para invadir as camadas mais profundas da bexiga. 0 terceiro tipo de cancro da bexiga é o adenocarcinoma, que é responsável por cerca de l%-2% de todos os cancros da bexiga; são estas as formas de cancro essencialmente invasivas. 0 cancro da bexiga é detectado e diagnosticado, normalmente, recorrendo à citoscopia e à citologia urinária. No entanto, estes processos revelam uma fraca sensibilidade. Os processos relativamente mais fiáveis de detecção actualmente utilizados em análises clinicas compreendem o exame STAT ao antigénio do tumor da bexiga (BTA), a análise da proteína NMP22, a análise da expressão da telomerase e o exame urinário do ácido hialurónico e da hialuronidase (HA-HAase). A vantagem de se utilizar estes marcadores no diagnóstico do cancro da bexiga reside na sua sensibilidade relativamente elevada nas fases precoces tumorais, comparativamente com a citologia convencional.

Por exemplo, o exame STAT ao BTA tem uma sensibilidade entre 60-80% e uma especificidade entre 50-70%, no que respeita ao cancro da bexiga, ao passo que o exame urinário a HA-HAase revela uma sensibilidade de 90-92% e uma especificidade entre 80-84%, no que respeita ao cancro da bexiga (J Urol 2001 165:1067). Em termos gerais, a sensibilidade para os tumores em fase Ta foi de 81% no caso da proteína da matriz nuclear (NMP22), 70% no caso da telomerase, 32% no caso da sensibilidade ao antigénio do 4 tumor da bexiga (BTA) e 26% para a citologia (J Urol 2001 166:470; J Urol 1999, 161:810). Embora a análise da repetição telomérica, que mede a actividade da telomerase, seja relativamente sensivel, a instabilidade da telomerase na urina faz com que presentemente este processo de detecção não seja fiável. A maior parte dos cancros da bexiga ocorrem na bexiga. De um modo geral, os cancros da bexiga são tratados com uma combinação de ressecção transuretral da bexiga (TUR) e imunoterapia ou quimioterapia intravesical. A natureza multifocal e recorrente do cancro da bexiga salienta as limitações da TUR. A maior parte dos cancros invasivos dos músculos não é curada apenas com a TUR. A cistectomia radial e o desvio urinário são os processos mais eficazes para a eliminação do cancro, mas têm um impacto indesejável nas funções urinária e sexual. O bacilo de Calmette-Guerin (BCG) intravesical é um agente vulgar e imunoterapêutico eficaz, utilizado para o tratamento do cancro da bexiga. O BCG também é utilizado como agente profilático para evitar a recorrência do cancro da bexiga. No entanto, há 30% de pacientes que não conseguem reagir à terapêutica com o BCG, nos quais continua a desenvolver-se a patologia invasiva e metastática (Catalona et ai. J Urol 1987. 137:220-224). Foram observados, frequentemente, efeitos secundários associados ao BCG, tais como a cistite induzida pelo fármaco, o risco de infecção bacteriana e hematúria, entre outros. Foram utilizadas já outras imunoterapias alternativas para o tratamento do cancro da bexiga, tais como os interferões KLH (Flamm et ai. Urology 1994; 33:138-143) (Bazarbashi et al. J Surg Oncol. 2000; 74:181-4), e 5 células dendríticas carregadas com o péptido MAGE-3 (Nishiyama et al. Clin Câncer Res 2001; 7:23-31).

Todas estas metodologias são ainda experimentais (Zlotta et al. Eur Urol 2000;37 Suppl 3:10-15). Continua a existir uma necessidade significativa de se dispor de modalidades de diagnóstico e de tratamento que sejam benéficas para os pacientes com cancro da bexiga. Além disso, sob um ponto de vista à escala mundial, continua a haver diversos cancros considerados mortíferos. Em particular, os carcinomas do pulmão, próstata, mama, cólon, pâncreas e ovários são as causas principais de morte por cancro. Estes e, virtualmente, todos os outros carcinomas partilham uma caracteristica letal comum. Com muito poucas excepções, a patologia metastática originada por um carcinoma é fatal. Por outro lado, mesmo para os pacientes de cancro que inicialmente sobrevivem aos seus cancros primários, as suas vidas são dramaticamente alteradas. Muitos pacientes com cancro experimentam fortes estados de ansiedade provocada pela consciência que têm de uma potencial recorrência ou fracasso do tratamento. Muitos pacientes de cancro ficam fisicamente debilitados a seguir ao tratamento. Além do mais, muitos pacientes de cancro sofrem uma recorrência. 0 cancro da próstata é o quarto cancro mais dominante nos homens, em todo o mundo, Nos Estados Unidos da América e na Europa do Norte é, de longe, o cancro mais frequente nos homens e é a segunda causa principal de morte por cancro nos homens. Só nos Estados Unidos da América do Norte há, seguramente, mais de 30 000 homens que morrem anualmente com esta doença, que é a segunda a seguir ao cancro do pulmão. Apesar da grandeza destes números, 6 continua a não existir nenhum tratamento eficaz para o cancro da próstata metastático. A prostatectomia cirúrgica, a terapia por radiação, a terapia por ablação hormonal, a castração cirúrgica e a quimioterapia continuam a ser as principais modalidades de tratamento, Infelizmente, estes tratamentos são ineficazes para muitas pessoas e estão, frequentemente, associados a consequências indesejáveis.

Na frente de diagnóstico, a falta de um marcador para o tumor da próstata que consiga detectar com exactidão tumores localizados numa fase precoce continua a ser uma limitação significativa em termos de diagnóstico e tratamento desta patologia. Embora a análise sérica do antigénio específico da próstata (PSA) tenha sido uma ferramenta muito útil, a sua especificidade e utilidade geral é considerada, contudo, insuficiente em diversos aspectos importantes. Embora marcadores anteriormente identificados, tais como os PSA, PSM, PCTA e PSCA tenham facilitado os esforços para diagnosticar e tratar o cancro da próstata, continua a haver a necessidade de identificar outros marcadores e alvos terapêuticos para os cancros da próstata e cancros congéneres, com a finalidade de se melhorar ainda mais o diagnóstico e a terapêutica. 0 carcinoma das células renais (RCC) é responsável por cerca de 3% das patologias mortíferas nos adultos. A partir do momento em que os adenomas atingem um diâmetro entre 2 e 3 cm passa a existir um potencial maligno. No adulto, os dois principais tumores renais malignos são o adenocarcinoma das células renais e o carcinoma das células transicionais do pélvis renal ou da uretra. A incidência do adenocarcinoma das células renais está estimada em mais de 29 0000 casos nos Estados Unidos da América e mais de 11 7 600 pacientes morreram desta doença em 1998. O carcinoma das células transicionais é menos frequente, com uma incidência de cerca de 500 casos por ano nos Estados Unidos da América do Norte. A cirurgia foi a terapêutica principal para o adenocarcinoma das células renais durante muitas décadas. Até há pouco tempo, a patologia metastática era refractária a qualquer terapia sistémica. Com os desenvolvimentos recentes das terapêutica sistémicas, em particular das imunoterapias, o carcinoma das células renais metastáticas pode ser combatido agressivamente, em determinados pacientes, com uma possibilidade de respostas duradouras. No entanto, continua a haver a necessidade de se dispor de terapias eficazes para estes pacientes.

No ano de 2000 ocorreram, em valor estimado, 130 200 casos de cancro colorrectal nos Estados Unidos da América do Norte, incluindo 93 800 casos de cancro do cólon e 36 400 casos de cancro rectal. Os cancros colorrectais constituem o terceiro caso mais frequente de cancros nos homens e nas mulheres. As taxas de incidência diminuíram significativamente durante 1992-1996 (-2,1% por ano). A investigação sugere que esta diminuição ficou a dever-se a um maior rastreio e à redução de pólipos, evitando a progressão de tais pólipos para cancros invasivos. Houve um valor estimado de 56 300 mortes (47 700 de cancro do cólon e 8 600 de cancro rectal) em 2000, correspondendo isto acerca de 11% de todas as mortes por cancro nos E.U.A..

No momento presente, a cirurgia é a forma mais vulgar de terapêutica do cancro colorrectal e, no caso dos cancros que não se tenham disseminado, é frequentemente curativa. Administra-se uma quimioterapia, ou uma quimioterapia mais radiação, antes ou após a cirurgia, à maior parte dos pacientes cujos cancros tenham penetrado profundamente nas paredes do intestino ou se tenham disseminado para os nódulos linfáticos. Ocasionalmente, é necessária uma colostomia permanente (criação de uma abertura abdominal para a eliminação dos resíduos corporais), sendo menos frequentemente necessária no caso do cancro rectal. Continua a ser necessário dispor de modalidades eficazes de diagnóstico e tratamento para o cancro colorrectal.

Houve um valor estimado de 164 100 casos novos de cancro pulmonar e bronquial em 2000, correspondendo isso a 14% de todos os diagnósticos de cancro nos E.U.A. A taxa de incidência de cancro pulmonar e bronquial tem vindo a diminuir significativamente nos homens, desde um valor da ordem de 86,5 por 100 000 em 1984 até 70,0 em 1996. Na década de 1990 a taxa de aumento entre as mulheres começou a diminuir. Em 1996, a taxa de incidência nas mulheres foi de 42,3 por 100 000.

Os cancros pulmonar e bronquial provocaram um valor estimado de 156 900 mortes em 2000, sendo responsáveis por 28% de todas as mortes por cancro. Durante os anos de 1992-1996, a mortalidade provocada pelo cancro pulmonar diminui significativamente entre os homens (-1,7% por ano), ao passo que no caso das mulheres as taxas ainda foram aumentando significativamente (0,9% por ano). Desde 1987 houve mais mulheres que morreram, em cada ano, devido a cancro pulmonar do que a cancro da mama que foi, durante mais de 40 anos, a principal causa de morte por cancro nas mulheres. A diminuição da incidência das taxas de mortalidade por cancro pulmonar resultou, essencialmente, de uma diminuição do número de fumadores ao longo dos 30 9 anos anteriores; no entanto, a diminuição do número de fumadoras entre as mulheres é inferior ao dos homens. Embora tenha diminuído a utilização de tabaco entre adultos, é preocupante o facto de a utilização do tabaco estar a aumentar, outra vez, entre os jovens.

As opções de tratamento para os cancros pulmonar e bronquial são determinadas pelo tipo e pela fase do cancro e compreendem a cirurgia, a terapêutica por radiação e a quimioterapia. Para muitos cancros localizados, a cirurgia é, vulgarmente, o tratamento escolhido. Uma vez que a patologia se encontra, normalmente, disseminada no momento em que é detectada, são frequentemente necessárias a terapêutica por radiação e a quimioterapia, conjuntamente com a cirurgia. A quimioterapia, por si só ou combinada com a terapia por radiação, é o tratamento seleccionado para o cancro pulmonar das células pequenas; quando sujeitos a este regime, há uma grande percentagem de pacientes em que se observa a remissão que em alguns casos é de longa duração. No entanto, continua a existir uma necessidade de se dispor de metodologias eficazes de tratamento e diagnóstico para os cancros pulmonar e brônquico.

Presume-se que tenha havido 182 800 novos casos invasivos de cancro da mama entre mulheres nos E.U.A. durante o ano 2000. Além disso, presume-se que tenham sido diagnosticados 1 400 novos casos de cancro da mama nos homens no ano 2000. Após um aumento de cerca de 4% por ano na década de 1980, as taxas de incidência de cancro da mama nas mulheres estabilizaram na década de 1990 para valores de cerca de 110,6 casos por 100 000.

Apenas nos E.U.A. admite-se que houve um valor estimado de 41 200 mortes (40 800 mulheres, 400 homens) no 10 ano 2000, devido ao cancro da mama. O cancro da mama é o segundo cancro responsável pela morte de mulheres. De acordo com os dados mais recentes, as taxas de mortalidade diminuíram significativamente entre 1992-1996, sendo as maiores taxas de diminuição observadas em mulheres jovens, tanto brancas como negras. Estas diminuições foram, provavelmente, o resultado da detecção precoce e das melhorias de tratamento.

Tendo em consideração as circunstâncias médicas e as preferências dos pacientes, o tratamento do cancro da mama pode implicar a lumpectomia (remoção local do tumor) e a remoção dos nódulos linfáticos sob o braço; a mastectomia (a remoção cirúrgica da mama) e a remoção dos nódulos linfáticos sob o braço; a terapia por radiação; a quimioterapia; ou a terapia hormonal. Frequentemente, são utilizados combinadamente dois ou vários processos. Diversos estudos comprovaram que as taxas de sobrevivência a longo prazo, em fases patológicas precoces, após a lumpectomia mais a radioterapia, são semelhantes às taxas de sobrevivência após a mastectomia radical modificada. Avanços significativos nas técnicas de reconstrução permitem diversas opções para a reconstrução mamária após a mastectomia. Recentemente, tais reconstruções têm sido efectuadas simultaneamente com a mastectomia. A excisão local do carcinoma ductal in situ (DCIS) com quantidades adequadas de tecido mamário normal envolvente, pode evitar a recorrência local de DCIS. A radiação da mama e/ou o fármaco tamoxifeno podem reduzir a probabilidade de repetição de DCIS no tecido mamário remanescente. Isto é importante na medida em que o DCIS, se não for tratado, pode evoluir para cancro mamário invasivo. Contudo, há 11 graves efeitos secundários ou sequelas com estes tratamentos. Em consequência, há a necessidade de se dispor de tratamentos eficazes contra o cancro da mama.

Foi estimado um valor de 23 100 novos casos de cancro do ovário nos E.U.A. no ano 2000. Este cancro é responsável por 4% da totalidade dos cancros entre as mulheres e está classificado em segundo lugar entre os cancros ginecológicos. Durante o período de 1992-1996, as taxas de incidência de cancro do ovário diminuíram significativamente. Como consequência do cancro do ovário, houve um valor estimado de 14 000 mortes no ano 2000. O cancro do ovário provoca mais mortes do que qualquer outro cancro do sistema reprodutor das mulheres. A cirurgia, a terapia por radiação e a quimioterapia são opções de tratamento para o cancro do ovário. A cirurgia visa, normalmente, a remoção de um ou de ambos os ovários, das trompas de Falópio (salpingo-ooforectomia) e do útero (histerectomia). Em alguns tumores bastante precoces, apenas irá ser removido o ovário afectado, especialmente em mulheres jovens que desejem ter filhos. Em caso de doença avançada, faz-se uma tentativa para remover todos os tecidos enfermos intra-abdominais para melhorar o efeito da quimioterapia. Continua a haver uma necessidade importante de opções eficazes de tratamento para o cancro do ovário.

Houve um número estimado de 28 300 casos novos de cancro pancreático nos E.U.A. no ano 2000. Nos últimos 20 anos as taxas de cancro pancreático diminuíram nos homens. As taxas entre as mulheres permanecerem aproximadamente constantes, mas pode ser que comecem a diminuir. O cancro pancreático provocou um número estimado de 28 200 mortes no 12 ano 2000 nos E.U.A.. Nos últimos 20 anos houve uma diminuição ligeira, mas significativa, das taxas de mortalidade entre os homens (cerca de -0,9% por ano), tendo todavia as taxas aumentado ligeiramente entre as mulheres. A cirurgia, a terapia por radiação e a quimioterapia são opções de tratamento para o cancro pancreático. Estas opções de tratamento podem prolongar o período de vida e/ou mitigar os sintomas em muitos pacientes, mas não é provável que constitua uma cura na maior parte dos casos. Há uma necessidade significativa de se dispor de mais opções terapêuticas e de diagnóstico para o cancro pancreático.

DESCRIÇÃO ABREVIADA DA INVENÇÃO A presente invenção diz respeito a uma nova sequência de ácido nucleico e ao polipeptido por ela codificado, designado por 158P1D7. Tal como aqui utilizado, o termo "158P1D7" pode designar novos polinucleótidos ou polipeptidos ou ambos, no âmbito da presente invenção.

Os ácidos nucleicos que codificam 158P1D7 são expressos em excesso nos cancros enumerados no Quadro 1. A análise da expressão, pela transferência de Northern da expressão de 158P1D7 em tecidos normais revela um padrão de expressão restrito em tecidos adultos. São apresentadas as sequências de nucleótidos (figura 2) e as de aminoácidos (figura 2 e figura 3) de 158P1D7. O perfil de 158P1D7, associado aos tecidos, em tecidos adultos normais, combinado com a expressão excessiva observada em tumores da bexiga, revela que o 158P1D7 é anormalmente expresso em excesso, pelo menos em alguns cancros. 13 São aqui descritos os polinucleótidos correspondentes, ou complementares, aos ácidos nucleicos, aos ARNm e/ou às sequências codificadoras de 158P1D7, de preferência nas suas formas isoladas, e também aos próprios péptidos/proteinas: ADN, ARN, híbridos de ADN/ARN e moléculas congéneres (tais como as PNA), polinucleótidos ou oligonucleótidos complementares das sequências dos ácidos nucleicos de 158P1D7 ou das sequências de ARNm ou partes suas e diversos ARNm ou polinucleótidos que codificam 158P1D7. A invenção proporciona diversas composições imunogénicas ou terapêuticas e estratégias para tratar cancros que exprimam 158P1D7, tais como os cancros da bexiga, incluindo as terapias destinadas a inibir a transcrição, a tradução, o processamento ou a actividade de 158P1D7, e também vacinas contra o cancro.

DESCRIÇÃO ABREVIADA DAS FIGURAS

Figura 1. Sequência de ácidos nucleicos de 158P1D7. A sequência SSH de 158P1D7 contém 231 pb. (SEQ ID. NO.:655)

Figura 2. Sequências de ADNc (SEQ ID. NO.:656) e de aminoácidos (SEQ ID. NO.:657) para 158P1D7. A metionina inicial está sublinhada. A grelha de leitura aberta vai desde o ácido nucleico 23 até ao 2548, incluindo o codão de terminação.

Figura 3. Sequência de aminoácidos de 158P1D7 (SEQ ID. NO. :6 5 7) .

Figura 4. Alinhamento sequencial de 158P1D7 com a proteína hipotética humana FLJ22774, clone KAIA1575 (SEQ ID. NO. : 658) . 14

Figura 5a. Alinhamento da sequência de aminoácidos de 158P1D7 com a proteína humana (FLJ227744, SEQ ID. NO.:659).

Figura 5b. Alinhamento da sequência de aminoácidos de 158P1D7 com a proteína humana semelhante a IGFALS (SEQ ID. NO.:660).

Figura 6. Expressão de 158P1D7 por RT-PCR. Preparou-se a primeira cadeia de ADNc a partir do lote vital 1 (VP1: fígado, pulmão e rim), do lote vital 2 (VP2, pâncreas, cólon e estômago) , do lote de xenoenxerto da próstata (LAPC-4AD, LAPC-4AI, LAPC-9AD, LAPC-9AI), do lote de cancro da próstata, do lote de cancro da bexiga, do lote de cancro do cólon, do lote de cancro do pulmão, do lote de cancro do ovário, do lote de cancro da mama e do lote de metástases. A normalização foi efectuada por PCR, utilizando iniciadores para a actina e GAPDH. Efectuou-se uma PCR semi-quantitativa, utilizando iniciadores para 158P1D7, com 30 ciclos de amplificação. Observa-se uma forte expressão de 158P1D7 no lote de cancro da bexiga e no lote do cancro da mama. Foram observados níveis menores de expressão nos lotes VP1, VP2, do xenoenxerto, do cancro da próstata, do cancro do cólon, do cancro do pulmão, do cancro do ovário e das metástases. no intestino

Figura 7. Expressão de 158P1D7 em tecidos humanos normais. Foram hibridadas duas transferências de Northern de vários tecidos, à razão de 2 yg de ARNm/pista, com fragmentos de 158P1D7. Os padrões dimensionais, em quilobases (kb), estão indicados ao lado. Os resultados mostram a expressão de 158P1D7 na próstata, fígado, placenta, coração e, em níveis menores, delgado e no cólon. 15

Figuras 8A e 8B. Expressão de 158P1D7 em amostras de pacientes com cancro da bexiga. Extraiu-se ARN de linhas de células de cancro da bexiga (CL), de bexigas normais (N) , de tumores da bexiga (T) e de tecidos adjacentes normais correspondentes (NAT) isolados a partir de pacientes com cancro da bexiga. As transferências de Northern, com 10 pg de ARN total/pista, foram hibridadas com o fragmento de 158P1D7. Os padrões dimensionais, em quilobases (kb), estão indicados ao lado. Os resultados mostram a expressão de 158P1D7 em 1 de 3 linhas de células de cancro da bexiga. Nas amostras de pacientes, a expressão de 158P1D7 é detectada em 4 dos 6 tumores estudados (8A) . Num outro estudo, a expressão de 158P1D7 é detectada na totalidade dos tumores dos pacientes estudados (8B). A expressão observada em tecidos adjacentes normais (isolados dos tecidos patológicos), mas não em tecidos normais, isolados a partir de dadores saudáveis, pode indicar, eventualmente, que estes tecidos não são totalmente normais e que o 158P1D7 pode ser expresso em tumores em fase precoce.

Figura 9. Expressão de 158P1D7 em amostras de pacientes com cancro pulmonar. Extraiu-se ARN de linhas de células de cancro do pulmão (CL), de tumores pulmonares (T) e dos seus tecidos adjacentes normais (NAt) isolados a partir de pacientes com cancro pulmonar. As transferências de Northern com 10 pg de ARN total/pista foram hibridadas com o fragmento de 158P1D7. Os padrões dimensionais, em quilobases (kb), estão indicados ao lado. Os resultados mostram a expressão de 158P1D7 em 1 de 3 linhas de células de cancro do pulmão e na totalidade dos 3 tumores pulmonares estudados, mas não em tecidos pulmonares normais. 16

Figura 10. Expressão de 158P1D7 em amostras de pacientes com cancro da mama. Extraiu-se ARN de linhagens de células de cancro da mama (CL) , de mama normal (N) e de tumores mamários (T), isoladas a partir de pacientes com cancro da mama. As transferências de Northern com 10 pg de ARN total/pista foram hibridadas com o fragmento de 158P1D7. Os padrões dimensionais, em quilobases (kb), estão indicados ao lado. Os resultados mostram a expressão de 158P1D7 em 2 de 3 linhas de células de cancro da mama e em 2 tumores mamários, mas não em tecido mamário normal

Figura 11. Determinou-se o perfil de hidrofilicidade dos aminoácidos de 158P1D7, recorrendo à análise sequencial por algoritmo a correr em computador, utilizando o processo de Hopp e Woods (Ηορρ T.P., Woods K.R, 1981. Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A.. 78: 3824-3828), ao qual se tem acesso no website Protscale (www.expasy.ch/cgi-bin/protscale.pl), através do servidor de biologia molecular ExPasy.

Figura 12. Determinou-se o perfil de hidrofilicidade dos aminoácidos de 158P1D7, recorrendo à análise sequencial por algoritmo a correr em computador, utilizando o processo de Kyte e Doolittle (Kyte J., Doolittle R.F., 1982. J. Mol. Biol. 157:105-132), ao qual se tem acesso no website ProtScale (www.expasy.ch/cgi-bin/protscale.pl), através do servidor de biologia molecular ExPasy.

Figura 13. Determinou-se o valor percentual do perfil dos resíduos aminoácidos acessíveis de 158P1D7, pela análise sequencial por meio de um algoritmo a correr em computador, utilizando o processo de Janin (Janin J., 1979 Nature 277:491-492), ao qual se tem acesso no website Protscale (www.expasy.ch/cgi-bin/protscale.pl) , através do servidor de biologia molecular ExPasy. 17

Figura 14. Determinou-se o perfil da flexibilidade média dos aminoácidos de 158P1D7, por análise sequencial por meio de um algoritmo a correr em computador, utilizando o processo de Bhaskaran e Ponnuswamy (Bhaskaran R., e Ponnuswamy P.K., 1988. Int. J. Pept. Protein Res. 32:242- 255) , ao qual se tem acesso no website ProtScale (www.expasy.ch/cgi-bin/protscale.pl), através do servidor de biologia molecular ExPasy.

Figura 15. Determinou-se o perfil da hélice β dos aminoácidos de 158P1D7 por análise sequencial por meio de um algoritmo a correr em computador, utilizando o processo de Deleage e Roux (Deleage, G., Roux B. 1987 Protein Engineering 1:289-294), ao qual se tem acesso no website ProtScale (www.expasy.ch/cgi-bin/protscale.pl), através do servidor de biologia molecular ExPasy.

Figuras 16A e 16B. Previsão da região transmembranar e orientação para o 158P1D7.

DESCRIÇÃO MINUCIOSA

Descrição geral das secções I. ) Definições II. ) Polinucleótidos de 158P1D7 II.A.) Utilizações dos polinucleótidos de 158P1D7 II.A.1.) Monitorização das anomalias genéticas II.A.2.) Variantes anti-sense II.A.3.) Iniciadores e pares de iniciadores II.A.4.) Isolamento das moléculas de ácido nucleico que codificam 158P1D7 18 II. A.5.) Moléculas de ácidos nucleicos recombinantes e sistemas hospedeiro-vector III. ) Proteínas aparentadas com 158P1D7 III.A.) Variante de proteínas portadoras de motivos III.B.) Expressão de proteínas aparentadas com 158P1D7 III.C.) Modificações de proteínas aparentadas com 158P1D7 III. D.) Utilizações de proteínas aparentadas com 158P1D7 IV. ) Anticorpos de 158P1D7 V. ) Respostas imunitárias celulares a 158P1D7 VI. ) Animais transgénicos de 158P1D7 VII. ) Processos para a detecção de 158P1D7 VIII. ) Processos para monitorizar a importância de genes aparentadas com 158P1D7 e seus produtos IX. ) Identificação de moléculas que interactuam com 158P1D7 X. ) Processos terapêuticos e composições X.A.) Vacinas anti-cancro X.B.) 158P1D7, enquanto alvo relevante para a terapia à base de anticorpos X.C.) 158P1D7, enquanto alvo relevante para respostas imunitárias celulares X.C.l. Vacinas de minigenes

X.C.2. Combinação de péptidos CTL com péptidos auxiliares X.C3. Combinações de péptidos CTL com agentes estimuladores de células T X.C.4. Composições de vacinas que compreendem DC estimuladas com péptidos CTL e/ou HTL X.D.) Imunoterapia adoptiva X. E.) Administração de vacinas para fins terapêuticos ou profiláticos XI. ) Variantes de 158P1D7 para diagnóstico e prognóstico. XII. ) Inibição da actividade da proteína 158P1D7 19 ΧΙΙΑ.) Inibição de 158P1D7 com anticorpos intracelulares XII.B.) Inibição de 158P1D7 com proteínas recombinantes XII.C.) Inibição da transcrição ou tradução de 158P1D7 XII.D.) Considerações gerais para estratégias terapêuticas XIII) Estojos I.) Definições:

Salvo quando definidos de outro modo, todos os termos da técnica, notações e outros termos ou terminologia científica, aqui utilizados, têm as significações que vulgarmente lhes são atribuídas pelos especialistas na matéria respeitante ao domínio da invenção. Em alguns casos, são aqui definidos termos com significações vulgares, por razões de clareza e/ou para uma referência fácil, esclarecendo-se que a inclusão de tais definições não pretende constituir uma diferença substancial em relação ao que é geralmente subentendido na especialidade. Muitos dos processos e técnicas aqui descritos ou referenciados são perfeitamente conhecidos e vulgarmente utilizados em metodologias convencionais praticadas pelos especialistas na matéria, por exemplo, as metodologias de clonagem molecular, generalizadamente utilizadas, descritas na obra de Sambrook et ai., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2a, edição (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.. Sempre que adequado, os procedimentos envolvendo a utilização de estojos e reagentes existentes nos circuitos comerciais são praticados, em geral, em conformidade com os protocolos e/ou parâmetros definidos pelos fabricantes, salvo quando especificado de outro modo. 20 O termo "cancro da bexiga invasivo" designa os cancros da bexiga que se tenham disseminado para a parede do músculo da bexiga e abrange as fases T2 - T4 e a patologia subjacente ao sistema TNM (tumor, nódulos, metástases). Em geral, estes pacientes têm resultados substancialmente menos favoráveis quando comparados com pacientes com cancros não invasivos. A seguir à cistectomia, 50% ou mais desses pacientes com cancro invasivo irão desenvolver metástases (Whittmore. Semin Urol 1983; 1:4-10). A frase "alterar o padrão de glicosilação natural" tem por objecto, para os fins aqui almejados, desiqnar a supressão de um ou vários radicais hidratos de carbono existentes na sequência natural de 158P1D7 (quer por remoção do local de glicosilação subjacente quer por supressão da glicosilação por meios químicos e/ou enzimáticos) e/ou a adição de um ou vários locais de glicosilação que não estejam presentes na sequência natural de 158P1D7. Além disso, tal frase abrange as modificações qualitativas ocorridas na glicosilação das proteínas naturais, envolvendo uma modificação da natureza e das proporções dos diversos radicais hidratos de carbono presentes. O termo "análogo" designa uma molécula que é estruturalmente semelhante, ou que partilha atributos similares ou correspondentes, a uma outra molécula (v.g. uma proteína conotada com 158P1D7). Por exemplo, o análogo da proteína 158P1D7 consegue ligar-se especificamente a um anticorpo ou a uma célula T que se ligue especificamente à proteína 158P1D7. O termo "anticorpo" é aqui utilizado no seu sentido mais amplo. Assim sendo, um "anticorpo" pode ocorrer 21 naturalmente ou pode ser feito artificialmente, tal como sucede com os anticorpos monoclonais produzidos por meio da tecnologia convencional dos hibridomas. Os anticorpos anti-158P1D7 ligam-se às proteínas 158P1D7, ou a um seu fragmento, e compreendem anticorpos monoclonais e policlonais e também os fragmentos que contenham o domínio de ligação do antigénio e/ou uma ou várias regiões desses anticorpos determinantes da complementaridade.

Define-se um "fragmento de anticorpo" como sendo pelo menos uma parcela de uma região variável da molécula de imunoglobulina que se liga ao seu alvo destinatário, isto é, a região de ligação do antigénio. De acordo com uma variante, designa especificamente anticorpos simples anti-158P1D7 e seus clones (incluindo anticorpos agonistas, antagonistas e neutralizadores) e composições de anticorpos anti-158PlD7 com especificidade poliepitópica. 0 termo "sequências optimizadas em codões" designa as sequências de nucleótidos que tenham sido optimizadas para uma espécie hospedeira particular, substituindo qualquer um ou mais do que um codão que tenha uma frequência de utilização inferior a cerca de 20% e mais preferencialmente inferior a cerca de 30% ou 40%. A sequência pode ser "completamente optimizada" de modo a não conter nenhum codão que tenha uma frequência de utilização inferior a cerca de 20% e mais preferencialmente inferior a cerca de 30% ou 40%. As sequências nucleot ídicas que tenham sido optimizadas para a expressão numa dada espécie hospedeira, por eliminação de sequências de poliadenilação espúrias, por eliminação dos sinais de junção exão/intrão, por eliminação de repetições semelhantes ao transposão e/ou por optimização do conteúdo em GC, para além da optimização de 22 codões, são aqui designadas por "sequências com expressão melhorada". 0 termo "agente citotóxico" designa uma substância que inibe ou limita uma ou várias funções das células e/ou provoca a destruição das células. Este termo pretende abranger isótopos radioactivos, agentes quimioterapêuticos e toxinas, tais como as toxinas de moléculas pequenas ou as toxinas enzimaticamente activas de origem bacteriana, fúngica, vegetal ou animal, incluindo os seus fragmentos e/ou variantes. Como exemplos de agentes citotóxicos refere-se, mas sem qualquer limitação, os seleccionados entre maitansinóides, itrio, bismuto, rícino, cadeia A do rícino, doxorrubicina, daunorrubicina, taxol, brometo de etídio, mitomicina, etopósido, tenopósido, vincristina, vinblastina, colchicina, di-hidroxi-antracina-diona, actinomicina, toxina da difteria, exotoxina de Pseudomonas (PE)A, PE40, abrina, cadeia A de abrina, cadeia A de modecina, α-sarcina, gelonina, nitogelina, retstrictocina, fenomicina, enomicina, curicina, crotina, calicheamicina, inibidora da saponária officinalis e glicocorticóides e outros agentes quimioterapêuticos, bem como os radioisótopos tais como At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm , Bi , P e os isótopos radioactivos de Lu. Os anticorpos também podem ser conjugados com uma enzima activadora de um pro-fármaco contra o cancro, a qual seja capaz de converter o pro-fármaco na sua forma activa. O termo "homólogo" refere-se a uma molécula que exiba homologia com uma outra molécula, por exemplo, devido ao facto de ter sequências de resíduos químicos que sejam iguais ou semelhantes nas posições correspondentes. 23 0 "antigénio leucocitário humano" ou "HLA" é uma proteína do complexo humano de histocompatibilidade principal (MHC) de classe I ou de classe II (ver, v.gn, Stites, et ai., IMMUNOLOGY, 8TH ED., Lange Publishing, Los Altos, CA (1994).

Os termos "hibridar", "hibridação", "híbrido" e outros semelhantes, utilizados no contexto dos polinucleótidos, servem para designar condições convencionais de hibridação, de preferência as que correspondam a uma hibridação em formamida a 50%/SSC6X/SDS a 0,1%/ADNss a 100 pg/mL, com temperaturas de hibridação superiores a 37°C e temperaturas de lavagem, em SSC a 0,1X/SDS a 0,1%, superiores a 55°C.

Os termos "isolado" ou "biologicamente puro" designam um material que se encontra substancial ou essencialmente isento de componentes que normalmente acompanham esse material quando este se encontra no seu estado natural. Assim, os péptidos isolados, de acordo com a presente invenção, preferencialmente não contêm nenhuns materiais que lhes estejam normalmente associados ou presentes quando tais péptidos se encontram no seu ambiente in situ. Por exemplo, diz-se que um polinucleótidos está "isolado" quando se encontra substancialmente separado de polinucleótidos recombinantes que correspondam, ou sejam complementares, a ácidos nucleicos diferentes dos de 158P1D7, ou que codifiquem polipeptidos diferentes do produto génico 158P1D7 ou seus fragmentos. Um especialista na matéria consegue praticar facilmente processos de isolamento de ácidos nucleicos para obter um polinucleótido de 158P1D7 isolado. Diz-se que uma proteína se encontra "isolada", por exemplo, quando são utilizados processos físicos, mecânicos e/ou químicos para se retirar a proteína 24 158P1D7 dos constituintes celulares que estão normalmente associados à proteína, ou que se encontrem presentes. Um especialista na matéria consegue praticar facilmente processos de purificação convencionais para obter uma proteína 158P1D7 isolada. Em alternativa, é possível preparar uma proteína isolada por meios sintéticos ou químicos. 0 termo "mamífero" designa qualquer organismo classificado como sendo um mamífero, incluindo os murganhos, ratos, coelhos, cães, gatos, bovinos, equídeos e seres humanos. De acordo com uma forma de realização da invenção, um mamífero é um murganho. De acordo com uma outra forma de realização da invenção, um mamífero é um ser humano.

Os termos "cancro metastático da bexiga" e "doença metastática" servem para designar cancros da bexiga que se tenham disseminado para os nódulos linfáticos regionais ou para locais distantes, podendo ser identificados pelas fases TxNxM+, segundo o sistema TNM. Os locais mais vulgares de localização das metástases do cancro da bexiga são os nódulos linfáticos. Outros locais frequentes de localização de metástases são os pulmões, os ossos e o fígado. 0 termo "anticorpo monoclonal" designa um anticorpo obtido a partir de uma população de anticorpos substancialmente homogéneos, isto é, os anticorpos desse conjunto são idênticos, com a excepção de possíveis mutações que ocorram naturalmente e que se encontrem presentes em quantidades diminutas.

Um "motivo", enquanto motivo biológico de uma proteína conotada com 158P1D7, diz respeito a qualquer padrão de 25 aminoácidos que façam parte da sequência primária de uma proteína que esteja associada, com uma função particular (v.g., interacção proteína-proteína, interacção proteína-ADN, etc.) ou com uma modificação (v.g., que seja fosforilada, glicosilada ou amidada); ou a localização (v.g., sequência secretória, sequência de localização nuclear, etc.) ou uma sequência que seja considerada imunogénica, quer por via humoral quer por via celular. Um motivo pode ser contínuo ou susceptível de ser alinhado em determinadas posições que sejam, geralmente, aparentadas com uma determinada função ou propriedade. No contexto dos motivos de HLA, o termo "motivo" refere-se ao padrão de resíduos de um péptido de comprimento definido, normalmente um péptido que compreenda entre cerca de 8 e cerca de 13 aminoácidos para um motivo de HLA de classe I e que compreenda entre cerca de 6 e cerca de 25 aminoácidos para um motivo de HLA de classe II, sendo tal padrão reconhecido por uma molécula particular de HLA. Os motivos peptídicos para a ligação de HLA são, tipicamente, diferentes para cada proteína codificada por cada alelo de HLA humano e diferem do padrão de resíduos de ancoragem primários e secundários.

Um "excipiente farmacêutico" é um material, por exemplo, um adjuvante, um veículo, um agente para ajustar o pH e os seleccionados entre agentes tampão, agentes para ajustar a tonicidade, agentes humectantes, conservantes e outros. 0 termo "f armaceut i camente aceitável" designa uma composição ou agente inerte e não tóxico que seja fisiologicamente compatível com os mamíferos, por exemplo, os seres humanos. 26 0 termo "polinucleótido" designa uma forma polimérica de nucleótidos com um comprimento pelo menos igual a 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 100 bases ou pares de bases, quer sejam ribonucleótidos ou desoxinucleotidos ou uma forma modificada de qualquer tipo de nucleótidos, considerando-se que estão abrangidas as formas de cadeia singular e dupla de ADN e/ou ARN. Na especialidade, este termo é vulgarmente utilizado, de forma indiferenciada, em vez de "oligonucleótido", embora o termo "oligonucleótido" possa ser utilizado para designar um subconjunto de polinucleótidos com um comprimento inferior a cerca de 50 nucleótidos. Um polinucleótido pode compreender uma sequência nucleotidica aqui descrita, em que a timidina (T) (conforme ilustrado, por exemplo, na SEQ ID NO: 656) também pode ser uracilo (U); esta definição abrange as diferenças entre as estruturas químicas de ADN e ARN, e em particular considera o facto de uma das quatro bases principais no ARN ser uracilo (U) em vez de timidina (T). O termo "polipeptido" designa um polímero que tem pelo menos cerca de 4, 5, 6, 7 ou 8 aminoácidos. Ao longo da memória descritiva, são utilizadas as designações convencionais de 3 letras ou de uma só letra para identificar os aminoácidos. Na especialidade, este termo é frequentemente utilizado, de forma indiferenciada, em vez de "péptido" ou "proteína", pelo que é possível utilizar o termo "péptido" para designar o subconjunto de polipeptidos com um comprimento inferior a cerca de 50 aminoácidos.

Um "resíduo de ancoragem primário" de HLA é um aminoácido de uma parcela concreta situada ao longo de uma sequência peptídica para a qual se sabe que proporciona um ponto de contacto entre o péptido imunogénico e a molécula 27 de HLA. Geralmente, um a três e vulgarmente dois resíduos de ancoragem primários, contidos num péptido com um comprimento definido, constituem um "motivo" para um péptido imunogénico. Subentende-se que estes resíduos estabelecem um contacto perfeito com o encaixe de uma molécula de HLA de ligação ao péptido, com as suas cadeias laterais fixadas em bolsas específicas do encaixe de ligação. De acordo com uma forma de realização, por exemplo, os resíduos de ancoragem primários para uma molécula de HLA de classe I estão localizados na posição 2 (a partir da posição do terminal amino) e na posição do terminal carboxilo de um epítopo peptídico com 8, 9, 10, 11 ou 12 resíduos, em conformidade com a invenção. De acordo com uma outra forma de realização, por exemplo, os resíduos de ancoragem primários de um péptido, que irão ligar-se a uma molécula de HLA de classe II, estão afastados uns relativamente aos outros, em vez de estarem nos terminais de um péptido, em que o referido péptido tem um comprimento, em geral, igual a 9 aminoácidos pelo menos. As posições de ancoragem primárias para cada motivo e supermotivo estão explicitadas no Quadro IV. Por exemplo, é possível criar péptidos análogos, alterando a presença ou a ausência de resíduos particulares nas posições de ancoragem primárias e/ou secundárias explicitadas no Quadro IV. Tais análogos são utilizados para modular a afinidade de ligação e/ou a cobertura populacional de um péptido que compreenda o motivo ou supermotivo particular de HLA.

Uma molécula de ADN ou ARN "recombinante" é uma molécula de ADN ou ARN que tenha sido submetida a manipulaçao molecular in vitro. 28 A "restringência" das reacções de hibridação é facilmente determinável por um especialista na matéria e é geralmente um cálculo empirico que depende do comprimento da sonda hibridante, da temperatura de lavagem e da concentração salina. Em geral, as sondas hibridantes mais compridas exigem temperaturas mais elevadas para uma recombinação conveniente, ao passo que as sondas de hibridação mais curtas necessitam de temperaturas mais baixas. A hibridação depende, geralmente, da aptidão das sequências de ácidos nucleicos desnaturados para se recombinarem quando se encontram presentes cadeias complementares num ambiente a uma temperatura inferior à sua temperatura de fusão. Quanto mais elevados forem os graus de homologia desejada entre a sonda hibridante e a sequência hibridável, tanto mais elevadas irão ser as temperaturas relativas que é possível utilizar. Em consequência, infere-se daqui que as temperaturas relativas mais elevadas irão fazer com que haja uma tendência para que as condições de reacção sejam mais restringentes, sendo portanto menos restringentes para as temperaturas mais baixas. Para obter pormenores suplementares e uma melhor explicação sobre a restringência das reacções de hibridação, ver Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers, (1995).

As "condições restringentes" ou "condições de restringência elevada", conforme aqui se define, são identificadas, mas sem que isso constitua qualquer limitação, pelos factos seguintes: (1) utilização de uma força iónica fraca e de uma temperatura elevada para a lavagem, por exemplo, cloreto de sódio 0,015M/citrato de sódio 0,0015 M/dodecil-sulfato de sódio a 0,1% a 50°C; (2) 29 utilização de um agente desnaturante durante a hibridação, tal como a formamida, por exemplo, formamida a 50% (v/v) com albumina do soro de bovino a 0,1%/Ficoll a 0,1%/polivinilpirrolidona a 0,1%/tampão de fosfato de sódio 50 mM a pH 6,5 com cloreto de sódio 750 mM, citrato de sódio 75 mM a 42 °C; ou (3) utilização de formamida a 50%, SSC 5x (NaCl 0,75 M, citrato de sódio 0,075 M) , fosfato de sódio 50 mM (pH 6,8), pirofosfato de sódio a 0,1%, solução de Denhardt 5x, ADN de esperma de salmão tratado com ultra-sons (50 pg/mL) , SDS a 0,1% e sulfato de dextrano a 10% a 42°C, com lavagens a 42°C em SSC 0,2x (cloreto de sódio/citrato de sódio) e formamida a 50% a 55°C, seguindo-se uma lavagem em condições de restringência elevada correspondentes a SSC 0,lx contendo EDTA a 55°C. As "condições de restringência moderada" são as descritas, sem que isso constitua qualquer limitação, por Sambrook et ai., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Press, 1989, e compreendem a utilização de uma solução de lavagem e condições de hibridação (v.g., temperatura, força iónica e concentração de SDS (%)) menos restringentes do que as descritas supra. Como exemplo de condições de restringência moderada indica-se a incubação, de um dia para o outro, a 37°C numa solução constituída por: formamida a 20%, SSC 5x (NaCl 150 mM, citrato de trissódio 15 mM) , fosfato de sódio 50 mM (pH 7,6), solução de Denhardt 5x, sulfato de dextrano a 10% e ADN de esperma de salmão submetido a sonicação e desnaturado na concentração de 20 mg/mL, seguindo-se a lavagem dos filtros em SSC lx a uma temperatura de cerca de 3 7-50°C. Um especialista na matéria sabe como ajustar a temperatura, a força iónica, etc., conforme necessário, para acomodar 30 factores tais como o comprimento da sonda hibridante e não só.

Um "supermotivo" de HLA é uma especificidade de ligação peptídica partilhada por moléculas de HLA codificadas por dois ou mais alelos de HLA.

Um "animal transgénico" (v.g., um murganho ou um rato) é um animal que possui células que contêm um transgene, tendo esse transgene sido introduzido no animal ou num antepassado desse animal numa fase pré-natal, v.g., numa fase embrionária. Um "transgene" é uma ADN que é integrado no genoma de uma célula a partir da qual se desenvolve um animal transgénico.

Tal como aqui utilizada, uma "vacina" de HLA ou de resposta imunitária celular é uma composição que contém ou que codifica um ou vários péptidos da invenção. Há inúmeras variantes de tais vacinas, por exemplo, uma mistura de um ou vários péptidos individuais; um ou vários péptidos da invenção compreendendo um péptido poliepitópico; ou ácidos nucleicos que codifiquem tais péptidos ou polipeptidos individuais, v.g., um minigene que codifique um péptido poliepitópico. Os péptidos ou polipeptidos podem ser, facultativamente, modificados, por exemplo, por lipidação e por adição de sequências de encaminhamento ou de outro tipo. Os péptidos de HLA de classe I da presente invenção podem ser misturados, ou ligados, com péptidos de HLA de classe II para facilitar a activação simultânea dos linfócitos T citotóxicos e dos linfócitos T auxiliares. As vacinas de HLA também podem compreender células que apresentem antigénios estimulados por péptidos, v.g., células dendríticas. 31 0 termo "variante" designa uma molécula que apresenta uma variação relativamente a uma norma ou tipo descrito, tal como uma proteina que possua um ou vários resíduos aminoácidos diferentes nas posições correspondentes de uma proteína descrita de forma específica (v.g.r a proteína 158P1D7 ilustrada na figura 2 ou na figura 3). Um análogo é um exemplo de uma proteina variante.

As proteínas aparentadas com a 158P1D7 compreendem as que são aqui identificadas especificamente, e também as variantes alélicas, as variantes por substituição conservadora, análogos e homólogos que possam ser isolados/gerados e caracterizados sem experimentação excessiva, praticando os processos aqui apresentados ou facilmente reconhecidos e disponíveis na especialidade. Também estão incluídas as proteínas de fusão que combinem partes de diferentes proteínas 158P1D7, ou seus fragmentos, e ainda as proteínas de fusão de uma proteína 158P1D7 com um polipeptido heterólogo. Tais proteínas 158P1D7 são genericamente designadas por proteínas aparentadas com 158P1D7, ou 158P1D7. 0 termo "proteína conotada com 158P1D7" designa um fragmento polipeptídico de uma sequência da proteína 158P1D7 que possui 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, ou mais de 25 aminoácidos; ou que possua pelo menos cerca de 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 80, 85, 90, 95, 100 ou mais de 100 aminoácidos. II.) Polinucleótidos de 158P1D7 32

Descreve-se aqui polinucleótidos correspondentes, ou complementares, à totalidade ou a uma parte de um gene de 158P1D7, ao ARNm e/ou à sequência codificadora, de preferência numa forma isolada, incluindo os polinucleótidos que codificam uma proteína conotada com a 158P1D7, e seus fragmentos, ADN, ARN, híbridos de ADN/ARN e moléculas congéneres, polinucleótidos ou oligonucleótidos complementares de um gene de 158P1D7 ou uma sequência de ARNm, ou uma parte sua, e polinucleótidos ou oligonucleótidos que hibridem com um gene de 158P1D7, ARNm ou com um polinucleótido que codifique a 158P1D7 (genericamente, "polinucleótidos de 158P1D7"). Em todos os casos, ao tomar-se por referência esta secção, T também pode ser U na figura 2.

Como variantes de um polinucleótido de 158P1D7 refere-se: um polinucleótido de 158P1D7 que possui a sequência ilustrada na figura 2, a sequência nucleotídica de 158P1D7, tal como ilustrada na figura 2, em que T é U; pelo menos 10 nucleótidos contíguos de um polinucleótido que possua a sequência ilustrada na figura 2; ou, pelo menos 10 nucleótidos contíguos de um polinucleótido que possua a sequência, tal como ilustrada na figura 2, em que T é U. Por exemplo, as variantes de nucleótidos 158P1D7 compreendem, sem qualquer limitação: (a) um polinucleótido que compreenda ou tenha a sequência ilustrada na figura 2, em que T também pode ser U; (b) um polinucleótido que compreenda ou tenha a sequência ilustrada na figura 2, desde o número do resíduo nucleotídico 23 até ao número do resíduo nucleotídico 2548, em que T também pode ser U; 33 (c) um polinucleótido que codifique uma proteína conotada com 158P1D7, cuja sequência seja codificada pelos ADNc contidos no plasmídeo designado por pl58PlD7-Turbo/3PX depositado na Colecção Americana de Culturas Tipo com o número de admissão No. PTA- _ em 22 de Agosto de 2001 (enviado por via 'Federal Express' em 20 de Agosto de 2001) ; (d) um polinucleótido que codifique uma proteína conotada com 158P1D7, que seja pelo menos 90% homóloga com a totalidade da sequência de aminoácidos ilustrada na figura 2; (e) um polinucleótido que codifique uma proteína conotada com 158P1D7, que seja pelo menos 90% homóloga com a totalidade da sequência de aminoácidos ilustrada na figura 2; (f) um polinucleótido que codifique pelo menos um péptido explicitado nos Quadros V-XVIII; (g) um polinucleótido que codifique uma região peptídica que possua pelo menos 5 aminoácidos da figura 3 em qualquer posição indicada por um número inteiro que pode ir até 841 e que inclua uma posição de aminoácidos que tenha um valor superior a 0,5 no perfil de hidrofilicidade indicado na figura 11; (h) um polinucleótido que codifique uma região peptídica que possua pelo menos 5 aminoácidos da figura 3 em qualquer posição indicada por um número inteiro que pode ir até 841 e que inclua uma posição de aminoácidos que tenha um valor superior a 0,5 no perfil de hidropaticidade indicado na figura 12; (i) um polinucleótido que codifique uma região peptídica que possua pelo menos 5 aminoácidos da figura 3 34 em qualquer posição indicada por um número inteiro que pode ir até 841 e que inclua uma posição de aminoácidos que tenha um valor superior a 0,5 no perfil percentual de resíduos acessíveis indicado na figura 13; (j) um polinucleótido que codifique uma região peptídica que possua pelo menos 5 aminoácidos da figura 3 em qualquer posição indicada por um número inteiro que pode ir até 841 e que inclua uma posição de aminoácidos que tenha um valor superior a 0,5 no perfil de flexibilidade média indicado na figura 14; (k) um polinucleótido que codifique uma região peptídica que possua pelo menos 5 aminoácidos da figura 3 em qualquer posição indicada por um número inteiro que pode ir até 841 e que inclua uma posição de aminoácidos que tenha um valor superior a 0,5 no perfil de hélice β indicado na figura 15; (l) um polinucleótido que seja totalmente complementar de um polinucleótido dos referidos nas alíneas (a)-(k); (m) um polinucleótido que hibride selectivamente, em condições rigorosas, com um polinucleótido das alíneas (a)— (D ; (n) um péptido que seja codificado por um polinucleótido de uma qualquer das alíneas (a)-(k); e, (o) um polinucleótido de uma qualquer das alíneas (a)-(m) ou um péptido da alínea (n) conjuntamente com um excipiente farmacêutico e/ou numa forma de dosagem unitária humana.

Tal como aqui se utiliza, subentende-se que um intervalo identifique especificamente a totalidade das suas posições unitárias inteiras. 35 II.A.) Utilizações de polinucleótidos de 158P1D7 II.A.1.) Monitorização: anomalias genéticas

Os polinucleótidos dos parágrafos precedentes têm diversas aplicações específicas diferentes. 0 gene 158P1D7 humano circunscreve-se à localização cromossómica explicitada no exemplo 3. Por exemplo, uma vez que o gene 158P1D7 se circunscreve a este cromossoma, os polinucleótidos que codifiquem regiões diferentes da proteína 158P1D7 podem ser utilizados para caracterizar anomalias citogenéticas deste local cromossómico, tais como as anomalias que são identificadas como estando associadas a diversos cancros. Em determinados genes, foi identificado um conjunto de anomalias cromossómicas, incluindo rearranjos, sendo essas anomalias consideradas como anomalias citogenéticas em diversos cancros diferentes (ver, v.g., Krajinovic et ai., Mutat. Res. 382(3-4): 81-83 (1998); Johansson et ai., Blood 86(10): 3905-3914 (1995) e

Finger et ai., P.N.A.S. 85(23): 9158-9162 (1988)). Deste modo, os polinucleótido que codificam regiões especificas da proteína 158P1D7 constituem novas ferramentas que podem servir para delinear, com maior exactidão do que aquela que era anteriormente possível, anomalias citogenéticas na região cromossómica que codifica a 158P1D7 que pode contribuir, eventualmente, para o fenótipo maligno. Neste contexto, estes polinucleótidos satisfazem a necessidade existente na especialidade de se aumentar a sensibilidade de despistagem cromossómica, com a finalidade de se identificar anomalias cromossómicas mais subtis e menos 36 vulgares (ver, v.g., Evans et ai., Am. J. Obstet Gynecol 171 (4) : 1055-1057 (1994) ) .

Além disso, uma vez que se comprovou que a 158P1D7 é fortemente expressa em cancros da bexiga e noutros cancros, os polinucleótidos de 158P1D7 são utilizados em processos para avaliação do estado de produtos génicos de 158P1D7 em tecidos normais, comparativamente com tecidos cancerosos. De uma forma típica, os polinucleótidos que codificam regiões especificas da proteína 158P1D7 são utilizados para avaliar a presença de perturbações (tais como supressões, inserções, mutações pontuais ou alterações que resultem numa perda de um antigénio, etc.) em regiões específicas do gene de 158P1D7, tais como as regiões que contenham um ou vários motivos. Como exemplos de análises possíveis refere-se as análises por RT-PCR e também as análises do polimorfismo de conformação das cadeias singulares (SSCP) (ver, v.g., Marrogi et al., J. Cutan. Pathol. 26(8) : 369- 378 (1999), utilizando-se nestes dois casos polinucleótidos que codificam regiões específicas de uma proteína, para se examinar estas regiões com a proteína. IIA.4.) Isolamento das moléculas de ácidos nucleicos que codificam a 158P1D7

As sequências de ADNc de 158P1D7 aqui descritas permitem fazer o isolamento de outros polinucleótidos que codificam produtos génicos de 158P1D7 e permitem também fazer o isolamento de polinucleótidos que codificam homólogos de produtos génicos de 158P1D7, de isoformas unidas alternadamente, de variantes alélicas e de formas mutantes dos produtos génicos de 158P1D7 e também de 37 polinucleótidos que codifiquem análogos de proteínas aparentadas com a 158P1D7. Os diversos processos de clonagem molecular que é possível utilizar para isolar os ADNc de comprimento completo que codificam um gene de 158P1D7 são perfeitamente conhecidos na especialidade (ver, por exemplo, Sambrook, J. et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a edição, Cold Spring Harbor Press, New York, 1989; Current Protocols in Molecular Biology. Ausubel et al., Eds., Wiley and Sons, 1995). Por exemplo, as metodologias de clonagem do fago λ podem ser utilizadas convenientemente, utilizando sistemas de clonagem existentes nos circuitos comerciais (v.g., Lambda ZAP Express, Stratagene) . Os clones do fago que contenham os ADNc do gene de 158P1D7 podem ser identificados por sondagem hibridante com um ADNc de 158P1D7 marcado ou com um seu fragmento. Por exemplo, de acordo com uma variante, é possível sintetizar o ADNc de 158P1D7 (Figura 2), ou uma sua porção, e utilizá-lo como sonda de hibridação para recuperar os ADNc justapostos e de comprimento completo correspondentes a um gene 158P1D7. 0 próprio gene 158P1D7 pode ser isolado por rastreio de bibliotecas de ADN genómico, bibliotecas de cromossomas artificiais bacterianos (BAC), bibliotecas de cromossomas artificiais de leveduras (YAC) e não só, com iniciadores ou sondas hibridantes de ADN de 158P1D7. II. A. 5.) Moléculas de ácidos sistemas hospedeiro-vector nucleicos recombinantes e 38

As moléculas de ADN ou ARN recombinantes podem conter um polinucleótido de 158P1D7, um seu fragmento, análogo ou homólogo, incluindo, mas sem que isso constitua qualquer limitação, fagos, plasmídeos, fagomideos, cosmideos, YAC, BAC, e também diversos vectores virais e não virais perfeitamente conhecidos na especialidade, e ainda células transformadas ou transfectadas com tais moléculas de ADN ou ARN recombinantes. Os processos para gerar tais moléculas são perfeitamente conhecidos (ver, por exemplo, Sambrook et al, 1989, supra). Um sistema hospedeiro-vector poderia compreender uma molécula de ADN recombinante que contivesse um polinucleótido de 158P1D7, um seu fragmento, análogo ou homólogo no interior de uma célula hospedeira adequada, procariótica ou eucariótica. Como exemplos de células hospedeiras eucarióticas adequadas refere-se as seleccionadas entre células de leveduras, células vegetais ou células de animais, tais como as células de um mamífero ou as células de um insecto (v.g., uma célula que possa ser infectada por baculovírus, tal como uma célula Sf9 ou HighFive). Como exemplos de células de mamíferos convenientes refere-se diversas linhagens de células do cancro da bexiga, tais como SCaBER, UM-UC3, HT1376, RT4, T24, TCC-SUP, J82 e SW780, outras linhagens de células de cancro da bexiga transfectáveis ou transduzíveis, e também um conjunto diversificado de células de mamíferos vulgarmente utilizadas para a expressão de proteínas recombinantes (v.g., células COS, CHO, 293, 293T) . Mais particularmente, é possível utilizar um polinucleótido que compreenda a sequência de codificação de 158P1D7, ou um seu fragmento, análogo ou homólogo, para gerar proteínas 158P1D7, ou seus fragmentos, utilizando um conjunto 39 qualquer de sistemas hospedeiro-vector, vulgarmente utilizados e perfeitamente conhecidos na especialidade.

Existe um conjunto amplo de sistemas hospedeiro-vector convenientes para a expressão de proteínas 158P1D7 ou seus fragmentos; ver, por exemplo, Sambrook et ai., 1989, supra; Current Protocols in Molecular Biology, 1995, supra). Os vectores preferíveis para a expressão em mamíferos compreendem, mas sem qualquer limitação, pADNc 3.1 myc-His-tag (Invitrogen) e o vector retroviral pSRcxtkneo (Muller et al., 1991, MCB 11:1785). Utilizando estes vectores de expressão, é possível exprimir a 158P1D7 em diversas linhas de células de cancro da bexiga e em linhas de células que não são de cancro da bexiga, incluindo, por exemplo, SCaBER, UM-UC3, HT1376, RT4, T24, TCCSUP, J82 e SW780. Os sistemas hospedeiro-vector da presente invenção são úteis para a produção de uma proteína 158P1D7, ou de um seu fragmento. Tais sistemas hospedeiro-vector podem ser utilizados para estudar as propriedades funcionais de 158P1D7 e de mutações ou análogos de 158P1D7. A proteína 158P1D7 humana recombinante, ou um seu análogo ou homólogo ou fragmento, pode ser produzida por células de mamíferos transfectadas com uma construção que codifique um nucleótido conotado com 158P1D7. Por exemplo, as células 293T podem ser transfectadas com um plasmídeo de expressão que codifique a 158P1D7, ou um seu fragmento, análogo ou homólogo, sendo a 158P1D7, ou a proteína com ela conotada, expressa nas células 293T, após o que se faz o isolamento da proteína 158P1D7 recombinante, recorrendo a processos convencionais de purificação (v.g., purificação por afinidade, utilizando anticorpos anti-158PlD7). De acordo com uma outra forma de realização, a sequência que 40 codifica a 158P1D7 é subclonada no vector retroviral pSRaMSVtkneo e utilizada para infectar diversas linhas de células de mamíferos, tais como NIH 3T3, TsuPrl, 293 e rat-1 com a finalidade de se estabelecer linhas de células em que tenha lugar a expressão de 158P1D7. Também é possivel utilizar um conjunto de outros sistemas de expressão perfeitamente conhecidos. As construções de expressão que codificam um péptido líder, unido concatenadamente com a sequência codificadora de 158P1D7, podem ser utilizadas para gerar uma forma segregada de proteína 158P1D7 recombinante.

Conforme aqui se esclarece, a redundância do código genético permite variações nas sequências génicas de 158P1D7. Em particular, sabe-se na especialidade que espécies de hospedeiros específicos têm frequentemente preferências por codões específicos e por tal motivo é possível adaptar a sequência explicitada, de modo a ser preferível para um hospedeiro desejado. Por exemplo, as sequências de codões análogos preferenciais têm, tipicamente, codões raros (isto é, codões com uma frequência de utilização inferior a cerca de 20% nas sequências conhecidas do hospedeiro desejado) substituídos por codões de frequência superior. As preferências por codões para uma espécie específica são calculadas, por exemplo, recorrendo a tabelas de frequência de utilização de codões disponíveis na internet, por exemplo, URL www.dna.affrc.go.jp/~nakamura/codon.html. São conhecidas outras modificações de sequências para aumentar a expressão proteínica num hospedeiro celular. Tais modificações compreendem a eliminação de sequências que codifiquem sinais de poliadenilação espúrias, sinais do 41 local de junção exão/intrão, repetições semelhantes a transposões e/ou outras sequências bem caracterizadas que sejam prejudiciais para a expressão qénica. 0 conteúdo da sequência em GC é ajustado para níveis médios para um dado hospedeiro celular, conforme calculado, tomando como referência genes conhecidos expressos na célula hospedeira. Sempre que possível, a sequência é modificada para evitar estruturas previstas de ARNm secundário uniforme. Outras modificações úteis são a adição de uma sequência de consenso de início da tradução no início da grelha de leitura aberta, conforme descrito por Kozak, Mol. Cell Biol., 9:5073-5080 (1989). Os especialistas na matéria sabem que a regra geral de que os ribossomas eucarióticos iniciam a tradução exclusivamente no codão AUG mais próximo de 5' deixa de ser válida apenas em condições raras (ver, v.g. , Kozak PNAS 92 (7): 2662-2666, (1995) e Kozak NAR 15 (20) : 8125-8148 (1987)) .

Em geral, as variantes alélicas de 158P1D7 humanas, que ocorrem naturalmente, partilham um grau elevado de identidade e de homologia estruturais (v.g., 90% ou mais de homologia). Tipicamente, as variantes alélicas da proteína 158P1D7 contêm substituições conservadoras de aminoácidos nas sequências de 158P1D7 aqui descritas, ou contêm uma substituição de um aminoácido de uma posição correspondente num homólogo da 158P1D7. Uma classe de variantes alélicas de 158P1D7 é constituída pelas proteínas que partilham um grau elevado de homologia pelo menos com uma pequena região de uma sequência particular de aminoácidos de 158P1D7, mas que contêm também um desvio radical em relação à sequência, tal como uma substituição não conservadora, um truncamento, uma inserção ou um desvio da grelha. Em comparações entre 42 sequências de proteínas, os termos similaridade, identidade ou homologia possuem significações distintas, conforme é sabido no domínio da genética. Além disso, os conceitos de ortologia e paralogia podem ser importantes para se descrever a relação dos membros de uma dada família de proteínas, num organismo, com os membros da mesma família noutros organismos.

As abreviaturas dos aminoácidos estão indicadas no Quadro II. As substituições conservadoras de aminoácidos podem ser feitas, frequentemente, numa proteína, sem se alterar a sua conformação ou a função dessa proteína. As proteínas da invenção podem conter 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 ou mais substituições conservadoras. Tais modificações compreendem aquelas em que se substitui um qualquer dos aminoácidos isoleucina (I), valina (V) e leucina (L) por qualquer outro destes aminoácidos hidrofóbicos; ácido aspártico (D) para substituir ácido glutâmico (E) e vice-versa; glutamina (Q) em vez de asparagina (N) e vice-versa; e serina (S) em vez de treonina (T) e vice-versa. Há outras substituições que também podem ser consideradas conservadoras, dependendo isso do ambiente do aminoácido particular e do seu papel na estrutura tridimensional da proteína. Por exemplo, os aminoácidos glicina (G) e alanina (A) podem ser frequentemente trocados entre si, o mesmo sucedendo com os aminoácidos alanina (A) e valina (V) . A metionina (M) , que é relativamente hidrofóbica, pode ser frequentemente trocada por leucina e isoleucina e por vezes por valina. A lisina (K) e a arginina (R) são frequentemente trocadas entre si em locais em que a particularidade significativa do resíduo aminoácido é a sua carga eléctrica e em que os 43 diferentes valores pK destes dois resíduos aminoácidos não são significativos. Ainda é possível considerar outras modificações "conservadoras" em ambientes particulares (ver, v.g., o Quadro III aqui apresentado; páginas 13-15 "Biochemistry" 2a ED. Lubert Stryer ed (Stanford University); Henikoff et al., PNAS 1992 Vol 89 10915-10919; Lei et al., j Biol Chem 1995 May 19; 270(20):11882-6). E possível produzir variantes de 158P1D7 recorrendo a métodos conhecidos na especialidade, tais como a mutagénese dirigida ao local, a exploração com alanina e mutagénese por PCR. As técnicas de mutagénese dirigida ao local (Cárter et al. , Nucl. Acids Res., 13:4331 (1986); Zoller et al., Nucl. Acids Res., 10:6487 (1987)), de mutagénese da cassete (Wells et al., Gene, 34:315 (1985)), de mutagénese por selecção das restrições (Wells et al. , Philos. Trans. R. Soc. London SerA, 317:415 (1986)) ou outras técnicas conhecidas podem ser praticadas com o ADN clonado para se obter ADN da variante de 158P1D7.

Também é possível efectuar a análise por exploração de aminoácidos para identificar um ou vários aminoácidos ao longo de uma sequência contígua que esteja implicada numa actividade biológica específica, tal como uma interacção proteína-proteína. Entre os aminoácidos preferíveis para se efectuar a exploração refere-se os aminoácidos neutros relativamente pequenos. Como exemplos de tais aminoácidos refere-se alanina, glicina, serina e cisteína. A alanina é, tipicamente, um aminoácido de exploração preferencial pertencente a este grupo, uma vez que elimina a cadeia lateral que está para além do carbono β e é menos provável que altere a conformação da cadeia principal da variante. A alanina também é tipicamente preferível porque é o 44 aminoácido mais vulgar. Além disso, encontra-se frequentemente tanto em posições protegidas como em posições expostas (Creighton, The Proteins, (W.H. Freeman & Co., N.Y.); Chothia, J. Mol. Biol., 150:1 (1976)). Se a substituição de alanina não gerar quantidades adequadas de variante, é possível utilizar um aminoácido isostérico.

Conforme aqui se define, as variantes de 158P1D7 e seus análogos ou homólogos possuem o atributo distintivo de terem pelo menos um epítopo que é "interreactivo" com uma proteína 158P1D7 que possui a sequência de aminoácidos designada por SEQ ID NO: 657. Tal como utilizado neste parágrafo, o termo "interreactivo" significa que um anticorpo, ou uma célula T, que se ligue especificamente a uma variante de 158P1D7 também se liga especificamente à proteína 158P1D7 que possui a sequência de aminoácidos identificada por SEQ ID NO: 657. Um polipeptido deixa de ser uma variante da proteína representada pela SEQ ID NO: 657 quando deixa de conter qualquer epítopo capaz de ser reconhecido por um anticorpo, ou por uma célula T, que se ligue especificamente à proteína 158P1D7. Os especialistas na matéria sabem que os anticorpos que reconhecem proteínas se ligam a epítopos de diversos tamanhos, considerando-se um agrupamento que tenha cerca de 4 a 5 aminoácidos, contíguos ou não, como sendo um número típico de aminoácidos num epítopo mínimo. Ver, v.g., Nair et al., J. Immunol 2000 165(12): 6949-6955; Hebbes et al., Mol Immunol (1989) 26 (9) : 865-73; Schwartz et al., J Immunol (1985) 135 (4) :2598-608.

Uma outra classe de variantes de proteínas aparentadas com a 158P1D7 é aquela que partilha 70%, 75%, 80%, 85% ou 90% ou mais similaridade com a sequência de aminoácidos 45 identificada por SEQ ID NO: 657, ou com um seu fragmento. Uma outra classe especifica de variantes de proteína 158P1D7, ou seus análogos, compreende um ou mais dos motivos biológicos de 158P1D7 aqui descritos ou presentemente conhecidos na especialidade. Assim sendo, são aqui descritos análogos de fragmentos de 158P1D7 (ácidos nucleicos ou aminoácidos) em que haja propriedades funcionais alteradas (v.g., imunogénicas), comparativamente com o fragmento inicial. Faz-se observar que motivos nas circunstâncias actuais, ou que venham a fazer parte da técnica, se destinam a ser aplicados às sequências de ácidos nucleicos ou de aminoácidos ilustradas na figura 2 ou na figura 3. II.A.) Variantes de proteínas portadoras de motivos São conhecidos diversos motivos na especialidade e é possível avaliar uma proteína para se investigar a presença de tais motivos, recorrendo a um conjunto de sítios da internet publicamente acessíveis (ver, v.g., os endereços de URL: pfam.wustl.edu/; searchlauncher.bcm.tmc.edu/seq-search/struc-predict.html psort.ims.u-tokyo.ac.ip/; www.cbs.dtu.dk/; www.ebi.ac.uk/intorpro/scan.html; www.expasy.cb/tools/scnpsitl.html; Epimatrix™ and Epimer™, Brown University, www.brown.edu/Research/TB-HIV_Lab/ epimatrix/epimatrix.html; e BIMAS, bimas.dcrt.nih.gov/.).

As sequências portadoras de motivos da proteína 158P1D7 estão explicitadas e identificadas no Quadro XIX.

0 Quadro XX explicita diversos motivos que ocorrem frequentemente, com base em pesquisas de pfam (ver o endereço de URL pfam.wustl.edu/). As colunas do Quadro XX 46 enumeram (1) a abreviatura do nome do motivo, (2) o valor percentual da identidade encontrada entre os diferentes membros da família de motivos, (3) o nome ou a descrição do motivo e (4) a função mais vulgar; está incluída informação sobre localização, se o motivo for relevante para localização.

Os polipeptidos que compreendem um ou vários dos motivos de 158P1D7 abordados anteriormente são úteis para esclarecer as características específicas de um fenótipo maligno, tendo em conta a premissa que estabelece que os motivos de 158P1D7 abordados anteriormente estão associados com a desregulação do crescimento e porque a proteína 158P1D7 é expressa em excesso nos cancros da bexiga (Ver, v.g., Quadro 1). A cinase II da caseína, a cinase de cAMP e da proteína dependente de cAMP e também a cinase C das proteínas, por exemplo, são enzimas sobre as quais se sabe que estão associadas ao desenvolvimento do fenótipo maligno (ver, v.g., Chen et al., Lab Invest., 78(2): 165-174 (1998) ; Gaiddon et al., Endocrinology 136(10): 4331-4338 (1995); Hall et al., Nucleic Acids Research 24(6): 1119-1126 (1996); Peterziel et al., Oncogene 18 (46): 6322-6329 (1999) e 0'Brian, Oncol. Rep. 5 (2): 305-309 (1998)). Além do mais, tanto a glicosilação como a miristoílação são modificações proteínicas também associadas ao cancro e à progressão do cancro (ver, v.g., Dennis et al., Biochem. Biophys. Acta 1473(1):21-34 (1999); Raju et al., Exp. Cell Res. 235(1): 145-154 (1997)). A amidação é uma outra modificação proteínica também associada ao cancro e à progressão do cancro (ver, v.g., Treston et al., J. Natl. Câncer Inst. Monogr. (13): 169-175 (1992)). 47

De acordo com uma outra forma de realização, as proteínas aqui descritas compreendem um ou vários dos epítopos imunorreactivos identificados de acordo com processos conhecidos na especialidade, tais como os péptidos explicitados nos Quadros V-XVIII. Os epítopos de CTL podem ser determinados utilizando algoritmos específicos que servem para identificar péptidos numa proteína 158P1D7 que têm uma afinidade de ligação suficiente com os alelos de HLA especificados (ver, Quadro IV; Epimatrix™ and Epimer™, Brown University, URL www.brown.edu/Research/TBHIV Lab/epimatrix/epimatrix.html; e BIMAS, URL bimas.dcrt.nih.gov/.)· Além disso, os processos para identificar péptidos, que têm uma afinidade de ligação suficiente com os alelos de HLA especificados e que são epítopos imunogénicos, são perfeitamente conhecidos na especialidade e são levados à prática sem necessidade de experimentação excessiva. Além disso, processos para identificar péptidos, que são epítopos imunogénicos, são perfeitamente conhecidos na especialidade e são levados à prática sem necessidade de experimentação excessiva, tanto in vitro como in vivo.

Também são conhecidos no domínio da técnica os princípios para a criação de análogos de tais epítopos, com a finalidade de se modelar a imunogenicidade. Por exemplo, começa-se com um epítopo portador de um motivo CTL ou HTL (ver, v.g., os motivos/supermotivos de HLA de classe I e de HLA de classe II indicados no Quadro IV) . Confere-se ao epítopo a característica de análogo, substituindo um aminoácido numa das posições especificadas, sendo esse aminoácido substituído por um outro aminoácido especificado para essa posição. Por exemplo, é possível substituir um 48 resíduo deletério por qualquer outro resíduo, por exemplo, um resíduo preferencial entre os definidos no Quadro IV; é possível substituir um resíduo menos preferencial por um resíduo preferencial entre os definidos no Quadro IV; ou é possível substituir um resíduo preferencial, que ocorra oriqinariamente, por um outro resíduo preferencial entre os definidos no Quadro IV. As substituições podem ocorrer em posições de ancoragem ou fixação primárias ou noutras posições num péptido; ver, v.g., o Quadro IV. Há inúmeras obras da especialidade que descrevem a identificação e a qeração de epítopos numa proteína relevante, bem como seus análoqos. Ver, por exemplo, os documento WO 9733602 to Chesnut et al.; Sette, Immunogenetics 1999 50 (3-4): 201-212; Sette et al., J.

Immunol. 2001 166(2): 1389-1397; Sidney et al., Hum.

Immunol. 1997 58 (1): 12-20; Kondo et al., Immunogenetics 1997 45(4): 249-258; Sidney et al., J. Immunol. 1996 157 (8): 3480-90; e Falk et al., Nature 351: 290-6 (1991);

Hunt et al. , Science 255:1261-3 (1992); Parker et al., J.

Immunol. 149:3580-7 (1992); Parker et al. , J. Immunol. 152:163-75 (1994)); Kast et al., 1994 152(8): 3904-12;

Borras-Cuesta et al., Hum. Immunol. 2000 61(3): 266-278;

Alexander et al., J. Immunol. 2000 164(3); 164(3): 1625- 1633; Alexander et al., PMID: 7895164, UI: 95202582; 0'Sullivan et al., J. Immunol. 1991 147(8): 2663-2669;

Alexander et al., Immunity 1994 1(9): 751-761 e Alexander et al., Immunol. Res. 1998 18(2): 79-92.

Uma molécula de uma proteína 158P1D7 purificada irá apresentar-se substancialmente isenta de outras proteínas ou moléculas que dificultem a ligação da proteína 158P1D7 ao anticorpo, às células T ou a outro ligando. A natureza e 49 o grau de isolamento e purificação irão depender do fim pretendido.

Os polipeptidos aparentadas com a 158P1D7, que contenham estruturas particularmente relevantes, podem ser previstos e/ou identificados recorrendo a diversas técnicas analíticas perfeitamente conhecidas na especialidade, incluindo, por exemplo, os processos analíticos de Chou-Fasman, Garnier-Robson, Kyte-Doolittle, Eisenberg, Karplus-Schultz ou Jameson-Wolf, ou com base na imunogenicidade. Os fragmentos que contêm tais estruturas são particularmente úteis para gerar anticorpos anti-158PlD7 específicos de subunidades, ou células T ou para identificar factores celulares que se liguem à 158P1D7. É possível determinar epítopos de CTL, utilizando algoritmos específicos para identificar péptidos contidos numa proteína 158P1D7, que sejam capazes de se ligarem de forma óptima aos alelos de HLA especificados (v.g., utilizando o site SYFPEITHI em World Wide Web URL syfpeithi.bmi-heidelberg.com/; as listagens do Quadro IV(A)-(E); Epimatrix™ and Epimer™, Brown University, URL (www.brown.edu/Research/TB-HIV Lab/epimatrix/ epimatrix.html); e BIMAS, URL bimas.dcrt.nih.gov/). Para ilustrar isto, foram previstos os epítopos peptídicos de 158P1D7 que são apresentados no contexto das moléculas HLA-Al, A2, A3, All, A24, B7 e B35 humanas de classe I do MHC (Quadros V-XVIII). Dito de forma concreta, introduziu-se a sequência completa de aminoácidos da proteína 158P1D7 no algoritmo de pesquisa de motivos peptídicos de HLA que pode ser encontrado no website, indicado supra, 'Bioinformatics and Molecular Analysis Section' (BIMAS). 0 algoritmo de pesquisa de motivos peptídicos de HLA foi desenvolvido pelo 50

Dr. Ken Parker, com base na ligação de sequências peptídicas especificas no encaixe das moléculas de HLA de classe I, em particular HLA-A2 (ver, v.g., Falk et ai., Nature 351: 290-6 (1991); Hunt et al., Science 255:1261-3 (1992); Parker et al., J. Immunol. 149:3580-7 (1992); Parker et al., J. Immunol. 152 : 163-75 (1994)). Este algoritmo permite a localização e o ordenamento e péptidos 8-mero, 9-mero e 10-mero de uma sequência proteínica completa para a ligação prevista a HLA-2, bem como a muitas outras moléculas de HLA de classe I. Muitos dos péptidos de ligação às moléculas de HLA de classe I são 8-, 9-, 10 ou 11-meros. Por exemplo, no caso de HLA-A2 de classe I, os epitopos contêm preferencialmente um aminoácido leucina (L) ou metionina (M) na posição 2 e valina (V) ou leucina (L) no terminal C (ver, v.g., Parker et al., J. Immunol. 149:3580-7 (1992)). Os resultados seleccionados, de péptidos com ligação prevista a 158P1D7, estão indicados nos Quadros V-XVIII subsequentes. Nos Quadros V-XVIII, estão indicados os primeiros 50 candidatos elegíveis ordenados, 9-meros e 10-meros, para cada membro da família, conjuntamente com as suas localizações, a sequência de aminoácidos para cada péptido específico e uma classificação estimada de ligação. O valor de classificação da ligação corresponde ao valor estimado do semiperíodo de dissociação de complexos que contenham o péptido, a 37°C e a pH 6,5. Antevê-se que os péptidos com o mais elevado valor de classificação da ligação sejam os mais fortemente ligados às moléculas de HLA de classe I sobre a superfície celular durante o maior intervalo de tempo e consequentemente constituem os melhores alvos destinatários imunogénicos para o reconhecimento de células T. 51 A verdadeira ligação de péptidos a um alelo de HLA pode ser avaliada estabilizando a expressão de HLA na linhagem de células T2 com insuficiência no processamento de antigénios (ver, v.g., Xue et ai., Prostate 30:73-8 (1997) e Peshwa et ai., Prostate 36:129-38 (1998)). É possível avaliar a imunogenicidade de péptidos específicos in vitro, estimulando linfócitos T citotóxicos CD8+ (CTL) na presença de células que apresentem os antigénios, tais como as células dendríticas.

Faz-se observar que todos os epítopos previsto pelo site BIMAS, pelos sites Epimer™ e Epimatrix™ ou especificados pelos motivos de HLA de classe I ou classe II, conhecidos na especialidade ou que venham a ser conhecidos na especialidade, tal como explicitados no Quadro IV (ou determinados utilizando o site URL syfpeithi.bmi-heidelberg.com/ World Wide Web) se destinam a ser "aplicados" à proteína 158P1D7. No contexto da presente memória descritiva, o termo "aplicado" significa que a proteína 158P1D7 é avaliada, v.g., visualmente ou por processos informáticos de pesquisa de padrões, conforme é sabido pelos especialistas na matéria relevante. IIIB.) Expressão de proteínas aparentadas com a 158P1D7 A proteína 158P1D7 pode ser expressa, convenientemente, em células (tais como as células 293T) transfectadas com um vector de expressão existente nos circuitos comerciais, por exemplo, um vector de expressão comandado por CMV que codifique a 158P1D7, com um marcador de identificação 6XHis e MYC no terminal C (pADNc3.1/mycHIS, Invitrogen or TagS, GenHunter 52

Corporation, Nashville TN). 0 vector Tag5 gera um sinal de secreção de IgGK que pode ser utilizado para facilitar a produção de uma proteina 158P1D7 segregada em células transfectadas. A proteina 158P1D7 segregada e marcada com o identificador HIS, existente no meio de cultura, pode ser purificada, v.g., recorrendo a uma coluna de níquel e praticando técnicas convencionais. III.C.) Modificações de proteínas aparentadas com a 158P1D7

Um tipo de modificação covalente consiste em fazer reagir os resíduos aminoácidos relevantes de um polipeptido de 158P1D7 com um agente reaccional orgânico que seja capaz de reagir com cadeias laterais seleccionadas ou com os resíduos dos terminais N ou C de 158P1D7. Um outro tipo de modificação covalente do polipeptido de 158P1D7 consiste em alterar o padrão natural de glicosilação de uma proteína. Um outro tipo de modificação covalente de um polipeptido 158P1D7 consiste em ligar o polipeptido 158P1D7 a um dos diversos polímeros não proteináceos, v.g., polietileno-glicol (PEG), polipropileno-glicol ou polioxialquileno, tal como explicitado nas patentes de invenção norte-americanas n°s 4 640 835; 4 496 689; 4 301 144; 4 670 417; 4 791 192 ou 4 179 337.

As proteínas aparentadas com a 158P1D7 também podem ser modificadas para formarem uma molécula quimérica constituída pela 158P1D7 fundida com uma outra sequência de aminoácidos ou polipeptidos heterólogos. Uma molécula quimérica deste tipo pode ser sintetizada quimicamente ou por via recombinante. Uma molécula quimérica pode ter uma proteína fundida com um outro antigénio associado ao tumor 53 ou com um seu fragmento. Em alternativa, uma proteína pode compreender uma fusão de fragmentos da sequência de 158P1D7 (ácidos nucleicos ou aminoácidos) , por forma a que seja criada uma molécula que não é, devido ao seu comprimento, directamente homóloga das sequências de ácidos nucleicos ou de aminoácidos ilustradas na figura 2 ou na figura 3. Uma molécula quimérica deste tipo pode compreender múltiplos da mesma subsequência de 158P1D7. Uma molécula quimérica pode compreender uma fusão de uma proteína conotada com a 158P1D7, marcada com epítopo de poli-histidina, que proporciona um epítopo ao qual se pode ligar selectivamente níquel imobilizado, com citoquinas ou com factores de crescimento. 0 identificador epítopo é colocado, geralmente, nos terminais amino ou carboxilo da 158P1D7. A molécula quimérica pode compreender uma fusão de uma proteína conotada com a 158P1D7 com uma imunoglobulina ou com uma região particular de uma imunoglobulina. Para se obter uma forma bivalente da molécula quimérica (também designada por "imunoadesina"), uma fusão deste tipo pode ser feita na região Fc de uma molécula de IgG. As fusões de Ig compreendem, preferencialmente, a substituição de uma forma solúvel (domínio transmembranar suprimido ou inactivado) de um polipeptido de 158P1D7 no lugar em que havia pelo menos uma região variável numa molécula de Ig. A imunoglobulina de fusão compreende as regiões CH2 e CH3 da charneira ou as regiões CHI, CH2 e CH3 da charneira de uma molécula de IgGI. Para a produção de fusões de imunoglobulinas ver, v.g., a patente de invenção norte-americana n° 5 428 130, concedida em 27 de Junho de 1995. III.D.) Utilizações de proteínas aparentadas com a 158P1D7 54

Uma vez que a proteína 158P1D7 é fortemente expressa em cancros da bexiga, então as proteínas aparentadas com as 158P1D7 são utilizadas em processos que permitem avaliar o estado dos produtos génicos de 158P1D7 em tecidos normais, comparativamente com tecidos cancerosos, permitindo assim esclarecer qual é o fenótipo maligno. De uma forma típica, os polipeptidos de regiões específicas da proteína 158P1D7 são utilizados para avaliar a presença de perturbações (tais como supressões, inserções, mutações pontuais, etc.) em tais regiões (por exemplo, regiões que contenham um ou vários motivos). Em análises exemplificativas são utilizados anticorpos, ou células T, endereçados para proteínas aparentadas com a 158P1D7, que compreendem os resíduos aminoácidos de um ou vários dos motivos biológicos contidos na sequência polipeptídica de 158P1D7, com a finalidade de se avaliar as características desta região em tecidos normais, comparativamente com tecidos cancerosos, ou para desencadear uma resposta imunitária ao epítopo. Em alternativa, as proteínas aparentadas com a 158P1D7, que contenham os resíduos aminoácidos de um ou mais dos motivos biológicos da proteína 158P1D7, servem para pesquisar factores que interactuem com essa região da 158P1D7.

Os fragmentos/subsequências da proteína 158P1D7 são particularmente úteis para gerar e caracterizar anticorpos específicos de domínios (v.g., anticorpos que reconheçam um epítopo extracelular ou intracelular de uma proteína 158P1D7), para identificar agentes ou factores celulares que se liguem à 158P1D7 ou a um seu domínio estrutural particular, e em diversos contextos terapêuticos e de diagnóstico, incluindo, sem qualquer limitação, análises de 55 diagnóstico, vacinas contra o cancro e processos para a preparação de tais vacinas.

As proteinas codificadas pelos genes de 158P1D7, ou pelos seus análogos, homólogos ou fragmentos, têm diversas utilizações, incluindo, mas sem qualquer limitação, a geração de anticorpos e em processo para identificar ligandos e outros agentes e constituintes celulares que se liguem a um produto génico de 158P1D7. Os anticorpos desenvolvidos contra uma proteína 158P1D7, ou contra um seu fragmento, são úteis em análises de diagnóstico e de prognóstico e em metodologias de imagiologia no combate a cancros humanos caracterizados pela expressão da proteína 158P1D7, referindo-se como exemplos os enumerados no Quadro I. Tais anticorpos podem ser expressos intracelularmente e podem ser utilizados em processo de tratamento de pacientes que padeçam de tais cancros. Os ácidos nucleicos ou as proteínas aparentadas com a 158P1D7, também podem ser úteis para gerar respostas de HTL ou CTL. São praticáveis diversas análises imunológicas úteis para a detecção de proteínas 158P1D7, incluindo, mas sem qualquer limitação, diversos tipos de análises radioimunológicas, análises imunossorventes ligadas a enzimas (ELISA), análises imunofluorescentes ligadas a enzimas (ELIFA), processos imunocitoquímicos e não só. Os anticorpos podem ser marcados e utilizados como reagentes imunológicos em imagiologia, sendo capazes de detectar células em que tenha lugar a expressão de 158P1D7 (v.g., em processos radiocintilográficos em imagiologia). As proteínas 158P1D7 também são particularmente úteis para a preparação de vacinas contra o cancro, conforme melhor se descreve adiante. 56 IV.) Anticorpos de 158P1D7

Os anticorpos preferidos ligam-se especificamente a uma proteína conotada com 158P1D7 e nao se ligam (ou ligam-se de um modo fraco) a péptidos ou proteínas que nao sao proteínas aparentadas com 158P1D7. Por exemplo, os anticorpos que se ligam a 158P 1D7 podem ligar-se a proteínas aparentadas com 158P1D7, tais como seus homólogos ou análogos.

Os anticorpos de 158P1D7 são particularmente úteis em. ensaios de diagnóstico e de prognóstico de cancro da bexiga e em metodologias de imagiologia.

Além do mais, os anticorpos expressos intracelularmente (v.g,, anticorpos de cadeia individual) são terapeuticamente úteis para o tratamento de cancros em que está envolvida a expressão de 158P1D7, tSLis como cancros da bexiga avançado ou rnetastático.

Diversos ensaios imunológicos são úteis para a detecção e quantificação de 158P1D7 e de proteínas mutantes compreender um e de ligar uma adequado. Tais aparentadas com 158P1D7. Tais ensaios poder ou vários anticorpos capazes de reconhecer proteína conotada, com 158P1D7, consoante ensaios são efectuados em vários formatos de ensaios imunológicos, bem conhecidos na especialidade, incluindo, mas sem que isso constitua qualquer limitação, diversos tipos de radio-imunoensaios, ensaios imunossorvent.es ligados a. enzimas (ELISA), ensaios imunof luorescentes ligados a enzimas (ELIFA), e semelhantes.

Os ensaios imunológicos sem anticorpo também compreendem ensaios de imunogenicidade de células T (inibitórios ou estimulatórios) , bem como ensaios de 57 ligação (MHC). ao complexo principal de histocompatibilidade

Além mais, uamoém são proporcionados métodos xmu ν*Ί l f~\ i i ! ι l « ! ógicos de imagiologia capazes de detectar cancros da bexiga que expressara 158P1D7, incluindo métodos radiocintigráficos de imagiologia utilizando anticorpos de 158P1D7 marcados. Tais ensaios são úteis, sob o ponto de vista clinico, na. detecçao monitorização e prognóstico de cancros que expressam 158P1D7, tais como o cancro da bexiga. a purificação de uma compreende a incubação de proteína conotada com um anticorpo de 158P1D7,

Os anticorpos de 158P1D7 também são utilizados em métodos para a purificação de uma proteína conotada com 158P1D7 e para o isolamento de homólogos de 158P1D7 e molécula s aparentadas com esta. Por exemplo, um método para

158P1D7 O Cfu. cL X foi acoplado a uma matriz sólida, com um lisado ou outra solução que contém uma proteína conotada com 158P1D7, sob condições que permit à proteína conotada eliminar impurezas am que o anticorpo de 158P1D7 se ligue com 158P1D7; lavando a matriz para e eiuindo a proteína conotada com 158P1D7 a partir do anticorpo acoplado. Há diversos métodos para a preparação de anticorpos que são bem conhecidos na especialidade. Por exemplo, os anticorpos podem ser preparados por imunização de um hospedeiro mamífero adequado utilizando uma proteína, um péptido ou um fragmento aparentadas com 158P1D7, numa forma isolada ou imunoconjugada (Antibodies: A Laboratory Manual, CSH Press, Eds., í-larlow, and Lane (1988); Harlow, Antibodies, Cold Spring Harbor Press, NY (1989)). Além disso, também é possível utilizar proteínas de fusão de 58 158P1D7, tais como uma proteína de fusão GST com 158P1D7. é produzida uma proteína de fusão GST que compreende a totalidade ou a maior parte da sequência de aminoácidos da figura 2 ou da figura 3, a qual é depois utilizada como imunogénio para gerar os anticorpos adequados. De acordo com outra variante, a proteína conotada com 158P1D7 é sintetizada e utilizado como imunogénio.

Além do mais, são utilizadas técnicas de imunização de ADN desguarnecido (na presença ou na ausência de uma proteína, conotada com 158P1D7 purificada ou de células que expressam 158P1D7) para gerar uma resposta imune ao imunogénio codificado (parei uma descrição, ver Donnelly et ai., 199 7, Ann. Rev. Imnvunol. 15: 617-648) , A sequência de aminoácidos de 158P1D7, conforme ilustrada na figura 2 ou na figura 3, pode ser analisada para seleccionar regiões específicas da proteína 158P1D7 para gerar anticorpos. Por exemplo, são utilizadas análises de hidrofobicidade e hidrofilicidade da sequência de aminoácidos de 158P1D7 oara identificar regiões hidrofílicas ;rutura de 158P1DV (ver, v.g., o exemplo intitulado "Perfis de antigenicidade"). As regiões da proteína 158P1D7 que mostram uma estrutura imunogénica, bem como outras regiões e domínios, podem ser facilmente identificadas utilizando diversos outros métodos conhecidos na especialidade, tais como as análises de Chou-Fasman, Hopp e Woods, Kyte-Doolittle, Janin, Bhaskaran e Ponnuswamy, Deleage e Roux, Garnier-Robson, Eisenberg, Karplus-Schultz ou Jameson-Wolf. de um.

Os métodos para a geração de anticorpos de 158P1D7 são ainda ilustrados por meio dos exemplos aqui apresentados. Os métodos para a preparação de uma proteína ou 59 polipeptido para utilização como imunogénio são bem conhecidos na. especialidade. Também são bem conhecidos na especialidade métodos para a preparação de conjugados imunogénicos de uma proteína com um veículo, tal como BSA, KLH ou outro veículo proteico. Em alguns casos, utiliza-se a conjugação directa, usando, por exemplo, reagentes de carbodiimida; em outr! os casos, são eficazes reagentes de ligação, tais como os comercializados pela Pierce Chemical Co ., Rockford , IL. A administraçao de um imunogénio de 158P1D7 é frequentemente efectuada por injecção ao longo de um período de tempo adequado e com a utilização de um adjuvante adequado, tal como é conhecido na especialidade. Durante o calendário de imunização, é possível medir títulos de anticorpos para determinar a adequabilidade da formação de anticorpo.

Os anticorpos monoclonais de 158P1D7 podem ser produzidos de diversos modos bem conhecidos na especialidade. Por exemplo, são preparadas linhagens de células imortalizadas que segregam um anticorpo monoclonal desejcido utilizando a tecnologia padrão de hibridoma de Kohler e Milstein ou modificações que imortalizam células B produtoras de anticorpo, tal como é comummente conhecido. As linhagens de células imortalizadas que segregam os anticorpos desejados são pesquisadas por irnunoensaio, no qual o antigénio é uma proteína conotada com 158P1D7. Quando se identifica a cultura de células imortalizadas desejada, as células podem ser expandidas e os anticorpos produzidos a partir de culturas in vitro ou a partir de fluido de ascites.

As regiões que se ligam especificamente às regiões desejadas da proteína. 158P1D7 também podem ser produzidas 60 no contexto de anticorpos enxertados quiméricos ou da região determinante de complementaridade (CDR) de origem em. múltiplas espécies.

Os anticorpos de 158P1D7 humanos ou humanizados também podem ser produzidos e são preferidos para utilização em contextos terapêuticos. Os métodos para a humanização de anticorpos de murino ou outros não humanos, por meio da substituição de uma ou várias CDR de anticorpos não humanos por sequência de anticorpo humanas correspondentes, são bem conhecidos (ver, por exemplo, Jones et al., 1986, Nature 321: 522-525; Riechmann et al., 1988, Nature 332: 323-327; Verhoeyen et al., 1988, Science 239: 1534-1536). Ver também Cárter et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89: 4285 e Sims et al., 1993, J. Immunol. 151: 2296.

Os métodos para a produção de anticorpos monoclonais totalmente humanos compreendem a apresentação de faigos e métodos transgénicos (para uma descrição, ver Vaughan et al., 1998, Nature Biotechnology 16: 535-539). Os anticorpos monoclonais de 158P1D7 totalmente humanos podem ser gerados utilizando tecnologias de clonagem que empregam grandes bancos de dados combinatórios de genes de Ig humanos (isto é, apresentação de fagos) (Griffiths e Hoogenboom, Building an in vitro immune system: human antibodies from phage display libraries. In: Protein Engineering of Antibody

Molecules for Prophylact Man, Clark, M. (Ed.), (1993); Burton e Barbas, ic and Therapeutic Applications in Nottingham Academic, págs. 45-64 Human Antibodies from. com.binato.rial libraries. Id., págs. 65-82). Os anticorpos monoclonais de 158P1D7 totalmente humanos também podem ser produzidos utilizando murganhos transgénicos manipulados de modo a conter locais de genes de imunoglobulina humanos, tal como 61 descrito no pedido de patente de invenção PCT n° WO 98/24893, de Kucherlapati e Jakobovits et ai., publicado a 3 de Dezembro de 1997 (ver também, Jakobovits, 1998, Εχρ. Ορίη. Invest. Drugs 7(4) : 607-614; patentes de invenção norte-americanas nos 6 162 963, publicada a 19 ae Dezembro de 2000; 6 150 584, publicada a 12 de Novembro de 2000 e 6 114 59 8, publicada a 5 de Setembro de 2000) . Este método evita a manipulação in vitro necessária com a tecnologia de apresentação de fagos e produz eficazmente anticorpos humanos autênticos com elevada afinidade. A reactividade dos anticorpos de 158P1D7 com uma proteína conotada com 158P1D7 pode ser estabelecida por meio de diversos modos bem conhecidos, incluindo as análises por Western blot, imunoprecipitação, ELISA e FACS, utilizando, consoante adequado, proteínas aparentadas com 158P1D7, células que expressam 158P1D7 ou seus extractos.

Um anticorpo de 158P1D7, ou um seu fragmento, pode ser marcado com um marcador detectável ou conjugado com uma segunda molécula. Como marcadores detectáveis adequados refere-se, mas sem que isso constitua qualquer limitação, um radioisótopo, um composto fluorescente, um composto bioluminescente, um composto quimioluminescente, um quelador metálico ou uma enzima. Além disso, são gerados anticorpos bi-específicos, que são específicos para dois ou mais epítopos de 158P1D7, utilizando métodos geralmente conhecidos na especialidade. Os anticorpos homodiméricos também podem ser gerados por técnicas de inter-ligação conhecidas na especialidade (v.g., Wolff et al., Câncer Res. 53: 2560-2565). V.) Respostas imunes celulares a 158P1D7 62 0 mecanismo peio qual as células T reconhecem os antigernos foi descrito. As composições de vacina de epítopo de péptido eficazes da invenção induzem respostas imunes teraoeutxcas ou profilácticas em segmentos bastante amplos da população mundial. Para melhor compreensão do valor e da eficácia das composições da invenção que induzem respostas imunes, é apresentada uma breve descrição da tecnologia associada à imunologia.

Um complexo de uma molécula de HLA e um antigénio peptídico acT:.ua como o ligando reconhecido por células T Í86; restritas a HLA (Buus, et al., Cell 47; 1071,

Baooitt, B. P. et al., Nature 317: 359, 1985; Townsend, A. e Bodmer, H., Annu. Rev. Immunol, 7: 601, 1989; Germain, R. N., Annu. Rev. Immunol. 11: 403, 1993). Através do estudo de análogos de antigénio substituídos num aminoácido individual e da sequenciação d£L ligação péptidos naturalmente processados ligados endogenamente, os resíduos críticos que correspondem aos motivos necessários para a ligação específica a moléculas de antigénio HLA foram identificados e são apresentados no quadro IV (ver também, e.g., Southwood, et ai., J. Immunol 160: 3363, 1998; Rammensee, et

Immunogenetics 4: 178, 1995;

Rammensee et al., SYFPEITHI, consultado através da World Wide Web na URL svfpeithi.bmi-heidelberg.com/;

Sidney, J. Ct jrr. Opin. Immunol. 10: 478, 1998; Engelhard, V. H., Curr. Opin. Immunol. 6: 13,1994; Sette, A. e Grey, Η. M., Curr. Opin. Immunol. 4: 79, 1992; Siniga glia, F. e Hammer, J. Curr. Biol. 6: 52, 1994; Ruppert et 3.1 * f Cell 74: 929-937, 1993; Kondo et al ., J. Immunol. 155: 43 0 7- 4312, 1995; Sidney et al., j. Immunol. 157: 3480-3490, 1996; Sidney et al., Human Immunol. 45: 79-93, í996; Sette, 63 A. e Sidney, J. ±mmunogenetics, Nov de 1999; 50(3-4): 201-12, descrição) .

Além do mais, as análises cristalográficas por raio-X de complexos de HLA-péptido revelaram bolsas dentro do pépti d. o que ligam fissuras/ranhuras de moléculas de HLA que acomodam., de um modo específico do alelo, resíduos criados por ligandos de péptido; estes resíduos por sua vez determinam a capacidade de ligação a HLA dos péptidos nos quais estão presentes. (Ver, e.g., Madden, D.R. Annu. Rev. Immunol. 13: 587, 1995; Smith, et al., Immunity 4: 203, 1996; Fremont et al., Immunity 8: 305, 1998; Stern et al., Structure 2: 245, 1994; Jones, E.Y. Curr. Opin, Immunol. 9: 75, 1997; Brown, J. H. et al., Nature 364: 33, 1993; Guo, H. C. et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90: 8053, 1993; Guo, H. C. et al., Nature 3 60: 364, 1992; Silver, M. L. et al., Nature 360: 367, 1992; Matsumura, M . et al., Scieno 257: 927, 1992; Madden et 31 * f C Θ1 -1 70: 1035, 1992 Fremont, D. H. et al., Science 257: 9: 19 , 1992; Saper, M A., Bjorkman, P. J. and Wil ey, D. C., .J . Mol. Biol. 219 277, 1991) .

Assim sendo, a definição de motivos de ligação a HLA específicos de alelos de classe I e de classe II, ou supermotivos de classe I ou classe II, permite a identificação de regiões numa proteína que estão correlacionadas com a ligação a antigénio(s) de HLA particular(es),

Assim, através de um processo de identificação do motivo de HLA, foram identificados candidatos para vacinas com base em epítopos; tais candidatos podem ainda ser avaliados por ensaios e ligação HLA-péptido para se determinar a afinidade de ligação e/ou. o período de tempo 6 4 de associaçao do epítopo e da sua molécula de HLA correspondente. É possível efestuar um processo de confirmação suplementar para seleccionar, entre estes candidatos a vacinas, epítopos com características preferidas em termos de cobertura de população e/ou de imunogeni.cidade. É possível utilizar diversas estratégias para avaliar a imunoaenicidade, incluindo: 1) Avaliação de culturas de células T primárias a partir de indivíduos normais (ver, e.g., Wentworth, P. A. et al., Mol. Immunol. 32: 603, 1995; Celis, E. et al,,

Proc. Natl. Acad. Sei. USA 91: 2105, 1994 • I b cí. 1 f V. et al., J. Immunol. 158: 1796, 1997; Kawashima, T ... 4~ J- ♦ tf L. al., Human

Immunol. 59 : 1, 1998). Este procedimento envo1ve a estimulação de linfócitos de sangue periféri co (PBL) a provenientes de sujeitos normais co: m um péptido de teste na presença do antigénio apre sentador de células in vitro ao longo de um período de várias semanas. As e r u 1 a. s T específicas para o péptido são activadas durante este tempo e são detectadas utilizando, e.g., um ensaio de libertação de linfocina ou 51Cr que envolve células alvos sensibilizadas para o péptido. 2) Imunização de murganhos transgénicos de HLA (ver, e.g., Wentworth, P. A. et al., J. Immunol. 26: 97, 1996;

Wentworth, P. A. et al., Int. Immunol . 8: 651, 19 96; Alexander, J. et al./ J. Immunol . 159: 4 753, 199 7) . Por exemplo, em tai s métodos, os pépt ide 3 s em ad j uvante incompleto de Freund são administrados por via subcutânea a

murganhos transgénicos de HLA

Decorridas várias semc após a imunização, os esplenóci desenvolvidos em cultura in vitro na .os são removidos presença, do péptido e de 65 testa, durante aproximadamente uma semana. As células T específicas para o péptido são detectas utilizando, v. g., um ensaio de libertação de olCr que envolve cérulas alvo sensibilizadas para o péptido e células alvo que expressam o antigénio gerado endogenamente. 3) Demonstração de respostas de memória de células T a partir de indivíduos imunes que foram vacinados eficazmente e/ou a partir de pacientes cronicamente doentes (ver, e.g., Re hermann, B. et al., J. Exp. Med. 1E 51: 1047, 1995; Doolai 1 ! D. L. et al ., Immunity 7: 9 7', 19 9 7; Bertoni, R. et

Clin. Invest. 100: 503, 1997; Threlkeld,

C et ai., J. Immunol. 159: 1648, 1997; Diepolder, Η. M. et ai., J. Virol. 71: 6011, 1997). Assim sendo, as respostas de memória são detectadas por cultura, de PBL provenientes de sujeitos que foram expostos ao antigénio devido à doença, tendo assim gerado uma resposta imune "naturalmente" ou a partir de pacientes que foram vacinados contra o antigénio. Os PBL provenientes de sujeitos são desenvolvidos em. cultura in vitro durante 1 a 2 semanas na presença do péptido de teste mais as células apresentadoras de antigénio (APC), para permitir a activação de células T de "memória", em comparação com células T "naturais". No final do período de cultura, a actividade de células T é detectada utilizando ensaios que compreendem a libertação de 51 Cr envolvendo alvos sensibilizados para o péptido, a proliferação de células T ou a libertação de linfocina, VI,) Animais transgénicos de 158P1D7

Os ácidos nucleicos que codificam uma proteína conotadsL com 158P1D7 também podem ser utilizcidos para gerar animais transgénicos ou animais "inactivados" (“knockout"), os quais, por sua vez, são úteis no desenvolvimento e 66 pesquisa de reagentes terapeuticamente úteis. De acordo com técnicas estabelecidas, o ADNc que codifica 158P1D7 pode ser utilizado para clonar ADN genómico que codifica 158P1D7. As sequências genómicas clonadas podem então ser utilizadas para gerar animais transgénicos que contêm células que expressam ADN que codifica 152P1D7. Os métodos para se gerar animais transgénicos, em particular animais tais como murganhos ou ratos, são agora convencionais e

encontram -se descritos, po r exemplo, nas patentes de invenção norte-americanas nos * 4 736 866, publicada a 12 de Abri1 de 1988 e 4 870 009, publicada a 26 de Setembro de 1989. Tipicamente, células particulares seriam dirigi 0.3. S para a incorporação transgénica de 158P1D7 com potenciadores específicos de tecidos.

Os animais transgénicos que incluem uma cópia de um transgen e que codific a 158P1D7 podem ser util .izados para avaliar o efeito do aumento de expressão de ADN que codifica 1 58P1D7. Tai s animais podem ser uti] .izados como animais de teste para reagentes sobre os quais se crê que confiram protecção, por exemplo, contra condições patológicas associadas à sua sobreexpressão. Um animal é tratado com um. reagente e uma incidência reduzida de uma condição patológica, em comparação com animais não tratados oue carregam o transgene, iria inoicar uma. intervenção terapêutica potencial para a condição patológica.

Em alternativa, é possível utilizar homólogos não humanos de 158P1D7 para construir um animal "inactivado" de 158P1D7 que possui um gene defeituoso ou alterado que

Ltre o ;odifica 108P1D7 como resultado de recombinação gene endógeno que codifica 158P1D7 e o ADN genómico alterado que codifica 158P1D7 introduzido numa célula 67 embriónica do animal. Por exemplo, o ADNc que codifica 158P1D7 pode ser utilizado para clonar ADN genómico que codifica 158P1D7, de acordo com técnicas. Uma porção do ADN genómico que codifica 158P1D7 pode ser suprimida ou substituída com outro gene, tal como um gene que codifica um marcador seleccionável que pode ser utilizado para monitorizar a integração. Tipicamente, são incluídas várias quilobases de A DN de flanqueamento não alterado (nas extremidades 5' e 3 ') no vector (ver, e .g., Thornas e Capecchi, Cell 51 : 503 (1987) para uma descrição de vectores recombir íantes homólogos). 0 vector é introduzido numa linhagem de células estaminais embriónicas {v.g., por electroporação) e são seleccionadas as células em que o ADN introduzido é recombinado hornologamente com o ADN endógeno (ver, v.g., Li et al., Cell, 69: 915 (1992)). As células seleccionadas são então injectadas num blastócisto de um animal {v.g., um murganho ou rato) para formar quimeras de agregação (ver, v.g., Bradley, em Teratocarcinomas and

Embryonic Robertson, possível i acolhiment

Stem Cells: A Practical Approach, E. ed. (IRL, Oxford, 1987), págs. 113-152). de ao mplantar então um embrião quimérico num animal o fêmea pseudográvido e levar a termo o embr para miar um animal 'inactivado' d^scenctenc que carrega o ADN recombinado hornologamente nas suas células germinais pode ser identificada por técnicas convencionais e utilizada para criar animais em que todas as células do animal contêm o ADN recombinado hornologamente. Os animais inactivados podem ser caracterizados, por exemplo, pela sua aptidão de defesa contra determinadas condições patológicas ou pelo seu desenvolvimento de condições patológicas devido à ausência do polipeptido de 158P1D7. 68 VII.) Métodos para a detecção de 158P1D7 0 perfil de expressão de 158P1D7 faz com que este seja um marcador de diagnóstico para a doença metastisada. Assim sendo, o estado de produtos do gene de 158P1D7 proporciona informações úteis para prever diversos factores, incluindo a susceptibilidade para doenças em estado avançado, taxa de progressão e/ou agressividade do tumor. Tal como aqui descrito mais minuciosamente, o estado dos produtos do gene de 158P1D7 em amostras de pacientes podem ser analisador por diversos protocolos, que são bem conhecidos na especialidade, incluindo análise imuno-histoquímica, as várias técnicas de Northern blotting, incluindo hibridação in situ, análise de RT-PCR (por exemplo, em amostras micro-cortadas por captura com laser), análise de Western blot e análise de conjuntos de tecidos.

Mais particularmente, são aqui descritos ensaios para a detecção de polinucleótidos de 158P1D7 numa amostra biológica, tal como urina, soro, osso, fluido prostático, tecidos, sémen, preparações celulares e semelhantes. Como polinucleótidos de 158P1D7 detectáveis refere-se, por exemplo, um gene de 158P1D7 ou um seu fragmento, ARNm de 158P1D7, ARNm de 158P1D7 de variante cortada alternativos e moléculas de ADN ou ARN recombinantes que contêm um polinucleótido de 158P1D7.

Um método para a detecção de um ARNm de 15 8P1 d 7 numa amostra biológica pode compreender a produção de ADNc a partir da amostra por transcrição inversa utilizando pelo menos um iniciador; amplificação do ADNc assim produzido utilizando polinucleótidos de 158P1D7 como iniciadores de sentido e anti-sense para amplificar os ADN s de 158P1D7 69 69 do ADNc de 158P1D7 possível determinar a cado. cDNAs e detecção cia presença amplificado. Facultativamente, é sequência do ADNc de 158P1D7 ampli

Um método para a detecção de um gene de 158P1D7 numa amostra biológica pode compreender isolar, em primeiro lugar, ADN genómico a partir da amostra; amplificar o ADN genómico isolado utilizando polinucleótidos de 158P1D7 como iniciadores de sentido e anti-sense e detectar a presença do gene de 158P1D7 amplificado. É possível conceber um número qualquer de combinações de sondas sentido e anti-sense a partir da sequência de nucleótidos proveniente de 158P1D7 (figura 2) e utilizar para este propósito.

Os métodos para detectar uma proteína conotada com 158P1D7 também são bem conhecidos na especialidade e compreendem, por exemplo, imunoprecipitação, análise imuno-histoquímica, análise de Western blot, ensaios de ligação molecular, ELISA, ELIFA e semelhantes. Por exemplo, um método para detectar a presença de uma proteína conotada com 158P1D7 numa amostra biológica compreende, em primeiro lugar, contactar a amostra com um anticorpo de 158P1D7, um seu fragmento reactivo a 158P1D7 ou uma proteína recombinante que contém uma região de ligação ao antigénio de um anticorpo de 158P1D7 e depois detectar a ligação da proteína conotada com 158P1D7 na amostra. /—1 ensaio p >ara identificar uma célula que expressa um gene de 158P1D7 pode compreender a detecção da presença de ARNm de 158P1D7 na célula. Os métodos para a detecção de ARNm particulares em células são bem conhecidos e compreendem, por exemplo, ensaios de hibridação utilizando sondas de ut i, 1 i z ando ADN complementares (tais como hibridação in situ ribossondas de 158P1D7 marcadas, Northern blot e 70 :ecnxcas associadas) e vários ensaios de amplificação de ácido nucleico (tais como RT-PCR utilizando iniciadores complementares específicos para 158P1D7, e outros métodos de detecção do tipo amplificação, tais como, por exemplo, ADN ramificado, SISBA, TMA e semelhantes) . Em alternativa, um ensaio para a identificação de uma célula que expressa um gene de 158P1D7 compreende a detecção da presença de uma preterna conotada, com 158PrD7 na célula ou segregada pela célula. Há diversos métodos para a detecção de proteínas que são bem conhecidos na especialidade, os quais são utilizados para a detecção de proteínas aparentadas com 158P1D7 e de células que expressam proteínas aparentadas com 158P1D7. A análise da expressão de 158P1D7 também é útil enquanto ferramenta para a identificação e avaliação de agentes que modulam a expressão do gene de 158P1D7. Por exemplo, a expressão de 158P1D7 é significativamente regulada por externalização no cancro da bexiga e é expressa nos cancros de tecidos apresentados no quadro I. A ident-LfzcLçao de uma molécula oq de um agente bzológico que iniba a expressão ou sobreexpressão de 158P1D7 em células cancerígenas possui uma importância terapêutica. Por exempro, um uai agente pocie ser identificado por meio da utilização de uma pesquisa que quantifique a expressão de 158P1D7 por RT-PCR, hibridação de ácido nucleico ou ligação a anticorpo. VIII.) Métodos para a monitorização do estado de genes conotados a 158P1D7 e geus produtos baoe-se que a oncogénese é um processo com múltiplos passos em. que o crescimento celular é prooressivamente 71 clesregulacio e as células progridem de um estado fisiologicamente normal para estados pré-cancerígenos e depois cancerígenos (ver, v.g., Alers et ai., Lab Invest. 77(5): 437-438 (1997) e Isaacs et ai., Câncer Surv. 23: 19-32 (1995)). Neste contexto, o exame de uma amostra biológica quanto e evidências de crescimento celular desregulado (tal como a expressão aberrante de 158P1D7 em cancros) permite uma detecção precoce de tal fisiologia aberrante, antes de um estado patológico, tal como cancro, ter progredido para um estado em que as opções terapêuticas são mais limitadas e/ou o prognóstico é pior. Em tais exames, o estado de 158P1D7 numa amostra biológica relevante pode ser comparado, por exemplo, com o estado de 158P1D7 numa amostra normal correspondente (v.g., uma amostra desse indivíduo ou, em alternativa, de um outro indivíduo que não está afectado pela patologia). Uma alteração no estado de 158P1D7 na amostra biológica (em comparação com a amostra normal) proporciona evidências de crescimento celular desregulado. Para além da utilização de uma amostra biológica que não é afectada por uma patoloqia, tal como uma amostra normal, também é possível utilizar um valor normativo predeterminado, tal como um nível normal predeterminado de expressão de ARNm (ver, v.g., Grever et ai., J. Comp. Neurol. 9 de Dez. de 1996; 376(2): 306-14 e patente de invenção norte-americana n° 5 337 5 q 1) para comparar o estado de 158P1D7 numa amostra.

Neste contexto, o termo "estado" é utilizado de acordo com o seu significado na especialidade e designa a condição ou estado de um gene e dos seus produtos. Tipicamente, os especialistas na matéria utilizam diversos parâmetros para avaliar a condição ou estado de um gene e dos seus 72 produtos. Estes compreendem, mas sem que isso constitua qualquer limitação, a localização dos produtos de gene expressados (incluindo a localização de células de expressão de 158P1D7), bem como o nível e a actividade biológica dos produtos de gene expressos (tais como ARNm, polinucleótidos e polipeptidos de 158P1D7). Tipicamente, uma alteração no estado de 158P1D7 compreende uma alteração na localização de 158P1D7 e/ou de células que expressam 158P1D7 e/ou um aumento na expressão de ARNm e/ou proteína de 158P1D7. 0 estado de 158P1D7 numa amostra pode ser analisado por diversos meios bem conhecidos na especialidade, incluindo, mas sem que isso constitua qualquer limitação, análise imuno-histoquímica, hibridação in si tu, análise de RT-PCR em amostras micro-cortadas com captura por laser, análise de Western blot e análise de conjuntos de tecidos. Protocolos típicos para a avaliação do estado do gene de 158P1D7 e de produtos do gene encontram-se disponíveis, por exemplo, por Ausubel et al. eds., 1995, Current Protocols In Molecular Biology, Unidades 2 (Northern Blotting), 4 (Southern Blotting), 15 (Immunoblotting) e 18 (análise por PCR) . Assim, o estado de 158P1D7 numa amostra biológica é avaliado por vários métodos utilizados pelos especialistas na matéria (incluindo, mas sem que isso constitua qualquer limitação, análise Southern genómica (para examinar, por exemplo, perturbações no gene de 158P1D7) ) . A análise de Northern e/ou a análise de PCR de ARNm. de 158P1D7 (para examinar, por exemplo, alterações nas sequências de polinucleótidos ou nos níveis de expressão de ARNm de 158P1D7) , e as analises de Western e/ou imuno-histoquímicas (para examinar, por exemplo, alterações nas sequências de 73 73 gene de 158P1D7 OU var i a.i ntes corta QSS ulas de ADN e ARN .do de 158 P1D7 . polipeptiaos, alterações na localização cie polipeptido numa amostra, alterações nos níveis de expressão de proteínas 158P1D7 e/ou associação de proteínas 158P1D7 com parceiros de ligação polipeptídicos). Como polinucleótidos de 158P1D7 detectaveis refere-se, por exemplo, 1 seus fragmentos, ARNm de 158P1D7, alternativas, ARNm de 158P1D7 e moléculas de ADN recombinantes que contêm um polinucleótido de 158P1D7 0 perfil de expressão de 158P1D7 faz com que este seja um. marcador para doença local e/ou metastisada, e proporciona informação sobre o crescimento ou potencial oncogénico de uma amostra biológica. Em particular, o estado de 158P1D7 proporciona informação útil para prever a sus cept ibi1idade para estados particulares de doença, progressão e/ou agressividade do tumor. São aqui descritos métodos e ensõiios para determinar o estado de 158P1D7 e para o diagnóstico de cancros que expressam 158P1D7, tais como os cancros de tecidos apresentados no quadro I. Por exemplo, uma vez que AR.N de 158P1D7 é elevadaraente expresso no cancro da bexiga e em outros cancros em relação a tecidos normais da bexiga, é possível utilizar ensaios que avaliam os níveis de transcritos ou proteínas de ARNm de 158P1D7 numa amostra biológica para diagnosticar uma doença associada à desregulação de 158P1D7 e podem proporcionar informações de prognóstico úteis para a definição de opções terapêuticas adequadas. 0 estado de expressão de 158P1D7 proporciona informações que compreende a presença, o estado e a 1 o c cl 11 z cl ç a c células displásicas, pré-cancerígenas e cancerígenas, prevendo a susceptibrlidade a diversos estados da doença e/ou avaliando a agressividade do tumor. 74

Além cio mais, o perfil de expressão torna-o útil como reagente de imagem para a doença metastisada. São aqui descritos vários métodos moleculares de prognóstico e diagnóstico psira examinar o estado de 158P1D7 em amostras biológicas, tais como aquelas provenientes de indivíduos que sofrem de uma patologia caracterizada por Um crescimento celular desregulado, tal como cancro.

Tal como descrito antes, o estado de 158P1D7 numa amostra biológica pode ser examinado por diversos procedimentos bem conhecidos na especialidade. Por exemplo o estado de 158P1D7 numa amostra biológica recolhida a partir de uma localização específica no corpo pode ser examinada por meio da avaliação da amostra quanto à presença ou ausência, de células que expressam 158P1D7 (v,g., aquelas que expressam ARNm ou proteínas de 158P1D7) Este exame pode proporcionar evidências de crescimento celular desregulado, por exemplo, no caso de se encontrar células que expressam 158P1D7 numa amostra biológica que não contém normalmente tais células (tal como um nódulo linratico) , uma vez que tais alterações no estado clg 158P1D7 numa amostra biológica são frequentemente associadas com um crescimento celular desregulado. de crescimento celular células cancerígenas a como a bexiga) para uma um nódulo linfático). A dencias de crescimento

Especificamente, um indicador desregulado são as metástases de partir de um órgão de origem (tal área diferente do corpo (tal como título exemplificativo, as evi celular desregulado são importantes visto que metástases ocultas de nódulos ! proporção substancial tais metástases estão infáticos podem ser detectadas numa de pacientes com cancro da próstata e cíósocí3.03 ^ 3 previsores co n h θ c ΐcios ci3 75 progressão da doença (ver, v.g., Murphy eí: al., Prostate 4 2 (4) : 315-317 (2000); Su et al., Semin. Surg. Oncol. 18 (1): 17-28 (2000) e Freeman et ai., J Urol, Ago. de 1995 154(2 Pt. 1) : 474-8) .

Os métodos para a monitorização de produtos genicos de 158P1D7 podem compreender a. determinação do estado dos produtos génicos de 158P1D7 expressos peias células a partir de um indivíduo que é suspeito de ter uma doença associada ao crescimento celular desregulado (tal como hiperplasia ou cancro) e depois comparar o estado assim. determinado com o estado produtos génicos de 158P1D7 numa correspondente amostrai normal. A presença de produtos génicos de 158P1D7 aberrantes na amostra de teste em relação à amostra normal proporciona urna indicação da presença de crescimento celular desregulado nas células do indivíduo.

Os ensaios úteis para a determinação da presença de cancro da bexiga em indivíduos podem compreender a detecção de um aumento significativo na expressão de ARNm ou de proteína de 158PiD/ numa amostrei de células ou de tecidos de teste em relação aos níveis de expressão em células ou tecidos normais correspondentes. A presença de ARNm de 158P1D7 pode, por exemplo, ser avaliada em amostras de tecido, incluindo, mas sem que isso constitua qualquer 1-i-nu i.avao, ^os -Lndicado^ no quadro 1 p presença de expressão significativa de 158P1D7 em qualquer um destes tecidos e util para indicar a emergência, presença e/ου gravidade de um c.a correspondentes não em níveis reduzidos. icro, uma vez que expressam ARNm de os tecidos normais 158P1D7 ou expressam 76 0 estado de 158P1D7 pode ser determinado ao nível de proteínas em vez do nível de ácido nucleico. Por exemplo, um tal método compreende a determinação do nível de proteína 158P1D7 expressa pelas células numa amostra de tecido de teste e comparação do nível assim determinado com o nível de 158P1D7 expresso numa amostra normal correspondente. A presença de proteína 158P1D7 pode ser avaliada, por exemplo, utilizando métodos imuno- histoquímicos. Os anticorpos de 158P1D7 ou parceiros (j-0 ligação capazes de detectar a. expressão da proteína 158] ? 1D 7 são utilizados em vários formatos de ensaio bem conhecidos na especialidade para este propósito. É possível avaliar o estado de sequências de nucleótidos e de aminoácidos de 158P1D7 numa amostra biológica para identificar perturbações na estrutura destas moléculas. Estas perturbações podem compreender inserções, supressões, substituições e semelhantes. Tais avaliações são úteis uma vez que perturbações nas sequências de nucleótidos e de aminoácidos são observadas em muitas proteínas associadas a um fenótipo desregulado de crescimento (ver, v.g., Marrogi et al., 1999, J. Cutan. Pathol. 26(8): 369-378). Por exemplo, uma mutação na sequência de 158P1D7 pode indicar a presença ou promoção de um tumor. Assim sendo, tais ensaios possuem um valor de diagnóstico e preditivo em que uma mutação em 158P1D7 indica uma potencial perda de função ou um aumento no crescimento do tumor. São bem conhecidos na especialidade diversos ensaios para a observação de perturbações nas sequências de nucleótidos e de aminoácidos. Por exemplo, o tamanho e a estrutura das sequências de ácidos nucleicos ou de 77 aminoáciclos dos produtos pênicos de são observados por protocoxos ae sequenciaçao de Northern, Southern, Western, PCR e ADN, aqui descritos. Além disso, há outros métodos para a observação de perturbações em sequências de nucieotidos e ae ammoácidos, tais corno análise da conrormação de polimorfismo de cadeia individual, que são bem conhecidos na especialidade (ver, v.g., patentes de invenção norte-americanas nos 5 382 510, publicada a 7 de Setembro ae 1999, e b 952 170, publicada a 17 de Janeiro de 19 95} .

Além do mais, é possível examinar o estado de metilação do gene de 158P1D7 numa amostra biológica. A desmetilação e/ou hipermetilação aberrantes de ilhas de CpG nas regiões reguladoras 5' do gene ocorrem frequentemente em células imortalizadas ou transformadas e podem provocar uma expressão alterada de vários genes. Por exemplo, a hipermetilação promotora dos genes DBCCR1, PAX6 e APC foi detectada em cancros da bexiga, provocando uma expressão aberrante dos genes (Esteller et al., Câncer Res 2001; 61: 3225-3229). Há vários ensaios para examinar o estado de metilação de um gene que são bem conhecidos na especialidade. Por exemplo, é possível utilizar, em abordagens de hibridação de Southern, enzimas de restrição sensíveis a metilação que não podem clivar sequências que contêm locais de CpG metilados para avaliar o estado de metilação de ilhas de CpG. Além disso, a MSP (PCR específica para metilação) pode rapidamente aferir o estado de metilação de todos os locais de CpG presentes nua ilha de CpG de um determinado gene. Este procedimento envolve a modificação inicial de ADN por bissulfureto de sódio (o gual irá converter todas as citosinas não metiladas em. 78 uracilo) seguindo-se a amplificação utilizando iniciadores específicos para ADN metilado versus não metilado. Os protocilos que envolvem a interferência da metilação também podem ser encontrados, por exemplo, em Current Protocols In Molecular Biology, Unidade 12, Frederick M. Ausubel et ai. eds., 1995.

A amplificação de genes constitui um método suplementar para avaliar o estado de 158P1D7. A amplificação de genes é medida directamente numa amostra, por exemplo, por Southern blotting ou Northern blotting c o nvenc i ona i s para quanti ficar a transcrição de ARNm (Thomas, 1980, Proc. Natl. Accid. Sei . USA, 77: 5201-5205), dot blotting (análise de ADN) ou hibridação in situ, utilizando uma sonda adequadamente marcada, com base nas sequências aqui fornecidas. Em alternativa, são utilizados anticorpos que reconhecem cadeias duplas específicas, incluindo cadeias duplas de ADN, cadeias duplas de ARN e cadeias duplas híbridas de ADN-ARN ou c cadeias duplas ADN-proteína. Por sua vez, os anticorpos são marcados e o ensaio é efectuado onde a. cadeia dupla está ligsLda à superiície, de modo que, apos a rormaçao da cadeia dupla sobre a superfície, a presença do anticorpo ligado a cadeia dupla possa ser detectada. 0 tecido de biopsia ou o sangue periférico podem ser convenientemente testados quanto à presença de células cancerígenas, utilizando, por exemplo, análises de Northern, dotblot ou RT-PCR, para detectar a expressão de 158P1D7. A presença de ARNm de 158P1D7 amplificável por RT-PCR proporciona uma indicação da presença de cancro. Os ensaios de RT-PCR são bem conhecidos na especialidade. Os ensaios de detecção por RT-PCR para células tumorais em. 79 sangue periférico estão, no momento, a ser avaliados para utilização no diagnóstico e na gestão de vários tumores sólidos humanos.

Um método para prever a susceptibilidade para cancro pode compreender a detecção de ARNm de 158P1D7 ou de proteína 158P1D7 numa amostra de tecido, em que a sua presença indica a susceptibilidade para cancro da bexiga, em que o grau de expressão de ARNm de 158P1D7 está correlacionado com o grau de susceptibilidade. A presença de 158P1D7 em tecidos da bexiga ou em outros tecidos podem, ser examinada, em que a presença de 158P1D7 na amostra constitui um indicador da susceptibilidade para cancro da bexiga (ou emergência ou existência de ara amor na bexiga). De igual modo, é possível avaliar a intearidade de seqi ie rracleótidos Λμ Γ-*. r~~- LA Li V _. aminoácidos de 108P1D7 numa amostra biológica para se identificar perturbações na estrutura destas moléculas, tais como inserções, supressões, substituições e semelhantes. A presença de uma ou várias perturbações nos produtos do gene 158P1D7 na amostra constituem uma indicação da susceptibilidade parai cancro da bexiga (ou a emergência ou existência de um tumor).

Um método para avaliar a agressividade de um tumor pode compreender a determinação do nível de ARNm de 158P1D7 ou de proteína 158P1D7 expresso pelas células tumorais, a comparação do nível assim determinado com o nível de ARNm de 158P1D7 ou de proteína 158P1D7 expresso num tecido normal correspondente recolhido a partir do mesmo indivíduo ou numa amostra de referência de tecido normal, em que o grau de expressão de ARNm de 158P1D7 ou de proteína 158P1D7 na amostra de tumor em relação à amostra normal indica o 80 grau de agressividade. A agressividade de um tumor pode ser avaliada por meio da determinação da extensão para a qual 158P1D7 é expressa em células tumorais, em que níveis elevados indicam tumores mais agressivos. A avaliação da integridade de sequências de nucleótidos e de aminoácidos de 158P1D7 numa amostra biológica pode ser utilizada para ident ificar perturbações na estrutura destas moléculas, tais como inserções, supressões, substituições e semel hantes. A presença de uma ou v árias perturbações indica tumores mais agressivos.

Os métodos para a observação da progressão de uma doença num indivíduo ao longo do tempo pode compreender a determinação do nível de ARNm de 158P1D7 ou de proteína 158P1D7 expresso pelas células numa amostra do tumor, a comparação do nível assim determinado de ARNm de 158P1D7 ou de proteína 158P1D7 expresso numa amostra de tecido equivalente recolhida a partir do mesmo indivíduo num momento diferente, em que o grau de expressão de ARNm de 158P1D7 ou de proteína 158P1D7 na amostra de tumor ao longo do tempo proporciona informações sobre a progressão do cancro. De acordo com uma variante específica, a progressão de um cancro da bexiga é avaliada por meio da determinação da expressão de 158P1D7 em células tumorais ao longo do tempo, em que um aumento na expressão ao longo do tempo indica uma progressão do cancro. Também é possível avaliar a integridade de sequências de nucleótidos e de aminoácidos de 158P1D7 numa amostra biológica para identificar perturbações na estrutura destas moléculas, tais como inserções, supressões, substituições e semelhantes, em que a presença de uma ou mais perturbações indica uma progressão do cancro. 81

As abordagens de diagnósticos anteriores podem ser combinadas com qualquer um dos vários protocolos de prognóstico e de diagnóstico conhecidos na especialidade. Por exemplo, os métodos podem compreender a observação de uma coincidência entre a expressão do gene 158P1D7 e de produtos do gene 158P1D7, (ou perturbações no gene 158P1D7 gene e nos produtos do gene 158P1D7) e um factor que é associado com a malignidade como meio para o diagnóstico e prognóstico do estado de uma amostra de tecido. Podem ser utilizados diversos factores associados a malignidade, tais como a expressão de genes associada a doenças (v.g., expressão de PSCA, H-ras e p53, etc..), bem como observações citológicas grosseiras (ver, v.g., Bocking et ai., 1984, Anal. Quant. Cytol. 6 (2): 74-88; Epstein, 1995, Hum. Pathol. 26(2): 223-9; Thorson et ai., 1998, Mod.

Pathol. 11(6) : 543-51; Baisden et ai., 1999, Am. J. Surg. Pathol, 23(8) : 918-24). Os métodos para a observação de uma c oincidência pi rd t- v çg Cu. c j- Cl expressão do gene 158P1D7 e os produtos do gene 1P8P1D 7 (ou pertu rbações no gene 158P1D7 e nos produtos do gene 158P1D7) e outro factor que esteja associado a doenças é útil, por exemplo, devido à presença de um conjunto de factores específicos que coincidem quando a doença proporciona informações cruciais para o diagnóstico e prognóstico do estado de uma amostra de tecido. de uma coincidência entre produtos do gene 158P1D7

Os métodos para a observação a expressão do gene 158P1D7 e dos (ou perturbações no gene 158P1D7 e nos produtos do gene 158P1D7) e outro ractor associado à doença implica a detecção da sobreexpressão de ARNm ou da proteína de 158P1D 1 numa. amostra de tecido, d.erectand.o a sobreexpressão 82 82 proteína amostr de ARNiri ou de BLCA-4A numa de tecido (ou expressão de de proteína PSCA) e observando uma coincidência de ARNm de 158P1D7 e a sobreexpressão de ARNm ou de proteína de BLCA-4 (ou expressão de PSCA.) (Amara et ai., 2001, Câncer Res. 61: 4660-4665; Konety et al., Clin Câncer Res, 2000, 6(7): 2618-2625). A expressão de ARNm de 158P1D7 e de BLCA-4 em tecido da bexiga pode ser examinada, em que a coincidência de sobreexpressão de ARNm de 158P1D7 e de BLCA-4 na amostra indica a existência de cancro da bexiga, de susceptib.ilidade a cancro da bexiga ou à emergência ou estado de um tumor na bexiga. a expressão de descritos e as cação de ácido especialidade.

Os métodos paira detectar e quantificar ARNm ou de proteína de 158P1D7 são aqui tecnologias padrão de detecção e quantifi nucleico e de proteína são bem conhecidas na

Os métodos padrão para a detecção e quantificação de ARNm de 158P1D7 compreendem a hibridação in situ utilizando ribossondas de 158P1D7 marcadas, Northern blot e técnicas associadas utilizando sondas de polinucleótido de 158P1D7, análise por RT-PCR utilizando iniciadores específicos parei 158P1D7, e outros métodos de detecção por amplificação, tais como, por exemplo, ADN ramificado, SISBA, TMA e semelhantes. Também é possível utilizar RT-PCR semi-quantitativa para detectar e quantificar a expressão de ARNm de 158P1D7. E iniciadores capazes de incluindo, mas sem que possível um número qualquer de amplificar 158P1D7 para este fim, isso constitua qualquer limitação, os diversos conjuntos de nic ade aaui descritos especificamente. Os anticorpos policlonaií monoclonais especificamente reactivos com proteína 158P1D7 de tipo 83 selvagem podem ser utilizados num ensaio imuno-histoquímico de tecido de biopsia. IX.) Identificação de moléculas que interactuam com 158P1D7

As sequências de ácido nucleico e de proteína de 15 8 P1D 7 aqui descritas permi tem que um. especialista na matéria identifique proteínas, moléculas pequenas e outros agentes que interaetuem com 158P1D7, bem como vias activadas por 158P1D7, através de qualquer um dos protocolos aceites na especialidade. Por exemplo, é possível utilizar um dos designados sistemas de captura de interacção (também designados como "ensaio de dois híbridos"). Em tais sistemas, as moléculas interactuam e reconsi :.uem um actor de :ranscrição que dirige a expressão de um gene repórter, sendo depois testada a expressão do gene repórter. Há outros sistemas que identificam interacções proteína-proteína in vivo através da reconstituição de um activador transcricional eucariótico, ver, v.g., patentes de invenção norte-americanas nos 5 955 280, publicada a 21 de Setembro de 1999, 5 925 523, publicada a 20 de Julho de 1999, 5 846 722, publicada a 9 de Dezembro de 1998 e 6 004 746, publicada a 21 de Dezembro de 1999. Também são disponibiiizados algoritmos na especialidade parei previsões com base no genoma da função da proteína (ver, v.g., Marcotte, et ai., Nature 402; 4 de Novembro de 1999, 83-86) .

Em a ernâtivd, é possível pesquisar bancos de dados las que interactuam com Em tais métodos, são a 158P1D7 por pesquisa de péptidos para identiticar molécu as sequências da proteína 158P1D7. identificados péptidos que se ligam 84 de bancos de dados que codificam uma colecção aleatória ou controlada de aminoácidos. Os péptidos codif icados pe] os bancos de dados são expressos como proteínas de fusão de proteínas revestidas com bacetriofagos, as partículas de bacteriofagos são então pesquisadas contra a proteína 158P1D7. nos 5 723 286 1, publi cada a 3

Assim sendo, péptidos que possuem diversas utilizações, tais como reagentes terapêuticos, de prognóstico ou de diagnóstico, são assim identificados sem qualquer informação anterior sobre a estrutura da molécula de ligando ou receptor esperada. Bancos de dados e métodos de pesquisa típicos que podem ser utilizados para identificar moléculas que interactuam com sequências da proteína 158P1D7 encontram-se descritas, por exemplo, nas patentes de invenção norte-americanas publicada a 3 de Março de 1998 e 5 733 7 de Março de 1998.

Em alternativa, são utilizadas linhagens celulares que expressam 158P1D7 para identificar interacções proteína-proteína mediadas por 158P1D7. Tais interacções podem ser examinadas utilizando técnicas de imunoprecipitação (ver, v.g., Hamilton BJ, et al. Biochem. Biophys. Res. Cornmun. 1999, 261: 646-51). A proteína 158P1D7 pode ser imunoprecipitada a partida de linhagens celulares que expressam 158P1D7 utilizando anticorpos anti-158PlD7. em alternativa, é possível utilizar anticorpos contra o marcador His numa linhagem celulares manipulada para expressar fusões de 158P1D7 e um marcador His (vectores supramencionados) . 0 complexo imunoprecipitado pode ser examinado quando à associação de proteína por procedimentos tais como Western blotting, marcação com 35S-m.etion.ina de 85 proteínas, microsequenciação de proteínas, coloração com prata e electroforése em gel bidimensional.

As moléculas pequenas e ligandos que interactuam com 158P1D7 podem ser identificados através de variantes relacionadas destes ensaios de pesquisa. Por exemplo, podem ser identificadas moléculas pequenas que interferem com a função da proteína, incluindo moléculas que interferem com a aptidão de 158P1D7 para mediar a fosforilação ou desfosforilação, a interacção com moléculas de ADN ou de ARN como indicação da regulação dos ciclos celulares, sinalização do segundo mensageiro ou tumorigénese. De igual modo, são identificadas moléculas pequenas que modulam os iónicos, a bomba de proteínas ou as funçõe ;S de cl Ç 3.0 Ο Θ 158P1D7 são utilizadas para t ratar es que pos suem um canc ro que expressa 158P1D7 (ver, v.g., Hille, B., lonic Channels of Excitable Membranes 2nd Ed., Sinauer Assoe., Sunderland, MA, 1992}, Além do mais, é possível identificar ligandos que regulam a função de 158P1D7 com base na sua aptidão para ligar 158P1D7 e activar uma construção repórter. Métodos típicos encontram-se descritos, por exemplo, na patente de invenção norte-americana n° 5 928 868, publicada a 27 de Julho de 1999, e compreendem métodos para a formação de ligandos híbridos em que pelo menos um ligando é uma molécula pequena. Numa variante ilustrativa, células manipuladas para expressar uma proteína de fusão de 158P1D7 e uma proteína de ligação a ADN são utilizadas para co-expressar uma proteína de fusão de um híbrido de ligando/molécula pequena e uma proteína activadora transcricional do banco de dados de ADNc. As células contêm ainda um gene repórter, cuja expressão é condicionada pela proximidade da primeira e da 86 segunda proteínas de fusão entre si, ura evento que apenas ocorre se o .ligando híbrido se ligar a locais alvo em ambas as proteínas híbridas. As células que expressam o gene repórter são seleccionadas e a molécula pequena desconhecida ou o ligando desconhecido são identificados. Este método proporciona um meio para identificar moduladores que activam ou inibem 158P1D7.

Um método para a pesquisa de uma molécula que interactue com uma sequência de aminoácidos de 158P1D7 apresentada na figura 2 ou figura 3, pode compreender os passos de contactar uma população de moléculas com a sequência de aminoáci dos de 158P1D7, permitindo que a população de moléculas s e da sequência de aminoácidos de 158P1D7 interactuem sob c ondições que facilitem a interacção, determinando a presença de uma molécula que interactua com a sequência de aminoácidos de 158P1D7 e depois separar as moléculas que não interactuam com a sequência de aminoácidos de 158P1D7 das moléculas que interactuam. 0 método pode ainda compreender a purificação, caracterizaçao ficaçao de uma molécula que interactua com a sequência de molécula identificada pode ser aminoácidos de 158P1D7. A utilizada para modular uma função realizada por 158P1D7. Pode ser efectuado o contacto de uma sequência de aminoácidos de 158P1D7 com um banco de dados de péptidos. X.) Métodos e composições terapêuticos uma proteína que .caçao de 158P1D / como uma prosema que e normalmente expressa num conjunto restrito de tecidos, mas que também é expressa em cancros da bexiga, abre diversas abordagens terapêuticas para o tratamento de tais cancros. J.1 t_ . .58P1D7 87

Tal como aqui contemplado, a 158P1D7 actua como factor de transcrição implicado na activação de genes promotores de tumores ou genes de repressão que bloqueiam a tumorigénese.

Assim sendo, abordagens terapêuticas que inibem a actividade da proteína 158P1D7 são úteis para pacientes que sofrem de um. cancro que expressa 158P1D7. De um modo geral, estas abordagens terapêuticas pertencem a duas classes. Uma classe compreende vários métodos para a inibição da ligação ou da associação da proteína 1558P1D7 com o seu parceiro de ligação ou com outras proteínas. A outra classe compreende vários métodos para a inibição da transcrição do gene 158P1D7 ou tradução de ARNrn de 158P1D7. Χ.Ά.) Vacinas anti-cancro A invenção proporciona vacinas para o cancro da bexiga que compreendem 158P1D7 ou um ácido nucleico conotado a 158P1D7. À luz da expressão de 158P1D7, as vacinas para o cancro da bexiga, previnem e/ou tratam cancros que expressam 158P1D7 com efeitos mínimos ou mesmo sem efeitos sobre tecidos não-alvo. A utilização de um antigénio de tumor is e/ou é bem ., 1995, Immunol. numa vacina que gera respostas imunes humora mediadas por células como terapia anti-cancro conhecida na especialidade (ver, v.g., Hodge et al Int. J. Câncer 63: 231-237; Fong et al., 1997, j. 159: 3113-3117). por

Tais métodos podem ser facilmente meio da utilização de 158P1D7 oi colocados em prática de uma. molécula de ácido nucleico que codifica 158P1D7 e vectores recombinantes capazes de expressar e apresentar o imunogénio de 158P1D7 (o qual compreende tipicamente vários epítopos de anticorpo ou de céiuias T) . É do conhecimento 88 dos especialistas na matéria que diversos sistemas de vacina para a administração de epitopo imuno-reactivos são bem conhecidos na especialidade (ver, v.g., Heryln et al., Ann Med, Fev, de 1999, 31 (1): 66-78; Maruyama et al., Câncer Immunol Immunother, Jun. de 2 0 00, 49 (3); 123-32). Resumidamente, tais métodos para gerar uma resposta imune (v.g., humoral e/ou mediada por células) num mamífero, compreendem os passos que consistem em: expor o sistema imune do mamífero a um epitopo imuno-reactivo (v.g., um epitopo presente na proteína 158P1D7, apresentada na SEQ ID NO: 657 ou um seu análogo ou homólogo) para que o mamífero possa gerar uma resposta imune que seia específica para esse epitopo (v.g., gera anticorpos que reconhecem especificamente esse epitopo). A proteína 158P1D7 total pode ser combinada e administrada por diversos modos. Tais composições de vacina podem compreender, por exemplo, lipopéptidos (v.g., Vitiello, A. et al.; J. Clin. Invest. 95: 341, 1995), composições de péptidos en capsuladas em microsferas poli (DL-lcLCtido -co-glicolido) i ("PLG") (ver, v.g,, Eldri< et aí., Molec. CO CM 1—I 0 r*1 1 M 287-294, 1991: Alonso et ,

Vaccine 12 : 299-306, 994; Jones et al., Vaccine 13: 675- 681, 1995), composições de péptidos contidas em complexos imunes de estimulação (ISCOMS) (ver, v.g., Takahashi et CLJl. * f

Nature 344: 873-875, 1990; Hu et .xp

Immunol. 113: 235-243, 1998), sistemas de péptidos de antigénio múltiplos (MAPs) (ver, v.g., Tam, J. P., Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 85: 5409-5413, 1988; Tam, J.P., J. Immunol. Methods 196: 17-32, 1996), péptidos formulados como péptidos multivalentes; péptidos para utilização em sistemas de administração balísticos, tipicamente péptidos 89 89 cri staliz ado s, vecto res vira is de administração (Perkus, M. E. et al ., em Cone ept s in vaccine development , Kaufmann, S. Η. E., ed., p. 37 9, 1996; Chakrabarti, S. et al., Nature 320 : 535, 198 6 ; nu, s. L. et al., Nature 320: 537, 1986; Kie ny, M. -P. 6 ?t ... 1 d±. , AI DS Bi o/Techno logy 4: 790, 19 8 6; T op, F. H * et al., u . Inf ect . D is . 124: 1 48, 1.9 71; cb anda, FJ. K. et 7 Cl -L · f \7 J_ 2Γ Logy 1 75: 535, 1990), partículas de origem vir al ou q η nt uJ.11 t é tica (v. g., E lofler, 1 if. et al., , J. Immunol. Met hods. 192 : 25, 19! 96; Eldridge, J. H, et al., Sem. Hematol. 30: 1 . 6 , 199 O . Falo, L. D., Jr. et al., Nature Med. 7: 649, 199b), adjuvantes (Warren, H. S., Vogel, F. R., e

Chedid, L, A. Annu. Rev. Immunol. 4: 369, 1986; Gupta, R.

Vacc ine 11: 293, 199 3) , lipossomas (Keddy, R , et mmu no 1. 148: 1585, 1 .992 X1 O O L., Immu n 01. 131, 1996), OU ADNc de sguarnecido ou absorvido ou las (Ulmer, J. B. et al., Science 259: 1 η λ tr / ^ D e .nson, H. L., Hunt, L. A., e Web ster, R. '<s ♦ , L: 951 1 1 Q Q "3 · / A J J O f Shiver, J. W. et al., em: Cone epts

SlI . , u

Vaccine 11 in vaccine development, Kaufmann, S. Η. E., ed., pág. 423, 1996; Cease, K. B., e Berzofsky, J. A., Annu. Rev. Immunol. 12: 923, 1994 e Eldridge, J. H. et al., Sem. Hematol. 30: 16, .993) imbém podem .ilizadas tecnologias de administração dirigidas a toxina, tamioém conhecidas como direccionamento mediado por receptor, tais como as dai Avant Immuη o t he r ape ut i c s, In c. (Needham, Ma s s acnu s e 11 s).

Em pacientes com cancro associado a 108P1D/, composições de vacina da invenção também podem ser utilizadas em conjunto com outros tratamentos utiiizadao para o cancro da bexiga, v.g., cirurgia, quimioterapxa, teraoias com fármacos, terapias com radiação, etc., 90 incluindo a utilização em combinação adjuvantes imunes, tais como IL--2, IL-12, GM--CSF e semelhantes.

Vacinas celulares

Os epitopos de CTL podem ser determinados utilizando algoritmos específicos para identificar péptidos na proteína 158P1D7 que se ligam aos alelos de HLA correspondentes (ver, v.g.r quadro IV; Epimer™ e Epimatrix™, Brown University (URL www.brown.edu/Research/ /TB-HIV_Lab/epimatrix/epimatrix.html); e BIMAS, (URL bimas.dcrt.nih.gov/; SYFPEITHI em URL syfpeithi.bmi-heidelberg.com/). 0 imunogénio de 158P1D7 pode conter uma ou mais sequências de aminoácidos identificadas utilizando técnicas bem conhecidas na especialidade, ais como as sequências apresentadas nos quadros V-XVIII ou um péptido de 8, 9, 10 ou 11 aminoácidos especificado por um motivo/supermot ivo de HLA de classe I (v.g., quadro IV (A), quadro IV (D) ou quadro IV (E) ) e/ou um péptido pelo menos de 9 aminoácidos que compreende um motivo/supermotivo de HLA de classe II (v.gu, quadro IV (B) ou quadro IV (C) ) . Conforme é sabido na especialidade, a ranhura de ligação de HLA de classe é essencialmente fechada nas extremidades de modo que apenas péptidos com um tamanho parti cular possam caber na ranhura e ligar-se; de um modo geral os epitopos de HLA de classe I possuem um comprimento de 8, 9, 10 ou 11 aminoácidos. Pelo contrário, a ranhura de ligação a HLA de classe II é essencialmente aberta nas extremidades; pelo que um péptido com cerca de 9 ou mais aminoácidos pode ligar-se a uma molécula de HLA de classe II. Devido às diferenças de ranhuras de 1 1 Oj ci a 0 entre HLA de cl asse I II, os motivos de HLA de classe I são específico s para 91 91 .o e/ou carboxi lo de 1 ama • Os ep ítopos de HL A de uir l comp rimento CÍ0 9, : 10, i-9, ?n ^ KJ J 21, 22, 23 , 24 ou comprimento, isto e, a posição dois de um motivo de classe I é o segundo aminoácidos na direcção de amino para carboxilo do péptido. As posições de aminoácido num motivo de classe II são apenas relativas entre si, não relativas ao péptido total, isto é, é possível adicionar aminoácidos suplementares aos terminais am: sequência que suporte um motiv classe II possuem frequentementí 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 22 aminoácidos ou superior a 25 aminoácidoí

Vacinas com baise em anticorpos São conhecidos na especialidade diversos métodos para gerar uma resposta imune num mamífero (por exemplo, o primeiro passo para gerar hibridomas). Os métodos para gerar uma resposta imune num mamífero compreendem a exposição do sistema imune do mamífero a um epítopo imunogénico numa proteína (v.g., a proteína 158P1D7) de modo que seja gerada uma resposta imune. Uma variante típica é constituída por um método para gerar uma resposta imune a 158P1D7 num hospedeiro, por meio do contacto do hospedeiro com uma quantidade suficiente pelo menos de um epítopo de células de 158P1D7B ou de células T citotóxicas, ou um seu análogo; e pelo menos um intervalo periódico após o qual se promove um novo contacto do hospedeiro com um epítopo de células B de 158P1D7 B ou de células T citotóxicas, ou um seu análogo. Um método para se gerar uma resposta imune contra uma proteína conotada com 158P1D7 ou um péptido multiepitópico preparado pelo homem pode compreender a administração de imunogénro de ió8P1D7 (v.g., a proteína 158P1D7 ou um seu fragmento peptídico, uma 92 proteína de fusão de 158P1D7 ou ura seus análogo, etc.) numa preparação de vacina para um ser humano ou outro mamífero.

Tipicamente, tais preparações de v acina contêm ainda um ad j uvante adequado (ver, v.g., paterr te de invenção n° 6 146 635) ou um epítopo auxiliador un liversal, tal como um péptido PADRE™ (Epimmune Inc., San Diego, CA; v er, v.g., Alexander et al., J. Immunol. 2000 164 (3); 164(3): 1625-1633; Alexander et al., Immunity 1994 1(9): 751-761 e

Alexander et ai., Immunol. Res. 1998 18(2) : 79-92). Um método alterna tivo compreende gerar uma respo sta imune num. indivíduo contra um imunogénio de 158P1D7 por meio: da administração in vivo ao músculo ou pele do corpo do indivíduo de uma molécula de ADN que cc impreende uma sequência de ADN que codifica um imunogénio de 158P1D7, em que a sequência de ADN está funcionalmente ligada a sequências reguladoras que controlam a expressão da sequência de ADN; em que a molécula de ADN é absorvida pelas células, a sequência de ADN é expressa nas células e uma resposta imune é gerada contra o imunogénio (ver, v.g,, a patente de invenção norte-americana n° 5 962 428) . Facultativamente, também é administrado um facilitador de vacina genético, tal como lípidos aniónicos; saponinas; lectinas; compostos estrogénicos; alquilos inferiores hidroxilados; sulfóxido de dimetilo e ureia.

Vacinas de ácido nucleico

As composições de vacina '''S presen te invenção compreendem modalidades mediadas por ácido nucleico. Ξ possível administrar a um paciente ADN OU ARN que codifica a.(s) proteína (s) aqui descrita (s). Os métodos de imunização 93 genética poderá ser utilizados para gerar respostas imunes humorais e celulares profilácticas ou terapêuticas dirigidas contra células cancerígenas que expressam 158P1D7. As construção que compreendem ADN que codifica uma proteina/imunogénio conotada com 158P1D7 e as sequências reguladoras adequadas podem ser injectadas directamente no músculo ou na pele de um indivíduo, de um modo tal que as 93 células do músculo ou d <3. pC. aosorvam construção e expressem a proteina/imunogénio de 158P1D7 codificado. Em alternativa, uma vacina compreende uma proteína conotada com 158P1D7. A expressão do imunogénio da proteína conotada com 158P1D7 resulta na geração de imunidade humoral e celular profiláctica ou terapêutica contra as células que suportam, essa proteína 158P1D7. É possível utilizar diversas técnicas de imunização genética profilácticas e terapêuticas conhecidas na especialidade (para uma descrição, veja-se a informação e as referências publicadas na morada www. qenweb. com.) . A administração com base em. ácido nucleico encontra-se descrita, por exemplo, por Wolff et, ai., Science 247: 1465 (1990), bem como nas patentes de invenção norte-americanas nos 5 580 859; 5 589 466;

566; 5 /39 118; 5 736 524; 5 679 647; e no documento WO 98/04720. Como exemplos de tecnologias de administração com base em

iDN :ere-se "ADN desguarnecido", administraçao facilitada (bupivicaína, polímeros, mediada com péptidos), complexos de lipidos catiónicos e administração mediadas por partículas ("pistola de genes") ou mediada, por pressão (ver, v.g., patente de invenção norte-americana n° . 5 922 687) . ira í:o cl ti

Imunização terapêutica ou profiláctica, as proteínas podem ser expressas por meio de vectores 94 virais ou bacterianos. Diversos sistemas de administração de gene virais que podem ser utilizados compreendem, vaccinia, varíola aviária, canarypox, adenovírus, vírus da gripe, poliovírus, adenovírus associado, lentn sindbis (ver, v.g,, Restifo, 1996, Curr. Opin, 658-663; Tsang et al., J. Natl. Câncer Tnst.. >ciado, lentiv írus e vírus , Curr, Ooin · Irarm; mol. 8 : Câncer Tnst.. 87: 982-990

(1995)). Também é possível utilizar sistemas de administração não virais por meio da introdução de ADN desguarnecido que codifica uma proteína conotada com 158P1D7 no paciente (v.g., por via intramuscular ou intradérmica) para induzir uma resposta anti-tumor. 0 vírus vaccinia para expressar sequêr péptidos da. invenção vírus de vaccinia é utilizado, por exemplo, como vector sias de nucleótidos que codificam os Após introdução num hospedeiro, o recombinante expressa o péptido imunogénico da proteína, desencadeando assim imune do hospedeiro. Os vectores de vaccini úteis para protocolos de imunização encontram-í v.g., na patente de invenção norte-americana n uma resposta .a e métodos se descritos, ° 4 722 848.

Um outro vectores Nature 3; vector é BCG (nacille Calmette Guerin). Os de BCG encont ram-se descritos por Stover Θ t 3.-L * f 31: 456 -46 0 ( 1991). Há diversos outros vec tores úteis para a administração ou imunização terapêutica dos péptidos da invenção, v.g., vectores de adenovírus ou vectores associados a adenovírus, vectores retrovirais, vectores de Salmonella typhi, toxina anthrax desintoxicados e semelhantes, vectores da os quais são evidentes cara ;spec .aiísta: na matéria partir dc descrição aqui apresentada. .Assim, os sistemas de administração de genes são utilizados para administrar uma. molécula de ácido nucleico 95 conotada cora 158P1D7. De acordo com uma variante, utiliza-se o ADNc de 158P1D7 humano de comprimento completo. De acordo com outra variante, são utilizadas moléculas de codificam linfócitos anticorpo específicos. ácido nucleico de 158P1D7 que citotóxicos (CIL) e/ou epítopos de vacinas ex vivo

Também é possível utilizar diversas estratégias ex vivo para gerar uma resposta imune. Uma abordagem envolve a utilização de células apresentadoras de antigénio (APC), tais como as células dendríticas (DC) para apresentar o antigénio de 158P1D7 ao sistema imune do paciente. As células dendríticas expressam moléculas MHC de classe I e II, co-estimulador B7 e IL--12, pelo que são células apresentadoras de antigénio bastante especializadas. No cancro da bexiga, células dendríticas autólogas estimuladas com péptidos do antigénio de MAGE-3 estão a ser utilizadas num ensaio clínico de fase I para estimular os sistemas imunes de pacientes com cancro da bexiga (Nishiyama et al., 2001, Clin Câncer Res, 7(1): 23-31). Assim, as células dendríticas podem ser utilizadas para apresentar péptidos de 158P1D7 a células T no contexto de moléculas MHC de classe I ou H 1—1 As células dendríti cas autólogas p odem ser estimuladas com pé ptidos de 158P1D7 ' capazes de se ligar a moléculas M HC de classe I e/ou classe II. As células dendríticas podem ser estimuladas com a proteína 158P1D7 completa. Uma alternativa, envolve a manipulação da sobreexpressão do gene 158P1D7 em células dendríticas utilizando vários vectores de implementação conhecidos na especialidade, tais como adenovírus (Arthur et aL, 1997, Câncer Gene Ther. 4: 17-25), retrovírus (Henderson et al ., 96 1996, Câncer Res. 56: 3763-3770), lentivírus, adenovírus associados, transfecção de ADN (Ribas et al., 1997, Câncer Res. 57: 2865-2869) ou transfecção de ARN proveniente de tumor (Ashley et ai., 1997, J. Exp. Med. 186 : 1177-1182). As células que expressam 158P1D7 também podem ser manipuladas para expressar mod.ulad.ores imunes, tais como GM-CSF, e utilizadas como agentes de imunização. X.B.) 158P1D7 como alvo para terapia com base em anticorpos A 158P1D7 constitui um alvo atra.cti.vo para estratégias terapêuticas com base em anticorpos. São conhecidas na especialidade diversas estratégias com anticorpos para dirigir moléculas extracelulares e intracelulares (ver, v.g., morte mediada por complemento e por ADCC, bem como a. utilização de intracorpos). Visto que a 158P1D7 é expressa por células cancerígenas de várias linhagens em relação às células normais correspondentes, é preparada a administração sistémica, de composições imuno-reactivas de 158P1D7 que exibem uma sensibilidade excelente sem efeitos de toxicidade, não específicos e/ou não dirigidos, provocados pela ligação da composição imuno-reactiva a órgãos ou tecidos não alvejados. Os anticorpos especificamente reactivos com domínios de 158P1D7 são úteis para o tratamento de cancros da bexiga que expressam 158P1D7 sistemicamente, quer como conjugados com uma toxina ou com um agente terapêutico quer como anticorpos desguarnecidos capazes de inibir a proliferação ou função de células.

Os anticorpos de 158P1D7 podem ser introduzidos num paciente de um modo tal que o anticorpo se ligue a 158P1D7 e module a sua função, tal como uma interseção com um. 97 parceiro cie ligação, e, consequentemente, medeie a destruição das células tumorais e/ou iniba o crescimento das células tumorais. Os mecanismos pelos quais tais anticorpos exercem um efeito terapêutico pode compreender citólise mediada por complemento, citotoxicidade celular dependente do anticorpo, modulação da função fisiológica de 158P1D7, inibição da ligação ao ligando ou das vias de transduçao do sinal, modulação dcL diferenciação de células tumorais, alteraçao dos perfis do factor de angiogénese e/ou apoptose.

Sera evidente para os especialistas na matéria que os anticorpos podem ser utilizados para dirigir e ligar especifícamente moléculas imunogénicas, tais como uma região imunogénica da sequência de 158P1D7 apresentada na figura 2 ou figura 3. Além disso, será evidente para os especiaiistcis na matéria que constitui um passo de rotina conjugar anticorpos com agente citotóxicos (ver, v.g.r Slevers et al. Blood 93: 113678-3684 (1 de Junho de 1999)). Quando agentes citotóxicos e/ou terapêuticos são administrados directamente a células, tais como por meio da sua conjugação com anticorpos específicos para uma molécula expressa por essa célula (v.g., 158P1D7), o agente citotóxico irá exercer o seu efeito biológico conhecido (isto é, citotoxicidade) nessas células. São conhecidos na especialidade diversos composições e métodos para a utilização de conjugados de anticorpo-agente citotóxico para destruir células. No contexto de cancros, os métodos típicos compreendem a administração a um animal que possui um tumor uma quantidade biologicamente eficaz de um conjugado que compreende um agente citotóxico e/ou terapêutico seleccionado ligado a um agente alvo (v.g., um. 98 anticorpo anti-158PlD7) que se liga a ura marcador (v.g., 158P1D7) expresso, acessível a ligação ou localizado sobre as superfícies das células. Uma variante típica consiste num método psira a administração de um agente citotóxico e/ou terapêutico a uma célula que expressa 158P1D7, o qu^l compreende a conjugação do agente citotóxico com um anticorpo que se liga imuno-especifícamente a um epítopo de 158P1D7, e expor a célula ao conjugado anticorpo—agente. Uma outra variante ilustrativa consiste num método de tratamento de um indivíduo que é suspeito de sofrer de cancro o'a bexiga metastisado, o qual compreende o passo de administrar por via parentérica ao referido indivíduo uma composição farmacêutica que compreende uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo conjugado com um aaente citotóxico e/ou terapêutico. anticorpos anti-árias abordagens io tratamento de sem que isso A imunoterapia para cancro utilizando 158P1D7 pode ser realizada de acordo com v. que têm vindo a ser utilizadas com êxito r outros tipos de cancro, incluindo, mas constitua qualquer limitação, cancro do cólon (Arlen et al., 1998, Crit. Rev. Immunol. 18: 133-138), mielomas múltiplos (Ozaki et ai., 1997, Blood 90: 3179-3186,

Tsunenari et aí., 1997, Blood 90: 2437-2444), cancro gástrico (Kasprzyk et ai., 1992, Câncer Res. 52: 2771- 2776), linfoma de células B (Funakoshi et ai., 1996, J. Immunother. Emphasis Tumor Immunol. 19: 93-101), leucemia (Zhong et ai., 1996, Leuk. Res. 2u: 581-589), cancro colo-rectal (Moun et ai., 1994, Câncer Res. 54; 6160-6166; 55: 4398-4403) e cancro Clin. Immunol. 11: 117-cas envolvem a conjugação

Velders et ai., 1995, Câncer Res da mama (Shepard et ai., 1991, J 127). Algumas abordagens terapêut: 99 cie anticorpo desguarnecido com uma toxina, tal como a conjugação de Y9i ou IJ,J com. anticorpos a.nti-CD20 (v.g., Zevalin', IDEC Pharmaceutiçais Corp. ou Bexxar , Couiter Pharmaceuticals), ao passo que outras envolvem a co-administração cie anticorpos e de outros agentes terapêuticos, tais como Herceptin" (trastuzumab) com paclitaxel (Genentech, Inc.). Para se tratar o cancro da bexiga, por exemplo, é possível administrar anticorpos de 158P1D7 em conjunto com radiação, quimioterapia e ablação de hormonas.

Embora a terapia com anticorpo de 158P1D7 seja útil para todos as etapas do cancro da bexiga, a terapia com anticorpo pode ser particularmente adequada em cancros avançados e metastáticos. 0 tratamento com terapia com anticorpo é indicado para pacientes que tenham recebido um ou vários ciclos de quimioterapia. Em alternativa, a terapia com anticorpo é combinado com um regime quimioterapêutico ou radiação para pacientes que não tenham recebido tratamento quimioterapêutico. Além disso, a terapia com anticorpo pode permitir a utilização de dosagens reduzidas de quimioterapia concomitante, em particular para pacientes que não toleram muito bem a toxicidade do agente quimioterapêutico.

Os pacientes de cancro podem ser avaliados quanto à presença e ao nível de expressão de 158P1D7, de preferência utilizando avaliações imuno-histoquímicas de tecidos do tumor, imagiologia de 158P1D7 quantitativa ou outras técnicas que indicam de um modo confiável a presença e o nível de expressão de 158P1D7. As análises imuno-hxstoquírnicas de biopsias os espécimes cirúrgicos de tumores são preferidas para este propósito. Os métodos para 100 100 a nanse &Θ íiiuno nxsooquimxca de tecidos de tumor são bem conhecidos na especialidade.

Os anticorpos monoclonais anti-158PlD7 para o tratamento de cancros da bexiga compreendem aqueles que dão inicio a uma resposta imune potente contra o tumor ou aqueles que são directamente citotóxicos. A este respeito, os anticorpos monoclonais (mAbs) anti-158PlD7 podem desencadear a xise de céluxas tumorais por mecanismos de citotoxicidade de células dependente de anticorpo (ADCC) ou mediada por complemento (ADCC), os quais requerem uma porção de Fc Intacta da molécula de imunoglobulina para interacção com locais de receptor de Fc de células efectoras em proteínas de complemento. Além do mais, mAbs anti-158PlD7 que exercem um. efeito biológico directo sobre o crescimento do tumor são úteis para o tratamento de cancros que expressam 158P1D7. Os mecanismos pelos quais os mAbs citotóxicos actuarn directamente compreendem: a inibição do crescimento celular, a modulação da diferenciação celular, a modulação dos perfis do factor de angiogénese do tumor e a indução de apoptose. O mecanismo, ti-158PlD7 particular ou mecanismos, pelo que um mAb utros que tais, tal como é conhecido na exerce um efeito anti-tumor é avaliado utilizando um número qualquer de ensaios in vitro que avaliam a morte celular, tais como ADCC, ADMMC, lise de células mediada pelo complemento e o especialidade.

Em alguns pacientes, a utilização de anticorpos monoclonais de murino ou de outros anticorpos monoclonais não humanos ou de mAbs quiméricos humano/murganho pode induzir reoosXas i munec' moderadas a fortes contra o anticorpo não humano. Tal pode resultar na remoção do 101 am-o. corpo ae circuiação e reduzir a eficácia. Nos casos mais graves, uma tax resposta imune pode dar origem, à rormação extensa de complexos imunes que, potencialmente, podem provocar uma falência renal.

As formulações de anticorpo anti-158P!D7 são administradas por meio de qualquer via capaz de administrar os anticorpos a uma célula tumorai. As vias de aammistraçao compreendem, mas sem que isso constitua qualquer limitação, as vias intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, intra-tumorai, intradérmica e semelhantes. De um modo geral, o tratamento envolve a administração repetida dcL preparaçao de anticorpo anti-158PlD7, através de uma via de aamxnxstraç;ão aceitável, tal como por injecçao intravenosa (IV), tipicamente numa dose compreendida entre cerca de 0,1 e cerca de 10 mg/kg de peso corporal. De um modo geral, as doses compreendidas entre 10 e 500 mg de mAb por semana são eficazes e bem toleradas.

Com base na experiência clínica com Herceptin no tratamento de cancro da mama metastático, uma dose inicial de carga de aproximadamente 4 mg/kg de peso corporal do paciente IV, seguida por doses semanais de cerca de 2 mg/kg IV da preparação de mAb anti-158PlD7, constitui um regime de dose aceitável. De preferência, a dose inicial de carga é administrada como uma infusão de 90 minutos ou superior. A dose de manutenção periódica é administrada como uma infusão de 30 minutos ou superior, desde que a dose inicial tenha sido bem tolerada. Tal como é do conhecimento dos especialistas na matéria, há diversos factores que podem influenciar o regime ideal de dose em casos particulares.

Facultativamente, os pacientes deverão ser avaliados quanto aos níveis de 158P1D7 numa determinada amostra 102 (v.g.f os níveis em circulação de antigénio de 158P1D7 e/ou de células que expressam 158P1D7) para auxiliar a determinação do regime de dose mais eficaz, etc.. Tais avaliações também são utilizadas parei monitorizar os propósitos ao longo da terapia e são úteis para avaliar o sucesso terapêutico em combinação com a avaliação de outros parâmetros (por exemplo, citologia de urina e/ou níveis de ImmunoCyt na terapia para o cancro da bexiga, ou, por analogia, níveis séricos de PSA na terapia para o cancro da próstata). 102 Também possiw .lizar anticorí .58P1D' anti-idiotípicos na terapia anti-cancro como vacina para a indução de uma resposta imune para células que expressam uma proteína conotada com 158P1D7. Em particular, a geração de anticorpos anti-idiotípicos é bem conhecida na especialidade; esta metodologia podem ser facilmente adaptada para gerar anticorpos anti-158PlD7 anti- idiot ípicos que imit am um epitopo numa proteína com 158P1D7 (ver. por exemplo, Wagner et al Hybri doma 16: 33-40; Foon et ai., 1995, J. Clin 96 : 334-342; Herlyn et al., 1 996, Câncer

Invest.

Immunother. 43: 65-76). Um tal anticorpo anti-idiotípico pode ser utilizado em estratégias de vacina para o cancro. X.C.) 158F1D7 como alvo para respostas imunes celulares

Um péptido pode estar presente individualmente numa vacina. Em alternativa, o péptido pode existir sob a forma de um homopolíitero que compreende multiplcis cóρia^ do mesmo péptido ou sob a forma de um heteropolime.ro de vários 103 péptidos. Os polímeros possuem a vantagem de apresentar uma reacção imunologica aumentada e, quando sao utij-.izad.os epítopos peptídicos diferentes para preparar o polímero, a aptidão suplementar para induzir anticorpos e/ou CTL que reagem com determinantes antigénicos diferentes do organismo patogénico ou propriedades associado ao tumor dirigido para uma resposta imune. A composição pode ser uma região que ocorre naturalmente de um antigénio ou pode ser preparada, v.g.r de um modo recombmante ou por síntese química.

Os veículos que é possível utilizar cora as vacinas da invenção são bem conhecidos na especialidade e compreendem, v.g., tiroglobulina, albuminas, tais como albumina do soro humana, toxóide tetânico, poliaminoácidos, tais como poli-L-lisina, poli-ácido L-glutâmico, vírus da gripe, proteína vacinas do núcleo do vírus da hepatite e semelhantes. podem conter um diluente fisiologicamente tolerável (isto é, aceitável), tal como água ou soluto salino e de preferência soluto salino tamponado com íosfato. As vacinas também compreendem tipicamente um adjuvante. Os adjuvantes, tais como adjuvante incompleto de Freund, fosfato de alumínio, hidróxido de alumínio ou alumina são exemplos bem conhecidos na especialidade. Além disso, conforme aqui descrito, as respostas de CTL podem ser amplificadas por conjugação de péptidos da invenção com lípidos, tais como tripanitoíl-S-glicerilcisteinilseril-serina (P3CSS). Além do mais, concluiu-se que um adjuvante, tal como olio-onucleótidos que contêm citosinas-fosforotioladas-guanina sintéticas (CpG), aumenta as respostas de CTL 10 a 100 vezes. (Ver, v.g-, Davila e Celis J. Immunol. 165: 539-547 (2000)). 104

Após imunização com uma composição peptídica, por via de injecção, aerossol, oral, transdérmica, transmucosal, intrapleural, intratecai ou outras vias adequadas, o através da específicas hospedeiro sistema imune do hospedeiro responde à vacina produção de grandes quantidades de CTL e/ou HTL para o antigénio desejado. Consequentemente, c a um desenvolvimento fica pelo menos parcialmente imune posterior de células que expressam ou que sobreexpressam o antigénio de 158P1D7, ou obtém pelo menos alguns benefícios terapêuticos quando o antigénio for associado ao tumor.

Uma vacina da invenção também pode compreende células apresentadoras de antigénio (APC), tais como células dendríticas (DC) , como veículo para apresentar péptidos da invenção. As composições de vacina podem ser criadas in vitro, após mobilização e colheita de células dendríticas, em que a carga das células dendríticas ocorre in vitro. Por exemplo, as células dendríticas são transfectadas, v.g., com um. minigene de acordo com a invenção ou são estimuladas com péptidos. As células dendríticas podem então ser administradas a um paciente para provocar respostas imunes in vivo. As composições de vacina, com base em ADN ou era péptido s, t ambém ~m ser administradas in vivo em combinação com mobilização de células dendríticas, em pue a carga das células dendríticas ocorre in vivo.

De preferência, são utilizados os princípios seguintes durante a selecção de um conjunto de epítopos para inclusão numa composição polieptitópica para utilização numa vacina ou para a selecção de epítopos discretos para inclusão numa vacina e/ou para codificação por ácidos nucleicos, tais como um minigene. É preferível que cada um dos princípios seguintes seja equilibrado para fazer a selecção. Os 105 múltiplos epítopos que se pretende incorporar numa determinada vacina podem ser, embora tal não seja necessário, contíguos em sequência no antigénio nativo a partir do qual são obtidos os epítopos. apos foram 1.) Sao seleccionados epítopos que, administração, imitam as respostas imunes que observadas como estando relacionadas com a limpeza do tumor. Para HLA de classe I, tal inclui 3 a 4 epítopos provenientes de pelo menos um antigénio associado ao tumor (TAA) . Para HLA de classe II, utiliza-se uma proporção semelhante; novamente são seleccionados 3 a 4 epítopos a partir de pelo menos um TAA (ver, v.g., Rosenberg et al., Science 278: 1447-1450). Os epítopos provenientes de um TAA podem ser utilizados em combinação com epítopos provenientes de um ou mais TAA adicionais para produzir uma vacina dirigida a tumores com padrões de expressão que variam de TAA expressos frequentemente. 2. ) São seleccionados epítopos que possuem a necessária afinidade de ligação estabelecida como estando correlacionada com a imunogenicidade: para HLA de classe I um CI50 de 500 nM ou inferior e frequentemente 200 nM ou inferior; e para a classe II um CI50 de 1000 nM ou inferior. 3. ) São seleccionados péptidos que suportam de supermotivos suficientes, péptidos que suportam um motivo específico do alelo, para conferir uma ampla cobertura de população. P°r exemplo, e preferível possuir pelo menos 80% de cobertura da população. É possível utilizar uma análise de Monte Cario, que é uma avaliação estatística conhecida na especialidade, para avaliar a amplitude, ou redundância, da cobertura de população. ou um conjunto s uíiciei 106 4. ) Durante a selecção de antigénios associados ao cancro da útil seleccionar análogos visto desenvolvido tolerância paira o epí epítopos provenientes bexiga, é frequenteine que o paciente pode topo nativo. de nte ter 5.) referidos >ao ;ar como ticularmen "eoítopos e iraportantes encaixados". os

Os epítopos epítopos encaixados ocorrem onde pelo menos dois epítopos são sobrepostos numa determinada sequência peptídica. Uma sequência peptídica encaixada pode compreender epítopos de células B, de HL A de classe I e/ou de HL A de classe II.

Quando se utilizada epítopos encaixados, um objectivo geral consiste em proporcionar o maior número possível de epítopos por sequência. Assim, um aspecto é evitar proporcionar um péptido que é mais comprido do que o terminal amino do epítopo do terminal amino e do que o terminal carboxilo do epítopo do terminal carboxilo no péptido. Quando se utiliza uma sequência multi-epitópica, tal como uma sequência que compreende epítopos encaixados, é normalmente importante pesquisas a sequência de modo a garantir que esta não apresenta propriedades patológicas ou outras propriedades biológicas prejudiciais. ssível que abranja os é seme lhan te, se nã o o -ecçao de uir i péptido que entanto , co m um pépt ido :ivo de mií limizaçáo do cessida '•wí de integrar entre 0 s epítopos na aminoá eido separado res 6.) Caso seja criada uma proteína poliepitópica, ou durante a criação de um minigene, um objectivo consiste em gerar o péptido mais pequeno p( epítopos relevantes. Este principie mesmo, que o utilizado durante a se compreende epítopos encaixados. No poliepitópico artificial, o objec tamanho é equilibrado com a n quaisquer sequências separadoras 107 podem, por exemplo, ser introduzidos para evitar epítopos de junção (um epítopo reconhecido pelo sistema imune, que não está presente no antigénio alvo, e que é apenas criado pela justaposição de epítopos criada pelo homem), ou para facilitar a clivagem entre epítopos aumentando assim a apresentação do epítopo. Os epítopos de junção deverão ser normalmente evitados, uma vez que o recipiente pode gerar uma reposta imune contra esse epítopo não nativo. É particularmente importante um epítopo de junção que é um "epítopo dominante". Um epítopo dominante pode proporcionar uma resposta tão exagerada que as respostas imunes a outros epítopos são diminuídas ou suprimidas. 7.) Mo caso de estarem presentes sequências de múltiplas variantes da mesma proteína alvo, então os epítopos de péptido potenciais também podem ser seleccionados com base na sua conservação. Por exemplo, um critério para a conservação pode definir que a sequência total de um péptido de ligação a HLA de classe I, ou que o núcleo total 9-mer de um péptido de ligação a classe II, seja conservada numa determinada percentagem das sequências avaliadas para um antigénio de proteína específico. X.C.1. Vacinas de minigene

Encontram-se disponíveis várias abordagens diferentes que permitem a administração em simultâneo de múltiplos epítopos. Os ácidos nucleicos que codificam péptidos são particularmente úteis. Os epítopos para inclusão num minigene são preferencialmente seleccionados de acordo com as linhas gerais apresentadas na secção anterior. Um meio preferido para a administração de ácidos nucleicos que 108 codificain utiliza construções de minigene que codificam um péptioo que compreende um ou múltiolos epítopos. A utilização de minigenes com mu Iti-epítopos enco ntra se a seguir descrita e por Ishioka et al., J. Immunol. 162 3915-3925, 1999; An, L, e Whitton, J. L., J. Virol . 71 2292, 1997; Thomson, S. A. et al., J. Immunol. 157: 822 1996; víhiLton, J. l. et al., J. Virol. 6 /: 348, 1993;

Hanke, et a.1., Vaccine 16: 426, 1998. Por exemplo, é possi ível construi uir um plasmídeo de ADN com multi-epitopos que codifica epítopos que suportam supermotivos e/ou motivos provenientes de 158P1D7, o epítopo de células T auxiliadoras universais PADRE® (ou múltiplos epítopos de HTL provenientes de 158P1D7) e uma sequência de sinal de translocaçao do retículo endoplásmico. Uma vacina, também pode compreender epítopos provenientes de outros TAA. A imunogerucidade de um minigene multi-epitópico pode ser confirmada em murganhos transgénicos para avaliar a magnitude de respostas de indução de CTL contra os epítopos testados. Além disso, a imunogenicidade de epítopos codificados por ADN pode ser correlacionada com as respostas in vitro de linhagens de CTL específicas contra células alvo transfectadas com o plasmídeo de ADN. Assim, estas experiências podem mostrar que o minigene serve para: 1.) gerar uma resposta de CTL e 2.) que os CTL induzidos reconhecem células que expressam os epítopos codificados.

Por exemplo, para se criar urna sequência de ADN que codifica os epítopos seleccionados (minigene) para expressão em células humanas, as sequências de aminoácidos dos epítopos podem ser utilizar um quadro de guiar a selecção do inversamente traduzidas. É possível utilização de codões humanos para codão para cada aminoácido. Estas 109 sequências cie ADN que codificara epí topos podem ser directamente unidas, de modo que, quando traduzidas, seja criado uma sequência de polipeptido contígua. Para se optimizar a expressão e/ou a imunogenicidade, é possível incorporar elementos suplementares na concepção do minigene. Como exemplos de sequências de aminoácidos que podem ser inversamente traduzidas e incluídas na sequência do minigene refere-se: epítopos de HLA de classe I, epítopos cie HLA de classe II, epítopos cie anticorpo, uma sequência de sinal de ubiquitinação e/ou um sinal dirigido ao retículo endoplásmico. Além disso, a apresentação por HLA de epítopos de CTL e HTL pode ser melhorada pela inclusão de sequências de flanqueamento sintéticas (v.g, , poli-alanina) ou que ocorrem naturalmente, adjacentes aos epítopos de CTL ou HTL. A sequência do minigene pode ser convertida em ADN por montagem de oligonucleótidos que codificam as cadeias mais menos do minigene. Os oligonucleótidos sobrepostos fosfori adequadas. nto de 30 a 100 bases) podem ser sintetizados, dos, purificados e reco mbinados sob condi Ções f utilizando técnicas bem conhecidas. As .de s dos o1i go nu c1e ó t ido s podem ser unidas, por exemplo, utilizando ligase de ADN T4. este minigene sintético, que codifica o polipeptido do epítopo, pode 0 ntão ser clonado num vector de expressão São preferencialmente incluídas no adrão reguladoras, bem conhecidas pelos de se jado. vector sequênc e spe cia1i s t a s as na matéria, para garantir a expressão nas células alvo. São desejáveis vários elementos no vector: um promotor com um local de clonagem a jusante para inserção do minigene, um sinal de poliadenilação para uma terminação de transcrição 110 110 ; e um marcador a ampic i1i n a ou utilizar vários eficaz; uma origem de replicação de E. coli seleccionável de E. coli (v.g, resistência a canamicina) . Para este fim é possível i promotores, v.g.f o promotor (hCMV). Ver, v.g.f as patentes nos 5 580 859 e 5 589 466, do citomegalovírus humano de invenção norte-americanas para outras sequências de promotor adequadas.

Modificações suplementares no vector poderão ser desejadas para optimizar a expressão e imunogenicidade do minigene. Em alguns casos, são necessários intrões para a expressão eficaz do gene g pod .endo ser incorpo: rados um ou vários intrões sintético s ou que ocorrem natu ralmente iicl região transcrita do minigene. A inclusão de sequências de ARNm para. ser c replicação em onsiderada para C 0.1. U1 3. s de mamíferos também pode aumentar a expressão do minigene.

Depois de se ter seleccionado o vector de expressão, o minigene é clonado na região poliligador a jusante do promotor. Este plasmídeo é transformado numa cadeia de E. rquada e o ADN é preparado utilizando técnicas padrão. A orientação e a sequência de ADN do minigene, bem como todos os outros elementos incluídos no vector, são confirmados utilizando análises de mapeamento de restrição e análise de sequência de ADN. As células bacterianas que carregam o plasmídeo correcto podem ser armazenadas como um banco de células principal e um banco de células de trabalho.

Além do mais, as sequências imunoestimuladoras (ISSs ou CpGs) parecem desempenhar um papel na imunogenicidade das vacinas de ADN. Se desejado, estas sequências podem ser 111 incluídas no vector, no exterior da região de codificação do minigene, para aumentar a imunogenicidade.

Em algumas variantes, é possível utilizar um vector de expressão bi-cistrónico que permite a produção de epítopos codificados pelo minigene e de uma segunda proteína (incluída para aumentar ou para diminuir a imunogenicidade). Como exemplos de proteínas ou polipeptidos que podem potenciar beneficamente a resposta imune no caso de co-expressão refere-se citoquinas {v.g., IL~ 2, IL-12, GM-CSF), moléculas indutoras de citoquina (v. g,, LeIF), moléculas co-estimuladoras ou, para respostas de HTL , proteínas de 1 igação a pan-DR (PADRE™, Epimmune,

San Diego, CA) . Os epítopos auxiliadores (HTL) podem ser unidos a sinais alvo intracelulares e expressos em separado dos epítopos de CTL expressos; tal permite a orientação dos epítopos de HTL para um compartimento celular diferente do dOS epítopos de CTL. Se necessário, tal poderá faci: litar 3. entr ciQci íUSi-S ef ícaz de epítopos de HTL em vias de HL A de classe II, melhorando assim a indução de HTL, Ao contrário da indução de HT L ou de -i- -i-i F a diminu ição específica da resposta imune Por CO" expressão d e molécula5 imunossupressoras {v.g., T GF-β) pode ser bené fica em certas doenças. É possível produzir quantidades terapêuticas d© plasmídeo de ADN, por exemplo, por fermentação em E. colh seguida de purificação. São utilizadas aliquotas do banco de células de trabalho para inocular meio de crescimento e deixadas crescer até à saturação em frascos de agitação °u num bio-reactor, de acordo com técnicas bem conhecidas. ^ plasmídeo de ADN pode ser purificado utilizando tecnologiaS de bio-separação convencionais, tais como resinas de 112 permuta aniónica em fase sólida disponibilizadas por QIAGEN, Inc. (Valência, Califórnia). Se necessário, é possível isolar ADN super-espiralado a partir de formas circulares abertas e lineares utilizando electroforése em gel ou outros métodos. 0 plasmídeo de ADN purificado podem ser preparado para injecção utilizando várias formulações. A mais simples destas compreende a reconstituição de ADN liofilizado em soluto salino estéril tamponado com fosfato (PBS). Esta abordagem, referida como "ADN desguarnecido", é actualmente utilizada para administração por via intramuscular (IM) era ensaios imunotera desejável plasmídeo clínicos. pêuticos de v um método 3cira se maximizar os efeitos cinas de ADN de minigene, poderá ser alternativo para a formulação de de ADN purificado

Foram já descritos vários métodos e poderão ficar disponíveis novas técnicas. Também é possível utilizar lípidos catiónicos, glicolípidos e lipossomas fusogénicos na formulação (ver, v.g., conforme descrito no documento WO 93/24640; por Mannino & Gould-Fogerite, BioTechniques 6(7): 682 (1988); na patente de

invenção norte-americanas n° 5 279 833; no documento WO 91/06309; e por Feigner, et al. , Proc. Natl Acad. Sei. USA 84: 7413 (1987 ) . Além disso, os péptidos e compostos referidos colec tivamente como protectores, interactivos, compostos não c o n densáveis (PINO tambér n podem ser complexados com plasmídeo de ADN purificado para influenciar variáveis, tais como estabilidade, dispersão intramuscular ou tráfico para órgãos ou tipos de células esoecíficos. como A sensibilização ensaio funcional de células alvo pode ser utilizada para. a expressão e apresent açao em. 113 HLA de classe I de epítopos de CTL codificados pelo mini gene. Por exemplo, o plasmídeo de A.DN é introduzido numa linhagem celular de mamífero que é adequada corno alvo para ensaios padrão de libertação de crómio CTL. 0 método de transfecção utilizado irá dependente da formulação final. É possível utilizar electroporação para ADN "desguarnecido", ao passo que lípidos catiónicos permitem a transfecção directa in vitro. Um plasmídeo que expresse a proteína fluorescente verde (GFP) pode ser co-transfectado para permitir o enriquecimento de células transfectadas por com para ise, utilizando a selecção de células activadas fluorescência (FACS). Estas células são então marcadas crómio 51 (5iCr) e utilizadas como células alvo linhagens de CTL específicas para o epítopo; a citól detectada pe~ libertação de 51, indica a produção, de CTL codificados pelo de HTL pode ser avaliada ensaios para avaliar a apresentação em HLA, de epítopos minigene. A expressão de epítopos de um modo análogo, utilizando actividade de HTL. A imunogenicidade in vivo constitui uma seaunda

abo rdagem pa ra test ar de minigene. Murgan hos de HLA humai ias ade qua> ADN . a dose o a v ia for muiação (v. g-, IM ncionalmente as formulações de ADN ransgénicos que expressam proteínas 5 são imunizados com o produto de ia de administraçao são dependentes da 'ara ADN em PBS, mtraperitoneal (i.p.) para ADN em complexo com lípido). Decorridos vinte e quatro dias após a imunização, os esplenócitos são recolhidos e e presença ae Pe! teste. Depoxs, são efectuados simulados novamente durante uma. semana, na xidos que codificam cada um qos eoítoDos em para céluias efectoras oe CTL, os ensaios quanto a citóiise de células alvo marcadas 114 com 51 Cr e carregadas com péptido, utilizando técnicas convencionais. A li se de células alvo que foram, sensibilizadas por HLA carregada com epitopos de péptido, gue correspondem aos epitopos codificados com minigene, demonstra que a vacina de ADN funciona para a indução in vivo de CTL. A iunogenicidade de epitopos de HTL é confirmada em murganhos transaénicos de um modo semelhante.

Em alternativa, acioos nucieicos podem er administrados utilizando administraçao balística, conforme descrito, por exemplo, na patente de invenção norte- americana 204 253. Utilizando es ta técnica, >ao :oní administradas partículas iidas apenas por ADN. De acordo com uma outra variante alternativa, é possível aderir o ADN a partículas, tais como partículas de ouro. X.C.2. Combinações de péptidos de CTL com péptidos auxiliadores de

As composições de vacina que compreendem pépti /Ί m J. podem ser modificadas, v.g.f transformadas em análogos, para proporcionar os atributos desejados, tais como período de semi-vida no soro melhorado, uma cobertura de população mais ampla ou uma imunogenicidade aumentada.

Por exemplo, a aptidão de um péptido para induzir actividade de CTL pode ser melhorada por meio da ligação do péptido a uma sequência que contenha pelo menos um epítopo que seja capaz de induzir uma reposta de células T possa ser ligado frequentemente os HTL são ligados O separador é :ras relativamente auxiliadoras. Embora um péptido de CTL directamente a um péptido auxiliador T, conjugados de epítopo de CTL/epítopo de através de uma molécula separadora, tipicamente constituído por moléculas neut 115 pequenas, tais como aminoácidos ou miméticos de aminoácidos, os quais sâo substancialmente não carregados sob conaiçoes fisiológicas. Os separadores são tipicamente s separaaoreí seleccionados entre, v.g., Ala, Gly ou neutros de aminoácidos não polares ou aminoácidos polares neutros. Faz-se observar que o separador facultativamente presente não precisa de ser constituído pelos mesmo resíduos e, assim, pode ser um hetero- ou homo-oligómero. Quando presente, o separador irá normalmente ser constituído por pelo menos um ou dois resíduos, mais habitualmente entre três e seis resíduos e por vezes 10 ou mais resíduos. O epítopo de péptido de CTL pode ser ligado ao epítopo de péptido auxiliador T directamente ou por meio de um separador no terminal amino ou no terminal carboxilo do péptido de CTL. O terminal amino do péptido imunogénico ou do péptido auxiliador T pode ser acilado.

De acordo com determi auxiliador T é aquele que é auxiliadoras presentes na .adas variantes, o péptido reconhecido pelas células T maioria de uma população geneticamente diversa. Tal pode ser efectuado por meio da selecção de péptidos que se ligam a muitas, à maioria ou a todas as moléculas de HL A de classe II. Como exemplos de tais aminoácidos que ligam muitas moléculas HL A de classe II refere-se sequências de antigénios, tais como o toxóide de tétano nas posições 830-843 (QYIKANSKFIGITE; SEQ ID NO: 651), proteína circunsporozoite de Plasmodium falciparum (CS) nas posições NO: 652), e pro posições 116-131 outros exemplos

378-398 (DIEKKIAKMEKA S SVFNVVNS; SEQ ID teína de 18 kDa de Streptococcus nas (GAVDSILGGVATYGAA; SEQ ID NO: 653) . Como refere-se péptidos que suportam um

supermotivo DR -4-7 ou qualquer um dos motivos DR3. 116

Em alternativa, é possível preparar péptidos sintéticos capazes de estimular linfócitos T auxiliadores, de um modo fracamente restrito a HLA, utilizando sequências de aminoacidos não encontradas na natureza (ver, v.g., o pedido de publicação de patente de invenção PCT n° WO 95/07707). Estes compostos sintéticos referidos como epítopos de ligação a Pan-DR (v.g., PADRE™, Epimmune, Inc., San Diego, CA) são concebidos para se ligar, mais preferencialmente, à maioria das moléculas HLA-DR (HLA de classe II humana.) . Por exemplo, concluiu-se que um péptido epitópico de ligação a pan-DR que possui cL fórmula: aKXVAAWTLKAAa (SEQ ID NO: 654), em que "X" π spresenta ciclo-hexilalanina, fenilalanina ou tirosina, e "a" representa D-alanina ou L-alanina, se .1 .1 Cf 3. à mai , 01Γ Ϊ 3. 003

alelos de HLA-DR e estimula a resposta de linfócitos T dos indivíduos, alternativa a um los os aminoacidos a forma de ácidos auxiliadores a partir da maioria independentemente do seu tipo de HLA. Uma epítopo de ligação a pan-DR compreende toc naturais "L" e pode ser proporcionado sob nuí :os qi codificam o epítopo. podem ser biológicas.

Os epítopos peptídicos de HTL também modificados para alterar as suas propriedades

Por exemplo, p aminoácidos psira assim, estender odem ser modi ficados para incluir D- aumentar a sua resistên cia a proteases e, o seu período de semi- -vida no soro, ou podem ser conjugados com outras moléculas, tais como lípidos, proteínas, hidratos de carbono e semelhantes, para. aumentar a sua actividade biológica. Por exemplo, um péptido T auxiliador pode ser conjugado com uma ou várias cadeias de ácido palmítico em qualquer um dos terminais am i. η o ou carbox i 1 o. 117

X.C.3. Combinações de péptidos de CTL com agentes de estimulação de células T

Em algumas variantes poderá ser desejável incluir nas composições farmacêuticas da invenção pelo menos um componente que estimule os linfócitos B ou os linfócitos T. os lípidos foram identificados como agentes capazes de estimular CTL in vivo. Por exemplo, é possível adicionar resíduos de ácido palmítico aos grupos ε- e α-amino de um resíduo lisina e depois ligá-los, v.g., via um ou mais resíduos de ligaçao, tais como Gly, Gly-GIy-, Ser, Ser-Ser, ou semelhantes, a um péptido imunogénico. 0 péptido lipidado pode então ser administrado c lirectamente n uma micela ou partícula, i: ncorporado nui η. lipossoma ou emulsion ado num ad j uvante, v.g., adjuvan te incompleto de Freund. De acordo com uma variant e preferida, uma compreende Lys, o qual composição imunogénica particularmente eficaz acido palmítico ligado a grupos ε-- e α-amino de está ligado por meio de uma ligação, v.g., Ser-Ser, ao terminal amino do péptido imunogénico.

Como outro exemplo de estimulação com lípidos de respostas de CTL, é possível utilizar lipoproteínas de ώ· coli, tais como tripalmitoí1-S-glicerilcisteinillseril- serina (P3CSS) para estimular CTL específicos do vírus quando covalentemente ligadas a um péptido adequado (ver, v. g. , Deres, et ai., Nature 342: 561, 1989). Os P3CSS, por exemplo, e o indivíduo para estimular peptiaos podem ser acoplados a 1-popépt, ido administrado a um ^specificamente uma reposta imune para o antigénio alvo. rt-j-ém do mais, uma vez que a indução de anticorpos de neutralização também pode ser estimulada com epítopos 118 118 conjugados com P3CSS, e possível combinar duas dessas composições para provocar, ma is efic.azm.ente, respostas humoral e mediadas por células.

X.C.4. Composições de vacina que compreendem DC estimuladas com péptidos CTL e/ou HTL

Uma compos içí v r-i r· ina pode

Kmpreenc administração ex vivo de um mistura de péptidos que suportam epitopo para PBMC, ou DC isoladas a partir destas, provenientes do sangue qo psciente· É possível uti J izar um. fármaco para facilitar a colheita de DC, tal como Progenipoietin™ (Pharmacia-Monsanto, St. Louis, MO) ou GM-CSF/IL-4. Após a estimulação aas DC com péptido e antes da re-infusão nos pacientes, péptidos não ligados. De as Dc são lavadas para remover acordo com esta variante, uma vacina compreende DC apresentam os epítopos esi

Ό 3 "O znnuladas com ídicos estimai péptidos

3.0.0 S complex que 3 Q O 3 com moléculas de HLA nas suas superfícies.

As péptido 158P1D7 células

DC

T podem ser estimuladas ex vivo com uma alguns dos quais estimulam respostas acultativamente, é possível incluir um auxiliadoras (HTL), tal como um péptido mistura de de CTL a péptido de de HLA de HLA de classe II fracamente restrito natural ou artificial, para facilitar a resposta de CTL. Assim, uma vacina de acordo com a invenção é utilizada para tratar um cancro que expresse ou que sobreexpresse 158P1D7. X.D. Imunoterapia adoptiva São utilizados peptioos antigenicos aparentadas com 158P1D7 para provocar uma respo sta de CTL e/ou HTL ex vi vo, também.. As células CTL ou HTL resultantes podem ser 119 utilizadas para tratar tumores em pacientes que não respondem a outras formas convencionais de terapia ou que não irao responder uma vacina terapêutica de péptido ou de ácido nucleico de acordo com a invenção. As respostas de CTL ou HTL ex vivo a um antigénio particular são induzidas por incubação em. cultura de tecidos de células precursoras de CTL ou HTL, ou geneticamente compatíveis, do paciente em lulas apresentadoras de dendríticas, e o péptido um período de incubação 7 a 28 dias), em que as e expandidas em células conjunto com uma fonte de cé antigénio (APC), tais como células imunogénico adequado. Decorrido adequado (tipicamente de cera de células precursoras são activadas fundidas no paciente, a destruição (HTL) da célula de tumor). As também poderá ser efectoras, as células são novamente in onde irão destruir (CTL) ou facilitar sua células alvo específica (v.gr., um células dendríticas transfectadas utilizadas como células presentadoras de antigénio. X.E. Administração de vacinas para fins terapêuticos ou profiláticos

As composições farmacêuticas e de vacina da invenção são tipicamente utilizadas para tratar e/ou prevenir um cancro da bexiga que expressa ou que sobreexpressa 158P1D7. Em aplicações terapêuticas, as composições de péptido e/ou de ácido nucleico são administradas a um paciente numa quantidade suficiente para provocar uma reposta eficaz de células B, CTL e/ou. HTL ao antigénio e para curar ou pelo menos parcialmente interromper ou retardar os sintomas e/ou complicações. Uma quantidade adequada para atingir tal efeito é definida como "dose terapeuticamente eficaz". As quantidades eficazes para esta utilização irao 120 depender, v.g. , da composição particular administrada, da via de administração, do estado e da gravidade da doença que se pretende tratar, do peso e do estado geral de saúdo do paciente e do julgamento do médico.

Para composições farmacêuticas, os péptidos imunogénicos, ou ADN que os codifica, são normalmente administr ados a um indivíduo que já tem um tumor que expressei 158P1D7. Os péptidos, ou o Ar )N que os codifica, podem ser administrados individualmente : ou como fusões de uma ou mais sequência s de péptidos. Os pacientes podem ser tratados com os pépt idos imunogénicos em separado ou em conjunto com outros tratamentos, ta is como cirurgia, consoante adequado. a administração deverá diagnóstico de cancro da deverá ser seguida por

Para utilizaçião terapêutica, normalmente ter inicio no primeiro bexiga associado a 158P1D7. Esta doses de reforço até pelo menos os sintomas serem substancialmente abatidos e durante um período após este. A variante da composição de vacina (isto é, incluindo, mas sem que isso constitua qualquer limitação, variantes tais como misturas de péptidos, polipeptidos poliepitópicos, minigenes ou CTL especificas de TAA ou células dendríticas estimuladas) administrada ao paciente pode variar de acordo comi o estado da doença ou com o estado gerai de saiúde do paciente. Por exemplo, num paciente com um tumor que expressa 158P1D7, uma vacina que compreende CTL específicos de 158P1D7 pode ser mais eficaz para matar células tumorais nu paciente com doença avançada do que variantes alternativas.

De um modo geral, é importante proporcionar uma quantidade de epítopo peptídico administrada através de uma 121 via de adminxstraçao que seja suficiente para estimular eficazmente uma resposta de células T citotóxicas; também é possível administrar composições que estimulam repostas de células T auxiliadoras de acordo com esta variante da invenção. idos entre cerca de 5 0 0 ug e nte com 70 quil ogramas. As Ldas entre cerca de 1,0 ug e j que pro s seguem. durante um

De um modo geral, a dosagem para uma imunização terapêutica inicial tem lugar num intervalo de unidade de dosagem em que o valor inferior é de cerca de 1, 5, 50, 100 ou 1000 ug e o valor superior é de cerca de 1000 0; 20000; 30000 ou 50000 pg. Tipicamente, os valores de dosagem para um ser humano estão compree regime de reforço ao longo de semanas a meses, podem ser administradas em função da resposta e do estado do paciente, conforme determinado pela medição da actividade específica de CTL e HTL obtida através do sangue do paciente. A administração deverá ser continuada até pelo menos sintomas clínicos ou testes de lóiboratórios indicarem que a neoplasia foi eliminada ou reduzida, e durante um período após este. As dosagens, vias de administração e regimes de dose são ajustados de acordo com metodologias conhecidas na especialidade.

De acordo com determinadas variantes, os péptidos e composições são utilizados em estados de doenças sérios, isto é, com perigo de morte ou situações potenciais de perigo de morte. Em tais casos, como resultado das quantidades mínimas de substâncias exógenas e da natureza não tóxica dos péptidos nas composições preferidas da invenção, é possível e pode ser considerado necessário pelo 122 médico assistente administrar excessos substanciais destas composições de péptidos em relação a estas quantidades de dosagem referidas.

As composições de vacina da invenção também podem ser utilizadas meramente como agentes profilácticos. De um modo geral, a dosagem para uma imunização profiláctica iniciai ocorre normalmente num intervalo de unidade de dosagem em que o valor inferior é de cerca de 1, 5, 50, 500 ou 100U pg e o valor superior é de cerca de 10000; 20000; 30000 ou 50000 pg. Os valores de dosagem para um ser humano estão tipicamente compreendidos entre cerca de 500 pg e cerca de 50000 pg por paciente com 70 quilogramas. Depois destci administração, seguem-se dosagens de reforço compreendidas entre cerca de 1,0 pg e cerca de 50000 pg de péptido administrado em intervalos definidos, compreendidos entre cerca de quatro semanas a seis meses, após a administração inicial de vacina. A imunogenicidade da vacina pode ser avaliada por medição da actividade especifica de CTL e HTL obtida a partir de uma amostra de sangue do paciente. ão pretendidas para a tópica, oral, nasal, forma de um creme oi

As composições farmacêuticas para tratamento terapêutico parentérica (v.g., sob a forma de um creme ou unguento tópico) . De preferência, as composições farmacêuticas são administradas por via parentérica, v.g., por via intravenosa, subcutânea, intradérmica ou intramuscular. Assim, a invenção proporciona composições para administração por via parentérica que compreendem uma solução dos péptidos imunogénicos dissolvidos ou colocados em suspensão num veículo aceitável e, de preferência, um veículo aquoso. 123 É possível utilizar diversos veículos aquosos, v.g., água, água tamponada, 0,8% de soluto salino, 0,3% d.e glicina, ácido hialurónico e semelhantes. Estas composições podem ser esterilizadas por técnicas de esterilização convencionais bem conhecidas ou podem ser esterilizadas por filtração. As soluções aquosas resultantes podem ser embaladas para utilização tal qual ou liofilizadas, em que a preparação liofilizada é combinada com uma solução estéril antes da administração.

As composições podem conter substâncias auxiliares farmaceuticamente aceitáveis consoante necessário para aproximar às condições fisiológicas, tais como agentes para o ajuste do pH e agentes de tamponamento, agentes para ajustar a tonicidade, agentes humectantes, conservantes e semelhantes, por exemplo , acetato c ie sódio, lactato de sódio, cloreto de sódio, cloreto de porassio, cloreto de cálcio, mono-laurato de sorbitano, oleato de trietanol- amina, etc. . _L U J_ i L L U. _L d Vy, KJ <3 κ A concentração dos péptidos nas farmacêuticas pode variar amplamente, isto é, desde um valor inferior a cerca de 0,1%, normalmente de 2% ou pelo menos de cerca de 2%, até um valor máximo de 20% a 50% ou superior em peso, sendo seleccionada principalmente por volumes de fluido, viscosidades, etc., de acordo com a via particular de administração seleccionada.

Uma rorma de dosagem unitária para humanos da composição de péptido é tipicamente incluída numa composição rarmacêutica que compreende uma dose unitária pareL seres humanos de um veículo aceitável, de preferência um veículo aquoso, e e administrada num volume de fluido que é conhecido pelos especialistas na matéria para 124 utilizaÇão na administração de tais composições as seres humanos (ver, v.g., Remington's Pharmaceutical Sciences, 17a Edição, A, Gennaro, Editor, Mack Publishing Co., Easton, Pennsylvania, 1985).

As proteínas e/ou os ácidos nucleicos que codificam a(s) proteína(s) , também podem ser administrados por meio de lipossomas, os quais também podem servir para: 1) dirigir a(s) proteína(s) para um tecido particular, tal como tecido linfóide; 2) para dirigir selectivamente para células doentes; ou .3) para aumentar o período de semi-vi da da composição de péptido. Os lipossomas compreende emulsões, espumas, micelas, monocamadas insolúveis, cristais líquidos, dispersões de fosfolípidos, camadas lamelares e semelhantes. Nestas preparações, o péptido que se pretende administrar é incorporado como parte de um lípossoma, por si só ou em conjunto comi uma molécula que se liga a receptor que prevalece entre as células linroides, tal como anticorpos monoclonais que se ligam ao antigénio de CD45, ou com outras composiçoes terapêuticas ou imunogénicas. Assim, os lipossomas carregados ou decorados com um péptido desejado podem ser dirigidos para o local de células linfóides, onde os lipossomas administram as composições de péptido. Os lipossomas para utilização de acordo com a invenção são formados a partir de rípiaos formadores de vesículas convencionais, os quais incluem normalmente fosfolípidos neutros ou carregados negativamente e um esterol, tal como colesterol. A selecçao dos lípidos é normalmente orientada tendo em consideração, v.g., o tamanho do lipossoma, a laoiliciaae a ácido e a estabilidade dos lipossomas na corrente sanguínea. Encontram-se disooníveis diversos métodos para a 125 preparaçao de lipossomas, conforme descrito por, v n Szoka, et ai., Ann. Rev. Biophys. Bioeng. 9: 467 (1980), e nas patentes de invenção norte-americanas nos 4 235 871, 4 501 728, 4 837 028 e 5 019 369.

Para alvejar células do sistema imune, um ligando que será incorporado no lipossoma pode compreender, v.g. anticorpos, ou seus fragmentos, específicos para os determinantes da superfície celular das células do sistema imune desejadas. Uma suspensão de lipossoma que contém um péptido pode ser administrada por via intravenosa, local, tópica, etc,., numa dose que varia de acordo com, inter ãliã, a via de administração, o péptido que se Pretende administrar e o estado da doença que se pretende tratar.

Para composições sólidas, como veículos sólidos não tóxicos convencionais que é possível utilizar refere-se, por exemplo, manitol, lactose, amido, estearato de magnésio, sacarina de sódio, talco, celulose, glicose, sacarose, carbonato de magnésio de qualidade farmacêutica e semelhantes. Para a administração por via oral, uma composição não tóxica farmaceuticamente aceitável é formada pela incorporação de qualquer um dos excipientes normalmente utilizados, tais como os veículos referidos anres e, geralmente, 10% a 95% de ingrediente activo, isto e, um ou vários peptidos, e, mais preferencialmente, numa concentração de 25% a 75%.

Parα d acutunistraçdO por via de aerossóis, os péptidos imunogénicos são preferencialmente administrados sob uma rorma finamente dividida em conjunto com um tensioactivo e um propulsor. As percentagens típicas dos péptidos são de cerca de 0,01% a 20% em peso e preferencialmente de cerca de o d 1 u'o. como é evideni-t;, o tensioactivo deverá ser não 126 tóxico e, de preferência, solúvel no propulsor. Coiro exemplos de tais agentes refere-se os ésteres ou ésteres parciais de ácidos gordos que contêm entre cerca de 6 e 22 átomos de carbono, tais como os ácidos capróico, octanóico, láurico, palmítico, esteárico, linoleico, linolénico, oiestérico e oieico, com um álcool poli—hídrico alifático ou um seu anidrido cíclico. Também é possível utilizar ésteres mistos, tais como glicéridos mistos ou naturais. 0 tensioactivo pode constituir cerca de 0,10% a 20% em peso da composição e de preferência cerca de 0,25% a 5%. O equilíbrio da composição é normalmente o propulsor. Também é possível incluir um veículo, se desejado, tal como, v.g., lecitina para administração por via intranasal. XI.) Variantes de 158P1D7 para diagnóstico e prognóstico

Tal como ciqui descrito, os polinucleótidos, polipeptidos, células T citotóxicas (CTL) reactivas, células T auxiliadoras (HTL) reactivas e anticorpos anti-polipeptido de 158P1D7 são utilizados em ensaios de diagnóstico, prognóstico e terapêuticos bem conhecidos que examinam as condições associadas ao crescimento celular desregulado, tal como no cancro da bexiga.

A 158P1D7 pode ser utilizada de um modo análogo, ou complementar, à combinação de antigénio associada à bexiga, a mucinas e a CE A, representada num estojo de diagnóstico designado por ImmunoCyfh. O ImmunoCyt é um ensaio comercialmente disponível para .identificar e monitorizar a presença de cancro da bexiga (ver, Fradet et al., 1997, Can j Urol, 4(3): 400-405). Também são utilizados vários outros marcadores de diagnóstico em contextos semelhantes, incluindo p53 e H-ras (ver, v.g., Tulchinsky et al., Int J 127

Mol Med, Jul. de 1999, 4 (1): 99-102 e Minimoto et al., Câncer Detect Prev, 2000; 24(1) : 1-12) . Assim sendo, esta descrição de polinucleótidos e polípeptidos de 158P1D7 (bem como de sondas de polinucleótidos de 158P1D7 e anticorpos anti-158PlD7 utilizados para identificar a presença destas moléculas) e das suas propriedades permite O ώ especialistas na matéria utilizar estas moléculas em métodos análogos aos aqui utilizados, por exemplo, em diversos ensaios G0 diagnóstico dirigidos ao exame de condições associadas ao cancro da bexiga.

Variantes típicas de métodos de diagnóstico que utilizam os polinucleótidos, polípeptidos, células T reactivas e anticorpos de 158P1D7 são análogos aos métodos de ensaios de diagnóstico bem estabelecidos que utilizam, v.g., polinucleótidos, polípeptidos, células T reactivas e anticorpos de PSA. Por exemplo, do mesmo modo que são utilizados polinucleótidos de PSA como sonda (por exemplo, na análise de Northern, ver, v.g., Sharief et al., Biochem. Mol. Biol. Int. 33(3): 567-74 (1994)) e iniciadores (por al., J. presença z a. ç a o da. cros da 158P1D7 8P1D7 ou exemplo, na análise por PCR, ver, v.g., Okegawa et Urol. 163(4): 1189-1190 (2000)) para observar a e/ou o nível de ARNm de PSA em métodos de monitori sobreexpressão de PSA ou da metástase de can próstata, é possível utilizar os polinucleótidos de aqui descritos para detectar a sobreexpressão de 15 de outros cancros que do mesmo modo que são para gerar anticorpos

a metástase de cancro da bexiga e expressam este gene. Em alternativa, utilizados os polípeptidos de PSA específicos parei PSA, os quais podem então ser utilizados para observar a presença e/ou o nível de proteínas de PSA em. métodos de monitorização da. sobreexpressão da proteína 12 PSA (ver, v.g., Stephan et (2000)) ou da metástase de v.g., Alanen et al., Pathol. (1996)), é possível utilizar aqui descritos para gerar an detecçâo da sobreexpressão de células da bexiga e de célu expressam este aene. al., Urology 55(4) ; 56 0-3 células da próstata (ver, Res. Pract. 192(3): 233-7 os polipeptidos de 1 59P1D7 zicorpos para utilização na 158P1D7 ou da metástase de .las de outros cancros que

Especifícamente, uma vez que as metastases implicam o movimento de células cancerígenas a partir de um órgão de origem (bexiga) para uma área diferente do corpo (tal como um nódulo linfático) , é possível utilizar ensaios que examinam uma amostra biológica quanto à presença de células que expressam polinucleótidos e/ou polipeptidos de 158P1D7 para proporcionar evidências de metástases. Por exemplo, no caso de uma amostra biológica proveniente de um tecido que nao contém normalmente células que (nódulo 1i ϊ :onter células expressam 158P1D7 expressam 158P1D7, tal como a expressão de 158PID7 observada em xenoenxertos LAPC4 e LAPC9 isolsLdos a partir de nódulos linfáticos e de metástases ósseas, respectivamente, esta conclusão constitui uma indicação de metástase.

Em alternativa, os polinucleótidos e/ou polipeptidos de 158P1D7 podem ser utilizados para proporcionar evidências de cancro da bexiga, por exemplo, quando células numa amostra biológica que não expressara normalmente 158P1D7 ou que expressam 158P1D7 num nível diferente são encontradas a expressar 158P1D7 ou apresentam uma expressão aumentada de 158P1D7.

Em ainda p tais ensaios, retender qerax os especialistas na provas suplementares matéria podem de metástases 129 129 presença além. de por mexo de testes da amostra biológica quando à de um. marcador restrito a um segundo tecido (para 158P1D7), tal v.g.f Fradet et et ai., 2001, fragmentos de polinucleótidos como IiranunoCyt™, PSCA, etc. (ver, ai., 1997, Can J Urol, 4(3): 400-405; Amara Câncer Res 61: 4660-4665). Tal como os p o 1 i n u c 1 e ó t i .dos de PSA e variantes de são utilizadas por especialistas na matéria para utilização em métodos para monitorizar PSA, os fragmentos de polinucleótidos de 158P1D7 e variantes de polinucleótidos são utilizados de um modo análogo. Em particular, os polinucleótidos de PSA típicos utilizados em métodos para monitorizar PSA são sondas ou iniciadores constituídos por fragmentos da sequência de ADNc de PSA. Para ilustrar este facto, os iniciadores utilizados para amplificar por PCR um polinucleótido de PSA deverão incluir menos do que a sequência de PSA total para actuar na reacção em cadeia de polimerase. No contexto de tais reacções de PCR, os especialistas na matéria criam, normalmente diversos fragmentos diferentes de polinucleótidos que podem ser utilizados como iniciadores de modo a amplificar porções diferentes de um polinucleótido relevante ou para opt.im.izar as reacções de iinplif icação (ver, v . y . , 'aetano-Anolles, G. rsiotechnique: 25(3): 472-476, 478-480 (1998); Robertson et al. , Methods

Mo 1. Biol. 98: 121-154 (1998)). Uma ilustração adicional da utilização de tais fragmentos é apresentada no exemplo 4, no qual um. fragmento de polinucleótido de 158P1D7 é utilizado como sonda para mostrar a expressão de ARN de 158P1D7 em células cancerígenas. Além disso, variantes de sequências de polinucleótidos são utilizadas tipicamente :omo .n - '"raaores sondas para os ARNm correspondente: em. 130 130 análises por PCR e Fetal Diagn. Ther. Protocols In Molec de Northern (ver, v.g., Sawai et al., 1996 Nov-Dez 11(6): 407-13 e Current alar Biology, Volume 2, Unidade 2,

Frederick M.

Ausubel et al, eds 1995)). Os fragmentos e variantes de poli que s ã o capazes polinucleótidos nucleótidos são úteis neste contexto visto de se ligar a uma sequência alvo de (v.g., o polinucleótido de 158P1D7 apresentado na SEQ ID NO: 655) sob condições de elevado rigor.

Além do mais, os polipeptidos de PSA que contêm, um epítopo que pode ser reconhecido por um anticorpo ou por uma célula T que se liguem especificamente a esse epítopo são utilizados em métodos para monitorizar PSA. Os fragmentos de polipeptido de 158P1D7 e análogos e variantes de polipeptido também podem ser utilizados de um modo análogo. Esta prática de utilização de fragmentos de polipeptido ou variantes de polipeptido para gerar anticorpos (tais como anticorpos ou células T anti-PSA) é típica na especialidade, sendo utilizados diversos sistemas, tais como proteínas de fusão, pelos especialistas na matéria (ver, v.g., Current Protocols In Molecular

Biology, Volume 2, Unidade 16, Frederick M, Ausubel et al. eds., 1995). Neste contexto, cada epítopo actua de modo a proporcionar a arquitectura com a qual um anticorpo ou uma célula T são reactivos. Tipicamente, os especialistas na matéria criam fragmentos diferentes de polipeptido que podem ser utilizados de específicas para porções modo a gerar respostas imunes diferentes de um polipeptido cLHcL 939 um. relevante (ver, v.g., patente de invenção norte-ameri n° 5 840 501 e patente de invenção norte-americana n°5 533). Por exemplo, poderá ser preferível utilizar 131 polipeptido que compreende um dos motivos biológicos de I08PID / aqui descritos ou uma subsequência que suporte um. motivo que seja facilmente identificável por um especialista na matéria com base em motivos disponíveis na especialidade. Os fragmentos, variantes ou análogos de polipeptido são tipicamente úteis neste contexto desde que compreendem um epítopo capaz de gerar um anticorpo ou uma célula T específica para uma sequência polipetídica alvo (v.g., o polipeptido de 158P1D7 apresentado na SEQ ID NO: 657) .

Tal como aqui mostrado, os polinucleótidos e polipeptidos de 158P1D7 (bem como as sondeis de polinucleótido de 158P1D7 e anticorpos ou células T anti-158P1D7 utilizadas para identificar a presença destas moléculas) exibem propriedades específicas que os torna

Os ensaios os do gene uma doença utilizados úteis para o diagnóstico de cancros da bexiga, de diagnóstico que medem a presença de produt 158P1D7 para avaliar a presença ou o início de aqui descrita, tal como o cancro da bexiga, são para identificar póicientes parei medidas preventivas ou para nova monitorização, tal a PSA para monitorizar tais como polinucleótid como tem vindo a ser com êxito com o cancro da próstata. Materiais, :> s e polipeptidos de 158P1D7 (bem como sondas de polinucleótido de 158P1D7 e anticorpos anti-158P1D7 utilizados para identificar a presença destas moléculas), satisfazem a necessidade na especialidade para moléculas que possuem características semelhantes ou complementares às bexiga. Por último de diagnóstico, descritos possuem de PSA para situações de cancro da , para além da sua utilização em ensaios os polinucleótidos de 158P1D7 aqui diversas outras utilidades, tais como a 132 132 na identificação -1 r Z a Ç a Ο cie anormalidades cromossómicas oncogenéticas associadas na região cromossómica que é circunscrita pelo gene 158P1D7 gene (ver exemplo 3 seguinte) . Além do mais, para além da suai utilização em ensaios de diagnóstico, as proteínas e polinucleótidos aparentadas com 158P1D7 aqui descritos possuem outras utilidades, tais como a sua utilização em análises forenses de tecidos de origem desconhecida (ver, v.çr.f Takahama K Forensic Sei Int, 28 de Jun. de 1996; 80(1-2): 63-9).

Além disso, as proteínas ou polinucleótidos aparentadas com 158P1D7 podem ser utilizados para tratar uma condição patológica caracterizada pela sobreexpressão de 158P1D7. Por exemplo, a sequência de aminoácidos ou de ácidos nucleicos da figura 2 ou figura 3, ou fragmentos de qualquer uma destas , pode ser utilizada para gerar uma resposta irr iune para o antigénio de 158P1D7. Os anticorpos ou o u l r a s molécula.·: 5 que reajan í com 158P1D7 podem ser utilizados para modular a função desta molécula, proporciona ndo assim um benefício terapêutico. XII.) Inibição da função da proteína 158P1D7 São a seguir descritos diversos métodos e composições parõi a inibição da ligação de 158P1D7 ao seu parceiro de ligação ou da sua associação com outras proteínas, bem como métodos para inibir a função de 158P1D7. XII.A.) Inibição de 158P1D7 com anticorpos intracelulares

De acordo com uma abordagem, um vector recombinante que codifica anticorpos de cadeia simples que se ligam especificamente a 158P1D7 são introduzidos em células que 133 expressam 158P1D7 através de tecnologias de transferência de genes. Assim sendo, o anticorpo anti-158PlD7 de cadeia simples codificado é expresso intracelularmente, liga-se à proteína 158P1D7, inibindo assim a sua função. Os métodos para a manipulação de tais anticorpos de cadeia simples intracelulares são bem. conhecidos. Tais anticorpos intracelulares, também conhecidos como "intracorpos", são especificamente dirigidos a um compartimento particular dentro da célula, proporcionando controlo sob o local onde a actividade inibitória do tratamento é focada. Esta tecnologia foi aplicada com sucesso na especialidade (para uma descrição, ver Richardson e Marasco, 1995, TIBTECH vol. 13). Os intracorpos mostraram eliminar virtualmente a expressão de outro modo abundante de receptores de superfície de células (ver, v.g., Richardson et ai., 1995, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 92: 3137-3141; Beerli et ai, 1994, J. Biol. Chem. 289: 23931-23936; Deshane et ai., 1994, Gene Tber. 1: 332-337).

Os anticorpos ae cadeia simples compreendem os domínios variáveis de caceia pesacia e leve unidos por um polipeptiao ligaQor fiexiveí e são expressos como um polipeptido individual. Facultativamente, os anticorpos de cadeia simples sao expressos como um fragmento da região variável de cadeia simples unidos à região constante da cadeia leve. Sinais ae trafico intracelular bem conhecidos são manipulados em vectores polinucleotídicos recombinantes que codificam tais anticorpos de cadeia simples de modo a. dirigir com precisão o intracorpo para o compartimento intraceiuxar desejado. Por exemplo, os intracorpos dirigidos para o retículo endoplásmico (ER) são manipulados de modo a incorporar um péptido líder e, facultativamente, 134 um sinal de retenção de ER no terminal C, tal como o motivo de aminoácido KDEL. Os intracorpos que se pretende que exerçam a actividade no núcleo são manipulados para incluir um sinal de localização nuclear. Os radicais lipidos são unidos aos intracorpos de modo a prender o intracorpo ao lado citosólico da membrana de plasma. Os intracorpos também podem ser dirigidos para exercer função no citosol. Por exemplo, os intracorpos citosólicos são utilizados paira sequestrar factores dentro do citosol, evitando assim que estes sejam transportados para o seu destino celular natural.

Os intracorpos podem ser utilizados parei capturar 158P1D7 no núcleo, evitando assim a sua actividade dentro do núcleo. Os sinais dirigidos ao núcleo são manipulados em tais intracorpos de 158P1D7 de modo a alcançar o alvo desejado. Tais intracorpos de 158P1D7 são concebidos paira se ligarem especificamente a um domínio particular de 158P1D7. De acordo com outra variante, os intracorpos citosólicos que se ligam especificamente à proteína 158P1D7 são utilizados paira evitar que a 158P1D7 ganhe acesso ao núcleo, evitando assim que esta exerça qualquer actividade biológica no núcleo (v.g., evitando que 158P1D7 forme complexos de transcrição com outros factores).

Para se dirigir especificamente a expressão de tais intracorpos para células particulares, a transcrição do intracorpo é colocada sol ^ controlo regulatório de um promotor e/ou potenciador específico do tumor adequado. Para dirigir a expressão do intracorpo especificamente para a bexiga, por exemplo, é possível utilizar o promotor e/o o promotor/potenciador de PSCA (ver, por exemplo, a patente de invenção norte---americana n° 5 919 652, publicada a. 6 de 135 Julho de 1999 e Lin et ai (19 9 5) ) . PNAS, USA 92(3) 679-683 XII.B.) Inibição de 158P1D7 com proteínas recombinantes

De ligam-se exemplo, 15 8 P1D 7 acordo com outra abordagem, moléculas recombinantes a 158P1D7, inibindo assim a função de 158P1D7. Por estas moléculas recombinantes evitam ou inibem que ganhe acesso/se ligue ao seu parceiro de ligação, ou parceiros, ou se associe a outras proteínas. Tais moléculas recombinantes podem, por exemplo, conter a parte reactiva de uma molécula de anticorpo específica de 158P1D7. De acordo com uma variante particular, o domínio de ligação de 158P1D7 de um parceiro de ligação de 158P1D7 é manipulado numa proteína de fusão dimérica, em que a fusão compreende dois domínios de ligação do ligando de 158P1D7 ligados à porção Fc de uma IgG humanei, tal como

IgGl num. porção de IgG pode conter, por exemplo, os domínios CH2 e CH3 e a CH1. tais proteínas de sob uma forma solúvel associado à expressão fusão dimérica se liga região charneira, mas não o domínio fusão diméricas são administradas a pacientes de sofrem de um cancro de 158P1D7, em que a proteína de espeeificamente a 158P1D7 e bloqueia. a interaeção de 158P1D7 com um parceiro de ligação. Tais proteínas de fusão diméricas são ainda combinadas em proteínas multiméricas, utilizando tecnologias de ligação de anticorpos conhecidas. XII.C.) Inibição da transcrição ou tradução de 158P1D7 transcr 158P1D7 acordo com uma abordagem, um método para inibir a ção do gene '15 8P1D7 compreende o contacto do gene com. um polinucleótido anti-sense de 158P1D7. De 136 acordo com outra abordagem, um método para inibir a tradução de ARNm de 158P1D7 compreende o contacto do ARNm de 158P1D7 com um polinucleótido anti-sense. De acordo com outra abordagem, uma ribozima específica de 158P1D7 é utilizada para clivar a mensagem de 158P1D7, inibindo assim a tradução. Tais métodos com base em anti-sense e ribozimas também podem ser dirigidos às regiões reguladoras do gene 158P1D7, tais como os elementos promotores/potenciadores de 158P1D7. De igual modo, as proteínas capazes de inibir um factor de transcrição do gene 158P1D7 são utilizadas para inibir a transcrição de ARNm de 158P1D7. Os vários polinucleótidos e composições úteis nos métodos supramencionados foram já descritos antes. A utilização de moléculas anti-sense e moléculas de ribozima para inibir a transcrição e a tradução é bem conhecida na especialidade. Há outros factores que inibem a transcrição de 158P1D7 interferindo com a activação transcricional de 158P1D7 que também, são úteis para o tratamento de cancros da bexiga que expressam 158P1D7. De igual modo, os factores que interferem com o processamento de 158P1D7 são úteis para o tratamento de cancros da bexiga que expressam 158P1D7. XII.D) Considerações gerais para estratégias terapêuticas

As tecnoxogias de trcinsferência de genes e terapia de genes podem ser utilizadas para administrar moléculas polinucreótidas terapêuticas a células tumorais que sintetizam 158P1D7 (isto é, moléculas anti-sense, ribozima, polinucleótidos que codificam intracorpos e outras moléculas inibidoras de 158P1D7). São conhecidas na especialidade diversas abordagens de terapia de aenes. Os vectores recombinantes que codificam polinucleótidos anti- 137 sense de j. 5 8P j_D /, ribozimas, factores capazes de interferir com a transcrição de 158P1D7 e outros, podem ser administrados a células tumorais alvo, utilizando abordagens de terapia de genes.

As abordagens terapêuticas anteriores podem ser comDÍnaGSS com. gua.lguer um dos vários regimes d.e terapia, cirúrgicos, quimioterapêuticos ou de radiação. As abordagens terapêuticas da invenção podem permitir a utilização de dosagens reduzidas de quimioterapia (ou de outras terapias) e/ou uma administração menos frequente, que constitui uma vantagem para os pacientes e, em particular, para aqueles que não toleram bem a toxicidade do agente quimioterapêutico. A actividade anti-tumor de uma composição particular (v.g,, molécula anti-sense, ribozima, intracorpo), ou de uma combinação de tais composições, pode ser avaliada utilizando vários sistemas de ensaio in vitro e in vivo. Os ensaios in vitro que avaliam a actividade terapêutica compreendem ensaios de crescimento celular, ensaios de ágar-ágar leve e outros ensaios indicativos da actividade promotora do tumor, ensaios de ligeçao capazes de determinar a extensão para a qual . a c omp o s i ç õ e s terapêut ica irá inibir a ligação de 158P1D7 a um parceiro de ligaç ão, etc. . E possível avaliar in vivo o efeito de uma composição terapêutica de 158P1D7 num modelo animal adequado. Por exemplo, é possível utilizar modelos de cancro da bexiga xenogénicos, em que explantes de cancro da bexiga humano ou tecidos de xenoenxertos de passagem são introduzidos em animais imunocomprometidos, tais como murganhos desguarnecidos ou SCID (Shibayama et al., 1991, j íjrol., 138 146(4): 1136-7; Beecken et ai·; 2000, Urology, 56(3): 521-526). A eficácia, pode ser prevista utilizando ensaios que medem a inibição da formação do tumor, a regressão do tumor ou metástase e semelhantes.

Os ensaios in vivo que avaliam a promoção de apoptose são útei s para avaliar composições terapêuticas. De acordo com uma variante, xenoenxertos de murganhos que suportam tumores tratSLdos com a composição terapêuti ca podem ser examinados quanto à presença focos apoptóticos e comparados com murganhos que suportam xenoenxerto de controlo não tratados. A extensão de focos apoptóticos encontrados em tumores dos murganhos tratados proporciona uma indicação da eficácia terapêutica da composição.

As composições terapêuticas utilizadas na prática dos métodos referidos podem ser formuladas em composições farmacêuticas que compreendem um veiculo adequado para o método de administração desejado. Como veículos adequados refere-se qualquer material que quando combinado com a composição terapêutica mantenha a função anti-tumor da composição terapêutica e seja geralmente não reactivo com o sistema imune do paciente. Como exemplos refere-se, mas sem que isso constitua qualquer limitação, qualquer um dos diversos veículos farmacêuticos convencionais, tais como soluções estéreis de soluto salino tamponado com fosfato água bacteriostática e semelhantes (ver, Remington’s Pharmaceutical Sciences 16a Edição, A. Osal., Ed,, 1980),

As formulações terapêuticas podem ser solubilizadas e administradas por meio de qualquer via capaz de administrar a composição terapêutica ao local do tumor. Como via^ de administração potencialmente eficazes refere-se, mas sem que isso constitua qualquer limitação, as vias intravenosa 139 parentérica, intraperitoneal, intramuscular, intra-tumor, intradérmica, intra-órgão, ortotópica e semelhantes. Uma formulação preferida para injecção intravenosa compreende a composição terapêutica numa solução de água bacteriostática preservada, água não preservada estéril e/ou diluída em cloreto de polivinilo ou sacos de polietileno que contêm 0,9% de cloreto de sódio estéril para injecção, USP. As preparações terapêuticas de proteína podem ser liofilizadas e armazenadas como pós estéreis, de preferência sob vácuo, e depois reconstituídas em água bacteriostática (que contém, por exemplo, o conservante álcool benzilico) ou em água estéril antes da injecção.

Os protocolos de dosagem e de administração para o tratamento de cancros da bexiga utilizando os métodos descritos irão variar com o método e o cancro alvo e irão normalmente depender de diversos outros factores como é do conhecimento na especialidade. XIII.) Estojos

Os estojos podem compreender um veículo, uma embalagem ou um recipiente que é compartimentado de modo a receber um ou vários recipientes, tais como frascos, tubos e semelhantes, em que cada um dos recipientes compreende um dos elementos separados que se pretende utilizar no método. Por exemplo, o recipiente pode compreender uma sonda que é ou que pode ser marcada de modo a ser detectável. Tal sonda pode ser um anticorpo ou um polinucleótido específico para uma proteína conotada com 158P1D7 ou um gene 158P1D7 ou uma mensagem, respectivamente. No caso de se utilizar no método hibridação de ácido nucleico para detectar o ácido nucleico alvo, então o estojo também pode ter recipientes que contêm 140 nucleótidu(s) para a amplificaçao da sequência de ácido nucieico alvo e/ou um recipiente que contém um meio repórter, tal como uma proteína de ligação a biotina, tal como aviaina ou estreptavidina, ligada a uma molécula repórter, tal como um marcador enzimático, fluorescente ou um radioisótopo. O estojo pode incluir toda ou parte da sequência de aminoácidos da figura 2 ou figura 3 ou seus analogos, ou moléculas de ácido nucieico que codificam tcLÍs sequências de aminoácidos.

Tipicamente, os estojos podem compreender o recipiente descrito antes e um ou mais recipientes diferentes que compreendem os materiais desejáveis sob o ponto de vista lentms . comercial e do utilizador, incluindo tampões, dili filtros, agulhas, seringas e inserções de embalagem com as instruções para utilização.

Um marcador pode estar presente no recipiente para indicar que a composição é utilizada para uma terapia especifica ou para uma aplicação não terapêutica, e pode também indicar direcções para utilização in vivo ou m vitro, tais como as descritSLS antes. As direcções e/ou outras informações também podem ser incluídas numa etiqueta ou num inserção que é incluída no estojo.

EXEMPLOS Há vários aspectos da invenção que são ainda descritos e ilustrados por meio dos diversos exemplos seguintes, os caiais não pretendem limitar o âmbito da invenção. 141 _Li_isolamento—gerado por SSH de um fragmento de ADNc do gene 158P1D7

Pcird se isolar genes que são sobreexpressos no cancro da bexiga utilizou-se o procedimento de hibridação subtractiva por supressão (SSH) utilizando ANDc proveniente de Lecxdos de cancro ou bexiga, incluindo carcinoma de células transicionais. A sequência de ADNc SSH de 158P1D7 foi obtiaa a partir oe um lote de cancro da bexiaa menos a subtr acçao as ADí 4c de bexiga normal. Também foi incluído no ANDc controlador proveniente de outros 9 tecido; 5 normais. 0 ADNc de 158P1D7 foi i rlpnf Ί d- \_» 111. ! ficado como tendo uma elevada expressão no loue de tecido de cancro da bexiga, com uma expressão reduzida observada num lote restrito de tecidos normais. A sequência de ADN SSH de 231 pb (figura 1) possui uma homologia elevada (identidade de 230/231) em relação a uma proteína hipotética FLJ22774 (GenBank n° de adesão XM_033183) proveniente de um clone genómico do cromossoma 13. Um clone de ADNc de 158P1D7 (TurboScript3PX) de 2555 pb foi isolado a partir de ADNc de cancro de bexiga, igura apresentando um ORF de 841 aminoácidos (figura 2 3) . A proteína 158P1D7 possuí uma sequência de sinal e um domínio transmembranar e prevê-se que esteja localizada na superfície da célula utilizando a aplicação informática PSORT-I (URL psort.nibb.ac.jp:8800/form.html). A análise da sequência aminoácidos de 158P1D7 mostra uma identidade de 100% ao longo da região de 798 aminoácidos em relação a uma proteína hipotética humana FLJ22774 (n° de adesão ao n° de adesão ao GenBank XP_033182, figura 4). 142

Materiais e métodos

Tecidos humanos >ac ientes com cancro da bexiga foram

Os tecidos de adquiridos a partir de diversas fontes, tais como a partir de NDRi (Philadelphia, PA) . 0 ARNm para alguns tecidos normais foi adquirido a Clontech, Paio Alto, CA.

Isolamento de ARN

Os tecidos foram homogeneizados em reagente Trizol (Life Technologies, Gibco BRL) utilizando 10 mL/g de tecido de ARN total isolado. O poli A-ARN foi purificado a psLrtir do ARN total utilizando os estojos mini e mídr 'Oiigotex mRNA' de Qiagen. 0 ARN total e o ARNm foram quantificados por análise espectrofotométrica (O.D. 260/280 nm) e analisados por electroforése em gel. 01iqonuc1e ó t i d o s -igonucleótidos

Foram utilizados os seguintes purificados por HPLC. DPNCDN (iniciador da síntese de ADNc); 5 ' TTTTGATCAAGCTT3o3 ' (SEQ ID NO: 661)

Adaptador 1: 5'CTAATACGACTCACTATAGGGCTCGAGCGGCCGCCCGGGCAG3' (SEQ ID NO: 662) 3.GGCCCGTCCTAG5' (SEQ ID NO: 663)

Adaptador 2:

5!GTAATACGACTCACTATAGGGCAGCGTGGTCGCGGCCGAG3! ( SEQ ID NO:6 6 4) 3'CGGCTCCTAG5' (SEQ ID NO: 665)

Iniciador 1 de PCR: 143 5'CTAATACGACTCACTATAGGGC3' (SEQ ID NO: 666) Iniciador encaixado (NP)1; 5'TCGAGCGGCCGCCCGGGCAGGA3' (SEQ ID NO: 667) Iniciador encaixado (NP)2: 5'AGCGTGGTCGCGGCCGAGGA3’ (SEQ ID NO: 668).

Hibridação subtractiva por supressão

Utilizou-se a hibridação subtractiva por supressão (SSH) para identificar ADNc que correspondera aos genes que podem ser expressos diferencialmente no cancro da bexiga. Na reacção de SSH foi utilizado ADNc proveniente de tecidos de cancro da bexiga e tecidos normais. A sequência do gene 158P1D7 foi obtida a partir de um lote de cancro da bexiga menos a subtracção de ADNc de bexiga normal. A sequência de ADN SSH (figura 1) foi identificada. 0 ADNc proveniente do lote de tecidos normais de bexiga foi utilizado como fonte do ADNc "controlador", a passo que o ADNc proveniente de um lote de tecidos de cancro da bexiga foi utilizado como fonte de ADNc para "teste". Os ADNc de cadeia dupla que correspondem aos ADNc de prova e controlador foram sintetizados a partir de 2 pg de poli (A)+ —ARN isolado a partir de tecido de xenoenxerto relevante, utilizando o estojo de subtracção de ADNc com selecção por PCR de CLONTECH e 1 ng do oligonucleôt ido DPNCDN, enquanto iniciador. A síntese da primeira e segunda cadeias for efectuada tal como descrito no manual do utilizador do estojo (protocolo CLONTECH n° PT1117-1, n° catálogo: K1804-1). 0 ADNc resultante foi digerido com Dpn li durante 3 horas 0 ADNc digerido foi extraído com fenol/ /clorofórmio (a 1:1) e deixado precipitar em etanol. 144 0 ADNc controlador foi gerado por combinação numa proporção de 1:1 de ADNc digerido por Dpn II proveniente de uma fonte de tecido relevante (ver supra) com uma mistura de ADNc digeridos provenientes de nove tecidos normais: estômago, músculo do esqueleto, pulmão, cérebro, fígado, rim, pâncreas, intestino delgado e coração. 0 ADNc de prova foi gerado por diluição de 1 pL de ADNc digerido por Dpn II proveniente da fonte de tecido relevante (ver supra) (400 ng) em 5 pL de água. O ADNc diluído (2 p.L, 160 ng) foi então ligado a 2 pL do adaptador 1 e do adaptador 2 (10 pM) , em reacções de ligação em separado, num volume total de 10 pL, a 16°C de um dia para o outro, utilizando 400 u de ligase de ADN T4 (CLONTECH). A ligação foi terminada com 1 pL de EDIA 0,2 M e aquecimento a 72°C durante 5 minutos. A primeira hibridação foi efectuada por meio da adiçao de 1,5 pL (600 ng) de ADNc controlador a caca um de dois tubos que contém 1,5 pL (20 ng) de ADNc de prova ligado ao adaptador 1 e ao adaptador 2. Num volume final de 4 pL, cobriu-se as amostreis foram cobertas com oleo mineral, submeteu-se a desnaturação num dispositivo de ciclos térmico a 98 °C durante 1,5 minutos e depois deixou-se hibridar durante 8 horas a 68°C. Misturou-se então os produtos das duas hibridações com uma quantidade suplementar de 1 pL de ADNc controlador desnaturado no momento e deixou-se hibridar de um dia para o out.ro a 6 8 °C. Diluiu-se então a segunda hibridação em 200 μη ae Hepes 20 mM, PH 8,3, NaCl 5 0 mM, EDTA 0,2 mM, aqueceu-se a 7 0°C durante 7 minutos e armazenou-se a -20°C. 145

Amplirícaçao por PCR, clonagem e sequenciação de fragmentos de gene gerador por SSH reacções de a ampl ificar fragmentos d e genes provenientes de : SSH, foram efectua.das duas ainplif icações de :acção de PCR primária, adicionou-se 1 pL B hiforic laçao final diluída a 1 uL do iniciador 1 de PCR (10 μΜ), 0,5 pL de mistura de dNTP (10 μΜ), 2,5 pL de 10 x tampão de reaeção (CLONTECH) e 0,5 pL de 50 x mistura de polimerase de ADNc 'Advantage' (CLONTECH) num volume final de 25 pL. A reaeção de PCR 1 foi ef ectuada utilizando as condições seguintes: 75°C durante 5 minutos, 94°C. durante 25 segundos, depois 27 ciclos a 94°C durante 10 segundos, 66 °C durante 30 segundos, 72 °C durante 1,5 minutos. Foram efectuadas cinco reacções de PCR primárias em separado para cada experiência. Os produtos foram reunidos e diluídos a 1:10 com água. Para a reaeção de PCR secundária, adicionou-se 1 pL da mistura de reaeção de PCR reunida e diluída à mesma, mistura, de reaeção utilizada para a 1, com a excepção de se terem utilizado os iniciadores NP 1 e NP2 (10 pM) em vez do iniciador 1 de PCR. A PCR 2 foi efectuada utilizando 10 a 12 ciclos a 94°C durante 10 segundos, 68°C durante 30 segundos e 72°C durante 1,5 minutos. Os p>rodutos de PCR foram analisados utilizando electroforése em gel de agarose a 2%.

Os produtos de PCR foram inseridos num pCR2.1 utilizando o estojo de clonagem em vector T/A (Invitrogen). As E. coli transformadas foram submetidas a selecção por azul/branco e por ampicilina, As colónias brancas foram seleccionados, colocadas em placas com 96 cavidades e deixadas a desenvolver em líquido de cultura de um dia para o outro. Para identificar as inserções, a amplificação por 146 PCR foi efectuada era 1 mL de cultura de bactérias utilizando as condições de PCR1 e NP 1 e NP 2 como iniciadores. Os produtos de PCR foram analisados utilizando electroforése em gel de agarose a 2%. _ Λ Λ Ο.

Armazenou-se os clones bacterianos era glicerol a zuo num formato de 96 cavidades. Prepar -se o adi ADN plasmídeo, sequenciou-se e submeteu-se a pesquisas de homologia de ácidos nucleicos deis bases de dados GenBank, dBest e NCI-

Análise de expressão de RT-PCR

Os ADNc de primeira cadeia podem ser gerados a pcLrtir de 1 pg de ARNm com uti 1 i z a: ndo o sistema de iniciação com oligo (dT)12-18, ré-amplificação sobrescrito Gibco-BRL. 0 protocolo do fabricante foi utilizado, o qual incluía uma incubação durante 50 minutos a 42°C com transcriptase inversas e subsequente tratamento com RNAse H a 3 7°C durante 2 0 minutos. Depois de se completar a reacçáo, o volume pode ser aumentado até 200 uL com água, antes da normalizaçao. Os ADNc de primeira cadeia provenientes de 16 tecidos normais humanos podem ser obtidos a partir da Clontech. Ά normalização dos ADNc de primeira cadeia a partir de múltiplos tecidos foi erectuada por meio da utilização dos iniciadores 5’atatcgccgCgCtcgtcgtcgacaa3' (SEQ ID NO: 669) ttgtagaagg 31 (SEQ ID NO: 6 7 0) p ara Os ADNc de primeira cadeia (5 UL) um v o 1 ume t o t al de 50 pL que contém dttTp 0,2 μΜ cada, 1 X tampão de PCR 0 ΠΜ, MgCl2 1, 5 mM, KC1 50 mM, pH 8 ,3) ; ADN Klentaq (Clontect l) . E possi ve 1 e 5'agccacacgcagctcattgij amplificar β-actim foram amplificados num e 1 X polimerase dt 147 147 remover cinco pL da reacçao de PCk aos 18, 20 e 22 ciclos s e ut i1iz ar para eiectroforése em gel de agarose. A PCR -fo Ί efectuada utilizando um dispositivo de ciclos térmi co da MJ Research sob as condições seguintes: 3. desnaturação inic ial pode ser a 94°C durante 15 segunaos e depois 18, 2 0 e 22 ciclos a 94 °C durante 15, 65°C durante 2 minutos, 12' durante 5 segundos. Foi efectuada uma extensão final a 72' igarose, durante 2 minutos. Após electrotorése em ge_ comparou-se as intensidades das bandas dos 2 83 p.b. de β-actina provenientes de múltiplos tecidos por inspecção visual. Calculou-se os factores de diluição para os ADNc de primeira cadeia que provocam intensidades de banda de β-actina iguais em todos os tecidos após 22 ciclos de PCR. Podem ser necessárias três rondas de normalização para se alcançar intensidades de bandas iguais em todos os tecidos após 22 ciclos de PCR.

Para se determinar os níveis de expressão do gene 158P1D7, analisou-se 5 yL de ADNc de primeira cadeia normalizado por PCR, utilizando 26 e 3u cicios de amplificação. É possível alcançar uma análise de expressão semi-quantitativa por comparação dos produtos de PCR nos números de ciclo que proporcionam intensidades de banda clara. Os iniciadores utilizados para RT-PCR foram concebidos utilizando a sequência de SSH de 158P1D7 e são a seguir apresentados: 158P1D7.1 5' ATAAGCTTTCAATGTTGCGCTCCT 3’ (SEQ ID NO: 671) 158P1D7.2 5' TGTCAACTAAGACCACGTCCATTC3' (SEQ ID NO: 672) 148 RT-P ef ec lote ADNc dcti

Na figura 6 é apresentada CR t. ípica. A análise de H. Li ada em ADNc de primeira s de tecidos provenientes uma análise de expressão por expressão por RT-PCR foi cadeia gerados utilizando amostras. Os com beta-unto de de múltiplas demonstraram ser normalizados utilizando PCR na. Observou-se a expressão de 158P1D7 num conj cancro da bexiga.

Exemplo 2: clonagem de comprimento completo de 158P1D7 A sequência de ADNc de SSH do 158P1D7 foi obtida a partir de um lote de cancro da bexiga menos a subtracção de ADNc de bexiga normal. A sequência de ADNc de SSH (figura 1) foi designada por 158P1D7. 0 clone de ADNc de comprimento completo, clone 158P1D7, TurboScript3PX (figura 2) foi clonado a partir de ADNs do lote de cancro da bexiga. 0 ADNc do clone 158P1D7 foi depositado segundo os termos do tratado de Butapeste de 22 de Agosto de 2001, utilizando a "American Type Culture Collection' (ATCC; 10801 University Blvd., Manassas, VA 20110-2209 USA) como plasmídeo pl58PlD7-Turbo/3PX, e foi-lhe atribuído o n° de adesão

(ficha

Exemplo 3: mapeamento cromossómico de 156P1D7 A localização cromossómica pode implicar genes na patogénese de doenças. Encontram-se disponíveis diversas abordagens de mapeamento cromossómico, incluindo fluorescência em hibridação in situ (FISH), painéis híbridos de radiaçao humano/hamster (RH) (Walter et al., 1994; Nature Genetics 7: 22; Research Genetics, Huntsville Al), painéis híbridos de células somáticas humano-roedor, 149 tais corno os que se encontrara disponíveis pelo Coriell Institute (Camden. New Jersey) e visualizadores genómicos utilizando homologias cie BLAST para clones genómicos sequenciados e mapeados (NCBI, Bethesda, Maryland). 0 158P1D7 é mapeado para o cromossoma 13, utilizando a sequência de 158P1D7 e a ferramenta BLAST NCBI: (http://www.ncbi.nJm.nih.gov/genome/seq/page.cgi ?F=HsBlast. html&&ORG=Hs). Esta constitui uma região de amplificação frequente no cancro da bexiga (Prat et ai., IJrology, Maio de 2001; 57(5): 986-92; Muscheck et ai., Carcinogenesis,

Set. de 2000; 21(9): 1721-26) e está associada à proliferação rápida de células tumorais no cancro da bexiga avançado (Tomovska et al., Int J Oncol, Jun. de 2001; 18(6): 1239-44).

Exemplo 4: análise da expressão de 158P1D7 em tecidos ...........................-------------------—........................................ .................*-...................................................................................................................- .......... normais e em pacientes A análise cie 158P1D7 por RT-PCR é apresentada na figura 6. Ê observada uma forte expressão de 158P1D7 no lote de cancro da bexiga. A análise por 'northern blot' extensiva de 158P1D7 em 16 tecidos normais humanos confirma a expressão observada por RT-PCR (figura 7). Dois 4,6 e 4,2 kb são detectados ranscritos com aproximadamente na próstata e, em níveis mais reduzidos, no na placent no fígado, no intestino delgado e no cólon. em especímenes de tumores 15 8 P1D 7 na maioria dos Αα análise de 'Northern blot' de pacientes mostra a expressão tecidos de tumor de bexiga testados e na linhagem celular de cancro da bexiga, SCaBER (figuras 8A e 8B). a expressão detectada em tecidos normais adjacentes (isolados de 150 150 xlos de um da dor idOS não são ser expresso em dos normais e a saudável) pode indicar que estes t completamente normais e que o 158P1D7 pod tumores em etapas iniciais. A expressão restrita de 158P1D7 em t( expressão detectada no cancro da bexiga sugere que o 158P1D7 constitui um alvo terapêutico potencial e um marcador de diaanóstico para cancros humanos.

Exemplo 5: produção de 158P1D7 recombinante em sistemas procarióticos A. Transcrição in vitro e construções de tradução PCRII: para se gerar sondas de ARN sense e anti-sense de 158P1D7 para investigações de ARN in situ, são geradas construções de pCRII (Invitrogen, Carlsbad CA.) que codificam a totalidade, ou fragmentos, de ADNc de 158P1D7. o vector pCRII possui promotores Sp6 e T7 que flanqueiam a inserção para conduzirem a transcrição de ARN de 158P1D7 paira utilização como sondas em experiências de hibridação in situ de ARN. Tais sondas são utilizadas para analisar a expressão em células e tecidos de 158P1D7 ao nível do ARN. O ARN de 158P1D7 transcrito que representa a região de codificação de aminoácido de ADNc do gene 158P1D7 é utilizada em sistemas de tradução in vitro, tais como o sistema de reticulolisado acoplado TnT™ (Promega, Corp., Madison, Wl), para sintetizar a proteína 158P1D7. B. Construções bacterianas

Construções pGEX: para se gerar proteínas 158P1D7 recombinantes em bactérias que estão fundidas à proteína 151 glutationa S-transferase (GST), a totalidade ou partes da sequência de codificação da proteína de ADNc de 158P1D7 são fundidas ao gene de GST por clonagem num vector de fusão PGEX-6P-1 ou qualquer outro vector de fusão GST da família de pGEX (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ). Estas construções perm_i.i_.em a expressão controlada, de sequências da proteína 158P1D7 recombinante com GST fundida no terminal amino e um epítopo com seis histidina (6X His) no terminal carboxilo. Os marcadores GST e 6X His permitem a purificação da proteína de fusão recombinante a partir de bactérias induzidas com uma matriz de afinidade adequada e permitem o reconhecimento da proteína de fusão com anticorpos anti-GST e anticorpos His. 0 marcador 6X His é gerado por meio da adição de 6 codões histidina ao iniciador c ie clonagem na extremidade 3' do grelha de leitura abe rta (ORF). rJm local de clivagem proteolítica, tal como o local de reconhecimento PreScission™ em pGEX-6P~ 1, pode ser utilizado de um modo tal que permita a clivagem do marcador GST a partir da proteína conotada a 158P1D7. 0 gene de resistência a ampicilina e a origem pBR322 permitem a selecção e a manutenção dos plasmídeos pGEX em E. coli. Por exemplo, as construções são preparadas utilizando pGEX-6P-1 de um modo tal que as seguintes regiões de 158P1D7 sejam expressas como fusões no terminal amino para GST: aminoácidos 1 a 841 ou quaisquer 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 ou mais aminoácidos contíguos de 158P1D7 ou seus anaiogos.

Construções de pMAL: para se ger ar as proteínas 158P1D7 recombinantes ΛίΊ 1 s~\ Vj W. são fundidas à proteína de ligação a maltose (MBP) em células bacterianas, a totalidade ou partes da sequência de codificação da 152 proteína de ADNc de 158P1D7 são fundidas ao gene de MBP por clonagem em vectores pMAL-c2X e pMAL-p2X (New England Biolabs, Beverly, MA) , Tais construções permitem a expressão controlada de sequências de proteína 158P1D7 recombinante com MBP fundido no terminal amino e um epítopo com 6X His no terminal carboxilo. Os marcadores MBP e 6X His permitem a purificação da proteína recombinante a partir de bactérias induzidas com uma matriz de afinidcide adequada e permitem o reconhecimento da proteína de fusão com anticorpos anti-MBP e anticorpos anti-His. 0 6X His é gerado por meio da adição de codões de histidina à extremidade 3' do iniciador de clonagem. Um local de reconhecimento de factor Xa permite a clivagem do marcador pMAL a partir de 158P1D7. Os vectores pMAL-c2X e pMAL-p2X são optimizados de modo a expressarem a proteína recombinante no citoplasma ou periplasma, respectivamente. A expressão no periplasma aumenta a dobragem de proteínas com ligações dissulfureto. Por exemplo, as construções são preparadas utilizando pMAL-c2X e pMAL-p2X de um modo tal que as regiões seguintes da proteína 158P1D7 sejam expressas como fusões no terminal amino para MBP: aminoácidos 1 a 841; ou quaisquer 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 ou mais aminoácidos contíguos de 158P1D7 ou seus análogos. 158P1D7 em sequência de clonadas em , wi) . Tais

Construções de ρΞΤ: para se expressar células bacterianas, a totalidade ou partes da codificação da proteína de ADNc de 158P1D7 são vectores da família de pET (Novagen, Madison rigorosamente controlada em bactérias na presença proteínas que aumentem da ou vectores permitem a expressão proteína 158P1D7 recombinante na ausência de fusão a 8. 153 solubilidade, tais como NusA e tioredoxina (Trx), e marcadores de epítopo, tais como 6X His e S-Tag™, que auxiliam a purificação e a detecção da proteína recombinante. Por exemplo, as construções são preparadas utilizando um sistema de fusão pET NusA 43,1, de um modo tal que as regiões seguintes da proteína 158P1D / sejam expressas como fusões do terminal aramo para NusA: aminoácidos 1 a 841 ou quaisquer 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 ou mais aminoácidos contíguos de 158P1D7 ou seus anáiogos. B. Construções de leveduras

Construções de pESC: para se expressar 158P107 na espécie de levedura Saccharomyces cerevisiae para <?erar a proteína recombinante e estudos funcionais, a totalid-ade ou partes da sequência de codificação da proteína de ADNc de 158P1D7 são clonadas em vectores da família de pESC, cada um deles contendo entre 1 e 4 marcadores seleccionaveis,

Tais HIS3, TRP1, LEU2 e URAS (Stratagcne, La Jolla, CA; vectores permitem a expressão controlsLda a partir d o mesmo lonadas plasmídeo de até 2 genes diferentes ou seauências c que contêm marcadores de epítopo FlagJM ou Myc na mesma célula de levedura. Este sistema é útil para ajustar as interacções proteína-proteína 158P1D7. Além do mais, a expressão em leveduras origina modificações pós~traduçao semelhantes, tais como glicosilações e fosforilaçõ®3r as em células eucarióticas eparadas utilizando pESc seguintes da proteína 45 a «41 ou quaisquer 8, 9 , Por -HIS, 8 P1D 7 , 10, encontradas quando expressas exemplo, as construções são pr de um modo tal que as regiões sejam expressas: aminoácidos 1 154 11, 12, 13, 14, 15 ou rnais aminoácidos contíguos de 158P1D7 ou seus análogos.

Construções de pESP: para se expressar 158P1D7 na espécie de levedura Saccharomyces pombe, a totalidade ou partes da sequência de codificação da proteína de ADNc de 158P1D7 são clonadas em vectores da família de pESP. Estes vectores permitem um nível elevado de controlo da expressão da sequência de proteína 158P1D7 que está fundida pelo terminal amino ou pelo terminal carboxilo a GST, que auxilia a purif icaçrão da proteína, recombinante. Um marcador de epítopo Flag™ permite a detecção da proteína recombinante com anticorpo anti-Fiag*”. Por exemplo, as construções são preparadas utilizando o vector pESP-Ι, de um moao a 1 qu e proteína 158P1D7 seja expi ;omo fusões no terminal amino a GST: aminoácidos 1 a 841 ou quaisquer 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 ou mais aminoácidos contíguos de 158P1D7 ou seus análogos.

Exemplo 6: produção de 158P1D7 recombinante em sistemas eucarióticos A. Construções a partir de mamíferos λ i q nnmn fplnl ;

Para se expressar 158P1D7 recombinante em células eucarióticas, a totalidade ou partes das sequências de ADNc de 158P1D7 podem ser clonadas em qualquer um de diversos vectores de expressão conhecidos na especialidade. As construções podem ser transfectadas numa qualquer de diversas células de mamíferos. lisados de células 293T transfectadas podem ser sondados com um soro policlonal anti-158PlD7, tal como descrito antes. 155 Construções de pcDNA4/HisMax: par a se expresí 158P1D7 em células de mamíferos, o ORF de 158P1.D7 é clonado em pcDNA4/HisMax versão A (Invitrogen, Carlsbad, CA). A expressão de proteínas é controlada a partir do promotor de citamegalovírus (CMV) e do potenciador de tradução SP163. a proteína recombinante possui XpressTM e seis epítopos de histidina fundidos no terminal N. 0 vector p e DNA 4/H i sMax também possui o sinal de poliadenilação da hormona de crescimento de bovino (BGH) e a sequência de terminação de transcrição para aumentar a estabilidade de ARNm em conjunto com a origem SV40 para a replicação episomai e salvamento simples do vector em linhagens celulares que expressam o antigénio T grande. 0 gene de resistência a zeocina permite a selecção de células de mamíferos que expressam a proteína e o gene de resistência a ampicilina e a origem CoiEl permitem a selecção e manutenção do plasmídeo em E. coli. Nesta construção são expressas as regiões seguintes de 158P1D7: aminoácidos 1 a 841 ou auaisquer b 9, 10, 11, 12, 13, 14, ou mais aminoácidos contíguos de 158P1D7, variantes ou seus análogos.

Construções de pcDNA3.1/MycHis: para se expressar 158P1D7 em células de mamíferos, os ORF com locais de início da tradução Kozak de consenso foram clonados em pcDNA3.1/MycHis versão A (Invitrogen, Carlsbad, CA), A expressão de proteína é controlada a partir do promotor de citomegalovírus (CMV). As proteínas recombinantes possuem o epítopo myc e seis histidinas fundidos ao terminal C. o vector pcDNA3.1/MycHis também possui o sinal de poliadeniiaçao da hormona de crescimento de bovino (BGH) e a sequência ae terminação da transcrição para aumentar a estabilidade de ARNm, em conjunto com a origem SV40 para 156 replicação episomal e salvamento simples do vector em linhagens celulares que expressem o antigénio T grande. 0 gene de resistência a neomicina pode ser utilizado, uma vez gue permite a selecção de células de mamíferos que expressam a proteína, e o gene de resistência a ampicilina e a origem ColEl permitem a selecção de manutenção do plasmídeo em E. coli. Nesta construção são expressas as regiões seguintes de 158P1D7: aminoácidos 1 a 841 ou quaisquer 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 ou ma is aminoácidos contíguos de 158P1D7, variantes ou seus análogos.

Construção de pcDNA3.1/CT-GFP-TOPO: para se expressar 158P1D7 em células de mamíferos e para permitir a detecção das proteínas recombinantes utilizando fluorescência, os ORF com local de início da tradução Kozak de consenso são clonados em pcDNAS.1CT-GFP-TOPO (Invitrogen, CA). A expressão de proteína é controlada a partir do promotor de citomegalovírus (CMV). As proteínas recombinantes possuem a proteína fluorescente verde (GFP) fundida ao terminal C, o que facilita a detecção não invasiva in vivo e os estudos dcL bioiogia ceiuiar. O vector pcDNA3.1CT—GFP—TOPO também contém o sinal de poliadenilação da hormona de crescimento de bovino (BGH) e a sequência de terminação d.a transcrição para aumentar a estabilidade, em conjunto com a origem SV40 para a replicaçao episomal e salvamento simples do vector em linhagens celulares que expressa o antigénio T grande. 0 gene de resistência a ampicilina permite a selecção de células de mamíferos que expressam a proteína, e o gene de resistênc selecção construçã preparada ia a ampicilina e a origem ColEl permitem a e a manutenção do plasmídeo em E. coli. Uma o suplementar com uma fusão GFP no terminal N é no pcDNA3.1/NT-GFP-TOPO, gerando o comprimento 157 completo da proteína 158P1D7. Nesta constri ação s a o expressas as regiões seguintes de 158P1D7, aminoá eidos 1 a 841 ou quaisquer 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 ou mais aminoácidos contíguos de 158P1 D7, vari antes ou seus ar t>. fusão de fosfatase alcalina no terminal C das proteínas 158P1D7, fundindo em simultâneo a sequência de sinal IgGk ao terminal N. As proteínas 158P1D7 recombinantes resultantes são optimizadas para a secreção em meio de células de mamífero transfectadas e podem ser utilizadas para identificar proteínas, tais como ligandos ou receptores que interactuam. com as proteínas 158P1D7. A expressão de proteínas é controlada a partir do promotor de CMV e as proteínas recombinantes também possuem myc e seis histidinas fundidas ao terminal C de fosfatase alcalina. 0 gene de resistência a zeocina permite a selecção de células de mamíferos que expressam a proteína e o gene de resistência a ampicilina permite a selecção do plasmídeo em E. coli. Nesta construção são expressas as regiões seguintes de 158P1D7, aminoácidos 1 a 841 ou quaisquer 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 ou mais aminoácidos contíguos de 158P1D7, variantes ou seus análogos. ptag5: os ORD de 158P1D7 também são clonados em pTag-5. Este vector é semelhante a pAPtag mas na ausência da fusão a fosfatase alcalina. Esta construção gera uma fusão de imunoglobulina G1 Fc no terminal C da proteína 158P1D7, fundindo em simultâneo a sequência de sinal de IgGK eio terminal N. As proteínas 158P1D7 recombinantes resultantes são optimizadas para selecção em meio de células de são clonados era pAPtag-5 Esta construção gera uma os (GenHunter Corp. ORF de 158P1D7 Nashville, TN) 158 mamíferos transfectadas, e podem ser utilizadas para identificar proteínas, tais como ligandos ou receptores, que interactuam com as proteínas 158P1D7. A expressão de proteínas é controlada a partir do promotor de CMV e a proteína recombinante possui ainda myc e seis histicmas fundidas ao terminal C de fosfatase alcalina, 0 gene de resistência a zeocina permite a selecção de células de mamífero que expressam a proteína e o gene de resistênciai a ampicilina permite a selecção do plasmídeo em hl. coh. seguintes de , 10, 11, 12, de 158P1D7, clonados em

Nesta construção são expressas as regiões 158P1D7, aminoácidos 1 a 841 ou quaisquer 8, 9 13, 14, 15 ou mais aminoácidos contíguos variantes ou seus análogos.

PsecFc: os ORF de 158P1D7 também são psecFc. O vector psecFc foi montado por clonagem de imunoglobulina G1 Fc (regiões charneira, CH2, CI-I3) em pSecTag2 (Invitrogen, Califórnia). Esta construção gera uma fusão de imunoglobulina G1 Fc no terminal C das proteínas 158P1D7, fundindo em simultâneo a sequência de sinal IgG-kapa ao terminal N. A proteína 158P1D7 recombinante resultante é optimizada para secreção em meio de células de mamífero transfectadas e pode ser utilizada para identificar proteínas, tais como ligandos ou receptores, que interactuam com a proteína 158P1D7. A expressão da proteína é controlada a partir do promotor de CMV e a proteína recombinante também contém myc e seis histidinas fundidas ao terminal C de fosfatase alcalina. O gene de resistência a zeocina permite a selecção de células de mamíferos que expressam a proteína e o gene de resistência a ampicilina permite a selecção do plasmídeo em E, coh. Mesta construção são expressas as regiões seguintes de 159 158P1D7, aminoácidos 1 a 841 ou o"? quaisquer , 10, 11, 12, 13, 15 ou mais ammoacicios contíguos cie 158P1D7, variantes ou seus análogos.

Construções........de __£SRoç: para se gerar linhagens de células ae mamíferos que expressam 158P1D7 constitui, xvamente, os ORF são clonados em. construções de pSRa. Os retrovirus anrotrópicos e ecotrópicos são gerados por transrecção ae construções de pSRa na linhagem de montagem 293i-iOA ou por co-transf ecção de pSRa e de um plasmideo auxiliar (que contém as sequências de montagem, suprimidas) nas células, respectivamente. Os retrovírus podem ser utilizados para infectar diversas linhagens celulares de mamíferos, proporcionando a integração do gene cionado, 158P1D7, nas linhagens celulares hospedeiras. A expressão de proteínas é controlada a partir da repetição do terminal longa (LTR). O gene de resistência a neomicina permite a selecção de células de mamíferos que expressam a proteína e o gene de resistência a ampicilina e a origem ColEl permite a selecção e a manutenção do plasmídeo em E. coll. Subsequentemente, os vectores retrovirais podem ser utilizados para infecçac criacao de diversas linhagens celulares utilizando, por exemplo, células SCaBER, NIH 3T3, TsuPrl, 293 ou rat-1. São preparadas construções de pSRa suplementares que fundem um marcador epítopo, tal como um marcador FLAG, ao terminal C das sequências de 158P1D7 para permitir a detecção utilizando anticorpos anti-marcador epítopo. Por exemplo, a sequência FLAG 5' gat tac aag gat gac gac gat aag 3' é adicionada ao iniciador de clonagem na extremidade 3' do ORF. São preparadas construções de pSRa suplementares para. produzir GFP no terminal N e no terminal C e proteínas 160 cie fusão myc/6 6 HIS das proteínas 158P1D7 de comprimento completo. Em tais construções são expressas as regiões seguintes de 158P1D7: aminoácidos 1 a 841 ou quaisquer 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 ou mais aminoácidos contíguos de 158P1D7, variantes ou seus análogos.

Vectores virais suplementares: são preparadas construções suplementares para a distribuição mediada por vírus e expressaLO de 158P1D7. As concentrações elevadas de vírus que originam elevados níveis de expressão de 158P1D7 são alcançadas em sistemas de distribuição virais, tais orno vectores adenovirais e vectores de amplicao de herpes.

As sequências de codificação de 158P1D7 ou u seus fragmentos são amplificados por PCR e subclonados no vector transportador AdEasy (Stratagene). A recombinação e a montagem do vírus são efectuadas de acordo com as instruções do fabricante para gerar vectores adenovirais. Em alternativa, as sequências de codificação de 158P1D7 ou seus fragmentos são clonados no vector de HSV-1 (Imgenex) para gerar vectores virais de herpes. Os vectores virais são depois utilizados para a infecção de diversas linhsLgens celulares, tais como células SCaBER, NIH 3T3, 293 ou rat-1. Nesta construção são expressas as regiões seguintes de 158P1D7: aminoácidos 1 a 841 ou quaisquer 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 ou mais aminoácidos contíguos de 158P1D7, variantes ou seus análogos.

Sistemas de expressão por repetição: para se controlar a expressão de 158P1D7 em células de mamíferos, as sequências de codificação de 158P1D7 são clonadas em sistemas de expressão de mamíferos regulados, tais como o sistema T-Rex (Invitrogen), o sistema GeneSwitch (Invitrogen) e o sistema Ecdysone rigorosamente regulado 161 (Sratagene). Estes sistemas permitem o estudo dos efeitos temporais e dos efeitos dependentes da concentração de 158P1D7 recombinante. Subsequentemente, estes vectores são utilizados para controlar a expressão de 158P1D7 em várias linhagens celulares, tais como células SCaBER, NIH 3T3, 293 ou rat-1. Nestas construções são expressas as regiões seguintes de 158P1D7: aminoácidos 1 a 841 ou quaisquer 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 ou mais aminoácidos contíguos de 158P1D7, variantes ou seus análogos. B. Sistemas de expressão em baculovírus

Para se gerar proteínas 158P1D7 recombinantes num sistema de expressão em baculovírus, os ORF de 158P1D7 são clonados no vector de transferência de baculovírus pBlueBac 4.5 (Invitrogen), o qual proporciona um marcador His no terminal N. Especificamente, o pBlueBac-158PlD7 é co- transfectado com plasmídeo auxiliador pBac-N-Blue (Invitrogen) em células de insecto SF9 (Spodoptera frugiperda) para gerar baculovírus recombinante (ver o mais manual de instruções de Invitrogen para informaçõeí detalhadas). O baculovírus é então recolhido a partir do sobrenadante de células e purificado por ensaio de placas. A proteína 158P1D7 recombinante é então gerada por infecção de células de insecto HighFive (Invitrogen) com o baculovírus purificado. A proteína 158P1D7 recombinante pode ser detectada utilizando anticorpo anti-158PlD7 ou anticorpo anti-marcador His. A proteína 158P1D7 pode ser purificada e utilizada em diversos ensaios com base em células ou como imunogénio para gerar anticorpos policlonais e monoclonais esoecíficos para 158P1D7. 162 162 regiões seguintes de

Nesta construção são expressas a 158P1D7: 13, 14, aminoácidos 1 a 841 ou quaisquer 8, 9, 10, 11, 12, 15 ou mais aminoácidos contíguos de 158P1D7,

Vciric :e: rogo

Exemplo 7: perfis de antigenicidade A figura 11, figura 12, figura 13, figura 14 e figura 15 ilustram graficamente cinco perfis de aminoácidos da sequência de aminoácidos de 158P1D7, em que cada avaliação se encontra disponível acedendo ao sitio de ProtScale (URL www.expasy.ch/cgi-bin/protscale.pl) no servidor de biologia molecular ExPsLsy.

Estes perfis: figura 11, hidrofilicidade (Ηορρ T. P., Woods K. R., 1981. Proc. Natl. Acad. Sei. U, S. A. 78: 3824-3828); figura 12, hidroparicidade (Kyte u., Doolittle R. F., 1982 . J. Mol. Biol. 157: 105132); figura 13, percentagem de resíduos acessíveis (Janin J., 1979 Nature 277: 491-492); figura. 14, flexibilidade média. (Bhaskaxan R. K., 1988. Int. , J. Pept. Protein Rgs ♦ 32* -L D , hélice bet a (Deleage, G., Roux B. 1987 ing 1; 289-294) i ; e outros faculta t i vamente na especial.! d. a de, tal como no sítio im utilizados para ide] ntificar regiões di sponibi1i z ados ProtScale, foram um dos perfis de ando os parâmet ros D um tamanho de ltos da j anela em antigénicas da proteína 158P1D7. Cac aminoácidos de 158P1D7 foi gerado utm de ProtScale seguintes para análise janela de 9; 2) 10 0% de peso dos comparação com o centro da janela e 3) valores do perfil de aminoácidos normalizado de modo a estar compreendido entre 0 e 1. 163

Os perfis de hidrof ilicidade (figura li), Cle hidropaticidade (figura 12) e de percentagem de resíduos acessíveis (figura 13) f orara utilizados para determinar fragmentos de aminoácidos hidrofílicos (isto é, valores superiores a 0,5 no perfil de hidrofilicidade e no perfil de percentagem, qg resiouos acessrvers e valores roferiores no perfil de hidropaticidade) . É provável que tais regiões sejam expostas ao meio ambiente aquoso, estejam presentes sobre a superfície da proteína, encontrando-se assim disponíveis para reconhecimento imune, tais como por anticorpos.

Os perfis de flexibilidade média (figura 14) e hélice beta (figura 15) determinam os fragmentos de aminoácidos (isto é, valores superiores a 0,5 no perfil de hélice beta e no perfil de flexibilidade média) que não estão :omo cadeias estruturas secundárias, taie restrinaic em beta e hélices alfa. Também é prováve) este jam expostas na proteína e, assim, para reconhecimento imune, tais como por As sequências antigén iceis da l 13 , fig ura 1 4 ou f igu ra 15 são util imu nogén ios, quer pé Pt i Idos quer 5 C ( odificam, para ger ar anticorpos .cos e de diag nós ti co. Os imu no génios a ^, 7, 8 , 9, 10, 11, 12, , 13, 14, 1! 21, 22, 23, ; -5, 2 5, 3 0, 35, í. 1. n a s 1. ^ , -t -J , indicada, v.g., pelos perfis apresentados na figura 11, figura 12, figi ser quaisquer o, 17, 18, 19, 20, 21, ff, 23, 25, 25, 30, 35, 40, 45, 50 u mais de 50 aminoácidos contíguos, ou os correspondentes ácidos nucleicos que os codificam, a partir da proteína 158P1D7. Em particular, os imunogénios de péptidos podem compreender uma região peptídica pelo menos de 5 164 164 aminoácidos da inteiro até 841 possua um valor da figura 11; aminoácidos da inteiro até 8 41 figura 2 em qualquer incremento de número , que inclua uma posição de aminoácido que superior a 0,5 no perfil de hidrofilicidade uma região peptídica pelo menos de 5 figura 2 em qualquer incremento de número que inclua uma posição de aminoácido que possua um valor inferior a 0,5 no perfil de hidropaticidade da figura 12; uma região peptídica pelo menos de 5 aminoácidos da figura 2 em qualquer incremento de número inteiro até 8 41, que inclua uma posição de aminoácido que possua um valor superior a 0,5 no perfil de percentagem de resíduos acessíveis da figura 13; uma região peptídica pelo menos de 5 aminoácidos da figura 2 em qualquer incremento de número inteiro até 841, que inclua uma posição de aminoácido que possua um valor superior a 0,5 no perfil de flexibilidade média na figura 14 e uma região peptídica pelo menos de 5 aminoácidos da figura 2 em qualquer incremento de número inteiro até 841, que inclua uma posição de aminoácido que possua um valor superior a 0,5 no perfil de hélice beta da figura 15. Os imunogénios de péptidos também podem compreender ácidos nucleicos que codificam qualquer um dos a seguir referidos. Todos os imunogénios, de péptido ou de ácido nucleico, podem ser incorporados numa forma de dosagem unitária ou podem estar incluídos numa composições que compreenda um excipiente farmacêutico compatível com a fisiologia humana.

Exemplo 8: geração de anticorpos policlonais de 158P1D7 165

Os anticorpos policlonais podem ser criados num mamífero, por exemplo, por meio de uma ou mais injecções de um agente de imunização e, se desejado, um adjuvante. Tipicamente, o agente de imunização e/ou adjuvante sera injectado no mamífero por meio de múltiplas mjecçoes subcutâneas ou intraperitoneais. Para além da imunização com a proteína 158P1D7 de comprimento completo, são utilizados algoritmos por computador na concepção de imunogénios que, com base na análise da sequencia de aminoácidos apresentam características de serem, antigénicos e se encontrarem disponíveis para reconhecimento pelo sistema imune do hospedeiro imunizado (ver o exemplo intitulado "Perfis de antigenicidade"). Prevê-se que tais regiões sejam, hidro.filiças, sejam flexíveis, estejam numa conformação de hélice beta e estejam expostas na superfície da proteína (ver, v.g., figura 11, figura 12, figura 13, figura 14 ou figura 15 para os perfis de aminoácidos que indicam tais regiões de 158P1D7).

Por exemplo, as proteínas ou péptidos de fusão bacteriana recombinantes de 158P1D7 que codificam regiões hidrofílicas, flexíveis e de hélice beta da sequência de 158P1D7, tais como os aminoácidos 25--45 e 250-385 são utilizados como antigénios para gerar anticorpos policlonais em coelhos brancos da Nova Zelândia. É útil conjugar o agente de imunização com uma proteína sobre a qual se sabe que é imunogénica no mamífero sujeito a imunização. Como exemplos de tais proteínas imunogénicas refere-se, mas sem que isso constitua qualquer limitação, hemocianina de diodora apertura (KLH) , albumina do soro, tiroglobulina de bovino e inibidor de tripsina de soja. De acordo com uma variante, um péptido que coaifica os 16 6 aminoáciclos 25 45 cie 158P1D7 é conjugado com KLH θ é utilizado pa.ua imunizar coelhos. Em alternativa, o ^Quanta de xmunxzavão pode compreender a tonalidade ou porções da proteína 158P1D7, seus análogos ou proteínas de fusão. Por exemplo, a sequência de aminoácidos de 158P1D7 pode ser tunaida utilizando técnicas de ADN recombinante em qualquer um de diversos parceiros de proteína de fusão, os quais são bem conhecidos na especialidade, tais como glutationa-S-transferase (GST) e proteínas de fusão marcadas com HIS. Tais proteínas de fusão são purificadas a partir de bactérias induzidas utilizando a matriz de afinidade aaequcLda. De acordo com uma variante, uma proteína de fusão a com GST que codifica os aminoácidos 250-385 de 158P1D7 é produzida e é purificada, sendo gerado um produto de clivagem em que as sequências de GST são removidas por clivagem proteolítica. Esta proteína 158P1D7 clivada é utilizada como imunogénio. Como outras proteínas de fusão bacteriana recornbinantes que podem ser utilizadas refere-se a proteína de ligação a maltose, LacZ, tioredoxina, NusA ou uma região constante de imunoglobulina (ver a secção intitulada "Produção de 158P1D7 em sistemas procarióticos" em 'Current Protocols In Molecular Biology', Volume 2, Unidade 16, Frederick M. Ausubul et al. eds., 1995; Linsley, P.S., Brady, W., Urnes, M., Grosmaire, L., Damle, N., e Ledbetter, L. (1991) J. Exp. Med. 174. 561- 566) .

Para além de proteínas de fusão provenientes de bactérias, também são utilizados antigénios de proteína expressos em mamíferos. Estes antigénios são expressos a partir de vectores de expressão de mamíferos, tais como os vectores Tag5 e vectores de fusão a Fc (ver a secç§0 167 intitulada "Produção de 158P1D7 recombinante em sistemas eucarí óticos'') e mantêm modificações pós-tradução, tais como as glicosilações encontradas na proteína 158P1D7 nativa. De acordo com uma variante, o domínio extracelular previsto de 158P1D7, aminoácidos 1-614, é clonado no vector de secreção de mamífero, Tag5. a proteína recombinante é purificada por cromatografia com quelato metálico a partir dos sobrenadantes de cultura de tecidos de células 293T aue expressam de um modo estável o vector recombinante. 0 domínio extracelular de 158P1D7 Tag 5 purificado é então utilizado como imunogénio.

Durante o procedimento de imunização, é útil misturar ou emulsionar o antigénio em adjuvantes que aumentam a resposta imune do animal hospedeiro. Como exemplos de adjuvantes refere-se, mas sem que isso constitua qualquer limitação, adjuvante completo de Freund (CFA) e adjuvante de MPL-TDM (monofosforil-lípido A, dicorinomicolato de tre-halose sintético).

Num procedimento de imunização típico, os coelhos são inicialmente injectados por via subcutânea com até 200 pg, tipicamente 100-200 pg, de proteína ou péptido de fusão conjugado com KLH misturado em adjuvante completo de Freund (CFA) . Os coelhos são então injectados por via subcutânea de duas em duas semanas com até 200 pg, tipicamente 100-200 pg, do imunogénio em adjuvante incompleto de Freund (IFA). São recolhidas amostras de sangue de teste aproximadamente 1 a i0 dias apos cada imunização e são utilizadas para monitorizar a concentração do anti-soro por ELISA.

Para se testar o soro, tal como soro de coelho, quanto à reactividade com as proteínas 158P1D7, é possível clonar o ADNc de 158P1D7 de comprimento completo num vector de 168 expressão, tal como um que proporcione um marcador 6X His no terminal carboxilo (ADNpC 3.1 myc-his, Invitrogen, ver o exemplo intitulado "Produção de 158P1D7 recombinante em sistemas eucarióticos"). Após a transfecção das construções em células 293T, pesquisa-se lisados de células com soro anti-158PlD7 e com anticorpo anti-His (Santa Cruz Biotechnologies, Santa Cruz, CA) para se determinar a reactividade específica para a proteína 158P1D7 desnaturada, utilizando a técnica de ''Western blot'. Além disso, o reconhecimento da proteína nativa pelo anti-soro pode ser determinado por meio de análises de imunoprecipitação e de eitometria de fluxo de células 293T e de outras células que expressam 158P1D7 recombinante. Em alternativa, a especificidade do anti-soro é testada por meio de técnicas de Western blot, imunoprecipitação, microscopia fluorescente e eitometria de fluxo utilizando células que expressam endogenamente 158P1D7.

Os soros provenientes de coelhos imuniz ados com proteínas de fusão, i :ais como proteínas de fusão a GST e MBP, são purificados por depleção dos anticorpos reactivos a GST, MBP οια outra sequência de parceiro do fi .isão, por passagem através de i uma coluna de afinidade que contém o parceiro de fusão por si só ou no contexto de uma proteína de fusão irrelevante. Os soros provenientes de coelhos imunizados com proteína ou péptido marcado com His, bem como soros destituídos de parceiro de fusão, são ainda purificados por passagem através de uma coluna de afinidade constituída pelo imunogénio de proteína original ou pelo péptido livre acoplõido õl uma matriz de Affigel (BioRad) . 169

Exemplo 9: geração de anticorpos monoclonais de 158P1D7 (mobs)

Os raAbs terapêuticos para 158P1D7 podem compreender aqueles que reagem com epítopos da proteína que iriam perturbar ou modular a função biológica de 158P1D7, por exemplo, aqueles que iriam perturbar a. sua interacção com ligandos ou proteínas que medeiam ou que estão envolvidas na sua actividade biológica. Os mAbs terapêuticos também compreendem aqueles que ligam especificamente epítopos de 158P1D7 expostos na. superfície da célula, sendo por tal motivo úteis para alvejar conjugados de mAb-toxina. Os imunogénios psira a criação de tais mAbs compreendem aqueles concebidos para codificar ou para conter a proteína 158P1D7 total ou regiões da proteína 158P1D7 sobre as quais se prevê serem antigénicas a partir da análise computacional da sequêncieL de aminoáci õ O s (ver, v.g., figura 11, figura 12, figura 13, figura 14 ou figura 15, e o exemplo int itulado "Per f i ς /jci A. A. O ant igenicidade"). Os imunogénios compreendem, péptidos, proteínas bacterianas recombinantes, proteínas Tag 5 expressas em mamíferos e proteínas de fusão IgG FC humanas e de murinos. Além disso, as células que expressam níveis elevados de 158P1D7, tais como as células 293T-158P1D7, são utilizadas para imunizar murganhos.

Para se gerar mAbs para 158P1D7, os murganhos são, em primeiro lugar, imunizados por via intraperitoneal (IP) tipicamente com 10-50 pg de imunogénio de proteína ou com 107 células que expressam 158P1D7 misturadas em adjuvante completo de Freund. Os murganhos são então subsequentemente imunizados por via IP a cada 2 a 4 semanas, tipicamente com 10-50 pg de imunogénio de proteína ou com 10' células misturadas em adjuvante incompleto de Freund. Em 170 alternativa, é utilizaao o aaguvante MPL-TDM nas imunizações. Para além das estratégias de imunização com. base em proteínas e em células anteriores, é utilizado um procedimento de imunização com base em ADN em que um vector de expressão em mamíferos que codifica a sequência de 158P1D7 é utilizado para imunizar murganhos por direcção injecta do plasmídeo de ADN. Por exemplo, o domínio extracelular de 158P1D7, aminoácidos 1-614, é clonado no vector de secreção de mamíferos Tag5 e é utilizado o vector recombinante como imunogénio. Num outro exemplo, a sequência de ácidos nucleicos que codifica os aminoácidos 250-385 de 158P1D7 (que se prevê que sejam antigénico por análise da sequência, ver, v.g. , figura 11, figura 12, figura 13, figura 14 ou figura 15 ) é clonada num vector de secreção da fusão a Fc, em que a sequência de 158P1D7 é fundida no terminal amino com uma sequência líder de IgK e no terminal carboxilo com uma sequência de codificação da região Fc de IgG de murino ou humana. Este vector recombinante é então utilizado como imunogénio. Os procedimentos de imunização com plasmídeo são utilizados em combinação com proteínas purificadas expressas a partir do mesmo vector e com células que expressam. 158P1D7.

Durante o procedimento de imunização, são retiradas amostras de sangue de ensaio 7 a 10 dias após uma injecção para monitorizar concentração e a especificidade da resposta imune . Após se ter atingido uma r e a c t i v i dade 0 especificidade adequadas conforme determinado por análi se ELISA, Western blotting, imunoprecipitação, microscopia de fluorescência e citometria de fluxo, é então efectuada a criação cie fusão e hibridoma através de procedimentos 171 estabelecidos que são conhecidos na especialidade (ver, v.g.r Harlow e Lane, 1988).

De acordo com uma variante para se gerar anticorpos monoclonais de 158P1D7, uma proteína de fusão de glutationa-S-transferase (GST) que codifica os aminoácidos 250--385 da proteína 158P1D7 é expressa e purificada. Um fragmento de clivagem que codifica os aminoácidos específicos de 158P1D7 é então utilizsLdo como imunoqénio, no qual a GST é removida por proteólise específica para o local. Murganhos Balb C são inicialmente imunizados por via intraperitoneal com 25 pg da proteína 158P1D7 de clivagem misturada em adjuvante completo de Freund. Os murganhos são subsequentemente imunizados de duas em duas semanas com 25 pg de proteína 158P1D7 de clivagem misturada em adjuvante incompleto de Freund, num total de três imunizações, a concentração do soro a partir de murganhos imunizados é determinada por ELISA utilizando a proteína de fusão a GSI de comprimento completo e o imunogénio clivado. Monitoriza-se a reactividade e a especificidade do soro para a proteína 158P1D7 de comprimento completo por análise de Western blotting, imunoprecipitação e citometria de fluxo utilizando células 293T transf ectadas com ura vector de expressão que codifica o ADNc de 158P1D7 (ver, v.g., o exemplo intitulado "Produção de 158P1D7 recombinante em sistemas eucarióticos"). Também são utilizadas outras células que expressam 158P1D7 recombinante ou células que expressam endogenamente 158P1D7. Os murganhos que e são mantidos em ão final de proteína então sacrificados .rganhos sacrificados apresentam a reactividade mais fort repouso, depois é adicionada uma injecç 158P1D7 de clivagem em PBS e são decorridos quatro dias. Os baços dos mu 172 são recolhidos e fundidos com células de mieloma SPO/2 utilizando procedimentos convencionais (Harlow e Lane, 1988) . Os soorenadantes das cavidades de crescimento após selecçao com HAT sao analisados por ELISA, Western blot, imunoprecipitaçao, microscopia fluorescente e citometria de fluxo para identificar clones produtores de anticorpos específicos para 158P1D7. A afinidade de ligação de um anticorpo monoclonal de 158P1D7 é determinada utilizando tecnologias convencionais. As medições de afinidade quantificam a força do anticorpo para a ligação ao epítopo e são utilizadas para ajudar a definir quais anticorpos monoclonais de 158P1D7 são preferidos para utilização de diagnóstico ou terapêutica, conforme é evidente para um especialista na matéria, o sistema BIAcore (Uppsala, Sweden) constitui um método preferido paira a determinação dai afinidade de ligação. No sistema BIAcore é utilizada ressonância do plasmão de superfície (SPR, Welford K. 1991, Opt. Quant. Eiect. 23:1; Morton e Myszka, 1998, Methods in Enzymology 295: 268) para monitorizar as interac ções bromo lecu tempo real. A análise B TAcore gera, de um modo conr constantes da taxa. de associação, constantes da :es em dissociação, constantes de dissociação em equilíbrio e constantes de afinidade.

Exemplo 10: ensaio de ligação de HLA de classe I e de classe II

Os ensaios de ligação de HLA de classe I e de classe II que utilizam moléculas de HLA purificadas são efectuados em conformidade com protocolos descritos (v.g., publicações de patente de invenção PCT nos WO 9 4/2 012 7 e WO 9 4/032 05; 173 Sidney et al. rrent Protocols

Immuno1 ogy 18,3.1 (1998); Sidney, et al., J , Mol. Immunol. 31: 813 (1994)). De um modo resumido, L il.lULU.UiJ. et al moléculas de MHC purificadas (5 a 500 nM) são mantidas a incubar com diversos inibidores peptídicos não marcados e péptidos sonda radiomarcados com l2bI 1-10 nM, conforme descrito. Após a incubação, os complexos MHC-péptido são separados do péptido livre por filtração em gel e a fracção de peptxdo experiências ligado é determinada. Tipicamente, em preliminares, cada preparação de .MHC é titulada na presença de quantidades fixas de péptidos radiomarcado s para se detc srminar a concentração em moléculas de HLA necessári .a para 1 igar 10%-20% da r ad i 0 a c t i. v i d ade tota 1. Todos os ensa.i os de inibição e de ligação directa subsequentes são efectuados utilizando esseLS concentrações em HLA.

Uma vez que sob estas condições, [marcador] < [HLA] e Ciso - [HLA] , os valores de CI50 medidos constituem, aproximações razoáveis aos valores verdadeiros de KD. Os inibidores peptídicos são tipicamente testados para concentrações compreendidas entre 120 pg/mL e 1,2 ng/mL e são testados em duas a quatro experiências completamente independentes. Para permitir a comparação dos dados obtidos nas diferentes experiências, uma figura de ligação relativa é calculada para cada péptido por meio da divisão do valor de CI50 de um controlo positivo de inibição pelo valor

Cl50 para marcadas de dados cada péptido testado (tipicamente versões não lo péptido sonda radiomarcado). Para fins de bases e comparações inter-experiências, os valores de ligação relativos são compilados. Estes valores podem ser subsequentemente convertidos em valores de CI50 nM por meio 174 174 cia divisão do valor C inibição pelo valor relevante. Este método só mM dos controlos positivos para da ligaçao relativa do péptido de conclusão de dados é preciso e foram

de MHC consistente para a comparaçao dos péotidos que testados em dias diferentes ou com lotes diferentes purif icado.

Exemplo 11; identificação de epítopos candidatos de CTL que

suportam supermotivos e motivos de HLA

As composições de vacina de HLA. podem compreender epítopos múltiplos. Os epítopos múltiplos podem compreender supermotivos ou motivos de HLA múltiplos para se atingir uma cobertura de população mais ampla. Este exemplo ilustra a identificação e confirmação de epítopos que suportam supermotivos e motivos para a inclusão numa tal composição de vacina. O cálculo da população abrangida é efectuado utilizando a estratégia a seguir descrita.

Pesquisas e algoritmos epítopos que suportam As pesquisas efec por computador para identificaçã supermotivos e/ou motivos tuadas para identificar as sequên de xas de péptidos que suportam "Perfis de antigenicidade" motivos no exemplo intitulado e nos quadros V-XVIII utilizam os dados de sequência de proteína provenientes do produto génico de 158P1D7 apresentado nas figuras 2 e 3.

As pesquisas por computador para epítopos que suportem supermotivos ou motivos de HLA de classe I ou de classe II são efectuadas do modo seguinte. Todas as sequências de analisadas utilizando uma de cordões de texto para de péptidos que contenham proteína 158P1D7 traduzidas são aplicação informática de pesquisa identificar potenciais sequências 175 os motivos de liga ção a HLA facilmente produz idos de especialidade à luz de motivos/supermotivos. Além dc realizados mentalmente. adequados; tais programas são acordo com informaç:ões na descrições conhecidas de mais, tais cálculos podem ser

As sequências de supermotivos A2, A3 e DR são crassifiçadas utilizando algoritmos polinomiais para prever a sua capacidade para se ligar a moléculas especificas de HLA de ciasse I ou de ciasse II. Estes algoritmos polinomiais contabilizam o impacto de diferentes aminoácidos em posiçoes diferentes e são essencialmente baseados na premissa que a afinidade global (ou AG) das interacções péptido-molécula de HLA pode ser aproximada a uma função polinomial, linear do tipo: "AG" = au x a2i x asi ...... x anr; em que au é um coeficiente que representa o efeito da presença de um determinado aminoácido (j) numa determinada posição (i) ao longo da sequência de um péptido com n aminoácidos. A presunção crucial deste método consiste no factor de cada posição ser essencialmente independente de uma outra (isto é, ligação independente de cadeias laterais individuais). Quando o resíduo j está na posição i no péptido, é assumido que contribua com uma quantidade constante j± para a energia livre da ligação do péptido independentemente da sequência da parte restante do péptido. 0 método de derivação dos coeficientes específicos do algoritmo foi descrito por Gulukota et ai., J. Mol. Biol. 267: 1258-126, 1997; (ver também Sidney et ai., Human

Immunol. 45: 79-93, 1996; e Southwood et al., J. Immunol. 160: 3363-3373, 1998). Resumidamente, para todas as 176 176 posições i, igual para posição de ancoragem ou não de ancoragem, 3. méd ia. geomét rica da ligação me dia r e 1 a t. i v a (ARB) de t odos os péptidos que transportem j é calculada em relação à parte restante do grupo e é utixizada como estimativa de ji- Para péptidos de ciasse II, caso s e j am possíveis alinhamentos múltiplos, apenas o alinhamento com a classificação mais elevada é utilizado, de acordo com um procedimento iterativo. Para calcular uma claLSsif icação pelo algoritmo de um determinado péptido num conjunto de teste, os valores de ARB que correspondem à sequência do péptido são multiplicados. Caso este produto excede um determinado ligue. Os j do grau de o péptido se como função limite seleccionado, prevê-se que limites adequados são seleccionados rigor de previsão desejado.

Selecção de péptidos inter-reactivos de supertipo HLA-A2

As sequências de proteína completa provenientes de 158P1D7 são pesquisadas utilizando a aplicação informática de identificação de motivos, para identificar sequências de 8-, 9- 10- e 11-mer que contêm a especificidade de ancoragem principal supermotivo HLA-A2. Tipicamente, estas sequências são então classificadas utilizando o protocolo descrito antes e os péptidos que correspondem às sequências com classificação positiva são sintetizados e testados quando à sua capacidade para se ligar a moléculas de HLA-A*0201 purificada in vitro (HLA-A*0201 é considerado uma molécula de supertipo Ά2 protótipo).

Tais péptidos são então de se ligar a moléculas de sup A*0203, A*0 2 06 e Ã*6802) . Os três dos cinco alelos de menos testados quanto à capacidade ertipo A2 adicionais (A*0202, péptidos que se ligam a pelo supertipo A2 são tipicamente sao 177 considerados ligandos inter-reactivos de supertipo A2. Os péptidos preteridos ligara-se, com uma afinidade igual ou inferior a 50 0 nM, a três ou mais moléculas de supertipo HLA-A2.

Selecção de epítopos que suportam o supermotivo HLA-A3 A sequência de proteína 158P1D7 pesquisada antes também é examinada quanto à presença de pépt ancoragens primárias de supermotivos de HLA-A3 . Os que corres pondera às sequências que suportam supi HLA A3 são então sintetizados e testados quant O â moléculas de HLA-A* 0301 e de HLA—A*1101, as ] ipermotivos ligação í moléculaí codificadas pelos dois alelos de supertipo A3 mais Prevalent.es. Os péptidos ligam, pelo menos um. dos dois aieios com afinidades de ligação ^ 500 nM, frequentemente < 200 nM, são então testados quanto à inter-reactividade de ligaçã0 a outros alelos de supertipo A3 comuns (v.g., A*3i0l, A*3301 e A*6801) para identificar aqueles que se podem ligar a pelo menos três das cinco moléculas de supertipo HLA-A3 testadas. supermotivo HLA-B / é anali isada quanto à 10- ou 11-mer com o s corre ispondentes ε ;ão ligação a HLA-B*0702, a âglccgão de epítopos que suportam o A proteína 158P1D7 também presença de péptidos 1 cr> •k 1 00 supermotivo HLA-B7. 0 s péptido sintetizados e testados quanto à molécula codi ficada pelo ' alelo de (_i_sto é, o alelo de supertipo B7 que Se ligam a B*0702 com um supertipo B7 mais comum protótipo). Os péptidos CI5o de < 50 0 nM são identificadQS Péptidos são utilizando métodos convencionais, então testados quanto a ligação a

Ih ; o +- o «zr j—i O L- v.-' outire S 178 moléculas de supertipo B7 comuns (v.g., B*3501, B*5101, B*5301 e B*5401). Os péptidos capazes de se ligar a três ou mais dos alelos de supertipo B7 testados são assim identificados.

Selecção de epltopos que suportam os motivos AI e A2 4

Para aumentar ainda a cobertura da população, os epítopos HLA-A1 e HLA-A24 também podem ser incorporados em composições de vacina. Também é possível efectuar uma análise da proteína 158P1D7 para identificar sequências que contêm motivos HLA-A1 e HLA-A24.

Os epítopos com elevada afinidade e/ou com ligação inter-reactiva que suportem outros motivos e/ou supermotivos são identificados utilizando metodologias análogas.

Exemplo 12: confirmação de iraunogenicidade

Os péptidos candidatos que suportem supermotivos CTL A 2 inter-react ivos, que são identificados tal como aqui descrito, são seleccionados para confirmar a imunogenicidade in vitro. Esta confirmação é efectuada utilizando a metodologia seguinte.

Linhagens celulares alvo para pesquisa celular A linhagem celular .221A2.1, produzida por transferência do gene HLA-A2.1 na linhagem celular B-linfoblastóide humana mutante isenta de HLA-A, -B, -C 721.221, é utilizada como alvo carregado com péptido para a medição da actividade de CTL restrita a HLA-A2.1. Esta linhagem celular é deixada crescer em meio RPMI-1640 suplementado com antibióticos, piruvato de sóido, 179 aminoácidos nao essenciais e 10% (v/v) de FCS inactivado termicamente. As ceiulas que expressam um antigénio relevante, ou transrectantes que compreendem o gene que codifica o antigénio relevante, podem ser utilizadas como células alvo confirmar a aptidão de CTL específicos do péptido para reconhecer o antigénio endógeno. primarias

Culturas de indução de CTL t.res rezes com 3 mL de RPMI pa ra remover maior parte das células não aderentes e fracamente aderentes. Três mL de meio completo que contém 50 ng/rnL de GM-CSF e 100 0 U/mL de IL-4 são então adicionadas a cada cavidade. O TNF« é adicionado às DC no dia 6 a 75 ng/mL e as células são utilizadas para culturas de indução de CTL no dia 7.

Indução de CTL com DC e péptido: células T CD8+ são isoladas por selecção positiva com esferas imunomagnéticas Dynal (Dynabeads® M-450) e com o reagente detacha-bead®. Tipicamente, cerca de 200-250 χ 101 de PBMC são processadas para se obter 24 χ 101 de células T CD8+ (quantidade le s) suficiente para uma cultura em placa de 4 8 cavic

Resumidamente, as PBMC são dissolvidas em RPMI com 30 pg/rriL 1 cavidades. Após 2 horas a 37°C, as células não aderentes são removidas por agitação suave das olacas e aspiração dos sobrenadantes. As cavidades são lavadas um total 180 de DNAse, lavadas uma vez com PBS que contém 1% de soro AB humano e colocadas novamente em suspensão em PBS/1% de soro AB numa concentração de 20 x 106 células/mL. As esferas magnéticas são lavadas 3 vezes com PBS/soro AB, adicionadas às células (140 pL de esferas/20 x 106 células) e mantidas a incubar durante 1 hora a 4°C, sob mistura continua. As esferas e as células são lavadas 4x com PBS/soro AB para remover as células não aderentes e são colocadas novamente em suspensão a 100 x 106 células/mL (com base no número original de células) em PBS/soro AB que contém 100 pL/mL de reagente detacha-bead® e 30 pg/mL de DNAse. A mistura é mantida a incubar durante 1 hora à temperatura ambiente, sob mistura continua. As esferas são lavadas novamente com PBS/AB/DNAse para recolher as células T CD8+. As DC são recolhidas e submetidas a centrifugação a 1300 r.p.m. durante 5 a 7 minutos, lavadas uma vez com PBS com 1% de BSA, contadas e estimulada concentração em células de pg/mL de 32~microglobulina são então irradiadas (4200 ; com 4 0 pg/mL de péptido a uma 1-2 x lOVmL, na presença de 3 durante 4 horas a 20°C. As DC róids) , lavadas 1 vez com meio e e. contadas novame

Montagem das culturas de indução: submete-se 0,2 5 ml, de DC geradas por citoquina (a 1 χ io5 células/mL) s co_ cultura com 0,25 ml de células T CD8+ (a 2 x 10b células/roM em cada cavidade de uma placa com 48 cavidades, na presença de 10 ng/mL. de IL-7. Adiciona-se IL-10 humana recombinan i* o no di a seguinte numa concentração final de 10 ng/mL e, 4 8 horas depois, adicio na-se IL-2 humana recombinante a 10 lU/mh. culturas de com péptidos

Estimuiaçao das iderentes estimuladas indução com células sete e catorze dias 181 após a indução primária; estimula-se novamente as células com células aderentes estimuladas com péptido. Dissolve-se as PBMC e lava-se duas vezes com RPMI e DNAse. Coioca-se novamente em suspensão as células ci 5 x IO6 célulcLS/mL e irradia-se a ~4200 rads. Coloca-se e placas as PBMC a 2 x 10° em 0,5 mL de meio completo por cavidade e mantém-se a incubar durante 2 toras a 3 7°C, Lava.—se as praças duas vezes com RPMI batendo gentilmente na placa para remover as células não aderentes e estimula-se as células aderentes com r0 pg/raL cie péptido na presença de 3 pg/mL de β.?-microglobulina em 0,25 mL de RPMI/5% de AB por cavidade durante 2 horas a 37°C. Aspira-se a solução de péptido a partir de cada cavidade e lava-se as cavidades uma vez com RPMr. Aspira-se a maior parte do meio a partir das culturas de indução (células CD8 + ) e perfaz-se até 0,5 mL com meio rresco. Transfere-se então as células para cavidades que contem, as células aderentes estimuladas com péptido. Decorridas 24 horas, adiciona-se IL-10 humana recombinante numa o o icentração final CÍ0 10 ng/mL e adicionou _S8 f no dia segu inte ; e novan lente 2 cl 3 dias depois, IL2 humana reco mbir ‘ante a 50 IU/mT. ; (Ί 'sai et al., Criticai Rev: i.ews in

Immunology 18(i-2): 65-75, 1998). Decorridos 7 dias, teste se as cultur cis quanto a actividade de CTL num ensaio de libertação de sir, culturas οί r. Em algumas experiências, testa- aUanto ao reconhecimento especifico de péptidos ensaio ELISA IFNY Irs situ no momento da segunda estimula ?ao, endógeno cie activide paralelo seguindo-se o ensaio de reconhecimento Corridos 7 dias. Após a expansão, mede-se a m ambos os ensaios para uma comparação em 182 dg.^±S.§.9...i.^a ax.kÍ?3aaae 1j-tica de CTL por libertação de 51Cr

Sete cL.as apoS «. segunda estimulação, determina-se a citotoxicidade num ensaio de libertação de 51Cr padrão (5 horas), testando as cavidades individuais para uma E:T individuai. Prepara—se os ai vns Qp+· ί mri -.^no , , . . J· ° tuvus es amuiaQos com peptido por incubação das células com i n ra/ni He ^ ·. · ^ '-^m iu pg/mn cie peptiao ae um. dia para o outro a 37°C.

Remove-se as células aderentes a partir de frascos de cultura com tripsina-EDTA. Marca-se as células alvo com 200 yCi de cromato de sódio com 5iCr (Dupont, Wilmington, DE) durante 1 hora a 37°C. Coloca-se novamente em suspensão as células marcadas a 106 por mL e dilui-se a 1:10 com células K562 numa concentração de 3,3 x 106/mL (uma linhagem celular eritoblastoma sensível a NK utilizada para reduzir a lxse nao específica) . Coloca-se era placas as células alvo (lUG μη) e efectoras (ΙυΟ μη) em plcicas de fundo redonda com 96 cavidades e mantém-se a incubar durante 1 horas a 370C. Nesse momento, recolhe-se 100 pL de sobrenadante a partir de Cdda cavidade e deLermiiia se 3 percentagem de lise de acordo com a fórmula: [(c.p.m. da amostra de teste - c.p.m, da amostra de libertação espontânea de 51Cr)/ /(c.p.m. da amostra, de libertação máxima de 51 Cr - c.p.m. da amostra de libertação espontânea de 5lCr)] χ 100.

Determina-se 3 j-ioerraçao 133x1133 0 θ s p o ^ t cl n 0 3 por culturas expandidas. incubação dos alvos marcados com 1% de Trition x-100 e meio por si sós, respectivamente. Define-se uma cultura positiva como aquele em que a lise específica (amostra - referência) é 10% ou superior no caso de cavidades individuais e é 15% ou superior paras as duas proporções E:T mais elevadas quando são testadas 183

Medição in situ da produção de IFNy humano como indicador do reconhecimento específico de péptido e endógeno

Reveste-se 2 placas Iiranulon com anticorpo monoclonal IFNy anti-h umano de murganho (4 pg/mL de NaH C03 0,1 M. 8,2) de um dia para 0 outro a 4°C. Lava- se as placas PBS isento de Ca2* e Mg^/0,05% de Tween 20 e } Dloquei com PBS/10% de FCS durante 2 horas, período esse ao rim

pH com -se do e os alvos (100 cavidades vazias os quais apenas estimulados com concentração de 1 icubar durante 48 qual se adiciona os CTL (100 pL/cavidade) pL/cavidade) a cada cavidade, deixando para os ensaios padrão e em branco ( receberam meio). As células alvo, alvos péptido ou endígenos, são utilizadas numa x 10fc células/mL. Mantém-se as placas a ir horas a 37°C com. 5% de CO2.

Adiciona-se IFN-gama humana recombinante às cavidades padrão iniciando a 100 pg ou 1200 pg/100 microlitros de cavidade e mantém-se as placas a incubar durante 2 horas a 37°C. Lava-se as placas, adiciona-se 100 pL de anticorpo monoclonal IFN-gama anti-humano de murganho (2 microgramas/mL em PBS/3% de FCS/0,05% de Tween 20) e mantém-se a incubar durante 2 horas à temperatura ambiente. Após nova lavagem, adiciona-se 100 microlitros de HRP-estreptavidina (1:4000) e mantém-se as placas a incubar durante uma hora à temperatura ambiente. Lava-se então as placas 6x com tampão de lavagem, adiciona-se 100 microlitros/cavidade de solução de desenvolvimento (TMB 1:1) e deixa-se desenvolver as placas durante 5 a 15 minutos. Interrompe-se a reacção com 50 microlitros/ cavidade de H3P04 1 M e lê-se a uma OD 450. Uma cultura é considerada positiva caso se meça pelo menos 50 184 pg de IFN-gama/cavidade acima da referência e seja duas vezes o nível de expressão da referência.

Expansão de CTL

As culturas que demonstram uma actividade lítiCa específica contra alvos estimulados com péptido e/ou alvos tumorais são expandidas ao longo de um período de duas semanas com anti-CD3. Resumidamente, adiciona-se 5 x 10'1 r}e células CD8+ a um frasco T25 que contém o seguinte: i χ 106 de PBMC (autólogo ou alogeneico) irradiado (4200 rad) por mL, 2 χ 105 de células transformadas com EBV e irradiadas (8000 rad) por mL e OKT3 (anti-CD3) a 30 ng p0r mL em RPMI-1640 que contém 10% (v/v) de soro AB humano, aminoácidos não essenciais, piruvato de sódio, 2-mercaptoetanol 25 μΜ, L-glutamina e penicilina/estreptomicina. Adiciona-se IL2 humana recombinante decorridas 24 horas numa concentração final de 200 IIJ/mL e, depois, a cada três dias com meio fresco a 50 IU/mL. Divide-se as células no caso da concentração exceder 1 x 106/mL e avalia-se as culturas entre os dias 13 e 15 para proporções de E:T de 30, 10, 3 e 1:1 através do ensaio de libertação de blCr ou a 1 x 106/mL no ensaio de IFNy in situ, utilizando os mesmos alvos, tal como antes da expansão.

Expande-se as culturas na ausência de anti-CD3" do modo seguinte. As culturas que demonstram actividade lítica especifica contra alvos peptídicos e endógenos são seleccionadas e são adicionadas 5 x 10 de células CD8! a um frasco T25 que contém o seguinte: 1 x 10c de PBMC autólogos por mL, que foram estimulados com péptido com 10 pg/mL de péptido durante duas horas a 3 7°C e irradiadas (4200 rad); 2 χ 105 de células transformadas com. EBV e 185 irradiadas (8000 rad) por mL (v/v) de soro AB humano, piruvato de sódio, 2-ME 25 mM, em RPMI-1640 que contém 10% aminoácidos não essenciais, L-glutamina e gentamicina.

Imunogenicidade de péptidos que suportam supermotivos A2

Os péptidos de ligação inter-reactiva com supermotivo A2 são testados no ensaio celular quanto à aptidão para induzir CTL específicos de péptidos em indivíduos normais. Nesta análise, um péptido é tipicamente considerados como sendo um epítopo caso induza CTL específicos do péptido pelo menos em indivíduos e, de preferência, também reconheça o péptido endogenamente expresso. A imunogenicidade também pode ser conformada utilizando PBMC isolados a partir de pacientes que apresentem um tumor que expresse 158P1D7. Resumidamente, são isolados PBMC a partir de pacientes, estimulados com monócitos estimulados com péptidos e testados quanto à aptidão para reconhecer as células alvo estimuladas por péptidos, bem como células transfectadas que expressam endogenamente o antigénio.

Av ração de imunogenicidade A*03/AI1 Os péptidos de ligação inter-reactiva com supermotivos quanto à imunogenicidade à utilizada para avaliar a supermotivos HLA-A2. HLA-A3 também são avaliados utilizando metodologias análogas imunogenicidade dos péptidos com

Avaliação de imunogenicidade B7 A imunogenicidade pesquisada de péptidos de ligação inter-reactiva com supertipos B7, tal como aqui 186 identificada, é confirmada de um modo análogo à confirmação dos péptidos que suportam supermotivos A2 e A3.

Os péptidos que suportam outros supermotivos/motivos, v.g., HLA-A1, HLA-424, etc., também são confirmados utilizando uma metodologia semelhante.

Exemplo 13: implementação do supermotivo estendido para #Ββββββββββββββ^^^^^^^^^^^^^^^^^^^«ββββββββββββββ»«ββββββββαββββΒββββββββ»βββββββ» melhorar a capacidade de ligação de epitopos nativos por meio da criação de análogos

Os motivos e supermotivos HL A (que compreendem. resíduos primários e/ou secundários) são úteis na identificação e preparação de péptidos nativos com inter-reactividade elevada, tal como aqui demonstrado. Além disso, a definição de motivos e supermotivos HL,A também permite a manipulação de epitopos com inter-reactividade elevada por meio da identificação de resíduos na sequência do péptido nativo que possam ser substituídos por análogos para se conferir ao péptido determinadas caracteristicas, v.g., uma inter-reactividade superior no grupo de moléculas de HLA que compreende um supermotivo e/ou uma afinidade de ligação superior para algumas ou para todas essas moléculas de HLA. Como exemplos de péptidos análogos que exibem uma afinidade de ligaçao modulada refere-se os apresentados neste exemplo.

Criação de análogos em resíduos de ancoragem primários São implementadas estratégias de manipulação de péptidos para aumentar a inter-reactividade dos epitopos. >ortam

Por exemplo, as âncoras principais de péptidos que um supermotivo A2 sao eradas, por exemplo, para 187 introduzir um L, I, V ou M preferido na posição 2 e I ou V no terminal C.

Para se analisar a inter-reactividade dos péptidos análogos, cadai análogo manipulado é inicialmente testado quando à sua ligação ao alelo de supertipo A2 protótipo, A*02D1, e depois, se a capacidade de ligação a A*0201 for mantida, quanto à inter-reactividade com o supertipo A2.

Em alternativa, confirma-se que um péptido se liga a um ou a todos os membros de supertipo e depois cria-se o análogo para modular a afinidade de ligação a qualquer um (ou mais) dos membros de supertipo para se adicionar a cobertura de população. A selecção de análogos para imunogenicidade numa análise de pesquisa celular é ainda tipicamente restringida pela capacidade do péptido de tipo selvagem (WT) natural se ligar pelo menos fracamente, isto é, se ligar com um CI50 de 5000 nM ou inferior, a três ou mais dos alelos de supertipo A2. A razão para este requisito deve-se ao factor de os péptidos de WT deverem estar presentes endogenamente numa quantidade suficiente de modo a que esta. sejci biologicamente significativa. Os péptidos submetidos a analogia tem demonstrado possuir uma imunogenicidade e inter-reactividade aumentadas por células T específicas para o epítopo original (ver, v.g.f Parkhurst et ai., Immmol, 157: 2539, 1996; e Pogue et ai., Proc, Natl. Acad. Sei. USA 92: 8166, 1995) .

Na pesquisa celular destes análogos de péptidos, é importante confirmar que os CTL específicos do análogo também são capazes oe reconhecer o péptido de tipo selvagem e, quando possível, células alvo que expressam endogenamente o epítopo. 188

Criação de análogos de péptidos que suportam supermotivos HLA-A3 e HLA-B7 supermotivos HLA-semelhantes às idos que suportam A3 uti

Os análogos de epítopos que suportam são gerados utilizando estratégias izadas na criação de análogos de pépt supermotivos HLA-A2. Por exemplo, os pépti dos que se li gam a 3/5 das moléculas de supertipo A3 são manipulados nos resíduos de ancoragem primários de modo cL possuírem um resíduo preferido (V, S, M ou A) na posição 2.

Os péptidos análogos são então testados quanto à aptidão para se ligar a A*03 e A*ll (alelos de supertipos A protótipos). Os péptidos que demonstram uma capacidade de ligação £ 500 nM são então confirmados como possuindo inter-reactividade para o supertipo A3.

De um modo idêntico aos péptidos que suportam motivos A2 e A3, os péptidos que se ligam a 3 ou rnais dos alelos de supertipo B7 podem ser melhorados, onde possível, para se atingir uma ligação inter-reactiva melhorada ou uma afinidade de ligação o u período de semi-vida de ligação aue suportam possuírem um de ancoragem por Sidney et de ancoragem motivos e/ou superiores. Por exemplo, os péptidos supermotivos B7 são manipulados de modo a resíduo preferido (V, I, L ou F) na posição primária do terminal C, conforme demonstrado al. (J. Immunol. 157: 3480-3490, 1996). A criação de análogos nos resíduos primários de outros epítopos que suportam supermotivos é efectuada de um modo idêntico. é normalmente

Os péptidos análogos são i mu nogenicidade, tipic ame nte celular. Novamente, então confirmados quanto à num ensaio de pesquisa importante demonstrar que 189 os CTL específicos do análogo também são capazes de reconhecer o péptido de tipo selvagem e, quando possível, os alvos que expressam endogenamente o epítopo.

Criação de análogos em resíduos de ancoragem secundários

Além do mais, os supermotivos HL A são importantes na manipulação de péptidos com inter-reactividade elevada e/ou péptidos que se ligam a moléculas HLA com afinidade aumentada por meio da identificação de resíduos particulares nas posições de ancoragem secundárias que estão associadas a tais propriedades, Por exemplo, é analisada a capacidade de ligação de um péptido que suporta um supermotivo B7 com um resíduo F na posição 1. 0 péptido é então submetido à criação de um análogo, por exemplo, para substituir L por F na posição 1. 0 péptido submetido a analogia é avaliado quanto a uma afinidade de ligação ou período de semi-vida de ligação aumentados e/ou inter-reactividade aumentada. Um tal procedimento identifica péptidos submetidos a analogia com propriedades aumentadas.

Os análogos manipulados com uma capacidade de ligação ou inter-reactividade suficientemente melhoradas também podem ser testados quanto a imunogenicidade em murganhos transgénicos com HLA-B7, após, por exemplo, imunização com IFA ou imunização com um lipopéptido. Os péptidos submetidos a analogia são ainda testados quanto à aptidão para estimular uma resposta a recaída utilizando PBMC provenientes de pacientes com tumores que expressam 158P1D' 190 190 Outras estratégias de anal Uma outra forma de ar a posições de ancoragem, cisterna por um ácido ogia alogia de péptidos, não associada envolve a substituição de uma α-amino-butírico, Devido à sua natureza química, a cisterna possui a propensão para formar pontes dissulfureto e alterar de um modo suficiente a estrutura do péptido, reduzindo a capacidade de ligação. A substituição de cisterna por ácido α-amino-butírico não só alivia este problema, como tem demonstrado melhorar, em alguns casos, a capacidade de ligação e de inter-ligação al. em: Persistent Chen, John Wiley & substituições de um as propriedades de ligandos peptídicos (ver, v.g., a descrição por Sette et Virai Infections, Eds. R. Ahmed e I. Sons, England, 1999) .

Assim, por meio da utilização de único aminoácido, é possível modular lrgsição e/ou de inter-reactividade de para moléculas de supertipo HLA.

Exemplo 14: identificação e confirmação de sequências provenientes de 158P1D7 com motivos de ligação a HLA-DR

Os eprtopos de péptido que suportam um supermotivo ou motivo HLA de classe II são identificados e confirmados tal como a seguir indicado, utilizando uma metodologia semelhante à descrita para os oéptidos HLA de classe I.

Selecção de eprtopos que suportam supermotivos HLA-DR

Para se identificar eprtopos HTL de HLA de classe II provenientes de 158P1D7, analisa-se o antigénio de 158P1D7 qi

SUT seq nto à presença de sequências que s ermotivo de HLA-DR. Especificament uências de 15-mer que compreendem r uportam um motivo ou e, são seleccionadas im supermotivo DR, as 191 191 quais compreendem f Ianque ame rito com t. um núcleo 9-mer e regiões de ês resíduos no terminal N e C (total de 15 aminoácidos).

Foram desenvolvidos protocolos para prever a ligação de péptidos a moléculas DR (Southwood et al., J. Immunol. 160: 3363-3373, 1998). Estes protocolos, específicos para moléculas DR individuais, permitem a classificação e ordenação de regiões de núcleo 9-mer. Cada protocolo não classifica apenas as sequências de péptido quanto à presença âncoras primárias de supermotivo DR (isto é, na posição 1 e posição 6) dentro do núcleo 9-mer, mas ainda avalia as sequências quanto à presença de âncoras secundárias. Utilizando quadros de selecção específicos de alelos (ver, v. g., Southwood et al, ibid.) , concluiu--se que estes protocolos seleccionam eficazmente sequênci as de péptido com uma probabilidade elevada de lxgaçao a i ama molécula DR part icular. Além do mais, concluiu-se que a realização de stes pr o t o c o 1 o s s e qu e n c i a 1 me n t e, especific :ament.e os protocolos para DR1, DR4w4 e DR7, pode seleccionar eficazmente péptidos inter-reactivos com DR.

Os péptidos provenientes de 158P1D7 identificados antes são testados quanto à sua capacidade de ligação a diversas moléculas HLA-DR comuns. Todos os péptidos são testados inicialmente quanto à ligação a moléculas DR no painel principal: DR1, DR4w4 e DR7. Os péptidos que se ligam a pelo menos duas destas três moléculas DR são então testados quanto à ligação a moléculas DR2w2 βΐ, DR2w2 62, DRôwl9 e DR9 em ensaios secundários. Por último, os sao péptidos que se ligam a pelo menos duas destaLS quatro moléculas DR do painel secundário e, assim, cumulativamente a pelo menos quatro de sete moléculas DR diferentes, 192 pesquisados quanto à ligação a moléculas DR4wl5, DRbwll e DR8w2 em ensaios terciários. Os péptidos que se ligam a pelo menos sete das dez moléculas DR, que compreendem os ensaios de pesquiseis principal, considerados ligadores DR ir provenientes de 158P1D7 que se secundário e terei ário, são er-reactivos. Os péptidos igam a aleios HLA- DR comuns são particularmente interessantes.

Selecção de péptidos com motivo DR3

Visto que HLA-DR3 é um alelo que é prevalente em. populações caucasianas, negras e hispânicas, a capacidade de ligação a DR3 constitui um critério relevante na selecção de epítopos de HTL. Assim, os péptidos que mostram potencial como candidatos também podem ser testados quanto à sua capacidade de ligação a DR3. No entanto, à luz da especificidade de ligação do motivo DR3, os péptidos que se ligam apenas a DR3 também podem ser considerados candidatos para inclusão numa formulação de vacina.

Para identificar eficazmente péptidos que se ligam a DR3, são analisados antigénios alvo de 158P1D7 quanto a sequências que suportem um dos dois motivos de ligação específicos para DR3 descritos por Geluk et al. (J. Immunol. 152: 5742-5748, 1994). Os péptidos correspondentes são então sintetizados e confirmados como tendo a aptidão para ligar DR3 com uma afinidade de 1 μΜ ou melhor, isto é, inferior a 1 μΜ. São encontrados péptidos que satisfazem A. Jl. cj c que podem sei

Qualificados c o m o ligadores de afinidade elevada a HLA de classe II.

Os epítopos de ligação a DR3 identificados deste modo são incluídos em composições de vacina com epítopos de péptidos que suportam supermotivos DR. 193

De um modo semelhantes ao caso dos péptidos que suportam motivos HLA de classe I, os péptidos que suportam, motivos de classe II são submetidos a analogia para melhorar a afinidade ou a inter-reactividade. Por exemplo, o ácido aspártico na posição 4 da sequência de núcleo 9-mer é um resíduo óptimo para ligação a DR3 e a substituição por esse resíduo melhora frequentemente a ligação a DR3.

Exemplo 15: imunogenicidade de epítopos de HTL provenientes de 158P1D7

Este exemplo determina os epítopos imunogénicos que suportam motivos DR3 e supermotivos DR entre aqueles identificados utilizando a metodologia aqui apresentada. A imunogenicidade dos epítopos de HTL é confirmada de um modo análogo à determinação de imunogenicidade de epítopos de CTL, avaliando a aptidão para estimular respostas de HTL e/ou utilizando modelos de murganhos transgénicos adequados. A imunogenicidade é determinada por pesquisa quanto: 1.) indução primária in vitro utilizando

PrsMC normais ou 2. resoostas recaída partir de pacientes qi :êm tumores que expressam '158P1D7 de

Exemplo 16: cálculo das frequências supertipos HLA em diversas referências étnicas para se determinar a amplitude da cobertura de populações

Este exemplo ilustra a avaliação da cobertura de população de uma composição de vacina constituída por epítopos múitipios que incluem múltiplos supermotivos e/ou motivos.

Para se analisar a cobertura de população, são determinadas as frequências ae genes dos alelos HLA.. As 194 frequências de genes para cada alelo HLA são calculadas a partir das frequências do antigénio ou alelo utilizando a fórmula de distribuição binomial gf = 1 - (SQRT(f-af)) (ver, v.g., Sidney et al., Human Immunol. 45: 79-93, 1996). Para se obter as frequências fenotípicas totais, são calculadas frequências de genes cumulativas e as frequências de antigénios cumulativas obtidas através da utilização da fórmula inversa [af = 1 - (1 - Cgf)zj.

Quando os dados de frequêr 1 ^ -l- Cl não se encon d .1 s p o n í. v e i s a o nível da escrita pi ADN, assume-se correspondência com as frequências de antigé: nios defin ima sericamente. Para se obter a cobertura da populaçao de supertipo potencial total, não se assume qualquer desequ.il í de xigaçao, apenas os i leios que são B * 5 3 01 / B * 5 4 01, B*5501_2, B*5601, B*6701 e B*7501 (potencialmente também B*x^q]_ b*3504-06, B * 4 2 01 e B * 5 6 0 2 ) . confirmados como pertencentes a cada um dos supertipos são incluídos (estimativas mínimas). As estimativas da cobertura potencial total alcançada por combinações inter-locais são efectuadas por meio da adição à cobertura A da proporção da população coberta não A que seria esperado estarem cobertos pelos alelos B considerados (v.g., total = A + B * (1-A)). Os membros confirmados do supertipo de tipo A3 são A3, A11, A31, A*3301 e A*6801. embora o supertipo do tipo A3 também possa incluir A34, A66 e a*7401, estes cilelos não são incluídos nos cálculos da freauência alobal. De igual modo, os membros confirmados da família de supertipo de tipo A2 são A*0201, .A* 02 02, A* 02 03, A*0204, A * 0 2 0 5, A*02 0 6, A*0207, A*6802 e A*6901 . Por último, os alelos confirmados como sendo de supertipo cie ή pQ b7 são: B7, B*3501-03, 195 A cobertura de população alcançada pela combinação dos supertipos A2, A3 e B7 é aproximadamente 86% nos cinco grupos étnicos principais. A cobertura pode ser estendida por meio da inclusão dos péptidos que suportam os motivos AI e A24. Em média, o AI está presente em 12% e ο A24 em 29% da população dos cinco grupos étnicos principais (caucasiano, negro norte-americano, chinês, japonês e hispânico). Em conjunto, estes alelos são representados com uma frequência média de 39% nestas mesmas populações étnicas. A cobertura total nos grupos étnicos principais quando AI e A2 4 são combinados com a cobertura dos alelos de supertipo A2, A3 e B7 é > 95%. Ξ possível utilizar uma abordagem análoga para estimar a cobertura de população alcançada por meio de combinações de epítopos que suportam motivos de classe II.

Os estudos de imunogenicidade em seres humanos (v.g., Bertoni et ai., J. Clin. Invest. 100: 503, 1997; Doolan et aí., Immunity 7: 97, 1997; e Threlkeld et ai., J. Immunol. 159: 1648, 1997) demonstraram que péptidos de ligação de inter-reactividade levada são quase sempre reconhecidos epítopos. A utilização de péptidos de ligação de inter-reactividade elevada constitui um critério de selecção importante na identificação de epítopos candidatos a inclusão numa vacina que é imunogénica numa popuiaçao diversa.

Com um número suficiente de epítopos (conforme aqui descrito e conforme descrito na especialidade), prevê-se que a cobertura de população média seja superior a 95% em cadci uma das cinco populações étnicas principais. A análise de simulação de Monte Cario da teoria de jogo, que é conhecida na especialidade (ver, v.g., Osbome, M.J. e 196

Rubinstein, A. "A course in game theory" MIT Press, 1994), pode ser ut il izada para estimar que ; percentagem de indivíduos numa populaçao constituída pelos grupos étnicos caucasiano, ne gro norte-americano, ja ponês, chinês e hispânico iria reconhecer os epitopos de vacina aqui descritos. Uma Dereent agem preferida é de 9 0 %. Uma percentagem mais preferida é de 95%.

Exemplo 17: reconhecimento de CTL de antigénios processados endogenamente após estimulação

Este exemplo confirma que os CTL induzidos por epitopos de péptídos nativos ou transformados por analogia/ identificados e seleccionados tal como aqui descrito, reconhecem antigénios nativos sintetizados endogenamente.

As células efectoras isoladas a partir de murganhos transgénicos que são imunizadas com epitopos de péptidos, por exemplo, epitopos que suportam supermotivo HLA-A2, sao novamente estimuladas in vit.ro utilizando células estimuladoras revestidas com péptido. Decorridos seis dias, as células efectoras são testadas quanto a citotoxicidade e as linhagens celulares que contêm actividade citotóxica específica do péptido são novamente estimuladas. Decorridos ma is seis dias, estas células são testadas quanto a citotoxicidaide em células alvo Jurkat-A2.1/KJ° marcadas com "'Cr na ausência ou na presença do péptido e são também testadas em células alvo marcadas com J1Cr que suportam o antigénio endogenamente sintetizado, isto é, células que são transfectadas de um modo estável com vectores de expressão de 158P1D7.

Os resultados mostram que as linhagens de CTL obtidas a partir de animais com epítopo de péptido reconhecem o 197 197 antigénio cie do modelo de 158P1D7 sintetizado endogenamente. A selecção murganho transgénico a utilizar para uma tal análise depende do(s) epítopo(s) em avaliação. Para além do modelo de murganho transgénico HLA-A*0201/K3, há diversos outros modelos de murganho transgénico, incluindo murganho com All humano, que também é possível utilizar para avaliar os epítopos A3 e os B7, que tem sido caracterizados e outros que estão em desenvolvimento (v.g., murganho transgénico para HLA-A1 e A24). Os modelos de murganho HLA-DR1 e HLA-DR3 foram também desenvolvidos, os quais podem, ser utilizados para avaliar epítopos de HTL.

Exemplo 18: actividade de epítopos conjugados CTL-HTL em murganhos transgénicos

Este exemplo ilustra a indução de CTL e HTL em murganhos transgénicos, por meio da utilização de composições de vacina de péptidos CTL e HTL obtidos a partir de 158P1D7. As composições de vacina aqui utilizadas compreendem péptidos que se pretende administrar a um paciente com um tumor que expressa 158P1D7, A composição de péptido pode compreender múltiplos epítopos de CTL e/ou HTL. Os epítopos são identificados utilizando a metodologia aqui descrita. Este exemplo também ilustra que é possível alcançar uma imunogenicidade melhorada por meio da inclusão de um ou mais epítopos cie HTL numa composição de vacina cie CTL; uma tal composição de péptido pode compreender um epítopo de HTL conjugado com um epítopo de CTL. 0 epítopo de CTL pode ser um que se ligue a múltiplos membros da família HLA com uma afinidade de 500 nM ou inferior ou análogos desse epítopo. Se desejado, os péptidos podem ser lip.id.ados. 198 ocedimentos de Imunização: a imunização de murganhos transgénicos é efectuada. conforme descrito (Alexander et al., u. Immunol. 159: 4753-4761, 1997). Por exemplo, murganhos A2/Kb, os quais são transgénicos para o alelo HLA A2.1 humano e são utilizados para confirmar a imunogenicidade de epítopos que suportam o motivo HLA-A*0201 ou o supermotivo HLA-A2, e são estimulados subcutaneamente (base da cauda) com 0,1 mL de péptido em adjuvante incompleto de Freund, ou se a composição de péptido for um conjugado CTL/HTL lipidado, em DMSO/soluto salino ou se a composição de péptido for um polipeptido em PBS ou adjuvante incompleto de Freund. Decorridos sete dias após a estimulação, os esplenócitos obtidos a partir destes animais sâo novamente estimulados com linfoblastos activados com LFS irradiado singénicos revestidos com péptido.

Linhagens celulares: as células alvo para ensaios de citotoxicida.de especifica de péptido são células Jurkat transfectadas com o gene quimérico HLA-A2.1/Kb íed. 1 73 : 1007, 199 D · :ro: um a semana após a (30 X 106 células /frase o) i 37‘ 3C com linf oblast. s~\ X 10( células/ frasco ), cos, ern . 10 mL de meio de seis dias, as célul as (v.g., Vitiello et al., J. Exp. Med.

Activação de CTL in vitro: estimulação, as células de ba são mantidas em co-cultura a revestidos com péptido (10 irradiadas (3000 rads), singeneicos, cultura/frasco T25. Decorridos sei efectoras são colhidas e testadas quanto a actividade citotóxica.

Ensaio de actividade citotóxica: as células alvo (1,0

a 1,5 x 106) são mantidas a incubar a 37°C na >resenca de 200 pL de 51Cr. Decorridos 60 minutos, as cerufas âo 199 lavadas três vezes e são novamente colocadas em suspensão em. meio RIO. 0 péptido é adicionado numa concentração de 1 yg/mL. Para o ensaio, 104 células alvo marcadas com 51Cr são adicionadas em concentrações diferentes de células efectoras (volume final de 200 pL) em placas de fundo em U com 96 cavidades. Após um período de incubação de seis horas a 37°C, remove-se 0,1 ml de uma aliquota de sobrenadante a partir de cada cavidade e determina-se a radioactividade num contador gama automático Micromedic. Determina-se a percentagem de lise específica pela fórmula: percentagem de libertação específica = 100 x (libertação experimental - libertação espontânea)/(libertação máxima -libertação espontânea). Para facilitar a comparação entre ensaios de CTL separados efectuados sob as mesmas condições, expressa-se os dados de % libertação de 51Cr como unidades líticas/106 células. Uma unidade lítica é arbitrariamente definida como o número de células efectoras necessárias para s se alcançar uma lise de 30% de 10000 células alvo num ensaio de libertação de Cr de seis horas. Parai se obt er unidades líticas e spec íficas/10 f CS.Í5 unidaaes nticas/i0° obtidas na ausência do péptido sao subtraídas das unidades líticas/106 obtidas na presença de péptido. Por exemplo, no caso de se obter uma libertação de 31Cr de 30% parei uma proporção entre efector ( E):alvo (T) de 50:1 (i sto é, 5 X 10 células efectoras para 10 000 alvos) na ausência de péptido e 5:1 (is t o é, 5 X 104 células efectoras pa ra 10000 al .vos) na presença de péptido, então as unidades de lise específica seriam: [(1/50000)-(1/500000)] x 106 = 18 LU.

Os resultados são anaiísaoos para avaliar a magnitude das respostas. o.e CTn de animais injectados com a vacina d.e 200 conjugado CTL/HTL imunogénica e são comparados com a magnitude da resposta de CTL alcançada utilizando, por exemplo, os epítopos de CTL descritos antes no exemplo intitulado "Confirmação de imunogenicidade". É possível efectuar análise semelhantes a esta para confirmar a contêm de HTL. que uma que uma destas imunogenicidade de conjugados de péptidos que múltiplos epítopos de CTL e/ou múltiplos epítopos De acordo com estes procedimentos, conclui-se resposta de CTL é induzida e, concomitantemente, resposta de HTL é induzida após administração composiçoes.

Exemplo 19: selecção de epítopos de CTL e HTL para inclusão numa vacina específica para 158P1D7

Este exemplo ilustra um procedimento para a selecção de epítopos de péptido para composições de vacina da invenção. Os péptidos na invenção podem estar sob a forma de uma sequência de ácidos nucleicos, que uma. sequência individual ou uma ou várias sequências (isto é, minigene) que codifica o péptido(s) ou podem ser péptidos com um epítopo individual ou poliepitópicos.

Os princípios seguintes sao utilizados durante a. selecção de diversos epÍLopos para. inclusão numa, composição de vacina. Cada um dos princípios seguintes é equilibrado de modo a efectuar a selecção. São seleccionados epítopos que, após administração, imitam respostas imunes que estão correlacionadas com a destruição de 158P1D7. O número de epítopos utilizado depenae das observações d.e pacientes que destroem espontaneamente I08PID /. mor exemplo, no ciso de ter sido ooservado que pac ieiiL.es que deotroem espontaneamente 201 158P1D7 geram uma resposta imune a pelo menos três (3) epítopos a partir do antigénio de 158P1D7, então três ou quatro (3-4) epítopos deverão ser incluídos para HLA de ciasse I. É utilizada uma razão semelhante para determinar os epítopos de HLA classe II. São frequentemente seleccionados epítopos que possuem uma afinidade de ligação com CI50 de 500 nM ou inferior para uma molécula de HLA de classe I ou para a classe II um valor Cl só de 10 00 nM ou inferior; ou péptidos de HLA de classe I com classificações elevadas de ligação a partir do sítio BIMAS, em URL blmas.dert.nih.qov/,

Para se alccinçar uma ampla cobertura da. vacina ao longo de uma população diversa, são seleccionados péptidos que suportam supermotivos suficientes ou um conjunto suficiente de péptidos que suportam motivos específicos de alelos para se obter uma ampla cobertura de população. De acordo com uma variante, são seleccionados epítopos para proporcionar pelo menos 80% de cobertura da população. É possível utilizar uma análise de Monte Cario, que é uma

avaliaLção estcitística conhecida na especialidade, paraL avaliar a amplitude, ou redundância, da cobertura de população.

Quando se cria composições poliepitépicas, ou um minigene que as codifica, é tipicamente desejável gerar o péptido mais pequeno possível que compreende os epítopos relevantes. Os princípios utilizados são semelhantes, se não os mesmos, que os utilizados para a selecção de um péptido que compreende epítopos encaixados. Por exemplo, uma sequência de proteína para a composição de vacina é seleccíonado devido ao facto de apresentar um número máximo ^epi topos contidos na. sequ.ènc.ia, isto e, possui uma 202 c o n c e nt ração elevada de epítopos. Os epítopos podem ser encaixados ou sobrepostos (isto é, desviados no quadro em ilação ao outro). Por exemplo, no caso de epítopos sobrepostos, dois epítopos 9-mer e um epítopo 10-mer podem estar presentes num péptido com 10 aminoácidos. Cada ePítopo pode ser exposto e ligado por meio de uma molécula HLA, após a administração de um tal péptido, Um péptido ^ulti-epitópico pode ser gerado sinteticamente, recombinantemente ou por meio de clivagem a partir de uma íonte natural. Em alternativa, é possível preparar um análogo a partir desta sequência nativa, em que um ou mais ePítopos compreendem substituições que alteram as oriedades de inter-react ividade e/ou de afinidade de ligação do péptido poliepitópico. Uma tal composição de vacina é administrada para fins terapêuticos ou

Profilácticos. Esta variante proporciona a possibilidade de um aspecto ainda não descoberto do processamento do sistema imune irá ser aplicado à sequência encaixada nativa, facilitando assim a produção de composições de vacina, terapêuticas ou profilácticas, indutoras de uma resposta imune. Além do mais, uma tal variante proporciona a possibilidade de epítopos que suportam motivos serem transformados por uma HLA, a qual é ainda desconhecida. Além disso, esta variante (ausente da criação de quaisquer análogos) dirige a resposta imune para múltiplas sequências de péptidos que estão actualmente presentes em 158P1D7, evitando assim a necessidade de avaliar quaisquer epítopos de junção. Por último, a variante proporciona uma economia em escala na produção de composições de vacina de ácidos nucleicos. Em relação a esta variante, é possível obter programas informáticos de acordo com os princípios da 203 especialidade, os quais identificam numa sequência alvo, o maior número de epítopos por comprimento de sequência.

Quando administrada, uma composição de vacina constituída por péptidos seleccionados é seaura, eficaz e te em magnitude à células limpas que desencadeia uma resposta imune semelhan resposta imune de células de controlo ou suportam ou sobreexpressam 158P1D7.

Exemplo 20: construção de plasmídeos de adn de multi-epítopos "minigene"

Este exemplo descreve a construção de um plasmídeo de expressão de mmigene. Como é evidente, os plasmídeos de mmigene podem apresentar diversas configurações de células B, epítopos CTL e/ou HTL ou análogos de epítopos, tal como aqui descrito.

Um plasmídeo de expressão de de tipicamente múltiplos epítopos presente exemplo, epítopos supermotivos HLA-A2, HLA-A3, que suportam motivos HLA-A1 conjunto com epítopos g· epítopos DR3. São minigene compreende péptido CTL e HTL. No péptido que suportara HLA-B7 e epítopos de péptido e HLA-A24 são utilizados em suportam supermotivo DR e/ou /-·, r\ r-.\ ue seleccionados epítopos de péptido que suportam supermo vo ou motivo de HLA de classe I obtidos a partir de múltiplos 15 8P1D l de modo supermotivos/motivos que estejam representados para garantir uma ampla um modo semelhante, são classe II obtidos a partir uma amola cobertura de cobertura de população. De seleccionados epítopos de HLA de de 158rlD / para proporcionar populaçao, sto é, são seleccionados pítopos que suportam s que suportam motivo HLA do minigene. Os epítopos supermotivo HLA Dk-1-4-7 e epítopo DR-3 para inclusão na construção 204 de CTL e HTL são então incorporados num minigene para expressão num vector de expressão.

Uma tal construção pode ainda incluir sequências que dirigem os epítopos de HTL para o retículo endoplásmico. Por exemplo, a proteína li pode ser fundida a um ou mais epítopos de HTL conforme descrito na especialidade, em que a sequência CLIP da proteína li é removida e substituída com uma sequência de epítopo de HLA de classe II, de modo que o epítopo de HLA de classe II seja dirigido para o retículo endoplásmico, onde o epítopo se liga a moléculas de HLA de classe II.

Este exemplo ilustra os métodos que se irão utilizar para a construção de um plasmídeo de expressão que suporta um minigene. Encontram-se disponíveis outros vectores de expressão que é possível utilizar para composições de minigene, os quais são conhecidos pelos especialistas na matéria. O plasmídeo de ADN de minigene deste exemplo contém, uma sequência Kozak de consenso e uma sequência de sinal de cadeia leve de Ig kapa de murino de consenso seguida por epítopos CTL e./ou HTL seleccionados de acordo com os princípios aqui descritos. A sequência codifica um grelha de leitura aberta fundido ao marcador do epítopo de anticorpo Myc e His codificado pelo vector pcDNA 3.1 Myc-His.

Os oligonucleótidos sobrepostos, os quais podem, por exemplo, ter em média cerca de 70 nucleótidos em comprimento com sobreposições de 15 nucleótidos, são sintetizados e purificados por HPLC. Os oligonucleótidos codificam os epítopos de péptido seleccionados, bem como nucleótidos ligadores adequados, a sequência de Kozak e a 205 sequência de sinal, o minigene multietópico final é montado por extensão dos oligonucleótidos sobrepostos era três conjuntos de reacção utilizando PCR. Utiliza-se um dispositivo de PCR Perkin/Elmer 9600, sendo realizado um total de 30 ciclos utilizando as condições seguintes: 95°C durante 15 segundos, temperatura de recombinação (5°C abaixo da Tm calculada inferior de cada par de iniciador) durante 30 segundos e 72°C durante 1 minuto.

Por exemplo, um minigene é preparado do modo seguinte.

Para. uma primeira reacção de um dos dois oligonucleótic exemp lo utilizando oito oli pares oe iniciadores, combi 3 + 4, 5 + 6 e 7+8 em 100 pL d< Pfu polimerase (lx = KC1 J IR, recombina-se 5 pg de cada e depois estende-se; num nucleótidos, isto é, quatro -se os oligonucleótidos 1+2, de tampão de reacção que contém .0 mM, (NH4)2SC>4 10 mM, Tris- cloreto 20 mM, pH 8,75, MgS04 2 mM, 0,1% de Triton X-100, 100 pg/mL de BSA) , 0,25 mM de cada dNTP e 2,5 U de era.se. Os produtos dimér icos de são purificados em gel e mi st' ura que contém o produto de 1 + 2 e 3 + 4 0

Pfu poli completo 5+6 e 7+8, recombina-se e estende-se durante 10 ciclos. Mistura-se então metade das duas reacções, submete-se a 5 cicxos de recombinaçao e extensão e depois adiciona-se os iniciadores de flanqueamento para amplificar o produto de comprimento completo. Purifrca—se através de gel o produto de comprimento completo, clona-se numa extremidade de pCR (riivitrogen) e analisa-se os clones individuais por sequenciação. 206

Exemplo 21: a construção de plasmídeo e o grau para o qual induz imunogenicidade 0 grau para o qual uma construção de plasmídeo, por exemplo, um plasmídeo construído de acordo com o exemplo anterior, é capaz de induzir imunogenicidade é confirmado in vitro pode meio da determinação da apresentação de epítopo, por APC após transdução ou transfecção das APC com uma construção de ácido nucleico que expressa o epítopo. Um tal estudo determina a "antigenicidade" e permite a utilização de APC humanas. O ensaio determina a aptidão do epítopo para ser apresentado pelas APC, num contexto que é reconhecido por uma célula T, quantificando a densidade de complexos epítopo-HLA de classe I sobre a superfície da célula. A quantificação pode ser efectuada por medição

directa da quantidade de péptido eluido a partir das APC (ver, v.g., Sijts e t aí., J. Immunol. 1 56: 683-692, 1996; Demotz et aí., Nature 342 : 682-684, 19! 39); ou 0 número de complexos péptido -HLA de classe J. pode ser estimado por medição < ia quanti dade de lise ou de libertação . U _i_ cL S alvo doentes OU LÇão da concentração de n í v e i s e qu .1 v a 1 entes de (ver , e.g., Kageyama et -dade é confirmada 1 20 r de linfoquina induzida pelas < transfectadas e posterior deterrn: péptido necessária para se obte lise ou de libertação de linfoquina (v? aí., J. Immunol. 154: 557-575, 1995)

Sm alternativa, a inmnogen: meio de injecçoes in vivo em murganhos e subsequente avaliação in vitro da actividade de CTL e HTL, as quais são analisadas através de ensaios de citotoxicidade e proliferação, respectivamente, conforme descrito, v.g., por Alexander e t al., Iirununi t y 1: 751-761, 1994. 207

Por exemplo, para se confirmar a capacidade de uma construção de minigene de ADN que contém pelo menos um. péptido de supermotivo HLA-A2 para induzir CTL in vivo, são imunizados murganhos transgénicos HLA-A2.1/Kb, por exemplo, por via intramuscular com 100 yg de ADNc desguarnecido. Como meio para a comparação do nível de CTL induzido pela imunização com ADNc, um grupo de animais de controlo também é imunizado com uma composição de péptido real que compreende múltiplos epítopos sintetizados como um p o 1 i p e p t i d o i n d i v i d u tal como seriam codificados pelo minigene.

Os esplenócitos provenientes de animais imunizados são estimulados duas vezes cada uma delas com as composições respectivas (epítopos de péptido codificados no minigene ou péptido poliepitópico), e depois testados quanto à actividade citotóxica específica do péptido num ensaio de libertaça< o cie Cr. Os resultados indicam a amplitude da resposta de CTL di rigida. contra o epítopo restrito A2, indicando assim 3. imunogenicidade in vivo da vacina de minigene e da vacina poliepitópica.

Assim sendo, conclui-se que o minigene desencadeia uma resposta dirigida aos epítopos de péptido com supermotivo HLA-A2, tal como o faz a vacina de péptido poliepitópico. Também é efectusLda uma análise semelhante utilizando outros modelos de murganhos transgénicos HLA-A3 e HLA-B7 para testar a indução de CTL pelos epítopos de motivo ou ipermotivo HLA-A3 e HLA- concluindo-se também que o minigene desencadeia respostas imunes adequadas dirigidas para os epítopos proporcionados.

Para confirmar a capacidade de um minigene que codifica um epítopo de classe II para induzir HTL in vivo, 208 sao imunizados murganhos transgénicos DR, ou para aqueles epitopos que inter-reagem com a molécula MHC de murganho adequada, por exemplo, murganhos restritos I-A°, por via intramuscular com 1000 ug de plasmídeo de ADN. Como meio de comparação do nível de HTL induzido pela imunização com ADN, um grupo de animais de controlo é também imunizado com uma composição de péptido actual emulsionada em adjuvante completo de Freund. As células T CD4 + , isto é, HTL, são purificadas a partir de esplenócitos de animais imunizados e estimuladas com cada um das composições respectivas ípéptidos codificados no minigene). A resposta de HTL é medida utilizando um ensaio de proliferação com incorporação de H-timidina (ver, v.g., Alexander et ai. Immunity 1: 751-761, 1994). Os resultados indicam a magnitude da resposta de HTL, demonstrando assim a imunogenicidade in vivo do minigene.

Os minigenes de ADN, construídos conforme descrito no exempio anter: imbém podem ser confirmados como vacina em combinação com um agente de reforço utilizando um protocolo de reforço de iniciação. O agente de reforço pode ser constituído por uma proteína recombinante (v.g., Barnett et aí., Aids Res. and Human Retroviruses 1.4, Supplement 3: 5299-S309, 1998) ou vaccinia recombinante, por exemplo, que expressa um minigene ou ADN que codifica a proteína completa relevante (ver, v.g,, Hanke et aí., Vaccine 16: 439-445, 1998; Sedegah et al., Proc. Natl. Acad. Sei USA 95: 7648-53, 1998; Hanke e McMichael,

Immunol. Letters 66: 177-181, 1999; e Robinson et ai Nature Med. 5: 52 6-3 4, 1999) .

Por exemplo, a eficácia do minigene de .ADN utilizado num protocolo de reforço de iniciação é avaliado, 209 209 exemplo, são :om 100 pg de imunogénicos, inicialmente, em murganhos transgénicos. Neste imunizados IM murganhos transgénicos A2.1/Kb c um minigene de ADN que codifica os péptidos incluindo pelo menos um péptido que suporta um supermoOtovo HLA-A2. Após um período de incubação (compreendido entre 3 e 9 semanas), os murganhos são reforçados IP com 10' pfu/murganho de um vírus vaccinia recombinante que expressa a mesma sequência codificada pelo minigene de ADN. São imunizados murganhos de controlo com 100 μα de ADN ou de vaccinia recombinante sem a sequência do minigene, ou com. o com duas foram para. ADN que codifica o minigene, mas na ausência do reforç vaccinia. Após um período de incubação inicial de semanas, os esplenócitos provenientes dos murganhos imediatamente testados quanto a actividade específica o péptido num ensaio ELISPOT. Além disso, os esplenócitos s N— f'—' u. são estimulados in vitro com epítopos de A2 codificados no minigene e em vaccinia recombinante, e depois foram testados quanto a actividade específica para o péptido num ensaio ELISA de IFN alfa, beta e/ou gama.

Conclui-se que o minigene utilizado no protocolo de reforço de iniciação desencadeia respostas imunes superiores para os péptidos com supermotivo HLA-A2 do que o ADN por si só. Uma tal análise também pode ser efectuada utilizando modelos de murganhos transgénicos HLA-AI1 ou HLA-B7 para testas a indução de CTL por epítopos com motivo ou supermotivo hlA-Au ou HLA-B7. a utilização de protocolos de reforço de iniciação em. seres humanos é a seguir descrita no exemplo inritulado "Indução de respostas de CTL utilizando um protocolo de reforço de iniciação". 210

Exemplo 22: composição da péptido para utilizações profilácticas

As composições de vacina da presente invenção podem ser utilizadas para prevenir a expressão de 158P1D7 em pessoas qu e ap resentem risco para tumores Que exores sem este antigénio. Por exemplo, i ima composição de ep.itopo de péptido poliepitópico (ou um ácido nucleico que compreende o mesmo) que contém múltiplos epítopos de CTL e HTL, tais como os seleccionados nos exemplos anteriores, os quais são ainda seleccionados para abranger mais de 80% a população, é administrada a indivíduos em risco de um tumor associado a 158P1D7.

Por exemplo, uma composição com base em péptido é apresentada sob a forma de um. polipeptido individual que abrange múltiplos epítopos. A vacina é tipicamente administrada numa solução fisiológica que compreende um adjuvante, tal como adjuvante incompleto de Freund. A dose de péptido para a imunização inicial está compreendida entre cerca de 1 e cerca de 50000 pg e geralmente entre 100 e 50 0 0 pg, para um paciente com 70 kg. A administração inicial de vacina é seguida por dosagens de reforço em intervalos de 4 semanas, seguindo-se a ci v 3. r _Í. ãÇâ O da magnitude da resposta imune no paciente por meio de técnicas que determinam a presenç a de popul .ações de CTL específicas do pépt .ido numa amostr •a de PBMC. As doses de reforço : 3UP1 ement ares se o cie. Iministrada s consoa nte necessário. Conclui-se que a composição é segura e eficaz como profilaxia contra doenças associadas a 158P1D7.

Em alternativa, é utilizada uma composição que compreende tipicamente agentes de transfecção para a administração de uma vacina com base em ácido nucleico, em 211 conformidade com metodologias a.cru.i descritas. conhecidas na especialidade e 23: composições de vacina poliepitópicas obtidas a partir de sequências de 158P1D7 nativas

Uma sequência de poliproteína 158P1D7 nativa é analisada, de preferência utilizando algoritmos por computador definidos para cada supermotivo ou motivo de classe I e/ou de classe II, para identificar regiões '"'relativamente curtas" da poliproteína que compreendem. múltiplos epítopos. As regiões "relativamente curtas" são preferencialmente inferiores em termos de comprimento do que ura antigénio nativo inteiro. Esta sequência relativamente curta que contém múltiplos epítopos "encaixados", diferentes ou sobrepostos, é seleccionada; pode ser utilizada para gerar uma construção de minigene. A construção é manipulada de modo a expressar o péptido, o qual corresponde à sequência de proteína nativa. De um modo geral, o péptido "relativamente curto" possui um comprimento inferior a 250 aminoácidos, frequentemente um comprimento inferior a 100 aminoácidos, de preferência um comprimento inferior a 75 aminoácidos e mais preferencialmente um comprimento inferior a 50 aminoácidos. A sequênciSL de proteína da composição de vacina é seleccionada pelo facto de possuir um número máximo de epítopos contidos na sequência, isto é, possui uma concentração elevada de epítopos. Tal como aqui salientado, os motivos de epítopo podem ser encaixados ou sobrepostos (isto é, com o quadro desviado em relação ao outro) . Por exemplo, com epítopos sobrepostos, dois epítopos 9-mer e um epítopo 10-mer podem estar presentes num. péptido com 10 212 aminoácidos. Uma tal composição de vacina é administrada para fins terapêuticos ou profilácticos. A composição de vacina irá compreender, por exemplo, múltiplos epítopos de CTL a partir do antigénio de 158P1D7 e pelo menos um epítopo de HTL. Esta sequência nativa poliepitópica é administrada sob a forma de um péptido ou de uma sequência de ácidos nucleicos que codifica o péptido. Em alternativa, é possível preparar um análogo desta sequência nativa, em que um ou vários epítopos compreendem substituições que alteram, as propriedades de inter-reactividade e/ou de afinidade de ligação do péptido poliepitópico.

Variante um aspecto ai imune ser deste exemplo proporciona a possibilidade de nda não descoberto do processamento do sistema aplicado à sequência encaixada nativa, facilitando assim a produção de composições de vacina terapêuticas ou profilácticas que induzam respostas imunes. Além disso, uma tal variante proporciona a possibilidade de epítopos que suportam motivos para uma transformação de HL A, a qual nao é ainda conhecida. Além do mais, esta variante (excluindo uma variante por analogia) dirige a resposta imune para múltiplas sequências de péptido que estão actualmente presentes em 158P1D7 nativo, evitando assim sl necessidade de avaliar epítopos resultantes de junções. For último, a variante proporciona uma morna em escala durante a produção das composições de vacina de péptido ou de ácido nucleico.

Associada a esta variante, encontram-se disponíveis programas informáticos na especialidade que podem ser utilizados para identificar, numa sequência alvo, o maior número de epítopos por comprimento de sequência. 213

Exemplo 24: composições de vacina poliepitópicas provenientes de múltiplos antigénios

Os epítopos do péptido de 158P1D7 são utilizados em conjunto com epítopos provenientes de outros antigénios alvo associados a tumores, para criar uma composição de vacina que é útil para a prevenção ou para o tratamento de cancro da bexiga que expresse 158P1D7 e esses outros antigénios. Por exemplo, é possível proporcionar uma composição de vacina sob a forma de um polipeptido individual que incorpore múltiplos epítopos provenientes de 158P1D7, bem como antigénios associados a tumores que são frequentemente expressos com um cancro da bexiga alvo ou podem ser administrados compreende uma mistura de Em alternativa, a vacina associado à expressão de 158P1D7, sob a forma de uma composição que um ou vários epítopos discretos. pode ser administrada sob a forma de uma construção de minigene ou de células dendríticas que foram carregadas com. os epítopos de péptido in vitro.

Exemplo 25: utilização de péptidos para avaliar uma resposta imune s para analisar uma ticorpos específicos, tal análise pode ser et al., Science 279: utilizados péptidos o ou de prognóstico,

Os péptidos podem ser utilizado resposta imune quanto à presença de an1 CTL ou HTL, dirigidos a 158PID7. Uma efectuada de um modo descrito por Ogg 210-3---2.106, 1998, Neste exemplo, são como reagente para fins de diagnóstic não como um imunogénio. de

Neste exemplo, sao utilizados complexos tetraméricos antigénxo de leucócitos humanos com elevada 214

sensibixiaade ("tetrâmeros") para análise inter-seccional, por exemplo, de frequências de CTL específicas para HL ΔΑ 0201 ae 158P1l)7 obtidas a partir de indivíduos positivos a hlA A* U2 01 em diversos estádios da doença ou cipós imunização com um péptido derivado 158P1D7 que contém um motivo A*0201. Os complexos tetraméricos são sintetizados conrorme descrito (Musey et ai., N. Engl. J. Med. 337: 1267, -1.997). Resumidamente, a cadeia pesada de HLA pur±fii.,ada (A*02ul neste exemplo) e β2—microglobulina sao sintetizadas através de um sistema de expressão procuriótxco. A cadeia pesada é modificada por supressão da cauaa cxtosólica transmembranar e adição ao terminal COOH de uma sequencia que contém um local de biotinilação enzimático BirA. A cadeia pesada, a 32-microglobulina e o péptido são redobrados por diluição. O Produto redobrado de de oroteína 45 kD é isolado por cromatografia líquid; rápida e depois é submetida a biotinilação por BirA na presença de biotina (Sigma, st. Louis, Missouri), adenosina-5'-trifosfato e magnésio. O conjugado estreptavidina-ficoeritrina é adicionado numa proporção molar de 1:4 e o produto tetramérico é concentrado até 1 mg/mli. O produto resultante é designado como tetrâmero-ficoeritrina.

Para a análise de amostreis de sangue do paciente, aproximadamente um milhão de PBMC são centrifugadas a 300g durante 5 minutos e colocaaas novamente em suspensão em 50 pL de soluto salino frio tamponado com fosfato. A análise tricoxor é efectuada com o tetrâmero-ficoeritrina, em conjunto com anti-CD8-tricolor e anti-CD38. As PBMC são mantidas a incubar com tetramero e anticorpos em gelo durante 30 a 60 minutos, depois lavadas duas vezes e 215 fixadas com formaldeído. São aplicados portões para conter > 99,98% das amostras de controlo. Os controlos para os tetrâmeros compreendem indivíduos negativos a A*0201 <=, dadores não doentes positivos a A*0201. A percentagem de células manchadas com tetrâmero é então determinada por citometria de fluxo. Os resultados indicam o número de células na amostra de PBMC que contêm CTL restritas ao epítopo, indicando assim facilmente a extensão da resposta imune ao epítopo de 158P1D7 e, consequentemente, o estado de exposição a 158P1D7 ou exposição a uma vacina que proporcione uma resposta protectora ou terapêutica.

Exemplo 26: utilização de epítopos de péptido para avaliar respostas de memória reagentes respostas Uma tai e tenham.

Os epítopos de péptido são utilizados como para avaliar as respostas de células T, tais como agudas ou respostas de memória, em pacientes, análise pode ser efectuada em pacientes qi recuperado de doença associada a 108P1D7 ou que tenham sido vacinados com uma vacina de 153P1D7.

Por exemplo, é possível a nalisar a resposta de CTL restrita cie classe I de pessoas que tenham sido va cinadas. A vacina pode ser uma qualquer vacina de 158P1D7. As PBMC são recolhidas a partir de indivíduos vacinados e que possuem o tipo HLA péptido cia invenção supermotivos para múltiplos membros da São então utilizados epítopos que, de um modo óptimo, suportam proporcionar inter--reactivida.de com família de supertipo de HLA, para a _1S( de imostras pi 'jvenientí

Lli U j. v _l px u. W i transportam esse tipo de HLA. 216

As PBMC obtidas a partir de indivíduos vacinados são separadas em gradientes de densidade Ficoll-Histopaque (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO), lavadas três vezes em HESS (GIBCO Laboratories), colocadas novamente em suspensão em RPMI-1640 (GIBCO Laboratories) suplementado com L-glutamina (2 mM) , penicilina (50 U/mL), estreptomicina (50 yg/mL) e Hepes (10 mM) , contendo 10% de soro de AB humano termicamente inactivado (RPMI completo) e colocadas em placas utilizando formatos de microcultura. Adiciona-se um péptido sintético que compreende um epítopo da invenção a 10 gg/mL a cada cavidade e acrescenta-se o epítopo 128-140 de núcleo de VHB a 1 yg/rnL a cada cavidade como fonte de células T auxiliadoras durante a -orimeira semana de estimul .a-se 4 x 105 PBMC caao ni uma ρ r a c a de fundo .00 μ/· cavidade de RPMI :iona-si 5 1 u 0 μ L de RPMI f -i r“> ^ 1 luai. / de rIL-; 2 a cada est imulação. No format o de com pépt ido em p cu redondo com 9 6 r* completo • Nos d: ias com pleto e 20 U /mL cav idside . No dia ' r de fundo plano com ? pép tido, rIL- 2 e irradia·; ransfere-se as culturas paira uma placa cavidades e estimula-se novamente com 10”' células alimentadoras autólogas (3000 rad). Testa-se as culturas quanto à actividade citotóxica no dia 14. Uma resposta de positiva requer que duas ou mais das oito culturas replicado apresentem uma libertação de 3lCr específ superior a 14%, com base na comparação com sujeitos controlo não doentes, tal como descrito antes (Reherma:

CTL et al., Mature Med. 2: 1104-1108, 1996; Rehermann et ai., J. Clin. Invest. 97: 1655-1665, 1996; e Rehermann et al. J. Clin. Invest. 98: 1432-1440, 1996). 217

As linhagens celulares alvo são B-LCL transformadas com EBV autólogas e alogeneicas que são adquiridas à American Society for Histocompatibility and Immunogenetics (ASHl, Boston, MA) ou estabelecidas a partir de um conjunto de pacientes conforme descrito (Guilhot, et al., J. Virol. 66: 2670-2678, 1992).

Os ensaios de citotoxicidade são efectuados do modo seguinte. As células alvo constituídas pela linhagem celular linfoblastóide B transformada com EBV autóloga ou correspondente a HL A alogeneico são mantidas a incubar de um dia para o outro com o epítopo de péptido sintético a 10 μΜ e marcadas com 100 yCi de 51Cr (Amersham Corp., Arlington Heights, il) durante 1 hora, após o que são lavadas quatro vezes com HESS. A actividade citolítica é determinada num ensaio padrao de libertação de blCr em cavidades em separado de 4 horas, utilizando placas com fundo em U de 96 cavidades que contem. .3000 alvos/cavidae. As PBMC estimuladas são testadas para proporções efector/alvo (E/T) de 20-50:1 no dia 14. A percentagem de citotoxicidade é determinada a partir da fórmula: 100 x [(libertação experimental - libertação espontânea) /(libert ação máxima - 1i oerta ção espontânea) ' ] . A libertação máxima é determinada por lise de alvos com detergente (2% de Triton X-100; Sigma Chemical Co., St

Louis, MO) . A libertação espontânea é < 25% da libertação máxima para todas as experiências.

Os resultados de uma tal análise indicam o nível de populações de CTL restritas a HLA que foram estimuladas por exposição prévia a 158P1D7 ou a uma vacina de 158P1D7.

De igual modo, as respostas de Hm restritas a ciasse II também, podem ser analisadas. PBMC purificadas são 218 desenvolvidas em cultura numa placa de fundo plano com 96 cavidades a uma densidade de 1,5 x IO3 células/cavidade e são estimuladas com 10 pg/mL de péptido sintético, antigénio 158P1D7 total ou PHA. As células são colocadas de um modo rotineiro em placas com réplicas de 4 a 6 cavidades para cada condição. Após sete dias de cultura, remove-se o meio e substitui-se com meio fresco que contém 10 U/mL de IL-2. Decorridos dois dias, adiciona-se 1 pCi de :'H-timidina a cada cavidade e mantém-se a incubar durante mais 18 horas. Recolhe-se então o ADN celular em bases de fibra de vidro e analisa-se quanto à incorporação de 3H-timidina. Calcula-se a proliferação de células T específicas para antigénio como proporção da incorporação de 3H-timidina na presença de antigénio a dividir pela incorporação de 3H~ timidina na ausência de antigénio.

Exemplo 27: indução da resposta de CTL especifica em seres humanos

Prepara-se um ensaio clínico de seres humanos para uma composição imunogénica que compreende epítopos de CTL e HTL sob a forma de um estudo com escalonamento de dose, de fase I IND, o qual é efectuado sob a forma de um ensaio controlado com placebo, com dupla ocultação, aleatório. Um tal ensaio é concebido, por exemplo, do modo seguinte.

Um total de 27 indivíduos é inscrito e dividido em 3 grupos:

Grupo I : 3 sujeitos são i n j e c t. a d o s c o m placebo e 6 sujeitos são injectados co: m 5 pg da composição de péptido; Grupo I 1: 3 sujeitos são injectados com placebo e 6 sujeitos são i n j e c t a d o s co: m 50 pg da composição de péptido; 219 Grupo 111: 3 su jeitos são i sujeitos são injectados com 500 ua ijectaáos com placebo e 6 da composição de péptido.

Decorridas 4 semanas após a primeira injecção, os sujeitos recebem uma inoculação de reforço na dose. todos mesma 0 final medido tolerabilidade da imunogenicidade. As de péptido constiti desta composição de neste estudo diz respeito à segurança e composição de péptido, bem como a sua respostas imunes celulares à composição uem um índice da actividade i péptido, podendo assim ser con trínseca ideradas uma medida de encácia biológica. Os dados a seguir apresentados resumem os dados clínicos e laboratoricLÍs que dizem respeito aos objectivos em termos de segurança e encacia.

Segurança: a incidência monitorizada no placebo e no fármaco e avaliada em termos de Avaliação da eficácia da de eventos adversos é grupo de tratamento com grau e de reversibilidade, vacina: para se avaliar a eficacia da depois da periférico vacina, recolhe-se sangue dos sujeitos antes e mjecçao. As células mononucleares de sangue são isoladas a partir de sangue heparinizados fresco através de centrifugação de gradiente de densidade de Ficoll-Hypaque, divididas em aliquotas em meio de congeiamento e armazenadas congeladas. As amostras são testadas quanto à actividade de CTL e HTL. :iuj

Cp.,10 vacina e segura e eficaz

Exemplo 28: ensaios de fase II em pacientes que expressam 158P1D7

Os ensaios de fase II efeito da administração das

são efectuados para estudar o composições de péptido CTL-HTL 220 a pacientes que apresentam cancro da bexiga que expressa 15 8 P1D 7 . Os objectivos principais do 0 ro saio são determinar uma dose e um regime eficazes para 3. inclusão de CTL em pacientes com cancro da bexiga q ue expresse 158P1D7, estabelecer a segurança da indução de uma resposta de CTL e HTL nestes pacientes e observar até que nível de activação de CTL melhora o cenário clinico destes pacientes, tal como manifestado, v.g )e .a redução e/ou diminuição de lesões,

Um t estudo é concebido, por exen o, do modo seguinte.

Os >tudos sâo realizados em múltiplos centros concepção do ensaio consiste num protocolo de escalonamento de dose, não controlado, aberto, em que a composição de péptido é administrada sob a forma de uma dose individual seguida, decorridas seis semanas, por uma injecção individual de reforço da mesma dose. As doses são de 50, 500 e 5000 microgramas por injecção. São registados os efeitos adversos associados ao fármaco (gravidade e reversibilidade).

Ha três grupos de p>acientes. Ao primeiro grupo são injectados 50 microgramas da composição de péptido e ao segundo e terceiro grupos são injectados 500 e 5000 microgramas da composição de péptido, respectivamente. Os pacientes de cada grupo apresentam idades compreendidas entre 21 e 65 e representam diversos grupos étnicos. Todos eles possuem um tumor que expressa 158P1D7,

As manifestações clínicas ou repostas de células T especificas do antigénio são monitorizadas para avaliar os efeitos aa administração das composições de péptido. Conclui-se que a composição de vacina é segura e eficaz para o tratamento de doenças associadas a 158P1D7. 221

Exemplo 29: indução de respostas de CTL utilizando um protocolo de reforço de Iniciação

Também é possível utilizar um protocolo de reforço de iniciação, semelhante em termos de princípios, ao utilizado para confirmar a eficácia de uma vacina de ADN em murganhos transgénicos, tal como descrito antes no exemplo intitulado "A construção de plasmídeo e o nível até ao qual induz imunogenicidade", para a administração da vacina a seres humanos. Um tal regime de vacina pode compreender uma administração inicial, por exemplo, de ADN desguarnecido seguindo-se um reforço utilizando vírus recombinante que codifica a vacina ou uma mistura recombinante de proteína/polipeptido ou de um péptido administrada num adjuvante.

Por exemplo, a imunização inicial pode ser efectuada utilizando um vector de expressão, tal como o construído no exemplo intitulado "Construção de plasmídeos de ADN com multi-epítopos 'Minigene'", sob a forma de ácido nucleico desguarnecido administrado IM (ou SC ou ID) em quantidades compreendidas entre 0,5 e 5 mg em múltiplos locais. O ácido nucieico (0,1 a 1000 pg) também pode ser administrado usando uma pista de genes. Após um período de incubação de 3 a 4 semanas, é então administrada uma dose de reforço, o reforço pode ser um vírus de varíola aviária recombinante administrado numa dose de 5 x 107 a 5 x 109 pfu. Também é possívei utilizar um viius recombinante alternativo, tal como um MVA, canarypox, adenovírus ou vírus associado a. aoenovíruo, para o reforço, ou então e possível administrar a proteína poliepitópica ou uma mistura de péptidos. Para a avaliação da eficácia da vacina, são obtidas amostras de sangue d. o pacienut; ani_eo aa imumzaçao, bem como em. 222 222 intervalos após a adminis tração da vacina inicial e doses de reforço d. a v acina. As c é 1 u 1 as mo η o n u. c 1 e a: res de sangue periférico são isofadas a partir de sangue heparini zado fresco por centrifugação por gradiente de densidade de Ficoll-Hypa que, dividida s em aliquotas em meio de congelament o e armazenad as congeladas. As amostras são testadas quanto à actividade de CTL e HTL. anaiis e dos resultados indica que é gerada uma magnitude de resposta suficiente para alcançar uma imunidade terapêutica ou profilática, contra 158P1D7.

Exemplo 30: administração de composições de vacina utilizando células dendríticas (DC)

As vacinas que compreendem epitopos de péptido podem ser administradas utilizando APC ou APC "profissionais", tais como DC. Neste exemplo, DC estimuladas com péptido são admi n i s t r ada s vi vo a um paciente para estimular uma resposta de Neste método, as células dendríticas são imuladas com uma vacina que e HTL de péptido. As células infundidas no paciente para e HTL in vivo. As CTL e HTL ou facilitam a destruição, cilvo que suportam a proteína os epitopos na vacina foram isoladas, expandidas e est compreende epitopos de CTL dendríticas são novamente provocar respostas de CTL induzidas destroem então respectivamente, das células 158P1D7 a partir da qual obtidos.

Por exemplo, uma mistura de péptidos que compreendem epitopos é administrada ex vivo a PBMC, ou a DC isoladas a partir destas. É possível utilizar um fármaco para facilitar a recolha de DC, tal como Progenipoietin™ (Monsanto, St. Louis, MO) ou GM-CSF/IL-4. Após a 223 estimulação de DC com péptidos, e antes da re-infusão nos pacientes, as DC são lavadas para remover os péptidos não ligados.

Tal como será apreciado sob o ponto de vista clinico & facilmente determinado por um especialista na matéria com base nos resultados clínicos, o número de DC re-infundidas no paciente pode variar (ver, v.g., Nature Med. 4: 328, 1998; Nature Med. 2: 52, 1996 e Prostate 32: 272, 1997). Embora sejam tipicamente administradas 2 a 50 x 10° DC por paciente, também, é possível utilizar um número superior de tais populações de as PMBC carregadas sem p ur i fi c ação das DC, tal como 107 ou 108. Tipicamente, células contêm entre 50% a 90% de DC.

De acordo com algumas variantes, com péptido são injectadas em paciente DC. Por exemplo, as PBMC geradas após tratamento com um agente, tal como Progenipoietin™, são injectadas em pacientes sem purificação das DC. O número total de PBMC que são administradas está frequentemente compreendido entre IO8 e 10lu. De um modo geral, as doses de células injectadas em paciente é baseada na percentagem de DC no sangue de cada paciente, conforme determinado, por exemplo, por análise de imunofluorescência com anticorpos anti-DC específicos. Assim, por exemplo, no caso de Progenipoietin™ mobilízcir 2% de DC no sangue periférico de determinados pacientes e se pretender que o paciente receba 5 x 106 DC, então o paciente será injectado com um total de 2,5 x 103 PBMC carregadas com péptido. A percentagem de DC mobilizadas por um agente tal como Progenipoietin™ é tipicamente estimada como estando compreendida entre 2% e 10%, embora possa variar conforme é do conhecimento dos especialistas na matéria. 224

Activação ex vivo de respostas de CTL/HTL

Em alternativa, as respostas de CTL ou HTL ex vivo a antigénios de 158P1D7 pode ser induzida por incubação, em cultura de tecidos, com células precursoras de CTL ou HTL do paciente, ou geneticamente compatíveis, em conjunto com uma fonte de APC, tal como DC, e péptidos imunogénicos. Após um período de incubação adequado (tipicamente compreendido entre cerca células precursoras são efectoras, as células são onde irão destruir (CTL) das suas células alvo de 7 a 28 dias), durante o qual as activadas e expandidas em células submetidas a infusão no paciente, ou facilitar a destruição (HTL) específicas, isto é, células tumorais.

Exemplo 31: um método alternativo de identificação e confirmação de péptidos que suportam motivos

Um outro método de identificação e confirmação de péptidos que suportam motivo consiste em eluir estes péptidos a partir de células que suportam moléculas MHC detinidas. Por ex emplo, linhagens de célu las irS transformadas com í EBV utilizadas para a escrita em tecidos

foram já. bastante caracterizados para. determinar que moléculas de HLA expressam. Em determinados casos, estas células expressam apenas um tipo único de moléculas de HLA. Estas células podem ser transfectadas com ácidos nucleicos que expressam o antigénio relevante, v.g., 158P1D7. Os péptidos produzidos por processamento de antigénio endógeno de péptidos produzidos como resultado de transfecção irão então ligar-se a moléculas de HLA dentro da célula e ser transportadas e apresentadas sobre a superfície da célula. Os péptidos são então eluídos a partir das moléculas de HLA 225 por meio de exposição λ condições rigeiramente ácidas e é determinada a sua sequência. de aminoácidos, v. a., por análise espectral de massa (e.g., Kubo et al,, j. immunol. 152: 3913, 1994) . Visto que a. maioria dos péptidos que se iras de ligam a uma molécula de HíjA Particular sao oor^adc motivo, esta consiste numa moa a1i dade alternativa para obter os péptidos que suportam um motivo correlacionado com a molécula de HLA pcirtieuiar expressa na célula.

Em alternativa, é possível transfectar linhagens de células que não expressam moléculas de HLA endógeno com uma construção de expressão que codifica um alelo de HLA individual. KstcLS cérulas podem então ser utilizadas conforme descrito, isto é, podem ser transfectadas com ácidos nucleicos que codificam 158P1D7 para isolar péptidos que correspondem a 158P1D7 que foram apresentados sob a superfície da célula. Os péptidos obtidos a partir de uma tal análise irão ser portadores de motivo(s) que correspondera à ligação a um alelo de HLA individual que é exoresso na célula.

Conforme é conhecido na especialidade, é possível efectuar uma análise semelhante numa célula que suporta mais do que um alelo de HLA e, subsequentemente, determinar péptidos específicos para cada alelo de HLA expresso. Amém do mais, também será reconhecido pelos especialistas na matéria que é possível utilizar meios diferentes da transfecçao, tais como a carga com um antigénio de proteína, para proporcionar uma fonte de antigénio para a célula. 226

Exemplo 32: polinucleótidos complementares

As sequência complementares às sequências que codificam 158P1D7, ou quaisquer suas partes, são utilizadas para detectar, diminuir ou inibir a expressão de 158P1D7 que ocorre naturalmente. Embora a utilização de oligonucleótidos que compreende entre cerca de 15 e 30 pares de base seja descrita, é utilizado um procedimento praticamente idêntico com fragmentos de sequência mais curtos ou mais longos. Os oligonucleótidos adequados são concebidos utilizando, v.g., a aplicação informática OLTGO 4.06 (National Biosciences) e a sequência de codificação de 158PID7. Para inibir a transcrição, um oligonucleótido complementar é concebido a partir da sequência em 5' mais itar a ligação do promotor à. Para inibir a tradução, é > complementar para evitar a sequência de codificação concebido um oligonucleót: ligação ribossómica ao transcrito que codifica 158P1D7

Exemplo 33: purificação de 185F1D7 que ocorre naturalmente ou recombinante utilizando anticorpos específicos para 158P1D7 A 158P1D7 que ocorre naturalmente ou recombinante é substancialmente purificada por cromatografia de imuno-afinidade utilizando anticorpos específicos para 158P1D7. Uma coluna de imuno-afinidade é construída por acoplamento covalente de anticorpos anti-158PlD com uma resina cromatográfica activada, tal como SEPHAROSE activada com CNBr (Amersham Pharmacia Biotech). Após o acoplamento, a resma é bloqueada e lavada de acordo com as instruções do fabricante. 227 ’az-se passar meio que contém 158P1D7 através da Ções que permitam a absorção preferencial de 158P1D7 (v ° Çf · f tampões de elevada força iónicsi. na presença de deteroen-pq coluna de imu no ---afinidade e lava-se a coluna, sob co ond;

Elui-se a corur sob condições que perturbem a il(3açã0 anticorpo/158P1D7 (v.g., um tampão de pH 2 a p.H 3 0 α uma elevada concentração de um caotrópico, tal como ur^i

Ou íac .ocianato) e recolhe-se GCkP.

Exemplo 34; identificação de moléculas que interage»^ 158P1D7 .58P1D7, ou seus fragmentos biologicamente act--í vos, r, é marcada com reagente Bolton-Hunter 121 l. (Ver v.g., Bolton et ai. (1973) Bioc 133 : 52 9', 7- ^ > · As moléculas candidatas previamente montadas nas cavidades de uma placa com multi-cavidades são mantidas a incubar com 158P1D7 marcado, são lavadas e são testadas quaisquer cavidades com complexo de 158P1D7 marcado. Os dados obtidos utilizando concentrações diferentes de 158P1D7 são utilizados para calcular valores para o número, afinidaide e associação de 158P1D7 com as moléculas candidatas. Ao longo desta memória, descritiva, são referenciados diversos aaaos de publicações, pedidos e patentes de invenção com de sítios web. (Os sítios web são referenciados pelas suas moradas 'Uniform Resource Locator', ou URL, na World Wrde Web) . As descrições de cada um destes itens de informação sao aqui incorporadas por referência na sua totalidade. -ΓΡ

Exemplo 35: ensaio in vivo para a promoção do crescimento .. ——.......................luuinnnnnnnnjimuui ir........................*" -----------------*-----------------.«S mmnim—wmMWMiiiiiimmn tumoral de 158P1D7 228 0 efeito da proteína 158P1D7 sobre o crescimento celular do tumor pode ser confirmado in vivo por sobreexpressão do gene em células de cancro da bexiga. Por exemplo, é possivei injectar SQ murganhos SCrD em cada flanco com 1 x 106 células de cancro da bexiga (tais como células SCaBER, UM-UC-3, HT1376, RT4, T24, TCC-SUP, J82 e SW780) que contêm o vector vazio tkNeo ou 158P1D7. É possível utilizar pelo menos duas estratégias: (1) expressão de 158P1D7 constitutiva sob regulação de um promotor, tal como um promotor constitutivo obtido a partir de genomas de vírus, tais como o vírus de polioma, o vírus de varíola aviária (UK 2 21i 504, publicada a o de Julho de 1989), adenovírus (tal como Adenovírus 21, vírus do papiloma de bovino, vírus do sarcoma aviário, citomegalovírus, um retrovírus, vírus da hepatite B e vírus 40 de símios (SV40)), ou a partir de promotores de mamíferos heterólogos, v.g., o promotor actina ou um promotor de imunoglobulina, desde que tais promotores sejam, compatíveis com os sistemas de células hospedeiras; (2) expressão regulada sob o controlo de um sistema de vector indutível, tal como ecdisona, tet, etc., o qual pode ser utilizado desde que tais promotores sejam compatíveis com os sistemas de células hospedeiras. O volume do tumor é então monitorizado quanto ao aparecimento de tumores palpáveis e é acompanhado ao longo do tempo para determinar-se as células que expressam 158P1D7 de desenvolvem numa velocidade mais elevada e se os tumores produzidos pelas células que expressam 158P1D7 apresentam características de agressividade alteradas (v.g., aumento de metástases, resposta de vascularização reduzida a fármacos quimioterapêuticos). Além disso, é possível implantar 229 229 murai nhos com as mesmas células ortotopicamente para determinar se 158P1D7 possui um efeito sobre o crescimento local na bexiga· ou sobre a aptidão das células para criar metástases, especificamente nos pulmões ou nos nódulos linfáticos (Fu, X., et 3.1., Int. J, câncer, 199i. 49: págs. 938-939; Chang, S., et al., Anticancer Res., 1997. 17: págs. 3239-3242; Peralta, E. A., et al., J. Urol., 1999. 162: págs. 1806-1811). Além do mais, este ensaio é útil para confirmar o efeito inibitório sobre 158P1D7 de composições terapêuticas candidatas, tais como, por exemplo, anticorpos ou intracorpos de 158P1D7 e moléculas anti-sense ou ribozimas de 158P1D7.

Exemplo 36: inibição mediada por anticorpos monoclonais de 158P1P7 de tumores na bexiga in vivo A expressão significativa de 158P1D7 em tecidos cancerígenos, em conjunto com a expressão restrita em tecidos normais, torna a 158P1D7 um excelente alvo para terapia com anticorpos. Nos casos em que o anticorpo monoclonal alvo é uma proteína da superfície das célula, os anticorpos mostraram ser eficazes na inibição do crescimento tumoral (ver, v.g., (Saffran, D., et aí., PNAS 10: 1073—1078 ou www.pnas.org/cgi/doi/10.1073/pnas. Uól6246^8) .

Nos Cclsos em que o cilvo não está sobre a superfície das células, tal como PS A e PAP no cancro da próstata, os anticorpos m esmo assim i nostr aram reconr iecer e inibir o crescimento de c Θ1U .1.3. S que expressam estas proteínas (Saffran, D.C., et ai., Câncer and Metastasis Reviews, 1999. 18: págs. 437-449). Tal como qualquer proteína celular com um perfil de expressão restrito, a l5dP±D7 constitui ura alvo para imunoterapia com base em células T. 230

Assim sendo, a eficácia terapêutica de raAbs anti-158P1D7 em modelos em murganhos de cancro da bexiga humano é modulada em xenoenxertos de cancro da bexiga aue expressam 158P1D7 ou linhagens celulares de cancro da bexiga, tais como as descritos no exemplo (o exemplo intitulado "Ensaio in vivo para a promoção do crescimento tumoral de 158P1D7"), que foram manipuladas para expressar 158P1D7. A eficácia dos anticorpos no crescimento do tumor e na formação de metástases é confirmada, v.g., num modelo de xenoenxerto de cancro da bexiga ortotópica em murganhos. Os anticorpos podem ser não conjugados, conforme descrito neste exemplos, ou podem ser conjugados numa modalidade terapêutica, tal como é conhecido na especialidade. É confirmado que os mAbs anti-158P!D7 inibem a formação de tumores da bexiga que expressam 158P1D7. Os mAbs anti-158P1D7 também retardam o crescimento de tumores ortotópicos estabelecidos e prolongam, a sobrevivência de murganhos que apresentam tumores. Estes resultados indicam a utiliza o. a de mA-O s auL-i j. o 8 P1D / no trat ame n t o de esrádios locais ou avançados de cancro da bexiga. (Ver, v.g., Saffran, D., et ai., PNAS 10: 1073-1078 ou www.pnas.org/cgi/doi;10.1073/pnas.051624698). A administração de mAbs anti-158PlD7 retarda o crescimento de tumores ortotópicos estabelecidos e inibe a formação de metástases em locais distantes, resultando num prolongamento significativo na sobrevivência de murganhos que apresentam tumor. Estes estudos indicam que a 158P1D7 constitui um alvo atractivo para imunoterapia e mostra o potencial terapêutico de mAbs anti-158PlD7 para o tratamento de cancro da bexiga local e metastático. 231 Este exemplo demonstra que anticorpo 158P1D7 não conjugados são eficazes crescimento de tumores da bexiga humanos s monoclonais para inibir d e s e n v o 1 v i d o s de

oO em murganhos SCID; assim sendo, uma combinação de tais anticorpos monoclonais eficazes também é eficaz.

Inibição de tumores utilizando múltiplos mAbs de 158P1D7 não conjugados

Materiais e métodos :orpo monoclonais de 138P1D7

Os anticorpos monoclonais são criados contra 158P1D7, conforme descrito no exemplo intitulado "Geração de anticorpos monoclonais (mAbs) de 158P1D7". Os anticorpos são caracterizados por ELISA, Western blot, FACS e imunoprecipitação, de acordo com técnicas conhecidas na especialidade, quanto à sua capacidade para ligar 158P1D7. Os dados de mapeamento de epítopos para os mAbs anti-158P1D7, conforme determinado por ELISA e análise de Western, reconhecem epítopos na proteína 158P1D7. É efectuada a análise imuno-histoquímica de tecidos e células de cancro da bexiga com estes anticorpos.

Os anticorpos monoclonais são purificados ci partir de ascites ou de sobrenadantes de cultura de tecidos de hibridoma por cromatografia Sepharose de proteína G, submetidos a diálise contra PBS, esterilizados por filtração e armazenados a -20°C. As determinações de proteína são efectuadas através de um ensaio de Bradford (Bio-Rad, Hercules, CA). Um anticorpo monoclonal terapêutico ou um cocktail que compreende uma mistura de 232 anticorpos monoclonais individuais é preparada e utilizada para o tratamento de murganhos, aos quais se administra injecções subcutâneas ou ortotópicas de xenoenxertos de tumor da bexiga.

Linhagens celulares de cancro da bexiga

As linhagens celulares de cancro da bexiga (Scaber, J82, UM-UC-3, HT1376, RT 4, T24, TCC-SUP, J82 e SW780) que expressam 158P1D7 são geradas por transferência de genes retrovirais, conforme descrito por Hubert, R.S., et ai., STEAP: a prostate-specific cell-surface antigen highly expressed in human prostate tumors. Proc Natl Acad Sei USA, 1999. 96(25): 14523-8. A coloração de anti-158PlD7 é detectada através da utilização de um anticorpos anti-murganho de cabra conjugado com FITC (Southern Biotechnology Associates), seguindo-se a análise num citómetro de fluxo Coulter Epics-XL.

Modelos de murganhos in vivo

Os tumores subcutâneos (s.c.) são gerados por injecção de 1 x 10° células de cancro da bexiga que expressam 158P1D 7 misturadas numa diluição a 1:1 com Matrigel (Collaborative Research), no flanco direito de murganhos SCID machos. Para se testar a eficácia da formação do tumor, sao iniciadas injecções i .p. de anticorpo no mesmo dia das injecções de células tumorais. Como controlo, os murganhos sao mjectados com IgG de murganho purificada (iCM) ou PBS; ou com um anticorpo monoclonal purificado que recomece um antigenio irrelevante não expresso em células humanas. Em estudos preliminares, não foram encontradas diferenças entre IgG ae murganho ou PBS sobre no 233 crescimento do tumor. Os tamanhos dos tumores são determinados por medições com um paquímetro vernier e o volume tumoral é calculado como comprimento x largura x altura. Os murganhos com tumores s.c. superiores a 1,5 cm em diâmetro são sacrificados. Os níveis em circulação de mAbs anti-158PlD7 sâo determinados através de um estojo ELISA de captura (Bethyl Laboratories, Montgomery, TX). (Ver, v.g.r Saffran, D., et al., PNA.S 10:1073-1078).

As injecções ortotópicas são efectuadas, por exemplo, em. duas variantes alternativas, sob anestesia, por exemplo, ia bexiga (Peralta, I t pf pi 7 | — ♦ Λ A · f CT o ca .1. f » U ♦ 106-1811). De acordo com uma segunda l incisão através dtL parede abdominal, as peças de tumor da bexiga (1 a 2 mm por meio da utilização de cetamina/xilazina. De acordo com uma primeira variante, é administrada uma injecção intravesicular de células de cancro da bexiga directamente através da uretra e

U 199! em tamanho provenientes de um tumor s.c.) são cirurgicamente coladas na parede exterior da bexiga, designado por "implantação" (Fu, X., et al., Int. J. Câncer, 1991. 49: 938—939; Chang, S., et ai., Anticancer Res. . 1997. 17: págs. 3239-3242). Os anticorpos podem ser administrados a grupos de murganhos no momento da injecção de tumor ou de implantação ou decorridas 1 a 2 semanas para permitir o estabelecimento do tumor. :umores de mAbs anti!58PlD7 que inibem, o crescimento de cancro da bexiga que expressam 158P1D7 anti-158P lizaçao do comparação

De acordo com uma variante, o efeito de mAbs na formação de tumores é testado por meio da uti modelo ortotópico de implantação na bexiga. Em 234 com o modelo de tumor s.c., o modelo ortotópico, que requer a ligação cirúrgica de tecido tumorai directamente na bexiga, proporciona um crescimento tumoral local, desenvolvimento de metástases em locais distantes e subsequente morte (Fu, X., et al., Int. J. Câncer, 1991. 49: págs. 938-939; Chang, S., et ai., Anticancer Res., 1997. 17: págs. 3239-3242). Esta característica faz com que o modelo ortotópico seja mais representativo da progressão da doença em humanos e permita o seguimento do efeito terapêutico de mAbs, bem como de outras modalidades de tratamento, em objectivos clinicamente relevantes.

Assim sendo, células tumorais que expressam 158P1D7 são implantadas ortotopicamente e, decorridos 2 dias, os murganhos são separados em dois grupos e tratados com: a) 50 a 2000 yg, normalmente 200 a 500yg, de Ab anti-158PlD7 ou b) PBS, três vezes por semana durante duas a cinco semanas. Os murganhos são monitorizados semanalmente quando a indicações de crescimento tumoral.

Tal como salientado, uma vantagem principal do modelo de esmero da bexiga ortotópico é a ciptidão parai estudar o desenvolvimento de metástases. A formaçao ae metastases em murganhos que apresentam tumores ortotópicos estabelecidos é estudada por análise histológica de secções de tecido, incluindo os pulmões e os nódulos linfáticos (Fu, X., et al,, int. J. Câncer, 1991. 49: 938-939; Chang, S., et al., Anticancer Res., 1997. 17: 3239-3242). Além disso, a análise IHC utilizando anticorpos anti-158PlD7 pode ser efectuada em secções de tecido.

Aos murganhos que suportam tumores de bexiga ortotópicos estabelecidos que expressam 158P1D7 sao administradas injecções de 1000 yg de mAb anti-158PlD7 ou 235 PBS, ao longo de um período de 4 semanas. Deixa-se os murganhos de ambos os grupos estabelecer uma carga tumoral elevada (1 a 2 semanas de crescimento), para se garantir uma frequência elevada de formação de metástases nos pulmões e nos nódulos linfáticos dos murganhos. Os murganhos são então sacrificados e o seu tecido de tumor de bexiga local e o seu tecido dos nódulos linfáticos são analisados quanto à presença de células tumorais, através de análise de histologia e IHC.

Estes estudos mostram uma eficácia anti-tumor ampla dos anticorpos anti- 158P1D7 no início e na progr cancro da bexiga em modelos de murganhos. Os an anti-158P!D7 inibem a formação de tumores e rei ucorpos retardam o crescimento de tumores já estabelecidos e prolongam a sobrevivência dos murganhos tratados. Além disso, os mAbs anti-158PlD7 mostram um efeito inibitório drástico na disseminação do tumor de bexiga local oara locais distantes, mesmo na presença de uma carga tumoral elevada. Assim, os mAbs anti-158PlD7 são eficazes para os obiectivos clinicamente relevantes principais, incluindo a diminuição do crescimento tumoral, diminuição de metástases e prolongamento da sobrevivência.

Exemplo 37: comparação de homologia de 158P1D7 com sequências conhecidas A proteína 158P1D7 da figura Figure 3 possui 841 aminoácidos com um peso molecular calculado de 95,1 kDa e um valor de pi de 6,07. Prevê-se que a 158P1D7 seja uma proteína nuclear (65% por PSORT http://psort.nibb.ac.jp/ /form2.html) com a possibilidade de ser uma proteína de membrana do plasma (0,46 PSORT http: /,/psort. nibb. ac . jp/ 236 236 possui um local de clivagem eidos ( 326 e 627 e um local de /form.html) . A 158P1D7 Df potencial entre os amir sinal potencial nos aminoácidos 3-25.

Utilizando o sítio web PubMed da N.C.B.I. disponibilizado em http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez. concluiu-se ao nível de prol .θίη& cji 158P1D7 apresenta uma meihor homologia com a proteína FLJ22774 hipotética (registo PubMed: gi 14149932) de função desconhecida. A proteína 108P1D7 mostra alguma homologia com a proteína humana semelhante a IGFALS (proteína de ligação ao factor de crescimento do tipo insulina, subunidade lábil a ácido) (registo PubMed: gi 6691962) com 36% de identidade e 52% de homologia e com a proteína Slit 1 de murganho (registo PubMed: gi 5532493) com 24% de identidade e 37% de homologia (figuras 5a e 5b).

Os factores de crescimento do tipo insulina (IGF) têm mostrado desempenhar um papel importante no crescimento tumoral, incluindo no cancro da próstata, da mama, do cérebro e do ovário (0 'Brian 0 £ al, Urology, 2001, 58 : 1; Wang J et al Oncogene . 2001, O c\] 3857; Helle S et al, Br J Câncer. 2001, 85: 74 ) . Os IGF produzem o seu efe ito

oncogénico por meio da ligação a receptores de superfície e células específicos e por activação de sobrevivência, bem como de vias mitogénicas (Babajko S et al, Med Pediatr Oncol. 2001, 36: 154; Scalia P et al, J Cell Biochem. 2001, 82: 610). A actividade de factores de crescimento do tipo insulina é regulada por proteínas de ligação a IGF (IGF-BP) e da subunidade lábil a ácido (AILS) de IGF-BP (Zeslawski W et Q-L , EMBO J. 2001, 20: 3638; Jones JI. S Clemmons DR,

Endocr, Rev. 1995, 16: 3). No plasma, a maior parte dos IGFs existe sob a forma de um complexo ternário que contém 237 IGF-Bf e ALS (Jones JI. e Cleirunons DR. Endocr. Rev, 1995, 16: 3). A associação com ALS permite a retenção do complexo ternário nos vasos e estende o seu período de vida (Ueki I et al, Proc Natl Acad Sei USA 2000, 97: 6868). Estudos em murganhos demonstram a contribuição de ALS para o crescimento celular, mostrando que os murganhos que suportam ALS mutante exibem um défice de crescimento (Ueki I et ai, Proc Natl Acad Sei USA 2000, 97: 6868), o que indica que a ALS desempenha um papel crítico no crescimento de cé1u1as tumorais.

As proteínas Slit foram, em primeiro lugar, identificadas em Drosophila, como proteínas segregadas que regulam a direcção e a orientação de axões (Rajagopalan S et aí, Cell. 20 00, 103: 1033; Chen J et ai, J Neurosci. 2001, 21: 1548). Foram clonados homólogos de mamíferos em murganhos e em seres humanos, onde mostram regular a migração e a quimiotaxia (Wu J et al, Nature. 20 01, 410 : 948; Brose K e Tessier M, Curr Opin Neurobiol. 2 001, 10 : 95) . As proteínas Slit estão localizadas em dois locais subcelulares distintos nas células epitelisLÍs em função da etapa celular, estando a Slit 3 predominantemente localizada na mitocôndria e estando dirigida à superfície da célula em células mai J Physiol Cell Physiol. diferente de Slit sugere s confluentes (Little MH et aí, Am 2001, 281: C486). A localização que a Slit pode actuar de um modo diferente caso seja segregada, caso esteja associada à superfície da célula ou caso seja mantida na mitocôndria. A descrição da presente invenção em que 158P1D7 é elevadamente expressa em cancros da bexiga, mostrando em simultâneo um padrão de expressão restrito em tecidos normais indica que o gene de 158P1D7 desempenha um papel 238 importante na bexiga. É proporcionado pela presente invenção que a 158P1D7 controla o crescimento tumoral e a progressão por meio da regulação da proliferação, obrevivência, migração, expr essao de gene, bem como isponibilidade de superfície da célula. Assim sendo, no aso da 158P1D 7 actuar como reguladora do crescimer ito celular e apoptose, ou expressão, a 158P1D7 é utilizada para fins de terapia, de diagnóstico, de prognóstico ou de prevenção.

Além disso, as figuras 16A e 16B ilustram, uma região transmembranar e uma previsão de orientação para 158P1D7. a figura 16A é uma representcição esquemática da probabilidade de existência de regiões transmembranares e da orientação extracelular e intracelular de 158P1D7 com base no algoritmo de Sonnhammer, von Heijne e Krogh (Erik L.L. Sonnhammer, Gunnar von Heijne, e Anders Krogh: A hidden Markov model for predicting transmembrane helices in protein sequences. Em Proc. of Sixth Int. Conf. on Intelligent Systems for Molecular Biology, págs. 175-182 Ed J. Glasgow, T. Littlejohn, F. Major, R. Lathrop, D. Sankoff, e C. Sensen Menlo Park, CA: AAAI Press, 1998) . 0 método prevê que a 158P1D7 contenha uma região transmembranar individual entre os aminoácidos 611-633 com uma elevada probabilidade do terminal amino residir no exterior, que é consistente com a t .opologia de uma proteína tr an smembr ana r de tipo 1. Também é VI SUcii 1Z ciCici um fragmento hidrofóbico curto entre os anui .no ácidos 3 -25, que é consistente < som a existência de um péptido de sinal no terminal am: ino. A figurei 16B é uma representação esquemática da probabilidade de existência de regiões transmembrana res e da orientação de 158P1D7 com base no 239 algoritmo TMpred cie Hofmann e Stoffel, que utiliza TMBASE (K. Hofmann, W. StoffeL TMBASE ~ A. database of membrane spanning protein segments Biol, Chem. Hoppe-Seyler 374: 166, 1993) . 0 método prevê que a 158P1D7 contenha uma região transmembranar primário entre os aminoácidos 609-633 e uma região transmembranar secundário entre os aminoácidos 3-25 (aminoácidos contíguos com valores superiores a 0 no gráfico apresentam uma elevada probabilidade de serem regiões transmembranares) com uma orientação em que o terminal amino reside no interior e o terminal carboxilo no exterior. Também é previsto um modelo alternativo, consistente com a figura 16A, em que a 158P1D7 é uma proteína transmembranar de tipo 1 em que o terminal amino reside no exterior e a proteína contém um péptido de sinal do domínio transmembranar secundário entre os aminoácidos 3-25 e um domínio transmembranar principal entre os aminoácidos 615-633. Os algoritmos de previsão transmembranares para a figura 16A e figura 16B são consultados atra.vés do servidor de biologia molecular ExPasy (http://www.expasy.ch/tools/).

Exemplo 38: identificação e conformação de vias de transdução de sinal na 2001; 76: ilar 1, Me d í Ο-l jcl aesciito que muitas oroteínas de mamíferos interactuam com moléculas de sinalização e participam regulação de vias de sinalização, (j Neurochem 21 7 —22o) . Em. particular, a iGF e a. IGF—BP mostraram regular as vias mirogénica e de sobrevivência (Babajko S et a 2001, 36: 154; Scalia P et a±, 6i0). Utilizando técnic identificadas

Pediatr Oncol. Biochem. 2001, 82 imunoprecipitação e de Western blotting, são J Cell a s de 240 proteínas que se associam a 158P1D7 e medeiam os eventos de sinalização. Sabe~se que diversas vias que desempenham um. papel na biorogia de cancro são reguladas por 158P1D7, incluindo as vias de f osf olípidos, tais como PI3K, AKT, etc., as vias de adesão e migração, incluindo FAK, Rho, Rac-1, etc., bem como cascatas mitogénicas/sobrevivência, tais como ERK, p38, etc. (Cell Growth Differ. 2000, 11: 279; J Biol Chem. 1999, 274: 801; Oncogene. 2000, 19: 3003, J. Cell Biol. 1997, 138: 913.}. A análise bio- informática revelou que a 158P1D7 pode ser fosforilada por serina/treonina, bem como por tirosina-cinases. Assim, a rosforilaçao de 158P1D7 dá origem à activação das vias supramencionadas.

Utilizando, v.g., técnicas de Western blotting, confirma-se a aptidão da 158P1D7 para regular estas vias. As células que expressam ou à qual lhes falta 158P1D7 são deixadas sem tratamento ou estimuladas com citoquinas, hormonas e anticorpos anti-integrina. Os lisados de células são analisados utilizando anticorpos específicos anti-fosfo (Cell Signaling, Santa Cruz Biotechnology) para se detectar a fosforilação e a regulação de ERK, p38, AKT, PI3K, PLC e de outras moléculas de sinalização. Quando a 158P1D7 desempenha um papel na regulação das vias de sinalização, sejcLm individualmente ou em conjunto, é utilizada como alvo para fins de diagnóstico, prognóstico, preventivos e terapêuticos.

Para se confirmar que a 158P1D7 activa directa ou indirectamente vias de transdução de sinal conhecidas em células, são efectuados ensaios repórteres transcricionais com base em luciferase (luc) em células que expressam os genes individuais. Estes repórteres transcricionais contêm. 241 241 locais ae iiaaçao de conhecidos que estão transdução de sinal exempios destes assoei transdução de sina e apresentados: consenso para factor de transcrição localizados a. jusante de vias de bem caracterizadas. Os repórteres e .ados factores de transcrição, vias de estímulos de activação são a seguir 1· NFkB-luc, MFkB/Rel; Ik-cinase/SAPK; crescimento/ /apoptose/stresse 2. SRE-luc, SRF/TCF/ELK1; MAPK/SAPK; crescimento./ diferenciação 3. AP-i-iuc, FOS/JUN; MAPK/SAPK/PKC; crescimento/ /apoporose/stresse 4. ÃRE-luc, receptor de androgénio; esteróides/MAPK; crescimento/' diferenciação/apoptose 5. p53-luc, p53; SAPK; crescimento/diferenciação/ /apoptose c rescime nto/apopt o s e/ 6, CRE-luc, CREB/ATF2; PKA/p3 /stresse.

Os efeitos mediados pelo gene são avaliados em células que apresentam expressão de ARNm. Os plasmídeos do repórter luciferase são introduzidos por transfecção mediada por lípidos (TFX-50, Promega). A actividade de luciferase, um indicador de actividade transcricional relativa, é medida por incubação de extractos celulares com substrato de luciferina e a luminescência da reacção é monitorizada num luminómetro.

As vias de sinalização activadas pela 158P1D7 são mapeadas e utilizadas para a identificação e validação de alvos terapêuticos. Quando a 158P1D7 está envolvida na sinalização celular, esta é utilizada como alvo para fins de diagnóstico, prognóstico, preventivos e terapêuticos. 242

Exemplo 39: envolvimento na progressão Ί 0 gene de 158P1D7 pode contribuir para o crescimento de cérulas cancerígenas. 0 papel de 158P1D7 no crescimento tumoral é confirmado em diversas linhaaens de células primárias e transfectadas, incluindo linhagens de células da. próstata, go cólon, da oexiga e do rim, bem como de células NIH 3T3 manipuladas para expressarem de um modo estável 158P1D7. As células progenitoras às quais lhes falta 158P1D7 e as células que expressam 158P1D7 são avaliadas quanto ao crescimento celular utilizando um. ensaio de proliferação bem documentado (ver, v.g., Fraser SP. Grimes J'A. Djamgoz MB. Prostate. 2000; 44: 61, Johnson DE, Ochieng J, Evans SL. Anticancer Drugs. 1996, 7: 288).

Para se confirmar o papel de 158P1D7 no processo de transformação, é investigado o seu efeito em ensaios de formação de colónias. As células NIH3T3 progenitoras às quais lhes falta 158P1D7 são comparadas com células NHI-3T3 que expressam 158P1D7, utilizando um ensaio de ágar leve sob condições rigorosas e mais permissivas (Song z. et ai. Câncer Res. 2000, 60: 6730).

Para se confirmar papel de 158P1D7 na invasão e metástase de cé.l\ rias câncer ígenas, é utilizado um ensaio bem estabelecido, v.g., um ensaio de sistema d e inserção Transwell (Becton Dickinson) (Cance r Res. 1999, 59: 6010).

As células de controlo, incluindo linhagens de células da próstata, do cólon, da bexiga e do rim, às quais lhes falta 158P1D7, são comparadas com. células que expressam 158P1D7, respectivamente. As células são carregadas com o corante fluorescente, calceína, e colocadas em placas na cavidade superior da inserção Transwell revestida com um análogo de membrana, de suporte. A invasão é determinada pela 243 fluorescência de células na câmara inferior em relação à fluorescência da população total de células. A 158P1D7 também pode desempenhar um papel no ciclo celular e na apoptose. As células progenitoras e as células que expressam 158P1D7 são comparadas quanto a diferença na regulação do ciclo celular, utilizando um ensaio BrdU bem estabelecido (Abdel-Malek ZA. J Cell Physiol. 1988, 136: 247). Resumidamente, células deixadas crescer sob condições óptimas (soro completo) e limitantes (soro reduzido) são marcadas com BrdU e manchadas com Ab anti-BrdU e iodeto de propídio. As células são analisadas quanto à entrada nas fases Gl, Se G2M do ciclo celular. Em alternativa, o efeito de stresse sobre a apoptose é avaliador em células progenitoras de controlo e em. células que expressam 158P1D7, incluindo células normais e de tumores da bexiga. As células manipuladas e progenitoras são tratadas com diversos agentes quimioterapêuticos, tais como paclitaxel, gemcitabina, etc., e inibidores da síntese de proteínas, tais como ciclo-heximida. As células são manchadas com anexina V-FITC e a morte celular é medida por análise de FACS. A modulação da morte celular pela 158P1D7 pode desempenhar um papel crítico na regulação da progressão tumoral e na carga tumoral.

No caso da 158P1D7 desempenhar um papel no crescimento, transformação, invasão ou apoptose celular, esta é utilizada como alvo para fins de diagnóstico, prognóstico, preventivos e terapêuticos.

Exemplo 40: envolvimento na anqiogénese vasos sanguíneos do tumor (Hanahan A angiogénese ou formação de novos capilares é necessária para o crescimento 244 D, Folkman J. Ceil, 1996, 86: 353; Folkman J. Endocrinology. 1998 139: 441). Foram desenvolvidos diversos ensaios para medir a angiogénese in vitro e in vivo, tais como ensaios de cultura de tecidos, formação de tubos de células endoteliais e proliferação de células endoteliais. Utilizando estes ensaios, bem como neo-vascularização in vitro, é confirmado o efeito de 158P1D7 na angiogénese. Por exemplo, ceiuias endoteliais manipuladas para expressarem 158P1D / são avaliadas utilizando os ensaios de formação de tubos e de proliferação. 0 efeito de 158P1D7 também é confirmado em modeios de animais in vivo. Por exemplo, células que expressam ou às quais lhes falte 158P1D7 são implantcidas subcutaneamente em murganhos imunocomprometidos . A migração e angiogénese de células endoteliais são avaliadas de corri cio s o a ±o dias ntili^ando técnica^ de imuno-histoquímica. No caso da 158P1D7 afectar a ang^ogenese, eii^ao e utilizada como alvo para fins de diagnóstico, prognóstico, preventivos e terapêuticos.

Exemplo 41: regulação da transcrição A localização indicada antes de 158P1D7 no núcleo e a su,a simiiariaaae com IoF-ΒΡ, que se concluir activar as vias de sinalização e regular as funções celulares essenciais, suportam a utilização, de acordo com a presente invenção, de 158P1D7 com base no seu papel na reoulacão transcricional de genes eucarióticos. a regulação da expressão de genes é confirmada, v.g., através do estudo da expressão de genes em células que exPressam ou às quais lneo falta 1^8Plu7. Para este propósito, são efectuados dois tipos de experiências. 245

No primeiro conjunto de experiências, ARN de células progenitoras e de células que expressam 158P1D7 são extraídas e hibriaadas em conjuntos de genes comercialmente disponíveis (Clontech) (Smid-Koopman E et al. Br J Câncer. 2000. 83: 246). As células em repouso, bem como células tratadas com FBS ou androgénio são comparadas. Os genes diferentemente expressos são identificados de acordo com procedimentos conhecidos na especialidade. Os genes diferentemente expressos são então mapeados para vias biológicas (Chen K et ai., Tbyroid. 2001. 11: 41).

Mo segundo conjunto de experiências, a activação da via transcncional específica é avaliada utilizando construções repórteres de luciferase comercialmente disponíveis (v.g., Stratagene), incluindo: NFkB-iuc, SRE-luc, ELK1—luc, ARE—luc, p53—luc e CRE—luc. Estes repórteres transcricionais contêm locais de ligação de consenso para factores de transcrição conhecidos que estão localizados a jusante de vias de transdução de sinal bem caracterizadas e que representam uma boa ferramenta para confirmar a activação da via e pesquisar moduladores positivos e negativos da activação da via.

No caso da 158P1D7 desempenhar um papel na regulação de genes, então é utilizada como alvo para fins de diagnóstico, prognóstico, preventivos e terapêuticos.

Exemplo 42: localização subcelular de 158P1D7 A localização celular de 158P1D7 é avaliada utilizando técnicas de fraccionamento subcelular amplamente utilizadas em biologia celular (Storrie B, et al. Methods Enzymol· 1990; 182: 203-25). Diversas linhagens celulares, incluindo linhagens celulares da próstata, do rim e da bexiga, bem 246 como linhagens celulares manipuladas para expressar 158PÍD7, são separadas em fracções nucleares, citosólicas e membranares. A expressão de genes e a localização no núcleo, nas membranas pesadas (lisosomas, peroxisomas e mitocôndria), nas membranas leves (membrana de plasma e retículo endoplásmico) e fracções de proteínas solúveis são testadas utilizando técnicas de Western blotting.

Sm alternativa, células 293T são transfectadas com um vector de expressão que codifica genes individuais, marcado com HIS (PCDNA 3.1 MYC/HIS, Invitrogen) e a localização subcelular destes genes e determinada conforme descrito antes. Resumidamente, as células transfectadas são recolhidas e submetidas a um protocolo de fraccionamento subcelular diferencial (Pemberton, P.A. et ai, 1997, J of Histochemistry and Cytochemistry, 45: 1697-1706). A localização dos genes marcados com HIS é monitorizada por Western blotting.

Utilizando anticorpos de 158P1D7, é possível demonstrar a localização celular por imunofluorescência ou imuno-histoquímica. Por exemplo, as células que expressam ou às quais lhes falta 158P1D7 são aderidas a lâminas de microscópio e manchadas com Ab anti~158PlD7 especifico. As células são mantidas a incubar com um Ab anti-espécie secundário acoplado a FITC e analisadas por microscopia fluorescente. Em alternativa, as células e os tecidos que expressam 158P1D7 são analisados por IHC, conforme aqui descrito.

No caso da 158P1D7 estar localizada em compartimentos celulares específicos, então é utilizada como alvo para fins de diagnóstico, prognóstico, preventivos e terapêuticos. 247

Exemplo 43: envolvimento de 158F1P7 no tráfico de proteínas

Devido à sua similaridade com as proteínas Slit, a 158P1D7 pode regular o tráfico e a retenção intracelular na mitocôndria e/ou em compartimentos nucleares, 0 seu papel no tráfico de proteínas pode ser confirmado utilizando métodos bem estabelecidos (Valetti C. et al. Mol Biol Cell. 1999, 10: 4107). Por exemplo, a2-macroglobulina conjugada com FI TC é mantida a incubar com células que expressam 158P1D7 e células negativas a 158P1D7. A localização e absorção de FTTC-a2-macroglobulina são visualizadas utilizando um microscópio fluorescente. De acordo com uma outra abordagem, a co-localização de 158P1D7 com proteínas vesiculares é confirmada por técnicas de co-precipitação e Western blotting e microscopia fluorescente.

Em alternativa, células que expressam 158P1D7 e células às quais lhes falta 158P1D7 são comparadas utilizando albumina de soro de bovino marcada com bodipi-ceramida (Huber L et al. Mol. Cell. Biol. 1995, 15: 918). Resumidamente, deixa-se as células absorver a BSA marcada e coloca-se intermitentemente a 4°C e 18°C para permitir que o tráfico tenha lugar. As células são examinadas sob microscópios fluorescentes, em momentos diferentes, quanto ci presença de BSA marcada em compartimentos vesiculares específicos, incluindo retículo de Golgi, retículo endop1á smic o, e t c.,

De acordo com outra variante, o efeito de 158P1D7 sobre o transporte membranar é avaliado utilizando complexos de biotinavidina. As células que expressam ou às quais lhes falta 158P1D7 são mantidas a incubar transrentemente com biotina. As células são colocadas a 4°C 248 ou aquecidas transientemente até 37°C durante vários perxodos de o empo. As células são fraccionadas e examinadas pou. precipitação o.e afinidade com avidina quanto à presença de piotina em compartimentos celulares específicos. Utixixciiido Lais oistemas de ensaios, são identificadas proteínas, anticorpos e moléculas pequenas que modificam o eieii_o de 158P1D7 no transporte vesicular. No caso da 1j8p1D7 desempenhar um papel no tráfico intracelular, então a io«PiD7 constitui um alvo para fins de diagnóstico, prognóstico, preventivos e terapêuticos.

Exemplo 41; associação proteína-proteina

As proteínas TGF e IGF-BP mostraram interactuar com outras proteínas, formando assim complexos de proteínas que podem regular a localização de proteínas, a actividade bioxogica, a transcrição de genes e a transformação celular (Zeslawski W et al, EMBO J. 2001, 20: 3638; Yu H, Rohan T, J Natl Câncer Inst. 2000, 93: 1472). Utilizando técnicas de imunoprecipitação, bem como sistemas híbridos de duas leveduras, sao identificadas proteínas que estão associadas a 158P1D7. Os imunoprecipitados provenientes de células que expressam 158P1D7 e de células às quais lhes falta 158P1D7 são comparados quanto a associações proteína-proteína específicas. São efectuados estudos para determinar a extensão da 3.SSOC10.Ç8.O de 153P1D7 com receptores, tais como os receptores de EGF e TGF, € 3 com proteínas intra celulares, tais como IGF-BP, proteí nas citosqueletais, etc. . Os estudos de comparação de células positivas a 158P1D 7 Θ negativas a 158P1D7, bem como estudos de comparaçao de células nãc e s t i mu 1 a d a s / e m repouso e células tr; atadas com. 249 activadores de células epitexiais, tais como citoquinas, factores de crescimento e Ab anti-integrina, revelam, interacções proteína-proteína únicas. quis a r molécu.' No caso da uenas molécul

Além disso, as interacções proteína-proteína são confirmadas utilizando a metodologia híbrida de duas leveduras (Curr Open Chem Biol. 1999, 3: 64). um vector que transporta uma biblioteca de proteínas fundida ao domínio de cLCtivação de um factor de transcrição é introduzido numa levedura que expressa uma proteína de fusão de domínios de ligação 158P1D7-ADN e uma construção repórter. A interacção proteína-proteína é detectada pela actividade de repórter colorimétrica. A associação específica com receptores de superfície e moléculas efectoras orienta um especialista na matéria para o modo de acção da 158P1D7, identificando assim alvos terapêuticos, de prognóstico, preventivos e/ou de diagnóstico para o cancro. Este ensaio e ensaios semelhantes são também utilizados para identificar e pesquisar moléculas pequenas que interactuam com 158P1D7. :aso da 158P1D7 estar associada a proteínas ou moléculas, então é utilizada como alvo para fins de diagnóstico, prognóstico, preventivos e terapêuticos.

QUADROS 250 QUADRO I: tecidos que expressam 158P1D7 quando malignos bexiga, próstata, cólon, pulmão, mama, ovário.

QUADRO II: ABREVIATURAS DE AMINOÁCIDOS LETRA ÚNICA 3 LETRAS NOME COMPLETO F Phe fenilalanina L Leu leucina S Ser serina Y Tyr tirosina C Cys cisteina W Trp triptofano P Pro prolina H His histidina Q Gin glutamina R Arg arginina I Ile isoleucina M Met metionina T Thr treonina N Asn asparagina K Lys lisina V Vai valina A Ala alanina D Asp ácido aspártico E Glu ácido glutâmico G Gly glicina

QUADRO III: MATRIZ DE SUBSTITUIÇÃO DE AMINOACIDOS 251

Adaptado da aplicação informática GCG de matriz de substituição de aminoácidos BLOSUM62 9.0 (matriz de substituição de bloco). Quanto maior o valor, maior a probabilidade de encontrar uma substituição em proteínas naturais associadas. (Ver, URL www.ikp.unibe.ch/manual/blogsum62.html) Λ C D 1 £ o H K II N s F 0 £4 S V te t s *3 0 ··· £ --· I - 3 .V. 1 ... •y -1 -? ·. 1 "1 * Q 9 3 -2 .¾ 9: - "4 VJ, -:¾ -1 —3· " 3· ‘3 3 ~3 " À ' 3. * *'· ·.. 2 C £ 2 3 ,v. ·? ^ -3 "I -4 - X. -¾ "3. 0 .-.-2 0 -V t 4 '3 » 5 -3 V ·»£ 0 1 ... 2 Q "1 2 ΰ 0 41 -2 -3 & δ Ú ».3 e Q " J “3 -3 • FS .<1 Λ.*ί· • 1 :ΐ 3 F 6 • 2 w 4 -4 -.3 4 -2 »2 -2 0 -:ϊ -3 β e -=3 1 •3 +. 'S Ú "3 ,λ*3 Λ 4 -3 2 i "3 "3 V ** *? ·· 1 3 -3 "I >S.· 5 ' i >3 “3L 1. *·* 9 ν ^· ~3 “2 Κ 4 2 -3 -3 -2 _ >í! -3. L S 'v 2 “3 0 »1 . ^ " & 1 ι w λ € bS δ 9 .1 ϋ "4 κ.ν·ί ΐν 3Ί 1 “1 ^ yy -1 Λ t , -t <·> /· .. -¾ “4 ·.·.· ''ϊ F Λ <3 !Ík: s c? -X -I —3 --¾ V 1. 4 1 -2 -3 -3!

QUADRO IV A 252

SUPERMOTIVOS POSIÇÃO POSIÇÃO POSIÇÃO 2 (Ancoragem principal) 3 (Ancoragem principal) Terminal C (Ancoragem principal) AI TIL VMS FWY A2 LIVMATQ IVMATL A3 VSMKTLI RK A2 4 YF WIVLMT FI YWLM B7 P VILF MWYA B27 RHK FYhWMIVA B44 E D FMYLIMVA B58 ATS FWÍLIVMA B62 QLIVMP FMYMIVLA MOTIVOS AI TSM Y AI DEAS Y A2.1 LM VQIAT VLIJMAT A3 LMVISATFCGD KYRHFA AI 1 VTMLISAGNCDF K RYH A2 4 YFWM FLIW A*3101 MVTALIS RA A*33 01 MVALFIST RK A* 6 8 01 AVTMSLI RK B* 0 7 0 2 P 1MFWYAIV B*3501 P LMFWYTVA B51 P LIVF WYAM B* 53 01 P IMFWYALV B* 5 4 01 P ATIVLMFWY 253

Os resíduos a negrito são preferidos; os resíduos em itálico são menos preferidos. Considera-se que um péptido suporta um motivo se possuir ancoragens primárias em cada posição de ancoragem primária para um motivo ou supermotivo, tal como especificado no quadro anterior.

QUADRO IV (B): SUPERMOTIVOS HLA DE CLASSE II

1 6 9 w, F, Y, V, I, L A. V, I, L, P, c, S, T A, V, I, L, C, S, T, Μ, Y

QUADRO IV C MOTIVOS Ia ancoragem 1 2 3 4 5 Ia ancoragem 6 7 8 9 DR4 preferido FMYLIVW M T I VST CPALIM MH MH prejudicial w R WDE DR1 preferido MFLIVWY PAMQ VMAT SPLIC M AVM prejudicial C CH FD CWD GDE D DR7 preferido MFLIVWY M W A IVMSACTPL M IV prejudicial C G GRD N G DR3 MOTIVOS Ia 2 3 Ia 5 Ia ancoragem ancoragem ancoragem 1 4 6 motivo a LIVMFY D preferido motivo b LIVMFAY DNQEST KRH preferido Super- MFLIVWY VMSTACPLJ motivo DR Os resíduos em itálico indicam resíduos menos preferidos ou "tolerados".

QUADRO IV D 254

POSIÇÃO

SUPER- 1 2 345678 terminal C

MOTIVOS

Al Ia ancoragem 1a TILVMS ancoragem

FWY A2 Ia ancoragem 1a LIVMATQ ancoragem

LIVMAT A3 preferido prejudicial DE (3/5); P (5/5) Ia ancoragem VSMÃTLl YEW (4/5) DE (4/5) YFW (3/5) YEW (4/5) P (4/5) ii ancoragem RK A24 1a ancoragem Ia YF WIVLMT ancoragem FIYWLM B7 preferido FWY Ia ancoragem FWY FWY Ia (5/5) P (4/5) (3/5) ancoragem LIVM VIL FMWYA (3/5) prejudicial DE DE G QN DE (3/5); (3/5) (4/5) (4/5) (4/5)

P (5/5);

G (415);

A (3/5);

QN (3/5) B27 Ia ancoragem Ia RHK ancoragem

FYLmiVA B44 Ia ancoragem Ia ED ancoragem

FWYLIMVA B58 1a ancoragem 1a ATS ancoragem

YWÍLIVMA B62 Ia ancoragem Ia QLIVMP ancoragem

YWÍMIVLA 255

QUADRO IV E

1 2 3 4 5 6 1 8 9 Terminal C AI preferido GFYW Ia ancoragem DEA YFW P DEQN YFW ou terminal C 9- STM Ia ancoragem inch Y prejudicial DE RHKLIVMP A G A AI preferido GRHK ASTCLIVM 1! GSTC ASTC: LIVM DE Ia ancoragem 9- ancoragem Y mer DEAS prejudicial A RHKDEPY DE PQN RHK PG GP PW AI preferido YFW Ia ancoragem DEAQN A YFWQN PASTC GDE P 1! 10- STM ancoragem mer Y prejudicial GP RHKGLIVM DE RHK QNA RHXYFW RHK A AI preferido YFW STCLIVM 1! A YFW PG G YFW 1! 10- ancoragem ancoragem mer DEAS Y prejudicial RHK RHKDEPY P G PRHK QN FW A21 preferido YFW Ia ancoragem YFW STC YFW A P Ia ancoragem 9- LMIVQAT VLIJIT mer prejudicial DEP DERKH RKH DERKH 256

1 2 3 4 5 6 1 8 9 Terminal C Α2.1 preferido AYI-W Ia ancoragem LVIM G G FYWL 1! 10- LMIVQAT VIM ancoragem mer VLIMAT prejudicial DEP DE RKHA P RKH DERKH RKH 3 preferido RHK Ia YTW PRHKYFW A YFW P Ia ancoragem ancoragem KYRM LMVISATF CGD prejudicial DEP DE 11 preferido A Ia ancoragem YFW YFW A YFW YFW P Ia ancoragem VTLMISAG KM NCDF prejudicial DEP A G 24 preferido YFWRHK Ia ancoragem STC YFW YFW Ia ancoragem mer YFW FLIW prejudicial DEG DE G QNP DERHK G AQN 24 preferido Ia ancoragem P YFW P 1! mer YF M ancoragem FLIW prejudicial GDE QN RHK DE A QN DEA 251

1 2 3 4 5 6 1 8 9 Terminal C 101 preferido RHK MVTALIS Ia YFW AP Ia ancoragem ancorag RK em YFW P YFW prejudicial DEP DE ADE DE DE DE 301 preferido 1! YFW AYFW Ia ancoragem ancoragem MVAL RK FIST prejudicial GP DE Α680 preferido YFWSTC Ia ancoragem YFWLIVM YFW P Ia ancoragem 1 AVTMSLI RK prejudicial GP DEG RHK A Β070 preferido RHKFWY Ia ancoragem P RHK RHK RHK RHK PA Ia ancoragem 2 LMF WYAIV prejudicial DEQNP DEP DE DE GDE QN DE Β350 preferido FWYLIV Ia ancoragem P FWY FWY Ia ancoragem 1 M limiVA prejudicial AGP G G Β51 preferido LIVMFW Ia ancoragem P FWY STC FWY G FWY Ia ancoragem Y LIVFM prejudicial AGPDER DE G DEQN GDE HKSTC 258 1 2 3 4 5 6 1 8 9 Terminal C Β530 preferido LIVMFW Ia ancoragem P FWY STC FWY LIVMFWY FWY Ia ancoragem 1 Y IMFWYAL 7 prejudicial AGPQN G RHKQN DE Β540 preferido FWY Ia ancoragem P FWYLIVM LIVM ALIVM FWYAP Ia ancoragem 1 ATIVLMF W prejudicial GPQNDE GDESIC RHKDE DE QNDGE DE Os resíduos em itálico indicam resíduos menos preferidos ou "tolerados A informação neste quadro é específica para 9- mers, salvo quando indicado de outro modo. 259 QUADRO V Resultados da classificação do péptido HLA - 158P1D7 - Al, 9-mers Classificação Posição inicial Listagem dos resíduos da subsequência Resultado (estimativa do período de semi-vida de dissociação de uma molécula que contém esta subsequência) Seq. ID # 1 150 VIEPSAFSK 900,000 1 . 2 436 NLEYLYLEY 225,000 2 . 3 812 LVEQTKNEY 45,000 3 . 4 828 HAEPDYLEV 45,000 4 . 5 711 GSDAKHLQR 37,500 5. 6 546 CTSPGHLDK 25,000 6. 7 265 SICPTPPVY 10,000 7 . 8 351 NIESLSDLR 9,000 8 . 9 799 LMETLMYSR 9,000 9 . 10 173 ESLPPNIFR 7,500 10 . 11 650 DNSPVHLQY 6,250 11. 12 601 LTDAVPLSV 6,250 12 . 13 174 SLPPNIFRF 5, 000 13 . 14 100 IADIEIGAF 5, 000 14. 15 682 MVSPMVHVY 5, 000 15. 16 102 DIEIGAFNG 4,500 16 . 17 134 GLENLEFLQ 4,500 17 . 38 47 NCEAKGIKM 4,500 18 . 19 383 LVEYFTLEM 4,500 19. 20 401 VLEEGSFMN 4,500 20 . 21 388 TLEMLHLGN 4,500 21 22 749 FQDASSLYR 3,750 22 23 56 VSEISVPPS 2,700 23 . 24 651 NSHILCPGL 2,700 24. 25 431 FLGLHNLEY 2,500 25. 26 291 INDSRMSTK 2,500 26 . 27 142 QADNNFITV 2,500 27. 25 502 ILDDLDLLT 2,500 CO 29 522 SCDLVGLQQ 2,500 29 . 260 QUADRO V Resultados da classificação do péptido HLA - 158P1D7 - Al, 9-mers Classificação Posição inicial Listagem dos resíduos da subsequência Resultado (estimativa do período de semi-vida de dissociação de uma molécula que contém esta subsequência) Seq. ID # 30 223 NCDLLQLKT 2,500 CO O 31 771 ITEYLRKNI 2,250 31. 32 232 WLENMPPQS 1,800 32 . 33 171 AIESLPPNI 1,800 33 . 34 137 NTLEFLQADN 1,800 34. 35 355 LSDLRPPPQ 1,500 35. 36 380 KSDLVEYFT 1,500 36 . 37 59 ISVPPSRPF 1,500 37. 38 255 GSILSRLKK 1,500 38 . 39 540 VTDDILCTS 1,250 39 . 40 308 TKAPGLIPY 1,250 40. 41 817 KNEYFELKA 1, 125 41. 42 743 STEFLSFQD 1, 125 42 . 43 359 RPPPQNPRK 1,000 43. 44 246 VCNSPPFFK 1,000 44 . 45 417 YLNGNHLTK 1,000 45. 46 433 GLFINLEYLY 1,000 46 . 47 785 DMEAHYPGA 0,900 47 . 48 398 RIEVLEEGS 0,900 CO 49 701 EEEEERNEK 0,900 49 . 50 833 YLEVLEQQT 0,900 50 . 261 QUADRO VI Resultados da classificação do péptido HLA - 158P1D7 - Al, 10-mers Classificação Posição inicial Listagem dos resíduos da subsequência Resultado (estimativa do período de semi-vida de dissociação de uma molécula que contém esta subsequência) Seq. ID # 1 56 VSEISVPPSR 27,000 51. 2 669 TTERPSASLY 11,250 52 . 3 210 ILDLQLEDNK 10,000 53 . 4 781 QLQPDMEAHY 10,000 54. 5 150 VIEPSAFSKL 9,000 55. 6 171 AIESLPPNIF 9,000 56. 7 828 HAEPDYLEVL 9,000 57. 8 123 SLEILKEDTF 9,000 58 . 9 398 RIEVLEEGSF 9,000 59 . 10 812 LVEQTKNEYF 9,000 60 . 11 173 ESLPPNIFRF 7,500 61. 32 546 CTSPGHLDKK 5, 000 62 . 13 134 GLENLEFLQA 4,500 63 . 14 401 VLEEGSFMNL 4,500 64. 15 380 KSDLVEYFTL 3,750 65. 16 456 NPMPKLKVLY 2,500 66 . 17 505 DLDLLTQIDL 2,500 67. 18 502 ILDDLDLLTQ 2,500 co 19 743 STEFLSFQDA 2,250 69. 20 771 ITEYLRKNIA 2,250 70 . 21 682 MVSPMVHVYR 2,000 71. 22 214 QLEDNKWACN 1,800 72 . 23 355 LSDLRPPPQN 1,500 73 . 24 264 ESICPTPPVY 1,500 74 . 25 753 SSLYRNILEK 1,500 75. 26 561 NSEILCPGLV 1,350 76 . 27 601 LTDAVPLSVL 1,250 77. 28 276 HEDPSGSLHL 1,250 78 . 29 590 TTNTADTILR 1,250 79 . 262 QUADRO VI Resultados da classificação do péptido HLA - 158P1D7 - Al, 10-mers Classificação Posição inicial Listagem dos resíduos da subsequência Resultado (estimativa do período de semi-vida de dissociação de uma molécula que contém esta subsequência) Seq. ID # 30 149 TVIEPSAFSK 1,000 CO O 31 106 GAFNGLGLLK 1,000 81. 32 801 ETLMYSRPRK 1,000 82 . 33 545 LCTSPGHLDK 1,000 33 . 34 824 KANLHAEPDY 1,000 84. 35 525 LVGLQQWIQK 1,000 85. 36 300 TTSILKLPTK 1,000 86 . 37 477 HIFSGVPLTK 1,000 87. 38 100 LADIEIGAFN 1,000 85. 39 768 QLGITEYLRK 1,000 89 . 40 245 VCNSPPFFK 1,000 90. 41 721 LLEQENHSPL 0,900 91. 42 700 LEEEEERNEK 0,900 92 . 43 102 DIEIGAFNGL 0,900 93. 44 441 YLEYNAIKEI 0,900 94. 45 436 NLEYLYLEYN 0,900 95. 46 36 NCEEKDGTML 0,900 96 . 47 513 DLEDNPWDCS 0,900 97. 48 383 LVEYFTLEML 0,900 CO 49 388 TLEMLHLGNN 0,900 99 . 50 137 NLEFLQADNN 0,900 100 . 263 QUADRO VII Resultados da classificação do péptido HLA - 158P1D7 - A2, 9-mers Classificação Posição inicial Listagem dos resíduos da subsequência Resultado (estimativa do período de semi-vida de dissociação de uma molécula que contém esta subsequência) Seq. ID # 1 465 YLNNNLLQV 735,860 101 . 2 614 LLIMFITIV 423,695 102 . 3 193 NQLQTLPYV 330,059 103 . 4 616 imfittvtfc 285,492 104. 5 140 FLQADNNFI 263,950 105. 6 415 KLYLNGNHL 239,259 106 . 7 439 YLYLEYNAI 230,356 107. 8 611 ILGLLIMFI 224,357 108 . 9 2 KLWIHLFYS 158,832 109 . 10 429 GMFLGLHNL 131,296 110 . 11 581 YLMVTTPAT 1126,833 111. 12 463 VLYLNNNLL 116,211 112 . 13 574 SMPTQTSYL 84,856 113 . 14 71 LLNNGLTML 85,527 114 . 15 4 WIHLFYSSL 77,017 115 . 16 305 KLPTKAPGL 74,768 116 . 17 613 GLLIMFITI 73,343 117. 18 213 LQLEDNKWA 71,445 118 . 19 826 NLHAEPDYL 57,572 119 . 20 803 LMYSRPRKV 54,652 120 . 21 501 NILDDLDLL 50,218 121. 22 798 KLMETLMYS 50,051 122 . 23 527 GLQQWIQKL 49,134 123 . 24 158 KLNRLKVLI 36,515 124 . 25 178 NIFRFVPLT 33,135 125. 26 225 DLLQLKTWL 32,604 126 . 27 462 KIVLYLNNNL 24,206 127 . 264 QUADRO VII Resultados da classificação do péptido HLA - 158P1D7 - A2, 9-mers Classificação Posição inicial Listagem dos resíduos da subsequência Resultado (estimativa do período de semi-vida de dissociação de uma molécula que contém esta subsequência) Seq. ID # 28 767 QQLGITEYL 21,597 128 . 29 116 QLHIZVHNSL 21,362 129 . 30 68 QLSLLNNGL 21,362 130 . 31 502 ILDDLDLLT 20,776 131. 32 70 SLLNNGLTML 18,382 132 . 33 470 LLQVLPPHI 17,736 133 . 34 391 MLHLGNNRI 17,736 134. 35 164 VLILNADNI 17,736 135. 36 337 VLSPSGLLI 17,736 136 . 37 774 YLRKNIAQL 17,177 137 . 38 450 ILPGTFNPM 16,047 138 . 39 323 QLPGPYCPI 15,649 139. 40 367 KLILAGNII 14,971 140 . 41 316 YFTKPSTQL 13,512 141. 42 141 LQADNNFIT 12,523 142 . 43 214 QIEDNKWAC 9, 777 143 . 44 582 LMVTTPATT 9,149 144. 45 758 NILEKEREL 8,912 145 . 46 17 SLHSQTPVL 8, 759 146 . 47 182 FVPLTHLDL 8,598 147. 48 609 VLIIGLLIM 7,964 148 . 49 295 RMSTKTTSI 7,535 149 . 50 309 KAPGLIPYI 6, 415 150 . 265 QUADRO VIII Resultados da classificação do péptido HLA - 158P1D7 - A2, 10-mers Classificação Posição inicial Listagem dos resíduos da subsequência Resultado (estimativa do período de semi-vida de dissociação de uma molécula que contém esta subsequência) Seq. ID # 1 613 GLLIMFITIV 922,161 151. 2 431 FLGLHNLEYL 609,108 152 . 3 616 IMFITIVFCA 301,064 153 . 4 600 SLTDAVPLSV 285,163 154 . 5 417 YLNGMCLTKL 226,014 155. 6 473 VLPPHIFSGV 224,653 156 . 7 70 SLLNNGLTML 181,794 157 . 8 433 GLHNLEYLYL 176,240 158 . 9 166 ILNADNIESL 167,806 159 . 10 407 FMNLTRLQKL 163,232 160 . 11 174 SLPPNIFRFV 145,364 161. 12 425 KLSKGMFLGL 142,060 162 . 13 581 YLMVTTPATT 126,833 163 . 14 409 NLTRLQKLYL 117,493 164. 15 610 LILGLLIMFI 114,142 165. 16 746 FLSFQDASSL 98,267 166. 17 213 LQLEDNKWAC 97,424 167 . 18 141 LQADNNFITV 93,387 168 . 19 465 YLNNNLLQVL 92,666 169. 20 369 ILAGNIIHSL 83,527 170 . 21 415 KLYLNGNHLT 83,462 171. 22 140 FLQADNNFIT 81,516 172 . 23 158 KLNRLKVLIL 70,507 173 . 24 611 ILGLL1MF1T 69,289 174 . 25 78 MLHTNDFSGL 69,001 175 . 26 615 LIMFITIVFC 54,353 176 . 27 802 TLMYSRPRKV 51,468 177. 28 531 WIQKLSKNTV 43,992 178 . 29 469 NLLQVLPPHI 38,601 179 . 266 QUADRO VIII Resultados da classificação do péptido HLA - 158P1D7 - A2, 10-mers Classificação Posição inicial Listagem dos resíduos da subsequência Resultado (estimativa do período de semi-vida de dissociação de uma molécula que contém esta subsequência) Seq. ID # 30 67 FQLSLLNNGL 36,864 180. 31 803 LMYSRPRKVL 34,412 181. 32 115 KQLHINHNSL 28,049 182 . 33 462 KVLYLNNNLL 24,206 183 . 34 86 GLTNAISIHL 21,362 184 . 35 401 VLEEGSFMNL 18,106 185. 36 44 MLIMCEAKGI 17,736 186 . 37 596 TILRSLTDAV 17,338 187 . 38 621 IVFCAAGIVV 15,695 188 . 39 501 NILDDLDLLT 15,544 189 . 40 4 WIHLFYSSLL 13,512 190. 41 486 KVNLKTNQFT 12,552 191. 42 163 KVLILNADNI 11,822 192 . 43 336 KVLSPSGLLI 11,822 193. 44 60 SVPPSRPFQL 10,841 194 . 45 282 SLHLAATSSI 10,433 195. 46 110 GLGLLKQLHI 10,433 196 . 47 766 LQQLGITEYL 9,923 197 . 48 126 ILKEDTFHGL 9,902 198. 49 15 CISLHSQTPV 9,563 199 . 50 582 LMVTTPATTT 9, 149 200 . 267 QUADRO IX Resultados da classificação do péptido HLA - 158P1D7 - A3, 9-mers Classificação Posição inicial Listagem dos resíduos da subsequência Resultado (estimativa do período de semi-vida de dissociação de uma molécula que contém esta subsequência) Seq. ID # 1 754 SLYRNILEK 300,000 201. 2 417 YLNGNHLTK 60,000 202 . 3 407 FMNLTRLQK 40,000 203 . 4 433 GLHNLEYLY 36,000 204. 5 802 TLMYSRPRK 30,000 205. 6 43 TMLINCEAK 30,000 206. 7 342 GLLIHCQER 18,000 207. 8 799 LMETLMYSR 18,000 208 . 9 613 GLLIMFITI 16,200 209 . 10 429 GMFLGLHNL 13,500 210 . 11 174 SLPPNIFRF 13,500 211. 12 768 QLGITEYLR 12,000 212 . 13 627 GIWLVLHR 10,800 213 . 14 150 VIEPSAFSK 9,000 214. 15 415 KLYLNGNHL 9,000 215 . 16 527 GLQQWIQKL 8,100 216 . 17 436 NLEYLYLEY 8,000 217 . 18 431 FLGLHNLEY 8,000 218 . 19 378 LMKSDLVEY 6,000 219 . 20 529 QQWIQKLSK 6,000 220 . 21 546 CTSPGHLDK 3,000 221. 22 463 VLYLNNNLL 3,000 222 . 23 439 YLYLEYNAI 3,000 223 . 24 2 KLWIHLFYS 2,700 224. 25 367 KLILAGNII 2,700 225. 26 297 STKTTSILK 2,000 226 . 27 6 HLFYSSLLA 2,000 227. 28 632 VLHRRRRYK 2,000 228 . 29 409 NLTRLQKLY 2,000 229 . 268 QUADRO IX Resultados da classificação do péptido HLA - 158P1D7 - A3, 9-mers Classificação Posição inicial Listagem dos resíduos da subsequência Resultado (estimativa do período de semi-vida de dissociação de uma molécula que contém esta subsequência) Seq. ID # 30 611 ILGLLIMFI 1,800 230. 31 337 VLSPSGLLI 1,800 231. 32 305 KLPTKAPGL 1,800 232 . 33 390 EMLHLGNNR 1,800 233 . 34 158 KLNRLKVLI 1,800 234. 35 682 MVSPMVHVY 1,800 235. 36 616 IMFITIVFC 1,500 236 . 37 659 SMYGHKTTH 1,500 237. 38 628 IVVLVLHRR 1,350 238 . 39 614 LLIMFITIV 1,350 239 . 40 323 QLPGPYCPI 1,350 240 . 41 610 LILGLLIMF 1,350 241. 42 729 PLTGSNMKY 1,200 242 . 43 453 GTFNPMPKL 1, 012 243 . 44 228 QLKTWLENM 0,900 244 . 45 450 ILPGTFNPM 0,900 245 . 46 615 LIMFITTVF 0,900 246 . 47 609 VLILGLLB4 0,900 247 . 48 255 GSILSRLKK 0,900 248 . 49 482 VPLTKVMLK 0,900 249 . 50 774 YLRKNIAQL 0,900 250 . 269 QUADRO X Resultados da classificação do péptido HLA - 158P1D7 - A3, 10-mers Classificação Posição inicial Listagem dos resíduos da subsequência Resultado (estimativa do período de semi-vida de dissociação de uma molécula que contém esta subsequência) Seq. ID # 1 439 YLYLEYNAIK 300,000 251. 2 793 KLMETLMYSR 121,500 252 . 3 632 VLHRRRRYKK 60,000 253 . 4 768 QLGITEYLRK 40,000 254 . 5 477 HIFSGVPLTK 20,000 255. 6 211 ILDLQLEDNK 20,000 256. 7 491 GVPLTKVNLK 18,000 257 . 8 681 HMVSPMVHVY 18,000 258 . 9 616 IMFITIVFCA 13,500 259 . 10 149 TVIEPSAFSK 13,500 260 . 11 158 KLNRLKVLIL 10,800 261. 12 425 KLSKGMFLGL 10,800 262 . 13 815 QTKNEYFELK 9,000 263 . 14 609 VLILGLLIMF 9,000 264. 15 245 VVCNSPPFFK 9,000 265. 16 614 LLIMFITIVF 9,000 266 . 17 811 VLVEQTKNEY 9,000 267. 18 377 SLMKSDLVEY 9,000 268 . 19 453 GTFNPMPKLK 7,500 269 20 781 QLQPDMEAHY 6,000 270 . 21 655 HLQYSMYGHK 6,000 271. 22 378 LMKSDLVEYF 6,000 272 . 23 75 GLTMLHTNDF 6,000 273 . 24 106 GAFNGLGLLK 6,000 274 . 25 2 KLWIHLFYSS 5, 400 275 . 26 86 GLTNAISIHL 5, 400 276 . 27 401 VLEEGSFMNL 5, 400 277. 28 42 GTMLINCEAK 4,500 278 . 29 613 GLLIMFITIV 4, 050 279 . 270 QUADRO X Resultados da classificação do péptido HLA - 158P1D7 - A3, 10-mers Classificação Posição inicial Listagem dos resíduos da subsequência Resultado (estimativa do período de semi-vida de dissociação de uma molécula que contém esta subsequência) Seq. ID # 30 627 GIVVLVLHRR 4, 050 280. 31 525 LVGLQQWIQK 4, 000 281. 32 134 GLENLEFLQA 3,600 282 . 33 433 GLHNLEYLYL 3,600 283 . 34 110 GLGLLKQLHI 3,600 284. 35 6 HLFYSSLLAC 3,000 285. 36 470 LLQVLPPHIF 3,000 286 . 37 194 QLQTLPYVGF 3,000 287. 38 290 SINDSRMSTK 3,000 288 . 39 126 ILKEDTFHGL 2,700 289 . 40 357 DLRPPPQNPR 2,700 290. 41 796 ELKLMETLMY 2,400 291. 42 546 CTSPGHLDKK 2,250 292 . 43 803 LMYSRPRKVL 2,250 293. 44 729 PLTGSNMKYK 2,250 294. 45 369 ILAGNILHSL 2, 025 295. 46 123 SLEILKEDTF 2,000 296 . 47 765 ELQQLGITEY 1,800 297. 48 112 GLLKQLHINH 1,800 298. 49 367 KLILAGNIIH 1,800 299 . 50 78 MLHTNDFSGL 1,800 300 . 271 QUADRO XI Resultados da classificação do péptido HLA - 158P1D7 - All, 9-mers Classificação Posição inicial Listagem dos resíduos da subsequência Resultado (estimativa do período de semi-vida de dissociação de uma molécula que contém esta subsequência) Seq. ID # 1 529 QQWIQKLSK 2,400 301. 2 297 STKTTSILK 2,000 302 . 3 546 CTSPGHLDK 2,000 303 . 4 754 SLYRNILEK 1,600 304. 5 656 LQYSMYGHK 1,200 305. 6 150 VIEPSAFSK 1,200 306. 7 407 FMNLTRLQK 0,800 307. 8 802 TLMYSRPRK 0,800 308 . 9 417 YLNGNHLTK 0,800 309 . 10 627 GIVVLVLHR 0,720 310 . 11 628 IVVLVLHRR 0,600 311. 12 440 LYLEYNAIK 0,600 312 . 13 246 VCNSPPFFK 0,600 313 . 14 359 RPPPQNPRK 0,600 314. 15 66 4 KTTHHTTER 0,600 315. 16 43 TMLINCEAK 0,600 316 . 17 730 LTGSNMKYK 0,500 317 . 18 478 IFSGVPLTK 0,400 318 . 19 107 AFNGLGLLK 0,400 319. 20 372 GNIIHSLMK 0,360 320 . 21 342 GLLIHCQER 0,360 321. 22 482 VPLTKVNLK 0,300 322 . 23 728 SPLTGSNMK 0,300 323 . 24 420 GNHLTKLSK 0,240 324. 25 749 FQDASSLYR 0,240 325. 26 287 ATSSINDSR 0,200 326 . 27 790 YPGAHEELK 0,200 327. 28 328 YCPIPCNCK 0,200 328 . 29 255 GSILSRLKK 0,180 329 . 272 QUADRO XI Resultados da classificação do péptido HLA - 158P1D7 - All, 9-mers Classificação Posição inicial Listagem dos resíduos da subsequência Resultado (estimativa do período de semi-vida de dissociação de uma molécula que contém esta subsequência) Seq. ID # 30 799 LMETLMYSR 0,160 330. 31 768 QLGITEYLR 0,160 331. 32 20 SQTPVLSSR 0,120 332 . 33 454 TFNPMPKLK 0,100 333 . 34 550 GHLDKKELK 0,090 334. 35 809 RKVLVEQTK 0,090 335. 36 336 KVLSPSGLL 0,090 336 . 37 462 KVLYLNNNL 0,090 337. 38 163 KVLILNADN 0,090 338 . 39 252 FFKGSILSR 0,080 339 . 40 351 NIESLSDLR 0,080 340. 41 769 LGITEYLRK 0,060 341. 42 526 VGLQQWIQK 0,060 342 . 43 453 GTFNPMPKL 0,060 343. 44 42 GTMLINCEA 0,060 344 . 45 629 VVLVLHRRR 0,060 345. 46 608 SVLILGLLI 0,060 346 . 47 183 VPLTHLDLR 0,060 347 . 48 486 KVNLKTNQF 0,060 348 49 481 GVPLTKVNL 0,060 349 . 50 707 NEKEGSDAK 0,060 350 . 273 QUADRO XII Resultados da classificação do péptido HLA - 158P1D7 - All, 10-mers Classificação Posição inicial Listagem dos resíduos da subsequência Resultado (estimativa do período de semi-vida de dissociação de uma molécula que contém esta subsequência) Seq. ID # 1 149 TVIEPSAFSK 9,000 351. 2 245 VVCNSPPFFK 6,000 352 . 3 42 GTMLINCEAK 6,000 353 . 4 481 GVPLTKVNLK 6,000 354. 5 525 LVGLQQWIQK 4, 000 355. 6 453 GTFNPMPKLK 3,000 356. 7 106 GAFNGLGLLK 2,400 357. 8 477 HIFSGVPLTK 1,600 358 . 9 416 LYLNGNHLTK 1,200 359 . 10 528 LQQWIQKLSK 1,200 360 . 11 815 QTKNEYFELK 1,000 361. 12 300 TTSILKLPTK 1,000 362 . 13 546 CTSPGHLDKK 1,000 363 . 14 798 KLMETLMYSR 0,960 364. 15 200 YVGFLEHIGR 0,800 365. 16 406 SFMNLTRLQK 0,800 366 . 17 439 YLYLEYNAIK 0,800 367. 18 768 QLGITEYLRK 0,800 368 . 19 632 VLHRRRRYKK 0,800 369. 20 801 ETLMYSRPRK 0, 450 370 . 21 310 APGLIPYITK 0,400 371. 22 789 HYPGAHEELK 0,400 372 . 23 655 HLQYSMYGHK 0,400 373 . 24 451 LPGTFNPMPK 0,400 374 . 25 689 VYRSPSFGPK 0,400 375. 26 545 LCTSPGHLDK 0,400 376 . 27 210 ILDLQLEDNK 0,400 377. 28 590 TTNTADTILR 0,400 378 . 29 290 SINDSRMSTK 0,400 379 . 274 QUADRO XII Resultados da classificação do péptido HLA - 158P1D7 - All, 10-mers Classificação Posição inicial Listagem dos resíduos da subsequência Resultado (estimativa do período de semi-vida de dissociação de uma molécula que contém esta subsequência) Seq. ID # 30 45 LINCEAKGIK 0,400 380. 31 682 MVSPMVHVYR 0,400 381. 32 . 182 FVPLTHLDLR 0,400 382 . 33 767 QQLGITEYLR 0,360 383 . 34 627 GIVVLVLHRR 0,360 384. 35 631 LVLHRRRRYK 0,300 385. 36 221 ACNCDLLQLK 0,200 386 . 37 336 KVLSPSGLLI 0,180 387. 38 706 RNEKEGSDAK 0,120 388 . 39 254 KGSILSRLKK 0,120 389 . 40 462 KVLYLNNNLL 0,090 390. 41 163 KVLILNADNI 0,090 391. 42 621 IVFCAAGIVV 0,080 392 . 43 748 SFQDASSLYR 0,080 393. 44 119 INHNSLEILK 0,080 394. 45 753 SSLYRNILEK 0,060 395. 46 60 SVPPSRPFQL 0,060 396 . 47 490 KTNQFTHLPV 0,060 397. 48 700 LEEEEERNEK 0,060 398. 49 628 JVVLVIHKRR 0,060 399 . 50 608 SVLILGLLIM 0,060 400 . 275 QUADRO XIII Resultados da classificação do péptido HLA - 158P1D7 - A24, 9-mers Classificação Posição inicial Listagem dos resíduos da subsequência Resultado (estimativa do período de semi-vida de dissociação de uma molécula que contém esta subsequência) Seq. ID # 1 443 EYNAIKEIL 420,000 1 2 789 HYPGAHEEL 330,000 2 3 819 EYFELKANL 288,000 3 4 804 MYSRPRKVL 200,000 4 5 8 FYSSLLACI 60,000 5 6 386 YFTLEMLHL 20,000 6 7 739 EFLQADNNF 18,000 7 8 462 KVLYLNNNL 17,280 8 9 350 RNIESLSDL 14,400 9 10 599 RSLTDAVPL 12,000 10 11 336 KVLSPSGLL 12,000 11 12 305 KLPTKAPGL 12,000 12 13 736 KYKTTNQST 12,000 13 14 580 SYLMVTTPA 10,500 14 15 415 KLYLNGNHL 9,600 15 16 272 VYEEHEDPS 9,000 16 17 202 GFLEHIGRI 9,000 17 18 438 EYLYLEYNA 9,000 18 19 466 LNNNLLQVL 8,640 19 20 767 QQLGITEYL 8,400 20 21 203 FLEHIGRIL 8,400 21 22 607 LSVLILGLL 8,400 22 23 87 LTNAISIHL 8,400 23 24 537 KNTVTDDIL 8,000 24 25 219 KWACNCDLL 8,000 25 26 758 NILEKEREL 7,920 26 27 408 MNLTRLQKL 7,920 27 28 527 GLQQWIQKL 7,920 28 29 416 LYLNGNHLT 7,500 29 276 QUADRO XIII Resultados da classificação do péptido HLA - 158P1D7 - A24, 9-mers Classificação Posição inicial Listagem dos resíduos da subsequência Resultado (estimativa do período de semi-vida de dissociação de uma molécula que contém esta subsequência) Seq. ID # 30 199 PYVGFLEHI 7,500 30 31 486 KVNLKTNQF 7,200 31 32 109 NGLGLLKQL 7,200 32 33 196 QTLPYVGFL 7,200 33 34 133 HGLENLEFL 7,200 34 35 225 DLLQLKTWL 7,200 35 36 83 DFSGLTNAI 7,200 36 37 456 NPMPKLKVL 7,200 37 38 561 NSEILCPGL 7,200 38 39 501 NILDDLDLL 7,200 39 40 500 SNILDDLDL 6,000 40 41 221 ACNCDLLQL 6,000 41 42 71 LLNNGLTML 6,000 42 43 604 AVPLSVLIL 6,000 43 44 182 FVPLTHLDL 6,000 44 45 347 CQERNIESL 6,000 45 46 669 TTERPSASL 6,000 46 . 47 10 SSLLACISL 6,000 47 48 590 TTNTADTIL 6,000 48 49 481 GVPLTKVNL 6,000 49 50 432 LGLHNLEYL 6,000 50 277 QUADRO XIV Resultados da classificação do péptido HLA - 158P1D7 - A24, 10-mers Classificação Posição inicial Listagem dos resíduos da subsequência Resultado (estimativa do período de semi-vida de dissociação de uma molécula que contém esta subsequência) Seq. ID # 1 773 EYLRKNIAQL 300,000 401. 2 385 EYFTLEMLHL 200,000 402 . 3 438 EYLYLEYNAI 90,000 403 . 4 181 RFVPLTHLDL 72,000 404 . 5 202 GFLEHIGRIL 50,400 405. 6 677 LYEQHMVSPM 37,500 406 . 7 315 PYITKPSTQL 30,000 407 . 8 252 FFKGSILSRL 28,000 408 . 9 622 VFCAAGIVVL 20,000 409 . 10 179 IFRFVPLTHL 20,000 410 . 11 359 RPPPQNPRKL 15,840 411. 12 462 KVLYLNNNLL 14,400 412 . 13 115 KQLHINHNSL 14,400 413 . 14 757 RNILEKEREL 13,200 414. 15 832 DYLEVLEQQT 12,960 415 . 16 691 RSPSFGPKHL 12,000 416 . 17 428 KGMFLGLHNL 12,000 417 . 18 158 KLNRLKVLIL 12,000 418 . 19 131 TFHGLENLEF 11,000 419 . 20 425 LSKGMFLGL 9,600 420 . 21 150 VIEPSAFSKL 9,504 421. 22 139 EFLQADNNFI 9,000 422 . 23 102 DIEIGAFNGL 8,640 423 . 24 465 YLNNNLLQVL 8,640 424 . 25 67 FQLSLLNNGL 8,640 425 . 26 401 VLEEGSFMNL 8,640 426 . 27 497 LPVSNILDDL 8,400 427. 28 766 LQQLGITEYL 8,400 428 . 29 96 GFNNLADIEI 8,250 429 . 278 QUADRO XIV Resultados da classificação do péptido HLA - 158P1D7 - A24, 10-mers Classificação Posição inicial Listagem dos resíduos da subsequência Resultado (estimativa do período de semi-vida de dissociação de uma molécula que contém esta subsequência) Seq. ID # 30 738 KTTNQSTEFL 8,000 430. 31 380 KSDLVEYFTL 8,000 431. 32 295 RMSTKTTSIL 8,000 432 . 33 526 VGLQQWIQKL 7,920 433 . 34 407 FMNLTRLQKL 7,920 434 . 35 580 SYLMVTTPAT 7,500 435. 36 464 LYLNNNLLQV 7,500 436 . 37 828 HAEPDYLEVL 7,200 437 . 38 329 CPIPCNCKVL 7,200 438 . 39 36 NCEEKDGTML 7,200 439 . 40 346 HCQERNIESL 7,200 440 . 41 166 ILNADNIESL 7,200 441. 42 60 SVPPSRPFQL 7,200 442 . 43 605 VPLSVLILGL 7,200 443 . 44 480 SGVPLTKVNL 7,200 444 . 45 603 DAVPLSVLIL 7,200 445 . 46 494 FTHLPVSNIL 6,720 446 . 47 592 NTADTILRSL 6,720 447 . 48 417 YLKGNHLTKL 6,600 448 . 49 118 HINHNSLEIL 6,000 449 . 50 500 SNILDDLDLL 6,000 450 . 279 QUADRO XV Resultados da classificação do péptido HLA - 158P1D7 - B7, 9-mers Classificação Posição inicial Listagem dos resíduos da subsequência Resultado (estimativa do período de semi-vida de dissociação de uma molécula que contém esta subsequência) Seq. ID # 1 456 NPMPKLKVL 240,000 451 . 2 458 MPKLKVLYL 80,000 452 . 3 692 SPSFGPKHL 80,000 453 . 4 61 VPPSRPFQL 80,000 454. 5 517 NPWDCSCDL 80,000 455. 6 604 AVPLSVLIL 60,000 456 . 7 26 SSRGSCDSL 40,000 457. 8 207 IGRILDLQL 40,000 458 . 9 410 LTRLQKLYL 40,000 459 . 10 159 LNRLKVLIL 40,000 460 . 11 774 YLRKNIAQL 40,000 461. 12 625 AAGIVVLVL 36,000 462 . 13 336 KVLSPSGLL 30,000 463 . 14 481 GVPLTKVNL 20,000 464 . 15 182 FVPLTHLDL 20,000 465. 16 462 KVLYLNNNL 20,000 466. 17 652 SPVHLQYSM 20,000 467. 18 575 MPTQTSYLM 20,000 468 . 19 752 ASSLYRNIL 18,000 469 . 20 370 LAGNIIHSL 12,000 470 . 21 154 SAFSKLNRL 12,000 471. 22 713 DAKHLQRSL 12,000 472 . 23 221 ACNCDLLQL 12,000 473 . 24 106 GAFNGLGLL 12,000 474 . 25 249 SPPFFKGSI 8,000 475. 26 306 LPTKAPGLI 8,000 476 . 27 250 PPFFKGSIL 8,000 477 . 28 360 PPPQNPRKL 8,000 478 . 29 453 GTFNPMPKL 6,000 479 . 280 QUADRO XV Resultados da classificação do péptido HLA - 158P1D7 - B7, 9-mers Classificação Posição inicial Listagem dos resíduos da subsequência Resultado (estimativa do período de semi-vida de dissociação de uma molécula que contém esta subsequência) Seq. ID # 30 310 APGLIPYIT 6,000 480 . 31 316 YITKPSTQL 6,000 481. 32 400 EVLEEGSFM 5, 000 482 . 33 429 GMFLGLHNL 4, 000 483. 34 418 LNGNHLTKL 4, 000 484 . 35 544 ILCTSPGHL 4, 000 485. 36 826 NLHAEPDYL 4, 000 486. 37 350 RNIESLSDL 4, 000 487 . 38 4 WIHLFYSSL 4, 000 458 . 39 501 NILDDLDLL 4, 000 489 . 40 109 NGLGLLKQL 4, 000 490 . 41 607 LSVLILGLL 4, 000 491. 42 71 LLNNGLTML 4, 000 492 . 43 599 RSLTDAVPL 4, 000 493 . 44 739 TTNQSTEFL 4, 000 494 . 45 87 LTNAISIHL 4, 000 495. 46 130 DTFHGLENL 4, 000 496 . 47 415 KLYLNGNHL 4, 000 497 . 48 175 LPPNTFRFV 4, 000 498 . 49 105 IGAFNGLGL 4, 000 499 . 50 296 MSTKTTSIL 4, 000 500 . 281 QUADRO XVI Resultados da classificação do péptido HLA - 158P1D7 - B7, 10-mers Classificação Posição inicial Listagem dos resíduos da subsequência Resultado (estimativa do período de semi-vida de dissociação de uma molécula que contém esta subsequência) Seq. ID # 1 249 SPPFFKGSIL 80,000 501. 2 548 SPGHLDKKEL 80,000 502 . 3 497 LPVSNILDDL 80,000 503 . 4 329 CPIPCNCKVL 80,000 504. 5 790 YPGAHEELKL 80,000 505. 6 605 VPLSVLILGL 80,000 506. 7 359 RPPPQNPRKL 80,000 507. 8 189 DLRGNQLQTL 40,000 508 . 9 647 QMRDNSPVHL 40,000 509 . 10 566 CPGLNNPSM 20,000 510 . 11 807 RPRKVLVEQT 20,000 511. 12 462 KVLYLNNLL 20,000 512 . 13 60 SVPPSRPFQL 20,000 513 . 14 713 DAKHLQRSLL 18,000 514. 15 751 DASSLYRNIL 18,000 515. 16 603 DA VPLSVLIL 12,000 516 . 17 624 CAAGIVVLVL 12,000 517 . 18 428 KGMFLGLHNL 12,000 518 . 19 825 ANLHAEPDYL 12,000 519 . 20 220 WACNCDLLQL 12,000 520 . 21 803 LMYSRPRKVL 9,000 521. 22 198 LPYVGFLEHI 8,000 522 . 23 361 PPQNPRKLIL 8,000 523 . 24 176 PPNIFRFVPL 8,000 524 . 25 475 PPHIFSGVPL 8,000 525. 26 62 PPSRPFQLSL 8,000 526 . 27 179 IFRFVPLTHL 6,000 527. 28 668 HTTERPSASL 6,000 528 . 29 383 LVEYFTLEML 6,000 529 . 282 QUADRO XVI Resultados da classificação do péptido HLA - 158P1D7 - B7, 10-mers Classificação Posição inicial Listagem dos resíduos da subsequência Resultado (estimativa do período de semi-vida de dissociação de uma molécula que contém esta subsequência) Seq. ID # 30 608 SVLILGLLIM 5, 000 530. 31 393 HLGNNRIEVL 4, 000 531. 32 589 TTTNTADTIL 4, 000 532 . 33 738 KTTNQSTEFL 4, 000 533 . 34 78 MLHTNDFSGL 4, 000 534. 35 16 ISLHSQTPVL 4, 000 535. 36 9 YSSLLACISL 4, 000 536 . 37 814 EQTKNEYFEL 4, 000 537. 38 407 FMNLTRLQKL 4, 000 538 . 39 575 MPTQTSYLMV 4, 000 539 . 40 4 WIHLFYSSLL 4, 000 540 . 41 417 YLNGKHLTKL 4, 000 541. 42 63 PSRPFQLSLL 4, 000 542 . 43 757 RNILEKEREL 4, 000 543 . 44 108 FNGLGLLKQL 4, 000 544 . 45 409 NJTRLQKLYL 4, 000 545. 46 556 ELKALNSEIL 4, 000 546 . 47 166 ILNADNIESL 4, 000 547 . 48 217 DNKWACNCDL 4, 000 548 . 49 364 NPRKLILAGN 4, 000 549 . 50 295 RMSTKTTSIL 4, 000 550 . 283 QUADRO XVII Resultados da classificação do péptido HLA - 158P1D7 - B35, 9-mers Classificação Posição inicial Listagem dos resíduos da subsequência Resultado (estimativa do período de semi-vida de dissociação de uma molécula que contém esta subsequência) Seq. ID # 1 458 MPKLKVLYL 60,000 551. 2 652 SPVHLQYSM 40,000 552 . 3 575 MPTQTSYLM 40,000 553 . 4 517 NPWDCSCDL 40,000 554. 5 456 NPMPKLKVL 20,000 555. 6 692 SPSFGPKHL 20,000 556 . 7 61 VPPSRPFQL 20,000 557. 8 792 GAHEELKLM 18,000 558 . 9 26 SSRGSCDSL 15,000 559 . 10 426 LSKGMFLGL 15,000 560 . 11 599 RSLTDAVPL 15,000 561. 12 727 HSPLTGSNM 10,000 562 . 13 288 TSSINDSRM 10,000 563 . 14 713 DAKHLQRSL 9,000 564. 15 378 LMKSDLVEY 9,000 565. 16 306 LPTKAPGLI 8,000 566 . 17 249 SPPFFKGSI 8,000 567. 18 747 LSFQDASSL 7,500 568 . 19 228 QLKTWLENM 6,000 569 . 20 674 SASLYEQHM 6,000 570 . 21 400 EVLEEGSFM 6,000 571. 22 258 LSRLKKESI 6,000 572 . 23 796 ELKLMETLM 6,000 573 . 24 752 ASSLYRNIL 5, 000 574 . 25 607 LSVLILGLL 5, 000 575. 26 10 SSLLACISL 5, 000 576 . 27 59 ISVPPSRPF 5, 000 577. 28 296 MSTKTTSLL 5, 000 578 29 405 GSFMNLTRL 5, 000 579 . 284 QUADRO XVII Resultados da classificação do péptido HLA - 158P1D7 - B35, 9-mers Classificação Posição inicial Listagem dos resíduos da subsequência Resultado (estimativa do período de semi-vida de dissociação de uma molécula que contém esta subsequência) Seq. ID # 30 815 QTKNEYFEL 4,500 580. 31 350 RNIESLSDL 4, 000 581. 32 329 CPIPCNCKV 4, 000 582 . 33 474 LPPHIFSGV 4, 000 583 . 34 782 LQPDMEAHY 4, 000 584. 35 65 RPFQLSLLN 4, 000 585. 36 175 LPPNIFRFV 4, 000 586 . 37 805 YSRPRKVLV 3,000 587. 38 774 YLRKNIAQL 3,000 588 . 39 154 SAFSKLNL 3,000 589 . 40 410 LTRLQKLYL 3,000 590. 41 207 IGRILDLQL 3,000 591. 42 370 LAGNIIHSL 3,000 592 . 43 106 GAFNGLGLL 3,000 593. 44 156 FSKLNRLKV 3,000 594. 45 501 NILDDLDLL 3,000 595. 46 423 LTKLSKGMF 3,000 596 . 47 625 AAGIVVLVL 3,000 597. 48 159 LNRLKVLIL 3,000 598. 49 89 NAISIHLGF 3,000 599 . 50 309 KAPGLEPYI 2,400 600 . 285 QUADRO XVIII Resultados da classificação do péptido HLA - 158P1D7 - B35, 10-mers Classificação Posição inicial Listagem dos resíduos da subsequência Resultado (estimativa do período de semi-vida de dissociação de uma molécula que contém esta subsequência) Seq. ID # 1 319 KPSTQLPGPY 80,000 601. 2 566 CPGLVNNPSM 40,000 602 . 3 728 SPLTGSNMKY 40,000 603 . 4 572 NPSMPTQTSY 40,000 604. 5 652 SPVHLQYSMY 40,000 605. 6 359 RPPPQNPRKL 40,000 606. 7 456 NPMPKLKVLY 40,000 607. 8 548 SPGHLDKKEL 30,000 608 . 9 790 YTGAHEELKL 30,000 609 . 10 329 CPIPCNCKVL 20,000 610 . 11 249 SPPFFKGSIL 20,000 611. 12 605 VPLSVLILGL 20,000 612 . 13 497 LPVSNILDDL 20,000 613 . 14 156 FSKLNRLKV 15,000 614. 15 824 KANLHAEPDY 12,000 615. 16 807 RPRKVLVEQT 12,000 616. 17 747 LSFQDASSLY 10,000 617 . 18 691 RSPSFGPKHL 10,000 618 . 19 264 ESICPTPPVY 10,000 619. 20 651 NSPVHLQYSM 10,000 620 . 21 69 LSLLNNGLTM 10,000 621. 22 796 ELKLMETLMY 9,000 622 . 23 713 DAKHLQRSLL 9,000 623 . 24 198 LPYVGFLEHI 8,000 624. 25 517 NPWDCSCDLV 8,000 625. 26 499 VSNILDDLDL 7,500 626 . 27 126 ILKEDTFHGL 6,000 627. 28 370 LAGNIHSLM 6,000 628 . 29 458 MPKLKVLYLN 6,000 629 . 286 QUADRO XVIII Resultados da classificação do péptido HLA - 158P1D7 - B35, 10-mers Classificação Posição inicial Listagem dos resíduos da subsequência Resultado (estimativa do período de semi-vida de dissociação de uma molécula que contém esta subsequência) Seq. ID # 30 364 NPRKLILAGN 6,000 630. 31 647 QMRDNSPVHL 6,000 631. 32 446 AIKEILPGTF 6,000 632 . 33 535 LSKNTVTDDI 6,000 633 . 34 25 LSSRGSCDSL 5, 000 634. 35 9 YSSLLACISL 5, 000 635. 36 173 ESLPPNIFRF 5, 000 636 . 37 16 ISLHSQTPVL 5, 000 637 38 380 KSDLVEYFTL 4,500 638 . 39 220 WACNCDLLQL 4,500 639 . 40 435 HNLEYLYLEY 4, 000 640 . 41 236 MPPQSIIGDV 4, 000 641 42 382 DLVEYFTLEM 4, 000 642 . 43 35 CNCEEKDGTM 4, 000 643. 44 575 MPTQTSYLMV 4, 000 644 . 45 777 KNIAQLQPDM 4, 000 645. 46 191 RGNQLQTLPY 4, 000 6 46. 47 65 RPFQLSLLNN 4, 000 647 . 48 811 VLVEQTKNEY 4, 000 648. 49 4 6 INCEAKGIKM 4, 000 649 . 50 556 ELKALNSEIL 3,000 650 . 287 Quadro XIX: subseguências que suportam motivo da proteína 158P1D7

Motivos proteicos de 158P1D7 Local de N-glicosilação Número de correspondências: 3 1 292-295 NDSR 2 409-412 NLTR 3 741-744 NQST Local de fosforilaçao de proteína cinase dependente de cAMP- e de cGMP

262-265 KKES Local de fosforilação de proteína cinase C Número de correspondências: 3 1 26-28 SSR

2 297-299 STK 3 670-672 TER Local de fosforilação de caseína cinase II Número de correspondências: 12 1 149-152 TVIE 2 186-189 THLD 3 231-234 TWLE 4 290-293 SIND 5 354-357 SLSD 6 510-513 TQID 7 539-542 TVTD 8 600-603 SLTD 9 676-679 SLYE 10 720-723 SLLE 11 748-751 SFQD 12 816-819 TKNE 288 Quadro XIX: subsequências que suportam motivo da proteína 158P1D7

Local de fosforilação de Tirosina cinase 798-805 KLMETLMY Local de N-miristoilação Número de correspondências: 8

1 29-34 GSCDSL 2 86-91 GLTNAI 3 106-111 GAFNGL 4 255-260 GSILSR 5 405-110 GSFMNL 6 420-425 GNHLTK 7 429-434 GMFLGL 8 481-486 GVPLTK

Foram previstos dois motivos de proteína por Pfam 1- ATPase Archaeal nos aminoácidos 441-451 2- repetição rica em leucina no terminal C nos aminoácidos 218-268 e nos aminoácidos 517-567 289

Quadro XX: motivos com ocorrência frequente Nome % média de identidade Descrição Função potencial zf-C2H2 34% Dedo de zinco tipo C2H2 A proteína de ligação a ácido nucleico actua como factor de transcrição, provável localização nuclear. citocrome b N 68% Citocrome b(N-terminal)/b6/pe tB Oxidase ligada à membrana, gera superóxido. ig 19% Domínio de imunoglobulina Os domínios possuem um comprimento de cem aminoácidos e incluem um ligação dissulfureto intradomínios conservada. WD4 0 18% Domínio WD, repetição G-beta Repetições em sequência de cerca de 40 resíduos, cada uma delas contendo um motivo Trp-Asp. Actua na transducção de sinal e na interacção de proteína. PDZ 23% Domínio de PDZ Pode actuar na orientação de moléculas de sinalização para locais sub-membranosos. LRR 28% Repetição rica em leucina Motivos de sequência curta implicados nas interacções proteína-proteína. pcinase 23% Domínio de proteína cinase Núcleo catalítico conservado comum a serina/trionina-cinase e tirosina-proteína-cinase, as quais contêm um local de ligação de ATP e um local catalítico. 290

Quadro XX: motivos com ocorrência frequente Nome % média de identidade Descrição Função potencial PH 16% Domínio de PH Homologia pleckstrin implicada na sinalização intracelular ou como constituintes do cito-esqueleto. EGF 34% Domínio extracelular de tipo EGF Comprimento de 30-40 aminoácidos encontrado no domínio extracelular de proteínas ligadas à membrana ou em proteínas segregadas. rvt 49% Transcriptase inversa (polimerase de ADN dependente de ARN) ank 25% Repetição Ank Proteína citoplásmica, associa proteínas membranares integrais ao cito-esqueleto. óxido- 32% NADH- Associado à membrana. vermelho ql ubiquinona/ plastoquinona (complexo I), várias cadeias Implicado na translocação de protão através da membrana. efhand 24% Mão EF Domínio de ligação de cálcio, consiste num laço de 12 resíduos flanqueado em ambos os lados por um domínio de hélice alfa com 12 resíduos. 291

Quadro XX: motivos com ocorrência frequente Nome % média de identidade Descrição Função potencial rvp 79% Aspartil- protease retroviral Proteases aspartilo ou ácido, centradas num resíduo aspartilo catalítico. Colaqénio 42% Repetição de hélice tripla de colagénio (20 cópias) proteínas estruturais extracelulares implicadas na formação de tecido conectivo. A sequência é constituída por G-X-Y e as cadeias polipeptídicas formam uma hélice tripla. fn3 20% Domínio de fibronectina de tipo III Localizado na região extracelular de ligação ao ligando de receptores, possuindo um comprimento de cerca de 20 aminoácidos com dois pares de cisternas envolvidos nas ligações dissulfureto. 7tm 1 19% receptor transmembranar 7 (família de rodopsina) Sete regiões transmembranares hidrofóbicas, com o terminal N localizado extracelularmente ao passo que o terminal C é citoplásmico. Sinal através de proteínas G. 292

Quadro VII: CLASSIFICAÇÃO TNM DE TUMORES DA BEXIGA

Tumor primário (T) 0 sufixo (m) deverá ser acrescentado à categoria T adequada para indicar tumores múltiplos. 0 sufixo (is) pode ser adicionado a qualquer T para indicar a presença de carcinoma associado in situ. TX Tumor primário não pode ser avaliado TO Sem evidências de tumor primário

Ta Carcinoma papilar não invasivo

Tis Carcinoma in situ: "tumor plano" TI Tumor invade tecido conectivo sub-epitelial T2 Tumor invade músculo superficial (metade interior) T3 Tumor invade músculo profundo ou gordura perivesical T3a

Tumor invade músculo profundo (metade exterior) T3b

Tumor invade gordura perivesical i. microscopicamente ii. macroscopicamente (massa extravesical) T4 Tumor invade qualquer um dos seguintes: próstata, útero, vagina, parede pélvica ou parede abdominal T4a Tumor invade a próstata, útero, vagina T4b Tumor invade a parede pélvica ou a parede abdominal ou ambas 293

Tumor primário (T) Nódulos linfáticos regionais (N)

Os nódulos linfáticos regionais são aqueles dentro da verdadeira pélvis: todos os outros são nódulos distantes NX Nódulos linfáticos regionais não puderam ser avaliados NO Sem metástases nos nódulos linfáticos regionais Nl Metástase num nódulo linfático individual, 2 cm ou inferior na maior dimensão N2 Metástase num nódulo linfático individual, superior a 2 cm mas inferior a 5 cm na sua maior dimensão, ou em múltiplos nódulos linfáticos, nenhum deles superior a 5 cm na maior dimensão N3 Metástase num nódulo linfático superior a 5 cm na sua maior dimensão Metástases distantes (M) MX A presença de metástases distantes não pode ser avaliada MO Sem metástases distantes Ml Metástases distantes Agrupamento de estágios

0a Ta NO MO 0 15 Tis NO MO 1 TI NO MO II T2 NO MO T3a NO MO III T3b NO MO T4a NO MO IV T4b NO MO Qq T Nl-3 MO

Estágio 294

Tumor primário (T) 294 Qq T Qq N Ml 295

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110> AGENSYS, INC.

FARIS, MARY HUBERT, RENE RAITANO, ARTHUR AFAR, DANIEL LEVIN, ELANA CHALLITA-EID, PIA JAKOBOVITZ, AYA

DESIGNADA DE CANCRO

<120> ÁCIDO NUCLEICO E PROTEÍNA CORRESPONDENTE, POR 158P1D7, ÚTEIS PARA O TRATAMENTO E DETECÇÃO DA BEXIGA E DE OUTROS CANCROS <130> 511582005061 <140> EP 071016935 <141> 2001-08-22 <150> EP 019643451 <151> 2001-08-22 <150> PCT/US 01/26276 <151> 2001-08-22 <150> 60/227,098 <151> 2000-08-22 <160> 750 296 <1 7 0> Patentln Versão 2.1 <210> 1 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptídico <400> 1 vai lie Glu Prg Ser Ala i*he Ser tys 1 $ <210> 2 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptídico <40 0> 2 Asn Leu elu Tyr Leu Tyr Leu Slu Tyr 1 " 5 <210> 3 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> 297 297 peptidico <223> Descrição da sequência artificial: motivo <400> 3

Leu Vai Glu Gin Thr Lvs Asn Glu Tyr 1 $ ' '

<210> 4 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> peptidico <223> Descrição da sequência artificial: motivo <400> 4

His Ala Glu Pr© fi&p Tyr Leu Glu Vai X S

<210> 5 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> peptidico <223> Descrição da sequência artificial: motivo <400> 5

Gly Ser A$p Ala Lys His Leu Gin Arg X S

<210> 6 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial 298 <220> peptidico <223> Descrição da sequência artificial: motivo <400> 6 cys τNr ser Pr© <3ly His Léu Asp Lys 1 5

<210> 7 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <2 2 0> peptidico <223> Descrição da sequência artificial: motivo <400> 7 ser xle cys Pr© Tbr Pr© Pro vai Tyr 1 5

<210> 8 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> peptidico <223> Descrição da sequência artificial: motivo <400> 8

As© II€ Qlu Sèr Leu Ser Asp Leu Arg

1 S <210> 9 <211> 9 299

<212> PRT <213> Sequência artificial <220> peptidico <223> Descrição da sequência artificial: motivo <400> 9

Lm Nêt <Slu Thr teu M«t Tyr ser Arg 1 5

<210> 10 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> peptidico <223> Descrição da sequência artificial: motivo <400> 10

Glu s«r i.eu Pro Fra Asn. Ue Fbe Arg 1 5

<210> 11 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> peptidico <223> Descrição da sequência artificial: motivo <400> 11 A5D Asn Ser Vai His Leu sln· Tyr 1 5 12 300 <210> <211> <212> <213> <220> <223> <400> <210> <211> <212> <213> <22 0> <223> <40 0> 9 PRT Sequência artificial

Descrição da sequência artificial: motivo 12 Leu Thr Asp Ala. vai Pre Leu Ser Vai1 5 13 9 PRT Sequência artificial

Descrição da sequência artificial: motivo peptidico peptidico <210> <211> <212> <213> <220> <223> 13 Ser Leu Pro pro .Asm He Phe Ar§ PheI S 14 9 PRT Sequência artificial

Descrição da sequência artificial: motivo peptidico <400> 14 301 lie Ala Asp ile Glu ile Gly Ala Ptià 1 5

<210> 15 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> peptidico <223> Descrição da sequência artificial: motivo <400> 15

Vai Ser Pro fêet Vai His Vai Tyr 1 5

<210> 16 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> peptidico <223> Descrição da sequência artificial: motivo <400> 16

Asp lie Glu lie Gly Ala Phe Asei Gly 1 5

<210> 17 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> peptidico <223> Descrição da sequência artificial: motivo 302 <400> 17

Gly teu Glu Asn Leu Gl« Phe teu Gin 1 $

<210> 18 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> peptidico <223> Descrição da sequência artificial: motivo <400> 18

Asn Cys Glu Ala Lys Sly lie Lys Mét 1 5

<210> 19 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> peptidico <223> Descrição da sequência artificial: motivo <40 0> 19

Liga vai slu fyr Plm Thr teu Glu Net I 5

<210> 20 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> 303 <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptídico <400> 20

Vai Lm Glti Glu Gly Ser Phê Mút Asn Ϊ $ <21o> 21

<211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptídico <400> 21

Thr teu Glu Met Leu His teu Gly Asn

1 S

<210> 22 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptídico <400> 22

Phm Gin Asp Ala Ser ser Lm lyr Arg 1 S

<210> 23 <211> 9 <212> PRT 304 <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial : motivo <400> 23 Vai 1 Ser G1u ilfi Ser Vai Pr© 5 Pr© Ser <210> 24 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial : motivo <400> 24 ASO 1 ser €»1u lie Ley Cys Pr© S Gly léu <210> 25 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Descrição da sequência artificial : motivo <40 0> 25 Phe 1 Leu Gl y leu His Asn léu % S lu Tyr <210> 26 peptídico peptídico peptídico 305

<211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptídico <400> 26

Ile Asrt Ãsp ser Arq Piet Ser Thr Lys 1 5

<210> 27 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptídico <400> 27

Gin Ala Asp Asn Astt phe lie Thr vai 1 S

<210> 28 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptídico <400> 28 306

Ile ttn Asp Asp teu Ãsp teu Leu Thr 1 $

<210> 29 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> peptidico peptidico <223> Descrição da sequência artificial: motivo <400> 29

Ser Cys Asp Leu vai Gly L&u Gin Gin I ' 5

<210> 30 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Descrição da sequência artificial: motivo <400> 30

Asn Cys Asp Lty Leu Gin Leu Lys Thr 1 S

<210> 31 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptidico 307 <400> 31 xis Tfnr clu Tyr leu Arq iys Ase lie 1 5 <210> 32 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptídico <40 0> 32 Trp Leu Gl u ASR &et Prô Fro Gln Ser I 5 <210> 33 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptídico <400> 33 Ala lie êl u Ser Leu Pro Fro Asm lie 1 5 <210> 34 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> 308 <220> 308 peptidico <223> Descrição da sequência artificial: motivo <400> 34

Asn teu Glu Phe leu Glr> Ala Asp A$n

'" i ........ S

<210> 35 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> peptidico <223> Descrição da sequência artificial: motivo <400> 35

Leu ser Asp Leu: Arg Pro pto pro Gin 1 5

<210> 36 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> peptidico <223> Descrição da sequência artificial: motivo <400> 36

Lys Ser Asp teu Vali <3lu Tyr Pbè Tbr 1 5

<210> 37 <211> 9 <212> PRT 309 <213> Sequência artificial <220> peptidico <223> Descrição da sequência artificial: motivo <400> 37 11¾ ser Vai Pro Pro Ser Arg pro Phe 1 5

<210> 38 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> peptidico <223> Descrição da sequência artificial: motivo <400> 38

Gty ser ile Leu ser Arg Lm Lys Lys 1 s

<210> 39 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> peptidico <223> Descrição da sequência artificial: motivo <400> 39

vai Tht Aso A$p lie cys Thr S«r 1 S <210> 40 310 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequênci <400> 40 Tihr 1 Lys Ala Fro <210> 41 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequênci <400> 41 Lys ' 1 Asn Glu Tyr <210> 42 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial

Ptie Gltí Leu S

Lys Ala peptídico peptidico <220> peptídico <223> Descrição da sequência artificial: motivo <400> 42 43 311ser Thr Glu Fite Leu Ser Phe <31 n Àsp 1 5 <210> <211> <212> <213> <220> <223> <40 0> <210> <211> <212> <213> <220> <2 23> <400> 9 PRT Sequência artificial

Descrição da sequência artificial: motivo 43 Arg Pro Pro Prõ Gin Aso Pr© Arg Lys I S 44 9 PRT Sequência artificial

Descrição da sequência artificial: motivo peptidico peptidico <210> <211> <212> <213> <22 0> 44val Cys Ãsn Ser Pro Pro Phe Phe Lys 1 S 45 9 PRT Sequência artificial <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptidico 312 <400> 45

Tyr Leu Mn GTy Asn His leu Thr Lys l 5

<210> 46 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptidico <400> 46 sty Hl s Asm Lm <*lu Tyr Leu Tyr í 5

<210> 47 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptidico <400> 47 Ãsp Net Glu Alá. Hls Tyr Pro y Ala 1 5

<210> 48 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> 313

<223> Descrição da sequência artificial: motivo peptidico <400> 48 Árq 1 Xle Glu Vai i Leu Glu Glu Gly Ser 5 <210> 49 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptidico <40 0> 49 Glu I Glu Slu i Gl u Arg Asn Gltí tys 5 <210> 50 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptidico <40 0> 50 Tyr 1 Leu Glw Vai teu Glu Gin Gin Thr •S <210> 51 <211> 10 <212> PRT 314 <213> Sequência artificial <220> peptidico <223> Descrição da sequência artificial: motivo <400> 51

Vai Ser 61 ii IIe ser vai Pro Pro ser Arg X 5 .1.0

<210> 52 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> peptidico <223> Descrição da sequência artificial: motivo <400> 52

Thr Thr <ã1u Arg Pro Ser Ala Ser teu Tyr 1 ' 5 10

<210> 53 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> peptidico <223> Descrição da sequência artificial: motivo <400> 53 lie teu ksp leu Gin teu clu Asp Asn lys 1 S 10 <210> 54 315

<211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> peptidico <223> Descrição da sequência artificial: motivo <400> 54 G'1:fs L-êU Sltt Prô Asp Vef Glu Ala Hiâ Tyr I 5 10

<210> 55 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> peptidico <223> Descrição da sequência artificial: motivo <400> 55

Vai lia Glu Pro ser Ala Phs ser tys Leu 1 5 10

<210> 56 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> peptidico <223> Descrição da sequência artificial: motivo <400> 56 316

Ala ile Gl u ser teu Pr o Pro asa lie Phe 1 5 10

<210> 57 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> peptidico <223> Descrição da sequência artificial: motivo <400> 57

His Ala Glu Pre Asp Tyr Leu Glu vai Leu 1 5 10

<210> 58 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> peptidico <223> Descrição da sequência artificial: motivo <400> 58

Ser teu Glu ile Leu lvs sTu Asp Thr Phe 1 S 10

<210> 59 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> peptidico <223> Descrição da sequência artificial: motivo 317 <400> 59

Arg lie Glll Vãl Léu Glu 6ly Ser Ph« 1 S 10

<210> 60 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> peptidico <223> Descrição da sequência artificial: motivo <400> 60

Leu Vai Glu g!n Thr lys Asn Glu Tyf Phe 15 10

<210> 61 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> peptidico <223> Descrição da sequência artificial: motivo <400> 61

Glu :Ssr Léu Pr© Pr® Asn lie Fhe Arg Phe I 5 10

<210> 62 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial 318 <220> peptidico <223> Descrição da sequência artificial: motivo <400> 62

Cvs Thr Ser f»ro Glv hís Leu A$p tys Lys I 5 10

<210> 63 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> peptidico <223> Descrição da sequência artificial: motivo <400> 63

Gly teu Glw Asr Leu Gly Phe teu GÍn Ala 1 5 10

<210> 64 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> peptidico <223> Descrição da sequência artificial: motivo <400> 64 vai Leu Gly Glu Gly Ser Phe Met Asn teu - 1 5 10

<210> 65 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> 319 <220> 319 peptidico <223> Descrição da sequência artificial: motivo <400> 65

Lys ser Asp Leu Vai Glu Tyr Phe Thr Leu 1 5 10

<210> 66 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> peptidico <223> Descrição da sequência artificial: motivo < 4 0 0 > 66

Asn Pro fSet Pro Lys Leu Lvs Vai Leu Tyr 1 $ " 10

<210> 67 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> peptidico <223> Descrição da sequência artificial: motivo <400> 67

Asp teu Asp Leu Leu Thr Gin lie Asp Leu 1 $ 10 <210> 68 320

<211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptídico <400> 68 lie teu Asp a.$p teu Asp fey teu Thr Gin 1 S 10 <210> 69 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptídico <40 0> 69 Sçr Thr Glu Phe têO Ser Phe Gin ASp Ala 1 ' S 10 <210> 70 <211> 10 <212> PRT <213> <22 0> Sequência artificial <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptídico <400> 70 321 lie Thr €l« Tyr Leu A.rg tys As» lie Ala l ' $ 10

<210> 71 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> peptidico peptidico <223> Descrição da sequência artificial: motivo <400> 71

Vai Ser Pro Met Vai ais Vai Tyr Arg 1 S 10

<210> 72 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: motivo <400> 72

Gin Leu Glu Asp Asn lys Trp -Ala Cys Asn 1 5 10

<210> 73 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptidico 322 <400> 73 Léo : 1 àer ASp Leu Arg 5 pro Pro Pro Gló Α5Π 10 <210> 74 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptidico <400> 74 Glu I s«r 1U cys Pr© Thr pro Pro 5 Vai Tyr 10 <210> 75 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptidico <400> 75 Ser 1 Ser Leu Tyr Ar| 5 1 Asn ile teu Glu Lys 10 <210> 76 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial 323 <220> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptidico <400> 76 Α.$η 1 Ser Sltí 11« L«í 5 Cys PfD 6ly teu Vai 10 <210> 77 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptidico <40 0> 77 teu Thr asp Ala vai Pr o Lee Ser Vai Ley 1 S 10 <210> 78 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptidico <40 0> 78 HÍS .1 Glu Asp Pro Ser S s Gly ser Leu I Hls Leu IO <210> 79 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> 324 <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptidico <400> 79

Tfir Thr Asn Thr Ala Asp Thr lie Leu Arg 1. 5 10

<210> 80 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptidico <400> 80

Thr VaT He Glu pro Ser Ala Phe Ser Lys 1. S 10

<210> 81 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptidico <400> 81

Gly Ala Phe Asn 6ly Leu <5ly Léu Leu Lys 1 S 113 <210> 82 <211> 10 325 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptidico <400> 82 Gl U 1 Thr leu Met TVf ! * ser Arg Pro Arg Lys ; ίο <210> 83 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptidico <40 0> 83 L£U 1 Cys Thr Ser Pro Cly ttís Leu S Asp Lys 10 <210> 84 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptidico <400> 84

Lys Ala A$n teu His Ala Glu Pro Asp Tyr 1 5 10 326 <210> 85 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: motivo <400> 85 Leu 1 Vai Gly Leu Oln 5 Gin Trp ile Glu Lys 10 <210> 86 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Descrição da sequência artificial: motivo <40 0> 86 Thr I Thr Ser ile Leu tys Leu Pre s Thr Lys 10 <210> 87 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: motivo <400> 87 peptídico peptídico peptídico 327

His ΧΊ« phe ser ely vsl Pr© teu Tíir Lys X 5 10

<210> 88 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> peptidico peptidico <223> Descrição da sequência artificial: motivo <400> 88

Ile Ala Asp Xle slu Xle Gly Ala Phe Asn I S 10

<210> 89 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: motivo <400> 89

Gin Leu Glv Ile Tíir Glu Tyr Leu Arg Lys I 5 10

<210> 90 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptidico 328 <400> 90 328Vai vai Cys Asn Ser Pro Pto $

Pht phe tys 10

<210> 91 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptídico <400> 91

Leu leu Glu sis Glu Asn His Set pro Lau 1

S 10

<210> 92 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptídico <400> 92

Leu Glu Glu Glu Glu Glu Arg Asr Glu Lys

<210> 93 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> 329 <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptídico <400> 93

Asa lie Glu í.le Gly Ala. Phe As ή <*1y Leu 1 § 10

<210> 94 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptidico <400> 94

Tyr Leu Glu Tyr ASft Ala lie Lys Glu llè 1 5 ' 10

<210> 95 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptidico <400> 95

Asm Leu Glu Tyr Leu Tyr Leu Glu Tyr Asn 1 5 10

<210> 96 <211> 10 <212> PRT 330 <213> Sequência artificial <220> peptidico <223> Descrição da sequência artificial: motivo <400> 9 6

Aso Cys Gl u gUí Lvs Asp Gly Thr Met teu 1 ' S 10

<210> 97 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> peptidico <223> Descrição da sequência artificial: motivo <400> 97

Asp Leu Olu Asp Asn Pro Trp Asp Cys Ser 1 S 10

<210> 98 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> peptidico <223> Descrição da sequência artificial: motivo <400> 98

Leu Vai; Glu Tyr Ph« Thr Leu 6la mt Leu 1 $ 10 <210> 99 331 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptidico <400> 99 Thr 1 Lei* Slu «et 5 i hís Leu ely Asm Asm XO <210> 100 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptidico <40 0> 100 Asm i l Leu Sty Phe leu S Gire Ala Asp· asre Asm 10 <210> 101 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptidico <40 0> 101 332

Tyr Lt« Asn Asn Asn te« teu âlr» Vsl ' 1. $

<210> 102 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptídico <400> 102 tsu Leu |1 e Mst. Phe lie Thr He vsl 1 s

<210> 103 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptídico <40 0> 103

Asn Leu Gin Thr Ley Pro Tyr vai

I S

<210> 104 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptídico <400> 333 <400> 333 <210> <211> <212> <213> <220> <223> <400> <210> <211> <212> <213> <22 0> <223> <40 0> <210> <211> <212> <213> 104

Ile fêet Pite lie Thr Ile Vai Phe Cys 1 5 105 9

PRT

Sequência artificial

Descrição da sequência artificial: motivo 105

Phe leu <3In Ala Asp Asm Asn Phe Ile

1 S 106 9

PRT

Sequência artificial

Descrição da sequência artificial: motivo 106

Lys Leu fyr Leu Asn çly Asn hfis Leu •1 5 107 9

PRT

Sequência artificial peptidico peptidico 334

<220> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptidico <400> 107 Tyr Leu Tyr uau <5lu Tyr Asn Ala lie 1 $ <210> 108 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptidico <400> 108 1.1 e I Leu Gly Leu Leu ile Met Phe ile 5 <210> 109 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptidico <400> 109 iys I Léu Tfp Ilt His Lêy Phe Tyr Ser 5 <210> 110 <211> 9 <212> PRT 335 <213> Sequência artificial <220> peptidico <223> Descrição da sequência artificial: motivo <400> 110 <S]y Mst Phe Leu dy Leu Mis Asn Leu 1 5

<210> 111 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> peptidico <223> Descrição da sequência artificial: motivo <400> 111

Tyr Leu Met vai Thr Thr Pro Ala Thr ' 1 ....... s

<210> 112 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> peptidico <223> Descrição da sequência artificial: motivo <400> 112 val Leu Tyr Leu Asn Asn Asn Leu Leu I ' $ <210> 113 336 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptidico <400> 113 smr 1 mt Pr® Tfir <Sln Thr ser lyr teu 5 <210> 114 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptidico <40 0> 114 teu 1 Leu Asrs Asrt Gly Leu Thr teu 5 <210> 115 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptidico <400> 115 337

Yrp ile Hls Lea Pite Tyr Ser ser Lm 1 5 '

<210> 116 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptídico <400> 116 L.ys Lm Pró Thr tys Ala Pr» Gly Lm 1 '5

<210> 117 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptídico <400> 117

Gly leu Léu lie Nit Ptie ile Thr lie 1 S

<210> 118 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptídico 338 <400> 118 Leu l Gin teu Gl <210> 119 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência art ificial <22 0> <223> Descrição da sequênc <40 0> 119 Asn 1 tÈL H1S Ai <210> 120 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência art ificial <220> <223> Descrição da sequênc <400> 120

Tyr teu

Leu Met Tyr Ser Arg ?ro I s

<210> 121 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial 339 <220> peptidico <223> Descrição da sequência artificial: motivo <400> 121

Asn lie teu A$p Mp Leu Asp teu teu 1 $

<210> 122 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> peptidico <223> Descrição da sequência artificial: motivo <40 0> 122 tys teu Met Glu Tbr teu Net Tyr Ser I 5

<210> 123 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> peptidico <223> Descrição da sequência artificial: motivo <40 0> 123

Gly Leu Gin Gin Trp Ile Gin tys teu

i S

<210> 124 <211> 9 <212> PRT 340 <213> Sequência artificial <220> peptidico <223> Descrição da sequência artificial: motivo <400> 124

Lys Leu asm ΑΓ9 Leu Lys vai Leu Xle 1 5

<210> 125 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> peptidico <223> Descrição da sequência artificial: motivo <40 0> 125

Asrv Ile Phe Arg Phe Vai Pro Lêu Thr 1 5

<210> 126 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> peptidico <223> Descrição da sequência artificial: motivo <40 0> 126

Asp Leu Leu Gin Leu Lys Thr Trp teu 1 $ <210> 127 341

<211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptídico <400> 127 LV.S Vã! Leu Tyr Leu Aso Aso ASí* Leu 1 5

<210> 128 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptidico <400> 128

Gin Glr* teu sly ile Ttir slu Tyr Leu 1 S

<210> 129 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptidico <400> 129 130 342 &Ίη ueu His lis fisn His fián ser teu 1 5 <210> <211 > <212> <213> <220> <223> <4 Ο 0> 9 PRT Sequência artificial

Descrição da sequência artificial: motivo peptidico <210> <211> <212> <213> <22 0> <223> <40 0> 1306lrs Leu Ser teu Leu Aso Asn 6:1 y teu 1 S 131 9 PRT Sequência artificial

Descrição da sequência artificial: motivo peptidico 131 IIe Leu Asp Asp Leu Ã$p Leu Leu Thr 1 $ <210> <211> <212> <213> <22 0> 132 9

PRT

Sequência artificial <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptidico 343 <400> 132

Ser Leu Lee Ase Ase s'1y Lee Thr NSet: 1 5

<210> 133 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> peptidico <223> Descrição da sequência artificial: motivo <400> 133

Leu Lee 6ln vai Lee Pro Pro His lie 1 5

<210> 134 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> peptidico <223> Descrição da sequência artificial: motivo <40 0> 134

Met Lee Hi s Lee Sly Aso Ase Arq llé 1 5

<210> 135 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> 344 <223> <400>

Descrição da sequência artificial: motivo peptidico <210> <211> <212> <213> <22 0> <223> <40 0> 135vai teu lie Leu Asa Asp Asa Ala Xle 1 5 136 9 PRT Sequência artificial

Descrição da sequência artificial: motivo peptidico 136

I

Leu Ser Pm Ser Gly teu Leu 1'le S <210> <211> <212> <213> <22 0> <223> <40 0> 137 9 PRT Sequência artificial

Descrição da sequência artificial: motivo peptidico <210> <211> 137Tyr teu Árg tys Asa Ile Ala £'ln teu l S 138 9

<212> PRT 345 <213> Sequência artificial <220> peptidico <223> Descrição da sequência artificial: motivo <400> 138

Xle Leu Pr© sly Thr Plie Asr* Pro wet l $

<210> 139 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> peptidico <223> Descrição da sequência artificial: motivo <40 0> 139

ôlfi Leu Pro cHy Pro Tyr Cys Pro lie 1 S

<210> 140 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> peptidico <223> Descrição da sequência artificial: motivo <400> 140 L.ys Leu lie teu Ala Gly Asn lie lie 1 s <210> 141 9 346 <211> <212> <213> <220> <223> <400> <210> <211> <212> <213> <22 0> <223> <40 0> PRT Sequência artificial

Descrição da sequência artificial: motivo 141 Tyr lie Thr Lys Pr© Ser Thr Gin Leu1 S 142 9 PRT Sequência artificial

Descrição da sequência artificial: motivo 142

Leu Gin Ala Asp Asn Asn ;Fhe Xle Thr I ' S peptidico peptidico <210> <211> <212> <213> <220> <223> 143 9 PRT Sequência artificial

Descrição da sequência artificial: motivo peptidico <400> 143 347 6ln Leu Glu Asp Asn Lys Trp Ala Cys 1 5 <210> 144 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptidico <40 0> 144 Leu 1 «et Vai Thr Thr pro Ala. Thr Thr s <210> 145 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptidico <400> 145 ASH X lie L€d Glu Lys Glu Arg GÍu Leu <210> 146 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptidico 348 <400> 146

<210> 147 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptídico <40 0> 147 phe vai Pr© Leu Thr Nls Leu Asp Lee

X 5

<210> 148 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptídico <400> 148

I vai Leu lie Leu <3íy Leu Leu lie <210> 149 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial 5 <220> 349 <223> Descrição da sequência artificial: motivo <400> 149 Arg Net Ser Thr tys Thr Thr Ser Xle1 S <210> 150 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Descrição da sequência artificial: motivo <40 0> 150 Lys 1 <210> 151 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência <22 0> <223> Descrição da sequência artificial: motivo <40 0> 151 Gly Leu Leu lie Met Plie Tle Thr lie vai 1 5 10 <210> 152 <211> 10

Ala Pt© Gly Le« ile Pro Tyr lie S artificial peptidico peptidico peptidico

<212> PRT 350 <213> Sequência artificial <220> peptidico <223> Descrição da sequência artificial: motivo <400> 152

Leu ily Leu Mis A$n Leu Slu Tyr Leu 1 .5 lô

<210> 153 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> peptidico <223> Descrição da sequência artificial: motivo <40 0> 153 lie mi xle Thr ile vai Phe Cys Ala I. S 10

<210> 154 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> peptidico <223> Descrição da sequência artificial: motivo <40 0> 154

Ser Leu Thr Asp Ala Vai PrO Léu Ser Vai l 5 10 <210> 155 <211> 10 351

<212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptidico <400> 155

Tyr teu Asn Sly Asn His teu Tht Lys teu 1 S iO

<210> 156 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptidico <400> 156

Vai teu Pr© Pr© His lie Phe ser ely Vai 1 S ' 10

<210> 157 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptidico <400> 157

Ser Lau Leu Asn Asn Gly Leu Thr Net teu 1 S 10 352

<210> 158 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptidico <400> 158 Gãly leu His Asn teu Glu Tyr teu Tyr teu 1 5 10 <210> 159 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptidico <400> 159 lie Leu Asn Asp Asn Ala lie õlo Ser Leu 1 S 10 <210> 160 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptidico <400> 160 353

Phs Met Asn teu Thr Arcj Leu Si n tys Leu i. s xo

<210> 161 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptídico <400> 161

Ser Leu Pm ptú AS-n lie Phe Arg Phe Vai 1 5 m

<210> 162 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptídico <40 0> 162 lys teu ser tys Ol y Met Phê Leu 6ly teu ' 1 S 10

<210> 163 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptídico 354 <400> 163 Tyr 1 LtíU Met Vai Thr S 'Thr Pro Ala Thr Thr TO <210> 164 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptidico <40 0> 164 as η 1 Leu Thr Arg Leu 5 Gin tys i.eu Tyr Leu 10 <210> 165 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptidico <400> 165 um 1 Ile Leu Gly Leu •5 Leu Ile Met SPhe Ile 10 <210> 16 6 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> 355 <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptidico <400> 16 6 f»he Leu Ser phe Gin Asp Ala ser Ser Leu I S 10 <210> 167 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptidico <40 0> 167 Leu Gin Leu Clts Asp asrt tys trp Ala cys 1 10 <210> 168 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptidico <400> 168 Leu Gin Ala Asp Asn 5 Asrs Piie lie Thr vai I 10 <210> 169 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> 356 <220> 356 peptidico <223> Descrição da sequência artificial: motivo <400> 169

Tyr Leu As« Asn Àsrt Leu <5ln Vai Leu 1 $ 10

<210> 170 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> peptidico <223> Descrição da sequência artificial: motivo <400> 170 lie Leu Ala 6ly A$fl Ilê :il« Mis ser Leu 1 $ . 10

<210> 171 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> peptidico <223> Descrição da sequência artificial: motivo <400> 171

Lys Leu Tyr Leu Asn £ly Aso His teu Thr 1 S 10 <210> 172 <211> 10 357

<212> PRT <213> Sequência artificial <220> peptidico <223> Descrição da sequência artificial: motivo <400> 172

Phe Leu Gin Ala Asp Ãsrc Asn Phe tle Thr 1 5 10

<210> 173 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> peptidico <223> Descrição da sequência artificial: motivo <40 0> 173

Lys Leu Asn Arg Leu Lys vai Leu lie Leu 1 5 10

<210> 174 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> peptidico <223> Descrição da sequência artificial: motivo <400> 174

Ile Leu 6ly Leu Leu Ile Net Phe lie Thr 1 $ 10 358

<210> 175 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> peptidico <223> Descrição da sequência artificial: motivo <400> 175 wtet Leu hí s ihr aso Asp Phe Ser Gly Leu 1 S 10

<210> 176 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> peptidico <223> Descrição da sequência artificial: motivo <40 0> 176 léu ile «et Pise il® Thr ile vai Cys 1 S 10

<210> 177 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> peptidico <223> Descrição da sequência artificial: motivo <400> 177 359

Thr Lm mt Tyr Ser Arg Pfo Arg Lys vai 1 '5 10

<210> 178 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> peptidico peptidico <223> Descrição da sequência artificial: motivo <400> 178

Tlê Gin iys t«u ser Lvs Asn Thr vai S 10

Trp

I artificial <210> 179 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência <220> <223> Descrição da sequência artificial: motivo <400> 179

Asri teu teu Gin vai teu Pro Pr© Mis íle 1 $ 10

<210> 180 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptidico 360 <400> 180 Fhe Gin Leu ser Leu leu Asrs Asn ely Leu 1 ' S 10 <210> 181 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptídico <40 0> 181 Leu Met Tyr Ser Arq Pro Arg Lys Vai Leu : I $ 10 <210> 182 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptídico <400> 182 Lys Gin Leu His lie As« His Asn Ser Leu 1 5 IO <210> 183 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> 361 <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptídico <400> 183 tys vai teu Tyr Leu asa Asn Asn leu teu 1 S 10 <210> 184 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptídico <40 0> 184 6ly Lm Thr asa Ala lie Ser 11 e his Leu 1 S 10 <210> 185 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptídico <40 0> 185 Vai Leu lllu Slu Gly Ser Phe. Me t Asn Leu 1 S 10 <210> 186 <211> 10

<212> PRT 362 <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptidico <400> 186 1. Leu lie Asji Cys Glu Ala Lys 5 6ly líe 10 <210> 187 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptidico <400> 187 Thr I lie Leu Arq Ser Lsu Thr aso Ala Vai 5' ' IO <210> 188 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptidico <40 0> 188 i val Cys Ala Ala Gly Il« 5 'val vai 10 <210> 189 363 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptídico <400> 189 Asr lie teu Asp Asp teu Asp Leu teu Tàr* 1 5 ' 10 <210> 190 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptidico <400> 190 Trp ile His teu phe Tyr ser .ser teu Leu l 5 10 <210> 191 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptidico <40 0> 191 Lys Vai Asn teu Lys Thr Asn Si o Thr ' 1 ' 5 10 364

<210> 192 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptidico <400> 192 Lys Vai Léu Xis Leu Asn Ãsp· Asr» Ala Xlé 1 | ' 10 <210> 193 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptidico <400> 193 Lys Vai teu Ser Pro Ser sly Leu Leu xle " 1 S 10 <210> 194 <211> 10 <212> PRT <213> <220> Sequência artificial <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptidico <400> 194 365 ser vai Pr® Pr® Ser Arg Pro Pfce Gin teu 1 S 10 <210> 195 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptídico <40 0> 195 Ser Lee Hís Leu Alia Ala Thr Ser Ser i:1e 1 5 10 <210> 196 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptídico <40 0> 196 sly Leu Gly Lee Leu Lys Gin Leu His Ile 1 5 10 <210> 197 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptídico 366 <4 Ο 0> 197

Leu G'ln Cl π Leu 61 y ile Tbr Clu Tyr Leu 1 5 10

<210> 198 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> peptidico <223> Descrição da sequência artificial: motivo <400> 198

Xle Leu Lys Glu Asp TLtr Phe His Gly Leu :i S 10

<210> 199 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> peptidico <223> Descrição da sequência artificial: motivo <400> 199

Cys lie ser leu His Ser Glsi Thr f>ro Vai 1 5 10

<210> 200 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> 367 <220> 367 peptidico <223> Descrição da sequência artificial: motivo <400> 200

Leu mt. vai Thr Thr pro Ala Thr Thr Thr 1 S 10

<210> 201 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> peptidico <223> Descrição da sequência artificial: motivo <400> 201 ser teu Tyr Ara Aso lie Leu Glu tys 1 5

<210> 202 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> peptidico <223> Descrição da sequência artificial: motivo <400> 202

Tyr Leu asrt Gly Aso His teu ihr tys 1 %

<210> 203 <211> 9 <212> PRT 368 <213> Sequência artificial <220> peptidico <223> Descrição da sequência artificial: motivo <400> 203

Phe Met Asn l«ii Thr Ar<* t€u gIr tys

1 S

<210> 204 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> peptidico <223> Descrição da sequência artificial: motivo <400> 204

Gly Lei* Mis Mn Leu G'lu Tyr Leu Tyr 1 5

<210> 205 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> peptidico <223> Descrição da sequência artificial: motivo <400> 205

Thr Leu Tyr ser alq Pro Arg tys 1 5 369 <210> 206 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial : motivo peptidico <400> 206 Thr I Nêt Lfâu lie fi tsíi Cys Gl u S Ãla Lys <210> 207 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Descrição da sequência artificial : motivo peptidico <40 0> 207 Gly 1 Leu L«y lie t lis Cys Glrs s Gl u Arg <210> 208 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Descrição da sequência artificial : motivo peptidico <400> 208 370

Deu Het Glu Thr teu Net Tyr ser Arq 1 5

<210> 209 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptidico <400> 209

Gly teu Leu lie fêet Phe lie Thr Ile I ' 5

<210> 210 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptidico <400> 210

Gly «et Phe· lêu sly L<eu hís as π Leu

I S

<210> 211 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptidico 371 <400> 211 ser Leu pto Fro asη X1 e Phe Aro Phe I 5

<210> 212 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptidico <400> 212

Gin Leu Sly lie Thr Glu lyr Leu Arg

1 S

<210> 213 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptidico <400> 213

Gly lie vai vai Leu vai Leu Mis Arg I S

<210> 214 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> 372

<223> Descrição da sequência artificial: motivo peptidico <400> 214 va'l i Ilé Slu fro Ser Alá Phe 5 Ser Lys <210> 215 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptidico < 4 0 0 > 215 Lys Ji1 Lt« Tyr Leu Ãsn <»1y Asn 5 His Leu <210> 216 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptidico <40 0> 216 ely 1. Lêii Gl n Gin τ r p 11 e 61 rs S Lys Leu <210> 217 <211> 9 <212> PRT 373 <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptídico <400> 217

<210> 218 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptídico <400> 218 plis ϊ tii <s1y Leu «Is Asn Leu <sl« Tyr

'1 S

<210> 219 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptídico <400> 219 L&u Met tys Ser Ásp Leu vai slu ty <210> 220

I 374

<211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptídico <400> 220

Gin Gin Trp lie Gin tys Ley Ser tys 1 5

<210> 221 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptídico <400> 221

Tt*r ser Pm Gly His Leu Asp Lys S

Cys 1 artificial <210> 222 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência <220> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptídico <400> 222 I 375teu ?yr teu Asn Asn Asa teu leu 5 <210> <211> <212> <213> <22 0> <223> <40 0> 223 9 PRT Sequência artificial

Descrição da sequência artificial: motivo peptidico <210> <211> <212> <213> <220> <223> <40 0> 223Tyr tey Tyr Lm <Slu Tyr Asa Ala lie ' 1 ' $ 224 9 PRT Sequência artificial

Descrição da sequência artificial: motivo peptidico <210> <211> <212> <213> <22 0> 224tys Leu Trp lie His Leu Phe Tyr Ser 1 S 225 9 PRT Sequência artificial <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptidico 376 <400> 225

Lys Leu Xle teu 1

Ale 61y Asn Xle Xlô 5 <210> 226 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Descrição da sequêncii <40 0> 226 ser Thf ív< Thr <210> 1 227 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Descrição da sequênci. <40 0> 227 Hl 5 1 Leu; Fhe Tyr <210> 228 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial artificial: motivo peptídico

Thr ser lie Leu Lys 5 artificial: motivo peptídico

Ser Ser Leu Leu Ala S 377

<220> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptidico <400> 228 Vai 1 Leu His An? Arq Arq Arg lyr tys 1 <210> 229 <211 > 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptidico <4 0 0> 229 Âiri Léu Thr Arg teu Lys Leu Tyr S <210> 230 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptidico <400> 230 lít Leu Gly Leu teu lie Met Phe lie 1 $ <210> 231 <211> 9 <212> PRT 378 <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptidico <400> 231 Vai 1 Lee Ser Pro Ser Gly Leu S Lee lie <210> 232 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptidico <40 0> 232 Lys l Leu Pro Thr Lys Ala Pro Qly teu 5 <210> 233 <211 > 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptidico <4 0 0> 233 S1 y I Ptet Leu Hl s Leu Gly A$p s Aso Arg <210> 234 379

<211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> peptidico <223> Descrição da sequência artificial: motivo <400> 234

Lys Leu Asn Arq isy Ly$ va1 teu lie 1 5

<210> 235 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> peptidico <223> Descrição da sequência artificial: motivo <400> 235 vai Ser Met vai his vai Tyr 1 s

<210> 236 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> peptidico <223> Descrição da sequência artificial: motivo <400> 236 380 ilt mt Ptie l1« Thr xl« vai Ptie Cys 1 5

<210> 237 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> peptidico peptidico <223> Descrição da sequência artificial: motivo <400> 237

S«r Het Tyr <51 y Mis Lys Ttar Tbr Mis 1 ' S

<210> 238 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Descrição da sequência artificial: motivo <400> 238

Ile vai vai Leu vai Lfi.o ni& Arg Arq 1 S

<210> 239 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptidico 381 <400> 239

l.eu Leu lie :Met Phe li e Thr Xlê Vai I S

<210> 240 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptídico <400> 240

Gin Leu Pro sly Pr o xyr Cys Pro II e 1 5

<210> 241 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptídico <400> 241

Leu ile Leu 6'ly teu Leu lie Met phe I s

<210> 242 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> 382 <220> 382 peptidico <223> Descrição da sequência artificial: motivo <400> 242

Fro teu Thr ely ser Asn Mst Lys Tyr

1 S

<210> 243 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> peptidico <223> Descrição da sequência artificial: motivo <400> 243

Sly Thr Fh« Asn f*ro Met Fro Lys Leu I 5

<210> 244 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> peptidico <223> Descrição da sequência artificial: motivo <400> 244

€ln Ley Lys Thr Trp Ltt* §1« Aso Mef 1 S

<210> 245 <211> 9 <212> PRT 383 <213> <220> <223> <400>

Sequência artificial

Descrição da sequência artificial: motivo peptidico <210> <211> <212> <213> <22 0> <223> <40 0> 245 Il« Leu Pro Gly Thr Phe Asπ Pro MetI S 246 9 PRT Sequência artificial

Descrição da sequência artificial: motivo peptidico 246 <210> <211> <212> <213> <22 0> <223> <40 0>

Leu ile Phe ll e Thr lie Vai Phe I $ 247 9

PRT

Sequência artificial

Descrição da sequência artificial: motivo 247

Vai i€M Il« Leu Gly Leu Leu ile Met 1 5 248 peptidico <210> 9 384 <211> <212> <213> <220> <223> <400> PRT Sequência artificial

Descrição da sequência artificial: motivo peptidico 248 1

Ser Ile teu Ser Arg Ley tys ty.s <210> <211> <212> <213> <220> <223> <400> 249 9 PRT Sequência artificial

Descrição da sequência artificial: motivo peptidico <210> <211> <212> <213> <220> <223> <400> 249 Vai pro tey Tiir iys Vai Asq teia tysI S 250 9 PRT Sequência artificial

Descrição da sequência artificial: motivo peptidico 250 385

Tyr Leu Arg lys Asn lle Ala Gin. teu 1 S " <210> 251 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptídico <400> 251 Tyr Leu Tyr teu Glu Tyr Asn Ala. ile Lys 1 S 10 <210> 252 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptídico <40 0> 252 uys i 1 Leu mt Glu Thr l«u mt Tyr ser Arg 5 10 <210> 253 <211> 10 <212> PRT <213> <220> Sequência artificial <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptídico 386 <400> 253

Vai teu Bis Arg Ari Ar§ Ar» Tyr tys Lys 1 5 10

<210> 254 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptidico <400> 254

Gin Leu Gly llê Thr Glu Tyr Arg tys 1. 5 10

<210> 255 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptidico <400> 255

His li® Phfè s«r Gly vai Pro ie« Thr Lys 1 S 10

<210> 256 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial 387 <220> peptídico <223> Descrição da sequência artificial: motivo <400> 256

Ilé teu Asp Leu 1

II rt teu Glu S

Asn lys 10

<210> 257 <211> 10 <212> PRT

<213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: <400> 257 GTy Vai Pro teu' Thr Lys vai así 1 $ <210> 258 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: <400> 258 His $ I vai ser pr& mt vai híí S <210> 259 <211> 10 <212> PRT peptidico 10 peptídico 10 388 <213> Sequência artificial <220> peptidico <223> Descrição da sequência artificial: motivo <400> 259 lie Met Phe Xl& Thr lie Vai Cvs Ala 1 5 XÔ

<210> 260 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> peptidico <223> Descrição da sequência artificial: motivo <400> 260

Thr vai 1¼ Pro Ser Ala. Phe Ser Lys 1 5 10

<210> 261 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> peptidico <223> Descrição da sequência artificial: motivo <400> 261

Lys Leu Asn Arg teu Lys Vai Leu lie Leu 1 S 10 <210> 262 389 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptidico <400> 262 Lys 1. Leu Ser Lys Gly wet Phe Leu Gly Leu 10 <210> 263 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptidico <400> 263 Gin 1 Thr Lys Asn 6lu Tyr Glu S Leu Lys. 10 <210> 264 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptidico <40 0> 264 390

Vai Leu ile teu sly teu leu lie mt Phe 1 $ 10

<210> 265 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptídico <400> 265

Vai Vâl Cvs Asn Ser Pm Pro Phe Ptie Lys 1 ' s 10

<210> 266 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptídico <400> 266

Leu isu Ile mt Phe xle Thr ile vai Phe 1 S 10

<210> 267 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptídico 391 <400> 267 vai ι Leu vai G1u Gin Thr Lys Asn $ G l ls Ty r iõ <210> 268 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptidico <40 0> 268 ser 1 Lau Lys Str Asp teu vai 5 Glu l y r 10 <210> 269 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptidico <400> 269 ely 1 Thr Pbe Asn Pro Met Pro Lys 5 Leu Lys 10 <210> 270 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> 392 <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptídico <400> 270

Gin Leu Gin Pro Asp Met Glu- Ala His Tyr 1 5 10

<210> 271 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptídico <400> 271

His Leu Gin. Tyr $er Tyr Gly His Lys 1 s 10

<210> 272 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptídico <400> 272

Leu M-et Lys ser Asp Leu Vai Glu.tyr Phe 1. 5 10

<210> 273 <211> 10 <212> PRT 393 <213> Sequência artificial <220> peptidico <223> Descrição da sequência artificial: motivo <400> 273

Cl y Leu Thr tóet Leu His Thr As π Asp fhe 1 $ 10

<210> 274 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> peptidico <223> Descrição da sequência artificial: motivo <400> 274 cly .Ala ph« Asn 6ly Leu cly Leu Ley Lvs 1 5 . 10

<210> 275 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> peptidico <223> Descrição da sequência artificial: motivo <400> 275

Lys Leu irp lie His Leu l%e Tyr ser Ser 1 5 10 <210> 276 394

<211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptídico <400> 276

Gly Leu Thr asa Ala llé Ser Ile Hi s Leu is io

<210> 277 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptidico <400> 277 val Leu Glu Glu Gly ser phe Het Asn Leu 1. 5 10

<210> 278 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptidico <400> 278 395

Gly Thr Met Leu lie Asn cys Gle Ala. tys 1 5 10 <210> 279 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptidico <40 0> 279 ciy 1 teu Leu l'1 e mt Phe Ile Thr S Ile Vai 10 <210> 280 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptidico <400> 280 cly 1 lie Vai vai teu vai teu hís 5 Arq Ârg 15 <210> 281 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptidico 396 <400> 281 Leu Vai cly Gin Gin Trp ile Gin tys 1 5 10 <210> 282 <211 > 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptidico <400> 282 Gly Leu Gl ϋ Asn ièti Glu Phe teu Gin Ala 1 s 10 <210> 283 <211 > 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptidico <40 0> 283 Gly Lêu Hls Asn Leu Glu Tyr teu Tvt Leu 1 S 10 <210> 284 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> 397 <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptídico <400> 284 aly Leu Gly teu Leu Lvs Slit teu His Lie 1 S 10 <210> 285 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptídico <40 0> 285 His Leu Phe Tyr Ser Ser teu teu Ala Cys 1 S 10 <210> 286 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptídico <40 0> 286 Leu Leu vai Leu pro Pro His Xle f%e 1 $ 10 <210> 287 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> 398 <220> 398 peptidico <223> Descrição da sequência artificial: motivo <400> 287 siri L«u «1 n Thr Lm Pro Tyr Vai «31 y Phe 1 S 10

<210> 288 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> peptidico <223> Descrição da sequência artificial: motivo <400> 288

Ser lie A$r» ASp S«r Arg Met Ser Thr Lys

1 $ XO

<210> 289 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> peptidico <223> Descrição da sequência artificial: motivo <400> 289 xle Leu Lys slu Asp Thr Phe His <sly Leu l S 10

<210> 290 <211> 10 <212> PRT 399 <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptidico <400> 290 ASP 1 teu Arg Pro Pro Pro Glrs .As» S Pro Arg 10 <210> 291 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptidico <40 0> 291 Cl u i Leu Lys Leu Met Glu Thr Leu 5 Met Tyr 10 <210> 292 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptidico < 4 0 0 > 292 cys 1 Thr ser Pro ely His Leu Asp tys Lys 10 <210> 293 <211> 10 400

<212> PRT <213> Sequência artificial <220> peptidico <223> Descrição da sequência artificial: motivo <400> 293 iêti Tyr ser Arg Pro Arg lys vai teu ...... 1 5 10

<210> 294 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> peptidico <223> Descrição da sequência artificial: motivo <400> 294

Prõ Leu Thr Oly Ser Asrs Met Lvs Tyr Lys 1 S 10

<210> 295 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> peptidico <223> Descrição da sequência artificial: motivo <400> 295 ile teu Ala slv Asn 11« ile His ser Leu 1 ' 5 10 <210> 296 401 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptídico <400> 296 ser teu clu Ile teu Lys Glu Asp Thr Phe 15 10 <210> 297 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptídico <40 0> 297 Gl« feu sln; siri teu Gly .11« Tèr Glu Tyr 1 5 10 <210> 298 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptídico <400> 298 Gly teu tey lys Gin leu His Xle As π «is 1 5 10 402 <210> 299 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptidico <400> 299 Lys 1 Leu ile Leu a! a €ly asn ile 5 lie His 10 <210> 300 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptidico <400> 300 Met l Leu Hls Thr As n Asp phe ser 5 sly Leu IO <210> 301 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptidico <40 0> 301 403 <5ln si n Trp xl e Gin iys Lm ser tys 1 5

<210> 302 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> peptidico <223> Descrição da sequência artificial: motivo <400> 302

ser Thr tys Thr Thr ser Xle Liy Lys 1 S

<210> 303 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> peptidico <223> Descrição da sequência artificial: motivo <400> 303

cys Ttir Ser Pro <3iv Mis Leu Asp Lys 1 S

<210> 304 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> peptidico <223> Descrição da sequência artificial: motivo 404 <400> 304 404

I

<210> 305 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptídico <400> 305 H.is Lys L#u <slri Tyr $er Nêt Tyr sly 1 $

<210> 306 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptidico <400> 306 vaí 11 e C>ly Pro Ser Ala Pht Ser Lys 1

S <210> 307 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> 405 <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptídico <400> 307

Met Asn teu Thr Arg Glri Lys 1 s

<210> 308 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptídico <400> 308

Thr Leu Mêt Tyr 5®r Arg pro Arq Lys I 5

<210> 309 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptídico <400> 309

Tyr Lêy Ãsn Gly Asm His Ley Thr Lys '1 $

<210> 310 <211> 9 <212> PRT 406 406 <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência <400> 310 Gl V lie Vai val <210> 311 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Descrição da sequência <40 0> 311 lie 1 Val Val Leu <210> 312 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência <400> 312 Leu I Tyr Leu C*-]y <210> 313 artificial: motivo peptídico L«lf Vai Leu Hls Arg $ artificial: motivo peptídico vai Leo His Arg Arg 5 artificial: motivo peptídico

Tyr as ri Ala l!@ Lys 407

<211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> peptidico <223> Descrição da sequência artificial: motivo <400> 313 vai cys ser Fr® pro phe Phe tys I 5

<210> 314 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> peptidico <223> Descrição da sequência artificial: motivo <400> 314

Arg Fr® Fr® Fr® Gl« A.srí Pr® Arg Lys 1 5

<210> 315 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> peptidico <223> Descrição da sequência artificial: motivo <400> 315 408Lys Thr Thr «is «is Thr Thr «1« Arçj 1 5

<210> 316 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptídico <400> 316

Thr «et Leu ile as» Cys Glu Ala iys

<210> 317 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <2 2 0> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptídico <400> 317

<210> 318 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptídico 409 <4 0 0> <210> <211> <212> <213> <220> <223> <4 0 0> 318Xl'e~Phê"Ser Gly vai Pro Lm Thr tys 1 5 319 9 PRT Sequência artificial

Descrição da sequência artificial: motivo peptidico <210> <211> <212> <213> <220> <223> <4 0 0> 319Álà"Phe Asn Gly t«u Gly teu l«u tys I 5 320 9 PRT Sequência artificial

Descrição da sequência artificial: motivo peptidico 320

ASíl Ils Ile Ml$ S«r teu U&t Lys <210> <211> < 212 > <213> 321 9 PRT Sequência artificial <220> 410 <220> 410 <223> Descrição da sequência <400> 321 Gly 1 lea tea lie <210> 322 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência <400> 322 vai 1 Pm Leu: Thr <210> 323 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência <400> 323 artificial: motivo peptidico

Nis Cys Gin Glu Arg 5 artificial: motivo peptidico

Lys vil Asn teu Lys 5 artificial: motivo peptidico

Ser Pro Lmu Thr Gly ser Asn wet Lys 1 5

<210> 324 <211> 9 <212> PRT 411 <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptidico <400> 324 Gly 1 Asn «is Ley Thr Lys Leu Ser Lys $ <210> 325 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptidico <40 0> 325 Phe I Gin Asp Ala Ser ser leu Tyr Arg 5 <210> 326 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptidico <4 0 0> 326 Ala 1 Thr Ser Ser lie Asn Asp Ser Anu s <210> 327 412

<211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> peptidico <223> Descrição da sequência artificial: motivo <400> 327

Tyr pro íily Ala «is G'lu Gl« Lati Lys

I · S

<210> 328 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> peptidico <223> Descrição da sequência artificial: motivo <400> 328

Tyr cys Fr o il e Fro cys Asrt cys iys 1 S

<210> 329 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> peptidico <223> Descrição da sequência artificial: motivo <400> 329 413 413 1 6ly ser lie teu ser Ar§ tm Lys tys

<210> 330 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptídico <400> 330

<210> 331 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptídico <400> 331 hr g1« tyr teu Arg $·

Gin Leu Sly 11«

I

<210> 332 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptídico <400> 414 <400> 414 <210> <211> <212> <213> <2 2 0> <223> <400> 332

Ser 51π TiNr Pre Vai Leu ser s«r Arg 1 5 333 9

PRT

Sequência artificial

Descrição da sequência artificial: motivo 333

Xhr Asn Prô Hat Pro Lys Leu Lys 1 5 334 9

PRT

Sequência artificial

Descrição da sequência artificial: motivo 334

Gly HiS: L«u Asp Lys Lys Glu Ley Lys I 5 ' 335 9

PRT

Sequência artificial peptidico <210> <211> <212> <213> <22 0> <223> <40 0> peptidico <210> <211> <212> <213> <220> 415 <220> 415 peptidico <223> Descrição da sequência artificial: motivo <400> 335

Arg tys vai Leu Vai Glu Gin Thr Lys I 5

<210> 336 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> peptidico <223> Descrição da sequência artificial: motivo <400> 336

Lys Vai teu ser Fro Ser Gly Leu Leu

' 1 S

<210> 337 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> peptidico <223> Descrição da sequência artificial: motivo <400> 337

Lys Vai teu Tyr Leu Asn Asn as» Leu 1 s

<210> 338 <211> 9 <212> PRT 416 <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptídico <400> 338

Lys Vâl L#U Ils Lttí ASíl ASp ASft Alâ. 1 s

<210> 339 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptídico <400> 339

Phe l*he tys Sly Ser lie Leu ser Arg 1 ' s

<210> 340 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptídico <400> 340

Am lie Slu ser teu Ser asp Leu Arg I s <210> 341 9 417 <211> <212> <213> <220> <223> <400> PRT Sequência artificial

Descrição da sequência artificial: motivo peptidico <210> <211> <212> <213> <220> <223> <400> 341tes* Gly Ile Thr Glu Tyr teu Arg tys1 s 342 9 PRT Sequência artificial

Descrição da sequência artificial: motivo peptidico <210> <211> <212> <213> <220> <223> 342vai Gly Leu Gin Trp xle Gin Lys i ' S 343 9 PRT Sequência artificial

Descrição da sequência artificial: motivo peptidico <400> 343 344 418Cily TNr Pha As η Pr ô Met. Pr© Lys Leu Ϊ $ <210> <211> <212> <213> <220> <223> < 4 Ο Ο > 9 PRT Sequência artificial

Descrição da sequência artificial: motivo peptidico <210> <211> <212> <213> <220> <223> <40 0> 344Gly Thr mt Leu X1« Asn Cys <61 u Ala i $ 345 9 PRT Sequência artificial

Descrição da sequência artificial: motivo peptidico <210> <211> <212> <213> <220> 345Vai Vai Leu vai Leu Bis Arg Arg Arg 1 S 346 9 PRT Sequência artificial <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptidico 1 419 <400> 346 s vai (L«u ll« Leu s!y Leu Leu lie

<210> 347 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptídico <400> 347 vai Pro Lê« Thr wis Leu Asp Leu Arg

<210> 348 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptídico <400> 348

<210> 349 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial 420 <220> peptidico <223> Descrição da sequência artificial: motivo <400> 349 <3l;y vai Pro Lee Thr Lys Vai As π Leu i $

<210> 350 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> peptidico <223> Descrição da sequência artificial: motivo <400> 350

As ti slu Lys olu Gly Ser Asp Ala Lys 1 S

<210> 351 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> peptidico <223> Descrição da sequência artificial: motivo <400> 351

Thr va1 ile elu Pro ser Ala phe ser Lys I S 10

<210> 352 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial 421 <220> peptidico <223> Descrição da sequência artificial: motivo <400> 352 vai Vai Cys asíi Set Pr o Pr© Phe Phe Lys 15 10

<210> 353 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> peptidico <223> Descrição da sequência artificial: motivo <400> 353

Gly Thr $et lie ash cys Glv Ala Lys 1 5 ' 10

<210> 354 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <2 2 0> peptidico <223> Descrição da sequência artificial: motivo <400> 354 61y vai pro tsa Thr Lys vai aso Lys 1 5 10 <210> 355 <211> 10 422

<212> PRT <213> Sequência artificial <220> peptidico <223> Descrição da sequência artificial: motivo <400> 355 L«u v&l Gly Leu Gin Gin Trp lie Gin Lys 1 S 10

<210> 356 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> peptidico <223> Descrição da sequência artificial: motivo <400> 356

Gly Thr Phe Pro Met Pro Lys teu Lys I S 10

<210> 357 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> peptidico <223> Descrição da sequência artificial: motivo <400> 357

Ala PNe Asn Gly Ltu <sly uu Lys l S 10 423 <210> 358 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptidico <400> 358 Hl S X He pjbté ser G-1 y Vai pr çj 5 Thr lys 10 <210> 359 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptidico <40 0> 359 Leu 1 ryr teu Asn cfly Asn His Leu S TOr Lys W <210> 360 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptidico <400> 360 424 L«u'«1« Sln Trp 11 e slf» tys teu Ser tys 1 S 10 <210> 361 <211> 10

<212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptidico <400> 361 6¼ Thr tys Asn <s!u Tyr Hie síu t«u tys 1 5 10 <210> 362 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptidico <400> 362 Thr Thr Ser Ile teu Lys teu Pro Thr tys 1 5 10 <210> 363 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <2 2 0> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptidico 425 <400> 363 cys Thr Ser Pro Gly Mis Leu Asp Lys lys 1 S 1*3

<210> 364 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptidico <400> 364 ieti mt Glu Thr teu Met Tyr ser Arg 5 10

Lys 1 artificial <210> 365 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência <220> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptidico <400> 365 ryr vai Gly Pine Leu Glu «is Ile «1y hm '1 5 10

<210> 366 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> 426

<223> Descrição da sequência artificial: motivo <400> 366 Ser Phe «et Aso léu Jhr Arq teu Gin tys 1 S 10 <210> 367 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Descrição da sequência artificial: motivo <40 0> 367 Tyr Leu Tyr Leu Clu Tyr As π Ala Ile Lys 1 S " 10 <210> 368 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: motivo <400> 368 Si fi Leu Gly Tle Thr Glu Tyr Leu Ara tvs i S 10 <210> 369 <211> 10 <212> PRT peptídico peptídico peptídico 427 <213> Sequência artificial <220> peptidico <223> Descrição da sequência artificial: motivo <400> 369 Vâl Leu Hís Arg Arg A.rq Arg Tyr lys lys Ϊ S '10

<210> 370 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> peptidico <223> Descrição da sequência artificial: motivo <400> 370

Glu rbr L€u; Met ivr ser Ara Pro Arg Lys 1 s ' 10

<210> 371 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> peptidico <223> Descrição da sequência artificial: motivo <400> 371

Ala Pro fíly Leu Il:« Pró Tyr Ilè-Thr Lys 1 5 10 <210> 372 428

<211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> peptidico <223> Descrição da sequência artificial: motivo <400> 372

Hi's Tyr Pró Gly Ala Mis Glu c>lu Lsu Lys 1 S 10

<210> 373 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> peptidico <223> Descrição da sequência artificial: motivo <400> 373

His te« Gin Tyr ser Mét Tyr ely Nis Lys 1 5 20

<210> 374 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> peptidico <223> Descrição da sequência artificial: motivo <400> 374 429

Leu Fro sly Thr Fbe As« Pr© ítet Pró: tys 1 S lô

<210> 375 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> peptidico <223> Descrição da sequência artificial: motivo <400> 375

Vai Tyr Arg ser Pro Ser Phe Gly Pro Lys I 1 S 10

<210> 376 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> peptidico <223> Descrição da sequência artificial: motivo <400> 376 —4-eo Cys Thr ser Pro Gly His Leu Asp Lys .1 5 10

<210> 377 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> peptidico <223> Descrição da sequência artificial: motivo 430 <400> 377 He tea Asp Gin Leu Glu Asp 1 S <210> 378 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: <400> 378 Thr 1 Thr Asr$ Thr Ala Asp Thr lie S <210> 379 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: <400> 379 Ser 1 Ils Asn Aâp Sef Arg jwfet Ser 5 <210> 380 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial ΙΟ 10 peptídico peptídico 10 431

<220> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptidico <400> 380 L.etí 1 Ile Asn tys sly Ala Lys Gly 5 Ile Lys 10 <210> 381 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptidico <400> 381 fêet 1 Vai Ser Fr© Ftef Va.l Hls vai $ Tyr Arg 10 < 210 > 382 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptidico <400> 382 Phe Vai Pr® teu Thr His teu Asp teu Arq 1 5 10 <210> 383 <211> 10 <212> PRT 432 <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptidico <400> 383 G'l η 1 Gin Leu Gly He Thr 61 u Tyr $ Leu Arg 10 <210> 384 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptidico <40 0> 384 Gly 1 He Vâl Vai Leu Vai Leu His S Arg Arg 1Õ <210> 385 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptidico <400> 385 L^U 1 Vai Leu His Arg Afg Arg Arg S Tyr tys 10 <210> 386 433

<211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptídico <400> 386

Ala cys Aso cys Asp Leu 61« teu tys 1 .5 10

<210> 387 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptídico <400> 387

Lys Vai teu ser Pro Ser Gly fey teu Ile 1 5 10

<210> 388 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptídico <400> 388

Arsj Asa 61 y Lys 6l« «1y S«r Asp Alá tys 1 ' S 10 434 <210> 389 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptídico <400> 389 Lys sly ser ile teu Ser Arq teu Lys Lys ' 1 5 10 <210> 390 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptídico <400> 390

Lys vai leu Tyr* teu Asn Asn As» teu Leu 1 5 10

<210> 391 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptídico <400> 391 435

Lys 1 vai leu lie Leu Asn Asp Asu 5 Ala Ile 10 <210> 392 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptidico <40 0> 392 lie 1 Vai Phe Cys Ala Ais <3ly Ile 1 vai vai 10 <210> 393 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptidico <40 0> 393 ser I pite 6Ir Asp Ala s«r Ser Leu 5 Tyr Arq 10 < 210 > 394 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptidico 436 <400> 394 llê Asn His Aso ser ieu Glu xle teu Lys I 5 10

<210> 395 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptidico <400> 395

<210> 396 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptidico <400> 396

Ser vai Pra Pm ser ΑΠ» Pro Ph« <3lr* Leu 1 5 10 <210> 397 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> 437 <220> 437 peptidico <223> Descrição da sequência artificial: motivo <400> 397

Lys Thr Ãsn Gin Phe Thr hís teu Pro vai I 5 10

<210> 398 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> peptidico <223> Descrição da sequência artificial: motivo <400> 398

Leu G!u Glu Glu Glu Glu Arg Asn Glt) t.ys I $ 10

<210> 399 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> peptidico <223> Descrição da sequência artificial: motivo <400> 399 lie Vai Vai teu vai Leu Hís Arg Aro Ara :l '5 10

<210> 400 <211> 10 <212> PRT 438 438 <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: <400> 400 ser I Vai Leu lie Leu Gly Leu Leu $ <210> 401 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: <400> 401 Glu 1 Tyr Leu Arg lys Asn lie Ala ' 5 <210> 402 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: <400> 402 g! u 1 Tyr Phe Thr Leu Glu Met Leu 5 <210> 403 10 peptídico peptídico peptídico 10 439

<211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptídico <400> 403 gIm Tyr L«u iyr teu slu Tyr Asn Ala lie 1 S XÔ

<210> 404 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptidico <400> 404

Arg Phe Vai Leu Thr Mis teu Asp Leu 1 s 1Ô

<210> 405 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptidico <400> 405 440 tGlyPhe Leu elu Kls lie Gly Arg Ile Leu 1 S 10

<210> 406 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> peptidico <223> Descrição da sequência artificial: motivo <400> 406

Leu Tyr Gly Gin His Môt vai ser prtn mt 1 5 10

<210> 407 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> peptidico <223> Descrição da sequência artificial: motivo <400> 407

Pro Tyr lie Thr lys Pro ser Thr Gin teu 1 5 10

<210> 408 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> peptidico <223> Descrição da sequência artificial: motivo 441 <400> 408

Phe ΡΗβ Lys 6ly S«r ile teu ser Arg teu 1 S 10

<210> 409 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> peptidico <223> Descrição da sequência artificial: motivo <400> 409

Vai Phe Cys Alâ Ala fí1y lie Vai Vai teu 1 5 10

<210> 410 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> peptidico <223> Descrição da sequência artificial: motivo <400> 410 lie php Are Phe vai pro teu Ttir «Is teu 1 5 10

<210> 411 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial 442 <220> peptidico <223> Descrição da sequência artificial: motivo <400> 411

Arg Pro Pro Pro sln Asn Pro âr§ Lys Leu 1 S 10

<210> 412 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> peptidico <223> Descrição da sequência artificial: motivo <400> 412

Lys val L€U Tyr Léu Asa as π Ã&rt Leu Leu 1 s 10

<210> 413 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> peptidico <223> Descrição da sequência artificial: motivo <400> 413

Lys slrs L«u Mis lie A$n Hts asls S«r Léu 1 5 10

<210> 414 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> 443 <223> Descrição da sequência artificial: motivo <400> 414 1 <210> 415 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência <22 0> <223> Descrição da sequência artificial: motivo <400> 415 ASp 1 <210> 416 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência <22 0> <223> Descrição da sequência artificial: motivo <400> 416 Àrq Ser Pro Ser Phe <3ly Pro Lys Hls teuI s ίο <210> 417 <211> 10

Asrs lie Leu Glu tys Glu Arg Glu teu 5 10 artificial

Tyr teu Glu vai Leu Glu sl» cln Thr 5 10 artificial peptidico peptidico peptidico

<212> PRT 444 <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptidico <400> 417 Lys Gly Pite teu Gly Lm Mis Asn Leu 1 S 10 <210> 418 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptidico <40 0> 418 Lys Leu Asm Arg teu Lys vai leu lie teu 1 $ ' 10 <210> 419 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptidico <400> 419 Thr Phs Hi s Gly Leu Glu As π Leu Glu Pfte 1 5 10 <210> 420 <211> 10 445

<212> PRT <213> Sequência artificial <220> peptidico <223> Descrição da sequência artificial: motivo <400> 420

Lys L-su Ser Lys siy M«:t Phe tfiu Gly Ley ' 1 b 10

<210> 421 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> peptidico <223> Descrição da sequência artificial: motivo <400> 421

Vai lia Glu Pre sar Ala Phe ser Lys Lau 1 § 10

<210> 422 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> peptidico <223> Descrição da sequência artificial: motivo <400> 422

Gly pba Le» Gin Ala A&p Asn Asn f»he lie 1 $ Ί0 446 <210> 423 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptidico <400> 423 ÂSp 1 lie Glu ile Gly Ala Pbe. As π 5 Gly Leu 10 <210> 424 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptidico <400> 424 Tyr Leu Asn Asn Aso Leu Leu Gln Vai Leu ' 1 5 10 <210> 425 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptidico <40 0> 425 447

Phe <*1« teu ser ieu Leu asn Asn Gly Leu 1 5 10 <210> 426 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptídico <400> 426 vai teu gIií slu sly ser phe Metr Asti Leu I 5 .10 <210> 427 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptídico <400> 427 Leu Pro Vai Ser As« Jle Leu Asp Asp Leu 1 5 10 <210> 428 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptídico 448 <4Ο0> 428

Lew €'lm ¢1 η Leu <3ly xl« thr Glu Tyr Leu 1 5 '10

<210> 429 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> peptidico <223> Descrição da sequência artificial: motivo <400> 429

Gly Phe ash Asn ile Ala Asp xle 6lu lies 1 5 10

<210> 430 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> peptídico <223> Descrição da sequência artificial: motivo <400> 430

Leu Gin Gin Leu Gly lie Thr Glu Tyr Leu 1 $ 10

<210> 431 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> 449 449 peptidico <223> Descrição da sequência artificial: motivo <400> 431

Lys ser A$p teu Vai slu Tyr Fhe Tlr Leu 1 5 10

<210> 432 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> peptidico <223> Descrição da sequência artificial: motivo <400> 432

Aro «et ser Tbr Lys Thr Thr Ser lie Leu i s m

<210> 433 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> peptidico <223> Descrição da sequência artificial: motivo <400> 433 val cly Leu Gin Gin Trp líe Gin Lys Leu 1 5 "10

<210> 434 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> 450 <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptidico <400> 434 Pile 1 Met Asn teu Tb r Arg Leu Gin & Lys Leu ID <210> 435 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptidico <400> 435 ser 1 Tyr Leu Vai Thr Thr Pro $ Ala Thr 10 <210> 436 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptidico <40 0> 436 Leu 1 Tyr Leu asu As o Asn Leu Leu 5 g!n Vai 10 <210> 437 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> 451 <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptidico <400> 437 .AÍ a tSlu Pro Asp Tyr teu Glu Vai teu S ‘ 10 Hí s 1 artificial <210> 438 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência <220> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptidico <400> 438

Cys -Fro lie ppq cys cys Lys vai teu 1 5 10

<210> 439 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptidico <400> 439

Asn 1

Cys 6lu Giu

Lys " 5

Gly Thr Met Léu 10 <210> 440 <211> 10 452

<212> PRT <213> Sequência artificial <220> peptidico <223> Descrição da sequência artificial: motivo <400> 440 Nís Cy.s Gin Glti ftrg Asn ile Glti Ser teu 1 5 10

<210> 441 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> peptidico <223> Descrição da sequência artificial: motivo <400> 441 X'le Leu Asn Asp Asn Ala Ile Glu ser teu 1 5 10

<210> 442 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> peptidico <223> Descrição da sequência artificial: motivo <400> 442

Ser vai Pro Pro Ser Arg Pro Phe Gin Leu 1 S 10 453

<210> 443 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptídico <400> 443 vai pro teu ser vai Leu lie L&u Gly Leu 1 S 10

<210> 444 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptídico <400> 444 ser -Glv vai Pr o Leu Thr tys vai Asn Leu 1 5 10

<210> 445 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptídico <400> 445 454 mp Ala vai Pro leu Ser vai Léu lie teu 1 5 10 <210> 446 <211> 10

<212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptidico <40 0> 446 Phe Thr hí s Léu Pr o- Vai Ser Ase lie teu 1 S 10 <210> 447 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptidico <40 0> 447 Asrt Thr Ala Asp Thr lie Leu Arg ser Leu 1 S 10 <210> 448 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptidico 455 <400> 448 Tyr ι 1 Leu: asn Gly Asn 1 Hl* s Leu Thr Lys Leu 10 <210> 449 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptidico <40 0> 449 H:ÍS 1. Ilt. Asn His Asr? S t Ser Leu slu lie Léu 10 <210> 450 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptidico <400> 450 Ser 1 Asr* lie Leu Asp Asp Leu Asp S Leu Leu 10 <210> 451 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> 456 <223> <400>

Descrição da sequência artificial: motivo peptidico 451

As ?i Pro M%t Pm tys Leu Lys Vai Leu I 5. <210> <211> <212> <213> <22 0> <223> <40 0> 452 9 PRT Sequência artificial

Descrição da sequência artificial: motivo peptidico 452

Met Pro Lys teu tys vai teu Tyr Leu 1 5' <210> <211> <212> <213> <220> <223> <400> 453 9 PRT Sequência artificial

Descrição da sequência artificial: motivo peptidico <210> <211> <212> <213> 453Ser Pm ser Phe Gly Pm Lys His Lm 1 $ .. 454 9 PRT Sequência artificial <220> 457 <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptidico <400> 454

<210> 455 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptidico <400> 455 1

<210> 456 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptidico <400> 456

Ala Vai Pr o teu Ser Vai Leu Ile Leu <210> 457 <211> 9 1 458

<212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptidico <400> 457

Ser Ser Arg g1y Ser Cvs âsp ser Leu I ‘ 5

<210> 458 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptidico <400> 458 lie Sly Arg lie Leu âsp Leu Gin Leu I ' $

<210> 459 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptidico <400> 459

Leu Thr Arg Leu Gin Lys Leu Tyr Leu I 5 459

<210> 460 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptídico <400> 460

Leu As π Arg Leu Lys Vai Leu lie Leu 1 *5

<210> 461 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptídico <400> 461

Tyr teu Arg Lys Asn lie Ala Leu 1 ' 5

<210> 462 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptídico <400> 462 460

<210> < 211 > <212> <213> <220> <223> < 4 0 0 > <210> <211> <212> <213> <22 0> <223> <40 0> <210> <211> <212> <213> <220> 463 9 PRT Sequência artificial

Descrição da sequência artificial: motivo peptidico 463

Lys vai Leu Ser Pro Ser Gly Leu Leu 1 S 464 9 PRT Sequência artificial

Descrição da sequência artificial: motivo 464Gly vai Pro Leu Thr Lys vai Astt Leu 1 5 465 9 PRT Sequência artificial peptidico <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptidico 461 <400> <210> <211> <212> <213> <220> <223> <40 0> 465phe Vai pro Leu itir His teu Asp Leu 1 $ 46 6 9 PRT Sequência artificial

Descrição da sequência artificial: motivo peptidico 46 6 <210> <211> <212> <213> <220> <223> <400> tvs Vai Leu Tyr Leu as π as« A$r* Leu 1 ' 5 467 9

PRT

Sequência artificial

Descrição da sequência artificial: motivo 467

Ser pro Vâl Ni5 Leu Tyr Ser mt " ' I 5 468 9

PRT

Sequência artificial peptidico <210> <211> <212> <213> <220> 462 <220> 462 peptidico <223> Descrição da sequência artificial: motivo <400> 468

Net: Pro Thr Gin Thr Ser Tyr teu Met 1 5

<210> 469 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> peptidico <223> Descrição da sequência artificial: motivo <400> 469

Allã Ser ser Leu Tyr Arg Asn Ilè Leu 1 S

<210> 470 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> peptidico <223> Descrição da sequência artificial: motivo <400> 470

Leu Ala ely asπ ile 11 e His ser Leu 1 5

<210> 471 <211> 9 <212> PRT 463 <213> Sequência artificial <220> peptidico <223> Descrição da sequência artificial: motivo <400> 471

Ser Ala Hne Ser Lys Leu Asn Arg teu I 5

<210> 472 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> peptidico <223> Descrição da sequência artificial: motivo <400> 472

Asp Ala. tys His teu Sln Arg Ser Leu 1 5

<210> 473 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> peptidico <223> Descrição da sequência artificial: motivo <400> 473

Ala Cvs Asn Cys Asp Leu Leu Cl π Leu 1 5 <210> 474 464

<211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> peptidico <223> Descrição da sequência artificial: motivo <400> 474 ely Ala Píie Asn tfly teu 6ly Leu Leu 1 5

<210> 475 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> peptidico <223> Descrição da sequência artificial: motivo <400> 475

Ser Prõ Pro Phe Phe LyS Gly Ser Ile

I S

<210> 476 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> peptidico <223> Descrição da sequência artificial: motivo <400> 476 477 465t&y: Pr© Thr Lys Ala Pr© L&y lia I 5 <210> <211> <212> <213> <22 0> <223> <40 0> 9 PRT Sequência artificial

Descrição da sequência artificial: motivo peptidico <210> <211> <212> <213> <220> <223> <40 0> 477Pr© Pro Phe Phs Lys Gly ser lie Lsu 1 S 478 9 PRT Sequência artificial

Descrição da sequência artificial: motivo peptidico <210> <211> <212> <213> <220> 478Pr©'Pr© Pr© Glr* as© pro Ar§ Lys Leu 1 S 479 9 PRT Sequência artificial <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptidico <400> 466 <400> 466 <210> <211> <212> <213> <220> <223> <400> 479

Glv Thr Fhe Asn Pro Wet Pro iys Leu

1 S 480 9

PRT

Sequência artificial

Descrição da sequência artificial: motivo 480

Ala pro Gly teu Ite Pr© Tyr lie Thr 1 S peptidico <210> <211 > <212> <213> <220> <223> <4 Ο 0> 481 9 PRT Sequência artificial

Descrição da sequência artificial: motivo peptidico <210> <211 > <212> <213> 481Tyr 1¼ Thr ly.s Fr©· Ser Thr Gin Leu I 5 482 9 PRT Sequência artificial 467 <220> peptidico <223> Descrição da sequência artificial: motivo <400> 482

Gl u vai teu Glu €lu Cly Ser Phe Met 1 S

<210> 483 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> peptidico <223> Descrição da sequência artificial: motivo <400> 483

Gly Met Phe Leu Gly teu Hls teu 1 5

<210> 484 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> peptidico <223> Descrição da sequência artificial: motivo <400> 484

Leu Gly asn His teu Ttir Lys teu 1 5

<210> 485 <211> 9 <212> PRT 468 <213> Sequência artificial <220> peptidico <223> Descrição da sequência artificial: motivo <400> 485 lie tetí Cys Thf Ser Pro €S'1y líis Leu 1 ' 5

<210> 486 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> peptidico <223> Descrição da sequência artificial: motivo <400> 486

Asn iêu Nis Ala. Glu Pro Asp Tyr Leu 1 s

<210> 487 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> peptidico <223> Descrição da sequência artificial: motivo <400> 487

Arg Asrs lie Glu Ser Leu Ser Asp teu I 5 <210> 488 469

<211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> peptidico <223> Descrição da sequência artificial: motivo <400> 488

Trp l:1 e His teu Pbe Tyr Ser Ser teu I 5

<210> 489 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> peptidico <223> Descrição da sequência artificial: motivo <400> 489 asfí ile teu Asp Asp Leu Asp tey Leu 1 s

<210> 490 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> peptidico <223> Descrição da sequência artificial: motivo <400> 490 470

As n sly Leu Gly Leu leu Lys Gin Leu I 5

<210> 491 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> peptidico <223> Descrição da sequência artificial: motivo <400> 491

Leu Ser Vai Leu IIe Leu Glv Leu Leu I $

<210> 492 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> peptidico <223> Descrição da sequência artificial: motivo <400> 492

Leu Leu âsn Asn Gly Leu Thr Met Leu 1 S

<210> 493 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> peptidico <223> Descrição da sequência artificial: motivo 471 <400> 493

Arg ser Lm Ttir Asp Ala vai pro Leu 1. S <210> <211> <212> <213> <220> <223> <400> 494 9

PRT

Sequência artificial peptidico

Descrição da sequência artificial: motivo 494

Thr Thr As ti £1 π Ser Thr êlu Phe teu 1 5 <210> <211> <212> <213> <22 0> <223> <40 0> 495 9 PRT Sequência artificial <210> <211> <212>

Descrição da sequência artificial: motivo 495Leu Thr Asn Ala 11e ser fie Mis Leu I $ 496 9 PRT peptidico <213> Sequência artificial <220> 472 <220> 472 peptidico <223> Descrição da sequência artificial: motivo <400> 496

Asp Thf f*ht His 3í!y Léu Slu asii Leu

1 S

<210> 497 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> peptidico <223> Descrição da sequência artificial: motivo <400> 497

Lys teu Tyr Leu Aso €ly Asn Mis Leu ' 1 ' 5

<210> 498 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> peptidico <223> Descrição da sequência artificial: motivo <400> 498

Leu Pro Pro Asrt lie Phe Arg Pbe vai 1. 5

<210> 499 <211> 9 <212> PRT 473 <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptídico <400> 499

<210> 500 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptídico <400> 500

Het Ser Thr tys Thr Thr Ser Ilè Leu

X s

<210> 501 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptídico <400> 501 ser Pro Pro phe phe Lys sly Ser lie teu

<210> 502 474

<211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptídico <400> 502

Ser Pro 6lv »is lsu Asp tys l.ys Glu Leu 1*5' 10

<210> 503 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptidico <400> 503

Leu pro Vai Ser Asrt Ile leu Asp Asp Leu 1 5 10

<210> 504 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptidico <400> 504 475

<210> 505 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptídico <400> 505

Tyr Pre Gly Ala Hís GÍu Glu Leu Lys Leu 1 5 10

<210> 506 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptídico <400> 506 vai Pr© Leu ser vil teu lie Leu Gly teu I S 10

<210> 507 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptídico 476 <400> 507

Arg Pro Pro Pro. cl n âsr Piro Argi Lys Le=u 1 5 10

<210> 508 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptídico <400> 508

Asp Leu Ar<j Gly Aso Gin teu Gin Tbr Leu 1 ' 5 10

<210> 509 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptídico <400> 509 6Ín «et Aro Asp Aso Ser Pre Vai Mis Leu 1 5 . 10

<210> 510 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> 477 <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptidico <400> 510 cys 1 Pré- sly Leu Vai Asn Asn pro S Ser Miêt 10 <210> 511 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptidico <4 0 0> 511 Aff 1 Pro Arg Lys vai Leu vai Glu 5 6ln Thr 10 <210> 512 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptidico <400> 512 Lys X V&1 Léu Tyr Leu Aso Asn Asrt 5 Leu Leu 10 <210> 513 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial 478

<220> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptidico <400> 513 Ser vai fto prs Ser Arg Prc Ptie 1 5 Gin Leu 10 <210> 514 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptidico <400> 514 Asp Ala Lys M:1s leu Sln Arq Ser 1 s leu Leu 10 <210> 515 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptidico <400> 515 As-p Alá. ser Ser tew Tyr Arg Asn I $ lie Leu 10 <210> 516 <211> 10 <212> PRT 479 <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptidico <400> 516 Agp 1 A í ã. vai Pr o Latt ser Vai Lati S tla teu 10 <210> 517 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptidico <40 0> 517 Cys 1 Ala Ala Glv ile Val val teu 5 vai teu' 10 <210> 518 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptidico <400> 518 LVS ' 1 Phe teu <sly ueu Nis 5 As π Leu 10 <210> 519 <211> 10 480

<212> PRT <213> Sequência artificial <220> peptidico <223> Descrição da sequência artificial: motivo <400> 519

Ala Asn Leu His Ala Glu Pm Asp Tyr Leu 1 5 10

<210> 520 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> peptidico <223> Descrição da sequência artificial: motivo <400> 520

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<210> 521 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> peptidico <223> Descrição da sequência artificial: motivo <400> 521

Leu Met Tyr ser Arg Prs Arg fys vai Leu 1. 5 10 481

<210> 522 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptídico <400> 522

Leu Pm Tyr Vai Cly Phe Leu Glu «is fie I $ 10

<210> 523 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptídico <400> 523

<210> 524 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptídico <400> 524 482

Fro Fro A$r* tle Fhe Aro Fhe vai Fro · teu 1 5 10

<210> 525 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> peptidico peptidico <223> Descrição da sequência artificial: motivo <400> 525

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<210> 526 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Descrição da sequência artificial: motivo <400> 526

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<210> 527 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptidico 483 <400> 527 XI® Phe Arg Phe vai Pr© teu Ttir His Leu 1 S 10 <210> 528 <211> 10

<212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptídico <400> 528 H-is Thr Thr &Ί© Arq Pr© ser Ala ser Lm i 1 io <210> 529 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptídico <40 0> 529 Leu Vai slu ivr Phe Thr Leu 01'y fêét Léu 1 S 10 <210> 530 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptídico 484 <400> 530 ser Vai Leu He teu ely Leu l«u lie JWet I 5 10

<210> 531 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> peptidico <223> Descrição da sequência artificial: motivo <400> 531

His Letí Oly asr as is Arg lie Glu vai Leu 1 $ 10

<210> 532 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> peptidico <223> Descrição da sequência artificial: motivo <400> 532

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<210> 533 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> 485 485 peptidico <223> Descrição da sequência artificial: motivo <400> 533

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<210> 534 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> peptidico <223> Descrição da sequência artificial: motivo <400> 534

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<210> 535 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> peptidico <223> Descrição da sequência artificial: motivo <400> 535 lie Ser Leu His ser 4ln Thr Pr®'vai Leu 1 5 · ' 10

<210> 536 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial 486 <220> peptidico <223> Descrição da sequência artificial: motivo <400> 536

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<210> 537 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> peptidico <223> Descrição da sequência artificial: motivo <400> 537 alíi Sln Thr tys Ase oTu Tyr pfse slu Leu 1 5 10

<210> 538 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> peptidico <223> Descrição da sequência artificial: motivo <400> 538

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<210> 539 <211> 10 <212> PRT 487 <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptidico <400> 539 Met 1 Pr» The Gin Tbr Ser Tyr Leu 5 fêet vai 10 <210> 540 <211 > 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptidico <4 0 0> 540 irp 1 lie Mis Leu Phe Tyr ser ser S Leu Leu 10 <210> 541 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptidico <40 0> 541 Tyr 1 Leu Asn Gly Asn Mis Leu Thr S Lys Leu 10 <210> 542 <211> 10 488

<212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptidico <400> 542 pro ser Arg Pr© Phe sln Leu ser Leu Leu 1 5 10

<210> 543 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptidico <400> 543

<210> 544 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptidico <400> 544

Ph-e Asn Gly teu Gly Leu teu Lys Gin Leu 1 5 10 <210> 545 489 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptidico <400> 545 As η 1 teu Tbr Arg tei u Gin Lys teu 5 Tyr Leu 10 <210> 546 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptidico <400> 546 G ! u 1 Leu Lys AÍ a. teu -1 a Asn Ser Glu S lie Leu IO <210> 547 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptidico <40 0> 547 490 lie teu Asn Asp Aar* Ala X1« <slu $sr Leu 1 s 10

<210> 548 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptídico <400> 548 A5p Asn tys Trp Ala CVS Ã$n CVS ASp tsu 1 5 10

<210> 549 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptídico <400> 549

Asn Pro Arg tys teu lie teu Ala Gly Asu 1 5 10

<210> 550 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptídico <400> 491 <400> 491 <210> <211 > <212> <213> <220> <223> <40 0> <210> <211> <212> <213> <22 0> <223> <40 0> <210> <211> <212> <213> 550

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PRT

Sequência artificial

Descrição da sequência artificial: motivo 551 wet Pro tys Leu Lys Vai teu Tyr Leu 1 5 552 9

PRT

Sequência artificial

Descrição da sequência artificial: motivo 552

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PRT

Sequência artificial peptidico peptidico <220> 492 492 peptidico <223> Descrição da sequência artificial: motivo <400> 553 mt Pro Thr aln Thr ser ivr Leu mt 1 5

<210> 554 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> peptidico <223> Descrição da sequência artificial: motivo <400> 554

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<210> 555 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> peptidico <223> Descrição da sequência artificial: motivo <400> 555

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<210> 556 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial 493 <220> peptidico <223> Descrição da sequência artificial: motivo <400> 556 ser pro ser Phe Gly Pro Lys His Leu

1. S

<210> 557 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> peptidico <223> Descrição da sequência artificial: motivo <400> 557 vai Pró Pro Ser Arg Prõ Phe Gin Leu

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<210> 558 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> peptidico <223> Descrição da sequência artificial: motivo <400> 558

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<212> PRT <213> Sequência artificial <220> peptidico <223> Descrição da sequência artificial: motivo <400> 559 ser s®r Arg ely Ser cys A$p Ser teu 1 5

<210> 560 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> peptidico <223> Descrição da sequência artificial: motivo <400> 560 teu Ser tys Gly Mef Phe Leu Cly Leu 1 5

<210> 561 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> peptidico <223> Descrição da sequência artificial: motivo <400> 561

Arq Ser Leu Thr Asp Ala. Vai Pro Leu .....i ' 5 495

<210> 562 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> peptidico <223> Descrição da sequência artificial: motivo <400> 562

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<210> 563 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> peptidico <223> Descrição da sequência artificial: motivo <400> 563

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<210> 564 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> peptidico <223> Descrição da sequência artificial: motivo <400> 564 496

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<210> 565 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <2 2 0> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptidico <400> 565

Leu fclet lys ser Asp leu vai Glu Tyr 1 s

<210> 566 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <2 2 0> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptidico <400> 566

Leu Pró Thr tys· Âlà Fro <3ly teu Ile 1 $

<210> 567 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptidico 497 <400> 567

ser pro Pro Phe phe Lys GUly ser ile I S

<210> 568 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptídico <400> 568

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<210> 570 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> 498 <223> <400>

Descrição da sequência artificial: motivo peptidico <210> <211> <212> <213> <220> <223> <400> 570 $ar Ala Ser l«u Tvr «1« Gin Mis mt. 1 $ 571 9 PRT Sequência artificial

Descrição da sequência artificial: motivo peptidico 571 <210> <211> <212> <213> <22 0> <223> <40 0> <210> <211> <212>

y Vai Leu Gly Glu Gly Ser phe M-et 1 S 572 9

PRT

Sequência artificial

Descrição da sequência artificial: motivo 572

Leu ser Arg teu tys tys Glu ser Ile 573 9

PRT peptidico 499 <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptídico <400> 573 çly teu Lys Lei* Met 6lu Thr Leu Net 1

<210> 574 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptídico <400> 574

<210> 575 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptídico <400> 575

Leu Ser Vai teu I le Leu cly Leu Leu

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<211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptídico <400> 576 ser ser Leu teu Ala Cys ile ser Leu 1 s

<210> 577 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptídico <400> 577 lie Ser vel pro Pro ser Aro pro Phe 1 5

<210> 578 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptídico <400> 578 501

Met 1 Ser Thr tys Thr Thr ser rle teu s <210> 579 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: motivo <400> 579 01 y X s-er *>he Met A$n Leu Thr Arg Leu S <210> 580 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Descrição da sequência artificial: motivo <40 0> 580 Gin I Thr lvs Asn ely Tyr Phe Glu Leu s <210> 581 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptídico peptídico peptídico 502 <400> 581 Arg 1 Asn lie Gly Ser $ teu Ser Asp Leu <210> 582 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptidico <400> 582 cys 1 Pro llê Pro Cys 5 ãsr Cys tys vai <210> 583 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptidico <4 0 0> 583 Lm 1 Pro Pro h1s lie 5 Phe ser sly vai <210> 584 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> 503 <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptídico <400> 584

Leo Gin Pra 1

Met Glu Ala His Tyr 5

<210> 585 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptídico <400> 585 1

Pro Phe Gln Lêti Ser teu Ley Asn 5

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Leu pro Pro Asii

I <210> 587 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> 504 <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptidico <400> 587

Ty r Ser Arg Pro Arg tys Vai Lee vai * I S

<210> 588 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptidico <400> 588

Tyr Leu Arg tys Asn lie Ala <i1 π Liu ' 1 ' $

<210> 589 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptidico <400> 589

Ssr Ala phe s«r tys teu Asr Arg: Leu 1 5

<210> 590 <211> 9 <212> PRT 505 <213> Sequência artificial <220> peptidico <223> Descrição da sequência artificial: motivo <400> 590

Leu Tltr Àff Léu Gin Lys teu Tyr Lêu

I S

<210> 591 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> peptidico <223> Descrição da sequência artificial: motivo <400> 591 lie:'csly Arg lie Leu Asp Gin Leu í 5

<210> 592 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> peptidico <223> Descrição da sequência artificial: motivo <400> 592

Leu Ala 6ly A$n Xte 11« His Ser Leu

1 S <210> 593 506

<211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <2 2 0> peptidico <223> Descrição da sequência artificial: motivo <400> 593

Gly Alá Fhe Asrt <31 y Leu Gly L«u Leu 1 5

<210> 594 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> peptidico <223> Descrição da sequência artificial: motivo <400> 594

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1 ' S

<210> 595 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> peptidico <223> Descrição da sequência artificial: motivo <400> 595 ASO; il e Leu Asp

I s

Leu A,sp Leu teu 507

<210> 596 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> peptidico <223> Descrição da sequência artificial: motivo <400> 596

Leu Thr tys teu Ser Lys *s!y Met Pbé 1 S

<210> 597 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> peptidico <223> Descrição da sequência artificial: motivo <400> 597

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<210> 598 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> peptidico <223> Descrição da sequência artificial: motivo <400> 598 599 508Leu asíi Arg Lm tys vai Leu lie teu1 ' 5 <210> <211> <212> <213> <220> <223> <400> <210> <211> <212> <213> <22 0> <223> <40 0> <210> <211> <212> <213> <22 0> <223> 9 PRT Sequência artificial Descrição da sequência artificial: motivo 599Asn Ala lie Ser Xle Bis Leu <*!y PheI S 600 9 PRT Sequência artificial Descrição da sequência artificial: motivo 600Lys Alâ Pro Glv Leu lie Pro Tyr Xle '1 '5 601 10 PRT Sequência artificial Descrição da sequência artificial: motivo peptidico peptidico peptidico 509 <400> 601 tyâ ργο ser Thr 6ln Leu pro Gly 1 $ Pro Tyr 10 <210> 602 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptidico <400> 602 Cys Pro Gly Leu Vai Asn as ri Pro 1 ' 5 Ser táet 1Ó <210> 603 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptidico <40 0> 603 Ser Pro Leu Thr Gly ser Ase í*@t: 1 5 Lys Tyr 1.Ô <210> 604 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> 510 510 peptidico <223> Descrição da sequência artificial: motivo <400> 604

In Thr Ser Tyr 10

Asn

I artificial <210> 605 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência <22 0> peptidico <223> Descrição da sequência artificial: motivo <400> 605

Ser Pro Vai Hfs Leu Gin Tyr Ser Met Tyr

1 5 ID

<210> 606 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> peptidico <223> Descrição da sequência artificial: motivo <400> 606

<210> 607 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> 511 <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptidico <400> 607 As η 1 Pr o Het Pro tys Léu Lys Va.1 5 Léu Tyr 10 <210> 608 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptidico <400> 608 Ser 1 pro Glv His Leu Asp Lys Lys S Glu Leu 10 <210> 609 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptidico <40 0> 609 Tyr ? 1 >ro Gly Ala His Glu Glu Leu S Lys teu m <210> 610 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial 512

<220> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptidico <400> 610 Cys Pr» xl e Pr» Cys Asn cys tys vai teu 1 5 10 <210> 611 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptidico <400> 611 Ser 1 Pr o Pr© Phe Ptm tys aly Ser 5 lie Leu 10 <210> 612 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptidico <4 0 0> 612 vai Pro Leu Ser vai teu ile Leu &1y Leu 1 5 10 <210> 613 <211> 10 <212> PRT 513 <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptídico <400> 613

Pra vai ser Asa l'l« Leu Asp Asp Leu 15 10

<210> 614 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptídico <400> 614

Phe Ser Lys Asn Arg Leu Lys vai Leu 1 S ' 10

<210> 615 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptídico <400> 615

Lys Ala Leu Hls Alá <*tu Pre Asp Tyr '1 5 10 <210> 616 <211> 10 514

<212> PRT <213> Sequência artificial <220> peptidico <223> Descrição da sequência artificial: motivo <400> 616

Arg Pro Arg Lys Vai Leu Vai Glu Gln Thr 1 ' S 10

<210> 617 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> peptidico <223> Descrição da sequência artificial: motivo <400> 617 l,e.u Ser Phe Gin Asp Ala Ser Ser L«y Tyr 1.5 10

<210> 618 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> peptidico <223> Descrição da sequência artificial: motivo <400> 618

Arf ser Pro Ser Phe 6ly Pro Lys Hís Leu 1 5- 10 <210> 619 515 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: motivo <400> 619 Glu 1 Ser lie cys Pfí s Thr Pro £Tõ Ϊ vai Tvr lo <210> 620 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Descrição da sequência artificial: motivo <40 0> 620 Asn 1 Ser vai Hí s uu Gin Tyr S Ser Met 10 <210> 621 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptídico peptídico peptídico <400> 621 516

Leu ser* Leu Leu Asn Aso Gly L«u Thr Wet 1 S 10 <210> 622 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptídico <400> 622 Glti teu Lys Leu Met Gl u Thr Leu Met Tyr I S 10 <210> 623 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptídico <400> 623 Asp Ala Lys «is Leu Sl« Arg Ser Leu Leu 1 5 10 <210> 624 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptídico 517 <400> 624

Leu pro Tyr ve.1 sly Phe Leu: S'1u His lie 1 5 10

<210> 625 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> peptidico peptidico <223> Descrição da sequência artificial: motivo <400> 625 ãsr Pr» Trp Asp Cys Ser cys Asp Leu Vai 1 5 10

<210> 626 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: motivo <400> 626

Vai ser âsr lie Lau as|> Asp teu Asp teu 1 ' 5' 10

<210> 627 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptidico 518 <400> 627 ile Lew tys $1« Asp Thr Ph« «is 6ty te« 1 S 10

<210> 628 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptidico <400> 628

Ltu Ala Gly Asn lie lie «is ser Leu wet 1 5 10

<210> 629 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptidico <400> 629 Mêt Pro tys teu tys Vai teu Tyr teu Asn 1 ' S 10

<210> 630 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> 519 <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptídico <400> 630 Asn Pro Arg fys Leu Ile Leu Ala €ly Aso i $ io <210> 631 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptídico <400> 631

Glri M«t. Arq Asp aso Ser Pr© Vai Bis Leu 1 " 5 10 <210> 632 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptídico <400> 632 Ala xle Lys Glu lie Leu Pro Gl y Thr phe 1 ' 5 10 <210> 633 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> 520 <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptídico <400> 633

Leu ser Lys Asp Tfsr Vai Thr Asp Asp Ile 1 5 10

<210> 634 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptidico <400> 634

Leu ser ser Aro Gly ser cys As» ser Leu 1 % 10

<210> 635 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptidico <400> 635

Tyr ser ser Leu Leu Ala cys lie ser Leu 1 5 ' 10

<210> 636 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> 521

<220> 521 <223> Descrição da sequência artifici <400> 636 Gl μ 1 Ser i.eu Pro Pro Aso lie 5 <210> 637 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artifici <400> 637 lie s 1 er Leu Ni s Sér Gl d Thr 5 <210> 638 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artifici <400> 638 Lys Ser Asμ teu Vai Glu Tyr 1 5 <210> 639 <211> 10 <212> PRT al: motivo peptídico

Phe Arg Phe 10 al: motivo peptídico

Pro Vai Leu 10 al: motivo peptídico

Phe Thr Leu 10 522 <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptidico <400> 639 Trp Ala tys asíi Cys 1 ' S » ASp LèU Leu ) Glπ Leu 20 <210> 640 <211 > 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptidico <4 0 0> 640 HÍS 1 Asn Leu Glu Tys a r teu Tyr teu s Gl u Tyr 20 <210> 641 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptidico <40 0> 641 1 Pro Pro Gl a Sei 1 r lie lie aly 5 Asp val 10 <210> 642 <211> 10 523

<212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptidico <400> 642

Asp Leu vai Glu ryr Phe Thr Leu Glu Met 1 5 10

<210> 643 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptidico <400> 643

Cys Asm Cys <*lu Glu Lys Asp Gly Thr Met '1 s ' 10

<210> 644 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptidico <400> 644 «et Pr© Thr Gin Thr Ser Tyr teu Met vai 1 5 10 <210> 645 524 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptídico <400> 645 Lys Asíi lie Ala eln Léu Gin Pro Asp Met I S 10 <210> 6 46 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptídico <400> 6 46 Arg Gly Asm Gin teu Gin Thr teu Pro Tyr 1 5 10 <210> 647 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptídico <400> 647 Arg Pro Phe sim teu Ser Leu teu Asn Asm 1 S 10 525 <210> 648 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptidico <400> 648 Vâl 1 L«Lí Vai Glu Gin Thr Lys Asn s Glu ryr 10 <210> 649 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptidico <40 0> 649 . 1 Asn cys Ala Lys fily iTe S Lys «et 10 <210> 650 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptidico <40 0> 650 526

Glíi Léu Lys Ala Leu Asn Ser Glu rle Leu 1 s 10

<210> 651 <211> 14 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> io toxóide <223> Descrição da sequência artificial: antigé tetânico ilustrativo <400> 651

Thr Glu

Gin Tyr Ilé Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile 1 ' 5 10

<210> 652 <211> 21 <212> PRT <213> Plasmodium falciparum <400> 652

Ser Vai Phê 15

Asp Tle Glu Lys Lys Ilé Alá Lys «et Glu Lys Ala Ser 1 5 10

Asn vai vai Asn ser 20

<210> 653 <211> 16 <212> PRT <213> Streptococcus sp. <400> 653 jly Ala Ala 15 cly Ala vai Asp ser xle Leu Gly sly Vai Ala Thr Tyr 1 S 10 527

<210> 654 <211> 13 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: epítopo peptidico <220> <221> MOD_RES <222> (3) <223> Qualquer aminoácido <400> 654

Ala Lys xaa vai Ala Ala Trp Thr teu Lys Ala Ala Ala 1 $ 10 <210> 655 <211> 231

<212> ADN <213> Homo sapiens <400> 655 g&txtg&taa gctttcaafg tfgcgctcct g&eaatgtat tagaagtcct gatggggata 60

gaactttgca. qttacaatjga atagggcâgâ aaggtcetgg aagttg&gtg gatggctttg 120 tlafãtaâgg tatcaaacct ggtgctttgg tgggtagttt tagaatggac gtggtcttag 180 ttgacatgcg actatcattt attgaagatg ttgctgccag atgtaatgat c 231 <210> 656 <211> 2555 <212> ADN <213> Homo sapiens 528 <220>

<221> CDS <222> (23)..(2545) <400> 656 529 txggatttea tcacatgaca at atg aag ctg tgg att cat ctc ttt tat tea 52 «et Lys teu Trp ile Mi* Leu rtia Tyr ser 1 5 10

tct ctc Ctt gee tgt ata tct tta cac tcc caa act cca ats etc tea 100 ser Leu Leu Ala Cys 15 ile Sér teu Hl 5 Ser 20 Gin Thr Pro val Leu 25 s«r tct aga ggc tct tgt gat tct ctt: tgc aat tgt gag gaa gat MC 148 Ser Arg Gly ser 10 cys Asp ser Leu cys 35 Asn cys 6ÍU Glu Lys 40 Asp Gly &Ci$ atg cta. ata aat tgt gaa gea aaa gm-fc ate aag atg gta tct gaa 196 Thr «et Leu 45 Ile Asn Cys Glu Ala 50 Lys Gly ile iys «et 55 Val ser Gltt ata agt ftg cca cca tea ega cct ttc caa cta age tta tta aat aac 244 ile Ser 60 vai Pro PfG ser M Pra Phe Gin Leu Ser 70 Leu Leu Asn ASfl qqc ttfl aeet atg ctt cac ata Thr aat gac ttt tct ββ0 ctt acc aat gct 292 *ã leu Thr «et Leu HÍS £0 Asn Asp Phe Ser £5 Gly Leu Thr Asn Ala 90 att tea âtâ cac ctt goa ttt a&e aat att gea gat att ap ata 340 Ile Ser Ile Mis teu 95 Gly Phe Asn Asn Ile 100 Alá Asp Ile Glu lie 105 Gly gea ttt a&t ggc ctt ggç ctc ctg aaa caa ctt cat ate aat cac aat 388 Ala Phe ASA tsfy 110 Leu oiy Leu Leu Lys 115 Gin Leu MIS ile Asn 120 MIS Asn tct tta ga& att ctt ãiâa qag gat acfc ttc cat gga ctg gaa Glu aac ctg 436 Ser Lee Glu 125 Ile Leu Lys Glu Asp 130 Thr Phe Mis cfy Leu 135 Asn Leu qaa ttt ctg caa gea qat aac aat tt« ate aca gtg val 150 att qaa cca agt 484 Slu phe 140 teu slu Ai a Asp Asn 145 Asn Phe lie Thr ile Glu PTC ser gee ttt agt Ser aag etc aac aga ctc aaa gtg tta att tta aat gae aat 532 Àla 155 Phe Lys Leu Asm ISO Arg Leu Lys Val Leu 165 Ile Leu Asn ASp Asn 170 gct att gag agt ctt cct cca aac ate ttc cga ttt qtt cct tta acc 580 Àla 11« Glu Ser Leu 175 Pra Pre Asn Ile Phe ISO Arg Phe Val Pra Leu 185 Thr cat ctã gat ctt tgt gga aat caa tta caa at d ttg cct tat gtt Ui 628 HÍS Leu A.sp Leu 190 Arg Gly Asn Gin Leu ias Gin Thr Leu Prn Tyr Vai 200 ttt ctc yaa cac att ggc cga ata ttg gat ctt cag ttg gag gac aac 676 Phe teu Gm 205 HÍS ile Gly Arg lie 210 Leu ASP Leu Gin L8U 215 Glu ASP aso aaa tqg gee tgc aat tgt gac tta ttg cag tta aaa act tgg ttg gag 724 Lys Trp 22Ò Ala Cys ASn Cys Asp 225 Leu Leu ç!n Leu Lys 230 Thr Trp Leu -GlU aac atg cct' cca cag tct ata att ggt gat gtt gtc tgt aac age cct M» «et Pr o Pro Gin ser lie lie Gly Asp vai vai Cys Asn ser Pr» ??2 530 530 215 249 245 250 CCâ Pr© ttt Phe ttt Phe a«a Lys gga ety 255 sgt Ser He etc Leu &gt Sêr aga Arg 260 cta Leu a^g Lyi aat| Lys qm. Gltí tet Ser 2Ϊ5 att 11© tgc Cys cct pr® set Thr CCà Fr© 270 cca Pr® 81 t«t Tyr asa gaa. 01 u filu 275 cat HÍS mg Glu gat. ASp cct pr© tea ser 280 gga GÍy tea str tta Leu cat H*ÍS ctg L«tí 28$ gea gea Ala Ala ata Thr tet Ser tea Ser 290 ata. ile aat Asn gat Asp Ãgt Sêr ege Arg 295 atg: Met tea Ser act Thr Lys acc Thr 300 acg Thr t«c ser att lie cta teu aaa lys 395 ct» Léu ecc Pro ate Thr »a» tys gea Ãla 310 cca Pr© mt Gly ttg Leu ata Ile cct tat Pr© Tyr 515 St V: Ile aca Thr aâg Lys tta Pf© 329 tçe ser att Thr c»a Gin ctt Leu CCS pr® 325 9a» Gly cct Pr© tac Tyr tgc cys cct Pro 330 att 11 £ cct· Pr® tgt cys aac Asn tgt S! â&s Lys stç vai eta Leu tcc Ser CCS pra 340 tea ser oga eiy Ctt Léu cta Leu ata lia 345 cat HtS tgt cys C»g si n <31 u ege Arg 33Ô aac Asn att tu @aa 61 u age Ser tta Leu m tea ser gat Atp ttg Leu aga Arg cct Pro 360 cct Pr© ceg Pro c&à tftít aat Mn cct Pr© 563 â«a aag Ar© tys et t Leu att lie ct» Leu 370 Aia gga ely aat Mn att: Tle att He 3?5 cac H1S agt ser tta Léu atg wet aag Lys 380 tet Ser gat ttâ aso Leu <ttg vai §m ía Li tat. Tyr ttc Phè set Thr ttg Leu g»a Glu atg Met Ctt: Lêu eac HlS ttg Leu 385 390 sa» Giy 395 a&c A5© aat Asn tgt Arg att ile gaa Glu 400 gtt v«r ctt gaa gaa Leu Glu gÍu gga Uí rrn Ser ttt Phe atg mx. aac AíJft Cta Leu 410 acu Thr âgà A rg tta teu cas Cl n &·&·& Lys 415 etc Leu tat Tyr tta Leu ast Aon OS* á aac Asn cac- H1s <t9 Leu acc Thr aaa Lys 42 S tta Leu agt aèr aa« tys 9§c Gly atg Met 439 ttc Phe ctt teu ggt «*1 y ctc Leu eat HTS 435 aat Asn ctt Leu qaa Gltt tac Tyr tta Leu: 440 tat Tyr ctt Leu $&& è-lu tac Tyr ast Mn 445 SIS att He a&g ly$ gaa clu ata He 450 Cts Leu cea Pr® 99» 61 y ate Thr ttt Phe 4S5 aat Asn c:ca Pra atg «et cct: Pr© aaa Lys 460 ctt teu gtc v«1 etg Leu tat Tyr 465 tta Jv&UÍ aat Aan ase A-sn aac Asn ctc Leu 470 ctc. Leu ca a $1 fl: gtt val tts. teu cca Pr» 475 eca Pr® cat «is att Xl© ttt Phe te» ser 480 Ify gtt val cct Pró et» teu act Thr 485 Lys gt» vai aat Asn ctt: Leu aaa Lys 499 aea Thr saac ASfi cag Gin ttt Phé ate Thr 495 cat Hl s ct« t.su cct pro gta V&l agt ser 500 aat Asn att Ile ttg LQit gat Mp ga:t ÃSp SOS ctt Leu gat Asp tta Leu et» Leu aee Thr 510 cag Gin att lio gae Asp ctt Leu gag gat GtIU A^p 5.1.5 aac Asn ccc Pr© tgg irp S« ASO 520 tgc cys tcc ser tgt Cys pac Mp ctg t,eu 525 gtt vai gga Gly ctg Leu cag çlh esâ tgg Gin Tro 530 ata Ile cáa Cln ã-cLÇI Lys tta Leu 535 age ser aa>3 Lys aàC Asn ct<$ Thr 3t§ Vai 540 sca Thr qat Àsp gac ASp ate lie etc Leu 545 tgc Cys act Thr tcc ser ccc Pr® I cat Hl 5 ctc Leu gac ASp aa» Lys 16 64 mo

Me 9X6 964 1012 XO 69 1108 1X66 X204 1252 1300 1348 .096 1444 1492 15:40 1588 1636 531 aag Lys sts gas elo ctg Leu aaa Lys gee Ala et a Léu 560 aat ASO agt gaã Ser Glu att ile ctc Léu 565 tgt cca Cys Pre ggt Gly tta Leu 91* val 570 1732 aat Aso aac aso CCS Pr© ttc ser atg «et 575 CCS pro aca Thr cag 01 n act Thr agt tac Ser Tyr S69 ctt Leu atg «et gtc Val acc Thr sss act Thr 1.780 ect Pro gça Ala aca Thr aca Thr S90 aca Thr «at aso acg Thr gct Ã1« gat: ASp 595 act: Thr att Ile tta cga Leu Arg tet Ser 600 ctt Leu acg Thr 1828 8<1c Asp get Ala gtg vas 605 CCS Pra ctg teu tet Ser gtt vai cta teu 610 ata Ile ttg Leu gga Gly ctt Leu ctg Leu 6X5 att xle atg «et ttc Phe 1876 ate lia act Thr CIO att gtt lie vai ttc phe tgt Cys «« Ala 625 gea ggg Ãla Gly ata ile 9tg vai gtt vai 630 Ctt Leu gtt val ctt Leu cac kí s 1924 cot: Arg 635 agg Are ag« Arg â§& Apés tac Tyr aaa Lys 640 aag Lys aaa Lys caa 61« gta vai g«t ASp 645 gag caa 61u cln atg «et aga gac Arg Asp 650 1972 aac ASO agt ser cct ΡΠ3 «*9 val cat Hl S 655 ctt Leu cag íiln tac Tyr age ser atg tat «et Tyr 660 ggc <;1y cat Mis âáã. acc act Lys Thr Thr 665 2020 cat HÍ3 cac HÍS act Thr act Thr 670 gaa çlu aga Arg ccc Pr» tet ser gçc Ala 675 tea Ser ctc Leu tat gaa Tyr 01u caq Gin 680 cac nis atg Met 2068 vaf age sêr ccc Pro 685 «to «efc gtt vai cat HTS qtc Vai tat Tyr 690 aga Arg agt ser cca Pro tc<: ser ttt Phe 69S got síy cca aag Pru Lys 2116 cat hi s ctg Leu 700 gaá Cl U ‘3 «3 Glu gaa Clu aaa Glu 9*3 Glu 705 *99 Arg sat As ti 9*9 GlU aaa Lys gaa GlU 710 gga Gly agt Ser gat gea Asp Ala 2164 «as. Lys 715 c at Kfs çXq. Ltett caa Slfl: aga Arg agt ser 720 ctt Leu ttg Leu gaa C.ÍU Gin gaa gH· 725 aat Aà« cat Hls tea Ser cca prt> ctc Leu 730 2212 «ca Thr ggg cty tea Ser a&t Aâffi atg Met 735 s.aâ Lys tac ryr aaa Lys acc Thr acg Thr 740 aac ASO caa cln tea Ser aca Thr gaa Glu 745 ttt Phe 2260 tta i. eu tcc Ser ttc Phe c&a do ?S9 «at Àsp 9CC Ala age ser tea ttg Ser Leu 755 tac aga Tyr Arg ase Asn att ile tta Leu 769 gaa Glu asa Lys 2306 gaa Cl·. Arg gaa Cl« 7S5 ctt: Leu cag Gin caa Gl n ctg Leu 9m Gty 770 ate Ile aca Thr g&a Glu tac Tyr eta Leu 775 agg Arg aaa Lys aac Asn 2356 att ils qct Ala 780 esq Gin ctc Leu cag íiln CCT pro gat Ase 785 atg gag «et alu gea Ãla cat hIs tat Tyr 790 cct ΡΠ5 «B» C»1y gee Ala cac His 2404 gaa ela 79 S i SQ Clu ctg Lf;U a&g Lys tta teu atg «et 800 gaa Glu aca Thr tta Leu atg «et tac Tyr 805 tea cgt ser Arg cca Pro agg Arg aag Lys 810 2452 qta val tta l«u gtg vai gsa cia eag Glrs 8X5 aca Thr aa« Lys aat gag Asn Glu tat Tyr 820 ttt phe Ctt Leu aaã Lys gct Ala 825 aat Asn 2500 tta Leu cat «í s gct Ala gaa Glu: 830 cct Prts gac ASp tat Tyr tta Leu gaa GÍ« 835 gtc vai ctg Leu GlU cag Gin caâ aca Gin Thr 840 2545 tágattjgsga 2555 532

<210> 657 <211> 841 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 657 533

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<210> 671 <211> 24 <212> ADN <213> Sequência artificial <2 2 0> <223> Descrição da sequência artificial: iniciador <400> 671 ataagctttc aatgttgcgc tcct 24

<210> 672 <211> 24 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: iniciador <400> 672 tgtcaactaa gaccacgtcc attc 24

<210> 673 <211> 4 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> 548 <223> <400> <210> <211> <212> <213> <22 0> <223> <40 0> <210> <211> <212> <213> <220> <223> <400> <210> <211> <212>

Descrição da sequência artificial: motivo peptídico 673 aso Ãs:p St>r Arg 1 674 4 PRT Sequência artificial

Descrição da sequência artificial: motivo peptidico 674

Asr* Thf Arg I 675 4 PRT Sequência artificial

Descrição da sequência artificial: motivo peptidico 675

676 4 PRT

Asm ser Thr <213> Sequência artificial <220> 549 <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptidico <400> 676 L.ys Lys Glu ser 1 '

<210> 677 <211> 4 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptidico <400> 677

Thr vai xle 1

<210> 678 <211> 4 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptidico <400> 678

Thr Kis leu Asp 1

<210> 679 <211> 4 <212> PRT 550 <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptidico <400> 679

Thr Trp Leu Gtu

I

<210> 680 <211> 4 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptidico <400> 680

Ser Ilê Asn Àsp 1

<210> 681 <211> 4 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptidico <400> 681

Ser teu sar <210> 682

I 4 551 <211> <212> <213> <220> <223> <400> <210> <211> <212> <213> <22 0> <223> <40 0> <210> <211> <212> <213> <22 0> <223> <40 0> PRT Sequência artificial

Descrição da sequência artificial: motivo peptídico 682

Thr 1 €ΐη IIe Asp 683 4 PRT Sequência artificial

Descrição da sequência artificial: motivo peptídico 683

Thr Vai Thr Asp 2 684 4 PRT Sequência artificial

Descrição da sequência artificial: motivo peptídico 684

Ser teu Thr Asp 2 552

<210> 685 <211> 4 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptídico <400> 685 Sèr Leu Tyr Glu

X

<210> 686 <211> 4 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptídico <400> 686 ser t©« L.eu Glu 1

<210> 687 <211> 4 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptídico <400> 687 553 553 1

Ser í%e Gin Asp

<210> 688 <211> 4 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptídico <400> 688

Thr tys Aso Glu 1

<210> 689 <211> 8 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptídico <400> 689

Lys teu Met l <210> 690 <211> 6 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> 554 <223> <400>

Descrição da sequência artificial: mot ivo peptidico 690

Gly Ser Cys Asp ser teuI '5 <210> <211> <212> <213> <22 0> <223> <40 0> 691 6 PRT Sequência artificial

Descrição da sequência artificial: mot ivo peptidico 691

Gly Leu Thr Asπ Ala lie 1 S <210> <211> <212> <213> <22 0> <223> <40 0> <210> <211> <212> <213> 692 6 PRT Sequência artificial

Descrição da sequência artificial: mot ivo peptidico 692 &'1y Ala Fhe Asn Gly Leu I 5 693 6 PRT Sequência artificial <220> 555 <223> <400>

Descrição da sequência artificial: motivo peptidico 693 <210> <211> <212> <213> <220> <223> <400> <210> <211> <212> <213> <220> <223> <400>

Ser lie Leu Ser Arg i 5 694 6

PRT

Sequência artificial

Descrição da sequência artificial: motivo peptidico 694

Glv ser f*be Ust Asn Léu

1 S 695 6

PRT

Sequência artificial

Descrição da sequência artificial: motivo peptidico 695

Gly Asn LéU Thr Lys <210> <211> 6 9 6 6 556 556 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: <400> 6 96 Gly Met Leu Gly Leu 1 '$ <210> 697 <211> 6 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: <400> 697 Gly Vai Pro Leu Thr Lys 1 5 <210> 698 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: <400> 698 gIm Tyr Asn Alá lie lys Glu I 1 s peptídico peptidico peptídico 557 <210> 6 9 9 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial : motivo peptidico <400> 6 9 9 Ml 5 ;i Tyr Pr» Gly àl & Hl s Gl y S Glu teu <210> 700 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Descrição da sequência artificial : motivo peptidico <40 0> 700 Glu Tyr Phe Glu 1 teu tys Ala 5 ' Asrt teu <210> 701 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Descrição da sequência artificial : motivo peptidico <40 0> 701 558

Met Tvr Ser Arg Pro Arg Lys Vai teu 1 ' 5

<210> 702 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> peptidico peptidico <223> Descrição da sequência artificial: motivo <400> 702

Phe Tyr ser ser Lm Lm Ala cys ile + I * $

<210> 703 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Descrição da sequência artificial: motivo <400> 703

Tyr Phe Thr Leu sl» Leu Hls Leu

1 S

<210> 704 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptidico 559 <400> 704

Glu Phe teu €ln: Ala Asp asa Asn phe 1 „ S

<210> 705 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> peptidico <223> Descrição da sequência artificial: motivo <400> 705 tys Vai teu ivr teu asa asa Asn teu 1 5

<210> 706 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> peptidico <223> Descrição da sequência artificial: motivo <400> 706

Arg Asm xle çlu Ser teu Ser Sl« teu 1 S

<210> 707 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> 560 <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptídico <400> 707

Arq Ser Leu Tihr I

Asp Ala Vãl Pro Leu 5

<210> 708 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência <400> 708 tys 1 vai Leu ser <210> 709 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência <400> 709 Lys ' 1 teu Pro Thr <210> 710 <211> 9 <212> PRT artificial: motivo peptídico

Pro Ser g! y Leu teu5 artificial: motivo peptídico

Lys Ais Pr o teu 561 <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptidico <400> 710 Ly.$ Tyr Lys Thr Thr asíi Gin Ser Thr 1 5 <210> 711 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptidico <40 0> 711 Ser Tyr Leu m&t Vai Tbr Thr Pro Ala 1 $ <210> 712 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptidico <40 0> 712 Lys Leu Tyr Leu Asm Slu Aso His Leu 1 5 <210> 713 <211> 9 562 <212> <213> <220> <223> <40 0> <210> <211> <212> <213> <220> <223> <400> <210> <211> <212> <213> <220> <223> <400> <210> PRT Sequência artificial

Descrição da sequência artificial: motivo peptidico 713 Val Tyr <*1u <*1tJ His elu Asp Pro Ser1 5 714 9 PRT Sequência artificial

Descrição da sequência artificial: motivo peptidico 714 Gly pfie teu Glu His ile sly Arg ile1 S 715 9 PRT Sequência artificial

Descrição da sequência artificial: motivo peptidico 715 sIm Tyr Leu Tyr uew <»1u Tyr Asrt Ala I ‘ 5 716 563 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: motivo <400> 716 Leu Asti Asn Asn ..eu Leu Gin Vál Leu 1 s <210> 717 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: motivo <400> 717 Gin 1 Gin teu Gly Ele Tbr Glu Tyr 5 Leu <210> 718 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptídico <400> 718 564

Phe Lèu Glu Bis lie Gly Aro lie teu 1 5 <210> 719 <211 > 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptídico <4 0 0> 719 Leu Ser Vai L£u lle Leu Gly Leu Leu i S <210> 720 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptídico <400> 720 Leu fhr Asn Ala fie Ser fie Hls Leu 1 S <210> 721 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptídico 565 <400> 721

Lys Asm Thr vai Thr Asp Asp lie teu I S

<210> 722 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> peptidico <223> Descrição da sequência artificial: motivo <400> 722

Lys Trp Ala cys Asm Cys Asp Leu teu 1 5

<210> 723 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> peptidico <223> Descrição da sequência artificial: motivo <400> 723

Asm lie teti Glu Lys 61 u Arg 6ly Leu I 5

<210> 724 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> 566 <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptídico <400> 724

<210> 725 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptídico <400> 725

Gly teu Gln Gln Trp He Gin Lys teu 1 5

<210> 726 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptídico <400> 726

Leu Tyr Leu Asn Glv âsn His Leu Thr 1 S

<210> 727 <211> 9 <212> PRT 567 <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptídico <400> 727 pto tyr Vai tjly Phe Leu iSlu Hls Ik 1 5

<210> 728 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptídico <400> 728

Lys vai A.srí Leu Lys Thr Asn 6In: Phe 1 ‘5

<210> 729 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptídico <400> 729

Asr* Gly Lay Gly teu téu Lys Gin Leu 1 5 <210> 730 <211> 9 568 <212> PRT <213> Sequência art i ficial <220> <223> Descrição da s equência <400> 730 çln 1 Thr teu Pro <210> 731 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência art i ficial <220> <223> Descrição da s equência <400> 731 His ísly Leu elu 1 <210> 732 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência art i ficial <220> <223> Descrição da s equência <400> 732 ASp Leu Leu Gin

Tyr Vai <5ly Phe teu

Lys Thr Trp Leu <210> 733 569

<211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> peptidico <223> Descrição da sequência artificial: motivo <400> 733

Asp Phe ser $]y teu Thr A$r* Ala lie I S

<210> 734 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> peptidico <223> Descrição da sequência artificial: motivo <400> 734

<210> 735 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> peptidico <223> Descrição da sequência artificial: motivo <400> 735 570

Asn Ser Slu lie Leu Cys pro Gly Leu I s <210> 736 <211> 9

<212> PRT

<213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptidico <400> 736 Asr» lie Leu Asp A$p Leu Asp Leu Leu 1 § <210> 737 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptidico <40 0> 737 Ser A.sh lie Leu Asp Asp tm Asp Leu t 5 <210> 738 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptidico 571 <400> 738

Ala €ys Asπ Cys Asp Leu ta« Trp Leu 1 ‘ $

<210> 739 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptídico <400> 739

Lm Leu Asn Asn Gly teu Thr Net Leu 1 5

<210> 740 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptídico <400> 740

Ala vai Pró Leu ser vai Leu lie Leu

1. S

<210> 741 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> 572 <223> <400>

Descrição da sequência artificial: motivo peptidico 741

Prq Leu

MiS L«U

Leu <210> <211> <212> <213> <220> <223> <400> 742 9 PRT Sequência artificial

Descrição da sequência artificial: motivo peptidico 742 s Slís Glu Asrt 11« alu ser teuÍ s <210> <211> <212> <213> <22 0> <223> <40 0> 743 9 PRT Sequência artificial

Descrição da sequência artificial: motivo peptidico <210> <211> 743 Thr Thr Glu Arq Pr o Ser Ala Ser teu 1 " . S 744 9

<212> PRT 573 <213> Sequência artificial <2 2 0> peptidico <223> Descrição da sequência artificial: motivo <400> 744

S«r Leu Leu Ala Cys lie ser Leu 1 S

<210> 745 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> peptidico <223> Descrição da sequência artificial: motivo <400> 745

Thr Thr Asn Thr Ala Asp Thr lie Leu 1 $

<210> 746 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> peptidico <223> Descrição da sequência artificial: motivo <400> 746

Gly Val Pro Leu Thr Lys vai Asn Leu 1 5 <210> 747 574

<211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptídico <400> 747

Leu <3ly Le« «ris As π teu ely Tyr Leu I 5

<210> 748 <211> 6 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Descrição da sequência artificial: β-His tag <400> 748

HÍS HlS «IS Hl$ HlS H1S l s

<210> 749 <211> 4 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: motivo peptidico <400> 749 575 LVS Asp Glu Leu ' 1

<210> 750 <211> 24 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: oligonucleótido sintético <400> 750 gattacaagg atgacgacga taag 24 576

REFERÊNCIAS CITADAS NA DESCRIÇÃO A presente listagem de referências citadas pela requerente é apresentada meramente por razões de conveniência para o leitor. Não faz parte da patente de invenção europeia. Embora se tenha tomado todo o cuidado durante a compilação das referências, não é possível excluir a existência de erros ou omissões, pelos quais o IEP não assume nenhuma responsabilidade.

Patentes de invenção citadas na descrição wo 9733602 A, Chesn us 4640835 A [0092] us 4496689 A [0092] us 4301144 A [0092] us 4670417 A [0092] us 4791192 A [0092] us 4179337 A [0092] us 5428130 A [0093] wo 9824893 A, Kuche us 6162963 A [0112] us 6150584 A [0112] us 6114598 A [0112] us 4736866 A [0120] us 4870009 A [0120] us 5837501 A [0130] us 5382510 A [0140] us 5952170 A [0140] us 5955280 A [0150] us 5925523 A [0150] us 5846722 A [0150] us 6004746 A [0150] 577 us 5723286 A us 5733731 A us 5928868 A us 6146635 A us 5962428 A us 5580859 A us 5589466 A us 5804566 A us 5739118 A us 5736524 A us 5679647 A wo 9804720 A us 5922687 A us 4722848 A wo 9324640 A us 5279833 A wo 9106309 A us 5204253 A wo 9507707 A us 4235871 A us 4501728 A us 4837028 A us 5019369 A us 5840501 A us 5939533 A us 5919652 A wo 9420127 A wo 9403205 A GB 2211504 A EP 071016935 EP 019643451 [0152] [0152] [0154] [0163] [0163] [0164] [0192] [0164] [0192] [0164] [0164] [0164] [0164] [0164] [0164] [0166] [0198] [0198] [0198] [0201] [0205] [0224] [0224] [0224] [0224] [0234] [0234] [0241] [0322] [0322] [0464] A [0514] A [0514] 578 US 0126276 W [0514] US 60227098 B [0514]

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Claims

1 REIVINDICAÇÕES 1. Proteína para utilização no tratamento de cancro da bexiga, em que a proteína provoca uma resposta imune contra uma célula de cancro da bexiga que expressa uma proteína, em que a proteína compreende uma sequência idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 657, em que o medicamento é proporcionado ao sistema imune do mamífero e em que é provocada a resposta imune contra a referida célula de cancro da bexiga que expressa a proteína.

2. Proteína para utilização no tratamento de cancro da bexiga de acordo com a reivindicação 1, em que o medicamento expõe o sistema imune do mamífero à proteína.

3. Proteína para utilização no tratamento de cancro da bexiga de acordo com a reivindicação 2, em que a resposta imune compreende a célula apresentadora de antigénio que apresenta um antigénio obtido a partir da sequência de aminoácidos idêntica à sequência da SEQ ID NO: 657 para gerar uma resposta imune humoral.

4. Proteína para utilização no tratamento de cancro da bexiga de acordo com a reivindicação 2, em que a resposta imune compreende a célula apresentadora de antigénio que apresenta um antigénio obtido a partir da sequência de aminoácidos que é idêntica à sequência da SEQ ID NO: 657 para gerar uma resposta imune mediada por células.

5. Composição imunogénica para utilização no tratamento de cancro da bexiga provocando uma resposta imune contra 2 uma célula de cancro da bexiga, a qual compreende um veículo farmaceuticamente aceitável e uma proteína ou um ácido nucleico que codifica a proteína, em que a proteína compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 657 e é expressa pela referida célula de cancro da bexiga, em que a resposta imune é eficaz para inibir o crescimento de células cancerígenas.