PT1876236E - Anticorpos para substituição da função do factor de coagulação sanguínea viii - Google Patents

Description

ΕΡ 1 876 236/ΡΤ

DESCRIÇÃO "Anticorpos para substituição da função do factor de coagulação sanguínea VIII"

Campo do Invento 0 presente invento refere-se a anticorpos biespecificos que substituem funcionalmente o factor de coagulação VIII, um cofactor que aumenta reacções enzimáticas, métodos para a produção de tais anticorpos, e composições farmacêuticas compreendendo um tal anticorpo como um ingrediente activo.

Antecedentes da Técnica

Os anticorpos são altamente estáveis no sangue e têm baixa antigenicidade; portanto, têm atraído muita atenção como produtos farmacêuticos. Os anticorpos biespecificos, isto é, anticorpos que podem reconhecer dois tipos de antigénios simultaneamente, encontram-se entre estes anticorpos. Os anticorpos biespecificos foram propostos há algum tempo. No entanto, até à data, os únicos anticorpos biespecificos relatados na literatura são aqueles em que dois tipos de locais de ligação ao antigénio são meramente ligados entre si, tais como os destinados para redireccionamento de células NK, macrófagos, e células T (Documento sem ser de Patente 3). Por exemplo, MDX-210, um anticorpo actualmente em fase de investigação clinica, é um anticorpo biespecífico que apenas redirecciona monócitos expressando FcyRI e semelhantes contra células de cancro expressando HER-2/neu. Assim, até agora, não houve exemplos de anticorpos biespecificos utilizados como substitutos funcionais de cofactores que aumentam reacções enzimáticas.

Um cofactor é uma molécula auxiliar necessária para que uma enzima seja funcional, e um componente proteico ou não proteico que se liga a uma enzima e é necessário para a sua actividade catalítica. Exemplos de cofactores proteicos incluem, mas não estão limitados a, factor de coagulação VIII (F. VIII), factor de coagulação VIII activado (F. VlIIa), factor de coagulação V (F. V), factor de coagulação V activado 2 ΕΡ 1 876 236/ΡΤ (F. Va), factor tecidular (TF), trombomodulina (TM), proteína S (PS), proteína Z (PZ), heparina, complemento C4b, factor regulador do complemento H, proteína cofactor membranar (MCP), e receptor do complemento 1 (CRI).

Entre estes, F. VIII/F. VlIIa é um cofactor necessário para suficiente expressão da actividade do factor de coagulação IX activado (F. IXa) . Utilizando ensaios cromogénicos, Scheiflinger F., et al. verificaram que um certo tipo de anticorpo anti-F. IX/F. IXa pode aumentar a activação do factor de coagulação X (F. X) através de F. IXa (Documento de Patente 1) . No entanto, as medidas da recuperação da coagulação em plasma deficiente em F. VIII mostraram que não era observada recuperação da coagulação quando este anticorpo era adicionado sozinho; em vez disso, era observada recuperação da coagulação apenas quando F. IXa era adicionado exogenamente.

Sabe-se que F. VlIIa interage não só com F. IXa como também com F. X (Documentos sem serem de Patente 1 e 2) . A este respeito, o anticorpo de Scheiflinger F. et al. não substituiu suficientemente funcionalmente F. VIII/F. VlIIa, e a sua actividade é também estimada ser insuficiente.

[Documento de Patente 1] WO 01/19992 [Documento sem ser de Patente 1] Mertens. K. et al., Thromb. Haemost., 1999, Vol. 82, pág. 209-217 [Documento sem ser de Patente 2] Lapan, KA et al., Thromb. Haemost., 1998, Vol. 80, pág. 418-422 [Documento sem ser de Patente 3] Segai DM et al., Journal of Immunological Methods, 2001, Vol. 248, pág. 1-6

Divulgação do Invento [Problemas a Resolver pelo Invento]

Um objectivo do presente invento é proporcionar anticorpos biespecíficos que substituem funcionalmente o factor de coagulação VIII, um cofactor que aumenta reacções enzimáticas.

[Meio para Resolução dos Problemas] 3 ΕΡ 1 876 236/ΡΤ

Após dedicada investigação, os presentes inventores descobriram vários anticorpos biespecificos que se ligam especificamente tanto a F. IX/F. IXa como a F. X, e substituem funcionalmente F. VlIIa, mais especificamente, têm funções de cofactor para aumentar a activação de F. X através de F. IXa.

Destes anticorpos, os presentes inventores seleccionaram ainda um anticorpo (A44/B26) que reduziu o tempo de coagulação em 50 segundos ou mais em comparação com o observado quando não era adicionado qualquer anticorpo a um sistema de medição do tempo de coagulação utilizando soro humano deficiente em F. VIII. Os presentes inventores utilizaram então este anticorpo para produzir uma cadeia L comummente partilhada através da ligação das suas cadeias H com as cadeias L de A44. Como resultado, os presentes inventores mostraram que o anticorpo de cadeia L comummente partilhada pode ser produzido com A44L; no entanto, a actividade deste anticorpo era atenuada em comparação com a actividade do anticorpo biespecífico inicial (A44HL-B26HL).

Além disso, as CDR derivadas da cadeia L de A44 e da cadeia L de B26 foram combinadas com a estrutura (Fr) derivada da cadeia L de A44 para produzir cadeias L híbridas, e estas cadeias L foram utilizadas para produzir anticorpos comummente partilhados visando a recuperação da actividade de F. VIII. Como resultado, quando a combinação de CDR1, 2 e 3 era BBA(G) (CDR1, 2 e 3 eram a CDR derivada da cadeia L de B2 6, a CDR derivada da cadeia L de B26, e a CDR derivada da cadeia L de A44, respectivamente) , a actividade de F. VIII era significativamente aumentada em comparação com a actividade observada com A44/B26. Além disso, o tempo de coagulação foi reduzido em 70 segundos ou mais em comparação com o observado quando não foi adicionado anticorpo. Este anticorpo não atenuou as funções de F. VIII (0,1, 1 U/ml) , e, de facto, actuou de forma aditiva. Além disso, quando CDR1, 2, e 3 era ABA(G) ou BBA(G), os seus tempos de coagulação eram reduzidos em 60 segundos ou mais em comparação com o observado quando não era adicionado qualquer anticorpo.

Quando as cadeias H dos anticorpos A50 e A69, que são altamente homólogos a A44, foram combinadas com B2 6H e as cadeias L híbridas acima mencionadas, e as suas actividades 4 ΕΡ 1 876 236/ΡΤ foram avaliadas, foram obtidos anticorpos que têm actividades mais elevadas que aquelas com A44H. Além disso, quando foram produzidas cadeias L híbridas combinando as CDR de A44L, B26L, A50L, e A69L e as suas actividades foram examinadas, foram obtidos anticorpos altamente activos; no entanto, nenhum excedeu a actividade da cadeia L híbrida derivada de A44/B26 (BBA(G) ) .

Quando várias cadeias L híbridas (BBA, aAA, AAa, ABa, BBa, aBA, BAA, BAa, e ABA) ) foram combinadas com A69H e B2 6H e as suas actividades foram avaliadas, foram obtidos anticorpos altamente activos, e, particularmente no caso da combinação BBA ou BBa, o tempo de coagulação foi reduzido em 80 segundos ou mais em comparação com o observado quando não foi adicionado qualquer anticorpo.

Quando a humanização destes anticorpos foi ainda examinada, foi alcançada uma actividade igual à dos anticorpos originais através da combinação de (1) A69H humanizado, (2) B26H humanizado, e (3) cadeias L híbridas humanizadas.

Assim, tal como descrito acima, os presentes inventores conseguiram produzir anticorpos biespecíficos altamente activos que substituem funcionalmente o factor de coagulação VIII, e deste modo completaram o presente invento. O presente invento proporciona também métodos para recuperação ou aumento das actividades destes anticorpos, que diminuíram devido a cadeias L comummente partilhadas de cada anticorpo.

Isto é, o presente invento refere-se a anticorpos biespecíficos que substituem funcionalmente o factor de coagulação VIII, um cofactor que aumenta reacções enzimáticas, métodos para produção de tais anticorpos, e métodos para recuperação ou aumento das suas actividades que diminuíram devido às cadeias L comummente partilhadas de cada anticorpo. Mais especificamente, o presente invento proporciona: [1] Um anticorpo biespecífico que pode substituir funcionalmente o factor de coagulação VIII e que tem a actividade de aumentar a activação do factor X, que compreende: 5 ΕΡ 1 876 236/ΡΤ um primeiro dominio reconhecendo o factor de coagulação IX e/ou o factor de coagulação IX activado; e um segundo dominio reconhecendo o factor de coagulação X, em que o primeiro dominio compreende um primeiro polipéptido compreendendo a cadeia H de um anticorpo contra o factor de coagulação IX e/ou factor de coagulação IX activado; o segundo dominio compreende um segundo polipéptido compreendendo a cadeia H de um anticorpo contra o factor de coagulação X; e o primeiro e segundo domínios compreendem ambos um terceiro polipéptido compreendendo uma cadeia L comummente partilhada de um anticorpo contra o factor de coagulação IX, factor de coagulação IX activado, ou factor de coagulação X, em que o terceiro polipéptido compreende um local de ligação ao antigénio compreendendo CDR1, 2, e 3 seleccionadas individualmente a partir de CDR1, 2, e 3 de cada cadeia L de dois ou mais anticorpos; [2] 0 anticorpo biespecífico de [1], em que o primeiro polipéptido compreende um local de ligação ao antigénio compreendendo as sequências de aminoácidos das CDR de (al), (a2), ou (a3), e o segundo polipéptido compreende um local de ligação ao antigénio compreendendo as sequências de aminoácidos de (b), em que: (al) a CDR1, 2, e 3 da cadeia H compreende as sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 3, 5, e 7, respectivamente; (a2) a CDR1, 2, e 3 da cadeia H compreende as sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 21, 5, e 22, respectivamente; (a3) a CDR1, 2, e 3 da cadeia H compreende as sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 16, 17, e 18, respectivamente; e (b) a CDR1, 2, e 3 da cadeia H compreende as sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 26, 28, e 30, respectivamente.

[3] O anticorpo biespecífico de [1] que reconhece o factor de coagulação IX e/ou factor de coagulação IX activado, e o factor de coagulação X, em que a função substitutiva do factor de coagulação VIII é reduzir o tempo de coagulação em 50 segundos ou mais em comparação com o tempo de coagulação observado na ausência de um anticorpo num teste de tempo de tromboplastina activada parcial (APTT) que envolve o aquecimento de uma solução mista de 50 μΐ de solução de anticorpo, 50 μΐ de plasma deficiente em F. VIII (Biomerieux) , e 50 μΐ de reagente de 6 ΕΡ 1 876 236/ΡΤ ΆΡΤΤ (Dade Behring) a 37°C durante 3 minutos, a adição de 50 μΐ de CaCÍ2 20 mM à solução mista, e depois a medição do tempo de coagulação.

[4] Uma composição compreendendo o anticorpo de qualquer uma de [1] a [3], e um transportador farmaceuticamente aceitável.

[5] Uma composição farmacêutica compreendendo um transportador farmaceuticamente aceitável e o anticorpo de qualquer uma de [1] a [3], para utilização em prevenção e/ou tratamento de hemorragia, uma doença acompanhando hemorragia, ou uma doença causada por hemorragia, em que a hemorragia, a doença acompanhando hemorragia, ou doença causada por hemorragia é uma doença que se desenvolve e/ou progride devido à redução ou deficiência na actividade do factor de coagulação VIII e/ou factor de coagulação VIII activado.

[6] Utilização do anticorpo de qualquer uma de [1] a [3] para produção de uma composição farmacêutica contendo um transportador farmaceuticamente aceitável para prevenção e/ou tratamento de hemorragia, doença acompanhando hemorragia, ou doença causada por hemorragia, em que a hemorragia, doença acompanhando hemorragia, ou doença causada por hemorragia é uma doença que se desenvolve e/ou progride devido a redução ou deficiência na actividade do factor de coagulação VIII e/ou factor de coagulação VIII activado.

[7] A composição para utilização de [5] ou a utilização de [6], em que a doença que se desenvolve e/ou progride devido a redução ou deficiência na actividade do factor de coagulação VIII e/ou factor de coagulação VIII activado é hemofilia A.

[8] A composição para utilização de [5] ou a utilização de [6], em que a doença que se desenvolve e/ou progride devido a redução ou deficiência na actividade do factor de coagulação VIII e/ou factor de coagulação VIII activado é uma doença envolvendo o aparecimento de um inibidor contra o factor de coagulação VIII e/ou factor de coagulação VIII activado.

[9] A composição para utilização de [5] ou a utilização de [6], em que a doença que se desenvolve e/ou progride devido a redução ou deficiência na actividade do factor de coagulação VIII e/ou factor de coagulação VIII activado é hemofilia adquirida.

[10] A composição para utilização de [5] ou a utilização de [6], em que a doença que se desenvolve e/ou progride devido a redução na actividade do factor de coagulação VIII e/ou factor de coagulação VIII activado é a doença de von Willebrand. 7 ΕΡ 1 876 236/ΡΤ [11] Um estojo compreendendo pelo menos o anticorpo de qualquer uma de [1] a [3], ou a composição de [4].

[12] 0 estojo de [11] compreendendo ainda factor de coaqulação VIII .

Breve Descrição dos Desenhos A Fig. 1 é um diagrama mostrando uma região de inserção de pcDNA4-g4H. A Fig. 2 é um diagrama mostrando uma região de inserção de pcDNA4-g4L e pIND-g4L. A Fig. 3 é um diagrama mostrando uma região de inserção de pIND-g4H. A Fig. 4 mostra os resultados da medição da actividade semelhante a F. VlIIa de anticorpos biespecificos anti-F. IXa/anti-F. X, que foram preparados utilizando o anticorpo anti-F. IXa XB 12 e os anticorpos anti-F. X SB04, SB21, SB42, SB38, SB30, SB07, SB05, SB06, e SB34. As concentrações das soluções de anticorpo são 10 pg/ml (concentração final de 1 pg/ml). Como resultado, a actividade semelhante a F. VlIIa aumentou em 9 tipos de anticorpos biespecificos, listados daqui em diante pela ordem de actividade crescente: XB12/SB04, XB12/SB21, XB12/SB42, XB12/SB38, XB12/SB30, XB12/SB07, XB12/SB05, XB12/SB06, e XB12/SB34. A Fig. 5 mostra os resultados da medição da actividade semelhante a F. VlIIa do anticorpo anti-F. IXa XT04 e anticorpos biespecificos anti-F. IXa/anti-F. X preparados utilizando XT04 e os anticorpos anti-F. X SB04, SB21, SB42, SB38, SB30, SBO 7, SB05, SB06, e SB34. As concentrações das soluções de anticorpo são 10 pg/ml (concentração final de 1 pg/ml). Como resultado, XT04/SB04, XT04/SB21, XT04/SB42, XT04/SB38, XT04/SB30, XT04/SB07, XT04/SB05, XT04/SB06, e XT04/SB34 mostraram um aumento na actividade semelhante a F. VlIIa. A Fig. 6 mostra os resultados da medição da actividade semelhante a F. VlIIa em XB12/SB04, o anticorpo que exibiu a actividade mais elevada no ensaio da Fig. 4, a várias 8 ΕΡ 1 876 236/ΡΤ concentrações. Como resultado, XB12/SB04 mostrou um aumento dependente da concentração na actividade semelhante a F. VlIIa. A Fig. 7 mostra os resultados da medição do tempo de coagulação observada na presença de XB12/SB04, XB12/SB21, XB12/SB42, XB12/SB38, XB12/SB30, XB12/SB07, XB12/SB05, XB12/SB06, ou XB12/SB34. Após a solução de anticorpo e o plasma deficiente em F. VIII serem misturados, a concentração do anticorpo é de 1,7 pg/ml para XB12/SB06 e 10 pg/ml para o resto. Como resultado, XB12/SB04, XB12/SB21, XB12/SB42, XB12/SB38, XB12/SB30, XB12/SB07, XB12/SB05, XB12/SB06, e XB12/SB34 mostraram um efeito de redução do tempo de coagulação em comparação com o observado na ausência do anticorpo. A Fig. 8 mostra os resultados da medição do tempo de coagulação na presença de XT04/SB04, XT04/SB21, XT04/SB42, XT04/SB38, XT04/SB30, XT04/SB07, XT04/SB05, XT04/SB06, ou XT04/SB34. Após a solução de anticorpo e o plasma deficiente em F. VIII serem misturados, a concentração de anticorpo é de 5 yg/ml para XT04/SB06 e 10 yg/ml para o resto. Como resultado, XT04/SB04, XT04/SB21, XT04/SB42, XT04/SB38, XT04/SB30, XT04/SB07, XT04/SB05, e XT04/SB06 mostraram um efeito de redução do tempo de coagulação em comparação com o observado na ausência do anticorpo. Uma redução no tempo de coagulação não foi observada para XT04/SB34. A Fig. 9 mostra os resultados da medição do tempo de coagulação em XB12/SB04, o anticorpo que demonstrou o maior efeito de redução do tempo de coagulação nos ensaios das Figs. 7 e 8, a várias concentrações. Como resultado, XB12/SB04 mostrou uma redução dependente da concentração no tempo de coagulação. As concentrações de anticorpo na Fig. 9 representam os valores após a mistura das soluções de anticorpo e plasma deficiente em F. VIII. A Fig. 10 mostra os resultados de imunotransferência Western GST-AP de SB04 ou SB06. As fotografias 1, 2, e 3 representam os resultados de reacção da GST-AP transferida com SB04, SB06, e da amostra sem um anticorpo, respectivamente.

Como resultado, apenas foi detectada a reacção de ligação de SB04 com GST-AP. 9 ΕΡ 1 876 236/ΡΤ A Fig. 11 é um diagrama de pELBGlacI. ColElori, origem de replicação do plasmídeo da série ColEl; flori, região de origem de replicação do fago fl; lacl, região de codificação da proteína repressora da lactose; Piac, promotor da lactose; pelBss, sequência sinal da proteína PelB de E. coli; scFv, região de codificação do anticorpo de cadeia simples; gene III: região de codificação da proteína do GenelII do fago fl; Ampr, gene resistente à ampicilina; e Sfi I, local de clivagem da enzima de restrição Sfil. A Fig. 12 mostra medições da actividade semelhante a F. VlIIa obtidas utilizando os sobrenadantes da cultura dos anticorpos biespecíficos, que foram expressos através da combinação de anticorpos anti-F. IXa (A19, A25, A31, A38, A39, A40, A41, A44, A50, A69, e XB12) e anticorpos anti-F. X (B2, B5, B9, BI0, BI1, B12, B13, B14, B15, B16, B18, B19, B20, B21, B23, B25, B26, B27, B31, B34-1, B34-2, B35, B36, B38, B42, SB04, SB15, e SB27) . 0 símbolo + representa o caso em que a actividade semelhante a F. VlIIa é 0,1 ou mais. A Fig. 13 mostra os resultados de um ensaio de coagulação do plasma utilizando os anticorpos biespecíficos purificados, que foram expressos através de combinação de anticorpos anti-F. IXa (AI 9, A25, A31, A38, A39, A40, A41, A44, A50, A69, e XB12) e anticorpos anti-F. X (B2, B5, B9, ΒΙΟ, Bll, B12, BI3, BI4, BI5, B16, B18, B19, B20, B21, B23, B25, B26, B27, B31, B34-1, B34-2, B35, B36, B38, B42, SB04, SB15, e SB27). As reduções do tempo de coagulação, que variam de 10 segundos a 20 segundos, de 20 segundos a 40 segundos, de 40 segundos a 50 segundos, ou é de 50 segundos ou mais em comparação com o observado na ausência de anticorpo, estão representadas através do símbolo +, ++, +++, e ++++, respectivamente. A Fig. 14 mostra as medições dos tempos de coagulação observados utilizando A44/B26, um anticorpo que demonstrou maior efeito de redução do tempo de coagulação no ensaio da Fig. 13, a várias concentrações. O tempo de coagulação observado na ausência de anticorpo foi de 113 segundos. A adição de A44/B26 mostrou uma redução do tempo de coagulação dependente da concentração. As concentrações de anticorpo na Fig. 14 representam os valores após mistura das soluções de anticorpo e plasma deficiente em F. VIII. 10 ΕΡ 1 876 236/ΡΤ A Fig. 15 mostra as medições dos tempos de coagulação observados utilizando A69/B26, um anticorpo que demonstrou um maior efeito de redução do tempo de coagulação no ensaio da Fig. 13, a várias concentrações. O tempo de coagulação observado na ausência de anticorpo foi de 109,6 segundos. A adição de A69/B26 mostrou uma redução dependente da concentração no tempo de coagulação. As concentrações de anticorpo na Fig. 15 representam os valores misturando as soluções de anticorpo e plasma deficiente em F. VIII. A Fig. 16 mostra as medições dos tempos de coagulação observados na coexistência de A44/B26 ou XB12/SB04 e F. VIII. Como resultado, a solução da mistura de A44/B26 ou XB12/SB04 e F. VIII mostrou um efeito de redução do tempo de coagulação em comparação com o observado quando F. VIII era utilizado isoladamente. A Fig. 17 mostra as medições dos tempos de coagulação observados num plasma inibidor na presença de A44/B26 ou XB12/SB04. Como resultado, tanto A44/B26 como XB12/SB04 mostraram um efeito de redução do tempo de coagulação em comparação com o observado quando não foi adicionado qualquer anticorpo. A Fig. 18 mostra as medições dos tempos de coagulação observados utilizando XB12/SB04 e XB12 humanizado/SB04 humanizado a várias concentrações. O tempo de coagulação observado quando não foi adicionado anticorpo foi de 111,3 segundos. Como resultado, XB12 humanizado/SB04 humanizado mostraram um efeito de redução do tempo de coagulação comparável com o de XB12/SB04. As concentrações de anticorpo na Fig. 18 representam os valores após mistura das soluções de anticorpo e plasma deficiente em F. VIII. A Fig. 19 mostra a estrutura do vector de expressão da cadeia L, pCAGG- A Fig. 20 mostra as medições dos tempos de coagulação observados utilizando o anticorpo biespecífico produzido através de combinação de A44, B26 e AAA. Após mistura com a 11 ΕΡ 1 876 236/ΡΤ solução de anticorpo e plasma deficiente em F. VIII, a concentração de anticorpo foi de 30 pg/ml. A Fig. 21 mostra as medições dos tempos de coagulação observados utilizando os anticorpos biespecíficos produzidos através de combinação de A44/B26 e BAA (G) , ABA (G) ou BBA (G). Após mistura das soluções de anticorpo e plasma deficiente em F. VIII, as concentrações de anticorpo foram de 30 pg/ml. A Fig. 22 mostra as medições dos tempos de coagulação observados utilizando os anticorpos biespecificos produzidos através de combinação de B26/AAA e A50 ou A69. Após mistura das soluções de anticorpo e plasma deficiente em F. VIII, as concentrações de anticorpo foram de 30 pg/ml. A Fig. 23 mostra as medições dos tempos de coagulação observados utilizando o anticorpo biespecifico produzido através de combinação de A69, B26, e AAA. Após mistura da solução de anticorpo e plasma deficiente em F. VIII, a concentração de anticorpo foi de 30 pg/ml. A Fig. 24 mostra as medições dos tempos de coagulação observados utilizando os anticorpos biespecificos produzidos através de combinação de A69/B26 e BBA, aAA, AAa, ABa, BBa, aBA, BAA, BAa ou ABA. Após mistura das soluções de anticorpo e plasma deficiente em F. VIII, as concentrações de anticorpo foram de 30 pg/ml. A Fig. 25 mostra as medições dos tempos de coagulação observados utilizando os anticorpos biespecificos produzidos através de combinação de A69/B26 e BBA(G), AAa(G), BAa(G), ABa(G) ou BBa(G). Após mistura das soluções de anticorpo e plasma deficiente em F. VIII, as concentrações de anticorpo foram de 30 pg/ml. A Fig. 26 mostra as medições dos tempos de coagulação observados utilizando os anticorpos biespecificos produzidos através de combinação de A69/B26 e aAA(G) ou aBA(G). Após mistura da solução de anticorpo e plasma deficiente em F. VIII, as concentrações de anticorpo foram de 30 pg/ml. 12 ΕΡ 1 876 236/ΡΤ A Fig. 27 mostra as medições dos tempos de coagulação observados utilizando um anticorpo biespecífico quimérico e anticorpos biespecificos humanizados. A técnica de "botões-nas-casas" foi utilizada nas regiões constantes de cada anticorpo. Após mistura da solução de anticorpo e plasma deficiente em F. VIII, as concentrações de anticorpo foram de 30 pg/ml. A Fig. 28 mostra as medições dos tempos de coagulação observados utilizando dois tipos de anticorpos biespecificos humanizados. Regiões constantes de tipo selvagem foram utilizadas para cada anticorpo. Após mistura da solução de anticorpo e plasma deficiente em F. VIII, as concentrações de anticorpo foram de 30 pg/ml. A Fig. 29 mostra as medições dos tempos de coagulação observados quando se mistura A69/B26/BBA com XB12, SB04, XB12 e SB04, e XB 12/SB04, respectivamente. A concentração de cada anticorpo após mistura foi de 20 pg/ml.

Melhor Modo de Realização do Invento

Tal como aqui descrito, o termo "anticorpo multiespecifico" refere-se a um anticorpo que se pode ligar especificamente a pelo menos dois antigénios diferentes. Os anticorpos multiespecificos aqui são anticorpos biespecificos (BsAbs) (também designados anticorpos específicos duplos) que se podem ligar especificamente a dois antigénios.

No presente invento, o termo "antigénios(s) diferente(s)" não significa necessariamente que as próprias moléculas de antigénio sejam diferentes; pode simplesmente significar que os seus determinantes antigénicos são diferentes. Portanto, por exemplo, diferentes determinantes antigénicos dentro de uma única molécula estão também incluídos nos diferentes antigénios do presente invento, e dois anticorpos que reconhecem tais determinantes antigénicos diferentes dentro de uma única molécula, respectivamente, são considerados no presente invento como anticorpos que reconhecem diferentes antigénios. Além disso, no presente invento, o termo "cadeia leve (L) comummente partilhada" refere-se a uma cadeia leve que se pode ligar a duas ou mais cadeias pesadas diferentes, 13 ΕΡ 1 876 236/ΡΤ e mostra capacidade de ligação a cada antigénio. Aqui, o termo "cadeia(s) pesada(s) (H) diferente(s)" refere-se de preferência a cadeias pesadas de anticorpos contra diferentes antigénios, mas não está limitado a estas, e também se refere a cadeias pesadas cujas sequências de aminoácidos sejam diferentes umas das outras.

Os anticorpos multiespecificos do presente invento (de preferência anticorpos biespecificos) são anticorpos possuindo especificidade para dois ou mais antigénios diferentes, ou moléculas compreendendo fragmentos de tais anticorpos. Os anticorpos do presente invento não estão particularmente limitados, mas são de preferência anticorpos monoclonais.

Os anticorpos multiespecificos do presente invento compreendem cadeias leves (L) comummente partilhadas.

Os anticorpos multiespecificos do presente invento são de preferência anticorpos recombinantes produzidos utilizando técnicas de recombinação genética. (Ver, por exemplo, Borrebaeck CAK e Larrick JW, "THERAPEUTIC MONOCLONAL ANTICORPOS", Publicado no Reino Unido por MACMILLAN PUBLISHERS LTD, 1990) . Os anticorpos recombinantes podem ser obtidos através de clonagem de ADN codificando anticorpos a partir de hibridomas ou células produtoras de anticorpos, tais como linfócitos sensibilizados, que produzam anticorpos, inserindo-os em vectores adequados, e depois introduzindo estes em hospedeiros para produzir os anticorpos.

Os anticorpos do presente invento podem ser fragmentos de anticorpo ou anticorpos modificados. Os fragmentos de anticorpo incluem diacorpos (Db), anticorpos lineares, e anticorpos de cadeia simples (aqui adiante, também denotados como scFv). Aqui, um fragmento "Fv" é definido como o fragmento de anticorpo mais pequeno que compreende um local de reconhecimento do antigénio e local de ligação completos. Um fragmento "Fv" é um dímero (dímero VH-VL) em que uma região variável de cadeia pesada (H) (VH) e uma região variável de cadeia leve (L) (VL) estão fortemente ligadas por uma ligação não covalente. As três regiões determinantes de complementaridade (CDR) de cada uma das regiões variáveis interagem umas com as outras para formar um local de ligação 14 ΕΡ 1 876 236/ΡΤ ao antigénio à superfície do dímero VH-VL. Seis CDR conferem o local de ligação ao antigénio a um anticorpo. No entanto, uma região variável (ou metade do Fv compreendendo apenas três CDR específicas para um antigénio) sozinha pode reconhecer e ligar-se a um antigénio, embora a sua afinidade seja mais baixa do que a do local de ligação inteiro.

Um fragmento Fab (também chamado F (ab)) compreende ainda uma região constante da cadeia L e uma região constante da cadeia H (CHI). Um fragmento Fab' difere de um fragmento Fab por compreender adicionalmente vários resíduos derivados do terminal carboxilo da região CHI da cadeia H, compreendendo uma ou mais cisteínas da região charneira do anticorpo. Fab'-SH refere-se a um Fab' em que um ou mais resíduos de cisteína da sua região constante compreendem um grupo tiol livre. Um fragmento F(ab') é produzido através de clivagem de ligações dissulfureto entre os resíduos de cisteína na região charneira da digestão de F(ab')2 com pepsina. Outros fragmentos de anticorpo quimicamente ligados são também conhecidos dos peritos na técnica.

Os diacorpos são fragmentos de anticorpo bivalentes construídos através de fusão de genes (Holliger, P. et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90: 6444-6448 (1993); EP 404097; WO 93/11161). Os diacorpos são dímeros consistindo em duas cadeias polipeptídicas, em que cada cadeia polipeptídica compreende uma região variável da cadeia L (VL) e uma região variável da cadeia H (VH) ligadas com um ligador curto o suficiente para prevenir a associação destes dois domínios dentro da mesma cadeia, por exemplo, um ligador de cerca de 5 aminoácidos. As regiões VL e VH codificadas na mesma cadeia polipeptídica formam um dímero desde que o ligador entre a VL e VH seja demasiado curto para formar um fragmento de região variável de cadeia simples. Portanto, os diacorpos compreendem dois locais de ligação ao antigénio.

Um anticorpo de cadeia simples ou um fragmento de anticorpo scFv compreende as regiões VH e VL de um anticorpo, e estas regiões existem numa única cadeia polipeptídica. Em geral, um polipéptido Fv compreende ainda um ligador polipeptídico entre as regiões VH e VL, e isto permite que um scFv forme uma estrutura necessária para ligação ao antigénio 15 ΕΡ 1 876 236/ΡΤ (para uma revisão sobre scFv, ver Pluckthun "The Pharmacology of Monoclonal Antibodies" Vol. 113 (Rosenburg e Moore ed. (Springer Verlag, New York) págs. 269-315, 1994). No contexto do presente invento, os ligadores não estão particularmente limitados desde que não inibam a expressão das regiões variáveis do anticorpo ligadas às suas extremidades.

Os anticorpos biespecificos de tipo IgG podem ser segregados a partir de hibridomas híbridos (quadromas) produzidos através de fusão de dois tipos de hibridomas que produzem anticorpos IgG (Milstein, C. et al. Nature 1983, 305: 537-540). Eles podem também ser segregados tomando os genes da cadeia L e da cadeia H constituindo os dois tipos de IgG de interesse, um total de 4 tipos de genes, e introduzindo-os em células para co-expressar os genes.

Neste caso, através da introdução de substituições de aminoácidos adequados nas regiões CH3 das cadeias H, IgG possuindo uma combinação heterogénea de cadeias H podem ser preferencialmente segregadas (Ridgway JB et al. Protein Engineering 1996, 9: 617-621; Merchant AM et al. Nature Biotechnology 1998, 16: 677-681).

No que diz respeito às cadeias L, uma vez que a diversidade das regiões variáveis de cadeia L é menor que a das regiões variáveis de cadeia H, podem ser obtidas cadeias L comummente partilhadas que podem conferir a capacidade de ligação a ambas as cadeias H. Os anticorpos do presente invento compreendem cadeias L comummente partilhadas. IgG biespecificas podem ser eficientemente expressas através da introdução dos genes da cadeia L comummente partilhada e ambas as cadeias H em células.

Os anticorpos biespecificos podem ser produzidos através de reticulação química de Fab. O F(ab')2 biespecífico pode ser produzido, por exemplo, através da preparação de Fab' a partir de um anticorpo, utilizando-o para produzir um Fab' maleimidizado com orto-fenilenodi-maleimida (o-PDM), e fazendo depois reagir este com Fab' preparado a partir de outro anticorpo para reticular Fab derivados de diferentes anticorpos (Keler T et al. Câncer Research 1997, 57: 4008-4014) . O método de ligação química de um derivado de Fab'- 16 ΕΡ 1 876 236/ΡΤ ácido tionitrobenzóico (TNB) e um fragmento de anticorpo tal como Fab'-tiol (SH) é também conhecido (Brennan M et ai. Science 1985, 229: 81-83).

Em vez de uma reticulação química, também pode ser utilizado um fecho de leucina derivado de Fos e Jun. A formação preferencial de heterodímeros por Fos e Jun é utilizada, apesar de também formarem homodímeros. Fab' ao qual é adicionado fecho de leucina de Fos, e outro Fab' ao qual é adicionado fecho de leucina de Jun são expressos e preparados. Fab'-Fos e Fab'-Jun monoméricos reduzidos sob condições suaves são misturados e faz-se reagir para formarem F(ab')2 biespecíficos (Kostelny SA et al. J. of Immunology, 1992, 148: 1547-53). Este método pode ser aplicado não só a Fab' como também a scFv, Fv, e semelhantes.

Um anticorpo biespecífico pode também ser produzido utilizando um diacorpo. Um diacorpo biespecífico é um heterodímero de dois fragmentos scFv reticulados. Mais especificamente, é produzido através da formação de um heterodímero utilizando VH(A)-VL(B) e VH(B)-VL(A) preparados através de ligação das VH e VL derivadas de dois tipos de anticorpos, A e B, utilizando um ligador relativamente curto de cerca de 5 resíduos (Holliger P et al. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 1993, 90: 6444-6448). A estrutura desejada pode ser promovida através da ligação dos dois scFv com um ligador flexível e relativamente longo compreendendo cerca de 15 resíduos (diacorpo de cadeia simples: Kipriyanov SM et al. J. of Molecular Biology, 1999, 293: 41- 56), e realização de substituições de aminoácidos apropriados (botões-nas-casas: Zhu Z et al. Protein Science. 1997, 6: 781-788) .

Um sc (Fv) 2 que pode ser produzido através de ligação de dois tipos de scFv com um ligador flexível e relativamente longo, compreendendo cerca de 15 resíduos, pode também ser um anticorpo biespecífico (Mallender WD et al. J. of Biological Chemistry, 1994, 269: 199-206).

Exemplos de anticorpos modificados incluem, mas não estão limitados a, anticorpos ligados a várias moléculas tais como 17 ΕΡ 1 876 236/ΡΤ polietilenoglicol (PEG). No contexto do presente invento, a substância a que os anticorpos modificados são ligados não está limitada. Tais anticorpos modificados podem ser obtidos modificando quimicamente os anticorpos obtidos. Tais métodos estão bem estabelecidos na técnica.

Os anticorpos do presente invento são de preferência derivados de humano, ratinho, rato, ou outros, mas não estão limitados a estes. Podem também ser anticorpos geneticamente modificados, tais como anticorpos quiméricos ou humanizados.

Os métodos para obtenção de anticorpos humanos são conhecidos na técnica. Por exemplo, animais transgénicos portadores de todo o repertório de genes de anticorpos humanos podem ser imunizados com antigénios desejados para se obter anticorpos humanos desejados (ver Pedido de Patente Internacional WO 93/12227, WO 92/03918, WO 94/02602, WO 94/25585, WO 96/34096, e WO 96/33735).

Anticorpos geneticamente modificados podem também ser produzidos utilizando métodos conhecidos. Especificamente, por exemplo, os anticorpos quiméricos podem compreender regiões variáveis de cadeia H e de cadeia L de um anticorpo de animal imunizado, e as regiões constantes de cadeia H e de cadeia L de um anticorpo humano. Os anticorpos quiméricos podem ser obtidos através da ligação de ADN codificando as regiões variáveis do anticorpo derivadas do animal imunizado, com ADN codificando as regiões constantes de um anticorpo humano, inserindo-os num vector de expressão e, em seguida, introduzindo-o em células hospedeiras para produzir os anticorpos.

Os anticorpos humanizados são anticorpos modificados frequentemente referidos como anticorpos humanos "remodelados". Um anticorpo humanizado é construído através da transferência das CDR de um anticorpo derivado de um animal imunizado para as regiões determinantes de complementaridade de um anticorpo humano. São conhecidas técnicas de recombinação genética convencionais para tais fins.

Especificamente, uma sequência de ADN concebida de modo a que as CDR de um anticorpo de ratinho e as regiões estruturais 18 ΕΡ 1 876 236/ΡΤ (FR) de um anticorpo humano estejam ligadas pode ser sintetizada através de PCR a partir de vários oligonucleótidos preparados para compreender regiões que se sobrepõem nas suas extremidades. O ADN obtido pode então ser ligado a um ADN codificando a região constante do anticorpo humano, inserido num vector de expressão, e introduzido num hospedeiro para obter um anticorpo humanizado (ver Pedido de Patente Europeia No. 239400, e Pedido de Patente Internacional WO 96/02576) . As FR do anticorpo humano ligadas através de CDR são seleccionadas de modo a que as regiões determinantes de complementaridade formem locais de ligação ao antigénio adequados. Quando necessário, os aminoácidos das regiões estruturais das regiões variáveis do anticorpo podem ser substituídos de modo que as regiões determinantes de complementaridade do anticorpo humano remodelado formem locais de ligação ao antigénio apropriados (Sato K et al., Câncer Research 1993, 53: 851-856) . As substituições podem ser introduzidas em regiões estruturais derivadas de vários anticorpos humanos (ver Pedido de Patente Internacional WO 99/51743).

Os anticorpos multiespecíficos do presente invento reconhecem o factor de coagulação IX (F. IX) e/ou o factor de coagulação IX activado (F. IXa) de coagulação e factores relacionados com fibrinólise, e o factor de coagulação X (F. X) ; têm actividades que substituem funcionalmente o cofactor F. VIII/F. VlIIa; e compreendem cadeias L comummente partilhadas. Os anticorpos do presente invento possuem vulgarmente um estrutura compreendendo regiões variáveis de anticorpo anti-F. IXa e regiões variáveis de anticorpo anti-F. X.

Um anticorpo multiespecífico do presente invento é um anticorpo compreendendo um primeiro domínio reconhecendo o factor de coagulação IX e/ou o factor de coagulação IX activado e um segundo domínio reconhecendo o factor de coagulação X, em que o primeiro e o segundo domínios compreendem ainda um terceiro polipéptido compreendendo a sequência toda ou parcial de uma cadeia L comummente partilhada.

Mais especificamente, numa concretização preferida, um anticorpo do presente invento é um anticorpo multiespecífico que pode substituir funcionalmente o factor de coagulação VIII, 19 ΕΡ 1 876 236/ΡΤ que compreende um primeiro domínio reconhecendo o factor de coagulação IX e/ou o factor de coagulação IX activado, e um segundo domínio reconhecendo o factor de coagulação X; em que o primeiro domínio compreende um primeiro polipéptido compreendendo a cadeia H total ou parcial de um anticorpo contra o factor de coagulação IX ou o factor de coagulação IX activado, o segundo domínio compreende um segundo polipéptido compreendendo a cadeia H total ou parcial de um anticorpo contra o factor de coagulação X, e o primeiro e segundo domínios compreendem ainda um terceiro polipéptido compreendendo uma sequência comum da cadeia L total ou parcial. 0 factor de coagulação VIII activado (F. VlIIa) aumenta a activação de F. X através de F. IXa através da ligação tanto a F. IXa como a F. X. Entre os anticorpos biespecíficos acima descritos que reconhecem tanto a enzima F. IXa como o substrato F. X, alguns deles têm a actividade de aumentar a activação de F. X. De tais anticorpos, alguns deles podem ter a actividade de substituir funcionalmente o cofactor F. VIII/F. VlIIa. 0 F. VIII/F. VlIIa do presente invento é sujeito a proteólise limitada por proteases, tais como trombina; no entanto, desde que a actividade de cofactor de F. VIII/F. VlIIa esteja presente, a sua forma não importa. F. VIII/F. VlIIa mutantes e F. VIII/F. VlIIa modificados artificialmente através de técnicas de recombinação genética estão também compreendidos no F. VIII/F. VlIIa do presente invento, desde que tenham a actividade de cofactor de F. VIII/F. VlIIa.

Um "terceiro polipéptido" do presente invento é de preferência um polipéptido que compreende uma sequência total ou parcial da cadeia L de um anticorpo contra o factor de coagulação IX (F. IX), factor de coagulação IX activado (F. IXa), ou factor de coagulação X (F. X).

Além disso, um "terceiro polipéptido" do presente invento compreende de preferência um local de ligação ao antigénio compreendendo CDR1, 2, e 3, cada uma seleccionada independentemente a partir de CDR1, 2, e 3 de cada uma das cadeias L de dois ou mais anticorpos ou locais de ligação ao antigénio funcionalmente equivalentes a estes. 20 ΕΡ 1 876 236/ΡΤ

Numa concretização preferida, a CDR1, 2, e 3 da cadeia H do primeiro polipéptido de um anticorpo do presente invento constitui especificamente, por exemplo, um local de ligação ao antigénio compreendendo sequências de aminoácidos de cada uma das sequências de CDR1, 2, e 3 da cadeia H (SEQ ID NOs: 3, 5, e 7; ou 21, 5, e 22) de A44 ou A69 descritas nos seguintes Exemplos, ou um local de ligação ao antigénio funcionalmente equivalente a este.

Numa concretização preferida, a CDR1, 2, e 3 de cadeia H do segundo polipéptido constitui especificamente, por exemplo, um local de ligação ao antigénio compreendendo sequências de aminoácidos de cada sequência de CDR1, 2, e 3 de cadeia H (SEQ ID NOs: 26, 28, e 30) de B26 descritas nos seguintes Exemplos, ou um local de ligação ao antigénio funcionalmente equivalente a este.

As sequências de aminoácidos das regiões variáveis de cadeia H de A44, A50, A69, e B26 do presente invento estão descritas nos seguintes SEQ ID NOs, respectivamente: A44 : SEQ ID NO: 1 A50: SEQ ID NO: 15 A69: SEQ ID NO: 20 B26: SEQ ID NO: 24

As sequências nucleotidicas das CDR de cadeia H de A44, A50, A69, e B26 são descritas nos seguintes SEQ ID NOs, pela ordem das CDR 1, 2, e 3 (cada um dos SEQ ID NOs em parênteses indica as sequências de aminoácidos codificadas pela sequência nucleotídica): A44 : SEQ ID NOs : 2 (3 ), 4 (5 ) , e 6 (7) A50 : SEQ ID NOs : 109 (16) 1 10 (17) , e 111 (18 A6 9: SEQ ID NOs : 112 (21) 1 13 (5) , e 114 (22) B26: SEQ ID NOs : 25 ( 26) , 27 (28) , e 29 (30)

As sequências de aminoácidos das regiões variáveis de cadeia L de A44, A50, A69, e B26 do presente invento são descritas nos seguintes SEQ ID NOs, respectivamente: A44 : SEQ ID NO: 8 A50 : SEQ ID NO: 115 A6 9: SEQ ID NO: 116 B26: SEQ ID NO: 31 21 ΕΡ 1 876 236/ΡΤ

As sequências nucleotídicas das CDR de cadeia L de A44, A50, A69, e B26 são descritas nos seguintes SEQ ID NOs, pela ordem das CDR 1, 2, e 3 (cada um dos SEQ ID NOs em parênteses indica as sequências de aminoácidos codificadas pela sequência nucleotidica): A44: SEQ ID NOs: 9 (10), 11 (12), e 13 (14) A50: SEQ ID NOs: 117 (10), 118 (12), e 119 (19) A69: SEQ ID NOs: 120 (23), 121 (12), e 122 (14) B26: SEQ ID NOs: 32 (33), 34 (35), e 36 (37)

As sequências de aminoácidos de CDR1 são mostradas como se segue: A44: SEQ ID NOs: 3 e 10 A50: SEQ ID NOs: 16 e 10 A69: SEQ ID NOs: 21 e 23 B26: SEQ ID NOs: 26 e 33

As sequências de aminoácidos de CDR2 são mostradas como se segue: A44: SEQ ID NOs: 5 e 12 A50: SEQ ID NOs: 17 e 12 A69: SEQ ID NOs: 5 e 12 B26: SEQ ID NOs: 28 e 35

As sequências de aminoácidos de CDR3 são mostradas como se segue: A44: SEQ ID NOs: 7 e 14 A50: SEQ ID NOs: 18 e 19 A69: SEQ ID NOs: 22 e 14 B26: SEQ ID NOs: 30 e 37

Quando se produz um anticorpo inteiro utilizando as regiões variáveis divulgadas no presente invento, sem limitações particulares, podem ser utilizadas regiões constantes bem conhecidos dos peritos na técnica. Por exemplo, podem ser utilizadas regiões constantes descritas em "Sequences of proteins of immunological interest", (1991), U.S. Department of Health e Human Services. Public Health Service National Institutes of Health, ou "An efficient route to human bispecific IgG", (1998). Nature Biotechnology vol. 16, 677-681. 22 ΕΡ 1 876 236/ΡΤ

Os anticorpos biespecíficos preferidos do presente invento foram avaliados quanto à sua actividade para substituir F. VIII/F. VlIIa (um cofactor para a activação de F. X através de F. IXa) utilizando um sistema de medição compreendendo F. Xla (enzima de activação de F. IX), F. IX, F. X, substrato sintético de F. Xa (S-2222), e fosfolipidos. Estes resultados foram utilizados para seleccionar, em principio, os anticorpos biespecificos indicando actividade semelhante a F. VlIIa de 0,1 ou mais tal como aqueles possuindo actividade para substituir F. VIII/F. VlIIa. A "actividade semelhante a F. VlIIa" aqui mencionada é um valor obtido através da subtracção da alteração da absorvância do solvente ou sobrenadante da cultura sem expressão do anticorpo durante 30 minutos ou 60 minutos, da alteração da absorvância da solução de anticorpo ou sobrenadante da cultura contendo anticorpos expressos durante 30 minutos ou 60 minutos. A capacidade dos anticorpos biespecificos seleccionados acima, ou anticorpos biespecificos relacionados, para recuperar a coagulação foi medida num sistema de medição do tempo de coagulação utilizando plasma humano deficiente em F. VIII. Como resultado, foram obtidos anticorpos biespecíficos que reduzem o tempo de coagulação em comparação com o observado quando não foram adicionados anticorpos. O tempo de coagulação aqui mencionado refere-se ao tempo de tromboplastina activada parcial medido (APTT) utilizando plasma humano deficiente em F. VIII, tal como descrito no Exemplo 7. Utilizando estes anticorpos biespecificos, a redução do tempo de coagulação foi de preferência de 10 segundos ou mais, de maior preferência 20 segundos ou mais, ainda de preferência 40 segundos ou mais, ou ainda de maior preferência 50 segundos ou mais.

Mais especificamente, numa concretização preferida, os anticorpos multiespecíficos do presente invento podem substituir funcionalmente o factor de coagulação VIII, que reconhece o factor de coagulação IX e/ou o factor de coagulação IX activado e o factor de coagulação X. A função substitutiva de F. VIII pelos anticorpos multiespecificos do presente invento pode ser demonstrada através da medição da redução do tempo de coagulação em 23 ΕΡ 1 876 236/ΡΤ comparação com ο observado quando não é adicionado anticorpo num sistema de medição do tempo de coagulação utilizando plasma humano deficiente em F. VIII. 0 tempo de coagulação aqui mencionado refere-se a, por exemplo, tempo de tromboplastina activada parcial (APTT) num sistema de medição do tempo de coagulação utilizando plasma humano deficiente em F. VIII, tal como descrito no Exemplo 21. Concretizações preferidas do anticorpo multiespecifico do presente invento reduzem o tempo de coagulação em 50 segundos ou mais, de preferência 60 segundos ou mais, de maior preferência 70 segundos ou mais, e ainda de preferência 80 segundos ou mais.

Os anticorpos multiespecificos do presente invento compreendem de preferência CDR de cadeia H de um anticorpo anti-factor de coagulação IX/IXa e CDR funcionalmente equivalentes a estas, e CDR de cadeia H de um anticorpo anti-factor de coagulação X ou CDR funcionalmente equivalentes a estas.

Os anticorpos do presente invento compreendem de preferência um local de ligação ao antigénio compreendendo as sequências de aminoácidos de CDR1, 2, e 3 de cadeia H de SEQ ID NOs: 3, 5, e 7 (CDR da cadeia H de A44), ou as sequências de aminoácidos da CDR1, 2, e 3 de cadeia H de SEQ ID NOs: 21, 5, e 22 (CDR da cadeia H de A69) de um anticorpo anti-factor de coagulação IX/IXa, ou um local de ligação ao antigénio funcionalmente equivalente a este, e um local de ligação ao antigénio compreendendo as sequências de aminoácidos de CDR1, 2, e 3 de cadeia H de SEQ ID NOs: 26, 28, e 30 (CDR da cadeia H de B26) de um anticorpo anti-factor de coagulação X, ou um local de ligação ao antigénio funcionalmente equivalente a este.

No presente invento, um local de ligação ao antigénio "funcionalmente equivalente" tem propriedades de ligação semelhantes às de um local de ligação ao antigénio compreendendo as várias CDR aqui descritas. Mais especificamente, se as seguintes substituições de aminoácidos para estabilização permitem o reconhecimento de um determinante antigénico semelhante (epitopo), os locais de ligação ao antigénio resultantes incorporando tais substituições são "funcionalmente equivalentes". 24 ΕΡ 1 876 236/ΡΤ

As substituições de aminoácidos podem ser realizadas nos anticorpos (clones) do presente invento para evitar desamidação, oxidação da metionina, e tais, ou para estabilizar estruturalmente os anticorpos, tal como descrito abaixo.

Os resíduos de aminoácidos dos anticorpos do presente invento podem ser modificados conforme necessário para evitar desamidação, oxidação da metionina, e tais, ou para estabilizar estruturalmente os anticorpos.

Os resíduos N e M podem ser modificados para desamidação, oxidação da metionina, e assim por diante. 0 resíduo G da sequência NG na CDR3 da cadeia H de A44 e A69, e o resíduo T da sequência NT na CDR2 da cadeia H de B2 6 podem também ser modificados. Além disso, os resíduos M podem ser modificados para evitar oxidação da metionina. Além disso, o resíduo D da sequência RD no final da CDR2 da cadeia H de A44 e A69, e o resíduo V da sequência KV da CDR2 da cadeia H de A50 podem ser modificados para aumentar a estabilidade térmica, através da melhoria da estrutura da curva, e assim, a modificação para um resíduo G, S, ou T é particularmente preferida. De modo semelhante, o resíduo Y da CDR3 da cadeia L de A44, kabat 95, pode ser modificado para um resíduo P. Além disso, para aumentar a estabilidade térmica, através da melhoria do núcleo hidrófobo, o resíduo V da CDR1 da cadeia L de B26, kabat 33, pode ser modificado para um resíduo L. Além disso, para corrigir a perturbação das interfaces VH/VL, o resíduo L da sequência LDY ou o resíduo F da sequência FDY no final da CDR3 da cadeia H de A44, A50 e A69 pode ser modificado. De modo semelhante, o resíduo I da sequência IT ou o resíduo L da sequência LT no final da CDR3 da cadeia L de A44, A50, e A69 pode ser modificado. 0 resíduo Y da sequência RYS da CDR2 da cadeia L de B26 pode também ser modificado.

As sequências de cada uma das CDR de A44, A50, A69, e B26 são mostradas abaixo; os resíduos de aminoácidos que podem ser substituídos estão sublinhados. CDR1 da cadeia H de A44 : SSWMH (SEQ ID NO: 3) CDR1 da cadeia H de A50 : TYWMH (SEQ ID NO: 16) CDR1 da cadeia H de A69 : DYYMH (SEQ ID NO: 21) 25 ΕΡ 1 876 236/ΡΤ CDRl da cadeia H de B26: DNNMD (SEQ ID NO: 26) CDR2 da cadeia H de A44, A69 : YINPSSGYTKYNRKFRD (SEQ ID NO CDR2 da cadeia H de A50 : YINPSSGYTKYNQKFKV (SEQ ID NO CDR2 da cadeia H de B26 : DINTKSGGSIYNQKFKG (SEQ ID NO CDR3 da cadeia H de A44 : GGNGYYFDY (SEQ ID NO: 7) CDR3 da cadeia H de A50 : GNLGYFFDY (SEQ ID NO: 18) CDR3 da cadeia H de A69 : GGNGYYLDY (SEQ ID NO: 22) CDR3 da cadeia H de B26 : RRSYGYYFDY (SEQ ID NO: 30) CDRl da cadeia L de A44, A50 : KASQDVGTAVA (SEQ ID NO: 10) CDRl da cadeia L de A69 : KASQDVSTAVA (SEQ ID NO: 23) CDRl da cadeia L de B26 : KASQNVGTAVA (SEQ ID NO: 33) CDR2 da cadeia L de A44, A50, WASTRHT (SEQ ID NO: 12) A6 9: CDR2 da cadeia L de B26: SASYRYS (SEQ ID NO: 35) CDR3 da cadeia L de A44, A69: QQYSNYIT (SEQ ID NO: 14) CDR3 da cadeia L de A50 : QQYSSYLT (SEQ ID NO: 19) CDR3 da cadeia L de B26 : QQYNSYPLT (SEQ ID NO: 37) Ο presente invento refere-se ainda a métodos para recuperação ou aumento das actividades de anticorpos biespecificos que diminuíram devido a cadeias L comummente partilhadas de cada anticorpo, em comparação com as actividades dos anticorpos biespecificos originais sem as cadeias L comummente partilhadas. 0 presente invento proporciona métodos para produção dos anticorpos biespecificos do presente invento que utilizam os métodos acima mencionados.

Especificamente, o presente invento proporciona métodos para produção de um anticorpo biespecífico compreendendo uma primeira cadeia H, uma segunda cadeia H, e cadeias L comummente partilhadas, em que os métodos compreendem os passos de: (1) preparação de um primeiro anticorpo contra um primeiro antigénio, e um segundo anticorpo contra um segundo antigénio; (2) produção de um anticorpo biespecífico contra o primeiro antigénio e o segundo antigénio, que compreende regiões variáveis do primeiro anticorpo e do segundo anticorpo; (3) medição da actividade de ligação ao antigénio ou da actividade biológica do anticorpo biespecífico produzido no passo (2) ; 26 ΕΡ 1 876 236/ΡΤ (4) produção de um anticorpo de cadeia L comummente partilhada através de ligação da cadeia H do primeiro anticorpo e da cadeia H do segundo anticorpo com a cadeia L do primeiro anticorpo ou do segundo anticorpo; (5) medição da actividade de ligação ao antigénio ou actividade biológica do anticorpo de cadeia L comummente partilhada produzido no passo (4); (6) produção de um anticorpo de cadeia L comummente partilhada através da substituição de uma, duas, ou três CDR das cadeias L comummente partilhadas produzidas no passo (4) com as CDR do primeiro anticorpo, do segundo anticorpo, ou de outro anticorpo altamente homólogas às sequências de aminoácidos das CDR do primeiro anticorpo ou do segundo anticorpo; (7) selecção de um anticorpo de cadeia L comummente partilhada possuindo uma actividade desejada através da comparação da actividade de ligação ao antigénio ou da actividade biológica do anticorpo de cadeia L comummente partilhada produzido no passo (6) com a do anticorpo biespecifico original produzido no passo (2) ou o anticorpo de cadeia L comummente partilhada produzido no passo (4); e (8) obtenção de um anticorpo de cadeia L comummente partilhada que possui uma actividade equivalente a ou superior à do anticorpo biespecifico original produzido no passo (2) , através da repetição dos passos (6) e (7) conforme necessário para o anticorpo de cadeia L comummente partilhada seleccionado no passo (7).

No método acima mencionado do presente invento, primeiro são produzidos anticorpos biespecificos cujas cadeias L não sejam comummente partilhadas em cada anticorpo.

No presente invento, sem limitação particular, os anticorpos biespecificos podem ser obtidos através de qualquer método. Por exemplo, para obter anticorpos biespecificos substituindo funcionalmente um cofactor contra a enzima A e o substrato B, animais são imunizados separadamente com enzima A e substrato B de modo a obter anticorpos anti-enzima A e anticorpos anti-substrato B. Subsequentemente, são produzidos anticorpos biespecificos compreendendo as cadeias H e L do anticorpo anti-enzima A e as cadeias H e L do anticorpo anti-substrato B. De preferência, são obtidos vários tipos de ambos 27 ΕΡ 1 876 236/ΡΤ anticorpos anti-enzima A e anticorpos anti-substrato B, e de preferência, estes são utilizados para produzir anticorpos biespecificos derivados de tantas combinações quanto possível. Após a produção dos anticorpos biespecificos, são seleccionados aqueles possuindo uma actividade para substituir funcionalmente o cofactor.

Anticorpos contra enzimas ou substratos podem ser obtidos através de métodos bem conhecidos dos peritos na técnica. Por exemplo, podem ser preparados através de imunização de animais com antigénios. Antigénios utilizados para imunizar os animais incluem antigénios completos que possuem imunogenicidade, e antigénios incompletos (incluindo haptenos) não possuindo imunogenicidade. No contexto do presente invento, enzimas ou substratos, nos quais os anticorpos substituindo funcionalmente cofactores do presente invento são considerados actuar, são utilizados como antigénios (imunogénio). Exemplos dos animais que podem ser imunizados incluem, mas não estão limitados a, ratinhos, ratos, hamsters, cobaias, coelhos, galinhas, ou macacos rhesus. A imunização destes animais com os antigénios pode ser realizada através de métodos bem conhecidos dos peritos na técnica. No presente invento, as regiões variáveis da cadeia C e da cadeia H do anticorpo são de preferência colhidas a partir dos animais imunizados ou de células de tais animais. Este processo pode ser realizado utilizando técnicas geralmente conhecidas dos peritos na técnica. Os animais imunizados pelos antigénios expressam anticorpos contra esses antigénios, especialmente em células do baço. Portanto, por exemplo, as regiões variáveis da cadeia L e da cadeia H podem ser colhidas através da preparação de ARNm de células do baço de animais imunizados, e depois realização de RT-PCR utilizando iniciadores correspondendo às regiões variáveis dos anticorpos.

Mais especificamente, as enzimas e os substratos podem ser utilizados individualmente para imunizar os animais. As enzimas e os substratos utilizados como imunogénios podem ser proteína inteiras, ou péptidos parciais de tais proteínas. Um imunogénio utilizado para imunizar animais pode ser preparado como antigénio solúvel através da ligação de uma porção que serve como antigénio para outra molécula, ou um fragmento desta, dependendo da situação. 28 ΕΡ 1 876 236/ΡΤ

As células do baço podem ser isoladas a partir do baço de ratinhos imunizados e fundidas com células de mieloma de ratinho para produzir hibridomas. Os hibridomas que se ligam a antigénios são então seleccionados individualmente, e as regiões variáveis da cadeia L e da cadeia H podem ser colhidas através de RT-PCR utilizando iniciadores que correspondem às regiões variáveis. Podem ser utilizados iniciadores correspondendo às CDR, iniciadores correspondendo às estruturas que são menos diversas que as CDR, ou iniciadores correspondendo à sequência sinal e CHI ou às regiões constantes da cadeia L (CL) .

Alternativamente, ARNm podem ser extraídos de células do baço de animais imunizados e os ADNc das regiões variáveis da cadeia L e da cadeia H podem ser colhidos através de RT-PCR utilizando iniciadores correspondendo a locais próximos das regiões variáveis. Os linfócitos podem ser também imunizados in vitro e utilizados para construir uma biblioteca apresentando scFv ou Fab. Os clones do anticorpo de ligação ao antigénio podem ser concentrados e clonados através de peneira para obter as regiões variáveis. Neste caso, a pesquisa pode ser realizada utilizando uma biblioteca semelhante produzida a partir de ARNm derivados de monócitos do sangue periférico, baços, amígdalas, ou tais de humanos ou animais não imunizados.

Usando as regiões variáveis obtidas, são produzidos vectores de expressão de anticorpos. Um anticorpo biespecífico pode ser obtido através da introdução de um vector de expressão de anticorpo anti-enzima e um vector de expressão de anticorpo anti-substrato nas mesmas células para expressar o anticorpo.

Em seguida, no método do presente invento acima mencionado, são medidas actividades de ligação ao antigénio ou actividades biológicas dos anticorpos biespecíficos produzidos. Por exemplo, anticorpos possuindo uma actividade de substituir funcionalmente um cofactor podem ser seleccionados através de métodos tais como aqueles descritos abaixo. (1) Selecção de anticorpos utilizando um sistema de reacção compreendendo a enzima e o substrato, e utilizando 29 ΕΡ 1 876 236/ΡΤ como indicador, ο aumento da actividade enzimática (degradação do substrato) devido à adição do anticorpo. (2) Selecção de anticorpos utilizando um sistema que mede ou imita funções biológicas em que a enzima, o substrato, e cofactor estão envolvidos, e utilizando como indicador, a actividade de recuperação funcional causada pela adição do anticorpo na ausência do cofactor.

Mais especificamente, a "actividade" pode ser medida através da medição da capacidade de coagulação de anticorpos de teste, por exemplo, num sistema de medição do tempo de coagulação utilizando plasma humano deficiente em factor de coagulação.

Os anticorpos obtidos podem ser purificados até à homogeneidade. A separação e purificação dos anticorpos podem ser realizadas utilizando métodos de separação e purificação convencionais utilizados para proteínas comuns. Por exemplo, os anticorpos podem ser separados e purificados através da selecção e combinação apropriadas de cromatografia em coluna tal como cromatografia de afinidade, filtração, ultrafiltração, precipitação com sal, diálise, electroforese em gel de SDS-poliacrilamida, focagem isoeléctrica, e tais, sem limitação (Antibodies: A Laboratory Manual. Ed. Harlow e David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988) . Colunas utilizadas para cromatografia de afinidade incluem, por exemplo, colunas de proteína A e colunas de proteína G.

Numa concretização preferida do presente invento, o cofactor a substituir é F. VIII/F. VlIIa, e, mais especificamente, a combinação de enzima e substrato é um factor relacionado com coagulação/fibrinólise, F. IXa e F. X.

Portanto, um anticorpo específico preferido do presente invento compreende uma estrutura compreendendo a região variável de um anticorpo anti-F. IXa e a região variável de um anticorpo anti-F. X.

Mais especificamente, por exemplo, um anticorpo biespecífico substituindo funcionalmente F. VIII/F. VlIIa pode ser produzido através do seguinte método. 30 ΕΡ 1 876 236/ΡΤ

Os ratinhos são imunizados através de injecção subcutânea de F. IXa e F. X comercialmente disponível, individualmente. As células do baço são isoladas a partir dos baços de ratinhos imunizados mostrando maior título de anticorpo e fundidas com células de mieloma de ratinho para produzir hibridomas. Os hibridomas que se ligam aos antigénios (F. IXa e F. X) são seleccionados separadamente, e as regiões variáveis da cadeia L e da cadeia H são colhidas através de RT-PCR utilizando iniciadores correspondendo às regiões variáveis. As regiões variáveis da cadeia L são inseridas em vectores de expressão de cadeia L compreendendo a região constante de cadeia L, e as regiões variáveis da cadeia H são inseridas em vectores de expressão da cadeia H compreendendo a região constante da cadeia H, respectivamente. ARNm são extraídos dos baços destes ratinhos imunizados, e os ADNc das regiões variáveis da cadeia L e da cadeia H são colhidos através de RT-PCR utilizando iniciadores correspondendo às regiões variáveis. Uma biblioteca fágica apresentando scFv é então construída utilizando estas regiões variáveis. Em seguida, clones do anticorpo de ligação ao antigénio são concentrados e clonados através de peneira e as suas regiões variáveis são utilizadas para produzir vectores de expressão de anticorpo. Um vector de expressão do anticorpo anti-F. IXa (cadeia H e cadeia L) e um vector de expressão do anticorpo anti-F. X (cadeia H e cadeia L) são então introduzidos nas mesmas células de modo a expressar os anticorpos e obter anticorpos biespecíficos.

No método do presente invento acima mencionado, a cadeia H de um primeiro anticorpo (por exemplo, um anticorpo anti-F. IXa) e a cadeia H de um segundo anticorpo (por exemplo, um anticorpo anti-F. X) são ligadas com as cadeias L comummente partilhadas do primeiro anticorpo ou segundo anticorpo para produzir um primeiro anticorpo de cadeia L comummente partilhada. A actividade de ligação ao antigénio ou actividade biológica do anticorpo obtido é então medida.

Sem limitação particular a este método, cadeias L comummente partilhadas podem ser obtidas, por exemplo, através do seguintes passos (1) a (7): (1) selecção do anticorpo A contra o antigénio A, e anticorpo B contra antigénio B; 31 ΕΡ 1 876 236/ΡΤ (2) preparação das respectivas linhas celulares segregadoras de cadeia H, Ha (segregando a cadeia H do anticorpo A) e Hb (segregando a cadeia H do anticorpo B) , através da introdução de um vector de expressão de um gene codificando a cadeia H de cada anticorpo (de preferência o fragmento Fd, ou mais especificamente, a região compreendendo VH e CHI); (3) separadamente, a construção de uma biblioteca em que as cadeias L são expressas como proteínas de fusão com proteínas de superfície fágica; (4) introdução da biblioteca de cadeia L em E. coli Ha, e secreção de uma biblioteca fágica apresentando anticorpos (Fab quando a cadeia H é um fragmento Fd) compreendendo a cadeia H do anticorpo A e várias cadeias L à sua superfície; (5) concentração de clones da biblioteca fágica através de peneira utilizando o antigénio A; (6) infecção de E. coli Hb com os clones obtidos, e obtenção de uma biblioteca fágica apresentando anticorpos (Fab quando a cadeia H é um fragmento Fd) compreendendo a cadeia H do anticorpo B e várias cadeias L à sua superfície; e (7) concentração de clones a partir da biblioteca fágica obtida através de peneira utilizando antigénio B.

Cadeias L comummente partilhadas mostrando elevada afinidade para os antigénios e correspondendo a diferentes cadeias H que podem ser utilizadas para produzir anticorpos biespecíficos podem ser obtidas através da repetição dos passos acima mencionados (1) a (7).

Mais especificamente, cadeias L comummente partilhadas podem ser obtidas através dos seguintes passos (a) a (e): (a) produção de hospedeiros que segregam a cadeia H de um anticorpo que se liga a um antigénio desejado; (b) introdução de uma biblioteca de cadeia L de anticorpo nos hospedeiros do passo (a) , e secreção de uma biblioteca fágica apresentando anticorpos constituídos pelas cadeias H e L acima mencionadas; (c) selecção de uma biblioteca fágica apresentando os anticorpos que se ligam especificamente ao antigénio desejado do passo (a); (d) introdução da biblioteca fágica seleccionada no passo (c) em hospedeiros que segregam as cadeias H de um anticorpo 32 ΕΡ 1 876 236/ΡΤ que se liga a um antigénio desejado diferente daquele do passo (a) , e secreção de uma biblioteca fágica apresentando anticorpos constituídos pelas cadeias H e L; e (e) selecção de uma biblioteca fágica apresentando anticorpos que se ligam especificamente ao antigénio desejado do passo (d).

Cadeias L comummente partilhadas podem também ser obtidas através dos seguintes passos (a) a (e): (a) produção de hospedeiros que segreguem a cadeia H de um anticorpo que se liga a um antigénio desejado; (b) introdução da biblioteca de cadeia L do anticorpo nos hospedeiros do passo (a), e secreção de uma biblioteca fágica apresentando anticorpos constituídos pelas cadeias H e L acima mencionadas; (c) selecção de uma biblioteca fágica que apresenta os anticorpos que se ligam especificamente ao antigénio desejado do passo (a); (d) introdução da biblioteca fágica seleccionada no passo (c) em hospedeiros que segregam uma cadeia H compreendendo uma sequência de aminoácido diferente daquela da cadeia H do passo (a) , e secreção de uma biblioteca fágica apresentando anticorpos constituídos pelas cadeias H e L; e (e) selecção de uma biblioteca fágica apresentando anticorpos que se ligam especificamente a um antigénio reconhecido pela cadeia H do passo (d).

Além disso, anticorpos de cadeia L comummente partilhada podem ser produzidos através da substituição de uma, duas ou três CDR de cadeias L comummente partilhadas produzidas tal como descrito acima com CDR de um primeiro anticorpo, um segundo anticorpo, ou outro anticorpo contra um primeiro antigénio ou um segundo antigénio, cujas CDR têm elevada homologia com as sequências de aminoácidos das CDR do primeiro anticorpo ou do segundo anticorpo.

Esta "substituição" de CDR pode ser realizada de forma apropriada pelo peritos na técnica utilizando técnicas conhecidas tais como baralhamento de CDR. Mais especificamente, pode ser realizada através dos métodos descritos nos Exemplos. 33 ΕΡ 1 876 236/ΡΤ

Estes anticorpos de cadeia L comummente partilhada são comparados com o anticorpo biespecifico original do passo (2), em que as cadeias L não foram comummente partilhadas, ou os anticorpos de cadeia L comummente partilhada produzidos no passo (4) em termos da sua actividade de ligação ao antigénio ou da sua actividade biológica, e anticorpos de cadeia L comummente partilhada possuindo as actividades desejadas podem ser seleccionados.

No contexto do presente invento, "actividade desejada" refere-se, por exemplo, "actividade" que é equivalente ou maior em comparação com a do anticorpo antes das cadeias L serem comummente partilhadas. Mais especificamente, refere-se à actividade que é equivalente ou maior como cofactor F. VIII/F. VlIIa, em comparação com a do anticorpo antes das cadeias L serem comummente partilhadas. Portanto, nos passos acima mencionados, por exemplo, são de preferência seleccionados anticorpos de cadeia L comummente partilhada em que a actividade como cofactor F. VIII/F. VlIIa é equivalente ou aumentada.

No método acima mencionado, os passos acima mencionados (6) e (7) são repetidos, se necessário, utilizando os anticorpos de cadeia L comummente partilhada produzidos no passo (7), para obter anticorpos de cadeia L comummente partilhada possuindo actividade que é equivalente ou maior em comparação com a do anticorpo biespecifico original produzido no passo (2) . Sem limitação particular, a "repetição" acima mencionada refere-se de preferência a repetição duas vezes ou mais.

Os anticorpos biespecificos compreendendo cadeias L comummente partilhadas, que são produzidos através dos métodos acima mencionados do presente invento, estão também compreendidos no presente invento.

Numa concretização do presente invento, os anticorpos possuem actividade para substituir funcionalmente o cofactor F. VIII; portanto, espera-se que os anticorpos do presente invento se tornem agentes farmacêuticos eficazes para doenças causadas pela actividade (função) reduzida deste cofactor. Exemplos das doenças acima mencionadas incluem, mas não estão 34 ΕΡ 1 876 236/ΡΤ limitados a, hemorragia, doenças que acompanham hemorragia, e doenças causadas por hemorragia. Por exemplo, a redução ou deficiência na função de F. VIII/F. VlIIa causa um distúrbio de hemorragia designado hemofilia.

Entre as hemofilias, um distúrbio de hemorragia surgindo de uma redução ou deficiência congénita na função de F. VIII/F. VlIIa é designada hemofilia A. 0 sangramento num paciente de hemofilia A é tratado através de terapia de substituição utilizando uma preparação de F. VIII. Quando o exercício ou excursão dura provocam hemorragia intra-articular frequente, ou quando um paciente tem grave hemofilia, a administração preventiva de uma preparação de F. VIII pode ser conduzida (Nilsson IM et al., J. Intern. Med., 1992, Vol. 235, pág. 25-32; Lõfqvist T et al., J. Intern. Med., 1997, Vol. 241, pág. 395-400) . Uma vez que a administração preventiva de uma preparação de F. VIII diminui dramaticamente os episódios de hemorragia em pacientes com hemofilia A, tal prática tem-se tornado comum nos últimos anos. A diminuição dos episódios de hemorragia não só reduz os riscos de hemorragia letal e não letal e o sofrimento acompanhando tal hemorragia, mas também previne a artropatia hemofílica causada por hemorragia intra-articular frequente. Como resultado, a qualidade de vida de pacientes com hemofilia A pode ser grandemente melhorada. A semivida de uma preparação de F. VIII no sangue é curta, aproximadamente 12 a 16 horas. Portanto, para prevenção contínua, a preparação de F. VIII deve ser administrada aproximadamente três vezes por semana. Esta dosagem mantém a actividade F. VIII a aproximadamente 1% ou mais ("The 24th Academic Meeting of the Japanese Society on Thrombosis and Hemostasis", Academic Special Committee, Committee for discussing on standardization of hemophilia, mini-simpósio, 2001) . Na terapia de reposição no momento da hemorragia, a menos que a hemorragia seja leve, a administração adicional da preparação de F. VIII deve também ser realizada regularmente durante um certo período para evitar nova hemorragia e alcançar hemostasia completa.

Uma preparação de F. VIII é tipicamente administrada por via intravenosa. No entanto, existem dificuldades técnicas associadas à administração intravenosa. Em particular, a 35 ΕΡ 1 876 236/ΡΤ administração a pacientes jovens é ainda mais difícil porque as veias alvo são geralmente bastante estreitas.

Muitas vezes, o tratamento em casa e a auto-injecção são realizados para a administração preventiva da preparação de F. VIII, e para a administração de emergência aquando de hemorragia. A necessidade de administração frequente e as dificuldades técnicas de administração não só causam sofrimento ao paciente, como também levam os pacientes a sair da terapia domiciliária e da auto-injecção. Portanto, existe uma forte procura de agentes farmacêuticas que possam ser administrados a intervalos mais longos ou mais facilmente, em comparação com as preparações de factor de coagulação VIII actualmente disponíveis.

Em pacientes de hemofilia A, particularmente pacientes graves de hemofilia A, podem aparecer anticorpos contra F. VIII chamados inibidores. Quando tais inibidores são produzidos, o efeito da preparação de F. VIII é perturbado pelos inibidores. Como resultado, a gestão da hemostasia em pacientes torna-se muito difícil.

Quando ocorre hemorragia em tais pacientes de inibidor de hemofilia A, normalmente, é realizado tratamento de neutralização utilizando grandes quantidades de uma preparação de F. VIII, ou tratamento de derivação utilizando um concentrado complexo ou uma preparação de F. Vila. No entanto, no método de neutralização, a administração de uma grande quantidade da preparação de F. VIII pode em vez disso aumentar o título do inibidor (anticorpo anti-F. VIII). 0 tratamento de derivação tem também desvantagens, designadamente a curta semivida (aproximadamente 2 a 8 horas) do concentrado de complexo ou da preparação de F. VIIa no sangue. Uma vez que os seus mecanismos de acção são independentes da função de F. VIII/F. VlIIa, isto é, a função de catalisar a activação de F. X através de F. IXa, nalguns casos, o mecanismo de hemostasia não pode funcionar bem e não é assim produzida resposta. Como resultado, um efeito hemostático suficiente é muito mais difícil de obter em pacientes de inibidor de hemofilia A que em pacientes sem ser de inibidor de hemofilia A. Portanto, existe uma forte necessidade na técnica de um agente farmacêutico que não seja influenciado pela presença do 36 ΕΡ 1 876 236/ΡΤ inibidor, e também que substitua funcionalmente F. VIII/F. VlIIa.

Além da hemofilia e da hemofilia adquirida envolvendo auto-anticorpos anti-F. VIII, outro distúrbio de hemorragia conhecido relacionado com F. VIII/F. VlIIa é a doença de von Willebrand causada por anomalia ou deficiência funcional do factor de von Willebrand (vWF). 0 vWF é necessário não só para que as plaquetas adiram normalmente aos tecidos subendoteliais num local lesionado de uma parede vascular, como também para que as plaquetas formem complexos com F. VIII para manter o F. VIII plasmático a um nivel normal. Tais funções são diminuídas e causam anomalias na função de hemostasia em pacientes de doença de von Willebrand.

Para o desenvolvimento de produtos farmacêuticos que (i) tenham longos intervalos de administração, (ii) possam ser administrados facilmente, (iii) não sejam influenciados pela presença de inibidores, e (iv) substituam funcionalmente F. VIII/F. VlIIa independentemente deles, podem ser utilizados métodos que utilizem anticorpos. A semivida do anticorpo no sangue é, em geral, relativamente longa, variando de alguns dias a algumas semanas. Os anticorpos translocam-se geralmente para o sangue após administração subcutânea. Isto é, geralmente, os produtos farmacêuticos anticorpos satisfazem as propriedades (i) e (ii) acima mencionadas. 0 presente invento proporciona composições (farmacêuticas) compreendendo os anticorpos do presente invento e transportadores farmaceuticamente aceitáveis. Por exemplo, espera-se que os anticorpos do presente invento que reconhecem tanto F. IX como F. IXa e F. X, e substituem funcionalmente F. VIII se tornem produtos farmacêuticos (composições farmacêuticas) ou agentes farmacêuticos para prevenção e/ou tratamento de hemorragia, doenças acompanhando hemorragia, doenças causadas por hemorragia, e semelhantes.

No contexto do presente invento, hemorragia, doenças acompanhando hemorragia, e/ou doenças causadas por hemorragia referem-se de preferência a doenças que se desenvolvem e/ou progridem devido à redução ou deficiência na actividade do factor de coagulação VIII e/ou factor de coagulação VIII 37 ΕΡ 1 876 236/ΡΤ activado. Tais doenças incluem hemofilia A, doenças em que aparece um inibidor contra o factor de coagulação VIII e/ou factor de coagulação VIII activado, hemofilia adquirida, e doença de von Willebrand, mas não estão limitadas a estes.

As composições farmacêuticas utilizadas para fins terapêuticos ou preventivos, que compreendem anticorpos do presente invento como ingredientes activos, podem ser formuladas através da mistura, se necessário, com transportadores farmaceuticamente aceitáveis adequados, veículos, e de modo a que sejam inactivos contra os anticorpos. Por exemplo, podem ser utilizados água esterilizada, solução salina fisiológica, estabilizadores, excipientes, antioxidantes (tais como ácido ascórbico), tampões (tais como fosfato, citrato, e outros ácidos orgânicos), anti-sépticos, tensioactivos (tais como PEG e Tween), agentes quelantes (tais como EDTA), e aglomerantes. Eles podem também compreender outros polipéptidos de baixo peso molecular, proteínas tais como albumina do soro, gelatina e imunoglobulinas, aminoácidos tais como glicina, glutamina, asparagina, arginina e lisina, açúcares e hidratos de carbono tais como polissacáridos e monossacáridos, e álcoois de açúcar tais como manitol e sorbitol. Ao preparar uma solução aquosa para injecção, podem ser utilizadas solução salina fisiológica e soluções isotónicas compreendendo glicose e outros adjuvantes tais como D-sorbitol, D-manose, D-manitol, e cloreto de sódio, e se necessário, em combinação com solubilizantes apropriados tais como álcool (por exemplo, etanol), poliálcoois (tais como propilenoglicol e PEG), e tensioactivos não iónicos (tais como polissorbato 80 e HCO-50).

Se necessário, os anticorpos do presente invento podem ser encapsulados em microcápsulas (p. ex., as feitas de hidroximetilcelulose, gelatina, e poli(metilmetacrilato)), ou incorporados como componentes de sistemas de distribuição de fármacos coloidais (p. ex., lipossomas, microesferas de albumina, micro-emulsão, nanoparticulas, e nanocápsulas) (ver, por exemplo, "Remington's Pharmaceutical Science 16th edition", Oslo Ed. (1980) ) . Os métodos para preparação dos agentes farmacêuticos como agentes farmacêuticos de libertação controlada são também bem conhecidos, e tais métodos podem ser aplicados aos anticorpos do presente invento (Langer et ai., 38 ΕΡ 1 876 236/ΡΤ J. Biomed. Mater. Res. 15: 267-277 (1981); Langer, Chemtech. 12: 98-105 (1982); Patente U.S. No. 3773919; Pedido de Patente EP No. 58481; Sidman et al., Biopolymers 22: 547-556 (1983);

Pedido de Patente EP No. 133,988).

Os anticorpos ou as composições farmacêuticas do presente invento podem ser utilizados em combinação com o factor de coagulação VIII, e podem ser administrados com factor de coagulação VIII simultaneamente ou em momentos diferentes. Os anticorpos ou as composições farmacêuticas do presente invento e o factor de coagulação VIII podem também ser combinados num estojo. Quando os anticorpos ou as composições farmacêuticas do presente invento e o factor de coagulação VIII são utilizados em combinação, a dose de cada componente pode ser reduzida, conforme necessário, em comparação com quando os componentes são administrados individualmente.

Dois ou mais tipos dos anticorpos biespecificos ou das composições farmacêuticas do presente invento podem ser utilizados em combinação, e estes anticorpos ou composições podem ser usados em conjunto com outros anticorpos biespecificos contra F. IX/F. IXa e F. X, anticorpos anti-F. IX/F. IXa, anticorpos anti-F. X, ou combinações destes. Quando dois ou mais tipos dos anticorpos biespecificos ou das composições farmacêuticas do presente invento são usados em combinação, ou quando estes anticorpos ou composições são utilizados em conjunto com outros anticorpos biespecificos contra F. IX/F. IXa e F. X, anticorpos anti-F. IX/F. IXa, anticorpos anti-F. X, ou combinações destes, eles podem ser administrados simultaneamente ou a momentos diferentes. 0 presente invento pode também ser realizado como um estojo que combina dois ou mais tipos dos anticorpos biespecificos ou das composições farmacêuticas do presente invento, ou combina estes anticorpos ou composições com outros anticorpos biespecificos contra F. IX/F. IXa e F. X, anticorpos anti-F. IX/F. IXa, anticorpos anti-F. X, ou combinações destes. Além disso, quando dois ou mais tipos dos anticorpos biespecificos ou das composições farmacêuticas do presente invento são utilizados em combinação, ou quando estes anticorpos ou composições são utilizados em conjunto com outros anticorpos biespecificos contra F. IX/F. IXa e F. X, anticorpos anti-F. IX/F. IXa, anticorpos anti-F. X, ou combinações destes, a dose 39 ΕΡ 1 876 236/ΡΤ de cada componente pode ser reduzida conforme necessário em comparação com quando os componentes são administrados individualmente. A dose de uma composição farmacêutica do presente invento pode ser apropriadamente determinada considerando a forma de dosagem, o método de administração, a idade do paciente e o peso corporal, sintomas do paciente, tipo de doença, e grau de progresso da doença, e é finalmente decidida pelos médicos. Geralmente, a dose diária para um adulto é de 0,1 mg a 2000 mg de uma só vez ou em várias porções. A dose é de maior preferência 1 a 1000 mg/dia, ainda de preferência 50 a 500 mg/dia, e ainda de maior preferência 100 a 300 mg/dia. Estas doses podem variar, dependendo do peso corporal do paciente e da idade, e o método de administração; no entanto, a selecção da dosagem adequada está bem dentro da competência dos peritos na técnica. Do mesmo modo, o período de dosagem pode ser determinado apropriadamente de acordo com o progresso terapêutico. A terapia génica pode ser realizada através da incorporação de genes codificando os anticorpos do presente invento em vectores para terapia génica. Além da administração directa utilizando plasmídeos nus, métodos de administração adequados incluem administração após empacotamento em lipossomas e tais, formando uma variedade de vectores virais, tais como vectores retrovirais, vectores adenovirais, vectores de vírus vacínia, vectores de poxvírus, vectores de vírus adeno-associados, e vectores HVJ (ver Adolph "Virai Genome Methods" CRC Press, Florida (1996)), ou revestimento com contas de transporte tais como partículas de ouro coloidal (WO 93/17706, e tais) . No entanto, desde que os anticorpos sejam expressos in vivo e as suas actividades sejam exercidas, qualquer método pode ser utilizado para administração. De preferência, uma dose suficiente pode ser administrada através de uma via parentérica adequada (tal como, por exemplo, injecção ou infusão por via intravenosa, intraperitoneal, subcutânea, intradérmica, intramuscular, em tecidos adiposos ou glândulas mamárias; inalação; bombardeamento de partículas dirigido por gás (utilizando canhão de electrões e outros); ou via mucosa tal como gotas nasais). Alternativamente, os genes codificando os anticorpos do presente invento podem ser 40 ΕΡ 1 876 236/ΡΤ administrados em células sanguíneas, células de medula óssea, e outras ex vivo utilizando transfecção de lipossomas, bombardeamento de partículas (Patente U.S. No. 4945050), ou infecção virai, e as células podem ser reintroduzidas em animais. Qualquer gene codificando um anticorpo do presente invento pode ser utilizado em terapia génica, e seus exemplos incluem genes compreendendo sequências nucleotídicas codificando as CDR de A44, A69, e B26 acima descritas. O presente invento proporciona métodos para prevenção e/ou tratamento de hemorragia, doenças acompanhando hemorragia, e/ou doenças causadas por hemorragia, tais métodos compreendendo a administração dos anticorpos ou das composições do presente invento. Os anticorpos ou as composições podem ser administrados, por exemplo, através dos métodos acima mencionados. 0 presente invento refere-se também à utilização dos anticorpos do presente invento para produção de composições (farmacêuticas) do presente invento.

Além disso, o presente invento proporciona estojos a utilizar para os métodos acima mencionados, tais estojos compreendendo pelo menos um anticorpo ou uma composição do presente invento. Além disso, os estojos podem incluir, embalados com eles, uma seringa, agulha de injecção, veículo farmaceuticamente aceitável, algodão embebido em álcool, penso rápido, instruções descrevendo o método de utilização, e semelhantes.

Exemplos

Adiante, o presente invento é descrito especificamente utilizando Exemplos.

[Exemplo 1] Produção de anticorpo não neutralizante para o Factor IXa (F. IXa) 1-1. Imunização e produção de hibridomas

Oito ratinhos BALB/c (machos, com 6 semanas de idade no início da imunização, Charles River Laboratories Japan, Inc.) 41 ΕΡ 1 876 236/ΡΤ e cinco ratinhos MRL/lpr (machos, com 6 semanas de idade no inicio da imunização, Charles River Laboratories Japão, Inc.) foram imunizados contra Factor IXa humano (Enzyme Research Laboratories, Inc.) tal como descrito abaixo. Tal como a primeira imunização, 40 pg/cabeça de Factor IXa , emulsionado através de adjuvante completo de Freund (FCA) , H37Ra (Difco Laboratories), foi administrado subcutaneamente. Duas semanas depois, 40 pg/cabeça de Factor IXa , emulsionado através de adjuvante incompleto de Freund (FIA, Difco Laboratories), foi administrado subcutaneamente. A partir dai, a intervalos semanais, foram administrados reforços três a sete vezes. Após ter sido confirmado um aumento no titulo de anticorpo no soro contra o Factor IXa através de um ensaio imunossorvente ligado a enzimas (ELISA) descrito no seguinte Exemplo 1-2, 40 g/cabeça de Factor IXa 40 g/cabeça de Factor IXa diluído com solução salina tamponada com fosfato isenta de iões de cálcio e magnésio (PBS (-)),foram administrados por via intravenosa como imunização final. Três dias após a imunização final, os baços foram extraídos. Uma primeira parte de cada baço foi utilizada no Exemplo 10-2. As restantes células do baço foram fundidas com células de mieloma de ratinho, P3X63Ag8U.l (daqui em diante referidas como P3U1, ATCC CRL-1597), de acordo com o método convencional, utilizando PEG1500 (Roche Diagnostics) . As células fundidas, suspensas em meio RPMI1640 (Invitrogen) contendo FBS a 10% (Invitrogen) (daqui em diante referido como FBS a 10%/RPMI 1640), foram plaqueadas em placas de cultura de 96 poços. Nos dias 1, 2, 3, e 5 após a fusão das células, o meio foi substituído com meio selectivo HAT (FBS a 10%/RPMI 1640/HAT a 2% concentrado 50x (Dainippon Sumitomo Pharma Co., Ltd.)/BM-Condimed Hl a 5% (Roche Diagnostics)) para cultivar selectivamente os hibridomas. O sobrenadante da cultura colhido no dia 8 ou 9 após a fusão celular foi utilizado para medir a actividade de ligação ao Factor IXa utilizando um ELISA descrito no Exemplo 1-2 e os hibridomas possuindo actividade de ligação ao Factor IXa foram seleccionados. Subsequentemente, a actividade de neutralização da actividade enzimática do Factor IXa foi medida através do método descrito no Exemplo 1-3, e os hibridomas não possuindo actividade de neutralização para o Factor IXa foram seleccionados. Os hibridomas foram clonados através da realização de diluição limitante duas vezes, em que uma célula por poço foi plaqueada em placas de cultura de 96 poços. Nas 42 ΕΡ 1 876 236/ΡΤ células que foram confirmadas como colónias individuais através de observação microscópica, ELISA e medição da actividade de neutralização descrita nos Exemplos 1-2 e 1-3 foram realizados, e os clones foram seleccionados. As ascites do anticorpo clonado foram preparadas através do método descrito no Exemplo 1-4 e o anticorpo foi purificado a partir das ascites. Foi confirmado que o anticorpo purificado não prolongou o tempo de tromboplastina parcial activada (APTT) através do método descrito no Exemplo 1-5. 1-2. ELISA do Factor iXa

Após o Factor IXa , diluído a 1 yg/ml com um tampão de revestimento (bicarbonato de sódio 100 mM, pH 9,6, azida de sódio a 0,02%), ser dispensado numa placa Nunc-Immuno (placas Nunc-Immuno" 96 MicroWell™ MaxiSorp™ (Nalge Nunc

International)) a 100 μΐ/poço, foi incubado de um dia para o outro a 4°C. Após a placa ter sido lavada três vezes com PBS (-) contendo Tween® 20, foi bloqueada à temperatura ambiente durante duas horas com um tampão de diluição (Tris-HCl 50 mM, pH 8,1, albumina de soro bovino a 1%, MgCl2 1 mM, NaCl 0,15 M, Tween® 20 a 0,05%, azida de sódio a 0,02%). Após o tampão ser removido, anti-soro de ratinho ou o sobrenadante da cultura de hibridoma diluído com o tampão de diluição foi adicionado a 100 μΐ/poço à placa e incubado à temperatura ambiente durante uma hora. Após a placa ter sido lavada três vezes, 100 μΐ/poço de IgG de cabra anti-ratinho marcado com fosfatase alcalina (H+L) (Zymed Laboratories), diluído a 1/2000 com o tampão de diluição, foi adicionado e incubado à temperatura ambiente durante uma hora. Após a placa ter sido lavada seis vezes, 100 μΐ/poço de substrato colorimétrico Blue-Phos™ Microwell Substrato Fosfatase (Kirkegaard & Perry Laboratories) foi adicionado e incubado à temperatura ambiente durante 20 minutos. Após 100 μΐ/poço de Blue-Phos™, Solução Stop (Kirkegaard & Perry Laboratories) foi adicionada, a absorvância a 595 nm foi medida através de Microplate Reader Model 3550 (Bio-Rad Laboratories). 1-3. Medição da actividade de neutralização do Factor IXa 400 pg/ml de solução de fosfolípidos foram preparados através da dissolução de fosfolípidos (Sigma-Aldrich) com água 43 ΕΡ 1 876 236/ΡΤ destilada para injecção e submissão a ultra-sons. 40 1 de solução salina fisiológica tamponada com Tris contendo albumina de soro bovino a 0,1% (daqui em diante, referido como TBSB), 10 μΐ de Factor IXa a 30 ng/ml (Enzyme Research

Laboratories), 5 μΐ de solução de fosfolipidos a 400 pg/ml, 5 μΐ de TBSB contendo CaCl2 100 mM e MgCl2 20 mM e 10 μΐ de sobrenadante da cultura de hibridoma foram misturados numa placa de 96 poços, seguido de incubação à temperatura ambiente durante uma hora. 20 μΐ de Factor X a 50 pg/ml (Enzyme Research Laboratories) e 10 μΐ de Factor VIII a 3 U/ml (American diagnostica) foram adicionados a esta solução mista e feitos reagir à temperatura ambiente durante 30 minutos. A reacção foi parada através da adição de 10 μΐ de EDTA 0,5 M à mistura reaccional. Após 50 μΐ de solução S-2222 (Chromogenix) serem adicionados à solução reaccional e incubados à temperatura ambiente durante 30 minutos, a absorvância a 405 nm de comprimento de onda de medição, 655 nm de comprimento de onda de controlo foi medida através de Leitor de Microplacas Modelo 3550 (Bio-Rad Laboratories, Inc.) . 1-4. Produção de ascites e purificação de anticorpo A produção de ascites do hibridoma estabelecido foi realizada de acordo com o método convencional. Especificamente, 2*105 células de hibridoma cultivadas in vitro foram transplantadas nas cavidades abdominais de ratinhos BALB/c (machos, com 5 a 7 semanas de idade quando a experiência começou, Charles River Laboratories Japan) ou ratinhos BALB/c nus (machos, com 5 a 6 semanas de idade no início da experiência, Charles River Laboratories Japan e CLEA Japan, Inc.), ao qual tinha sido administrado pristano (2, 6, 10, 14-tetrametilpentadecano; Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) duas vezes por via intraperitonealmente. As ascites foram colhidas dos ratinhos cujos abdómenes estavam aumentados, uma a quatro semanas após o transplante. A purificação do anticorpo a partir das ascites foi realizada utilizando coluna Fast Flow de Proteína G-Sepharose” 4 (Amersham Biosciences) . As ascites, diluídas duas vezes no tampão de ligação (acetato de sódio 20 mM, pH 5,0), foram aplicadas à coluna e lavadas com 10 volumes da coluna de tampão de ligação. O anticorpo foi eluído em 5 volumes da coluna do 44 ΕΡ 1 876 236/ΡΤ

tampão de eluição (glicina-HCl 0,1 M, pH 2,5), e neutralizado com o tampão de neutralização (Tris-HCl 1 M, pH 9,0) . A solução resultante foi condensada com Centriprep™ 10 (Millipore), e o solvente foi substituído por TBS (solução salina tamponada com Tris 50 mM). A concentração de anticorpo foi calculada a partir da absorvância a 280 nm com base em A (1%, 1 cm) = 13,5. A absorvância foi medida através de DU-650 (Beckman Coulter). 1- 5. Medição do tempo de tromboplastina parcial activada (APTT) APTT foi medido através de KC10A (Amelung) ligada a CR-A (Amelung) . Uma mistura de 50 μΐ da solução de anticorpo, diluída com TBSB, 50 μΐ de plasma humano padrão (Dade Behring), e 50 μΐ de reagente de APTT (Dade Behring), foi aquecida a 37°C durante 3 minutos. A reacção de coagulação foi iniciada através da adição de 50 μΐ de CaCÍ2 20 mM (Dade Behring) à mistura e foi medido o tempo de coagulação.

[Exemplo 2] Produção de anticorpo não neutralizante contra o Factor X (F. X) 2- 1. Imunização e produção de hibridoma

Oito ratinhos BALB/c (machos, com 6 semanas de idade no início da imunização, Charles River Laboratories Japan) e cinco ratinhos MRL/lpr (machos, com 6 semanas de idade no início da imunização, Charles River Laboratories Japan) foram imunizados contra Factor X humano (Enzyme Research Laboratories, Inc.) tal como descrito abaixo. Tal como a primeira imunização, 40 pg/cabeça de Factor X, emulsionado com FCA, foi administrado por via subcutânea. Após duas semanas, 20 ou 40 pg/cabeça de Factor X, emulsionado com FIA, foi administrado por via subcutânea. Daí em diante, a intervalos semanais, os reforços foram administrados 3 a 6 vezes no total. Após um aumento no título sérico do anticorpo contra Factor X ter sido confirmado através do ELISA descrito no Exemplo 2-2, 20 ou 40 pg/cabeça de Factor X, diluído em PBS (-) , foi administrado por via intravenosa como imunização final. Três dias após a imunização final, os baços dos ratinhos foram removidos. Uma primeira parte de cada baço foi usada no Exemplo 10-2. As restantes células do baço foram fundidas com células de mieloma de ratinho, P3U1, de acordo com o método convencional, utilizando 45 ΕΡ 1 876 236/ΡΤ PEG1500. As células fundidas, suspensas em FBS a 10%/meio RPMI1640, foram plaqueadas numa placa de cultura de 96 poços. Nos dias 1, 2, 3, e 5 após a fusão celular, o meio foi substituído com meio selectivo HAT para cultivar selectivamente os hibridomas. A actividade de ligação ao Factor X foi medida utilizando o sobrenadante da cultura colhido no dia 8 após a fusão celular através da utilização do ELISA descrito no Exemplo 2-2. Os hibridomas possuindo a actividade de ligação ao Factor X foram seleccionados. Subsequentemente, a actividade de neutralização da actividade enzimática do Factor Xa foi medida, tal como descrito no Exemplo 2-3. Os hibridomas não possuindo actividade de neutralização para o Factor Xa foram clonados através da realização de diluição limitante duas vezes. As ascites do anticorpo clonado foram produzidas através do método descrito no Exemplo 1-4 para purificar o anticorpo a partir das ascites. Foi confirmado que o anticorpo purificado não prolonga APTT através do método descrito no Exemplo 1-5.

2-2. ELISA do Factor X

Após o Factor X, diluído até 1 g/ml com o tampão de revestimento, ser dispensado em placas Nunc-Immuno a 100 1/poço, incubou-se de um dia para o outro a 4°C. A placa foi lavada três vezes com PBS (-) contendo Tween® 20, e em seguida bloqueada à temperatura ambiente durante duas horas através do tampão de diluição. Após o tampão ser removido, o anti-soro de ratinho ou o sobrenadante da cultura de hibridoma, diluído com o tampão de diluição, foi adicionado à placa, e incubado à temperatura ambiente durante uma hora. Após a placa ser lavada três vezes, IgG de cabra anti-ratinho marcado com fosfatase alcalina (H+L), diluído a 1/2000 com o tampão de diluição, foi adicionado e incubado à temperatura ambiente durante uma hora. Após a placa ser lavada 6 vezes, 100 μΐ/poço de substrato colorimétrico Blue-Phos™ Phosphate Substrate (Kirkegaard & Perry Laboratories) foi adicionado e incubado à temperatura ambiente durante 20 minutos. Após serem adicionados 100 μΐ/poço de Blue-Phos™ Stop Solution (Kirkegaard & Perry Laboratories), a absorvância a 595 nm foi medida com o Leitor de Microplacas Modelo 3550 (Bio-Rad Laboratories). 46 ΕΡ 1 876 236/ΡΤ 2- 3. Medição da actividade de neutralização do Factor Xa 10 μΐ de sobrenadante de cultura de hibridoma, diluído cinco vezes com TBSB, e 40 μΐ de TBCP (TBSB contendo CaCl2 2,78 mM, fosfolípidos 22,2 μΜ (fosfatidilcolina: fosfatidilserina = 75:25, Sigma-Aldrich)) contendo 250 pg/ml de Factor Xa (Enzyme Research Laboratories) foram misturados e incubados à temperatura ambiente durante uma hora. 50 μΐ de TBCP, contendo 20 pg/ml de protrombina (Enzyme Research Laboratories) e 100 ng/ml de factor de coagulação V activado (Factor Va; Haematologic Technologies), foram adicionados a esta solução misturada e feitos reagir à temperatura ambiente durante 10 minutos. A reacção foi parada através da adição de 10 μΐ de EDTA 0,5 M. Após 50 μΐ de solução S-2238 1 mM (Chromogenix) serem adicionados a esta solução reaccional e incubados à temperatura ambiente durante 30 minutos, a absorvância a 405 nm foi medida com o Leitor de Microplacas Modelo 3550 (Bio-Rad Laboratories).

[Exemplo 3] Construção de vectores de expressão de anticorpos biespecíficos quiméricos 3- 1. Preparação de fragmentos de ADN codificando regiões variáveis de anticorpo de hibridomas

A partir de hibridomas produtores de anticorpo anti-F. IXa ou anticorpo anti-F. X, ARN totais foram extraídos utilizando QIAGEN® Rneasy® Mini Kit (QIAGEN) de acordo com o método descrito no manual de instruções. Os ARN totais foram dissolvidos em 40 μΐ de água esterilizada. ADNc de cadeia simples foram sintetizados através do método de RT-PCR utilizando o sistema de síntese de ADNc SuperScript (Invitrogen) de acordo com o método descrito no manual de instruções, utilizando 1 a 2 pg dos ARN purificados como molde. 3-2. Amplificação por PCR e análise da sequência da região variável da cadeia H do anticorpo

Como iniciadores para amplificação dos ADNc da região variável da cadeia H do anticorpo de ratinho (VH), foi preparada a mistura de iniciadores HB e mistura de iniciadores HF descrita no relatório de Krebber et ai. (J. Immunol. Methods 47 ΕΡ 1 876 236/ΡΤ 1997; 201: 35-55). 25 μΐ da solução reaccional (2,5 μΐ da solução de ADNc preparada no Exemplo 3-1, tampão KOD plus (TOYOBO), dNTP 0,2 mM, MgCl2 1,5 mM, e 0,75 unidades de ADN-polimerase KOD plus (TOYOBO)) foi preparada utilizando 0,5 μΐ cada de mistura reaccional de HB 100 μΜ e mistura reaccional de HF 100 μΜ. A PCR foi realizada utilizando o sistema Thermal Cycler GeneAmp PCR 9700 (Perkin Elmer) na condição A (aquecimento a 98°C durante 3 minutos, seguido de 32 ciclos de reacções a 98°C durante 20 segundos, 58°C durante 20 segundos, e 72°C durante 30 segundos) ou na condição B (aquecimento a 94°C durante 3 minutos, seguido de 5 ciclos de reacções a 94°C durante 20 segundos, 46°C durante 20 segundos, e 68°C durante 30 segundos, e mais 30 ciclos de reacções a 94°C durante 20 segundos, 58°C durante 20 segundos, 72°C durante 30 segundos) de acordo com a eficiência da amplificação dos fragmentos de ADNc. Após realização da PCR, a solução reaccional foi sujeita a electroforese em gel de agarose a 1%. Os fragmentos amplificados de tamanho desejado (cerca de 400 pb) foram purificados utilizando o QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN) através do método descrito no manual de instruções anexo e eluidos utilizando 30 μΐ de água esterilizada. A sequência nucleotidica de cada fragmento de ADN foi determinada utilizando BigDye Terminator Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems) com o sequenciador de ADN ABI PRISM 3100 Genetic Analyzer (Applied Biosystems) de acordo com o método descrito no manual de instruções anexo. As sequências determinadas pelo presente método foram comparadas e analisadas utilizando GENETYX-SV/RC Versão 6.1 (Genetyx) e foram seleccionadas aquelas possuindo sequências diferentes. 3-3. Preparação de fragmentos de ADN da região variável de anticorpo para clonagem

Para adicionar o local de clivagem da enzima de restrição Sfi I para clonagem a ambas as extremidades dos fragmentos de amplificação da região variável do anticorpo, foram realizados os seguintes procedimentos.

Para amplificação do fragmento VH incluindo um local de clivagem Sfi I adicionado (Sfi I-VH), foi preparado o iniciador VH-extremidade 5' cuja sequência (Gly4Ser)2-ligador do iniciador HB tinha sido alterada na sequência possuindo o local 48 ΕΡ 1 876 236/ΡΤ de clivagem Sfi I (SEQ ID NO: 42). Utilizando 0,5 μΐ de cada um de iniciador específico da sequência VH-extremidade 5' 10 μΜ e iniciador scfor 10 μΜ (J. Immunol. Methods 1997; 201: 35-55) , foram preparados 20 μΐ de solução reaccional (1 μΐ de solução de fragmento de amplificação de ADNc de VH purificado preparado no Exemplo 3-2, tampão KOD plus (TOYOBO), dNTP 0,2 mM, MgCÍ2 1,5 mM, 0,5 unidades de ADN-polimerase KOD plus (TOYOBO)). A PCR foi realizada utilizando o sistema Thermal Ciclor GeneAmp PCR 9700 (Perkin Elmer) na condição A (aquecimento a 98°C durante 3 minutos, seguido por 32 ciclos de reacções a 98 °C durante 20 segundos, 58 °C durante 20 segundos, e 72 °C durante 30 segundos) ou na condição B (aquecimento a 94°C durante 3 minutos, seguido de 5 ciclos de reacções a 94°C durante 20 segundos, 46°C durante 20 segundos, e 68°C durante 30 segundos, e mais 30 ciclos de reacções a 94°C durante 20 segundos, 58°C durante 20 segundos, e 72°C durante 30 segundos) de acordo com a eficiência de amplificação dos fragmentos de ADNc. Após a realização da PCR, a solução reaccional foi sujeita a electroforese em gel de agarose a 1%. Os fragmentos amplificados de tamanho desejado (cerca de 400 pb) foram purificados utilizando QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN) através do método descrito no manual de instruções anexo e eluídos utilizando 30 μΐ de água esterilizada.

Para amplificação de um fragmento de ADNc da região variável da cadeia L de anticorpo de ratinho (VL), primeiro, utilizando 0,5 μΐ de cada de mistura de iniciadores LB 100 μΜ e mistura de iniciadores LF 100 μΜ descritas no relatório de Krebber et al. (J. Immunol. Methods 1997; 201: 35-55), foram preparados 25 μΐ da solução reaccional (2,5 μΐ da solução de ADNc preparada no Exemplo 3-1, tampão KOD plus (TOYOBO), dNTP 0,2 mM, MgCl2 1,5 mM, 0,75 unidades de ADN-polimerase KOD plus (TOYOBO)). A PCR foi realizada utilizando o sistema Thermal Ciclor GeneAmp PCR 9700 (Perkin Elmer) nas condições de aquecimento a 94°C durante 3 minutos, seguido por 5 ciclos de reacções a 94°C durante 20 segundos, 46°C durante 20 segundos, e 68°C durante 30 segundos, e mais 30 ciclos de reacções a 94°C durante 20 segundos, 58°C durante 20 segundos, e 72°C durante 30 segundos, de acordo com a eficiência de amplificação dos fragmentos de ADNc. Após realização da PCR, a solução reaccional foi sujeita a electroforese em gel de agarose a 1%. Os fragmentos amplificados de tamanho desejado (cerca de 400 49 ΕΡ 1 876 236/ΡΤ pb) foram purificados utilizando QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN) através do método descrito no manual de instruções anexo e eluidos utilizando 30 μΐ de água esterilizada. Os fragmentos estavam num estado em que a sequência de (Gly4Ser)3-ligador derivada do iniciador LF foi adicionada ao seu terminal C. Para adicionar um local de clivagem Sfi I ao seu terminal C, foi preparado o iniciador VL-extremidade 3' em que a sequência de (Gly4Ser)3-ligador do iniciador LF foi alterada para a sequência possuindo o local de clivagem Sfi I (SEQ ID NO: 43). Para amplificar o fragmento VL incluindo o local de clivagem Sfi I adicionado (Sfi I-VL), foram utilizados 0,5 μΐ de cada uma da mistura de iniciadores de VL-extremidade 3' 10 μΜ e iniciador scback 10 μΜ para preparar 20 μΐ de solução reaccional (1 μΐ de solução de fragmento de amplificação de ADNc de VL purificada, tampão KOD plus (TOYOBO), dNTP 0,2 mM, MgCl2 1,5 mM, 0,5 unidades de ADN-polimerase KOD plus (TOYOBO)). A PCR foi realizada utilizando o sistema Thermal Ciclor GeneAmp PCR 9700 (Perkin Elmer) sob as condições de aquecimento a 94°C durante 3 minutos, seguido por 5 ciclos de reacções a 94°C durante 20 segundos, 46°C durante 20 segundos e 68°C durante 30 segundos, e mais 30 ciclos de reacções a 94°C durante 20 segundos, 58°C durante 20 segundos, e 72°C durante 30 segundos. Após realização da PCR, a solução reaccional foi sujeita a electroforese em gel de agarose a 1%. Os fragmentos amplificados do tamanho desejado (cerca de 400 pb) foram purificados utilizando QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN) através do método descrito no manual de instruções anexo e eluidos utilizando 30 μΐ de água esterilizada.

Os fragmentos Sfi I-VH e Sfi I-VL purificados foram digeridos com Sfi I (TAKARA) a 50°C de um dia para o outro na solução reaccional preparada de acordo com o método descrito no manual de instruções anexo. Subsequentemente, a solução reaccional foi purificada utilizando QIAquick PCR Purification Kit (QIAGEN) através do método descrito no manual de instruções anexo, e eluida utilizando 30 μΐ de Tampão EB ligado ao estojo. 3-4. Plasmideos de expressão de anticorpos IgG biespecificos

Quando os anticorpos IgG biespecificos desejados foram produzidos, produtos de substituição de aminoácidos na região CH3 de IgG4 foram preparados com referência à técnica de botões 50 ΕΡ 1 876 236/ΡΤ nas casas de IgGl (Ridgway et al., Protein Eng. 1996; 9: 617-621) para formar moléculas heterógenas de cada cadeia H. Tipo a (IgG4ya) é um produto de substituição de Y349C ou T366W, e tipo b (IgG4yb) é um produto de substituição de E356C, T366S, L368A, ou Y407V. Além disso, as substituições (-ppcpScp- - e -ppcpPcp-) foram introduzidas na região charneira de ambos os tipos de produtos de substituição. De acordo com a presente técnica, quase todas as cadeias H se podem tornar heterógenas. No entanto, este não é o caso para as cadeias L, e há o receio de a produção desnecessária de uma molécula de anticorpo poder influenciar a subsequente medição da actividade. Portanto, na presente estratégia, vectores de expressão induzidos por diferentes agentes foram utilizados como vectores de expressão correspondendo a cada um braço da molécula de anticorpo (referido como molécula HL) para expressar separadamente cada molécula HL possuindo cada especificidade e produzir eficientemente o tipo desejado de anticorpo IgG biespecifico nas células.

(SEQ

Para expressão de um braço de molécula de anticorpo (por conveniência, referido como molécula HL do braço direito), foi preparado pcDNA4-g4H ou pcDNA4-g4L, em que a jusante da região correspondente da cadeia H ou da cadeia L (Fig. 1 ou 2), isto é, a sequência sinal para células animais (IL3ss) (Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1984; 81: 1075), uma região variável do anticorpo de ratinho apropriada (VH ou VL) e a região constante de IgG4 a humana (SEQ ID NO: 44) ou a região constante ID NO: 45) foram incorporadas no vector indutivel por tetraciclina pcDNA4 (Invitrogen). Primeiro, pcDNA4 foi digerido com as enzimas de restrição Eco RV e Not I (TAKARA) cujos locais de restrição existem no local de multiclonagem. Após a cadeia H do braço direito do anticorpo biespecifico quimérico ou a unidade de expressão da cadeia L (respectivamente, cerca de 1,6 kb ou cerca de 1,0 kb) ser digerido com Xho I (TAKARA) , foi purificada utilizando QIAquick PCR Purification Kit (QIAGEN) através do método descrito no manual de instruções anexo, as extremidades foram terminadas de forma cega com ADN-polimerase KOD (TOYOBO) através de reacção a 72 °C durante 10 minutos na solução reaccional descrita no manual de instruções anexo. Os fragmentos terminados de forma cega foram purificados utilizando QIAquick PCR Purification Kit (QIAGEN) através do método descrito no 51 ΕΡ 1 876 236/ΡΤ manual de instruções anexo e digeridos com Not I (TAKARA). Os fragmentos terminados com Not I (cerca de 1,6 kb e 1,0 kb, respectivamente) e pcDNA4 gue tinham sido digeridos com Eco RV—Not I foram ligados utilizando Ligation High (TOYOBO) de acordo com o método descrito no manual de instruções anexo. A estirpe de E.coli DH5 (Competent high DH5 (TOYOBO)) fo transformada com a solução reaccional. Os respectivos ADN plasmidicos foram isolados a partir dos clones resistentes à ampicilina obtidos utilizando QIAprep Spin Miniprep Kit (QIAGEN).

Para o outro braço (por conveniência, referido como a molécula HL do braço esquerdo), foi preparado pIND-g4H ou pIND-g4L, em que a jusante das correspondentes regiões de cadeia H ou cadeia L (Fig. 2 ou 3), isto é, a sequência sinal para células animais (IL3ss) (EMBO. J. 1987; 6: 2939), uma região variável de anticorpo de ratinho apropriada (VH ou VL) e a região constante de IgG4 b humana (SEQ ID NO: 46) ou a região constante (SEQ ID NO: 45) foram incorporadas no vector indutivel por análogo de ecdisona pIND (Invitrogen) de acordo com o método acima descrito. Os respectivos ADN plasmidicos foram então isolados tal como descrito acima. 3-5. Construção de vectores de expressão de anticorpos biespecificos O plasmideo de expressão indutivel por tetraciclina (pcDNA4-g4H ou pcDNA4-g4L) preparado no Exemplo 3-4 foi digerido com Sfi I, e a solução reaccional foi sujeita a electroforese em gel de agarose a 1%. Os fragmentos (cerca de 5 kb) em que a região variável do anticorpo originalmente presente (VH ou VL (ver Fig. 1 ou 2) ) foi removida foram purificados utilizando QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN) através do método descrito no manual de instruções anexo, e eluidos utilizando 30 μΐ de água esterilizada. Estes fragmentos e os seus correspondentes fragmentos Sfi I-VH ou Sfi I-VL, derivados do anticorpo de F. IXa digerido com Sfi I preparado no Exemplo 3-3, foram ligados utilizando Quick Ligation Kit (New England Biolabs) de acordo com o método descrito no manual de instruções anexo. A estirpe de E. coli, DH5 (Competent high DH5 (TOYOBO)) foi transformada com a 3θφ&ο reaccional. Além disso, o fragmento em que a região variável do anticorpo 52 ΕΡ 1 876 236/ΡΤ (VH ou VL, ver Fig. 3 ou 2) foi removida do plasmídeo de expressão indutivel por análogo de ecdisona digerido com Sfi I (Exemplo 3-4, pIND-g4H ou pIND-g4L) através de um método similar ao descrito acima, e o fragmento Sfi I-VH ou Sfi I-VL derivado do anticorpo anti-F. X digerido com Sfi I foram incorporados através de um método similar ao descrito acima.

Foi confirmado que os respectivos transformantes resistentes a ampicilina resultantes têm a inserção do fragmento desejado utilizando um iniciador que ensanduicha o fragmento inserido através do método de PCR de colónias. Primeiro, para o vector de expressão da cadeia H ou cadeia L do anticorpo quimérico anti-F. IXa, foram sintetizados o iniciador CMVF (SEQ ID NO: 47), que é 21-mero e emparelha com o local de iniciação directa de CMV existente a montante do local de inserção, e o iniciador BGHR (SEQ ID NO: 48), que é 18-mero e emparelha com o local de iniciação inversa de BGH existente a jusante do local de inserção (Sigma Genosys). Para o vector de expressão da cadeia H ou cadeia L do anticorpo quimérico anti-F. X, foram sintetizados o iniciador EcdF (SEQ ID NO: 49), que é 24-mero e emparelha com o local de inserção a montante, e o iniciador BGHR (SEQ ID NO: 48), que é 18-mero e emparelha com o local de iniciação inversa de BGH existente a jusante do local de inserção (Sigma Genosys). Para a PCR de colónias, foram preparados 20 μΐ da solução reaccional (0,2 μΐ de cada um de iniciador 10 μΜ, tampão KOD dash (TOYOBO), dNTP 0,2 mM, 0,75 unidades de ADN-polimerase KOD dash (TOYOBO)). A quantidade apropriada dos transformantes foi adicionada à solução reaccional, e realizou-se a PCR. A PCR foi realizada utilizando o sistema Thermal Cicler GeneAmp PCR 9700 (Perkin Elmer) sob as condições de aquecimento a 96°C durante 1 minuto, seguido por 30 ciclos de reacções a 96°C durante 10 segundos, 55°C durante 10 segundos, e 72°C durante 30 segundos. Após a realização da PCR, a solução reaccional foi sujeita a electrof orese em gel de agarose a 1%, e os clones cujos fragmentos amplificados tinham o tamanho desejado foram seleccionados. Nos produtos de PCR, o excesso de iniciadores e dNTP foi inactivado utilizando ExoSAP-IT (Amersham Biosciences) de acordo com o manual de instruções anexo. A sequência nucleotidica de cada fragmento de ADN foi determinada utilizando o BigDye Terminator Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems) com o sequenciador de ADN ABI PRISM 3100 Genetic 53 ΕΡ 1 876 236/ΡΤ

Analyzer (Applied Biosystems) de acordo com o manual de instruções anexo. As sequências determinadas através do presente método foram analisadas utilizando um suporte lógico de análise GENETYX-SV/RC Versão 6.1 (Genetyx), foram seleccionados os clones desejados em que para VH, não foram introduzidas inserções, deleções, mutações e semelhantes, e os clones desejados em que para VL, não foram introduzidas inserções, deleções, mutações e semelhantes diferentes do pseudo gene de VL derivado de P3U1 utilizado nos hibridomas.

Os respectivos ADN plasmídicos foram isolados a partir dos clones desejados utilizando QIAprep Spin Miniprep Kit (QIAGEN) e dissolvidos em 100 μΐ de água esterilizada. O vector de expressão da cadeia H do anticorpo quimérico anti-F. IXa, o vector de expressão da cadeia L quimérica do anticorpo anti-F. IXa, o vector de expressão da cadeia H quimérica do anticorpo anti-F. X, e o vector de expressão da cadeia L quimérica do anticorpo anti-F. X foram apelidados como pcDNA4-g4IXaHn, pcDNA4-g4IXaLn, pIND-g4XHn, e pIND-g4XLn. As respectivas solução de plasmideo foram conservadas a 4°C até à sua utilização.

[Exemplo 4] Expressão de anticorpos biespecificos quiméricos 4-1. Preparação de soluções de ADN

Os vectores de expressão para a molécula HL do braço direito do anticorpo (pcDNA4-g4IXaHn e pcDNA4-g4IXaLn) são induzidos através de tetraciclina. Para suprimir completamente a expressão na ausência de tetraciclina, é necessário um plasmideo pcDNA6/TR (Invitrogen) codificando o repressor Tet. Além disso, os vectores de expressão para a molécula HL do baço esquerdo do anticorpo (pIND-g4XHn e pIND-g4XLn) são induzidos através de análogo de ecdisona (Ponasterona A), que é uma hormona de insectos. Assim, é necessário um plasmideo pVgRXR (Invitrogen), que codifica um receptor de ecdisona que reage com Ponasterona A e induz a expressão de um receptor de retinóide X. Portanto, foi preparado um total de 6 tipos de soluções de ADN plasmídico misturado para transfectar células animais. Para 1 ml de cultura celular, foram utilizados 218,8 ng de cada um de pcDNA4-g4IXaHn, pcDNA4-g4IXaLn, pIND-g4XHn, e pIND-g4XLn, e 1312,5 ng de cada um de pcDNA6/TR e pVgRXR. 54 ΕΡ 1 876 236/ΡΤ 4-2. Transfecção de células animais A estirpe HEK293H (Invitrogen) derivada de células de carcinoma renal fetal humano foi suspensa em meio DMEM contendo FCS a 10% (MOREGATE) , 1 ml da mesma (5xl05 células/ml) foi plaqueado em cada poço de uma placa de 12 poços para células aderentes (CORNING) cultivada numa incubadora de CO2 (37°C, CO2 a 5%). A mistura de ADN plasmidico preparada no Exemplo 4-1 e 7 μΐ de reagente de transfecção, Lipofectamine 2000 (Invitrogen) foram adicionados a 250 μΐ de meio Opti-MEM I (Invitrogen) e deixado a repousar à temperatura ambiente durante 20 minutos, e a mistura resultante foi adicionada às células em cada poço, e depois incubada durante 4 a 5 horas numa incubadora de CO2 (a 37°C, CO2 a 5%) . 4-3. Expressão induzida de anticorpos IgG biespecificos

Tal como descrito acima, o meio foi removido através de aspiração a partir da cultura de células transfectadas, e depois 1 ml de meio CHO-S-SFM-II (Invitrogen) contendo 1 pg/ml de tetraciclina (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) foi adicionado a este e cultivado durante um dia numa incubadora de CO2 (a 37°C, CO2 a 5%) para induzir a expressão primária da molécula HL do braço direito do anticorpo. Subsequentemente, o meio foi removido através de aspiração e as células foram lavadas uma vez com 1 ml de meio CHO-S-SFM-II. 1 ml de meio CHO-S-SFM-II contendo 5 μΜ de Ponasterona A (Invitrogen) foi adicionado e as células foram cultivadas durante 2 ou 3 dias numa incubadora de CO2 (a 37 °C, CO2 a 5%) para induzir a expressão secundária da molécula HL do braço esquerdo do anticorpo e segregar um anticorpo IgG biespecífico para meio. Após o sobrenadante da cultura ser colhido, as células foram removidas através de centrifugação (a aproximadamente 2000 xg durante 5 minutos à temperatura ambiente) e, conforme necessário, a solução resultante foi concentrada utilizando Microcon® YM-50 (Millipore). Esta amostra foi então conservada a 4°C até à sua utilização. 55 ΕΡ 1 876 236/ΡΤ [Exemplo 5] Determinação quantitativa da concentração de IgG humana 1 pg/ml de anticorpo de cabra purificado por afinidade para Fc de IgG humana (Cappel) foi preparado com o tampão de revestimento e imobilizado numa placa Nunc-Immuno. Após a placa ser bloqueada com o tampão de diluição (DB) , a amostra de sobrenadante da cultura, apropriadamente diluída utilizando DB, foi adicionada. Além disso, foi semelhantemente adicionada como padrão para o cálculo da concentração de anticorpo, uma série de diluições de duas vezes da IgG4 humana (anticorpo anti-TF humanizado, ver WO 99/51743) que foi produzida através de uma diluição em 11 passos de 1000 ng/ml utilizando DB. Após a amostra ser lavada três vezes, foi feita reagir IgG de cabra anti-humano e fosfatase alcalina (Biosource International).

Após a mistura ser lavada cinco vezes, substrato de fosfatase Sigma 104® (Sigma-Aldrich) foi corado como substrato, a absorvância a 405 nm foi medida com um comprimento de onda de referência de 655 nm utilizando um leitor de absorvância Modelo 3550 (Bio-Rad Laboratories). A concentração de IgG humana no sobrenadante da cultura foi calculada a partir da curva padrão utilizando suporte lógico Microplate Manager III (Bio-Rad Laboratories).

[Exemplo 6] Ensaio de actividade de activação semelhante ao factor de coagulação VIII (F. VlIIa) A actividade semelhante a F. VlIIa do anticorpo biespecífico foi avaliada através do seguinte ensaio enzimático. Além disso, todas as seguintes reacções foram realizadas à temperatura ambiente. Uma mistura de 40 1 de

Factor IX (3,75 g/ml, Enzyme Research Laboratories) e 10 1 da solução de anticorpo foi incubada durante uma hora numa placa de 96 poços. Além disso, 10 1 de Factor Xla (10 ng/ml,

Enzyme Research Laboratories),20 1 de Factor X (50 g/ml,

Enzyme Research Laboratories), 5 1 de fosfolípido (400 g/ml, ver Exemplo 1-3), e 15 1 de TBSB contendo Ca£15 mM e MgCl2 1 mM (daqui em diante, referido como TBSB-S) foram adicionados a esta, e foi iniciada a reacção enzimática. Após a reacção ser realizada durante 30 minutos, foi parada através da adição de 10 1 de EDTA 0,5 M. 56 ΕΡ 1 876 236/ΡΤ

Após 50 1 de solução de substrato colorimétrico serem adicionados a cada poço, a absorvância a 405 nm (comprimento de onda de referência, 655 nm) foi medida no minuto 0 e minuto 30 utilizando um Leitor de Microplacas Modelo 3550 (Bio-Rad Laboratories). A actividade semelhante a F. VlIIa foi representada pelo valor em que o valor de variação da absorvância na ausência de anticorpo durante 30 minutos era subtraído daquele na presença de anticorpo durante 30 minutos (ver Figs. 4 e 5). TBSB foi utilizado como solvente de fosfolípido, e foi utilizado TBSB—S como solvente de Factor Xla, Factor IX, e Factor X. A solução de substrato colorimétrico foi a mistura de substrato colorimétrico "tesutochimu" S-2222 (Chromogenix) que foi dissolvido de acordo com o manual de instruções anexo e solução de polibreno (brometo de hexadimetrina a 0,6 mg/L (Sigma)) a uma razão de 1:1.

Além disso, para XB12/SB04 que tem a actividade mais elevada, foi medida a dependência da concentração da actividade semelhante a F. VlIIa (Fig. 6).

[Exemplo 7] Ensaio de coagulação do plasma

Para determinar se os anticorpos biespecíficos do presente invento eram capazes de corrigir a capacidade de coagulação do sangue da hemofilia A, o efeito destes anticorpos no tempo de tromboplastina parcial activada (APTT) utilizando plasma deficiente em F. VIII foi examinado. Uma mistura de 50 1 de uma solução de anticorpo possuindo uma variedade de concentrações, 50 1 de plasma deficiente em F. VIII (Biomerieux) e 50 1 do reagente de APTT (Dade Behring) foram aquecidos a 372C durante 3 minutos. A reacção de coagulação foi iniciada através da adição de 50 1 de Ca£l(Dade Behring) à mistura. O período de tempo até à coagulação foi medido com KC10A (Amelung) ligado a CR-A (Amelung) (Figs. 7 e 8).

Para além disso, a dependência da concentração de XB12/SB04, que exibiu o efeito de redução do tempo de coagulação mais alto, foi medida (ver Fig.9). 57 ΕΡ 1 876 236/ΡΤ [Exemplo δ] Purificação do anticorpo 10 ml do sobrenadante da cultura obtido através do método descrito no Exemplo 4 foram concentrados até 1 ml utilizando Centricon® YM-50 (Millipore). A isto, foram adicionados 10 1 de BSA a 10%, 10 1 de TweêrSO a 1%, e 100 1 de rProteina A-Sepharose™ Fast Flow (Amersham Biosciences) e misturou-se por inversão de um dia para o outro a 4°C. A solução foi transferida para um copo de filtro de 0,22 μπι, Ultrafree®-MC (Millipore) e lavou-se três vezes com 500 μΐ de TBS contendo Tween® 20 a 0,01%. Subsequentemente, resina de rProteina A-Sepharose™ foi suspensa em HC1 10 mM, pH 2,0 contendo 100 μΐ de Tween® 20 a 0,01% e deixou-se repousar durante 3 minutos, e depois o anticorpo foi eluido. Imediatamente após isto, foram-lhe adicionados 5 μΐ de Tris-HCl 1 M, pH 8,0 e neutralizou-se. A concentração de IgG humana no sobrenadante da cultura foi calculada a partir da curva padrão utilizando o suporte lógico Microplate Manager III (Bio-Rad Laboratories) . A concentração de anticorpo foi determinada quantitativamente de acordo com Exemplo 5.

[Exemplo 9] Imunotransferência Western GST-AP de anticorpo anti-F. X

Uma E. coli recombinante para expressão da proteína de fusão (GST-AP) entre o péptido activado de F. X (AP) e glutationa-S-transferase (GST) foi construída. Após o ADNc cobrindo toda a região de tradução do F. X humano ter sido amplificado a partir de ADNc de fígado humano Marathon-Ready (Clontech) através do método de PCR, foi ainda utilizado como molde para amplificar a região de codificação da região AP (Leytus et al., Biochemistry 1986; 25: 5098) através do método de PCR, e depois subclonado no vector pGEM-T (Promega) para obter pGEX-FlOAP codificando GST-AP. A E. coli que foi transformada com este plasmídeo foi cultivada, e IPTG 1 mM foi adicionado quando a DO 600 atingiu 0,8 para induzir a expressão de GST-AP. Após o meio de cultura ser centrifugado (a 3000 xg, durante 30 minutos, a 4°C), os corpos bacterianos foram colhidos e armazenados a -20°C até à sua utilização. O sedimento de corpos bacterianos foi ressuspenso num volume de cultura de PBS de 1/20. Tampão de amostra de SDS- 58 ΕΡ 1 876 236/ΡΤ PAGE (IWAKI) foi adicionado na proporção de 2,4 ml por 0,1 ml da suspensão, que foi então fervida a 95°C durante 5 minutos. 10 μΐ da solução reaccional foram adicionados a cada poço de gel de SDS-PAGE mini (14%) (Asahi Techno Glass Corporation), e foi realizada electroforese. O gel sujeito a electroforese foi transferido para Immobilon-P“ Tranfer Membrane (Millipore), utilizando um aparelho de tranferência semi-seco (BIO-RAD), e a membrana foi bloqueada com BT-PBS (PBS contendo BSA a 2% e Tween® 20 a 0,05%). Após o bloqueio ficar completo, a membrana foi feita reagir durante uma hora com anticorpo anti-F. X de ratinho SB04 ou SB06, que foi purificado no Exemplo 1-4 e diluído com BT-PBS até 2 pg/ml. Após lavagem com PBS contendo Tween® 20 a 0,05%, a membrana foi feita reagir durante uma hora com IgG de cabra anti-ratinho marcada com fosfatase alcalina (H+L) (Zymed Laboratories) que foi diluída a 1/2000 com BT-PBS. Após lavagem com PBS contendo Tween® 20 a 0,05%, a membrana foi feita reagir com o substrato colorimétrico BCIP/NBT Phosphatase Substrate (Kirkegaard & Perry Laboratories) (ver Fig. 10).

[Exemplo 10] Aquisição de anticorpos biespecificos a partir da biblioteca de scFv derivada de baços de ratinhos imunizados 10-1. Antigénio e imunização

Três ratinhos BALB/c (machos, com 6 semanas de idade no início da imunização, Charles River Laboratories Japan), três ratinhos MRL/lpr (machos, com 6 semanas de idade no início da imunização, Charles River Laboratories Japan), e três ratinhos C57BL/6N (machos, com 6 semanas de idade no início da imunização, Charles River Laboratories Japan) foram imunizados contra um antigénio, Factor IXa (Enzyme Research

Laboratories, Inc.) ou Factor X (Enzyme Research Laboratories, Inc.) tal como descrito abaixo. Como iniciação, 40 pg/cabeça de um antigénio emulsionado através de Adjuvante Completo de Freund (FCA) (H37 Ra, Difco Laboratories) foram administrados por via subcutânea. Após duas semanas, 40 pg/cabeça de um antigénio emulsionado através de Adjuvante Incompleto de Freund (FIA) (Difco Laboratories) foram administrados por via subcutânea. A partir daí, as imunizações de reforço foram administradas três vezes a intervalos semanais. Oito dias após a imunização final, os baços foram removidos. 59 ΕΡ 1 876 236/ΡΤ 10-2. Construção da biblioteca fágica

Porções dos baços removidos dos ratinhos imunizados que foram preparados nos Exemplos 1-1 e 2-1 e dos baços removidos dos ratinhos imunizados preparados no Exemplo 10-1 foram adicionadas ao Reagente Trizol (Invitrogen) (50 mg de baço/ml do reagente) e homogeneizados utilizando um homogeneizador de vidro. Subsequentemente, de acordo com o método descrito no manual de instruções que acompanha o reagente, os ARN totais foram extraídos. Os ARN Poli-A(+) foram extraídos da extracção utilizando o estojo PolyATract System 1000 (Promega) de acordo com o método descrito no manual de instruções anexo. ADNc foram sintetizados através de RT-PCR (SuperScript III First-Strand Synthesis System for RT-PCR, Invitrogen), e armazenados a -20°C até à sua utilização.

Como iniciadores para amplificação do ADNc da região variável da cadeia H (VH) de anticorpo de ratinho e do ADNc da região variável da cadeia L (VL) de anticorpo de ratinho, foi preparada a mistura de iniciadores HB, mistura de iniciadores HF, mistura de iniciadores LB, e mistura de iniciadores LF que foram utilizadas nos Exemplos 3-2 e 3-3. Como iniciadores para amplificação de VH, 1 μΐ cada uma da mistura de iniciadores HB 100 μΜ e mistura de iniciadores HF 100 μΜ, foram utilizados para preparar 50 μΐ da solução reaccional (2,5 μΐ de solução de ADNc, tampão KOD plus (T0Y0B0), dNTP 0,2 mM, MgCl2 1,5 mM, 3,75 unidades de ADN-polimerase KOD plus (TOYOBO)) . Como iniciadores para amplificação de VL, 1 μΐ cada uma da mistura de iniciadores LB 100 μΜ e mistura de iniciadores LF 100 μΜ, foram utilizados para preparar 50 μΐ da solução reaccional possuindo os componentes semelhantes à solução acima descrita. A PCR foi realizada utilizando o sistema Thermal Ciclor GeneAmp PCR 9700 (Perkin Elmer) nas condições de aquecimento a 98°C durante 3 minutos, seguido por 32 ciclos de reacções a 98°C durante 20 segundos, 58°C durante 20 segundos, e 72°C durante 30 segundos. Após ser realizada a PCR, a solução reaccional foi sujeita a electrof orese em gel de agarose a 2%. Os fragmentos amplificados do tamanho desejado (cerca de 400 pb) foram purificados utilizando o QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN) através do método descrito no manual de instruções anexo e eluídos utilizando 50 μΐ de água esterilizada. Em 60 ΕΡ 1 876 236/ΡΤ seguida, para amplificação de fragmentos scFv, 10 amostras de 100 1 da solução reaccional (3 1 de solução de fragmento VH, 3 1 de solução de fragmento VL, tampão KOD plus (TOYOBO), dNTP 0,2 mM, MgCl2 1 mM, e 5 unidades de ADN-polimerase KOD plus (TOYOBO)) foram preparadas e a primeira PCR foi realizada nas condições de aquecimento a 94°C durante 3 minutos, seguido por 7 ciclos de reacções a 94°C durante 1 minuto e 63°C durante 4 minutos. A solução reaccional foi mantida a 63°C e depois 2,5 μΐ de cada um de iniciador scfor 10 μΜ e iniciador scback 10 μΜ foram adicionados a cada tubo, e foi ainda realizada a segunda PCR (aquecimento a 94°C durante 35 segundos, seguido por 30 ciclos de reacções a 94°C durante 2 minutos e 63°C durante 2 minutos). Após realização da PCR, a solução reaccional foi purificada através do estojo de purificação de PCR QIAquick (QIAGEN), e os produtos purificados foram digeridos com enzima de restrição Sfi I (TAKARA) a 50°C de um dia para o outro. Os produtos de digestão foram submetidos a electroforese em gel de agarose a 2%, e os fragmentos amplificados do tamanho desejado (cerca de 800 pb) foram purificados utilizando o QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN) através do método descrito no manual de instruções anexo e depois eluidos com uma quantidade apropriada de água esterilizada. Para a apresentação de scFv na proteína do gene III do fago, pELBGlacI (ver Fig. 11) foi utilizado como um vector fagomídico. Após 10 pg do vector serem digeridos com a enzima de restrição Sfi I (TAKARA) a 50 °C de um dia para o outro, os fragmentos digeridos do tamanho desejado (cerca de 5 kb) foram purificados utilizando QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN) através do método descrito no manual de instruções anexo e eluidos com uma quantidade apropriada de água esterilizada. Os produtos de PCR purificados e os fragmentos do vector purificados foram ligados a 16°C de um dia para o outro utilizando Ligation High (TOYOBO) de acordo com o método descrito no manual de instruções anexo. A solução resultante foi utilizada para transformar células de E. coli XLlblue electrocompetentes (Stratagene) ou electromax DH12 (Invitrogen) através de um método de electroporação de acordo com o método descrito no manual de instruções anexo. Todos os transformantes resistentes a ampicilina obtidos foram colhidos e armazenados a -20°C até à sua utilização como biblioteca de E. coli recombinante. 61 ΕΡ 1 876 236/ΡΤ A biblioteca de Ε. coli (2χ109 cfu) foi plaqueada em 50 ml de YTAG 2χ (TY 2x contendo ampicilina a 100 pg/ml e glicose a 2%) e cultivada a 37°C até ser alcançado um valor de DO 600 de 0,4 a 0,5. O fago auxiliar VCSM13 (Stratagene) (4x1o11) foi adicionado, deixado estar a 37°C durante 15 minutos para infecção. A este, foram adicionados 450 ml de ΥΤΑΚ 2χ (TY 2x contendo ampicilina a 100 pg/ml e canamicina a 25 pg/ml) e foram adicionados 25 μΐ de IPTG (1 mol/1), e cultivou-se a 30°C durante 10 horas. O sobrenadante da cultura foi colhido através de centrifugação e misturado com 100 ml de solução de PEG-NaCl (polietilenoglicol 8000 a 10%, 2,5 mol/1 de NaCl), e, em seguida, deixado estar a 4°C durante 60 minutos. Os fagos foram precipitados através de centrifugação a 10800 xg durante 30 minutos e os precipitados foram suspensos em 40 ml de água. Estes foram misturados com 8 ml de solução de PEG-NaCl e em seguida deixados em repouso a 4°C durante uma hora. Os fagos foram precipitados através de centrifugação a 10800 xg durante 30 minutos e, em seguida, suspensos em 5 ml de PBS para obter uma biblioteca fágica. A biblioteca fágica foi então conservada a 4°C até à sua utilização. 10-3. Concentração dos fagos ligados através do método de peneira

Factor IXa ou Factor X foi biotinilado utilizando No-Wight Premeasured NHS-PECd-Biotin Micrutubes (Pierce) . 100 pmol do Factor IXa ou Factor X biotinilado foram adicionados a 600 μΐ da solução de biblioteca fágica preparada no Exemplo 10-2, e foi colocado em contacto com o antigénio durante 60 minutos. Foram adicionados 600 μΐ de Dynabeads M-280 Streptavidin (DYNAL) lavadas com M-PBS a 5% (PBS contendo leite desnatado a 5% p/v) e a reacção de ligação foi realizada durante 15 minutos. Após os fagos que se ligaram às contas serem lavados várias vezes com 1 ml de PBST (PBS contendo Tween-20 a 0,1%), foram lavados com PBS. As contas foram suspensas em 0,8 ml de glicina/HCl (0,1 mol/1, pH 2,2) durante 5 minutos e os fagos foram eluidos.

Alternativamente, a biblioteca fágica (80 μΐ/poço x5) incubada durante 15 minutos com leite desnatado a 2,5% p/v foi adicionada ao Factor IXa ou Factor X (10 pg/po x5) imobilizado em Immunoplate (MaxiSorp, Nunc), e colocada em 62 ΕΡ 1 876 236/ΡΤ contacto com ο antigénio durante 60 minutos. Os fagos que se ligaram ao antigénio foram lavados várias vezes com 1 ml de PBST, e depois lavados com PBS. Foram suspensos em 0,8 ml de glicina/HCl (0,1 mol/1, pH 2,2) durante 5 minutos e os fagos foram eluidos. A solução de fagos colhidos foi neutralizada através da adição de 45 1 de Tris a 2 mol/1. Foi então adicionada a 10 ml de XLl-Blue em fase de crescimento logarítmico (DO 600 = 0,4 a 0,5) e deixou-se repousar a 37°C durante 30 minutos para infectar as células. Estas foram plaqueadas em placas de YTAG 2χ, e cultivadas a 30°C. As colónias foram colhidas, inoculadas em YTAG 2x, e cultivadas a 37°C até a DO 600 alcançar 0,4 a 0,5. 5 μΐ de IPTG (1 mol/1) e lxlO11 pfu de fago auxiliar (VCSM13) foram adicionados a 10 ml da cultura, e deixados em repouso a 37 °C durante 30 minutos. Após as células serem colhidas através de centrifugação, foram ressuspensas em 100 ml de ΥΤΑΚ 2χ, e cultivadas a 30 °C durante 10 horas. O sobrenadante da cultura foi colhido através de centrifugação, misturado com 20 ml de solução de PEG a 10%-NaCl a 5 mol/1, e deixado em repouso a 4°C durante 20 minutos. Os fagos foram precipitados através de centrifugação a 10800 xg durante 30 minutos. O precipitado foi suspenso em 2 ml de PBS e este foi utilizado para subsequente peneira. 10-4. ELISA dos Fagos

As colónias individuais descritas acima foram inoculadas em 100 μΐ de YTAG 2x e cultivadas a 30 °C de um dia para o outro. Após 5 μΐ da cultura serem inoculados em 500 μΐ de YTAG 2x e cultivados a 37°C durante 5 horas, 2xl08 pfu de fago auxiliar foram adicionados e deixados em repouso a 37°C durante 30 minutos. Além disso, estes foram cultivados com agitação a 37°C durante 30 minutos, e depois foram-lhe adicionados 120 μΐ de ΥΤΑΚ 2x contendo IPTG 0,5 mM. Isto foi cultivado a 30°C de um dia para o outro e o sobrenadante após centrifugação foi sujeito a ELISA. Para realizar o ELISA para os clones obtidos através de peneira do antigénio biotinilado, foi utilizada placa de microtitulação StreptaWell 96 (Roche) revestida utilizando 1,0 pg/ml de antigénio biotinilado. Além disso, para realizar ELISA para os clones obtidos através de peneira de um antigénio nativo, foi utilizada Immunoplate (MaxiSorp, 63 ΕΡ 1 876 236/ΡΤ

Nunc) na qual foi imobilizado 1,0 pg/ml do antigénio nativo. Após as placas serem lavadas com PBST para remover os antigénios, o bloqueio foi realizado à temperatura ambiente durante uma hora utilizando 200 1 de M-PBS ou 2% BSA-PBS a 2 (PBS contendo BSA a 2% p/v) como tampão de bloqueio. O tampão foi removido, e o sobrenadante da cultura foi adicionado e deixou-se repousar durante 60 minutos para se ligar aos fagos. Após as placas serem lavadas, os fagos de ligação foram detectados através de um anticorpo anti-M13 conjugado com HRP (Amersham Pharmacia Biotech) e substrato TMB (Zymed). A reacção foi parada através da adição de 1 mol/1 de H2SO4. A A450 foi então medida utilizando um leitor de placas. 10-5. Sequenciação e selecção dos clones

As culturas de clones positivos em ELISA de E. coli recombinante YTAG 2x foram utilizadas para amplificar a região de scFv através de PCR utilizando iniciadores de PBG3-F1 (5'-CAGCTATGAAATACCTATTGCC-3'/SEQ ID NO: 38) e PBG3-R1 (5'— CTTTTCATAATCAAAATCACCGG-3'/SEQ ID NO: 39) e a sua sequência nucleotidica foi determinada. Foi utilizado 1 μΐ da cultura, 1,5 μΐ de tampão KOD Dash 10x, 0,2 μΐ de cada um dos iniciadores a 10 pmol/l, e 15 μΐ de solução reaccional de PCR contendo 0,3 μΐ de polimerase KOD Dash (2,5 U/l, TOYOBO) para amplificação através de 30 ciclos de reacções a 96°C durante 10 segundos, 55°C durante 10 segundos, e 72°C durante 30 segundos utilizando o sistema Thermal Cycler GeneAmp PCR 9700 (Perkin Elmer). Após realização da PCR, foram adicionados 3 μΐ de ExoSAP-IT (Amersham) a 5 μΐ da solução reaccional, e manteve-se a 37°C durante 15 minutos e subsequentemente a 80 °C durante 15 minutos. Esta amostra foi utilizada para PCR utilizando PBG3-F2 (5 '-ATTGCCTACGGCAGCCGCT-3 '/SEQ ID NO: 40) ou PBG3-R2 (5' — AAATCACCGGAACCAGAGCC-3'/SEQ ID NO: 41) como iniciador, com o estojo BigDye Terminator Cycle Sequencing (Applied Biosystems) , e os produtos foram submetidos a electroforese com o Sequenciador de ADN PRISM 3700 de Applied Biosystems. 52 clones, possuindo, cada um, uma sequência de aminoácidos de CDR3 deduzida diferente a partir da sequência nucleotidica, foram seleccionados para anti-Factor IXa, e 33 clones foram seleccionados para anti-Factor X. 64 ΕΡ 1 876 236/ΡΤ 10-6. Construção de vectores de expressão de anticorpos IgG biespecificos

Para expressar o anticorpo scFv como tipo IgG, as regiões variáveis do anticorpo (VH, VL) foram clonadas em vectores de expressão indutíveis através de um método semelhante ao dos Exemplos 3-3, 3-4, e 3-5. As regiões variáveis (VH e VL) do anticorpo anti-F. IXa foram incorporadas em vectores indutíveis por tetraciclina (pcDNA4-g4H e pcDNA4-G4L, respectivamente). As regiões variáveis (VH e VL) do anticorpo anti-F. X foram incorporadas em vectores indutíveis por análogo de ecdisona (pIND-g4H e pcDNA4-g4L, respectivamente). Os respectivos ADN plasmídicos foram isolados dos clones desejados utilizando QIAprep Spin Miniprep Kit (QIAGEN) e dissolvidos em 100 μΐ de água esterilizada. 10-7. Expressão de anticorpos biespecificos quiméricos em células animais

Utilizando as soluções de ADN preparadas através de um método semelhante ao descrito no Exemplo 4-1, os anticorpos foram expressos em células animais através de um método semelhante ao descrito nos Exemplos 4-2 e 4-3, e os sobrenadantes da cultura foram colhidos. As amostras foram então armazenadas a 4°C até à sua utilização.

[Exemplo 11] Purificação do anticorpo 100 1 de rProteína A-SepharoSe Fast Flow (Amersham

Biosciences) foram adicionados a 10 ml dos sobrenadantes da cultura obtidos no Exemplo 10-7, e foram misturados através da inversão de um dia para o outro a 4°C. As soluções foram transferidas para o copo de filtro de 0,22 m UltrafréeMC (Millipore) e lavadas três vezes com 500 1 de TBS contendo

Tween®20 a 0,01%. A resina de rProteína A-Sepharose™ foi suspensa em HC1 10 mM (pH 2,0) contendo 100 μΐ de Tween® 20 a 0,01% e deixada em repouso durante 3 minutos, após o que os anticorpos foram eluídos. Imediatamente após isto, foram adicionados 5 1 de Tris-HCl 1 M, pH 8,0 para neutralização. A concentração de IgG humana nos sobrenadantes de cultura foi calculada a partir da curva padrão de IgG4 humana (anticorpo anti-TF humanizado, ver WO 99/51743), utilizando o suporte 65 ΕΡ 1 876 236/ΡΤ lógico Microplate Manager III (Bio-Rad Laboratories). As concentrações de anticorpo foram determinadas de acordo com o Exemplo 5.

[Exemplo 12] Ensaio de actividade semelhante a F. VIIIa

As actividades semelhantes a F. VlIIa dos anticorpos biespecificos foram avaliadas através do seguinte ensaio enzimático. Além disso, todas as seguintes reacções foram realizadas à temperatura ambiente. A mistura de 10 1 de 15 g/ml de Factor IX (Enzyme Research Laboratories) ,5 1 de TBSB contendo CaCl2 100 mM e MgCl2 20 mM, e 50 μΐ de um sobrenadante da cultura obtido através do método descrito no Exemplo 10-7 foram incubados durante uma hora numa placa de 96 poços. Além disso, 10 μΐ de Factor Xla a 10 ng/ml (Enzyme Research Laboratories) , 20 μΐ de Factor X a 50 pg/ml (Enzyme Research Laboratories), e 5 μΐ de fosfolipido a 400 pg/ml foram adicionados à mistura para inicio da reacção enzimática. Após realização da reacção durante 30 minutos, foi parada através da adição de 10 μΐ de EDTA 0,5 M.

Após 50 μΐ de solução de substrato colorimétrico serem adicionados a cada poço, a absorvância a 405 nm (comprimento de onda de referência, 655 nm) no minuto 0 e no minuto 60 foi medida utilizando o Leitor de Microplacas Modelo 3550 (Bio-Rad Laboratories). As actividades semelhantes a F. VlIIa foram representadas através dos valores em que o valor de variação da absorvância durante 60 minutos de um sobrenadante da cultura não expressando anticorpo foi subtraído daquele de um sobrenadante da cultura expressando anticorpo (ver Fig. 12).

Para um solvente de fosfolipido, Factor Xla, Factor IX e Factor X, foi utilizado TBSB. A solução de substrato colorimétrico é a mistura de substrato colorimétrico "tesutochimu" S-2222 (Chromogenix) a qual foi dissolvida de acordo com o manual de instruções anexo e solução de polibreno (brometo de hexadimetrina a 0,6 mg/1 (Sigma)), na proporção de 1:1. 66 ΕΡ 1 876 236/ΡΤ [Exemplo 13] Ensaio de coagulação do plasma

Para determinar se os anticorpos biespecificos purificados do Exemplo 11 recuperaram ou não a capacidade de coagulação do sangue da hemofilia A, os efeitos destes anticorpos no tempo de tromboplastina parcial activada (APTT) utilizando plasma deficiente em F. VIII foram avaliados através do método semelhante ao descrito no Exemplo 7 (ver Fig. 13).

Além disso, a dependência da concentração foi medida para A44/B26 e A69B26, que exibiram excelente efeito de redução do tempo de coagulação (ver Figs. 14 e 15).

[Exemplo 14] Consideração da utilização combinada de um anticorpo IgG biespecifico e F. VIII A utilização combinada de um anticorpo IgG biespecífico e F. VIII foi considerada utilizando o seguinte ensaio de coagulação do plasma. A mistura de 40 1 de uma solução de

anticorpo (25 g/ml) e 50 1 de plasma deficiente em F. VIII (Biomerieux) foi incubada à temperatura ambiente durante 30 minutos. Além disso, à mistura, foram adicionados 10 μΐ de preparação de factor de coagulação VIII recombinante Kogenate® FS (1 U/ml, BAYER) e 50 μΐ de reagente de APTT (Dade Behring), e foi aquecida a 37 °C durante 3 minutos. A reacção de coagulação foi iniciada através da adição de 50 1 de Ca£120 mM (Dade Behring) à mistura descrita acima. O período de tempo até à coagulação ocorrer foi medido utilizando KC10A (Amelung) ligado a CR-A (Amelung) (ver Fig. 16).

[Exemplo 15] O efeito de anticorpos IgG biespecif icos em plasma inibidor

O efeito de anticorpos IgG biespecificos no plasma inibidor foi avaliado através do seguinte ensaio de coagulação do plasma. A mistura de 50 1 de plasma deficiente em F. VIII

(Biomerieux) e 10 1 de anticorpo neutralizante anti-F. VIII humano (100 g/ml, Número de Catálogo: MAB3440, CHEMICON) foi incubada à temperatura ambiente durante 30 minutos. Esta foi utilizada como plasma inibidor. 40 1 de solução de anticorpo (25 g/ml) e 50 1 de reagente de APTT (Dade Behring) foram- lhe adicionados, e a mistura foi aquecida a 37°C durante 3 minutos. A reacção de coagulação foi iniciada através da adição 67 ΕΡ 1 876 236/ΡΤ de 50 1 de Ca£120 mM (Dade Behring) à mistura descrita acima. O período de tempo até ocorrer a coagulação foi medido utilizando KC10A (Amelung) ao qual foi ligado CR-A (Amelung) (ver Fig. 17) .

[Exemplo 16] Humanização de anticorpos biespecíficos

Entre os anticorpos biespecíficos obtidos nos Exemplos 1-7, XB12 (anticorpo anti-Factor IXa de ratinho)/SB04 (anticorpo anti-Factor X de ratinho) que exibiu o maior efeito de redução do tempo de coagulação sanguínea, foi humanizado como se segue. 16-1. Pesquisa de homologia do anticorpo humano

Os dados da sequência de aminoácidos do anticorpo humano foram obtidos a partir da Base de Dados de Kabat (ftp://np.ebi.ac.uk/pub/databases/kabat/) e Base de Dados IMGT (http://imgt.cines.fr/), ambas publicamente disponíveis, e a base de dados construída foi utilizada para pesquisar homologia na região variável da cadeia H de XB12 de ratinho, região variável da cadeia L de SB12 de ratinho, região variável da cadeia H de SB04 de ratinho e região variável da cadeia L de SBO4 de ratinho, separadamente. Como resultado, uma vez que foram confirmadas as elevadas homologias às seguintes sequências de anticorpos humanos, foram utilizadas como regiões estruturais (daqui em diante, abreviadas como FR) de um anticorpo humanizado. (1) Região variável da cadeia H de XB12: KABATID-020619 (Base de Dados de Kabat) (Mariette et al., Arthritis Rheum. 1993; 36: 1315-1324) (2) Região variável da cadeia L de XB12: N 2 de Acesso EMBL X61642 (Base de Dados IMGT) (Mark et al., J. Mol. Biol. 1991; 222: 581-597) (3) Região variável da cadeia H de SB04: KABATID-025255 (Base de Dados de Kabat) (Demaison et al., Immunogenetics 1995; 42 : 342-352) . (4) Região variável da cadeia L de SB04: N 2 de Acesso EMBL AB064111 (Base de Dados IMGT) (dados não publicados)

Foi então preparado um anticorpo humanizado em que as regiões determinantes de complementaridade dos respectivos 68 ΕΡ 1 876 236/ΡΤ anticorpos de ratinho foram implantadas em FR de anticorpos humanos de (1)-(4).

Além disso, utilizando o sitio da Web de pesquisa de homologia (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/), que está também publicamente disponível através de NCBI, foram pesquisadas sequências de sinal de secreção de anticorpo humano altamente homólogas aos anticorpos humanos de (1)-(4). As seguintes sequências de sinal de secreção foram obtidas e utilizadas para os procedimentos subsequentes. (1) Região variável da cadeia H de XB12: N2 de Acesso GenBank AF062120 (2) Região variável da cadeia L de XB12: N2 de Acesso GenBank M74019 (3) Região variável da cadeia H de SB04: N2 de Acesso GenBank BC019337 (4) Região variável da cadeia L de SB04: N2 de Acesso GenBank AY204756 16-2. Construção de vectores de expressão de genes de anticorpos humanizados

Para a sequência nucleotídica codificando uma sequência de aminoácidos de sequência de sinal de secreção para a região variável de anticorpo, 12 ADN oligo de cerca de 50 bases foram alternativamente preparados de modo a que cerca de 20 bases no lado 3' hibridassem com esta. Além disso, foi preparado um iniciador que híbrida com o lado 5' do gene da região variável do anticorpo e compreende a sequência de clivagem de Xho I, e um iniciador que híbrida com o lado 3' do gene da região variável do anticorpo e compreende a sequência de clivagem de Sfi I.

Os respectivos 1 μΐ dos ADN oligo sintetizados (2,5 μΜ) foram misturados, Tampão TaKaRa Ex Taq 1*, dNTP 0,4 mM, e 0,5 unidades de TaKaRa Ex Taq (todos estes, obtidos a partir de TAKARA) foram adicionados, e preparados de modo que a solução reaccional se tornasse 48 μΐ. Após aquecimento a 94°C durante 5 minutos, foram realizados dois ciclos de reacções a 94°C durante 2 minutos, 55°C durante 2 minutos, e 72°C durante 2 minutos, foram realizadas as reacções de montagem e alongamento dos respectivos ADN oligo sintetizados. Em seguida, foi 69 ΕΡ 1 876 236/ΡΤ foi adicionado 1 1 de iniciadores (cada um 10 M) , que hibridado com o lado 5' ou o lado 3' do gene do anticorpo, foram realizados 35 ciclos de reacções a 94°C durante 30 segundos, 55°C durante 30 segundos, e 72°C durante um minuto, e fez-se reagir a 72°C durante 5 minutos para amplificar o gene da região variável do anticorpo. Após ser realizada a PCR, a solução reaccional foi sujeita a electroforese em gel de agarose a 1%. Os fragmentos amplificados do tamanho desejado (cerca de 400 pb) foram purificados utilizando QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN) através do método descrito no manual de instruções anexo e eluidos utilizando 30 μΐ de água esterilizada. Os fragmentos foram clonados utilizando pGEM-T Easy Vector Systems (Promega) através do método descrito no manual de instruções anexo. As sequências nucleotidicas dos respectivos fragmentos de ADN foram sequenciadas utilizando BigDye Terminator Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems) com o sequenciador de ADN ABI PRISM 3700 (Applied Biosystems) de acordo com o método descrito no manual de instruções anexo.

Após os plasmideos, confirmados compreenderem sequências apropriadas do gene da região variável do anticorpo humanizado, serem digeridos com Xho I e Sfi I, as soluções reaccionais foram submetidas a electroforese em gel de agarose a 1%. Fragmentos de ADN possuindo o tamanho desejado (cerca de 400 pb) foram purificados utilizando QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN) através do método descrito no manual de instruções anexo e eluidos utilizando 30 μΐ de água esterilizada. Além disso, plasmideos de expressão indutiveis com tetraciclina (pcDNA4-g4H, pcDNA4-g4L) e plasmideos de expressão indutiveis por análogo de ecdisona (pIND-g4H, pIND-g4L), que foram preparados no Exemplo 3-4 e digeridos com Xho I e Sfi I, fragmentos (cerca de 5 kb) compreendendo uma região constante de anticorpo, foram purificados utilizando QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN) através do método descrito no manual de instruções anexo e eluidos utilizando 30 μΐ de água esterilizada. Os fragmentos génicos do anticorpo XB12 humanizado, que tinham sido digeridos com Xho I e Sfi I (região variável da cadeia H (daqui em diante, abreviado como VH)) ou região variável da cadeia L (daqui em diante, abreviado como VL) , e os plasmideos de expressão indutiveis com tetraciclina, que tinham sido digeridos com Xho I e Sif I (pcDNA4-g4H e pcDNA4-g4L), foram ligados utilizando Rapid DNA Ligation Kit 70 ΕΡ 1 876 236/ΡΤ (Roche Diagnostics) através do método descrito no manual de instruções anexo. Além disso, os fragmentos génicos do anticorpo SB04 humanizado, que tinham sido digeridos com Xho I e Sfi I (VH ou VL), e plasmideos de expressão indutiveis com análogo de ecdisona, que tinham sido digeridos com Xho I e Sif I (pIND-g4H e pIND-g4L), foram ligados utilizando Rapid DNA Ligation Kit (Roche Diagnostics) através do método descrito no manual de instruções anexo. Uma porção de cada solução reaccional foi utilizada para transformar a estirpe DH5 de E. coli (TOYOBO). 16-3. Preparação de anticorpo biespecifico humanizado

Utilizando 4 tipos de vector de expressão de anticorpo humanizado, pcDNA6/TR, e pVgRXR, a introdução do gene e a expressão induzida em HEK293H foram realizadas através do método descrito nos Exemplos 4-2 e 4-3. Além disso, o anticorpo foi purificado e a sua concentração foi determinada através do método descrito nos Exemplos 8 e 5. 16-4. Avaliação da actividade do anticorpo biespecifico humanizado e modificação da sequência do anticorpo

Para avaliar a capacidade de coagulação do plasma do anticorpo biespecifico humanizado e do anticorpo biespecifico quimérico (XB12/SB04) preparados, os efeitos dos anticorpos no APTT foram examinados utilizando plasma deficiente em F. VIII de acordo com o método de Exemplo 7. Para o anticorpo biespecifico humanizado cuja capacidade de coagulação sanguínea foi diminuída, os aminoácidos das FR do anticorpo humano foram modificados tendo em vista o aumento da actividade. Além disso, resíduos de cisteína da CDR3 da VH do anticorpo XB12, que podem causar a diminuição da estabilidade térmica e tais, foram modificados para resíduos de alanina. Especificamente, as mutações foram introduzidas nos vectores de expressão de anticorpos humanizados usando QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene) através do método descrito no manual de instruções anexo. Um anticorpo biespecifico humanizado (anticorpo XB12 humanizado (VH: hXB12f-A, VL: hXBVL))/anticorpo SB04 humanizado (VH: hSBo4e, VL: hSBVL-F3f) possuindo uma actividade de coagulação sanguínea equivalente à de XB12/SB04 foi obtido através de 71 ΕΡ 1 876 236/ΡΤ repetição das modificações de aminoácidos em sequências de FR e da avaliação da actividade (ver Fig. 18).

[Exemplo 17] Construção de vectores de expressão da cadela H de anticorpo IgG4 biespeciflco

Além disso, foram expressos os anticorpos biespecificos de A44 e B26 utilizando uma cadeia L que tinha sido baralhada nas CDR.

Foi construído o vector pCAGGss-g4CH em que a jusante do promotor CAGG, uma sequência sinal de células animais e o intrão imediatamente antes de IgGICHI humano ensanduichou dois locais Sfi I, e, mais a jusante deles, existia o ADNc da região constante de IgG4 humana. Um vector de expressão para células animais para segregar como cadeia H de IgG4 pode ser construído através da inserção entre os locais Sfi I do gene de VH que foi ensanduichado pelo local de processamento da sequência sinal e a sequência dadora de processamento. Além disso, para expressar preferencialmente IgG4 que tem cadeias H de combinação heterozigótica, produtos de substituição de aminoácidos para CH3 de IgG4 foram utilizados com referência à técnica de botões nas casas em IgGl (Protein Engineering Vol. 9, 617-621, 1996). 0 Tipo a é um produto de substituição de Y349C ou T366W, e o Tipo b é um produto de substituição de E356C, T366S, L368A, ou Y407V. Além disso, uma substituição de aminoácidos (-ppcpScp- -ppcpPcp-) foi também introduzida na região charneira para promover a formação do dímero de cadeias H. Em relação à sequência sinal, foi utilizada IL-3 de ratinho e IL-6 humana para o tipo a e tipo b, respectivamente (pCAGG-IL3ss-g4CHPa; pCAGG-IL6ss-g4CHPb). 0 fragmento de VH de anticorpo A44 obtido no Exemplo acima descrito foi inserido no local Sfi I de pCAGG-IL3ss-g4CHPa para obter pCAGG-chiA44-g4a e o fragmento de VH do anticorpo A69 foi inserido no local Sfi I de pCAGG-IL3ss-g4CHPa para obter pCAGG-chiA69-g4a. Além disso, pCAGG-chiB26-g4b foi obtido através da inserção de forma semelhante do fragmento de VH do anticorpo B26 no local Sfi I de pCAGG-IL6ss-g4CHPb. 72 ΕΡ 1 876 236/ΡΤ

[Exemplo 18] Construção do vector de expressão da cadeia L com troca de CDR

Foi construído o vector pCAGG- (pCAGG-IL3ss-hIgG leve) em que a jusante do promotor CAGG, a sequência sinal de IL-3 de ratinho e o intrão imediatamente antes da região constante humana ensanduichou dois locais Sfi I, e mais a jusante deles existia o exão da região constante da cadeia humana (CL) (ver Fig. 19) . Um vector de expressão para células animais para segregar como cadeia pode ser construído através da inserção do gene de VL entre os locais Sfi I ensanduichado pelo local de processamento da sequência sinal e da sequência dadora de processamento.

Para sintetizar ADN codificando a região variável da cadeia L em que as estruturas e as CDR da cadeia L do anticorpo A44 e as CDR da cadeia L do anticorpo A50, A69, e B26 foram combinadas, ADN oligo sintéticos possuindo cerca de 60 bases foram alternativamente preparados de modo a que cerca de 20 bases nos seus terminais hibridassem com esta. Além disso, foi preparado um iniciador scback que compreende o local de processamento da sequência sinal e o local Sfi I e híbrida com o lado 5' do gene de VL, e um iniciador scfor que compreende uma sequência dadora de processamento e local Sfi I e híbrida com o lado 3' do gene de VL. 73 ΕΡ 1 876 236/ΡΤ A44LF1 (SEQIDNO: 50)

GCCATGGCGGACTACAAAGATATTGTGATGACCCAGTCTCACAAATTCATGTCCACAT

CAGTAGGAGAC A44LRI (SEQIDNO: 51)

GGCTACAGCAGTCCCCACATCCTGACTGGCCTTGCAGGTGATGCTGACCCTGTCTCCI AGTGAT GTGGA A44LF2 (SEQ ID NO: 52}

GTGGGGACTGCTGTAGCCTGGTATCAACAGAAACCAGGGCAATCTCCTAAACTACTG

ATTTAC A44LR2 (SEQ ID NO: 53) GAAGCGATCAGGGACTCCAGTGTGCCGGGTGGATGCCCAGTAAATCAGTAGTTTAGG A44LF3(SEQIDNO: 54) GGAGTCCCTGATCGCTTCACAGGCAGTAGATATGGGACAGATTTCACTCTCACCATT A44LR3 (SEQ ID NO; 55) ACAGAGATAATCTGCCAGGTCTTCAGACTGCACATTGCTAATGGTGAGAGTGAAATC A44LF4 (SEQ ID NO: 56) CTGGCAGATTATCTCTGTCAGCAATATAGCAACTATATCACGTTCGGTGGTGGGACC A44LR4 (SEQ ID NO: 57)

GGAATTCGGCCCCCGAGGCCGACTTACCACGTTTCAGCTCCAGÇTTGGTCCCACCAC

CGAACGT 74 ΕΡ 1 876 236/ΡΤ A44LR4G1 y (SEQID NO: 58)

GGAATTCGGCCCCCGAGGCCGACTTACCTCGTTTCAGCTCCAGCTTGGTCCCACCAC

CGAACGT B26LRl„A44£r (SEQ ID NO: 59)

GGCTACAGCAGTCCCCACATtCTGACTGGCCTTGCAGGTGATGCTGACCCTGTCTCCT

ACTGATGTGGA B2SLR2A44ft (SEQ ID NO: 60)

GAAGCGATCAGGGACTCCACTGTACCGGTAGGATGCCGAGTAAATCAGTAGTTTAGG B26LF4_A44fir (SEQ ID NO: 61)

CTGGCAGATTATCTCTGTCAGCAATATAACAGCTATCÇACTCACGTTCGGTGGTGGGA

CC A69LRl_A44fr (SEQ ID NO: 62)

GGCTACAGCAGTACTCACATCCTGACTGGCCTTGCAGGTGATGCTGACCCTGTCTCCI

ACTGATGTGGA A50LF4_A44fr (SEQ ID NO: 63) scback (SEQ ID NO: 64)

TTACTCGCGGCCCAGCCGGCCATGGCGGACTACAAAG scfor (SEQ ID NO: 65)

GGAATTCGGCCCCCGAG 1 μΐ de cada um dos ADN oligo sintetizados preparados a 10 μΜ foi misturado na combinação mostrada na Tabela 1, e foram preparados 45 1 das so^ões reaccionais compreendendo tampão de enzima lx adicionado, dNTP 0,33 mM, 2,5 unidades de Polimerase Proof Start (Qiagen) ou LATaq (TAKARA). Após aquecimento a 94°C durante 5 minutos, foram realizados 7 ciclos de reacções a 94°C durante um minuto e 63°C durante 4 minutos, subsequentemente foram adicionados 5 μΐ de cada uma das soluções de scback 5 μΜ e scfor 5 μΜ, e foram realizados 30 ciclos de reacções a 94°C durante 30 segundos, 55°C durante 30 segundos, e 72°C durante 30 segundos para amplificar o gene de VL. 75 ΕΡ 1 876 236/ΡΤ

Tabela 1

> >. >» >% >» >* >. >« C3 CS CD CD CD CD CD CD CD CD st St st sí -St Sf St st st sr st St sr st st sr sr ΩΖ cr cc cr cr az cr cr cr cr cr cr cr az CÈ cr cr cr cr er _J _j _j -j __1 _j ... t ™l _j -j _j ~j st m· ST sr Sf *t 3j- M· sr St f St st st MT t «t *r st st St St st St st st St St <0· st < < < c < -t < < < < < < < < c ssC SSC < < CD cd co cd o co CTÍ o er> eo CO CS CD CD CD CD CD CD CD ΟΖ az cr az cr cr cr cr cr cr cr cr cr cr cr cr cr tr cr CC _i _I _j _j _i _! _t _1 _j _í ~1 -J sr st st sr 'T St st Sf s· sr St St MCf St St L4Jt· sr MT st sr sr <4*3* 'S *3 3 3 3 st St St sr < *t <« < < < <e < < < < < < C < st < cd cd o CD cd co cr> eo « CD co CD CD CD CD CD CD CD CD ll u. tu U- LL LU ll Ll Ll LL LL ll LL Ll U, Ll Ll Lu IL wJ _J _l _j _J n«st —J -J ....1 ....1 _J _l _i _1 _J 3Í *t st st St st 3 St st St st sf St st st st sf st st MT ST St st St 3 3 st V «rt* St st < < *c < «c c c < < < < < «t < sí sC St St < CM CM CM CM CM CM CM CM CM CM CM CM CM CM CM CM CM CM CM CM Ll Ll. Ll. Ll Ll Lu Ll Ll tu Ll» Ll Lu Ll tu LL Lu ll Lu UU —I ...1 ... 1 _J _i _J _t _J _J _! _j _l _1 _l ...,i —1 _J —i _j st "t sf st sf M* st st sf sr st st St St 3 sr sr sr Tt St st st 3 st st sr st st sr sr < < *t st <C < < C < < < < -£ < < < St st t“- r— LL u. LL ll LL Ll Ll Ll LL Lu LU LL Ll LU Ll LU Ll Ll Ll Ll -J _J mJ . _J _J «1 _l _j _J _) _J __| 1 _t _1 sr sr sr sr 'MT ’β- st sr sr 3 St St 3 st «4jj* sr sr 0· Sf st iÊÇf· sf q*j» St sf sr St St c < st c < < < < < S« < ssC St < s£ -r < < *c < L. L L. L L L L. L Sf- *4- L- H- M- V 4“ 4- st st st -¾ st •sr st 3 St st << <, *c <. .<, < <, sr st st MT 'St sr sf St St St St St St St st1 St St sf Ll_ U- Lu u_ Ll U_ Ll Lu Ll Ll Ll LL Lu ll Ll LL Ll Ll Ll Ll _J _l _j _J _J _l _i _j _i -J -J _I y ™l _J _J ST st *4g|* •d* O o O o st Sf St st >4^ O O O O St sf sr tf Lf> 10 LO LO St M St St MT LO LO 10 10 < <c *t SC <G < «r < < C <C < < < sr < < < St < v_ L. L L. L L L L U 4- 4- 4— M- <+- H~ 4- 4- •(J· 3 -St Sf st st sr sr st 3Í- 'St Mt st S St <4JJ* •40*· St st ***( CM <, <c <í «, s£ t CM <c CM CM CM CM CM CM CM «M CM CM CM OJ CM CM CM1 CM CM CM Ct Ct cr cr cr cr tr cr 5 cr cr cr az et cr cr cr cr cr er _ _ _f «j «hJ —t _l _l _l —I ...1 _J _l _l _j <0 C0 st sr LO to St <0 to <4Çf~ <o C0 C0 St C0 CM •cr CM 3 st sr CM CM CM CM CM st st CM CM st CM oo «t ÇD < < m m < m m < CD sr < *< QQ QQ St 03 L l u U U L U L L L L L Sf- t]l« •t- s- H- 4- 4~ 4- sr 3f sr st 3 sf sr St St St st St 3 «1 < j «i <t r· r* r* T** r“ az cr cr tr cr cr cr cr CC az cr cr CC cr cr cr CC cr az cr _J _j _i _l _l _1 _J _) _1 —I _j _i -j _j <0 «o MT St st (0 sr (0 o> O) C0 CD sr st <0 C0 σ> o» CM CM sf 0· CM Sf CM C0 C0 CM CM st ^· CM sr CM to 10 m CD < c < /ft < aa S« SC gQ CD sr < < CQ < CO st s£ , » • „ * . • t • · * * * * * « * ·· /^N cs o CD CD CD CD CD CD O O * ’ * * * " * * " * * W «c 3 < < m CS «í 0 < «< < < < 0 0 m OJ 3 < m m 3 3 c m m sr 03 en QQ 3 CO ciTi QD CQ QQ CD <c oa ·< QQ (0 to co CQ < QQ *c QD 0 CQ 76 ΕΡ 1 876 236/ΡΤ

Após realização da PCR, os produtos foram purificados a partir das soluções reaccionais totais utilizando QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen) através do método descrito no manual de instruções anexo, e eluidos utilizando água esterilizada. Após os fragmentos serem digeridos com enzima de restrição Sfi I (TOYOBO), foram submetidos a electroforese em gel de agarose a 2%. Os fragmentos de amplificação possuindo cerca de 0,4 kb foram purificados utilizando QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen) através do método descrito no manual de instruções anexo, e eluidos utilizando água esterilizada. Os fragmentos obtidos foram ligados utilizando Ligation High (TOYOBO) com o vector de expressão da cadeia L acima descrito pCAGG- que tinha sido digerido com Sfi I. Uma porção de cada solução reaccional foi usada para transformar a estirpe DH5 d®. coli (TOYOBO). As sequências nucleotidicas foram determinadas e confirmadas utilizando BigDye Terminator Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems) com o sequenciador de ADN ABI PRISM 3700 DNA Sequencer (Applied Biosystems) de acordo com o método descrito no manual de instruções anexo. pCAGG-A44BBA foi obtido através da inserção do fragmento BBA e outros vectores de expressão foram obtidos de forma semelhante através da inserção de outros fragmentos de VL. As respectivas sequências da região variável do anticorpo são descritas nas seguintes SEQ ID NOs. 77 ΕΡ 1 876 236/ΡΤ

Tabela 2

Nucíótidos SEQ 1D NO: Aminoácidos SEQ !D NO: (DMA (DCAGG-A44L) 66 67 (2) BBA (DCAGG-A44BBA) 68 69 (3)BAA CdCAGG-A44BAA) 70 71 (4) ABA (DCAGG-A44ABA) 72 73 (5) AAa (D C AGG-A44AAa) 74 75 (6) BAa (pCAGG-A44BAa) 76 77 (7)ABa (DCAGG-A44ABa) 78 79 (8)BBa (DCAGG-A44BBa) 80 81 (9)aAA (DCAGG-A44aAA) 82 83 EfEMim (DCAGG-A44aBA) 84 85 101) AAA (G) 1 (dCAGG-A44LG) 86 87 ΗΒΕ23Θ1 (DCAGG-A44BBAG) 88 89 |03)BAA(G)| (DCAGG-A44BAAG) 90 91 (oCAGG'A44ABAG) 92 93 |(15)AAa(G) (DCAGG-A44AAaG) 94 95 ΚΒΓΜΘ1 (DCAGG-A44BAaG) 96 97 07)ABa(G) (pCAGG-A44ABaG) 98 99 (18)BBa (G) (pCAGG-A44BBaG) 100 101 HBtEEQBBl (pCAGG-A44aAAG) j 102 103 1 (20)aBA (G) 1 (DCAGG-A44aBAG) 104 105 [Exemplo 19] Preparação de anticorpos Células da estirpe HEK293 derivadas de células de carcinoma renal fetal humano foram suspensas em meio DMEM (Invitrogen) contendo FCS a 10% (Moregate), 6*106 células foram plaqueadas em placas de 10 cm de diâmetro para células aderentes (Corning) e cultivadas numa incubadora de CO2 (37° C, CO2 a 5%) de um dia para o outro. Qualquer um dos vectores de expressão da cadeia L do Exemplo 18, dois tipos de vector de expressão da cadeia H (30 pg) de pCAGG-chiB26-g4b e pCAGG-chiA44-g4a ou pCAGG-chiA69-g4a do Exemplo 17, e 1,5 ml de meio OPTI-MEMI foram adicionados à mistura de 60 μΐ de reagente de transfecção Lipofectamine 2000 (Invitrogen) e 1,5 ml de meio Opti-MEM I (Invitrogen) e deixados em repouso à temperatura ambiente durante 20 minutos, e a mistura resultante foi adicionada às placas e cultivada durante 3 dias numa incubadora 78 ΕΡ 1 876 236/ΡΤ de CO2 a 5% (37°C, CO2 a 5%) . Ao sobrenadante da cultura obtido, foram adicionados 100 μΐ de rProteina A-Sepharose“ Fast Flow (Amersham Biosciences) e misturou-se por inversão a 4°C de um dia para o outro. A resina foi precipitada através de centrifugação e lavada com TBS contendo Tween® 20 a 0,01% três vezes. Subsequentemente, a resina foi suspensa em HC1 10 mM, NaCl 150 mM, pH 2,0 contendo 100 μΐ de Tween® 20 a 0,01% e deixada em repouso durante 3 minutos, e depois o anticorpo foi eluido. Imediatamente após a eluição, foram adicionados 5 μΐ de Tris-HCl 1 M, NaCl 150 mM, pH 8,0 e neutralizou-se.

[Exemplo 20] Determinação quantitativa da concentração de IgG 0 anticorpo de cabra purificado por afinidade para Fc de IgG humano (Cappel) foi preparado até à concentração de 1 g/ml com PBS, e imobilizado numa placa Nunc-Immuno. Após a placa ser bloqueada com PBS contendo BSA a 2%, foi adicionada a amostra de sobrenadante da cultura, apropriadamente diluída utilizando este tampão. Além disso, foi adicionada de forma semelhante como padrão para calcular a concentração de anticorpo, uma diluição em série de duas vezes de IgG4 humano (anticorpo anti-TF humanizado, ver WO 99/51743) que foi produzida através de uma diluição de 11 passos da concentração de 1 pg/ml com DB. Após lavagem de três vezes, foi feito reagir anti-IgG humana de cabra com fosfatase alcalina (Biosource International). Após lavagem cinco vezes, foi utilizado como substrato de fosfatase Sigma 104® (Sigma-Aldrich), e a absorvância a 405 nm com comprimento de onda de referência de 655 nm foi medida utilizando o leitor de absorvância SUNRISE RAINBOW (TECAN). A concentração de IgG humana no sobrenadante da cultura foi calculada a partir da curva padrão utilizando o suporte lógico LS-PLATE Manager 2001 (TECAN).

[Exemplo 21] Ensaio de coagulação do plasma

Para determinar se um anticorpo biespecífico do presente invento era ou não capaz de corrigir a capacidade de coagulação sanguínea de hemofilia A, foi considerada a influência do mesmo anticorpo em relação ao tempo de tromboplastina parcial activada (APTT) utilizando plasma deficiente em F. VIII. A mistura de 50 μΐ de uma solução de anticorpo possuindo uma variedade de concentrações, 50 μΐ de plasma deficiente em F. 79 ΕΡ 1 876 236/ΡΤ VIII (Biomerieux) e 50 μΐ de reagente de APTT (Dade Behring) foram aquecidos a 37°C durante 3 minutos. A reacção de coagulação foi iniciada através da adição de 50 μΐ de CaCl2 20 mM (Dade Behring) à mesma mistura tal como descrito acima. O período de tempo até à coagulação foi medido através de KC10A (Amelung) ao qual foi ligado CR-A (Amelung) (Figs. 20 e 26). Os resultados demonstraram que o anticorpo biespecífico encurtou o tempo de coagulação em comparação com o caso em que o anticorpo não foi adicionado.

[Exemplo 22] Humanização de um anticorpo biespecífico compreendendo cadeias L híbridas A humanização foi realizada como se segue no anticorpo biespecífico compreendendo uma combinação de anticorpo anti-factor IXa A69-VH, anticorpo anti-factor X B26-VH e cadeias L híbridas (BBA), que foi o mais eficaz para redução do tempo de coagulação sanguínea. 22-1. Pesquisa de homologia de anticorpos humanos

Dados da sequência de aminoácidos de anticorpos humanos foram obtidos a partir da Base de Dados de Kabat (ftp:/ftp.ebi.ac.uk/pub/databases/kabat/) e Base de Dados IMGT (http://imgt.cines.fr/), ambas acessíveis ao público, e a pesquisa de homologia foi realizada separadamente para a região variável da cadeia H de A69 de ratinho (sequência de aminoácidos: SEQ ID NO: 20), região variável da cadeia H de B26 de ratinho (sequência de aminoácidos: SEQ ID NO: 24), e região variável da cadeia L de BBA de ratinho (sequência de aminoácidos: SEQ ID NO: 69) utilizando a base de dados construída. Como resultado, verificou-se que as seguintes sequências de anticorpo humano são altamente homólogas; portanto, foram utilizadas como regiões estruturais (daqui em diante, FR) para os anticorpos humanizados. (1) região variável da cadeia H de A69: KABATID-000064 (Base de Dados de Kabat) (Kipps et al., J. Clin. Invest. 1991; 87: 2087-2096) (2) região variável da cadeia H de B26: N2 de Acesso EMBL AB063872 (Base de Dados IMGT) (Dados não publicados) 80 ΕΡ 1 876 236/ΡΤ (3) região variável da cadeia L de BBA: KABATID-024300 (Base de Dados de Kabat) (Welschof et al., J. Immunol. Method. 1995; 179: 203-214)

Foram produzidos anticorpos humanizados, em que cada uma das regiões determinantes de complementaridade (CDR) dos anticorpos de ratinho foi enxertadas nas FR de anticorpo humano de (1) a (3) .

Os inventores pesquisaram sequências de sinal de secreção de anticorpos humanos altamente homólogas às sequências dos anticorpos humanos de (1) a (3) utilizando o local da Web de NCBI disponível ao público para pesquisas de homologia (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/). Foram utilizadas as seguintes sequências de sinal de secreção obtidas a partir da pesquisa: (1) para a região variável da cadeia H de A69: No. de Acesso GenBank AF062257 SEQ ID NO: 123 (sequência nucleotídica) , SEQ ID NO: 124 (sequência de aminoácidos); (2) para região variável da cadeia H de B26: No. de Acesso GenBank AAC 18248 SEQ ID NO: 125 (sequência nucleotídica), SEQ ID NO: 126 (sequência de aminoácidos); e (3) para região variável da cadeia L de BBA: No. de Acesso GenBank AAA59100 SEQ ID NO: 127 (sequência nucleotídica), SEQ ID NO: 128 (sequência de aminoácidos) 22-2. Construção de vectores de expressão de genes de anticorpos humanizados

Em relação à sequência nucleotídica codificando a sequência de aminoácidos variando da sequência de sinal de secreção a uma região variável de anticorpo, foram produzidos alternativamente doze ADN oligo sintéticos de cerca de 50 bases, de modo a que aproximadamente 20 bases na extremidade 3' hibridassem com esta. Os ADN oligo foram concebidos de modo a que a sequência variando da extremidade 5' à extremidade 3' seja a sequência de anticorpo humano ou de modo a que a extremidade 5' seja a sequência de anticorpo humano e a extremidade 3' seja a sequência de anticorpo de ratinho. Foram produzidos um iniciador que emparelha com a extremidade 5' do 81 ΕΡ 1 876 236/ΡΤ gene da região variável do anticorpo e compreende uma sequência de restrição Xhol, e um iniciador que emparelha com a extremidade 3' do gene da região variável do anticorpo, compreende uma sequência de restrição Sfil, e codifica a extremidade 5' da sequência do intrão. 1 μΐ de cada de um dos ADN oligo sintéticos preparados a 2,5 μΜ foram misturados, e foi adicionado Tampão TaKaRa Ex Taq lx, dNTP 0,4 mM, e 0,5 unidades de TaKaRa Ex Taq (todos de TaKaRa), e a solução reaccional foi ajustada para 48 1. Após incubação a 94°C durante 5 minutos, foram realizados dois ciclos de reacções a 94°C durante 2 minutos, 55°C durante 2 minutos, e 72°C durante 2 minutos para formar uma montagem de cada um dos ADN oligo sintéticos e realizar reacções de alongamento. Em seguida, foi adicionado 1 μΐ de iniciadores (cada um a 10 μΜ) que emparelham à extremidade 5' e extremidade 3' do gene do anticorpo, foram realizados 35 ciclos de reacções a 94°C durante 30 segundos, 55°C durante 30 segundos, e 72°C durante 1 minuto, e depois esta foi feita reagir a 72°C durante 5 minutos para amplificar o gene da região variável do anticorpo. Após a PCR, a solução reaccional total foi sujeita a electroforese em gel de agarose a 1%. Os fragmentos amplificados possuindo o tamanho desejado (aproximadamente 400 pb) foram purificados utilizando QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN) de acordo com o método descrito nas instruções anexas, e eluidos com 30 μΐ de água esterilizada. Os fragmentos foram clonados utilizando pGEM-T Easy Vector Systems (Promega) de acordo com o método descrito nas instruções anexas. A sequência nucleotidica de cada fragmento de ADN foi determinada no sequenciador de ADN ABI PRISM 3700 DNA Sequencer ou ABI PRISM 3730xL DNA Sequencer (Applied Biosystems) utilizando BigDye Terminator Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems) de acordo com o método descrito nas instruções anexas.

Após digestão do plasmideo com o fragmento da região variável da cadeia H inserido e do plasmideo com o fragmento da região variável da cadeia L inserido, que se confirmou terem a sequência do gene da região variável do anticorpo humanizado correcta, com Xhol e Sfil, e com EcoRI, respectivamente, as soluções reaccionais foram submetidas a electroforese em gel de agarose a 1%. Fragmentos de ADN possuindo o tamanho desejado (aproximadamente 400 pb) foram purificados utilizando QIAquick 82 ΕΡ 1 876 236/ΡΤ

Gel Extraction Kit (QIAGEN) de acordo com o método descrito nas instruções anexas, e eluidos com 30 μΐ de água esterilizada. Subsequentemente, os genes da região variável preparados foram inseridos em vectores de expressão de células animais (pCAGG-IL3ss-g4CHPa, e pCAGG-IL6ss-g4CHPb) através do método descrito abaixo para expressar de preferência a IgG4 produzida no Exemplo 17, em que as duas cadeias H formam um heterodimero. Após digestão de pCAGG-IL3ss-g4CHPa com Xhol e Sfil (ambas de TaKaRa), fragmentos compreendendo a sequência sinal de IL-3 de ratinho foram removidos através da submissão da solução reaccional a electroforese em gel de agarose a 1% e colheita dos fragmentos da região do vector, e este fragmento foi utilizado para produzir o vector de expressão da cadeia H de A69 humanizado (a região constante compreende a substituição Y349C e T366W) através da inserção do fragmento do gene da região variável da cadeia H de A69 humanizado obtido acima. Semelhantemente, após digestão de pCAGG-IL6ss-g4CHPb com Xhol e Sfil (TaKaRa), fragmentos compreendendo a sequência sinal de IL-6 de ratinho foram removidos através da submissão da solução reaccional a electroforese em gel de agarose a 1% e colheita dos fragmentos da região do vector, e este fragmento foi utilizado para produzir o vector de expressão da cadeia H do B26 humanizado (a região constante compreende as substituições E356C, T366S, L368A, e Y407V) através da inserção do fragmento do gene da região variável da cadeia H do B26 humanizado obtido acima. Semelhantemente, o gene da região variável da cadeia H preparado foi inserido no vector de expressão de células animais (pCAGGss-g4CH) possuindo o gene da região constante de tipo selvagem produzido no Exemplo 17. Após digestão de pCAGGss-g4CH com Xhol e Sfil, fragmentos compreendendo a sequência sinal foram removidos através da submissão da solução reaccional a electroforese em gel de agarose a 1% e colheita dos fragmentos da região do vector, e este fragmento foi utilizado para produzir o vector de expressão da cadeia H humanizada (a região constante é de tipo selvagem) através da inserção do fragmento do gene da região variável da cadeia H humanizada obtido acima. Além disso, após digestão do vector de expressão da cadeia L (pCAGG-IL3ss-hIgG leve) produzido no Exemplo 18 com EcoRI, fragmentos compreendendo a sequência sinal de IL-3 de ratinho foram removidos através da submissão da solução reaccional a electroforese em gel de agarose a 1% e colheita dos fragmentos da região do vector, e este fragmento 83 ΕΡ 1 876 236/ΡΤ foi utilizado para produzir o vector de expressão da cadeia L de BBA humanizado através de inserção do fragmento do gene da região variável da cadeia L de BBA humanizado obtido acima. As reacções de ligação foram realizadas utilizando Rapid DNA Ligation Kit (Roche Diagnostics), e os vectores resultantes foram utilizados para transformar a estirpe DH5 d®, coli (TOYOBO). 22-3. Preparação de anticorpos biespecificos humanizados

Os anticorpos biespecificos humanizados foram expressos através do método descrito no Exemplo 4-2 ou através do seguinte método. A linha celular HEK293H (Invitrogen) derivada de células de cancro renal embrionário humano foram suspensas em meio DMEM (Invitrogen) contendo Soro Fetal Bovino a 10%, 10 ml desta suspensão foi plaqueada em cada placa (para células aderentes, diâmetro de 10 cm, CORNING) a uma densidade celular de 5χ105 a 6><105 células/ml, e após cultura durante cerca de 24 horas numa incubadora de CO2 (37°C, CO2 a 5%), o meio de cultura foi removido através de aspiração, e foram adicionados 6,9 ml de meio CHO-S-SFM-II contendo Soro Fetal Bovino a 1%. A solução de ADN plasmídico preparada em 22-2 (um total de 13,8 pg) foi misturada com 20,7 μΐ de Polietilenimina a 1 pg/ml (Polysciences Inc.) e 690 μΐ de meio CHO-S-SFMII, deixada em repouso durante 10 minutos à temperatura ambiente, e esta mistura foi adicionada às células em cada uma das placas, e depois incubada numa incubadora de CO2 (37°C, CO2 a 5%) durante 4 a 5 horas. Subsequentemente, foram adicionados 6,9 ml de meio CHO-S-SFM-II (Invitrogen) contendo Soro Fetal Bovino a 1% (Invitrogen), e esta foi cultivada numa incubadora de CO2 durante três dias. Após colheita do sobrenadante da cultura, as células foram removidas através de centrifugação (a aproximadamente 2000 xg, durante 5 minutos, à temperatura ambiente). O sobrenadante foi então esterilizado através de um filtro de 0,22 pm, MILLEX®-GV (Millipore) . Esta amostra foi então armazenada a 4°C até à sua utilização.

Em seguida, os anticorpos foram purificados através do método do Exemplo 11, e a sua concentração foi determinada através do método de Exemplo 5 ou através do método descrito abaixo. Foi utilizado Biacore 1000 (BIACORE) e Proteína A foi imobilizada em Sensor Chip CM5 (BIACORE) . Mais 84 ΕΡ 1 876 236/ΡΤ especificamente, de acordo com o protocolo do fabricante, o chip sensor activado foi feito reagir com solução de Proteína A (SIGMA) diluída a 50 pg/ml utilizando solução de acetato de sódio 10 mM (pH 4,0, BIACORE) a 5 μΐ/minuto durante 30 minutos, e depois foi realizado um processo de bloqueio para produzir um chip sensor com Proteína A imobilizada. Este chip sensor foi utilizado para medir as concentrações em sobrenadantes de cultura e produtos purificados com Biacore 1000 (BIACORE). O Tampão HBS-EP (BIACORE) foi usado para imobilização do chip sensor e medição das concentrações. Uma diluição em série de duas vezes da IgG4 humana (anticorpo anti-TF humanizado, ver W099/51743) em Tampão HBS-EP produzida através de uma diluição de seis passos a partir de 4000 ng/ml foi utilizada como padrão para a medição das concentrações. 22-4. Avaliação da actividade e modificação da sequência do anticorpo dos anticorpos biespecificos humanizados

Para avaliar a capacidade de coagulação do plasma dos anticorpos biespecificos humanizados preparados e do anticorpo biespecifico quimérico (A69/B26/BBA) , os efeitos dos anticorpos no APTT foi examinado utilizando plasma deficiente em F. VIII de acordo com o método do Exemplo 21. Os aminoácidos de FR do anticorpo humano foram modificados para aumentar a actividade do anticorpo biespecifico humanizado cuja capacidade de coagulação sanguínea tinha diminuído. Durante a expressão e secreção, três tipos de anticorpos, anticorpo A69 humanizado/BBA humanizado, anticorpo B26 humanizado/BBA humanizado, e anticorpo biespecifico Ά69 humanizado/B26 humanizado/BBA humanizado, são expressos. Estes anticorpos foram separados, e para purificação de apenas o anticorpo biespecifico, foram realizadas modificações de aminoácidos para reduzir o ponto isoeléctrico da região variável da cadeia H do A69 humanizado, e para aumentar o ponto isoeléctrico da região variável da cadeia H do B26 humanizado. Ao mesmo tempo, foram realizadas modificações de aminoácidos para evitar a piroglutamilação dos terminais amino da cadeia H, inibir a desamidação das sequências de CDR, e aumentar a estabilidade térmica. Mais especificamente, foram introduzidas mutações nas regiões variáveis do anticorpo humanizado utilizando QuikChange® Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene) de acordo com o método descrito nas instruções anexas. O plasmídeo 85 ΕΡ 1 876 236/ΡΤ com ο fragmento do gene da região variável da cadeia H inserido e o plasmideo com o fragmento do gene da região variável da cadeia L inserido, que se confirmou terem as sequências do gene da região variável do anticorpo humanizado desejadas, foram digeridos com Xhol e Sfil, e com EcoRI, respectivamente, e depois as soluções reaccionais foram submetidas a electrof orese em gel de agarose a 1%. Fragmentos de ADN possuindo o tamanho desejado (aproximadamente 400 pb) foram purificados utilizando QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN) de acordo com o método descrito nas instruções anexas, e em seguida eluidos com 30 μΐ de água esterilizada. Subsequentemente, estes fragmentos foram ligados ao gene da região constante do anticorpo através do método indicado no Exemplo 22-2 para produzir plasmideos de expressão do anticorpo. Os anticorpos biespecificos humanizados foram preparados através do método do Exemplo 22-3, e a actividade de coagulação sanguínea foi avaliada através do método do Exemplo 21.

Através da repetição das modificações de aminoácidos da sequência de FR e avaliação da actividade de coagulação, foram obtidos os anticorpos biespecificos humanizados (A69 humanizado (hA69a)/B26 humanizado (hB26-F123e4)/BBA humanizado (hAL-F123j4) e A69 humanizado (hA69-PFL)/B26 humanizado (hB26-PF)/BBA humanizado (hAL-s8)) possuindo actividade equivalente à do anticorpo biespecifico quimérico (A69/B26/BBA). A Fig. 27 mostra a actividade de coagulação sanguínea de anticorpos biespecificos humanizados em que foi formado um heterodimero utilizando a técnica de botões nas casas (Protein Engineering vol. 9, 617-621, 1996) na sequência da região constante. As sequências da região variável de cada um dos anticorpos humanizados são descritas nas seguintes SEQ ID NOs: (1) VH do anticorpo A69 humanizado (hA69a) SEQ ID NO: 129 (sequência nucleotídica) , SEQ ID NO: 130 (sequência de aminoácidos); (2) VH do anticorpo B26 humanizado (hB26-F123e4) SEQ ID NO: 131 (sequência nucleotídica), SEQ ID NO: 132 (sequência de aminoácidos); (3) VL do anticorpo BBA humanizado (hAL-F123j4) SEQ ID NO: 133 (sequência nucleotídica), SEQ ID NO: 134 (sequência de aminoácidos); (4) VH do anticorpo A69 humanizado (hA69-PFL) 86 ΕΡ 1 876 236/ΡΤ SEQ ΙΌ ΝΟ: 135 (sequência nucleotídica) , SEQ ID NO: 136 (sequência de aminoácidos); (5) VH do anticorpo B26 humanizado (hB26-PF) SEQ ID NO: 137 (sequência nucleotídica) , SEQ ID NO: 138 (sequência de aminoácidos); e (6) VL do anticorpo BBA humanizado (hAL-s8) SEQ ID NO: 139 (sequência nucleotídica) , SEQ ID NO: 140 (sequência de aminoácidos). 22-5. Avaliação da actividade dos anticorpos biespecificos humanizados compreendendo uma região constante de tipo selvagem, e modificação das sequências de anticorpo.

Quando se produz um anticorpo biespecífico de cadeia L comummente partilhada, podem ser expressos três tipos de anticorpos durante a expressão e secreção a partir de células animais. Esperava-se a expressão de três tipos de anticorpos, anticorpo A69 humanizado/BBA humanizado, anticorpo B26 humanizado/BBA humanizado, e anticorpo biespecífico A69 humanizado/B26 humanizado/BBA humanizado para os anticorpos também deste exemplo. Estes anticorpos foram separados, e apenas para purificação dos anticorpos biespecificos, foram realizadas modificações de aminoácidos para reduzir o ponto isoeléctrico da região variável da cadeia H de A69 humanizado, e para aumentar o ponto isoeléctrico da região variável da cadeia H do B26 humanizado. Como resultado, estes procedimentos permitiram que os anticorpos biespecificos desejados fossem separados, e assim foram preparados anticorpos biespecificos humanizados possuindo uma região constante de tipo selvagem e a actividade de coagulação foi avaliada. Para aumentar a estabilidade térmica, as sequências de aminoácidos da região variável do A69 humanizado e BBA humanizado do anticorpo biespecífico humanizado descrito no Exemplo 22-4 (A69 humanizado (hA69-PFL)/B26 humanizado (hB26-PF)/BBA humanizado (hAL-s8)) foram modificadas. Cada uma das sequências da região constante do anticorpo humanizado é descrita nas seguintes SEQ ID NOs: (7) VH do anticorpo A69 humanizado (hA69-KQ) SEQ ID NO: 141 (sequência nucleotídica), SEQ ID NO: 142 (sequência de aminoácidos); e (8) VL do anticorpo BBA humanizado (hAL-AQ) 87 ΕΡ 1 876 236/ΡΤ SEQ ID ΝΟ: 143 (sequência nucleotídica), SEQ ID NO: 144 (sequência de aminoácidos).

Os plasmídeos de expressão dos anticorpos foram produzidos através da ligação das sequências das regiões variáveis acima mencionadas a um gene da região constante de tipo selvagem (região constante de IgG4 humana ou região constante de ) atrá^ do método indicado no Exemplo 22-2.

Os anticorpos biespecificos humanizados foram preparados através do método do Exemplo 22-3, e depois purificados utilizando cromatografia de permuta catiónica. As condições para a cromatografia de permuta catiónica são indicadas abaixo. Uma vez que foram obtidos três tipos de picos correspondentes à combinação homogénea de A69 humanizado, o anticorpo biespecifico desejado, que é a combinação heterogénea de A69 humanizado e B26 humanizado, e a combinação homogénea de B26 humanizado, o anticorpo biespecifico foi purificado através de recolha das fracções do pico correspondendo ao anticorpo biespecifico. As fracções contendo o anticorpo biespecifico foram concentradas utilizando Amicon Ultra, MWCO 10000 (Millipore) , e dialisadas de um dia para o outro num local frio contra acetato de sódio 20 mM, NaCl 150 mM, solução pH 6,0, e, em seguida, foi determinada a sua concentração.

Coluna: Fase móvel:

Fluxo: Gradiente: Detecção:

ProPac WCX-10, 4x250 mm, (Dionex) A: NaH2P04/Na2HP04 10 mmol/1, PH 6,25 B: NaH2P04/Na2HP04 10 mmol/1, NaCl 500 mmol/1, pH 6, 25 1,0 ml/min B a 10% (5 min) (40 min) B a 60% (5 min 100% (5 min) 22 0 nm

Utilizando os anticorpos biespecificos purificados, a actividade de coagulação sanguínea foi avaliada através do método do Exemplo 21. Tal como descrito na Fig. 28, confirmou-se que o anticorpo humanizado (A69 humanizado (hA69-PFL)/B26 humanizado (hB26-PF)/BBA humanizado (hAL-s8)) que mostrou actividade equivalente ao anticorpo quimérico no Exemplo 22-4, e o anticorpo humanizado recém-preparado (A69 humanizado 88 ΕΡ 1 876 236/ΡΤ (hA69-KQ)/Β26 humanizado (hB26-PF)/ΒΒΆ humanizado (hAL-AQ)) têm um nivel semelhante de actividade de coagulação sanguínea.

[Exemplo 23] Utilização combinada de dois ou mais tipos de anticorpos 0 efeito de utilização de um anticorpo biespecífico na combinação com um ou mais outros anticorpos foi confirmado através de um ensaio de coagulação do plasma. 50 μΐ da solução de anticorpo, 100 μΐ de plasma deficiente em F. VIII (Biomerieux) , e 50 μΐ de solução de caolino a 0,3% (Biomerieux) foram misturados e aquecidos a 37°C durante 3 minutos. A reacção de coagulação foi iniciada através da adição de 100 μΐ de CaCl2 20 mM (Dade Behring) a esta solução mista. O tempo decorrido até à coagulação foi medido utilizando KC10A (Amelung) ligado a CR-A (Amelung). Os resultados de medição do tempo de coagulação do plasma quando o anticorpo biespecífico A69/B26/BBA foi misturado com o anticorpo anti-F. IXa (XB12), anticorpo anti-F. X (SB04), XB12 e SB04, e anticorpo biespecífico SB12/SB0 a 4 pg/ml.

Aplicabilidade Industrial O presente invento proporciona anticorpos biespecíficos altamente activos que substituem funcionalmente um factor de coagulação VIII e reconhecem tanto uma enzima como o seu substrato.

Uma vez que é provável que os anticorpos biespecíficos do presente invento sejam altamente estáveis no sangue e tenham baixa antigenicidade, é altamente provável que se tornem produtos farmacêuticos.

LISTAGEM DAS SEQUÊNCIAS

<110> CHUGAI SEIYAKU KABUSHIKI KAISHA

<120> Anticorpos que substituem a função de coagulação sanguínea do factor VIII <130> C1-A0504P 89 ΕΡ 1 876 236/ΡΤ <150> JP 2005-112514 <151> 2005-04-08 <160> 144 <170> Patentln versão 3.3

<210> 1 <211> 119 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 1

Met Gin Vai Gin Leu Gin Gin Ser Gly Ala Glu Leu Ala Lys Pro Gly 15 10 15

Ala Ser Vai Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser 20 25 30

Ser Trp Met His Trp Ile Lys Gin Arg Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp 35 40 45

Leu Gly Tyr Xle Asn Pro Ser Ser Gly Tyr Thr Lys Tyr Asn Arg Lys 50 55 60

Phe Arg Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala 65 70 75 80

Tyr Met Gin Leu Thr Ser Leu Thr Tyr Glu Asp Ser Ala Vai Tyr Tyr 85 90 95

Cys Ala Arg Gly Gly Asn Gly Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly 100 105 110

Thr Thr Leu Thr Vai Ser Ser 115 <210> 2 <211> 15 <212> ADN <213> Mus musculus <220> <221> CDS <222> (D . · (15) ΕΡ 1 876 236/ΡΤ 90 <400> 2 age tcc tgg atg cac 15

Ser Ser Trp Met His 1 5 <210> 3 <211> 5 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 3

Ser Ser Trp Met His 1 5 <210> 4 <211> 51 <212> ADN <213> Mus musculus <22 0> <221> CDS <222> (D ·. (51) <400> 4 tac att aat cct age agt ggt tat act aag tac aat cgg aag ttc agg 43

Tyr Ilé Asn Pro Ser Ser Gly Tyr Thr Lys Tyr Asn Arg Lya Phe Arg 1 5 10 15 gac Asp 51 <210> 5 <211> 17 <212> PRT <213> Mus musculus <4 0 0> 5

Tyr Ile Asn Pro Ser Ser Gly Tyr Thr Lys Tyr Asrt Arg Lys Phe Arg 1 5 10 15 Asp

<210> 6 <211> 27 <212> ADN 91 ΕΡ 1 876 236/ΡΤ <213> Mus musculus <22 0> <221> CDS <222> (1) .. (27) <4Ο0> 6 ggg ggt aac ggt tac tac ttt gac tac 27

Gly Gly Asn Gly Tyr Tyr Phe Asp Tyr 1 5

<210> 7 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <4O0> 7

Gly Gly Asn Gly Tyr Tyr Phe Asp Tyr 1 5

<210> 8 <211> 107 <212> PRT <213> Mus musculus 92 ΕΡ 1 876 236/ΡΤ <400> 8

Asp Ile Vai Met Thr Gin Ser His Lys Phe Met Ser Thr Ser Vai Gly 15 10 15

Asp Arg Vai Ser Ile Thr Cys lys Ala Ser Gin Asp Vai Gly Thr Ala 20 25 30

Vai Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ser Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45

Tyr Trp Ala Ser Thr Arg His Thr Gly Vai Pro Asp Arg Phe Thr Gly 50 55 60

Ser Arg Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Vai Gin Ser 65 70 75 80

Glu Asp Leu Ala Asp Tyr Leu Cys Gin Gin Tyr Ser Asn Tyr Ile Thr 85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg 100 105

<210> 9 <211> 33 <212> ADN <213> Mus musculus <22 0> <221> CDS <222> (1) .. (33) <400> 9 aag gcc agt cag gat gtg ggg act gct gta gcc 33

Lys Ala Ser Gin Asp Vai Gly Thr Ala Vai Ala 15 10

<210> 10 <211> 11 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 10

Lys Ala Ser Gin Asp Vai Gly Thr Ala Vai Ala 15 10 93 ΕΡ 1 876 236/ΡΤ <210> 11 <211> 21 <212> ADN <213> Mus musculus <22 0> <221> CDS <222> (D .. (21) <4 0 0> 11 tgg gca tcc acc cgg cac act Trp Ala Ser Thr Arg His Thr 1 5 <210> 12 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <4 0 0> 12 Trp Ala . Ser Thr Arg His Thr 1 5 <210> 13 <211> 24 <212> ADN <213> Mus musculus <22 0> <221> CDS <222> (D .. (24) <4 0 0> 13 cag caa tat age aac tat ate acg Gin Gin Tyr Ser Asn Tyr Ile Thr 1 5 <210> 14 <211> 8 <212> PRT <213> Mus musculus <4 0 0> 14 Gin Gin Tyr Ser Asn Tyr Ile Thr 1 5 94 ΕΡ 1 876 236/ΡΤ <210> 15 <211> 119 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 15 Met Gin Val Gin Leu Gin Gin Ser 1 5 Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys 20 Lys Tyr Trp Met His Trp Val Lys Gin 35 40 Ile Gly Tyr ile Asn Pro Ser Ser 50 55 Phe Lys Val Lys Ala Thr Leu Thr 65 70 Tyr Met Gin Leu Ser Ser Leu 85 Thr Cys Ala Asn Gly Asn Leu Gly 100 Tyr Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser 115 <210> 16 <211> 5 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 16 Thr Tyr Trp Met His 1 5 <210> 17 <211> 17 <212> PRT <213> Mus musculus

Gly Ala Glu Leu Ala Lys Pro Gly 10 15

Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr 25 30

Arg Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp 45

Gly Tyr Thr Lys Tyr Asn Gin Lys 60

Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala 75 80

Asp Glu Asp Ser Ala Vai Tyr Tyr 90 95

Phe Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly 105 110 95 ΕΡ 1 876 236/ΡΤ <4 Ο 0> 17

Tyr Ile Asn Pro Ser Ser Gly Tyr Thr Lya Tyr Asn Gin Lys Phe Lys 1 vai 5 10 15 <210> 18 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <4 0 0> 18

Gly Asn leu Gly Tyr Phe Phe Asp Tyr 1 5 <210> 19 <211> 8 <212> PRT <213> Mus musculus <4 0 0> 19

Gin Gin Tyr Ser Ser Tyr Leu Thr 1 5 <210> 20 <211> 119 <212> PRT <213> Mus musculus 96 ΕΡ 1 876 236/ΡΤ <4 0 0> 20 Met Glu Val Gin Leu Gin Gin Ser 1 5 Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr 20 Tyr Tyr Met His Trp Ile Lys Gin 35 40 Leu Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Ser 50 55 Phe Arg Asp Lys Ala Thr Leu Thr 65 70 Tyr Met Gin Leu Thr Ser Leu Thr 85 Cys Ala Arg Gly Gly Asn Gly Tyr 100 Thr Thr Leu Thr Val 115 Ser Ser <210> 21 <211> 5 <212> PRT <213> Mus musculus <4 0 0> 21 Asp Tyr Tyr Met His 1 5 <210> 22 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <4 0 0> 22 Gly Gly Asn Gly Tyr Tyr Leu Asp 1 5 <210> 23 <211> 11 <212> PRT <213> Mus musculus Tyr

Gly Ala Glu Leu Vai Lys Pro Gly 10 15

Ala Ser Gly Phe Asn He Lys Asp 25 30

Arg Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp 45

Gly Tyr Thr Lys Tyr Asn Arg Lys 60

Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala 75 80

Tyr Glu Asp Ser Ala Vai Tyr Tyr 90 95

Tyr Leu Asp Tyr Trp Gly Gin Gly 105 no 97 ΕΡ 1 876 236/ΡΤ <4Ο0> 23

Lys Ala Ser Gin Asp vai Ser Thr Ala Vai Ala 15 10 <210> 24 <211> 120 <212> PRT <213> Mus musculus <4 0 0> 24

Met Gin Vai Gin Leu Gin Gin Ser Gly Pro Glu Leu Vai Lys Pro Gly 15 10 15

Ala Ser Vai Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp 20 25 30

Asn Asn Met Asp Trp Vai Lys Gin Ser Hís Gly Lys Gly Leu Glu Trp 35 40 45

Ile Gly Asp Ile Asn Thr Lys Ser Gly Gly Ser Ile Tyr Asn Gin Lys 50 55 60

Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ile Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala 65 70 75 80

Tyr Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr 85 90 95

Cys Ala Arg Arg Arg Ser Tyr Gly Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gin 100 105 110

Gly Thr Thr Leu Thr Vai Ser Ser 115 120

<210> 25 <211> 15 <212> ADN <213> Mus musculus <220> <221> CDS <222> (1) .. (15) <400> 25 gac aac aac atg gac 15

Asp Asn Asn Met Asp 1 5 <210> 26 98 ΕΡ 1 876 236/ΡΤ <211> 5 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 26 Asp Asn Asn Met Asp 1 5 <210> 27 <211> 51 <212> ADN <213> Mus musculus <22 0> <221> CDS <222> (D · · (51) <4 0 0> 27 gat att aat act aaa agt ggt ggt tet Asp Ile Asn Thr Lys Ser Gly Gly Ser 1 5 ggo Gly <210> 28 <211> 17 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 28 Asp ile Asn Thr Lys Ser Gly Gly Ser 1 5 Gly <210> 29 <211> 30 <212> ADN <213> Mus musculus ate tac aac cag aag ttc aag 43 Ile Tyr Asn Gin Lys Phe Lys 10 15 51

Ile Tyr Asn Gin Lys Phe Lys 10 15 <220> <221> CDS <222> (1)..(30) 99 ΕΡ 1 876 236/ΡΤ <4Ο0> 29 agg agg age tac ggc tac tac ttt gac tac 30

Arg Arg Ser Tyr Gly Tyr Tyr Phe Asp Tyr 1 5 10

<210> 30 <211> 10 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 30

Arg Arg Ser Tyr Gly Tyr Tyr Phe Asp Tyr 15 10 <210> 31 <211> 108 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 31

Asp Ile Vai Leu Thr Gin Ser Gin Lys Phe Met Ser Thr Ser Vai Gly 15 10 15

Asp Arg Vai Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gin Asn Vai Gly Thr Ala 20 25 30

Vai Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ser Pro Lys Ala Leu Ile 35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser Gly Vai Pro Aep Arg Phe Thr Gly 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Vai Gin Ser 65 70 75 80

Glu Asp Leu Ala Glu Tyr Phe Cys Gin Gin Tyr Asn Ser Tyr Pro Leu 85 90 95

Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys Arg 100 105

<210> 32 <211> 33 <212> ADN <213> Mus musculus <22 0> <221> CDS 33 100 ΕΡ 1 876 236/ΡΤ <222> (D (33) <4 0 0> 32 aag gcc agt cag aat gtg ggt act gct gta gcc Lys Ala Ser Gin Asn Val Gly Thr Ala Val Ala 1 5 10 <210> 33 <211> 11 <212> PRT <213> Mus musculus <4 0 0> 33 Lys Ala Ser Gin Asn val Gly Thr Ala val Ala 15 10 <210> 34 <211> 21 <212> ADN <213> Mus musculus <22 0> <221> CDS <222> (D · · (21) <4 0 0> 34 tcg gca tcc tac cgg tac agt Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser 1 5 <210> 35 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <4 0 0> 35 Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser 1 5 <210> 36 <211> 27 <212> ADN <213> <22 0> Mus musculus 21 ΕΡ 1 876 236/ΡΤ 101 <221> CDS <222> (D · · (27) <4 0 0> 36 cag caa tat aac age tat cct etc acg 27

Gin Gin Tyr Asn Ser Tyr Pro Leu Thr 1 5 <210> 37 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 37

Gin Gin Tyr Asn Ser Tyr Pro Leu Thr 1 5 <210> 38 <211> 22 <212> ADN <213> Artificial <22 0> <223> Uma sequência de iniciador sintetizada artificialmente <4 0 0> 38 cagctatgaa atacctattg cc 22 <210> 39 <211> 23 <212> ADN <213> Artificial <22 0> <223> Uma sequência de iniciador sintetizada artificialmente <4 0 0> 39 cttttcataa tcaaaatcac cgg 23 <210> 40 <211> 19 <212> ADN <213> Artificial ΕΡ 1 876 236/ΡΤ 102 <22 0> <223> Uma sequência de iniciador sintetizada artificialmente <4 0 0> 40 attgcctacg gcagccgct 19 <210> 41 <211> 20 <212> ADN <213> Artificial <22 0> <223> Uma sequência de iniciador sintetizada artificialmente <4 0 0> 41 aaatcaccgg aaccagagcc 20 <210> 42 <211> 24 <212> ADN <213> Artificial <22 0> <223> Uma sequência de iniciador sintetizada artificialmente <4 0 0> 42 ttactcgcgg cccagccggc catg 24 <210> 43 <211> 28 <212> ADN <213> Artificial <22 0> <223> Uma sequência de iniciador sintetizada artificialmente <4 0 0> 43 ggaattcggc ccccgaggcc cactcacg 28

<210> 44 <211> 1215 <212> ADN 103 ΕΡ 1 876 236/ΡΤ <213> Homo sapiens <400> 44 ggcctcgggg gccagctttc tggggcaggc caggcctgac cttggctttg gggcagggag 60 ggggctaagg tgaggcaggt ggcgccagcc aggtgcacac ccaatgccca tgagcccaga 120 cactggacgc tgaacctcgc ggacagttaa gaacccaggg gcctctgcgc cctgggccca ISO gcfccfcgteee acacegcggt cacatggcac cacctctctt geagcttcca ccaagggccc 240 atccgtcttc occctggcgc cctgctccag gagcacctcc gagagcacag ccgccctggg 300 ctgcctggte aaggactact tccccgaacc ggtgacggtg tcgtggaact caggcgccct 360 gaccagcggc gtgcacacct tcccggctgt cctacagtcc tcaggactct actccctoag 420 cagcgtggtg acagtgccct ccagcagctt gggcacgaag acctacacct gcaacgtaga 480 tcacaagccc agcaacacca aggtggacaa gagagttgag tccaaatatg gtcccccatg 540 cccaccatgc GcagcacGtg agttcetggg gggaccatca gtattcetgt tccccccaaa 600 acccaaggac acfcctcatga tetcccggac ecctgaggtc acgtgcgtgg tggtggacgt 660 gagccaggaa gaocccgagg tccagttcaa ctggtacgtg gatggcgtgg aggtgeataa 720 tgccaagaca aagccgcggg aggagcagtt caacagcacg taccgtgtgg tcagcgtcct 780 cacegtectg caccaggact ggctgaacgg caaggagtac aagtgcaagg tctccaacaa 840 aggcctcccg teetceatcg agaaaaccat ctccaaagcc aaagggcagc cccgagagcc 900 acaggtgtgc accctgcccc catcccagga ggagatgacc aagaaccagg tcagcctgtg 960 gtgcctggtc aaaggcttct accccagcga catcgccgtg gagtgçrgaga gcaatgggca 1020 gccggagaac aactacaaga ccacgcctcc cgtgctggac tccgacggct ccttcttcct 1080 ctacagcagg ctaaccgtgg acaagagcag gtggcaggag gggaatgtct tctcatgctc 1140 cgtgatgcat gaggctctgc acaaccacta cacacagaag agcctctccc tgtctctggg 1200 taaatgagcg gccgc 1215 <210> 45 <211> 684 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 45 ggcctcgggg gccgaattcc taaactctga gggggtcgga tgacgtggcc attctttgcc 60 taaagcattg agtttactgc aaggtcagaa aagcatgcaa agcGGtcaga atggctgcaa 120 104 ΕΡ 1 876 236/ΡΤ agagctccaa caaaacaafct tagaacttfca ttaaggaata gggggaagct aggaagaaac 180 tcaaaacatc aagattttaa atacgcttct tggtctcctt gctataatta tctgggataa 240 gcatgctgtt ttctgtctgt ccctaacatg ccctgtgatt atccgcaaac aacacaccca 300 agggcagaac tttgttactfc aaacaccatc cfcgtttgctt ctttcctcag gaactgtggc 360 tgcaccatct gtottcatct tcccgccatc tgatgagcag ttgaaatctg gaactgcctc 420 tgttgtgtgc ctgctgaata acttctatcc cagagaggcc aaagtacagt ggaaggtgga 480 taacgccctc caatcgggta actcccagga gagtgtcaca gagcaggaca gcaaggacag 540 cacctacagc ctcagcagca ccctgacgct gagcaaagca gactacgaga aaoacaaagt 600 ctaagoctgc gaagtcaccc atcagggcct gagctcgccc gtoacaaaga gattcaacag 660 gggagagtgt tagagggcgg ccgc 684 <210> 46 <211> 1215 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 46 ggcetcgggg gcctcccagg ctctgggcag gcacaggeta ggtgccccta acccaggccc 60 tgcacacsaa ggggcaggtg ctgggctcag acctgccaag agccatatcc gggaggaccc 120 tgcccctgac ctaagcccac cccaaaggee aaactctcca ctccctcagc tcggacacct 180 tctetcetcc cagattccag taactcccaa tcttctctct gcagcttcca ccaagggccc 240 atccgtcttc ceectggegc cctgctccag gagcacctcc gagagcacag ccgccctggg 300 ctgcctggfcc aaggacfcact tccccgaacc ggtgacggtg tcgtggaact caggcgccct 360 gaccagcggc gtgcacacct tcccggctgt cctacagtcc tcaggactct actccctcag 420 cagcgtggtg accgtgccct ccagcagctt gggcacgaag acctacacct gcaacgtaga 480 tcacaagccc agcaacacca aggtggacaa gagagttgag tccaaatatg gtcccccatg 540 cceaecatgc ccagcacotg agttcctggg gggaccatca gtcttcctgt tccccccaaa 600 accoaaggac actctaatga tctcccggac ccctgaggtc aegtgcgtgg tggtggacgt 660 gagacaggaa gaccccgagg tccagttcaa ctggtacgtg gatggcgtgg aggtgcataa 720 tgcoaagaca aagccgcggg aggagcagtt caacagoaog taccgtgtgg tcagcgtcct 780 caccgtcctg caccaggaet ggetgaacgg caaggagtac aagtgcaagg tctccaacaa 840 aggcctcccg tcctccatcg agaaaaccat ctccaaagcc aaagggcagc cccgagagcc 900 acaggtgtac accctgcccc catcccagtg cgagatgacc aagaaccagg tcagcctgtc 960 ctgcgcggtc aaaggcttct atcccagcga eategacgtg gagtgggaga gaaatgggca 1020 gccggagaac aactacaaga ceacgcctcc cgtgctggac tccgacggct ccttcttcct 1080 cgtgagcagg ctaaccgtgg acaagagcag gtggcaggag gggaatgtct tctcatgctc 1140 105 ΕΡ 1 876 236/ΡΤ cgtgatgcat gaggctctgc acaaccacta ca.cacaga.ag agcctctccc tgtctctggg 1200 taaatgagcg gccgc 1215 <210> 47 <211> 21 <212> ADN <213> Artificial <22 0> <223> Uma sequência de iniciador sintetizada artificialmente <4 0 0> 47 cgcaaatggg cggtaggcgt g 21 <210> 48 <211> 18 <212> ADN <213> Artificial <22 0> <223> Uma sequência de iniciador sintetizada artificialmente <4 0 0> 48 tagaaggcac agtcgagg 18 <210> 49 <211> 24 <212> ADN <213> Artificial <22 0> <223> Uma sequência de iniciador sintetizada artificialmente <4 0 0> 49 ctctgaatac tttcaacaag ttac 24 <210> 50 <211> 69 <212> ADN <213> Artificial <22 0> ΕΡ 1 876 236/ΡΤ 106 <223> Uma sequência de iniciador sintetizada artificialmente <4 0 0> 50 gccatggcgg actacaaaga tattgtgatg acccagtctc acaaattcat gtccacatca 60 gtaggagac 69 <210> 51 <211> 69 <212> ADN <213> Artificial <22 0> <223> Uma sequência de iniciador sintetizada artificialmente <400> 51 ggctacagca gtccccacat cctgactggc cttgcaggtg atgctgaccc tgtctcctac 60 tgatgtgga 69 <210> 52 <211> 63 <212> ADN <213> Artificial <22 0> <223> Uma sequência de iniciador sintetizada artificialmente <4 0 0> 52 g^ggggacbg Gtgtagcctg gtatcaacag aaaccagggc aatctcctaa actactgatt 60 tac 63 <210> 53 <211> 57 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Uma sequência de iniciador sintetizada artificialmente <4 0 0> 53 gaagcgatca gggactccag tgtgccgggt ggatgcccag taaatcagta gtttagg 57 <210> 54 ΕΡ 1 876 236/ΡΤ 107 <211> 57 <212> ADN <213> Artificial <22 0> <223> Uma sequência de iniciador sintetizada artificialmente <4Ο0> 54 ggagtccctg atcgcttcac aggcagtaga tatgggacag atttcactct caccatt 57 <210> 55 <211> 57 <212> ADN <213> Artificial <22 0> <223> Uma sequência de iniciador sintetizada artificialmente <4O0> 55 acagagataa tctgccaggt cttcagactg cacattgcta atggtgagag tgaaatc 57 <210> 56 <211> 57 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Uma sequência de iniciador sintetizada artificialmente <400> 56 ctggcagatt atctctgtca gcaatatagc aactatatca cgttcggtgg tgggacc 57 <210> 57 <211> 64 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Uma sequência de iniciador sintetizada artificialmente <400> 57 ggaattcggc ccccgaggcc gacttaccac gtttcagctc cagcttggtc ccaccaccga 60 acgt 64 ΕΡ 1 876 236/ΡΤ 108 <210> 58 <211> 64 <212> ADN <213> Artificial <22 0> <223> Uma sequência de iniciador sintetizada artificialmente <400> 58 ggaattcggc ccccgaggcc gacttacctc gtttcagctc cagcttggtc ccaccaccga 60 acgt 64 <210> 59 <211> 69 <212> ADN <213> Artificial <22 0> <223> Uma sequência de iniciador sintetizada artificialmente <4 0 0> 59 ggctacagca gtccccacat tctgactggc cttgcaggtg atgctgaccc tgtctcctac 60 tgatgtgga 69 <210> 60 <211> 57 <212> ADN <213> Artificial <22 0> <223> Uma sequência de iniciador sintetizada artificialmente <4 0 0> 60 gaagcgatca gggactccac tgtaccggta ggatgccgag taaatcagta gtttagg 57 <210> 61 <211> 60 <212> ADN <213> Artificial <22 0> ΕΡ 1 876 236/ΡΤ 109 <223> Uma sequência de iniciador sintetizada artificialmente <4 Ο 0> 61 ctggcagatt atctctgtca gcaatataac agctatccac tcacgttcgg tggtgggacc 60 <210> 62 <211> 69 <212> ADN <213> Artificial <22 0> <223> Uma sequência de iniciador sintetizada artificialmente <4 0 0> 62 ggctacagca gtactcacat cctgactggc cttgcaggtg atçctgaccc tgtctcctac 60 tgatgtgga 69 <210> 63 <211> 57 <212> ADN <213> Artificial <22 0> <223> Uma sequência de iniciador sintetizada artificialmente <400> 63 ctggcagatt atctctgtca gcaatatagc agctatttaa cgttcggtgg tgggacc 57 <210> 64 <211> 37 <212> ADN <213> Artificial <22 0> <223> Uma sequência de iniciador sintetizada artificialmente <400> 64 ttactcgcgg cccagccggc catggcggac tacaaag 37 <210> 65 <211> 17 110

ΕΡ 1 876 236/ΡΤ <212> ADN <213> Artificial <22 0> <223> Uma sequência de iniciador sintetizada artificialmente <400> 65 ggaattcggc ccccgag 17

<210> 66 <211> 319 <212> ADN <213> Homo sapiens <22 0> <221> CDS <222> (1)..(318) <400> 6 6 gat att gtg atg acc cag tet cac aaa ttc atg tcc aca tea gta gga 48 Asp Ilé Val Mét Thr Gin Ser His Lys Phe Met Ser Thr Sar Val Gly 1 5 10 15 gac agg gtc age ate acc tgc aag gcc agt cag gat gtg g?g act gct 96 Asp Arg Val Ser ile Thr Cys Lys Ala Ser Gin Asp Val Gly Thr Ala 20 25 30 gta gcc tgg tat caa cag aaa cca ggg caa tet cct aaa cta ctg att 144 Vai Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ser Pro lye Leu Leu He 35 40 45 tac tgg gea tcc acc cgg cac act gga gtc cct gat ege ttc aca ggc 192 Tyr Trp Ala Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly 50 55 60 agt aga tat ggg aca gat ttc act ctc acc att age aat gtg cag tet 240 Ser Arg Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr He Ser Asn val Gin Ser 65 70 75 80 gaa gac ctg gea gat tat ctc tgt cag caa tat age aac tat ate acg 288 Glu Asp Leu Ala Asp Tyr Leu Cys Gin Gin Tyr Ser Asn Tyr Ile Thr 85 90 95 ttc ggt ggt ggg acc aag ctg gag ctg aaa c 319 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 100 105

<210> 67 <211> 107 <212> PRT <213> Homo sapiens 111 ΕΡ 1 876 236/ΡΤ <4Ο0> 67

Asp Ile Vai Met Thr Gin Ser His Lys Phe Met Ser Thr Ser 15 10

Asp Arg Vai Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gin Asp Vai Gly 20 25 30

Vai Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ser Pro Lys Leu 35 40 45

Tyr Trp Ala Ser Thr Arg His Thr Gly Vai Pro Asp Arg Phe 50 55 60

Vai Gly 15 Thr Ala Leu Ile Thr Gly

Gin Ser 80

Ser Arg Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Vai 65 70 75

Ile Thr 95

Glu Asp Leu Ala Asp Tyr Leu Cys Gin Gin Tyr Ser Asn Tyr 85 90

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg 100 105 <210> 68 <211> 319 <212> ADN <213> Homo <220> <221> CDS <222> (D . sapiens (318) 48 112 ΕΡ 1 876 236/ΡΤ <4Ο0> 68 gat att gtg atg acc cag tet cac aaa ttc atg tcc aca tea gta gga Asp Ile val Met Thr Gin Ser His lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly 1 5 10 15 gac agg gtc age ate acc tgc aag gcc agt cag aat gtg ggg act gct Asp Arg val Ser ile Thr Cys Lys Ala Ser Gin Asn val Gly Thr Ala 20 25 30 gta gcc tgg tat ca a cag aaa cca ggg caa tet cct aaa cta ctg att val Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ser Pro Lys leu Leu Ile 35 40 45 tac tcg gca tcc tac cgg tac agt gga gtc cct gat ege ttc aca ggc Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly 50 55 60 agt aga tat ggg aca gat ttc act ctc acc att age aat gtg cag tet Ser Arg Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Val Gin Ser 65 70 75 80 gaa gac ctg gca gat tat ctc tgt cag caa tat age aac tat ate acg Glu Asp Leu Ala Asp Tyr leu Cys Gin Gin Tyr Ser Asn Tyr Ile Thr 85 90 95 ttc ggt ggt ggg acc aag ctg gag ctg aaa c Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 100 105 <210> 69 <211> 107 <212> PRT <213> Homo sapiens <4 0 0> 69 Asp Ile Val Met Thr Gin Ser His Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys lys Ala Ser Gin Asn Val Gly Thr Ala 20 25 30 val Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ser Pro Lys Leu Leu ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly 50 55 60 Ser Arg Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr ile Ser Asn Val Gin Ser 65 70 75 80 Glu Asp Leu Ala Asp Tyr Leu Cys Gin Gin Tyr Ser Asn Tyr ile Thr 85 90 95 Phe Gly Gly Gly Thr lys leu GlU Leu Lys Arg ICO 105 96 144 192 240 288 319 <210> 70 <211> 319 113 ΕΡ 1 876 236/ΡΤ

<212> ADN <213> Homo sapiens <22 0> <221> CDS <222> (D .. (318) <4 0 0> 70 gat att gtg atg acc cag tet cac aaa ttc atg tcc aca tea gta gga 48 Asp Ile Vai Met Thr Gin Ser His Lys Phe Met Ser Thr Ser val Gly 1 5 10 15 gac agg gtc age ate ace tgc aag gcc agt cag aat gtg ggg act gct 96 Asp Arg Vai Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gin Asn Val Gly Thr Ala 20 25 30 g-ta gcc tgg tat caa cag aaa cea ggg caa tet cct aaa cta ctg att 144 Vai Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ser Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 tac tgg gea tcc acc cgg cac act gga gtc cct gat ege ttc aca ggc 192 Tyr Trp Ala ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly 50 55 60 agt aga tat ggg aca gat ttc act ctc acc att age aat gtg cag tet 240 Ser Arg Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn val Gin Ser 65 70 75 80 gaa gac ctg gea gat tat ctc tgt cag caa tat age aac tat ate acg 288 Glu Asp Leu Ala Asp Tyr Leu Cys Gin Gin Tyr Ser Asn Tyr Ile Thr 85 50 95 ttc ggt ggt ggg acc aag ctg gag ctg aaa c 319 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 100 105 <210> 71 <211> 107 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 11 Asp ile Val Met Thr Gin Ser His Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Vai Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gin Asn Val Gly Thr Ala 20 25 30 Vai Ala Trp Tyr Sln Gin Lys Pro Gly Gin Ser Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 114 ΕΡ 1 876 236/ΡΤ

Tyr Trp Ala Ser Thr Arg His Thr Gly Vai Pro Asp Arg Phe Thr Gly 50 55 60

Ser Arg Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Vai Gin Ser 65 70 75 ao

Glu Asp Leu Ala Asp Tyr Leu Cys Gin Gin Tyr Ser Asn Tyr Ile Thr 85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg 100 105

<210> 72 <211> 319 <212> ADN <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(318) <400> 72 gar. att gtg atg acu cag tet cac aaa ttc atg tcc aca tea gta gga Asp Ile Vai Met Thr Gin Ser His Lys Phe Het Ser Thr Ser Vai Gly 1 5 10 15 gac agg gtc age ate acc tgc aag gcc agt cag gat gtg GGG act gct Asp Arg Vai Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gin Asp Vai Gly Thr Ala 20 25 30 gta gcc tgg tat caa cag aaa cca GGG caa tet cct aaa eta ctg att vai Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ser Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 tac tcg gea tcc tac cgg tac agt gga gtc cct gat ege ttc aca ggc Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser Gly Vai Pro Asp Arg Phe Thr Gly 50 55 60 agt aga tat ggg aca gat ttc act ctc acc att age aat gtg cag tet Ser Arg Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Vai Gin Ser 65 70 75 80 gaa gac ctg gea gat tat ctc tgt cag caa tat age aac tat ate a cg Glu Asp Leu Ala Asp Tyr Leu Cys Gin Gin Tyr Ser Asn Tyr Ile Thr 85 90 95 ttc ggt ggt ggg acc aag ctg gag ctg aaa c Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 100 105 <210> 73 <211> 107 <212> PRT <213> Homo sapiens 48 96 144 192 240 288 319 115 ΕΡ 1 876 236/ΡΤ <4Ο0> 73

Asp Ile Vai Met Thr Sln Ser His Lys Phe Met Ser Thr Ser Vai Gly 15 10 15

Asp Arg Vai Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gin Asp Vai Gly Thr Ala 20 25 30

Vai Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ser Pro Lys Leu Leu ile 35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser Gly Vai Pro Asp Arg Phe Thr Gly 50 55 60

Ser Arg Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Vai Gin Ser 65 70 75 80

Glu Asp leu Ala Asp Tyr Leu Cys Gin Gin Tyr Ser Asn Tyr Ile Thr 85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr lys leu Glu Leu lys Arg 100 105 <210> 74 <211> 319 <212> ADN <213> Homo <22 0> <221> CDS <222> (D . (318) 48 116 ΕΡ 1 876 236/ΡΤ <4Ο0> 74 gat att gtg atg acc cag tet cac aaa ttc atg tcc aca tea gta gga Asp Ile Val Met Thr Gin Ser His Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly 1 5 10 15 gac agg gtc age ate acc tgc aag gcc agt cag gat gtg ggg act gct Asp Arg val Ser ile Thr Cys Lys Ala Ser Gin Asp Val Gly Thr Ala 20 25 30 gta gcc tgg tat caa cag aaa cca ggg caa tet cct aaa cta ctg att Val Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ser Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 tac tgg gca tcc acc cgg cac act gga gtc cct gat ege ttc aca ggo Tyr Trp Ala Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly 50 55 60 agt aga tat ggg aca gat ttc act ctc acc att age aat gtg cag tet Ser Arg Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr ile Ser Asn Val Gin Ser 65 70 75 80 gaa gac ctg gca gat tat ctc tgt cag caa tat age age tat tta acg Glu Asp Leu Ala Asp Tyr Leu Cys Gin Gin Tyr Ser Ser Tyr Leu Thr 85 90 95 ttc ggt ggt ggg acc aag ctg gag ctg aaa c Phe Gly Gly Gly Thr lys Leu Glu Leu Lys 100 105 <210> 75 <211> 107 <212> PRT <213> Homo sapiens <4 0 0> 75 Asp Ile Val Ket Thr Gin Ser His Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gin Asp Val Gly Thr Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ser Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Trp Ala Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly 50 55 60 Ser Arg Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Val Gin Ser 65 70 75 30 Glu Asp Leu Ala Asp Tyr Leu Cys Gin Gin Tyr Ser Ser Tyr Leu Thr 85 90 95 Pbe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg 100 105 96 144 192 240 288 319 <210> 76 <211> 319 117

ΕΡ 1 876 236/ΡΤ <212> ADN <213> Homo sapiens <22 0> <221> CDS <222> (1)..(318) <400> 76 gat att gtg atg acc cag tet cac aaa ttc atg tcc âca tea gta gga 48 Asp Ile Vai Met Thr Gin Ser Hls Lys Phe Met Ser Thr Ser Vai Gly 1 5 10 15 gae »99 gtc age ate acc tgc aag gcc agt cag aat gtg ggg act gct 96 Asp Arg Vai Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gin Asn Vai Gly Thr Ala 20 25 30 gta gcc tgg tat caa cag aaa cca ggg caa tet cct aaa cta ctg att 144 vai Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ser Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 tae tgg gea tcc acc egg cac act gga gtc cct gat ege ttc aca ggc 192 Tyr Trp Ala Ser Thr Arg His Thr Gly Vai Pro Asp Arg Phe Thr Gly 50 55 60 agt aga tat ggg aca gat ttc act ctc acc att age aat gtg aag tet 240 Ser Arg Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Vai Gin Ser 65 70 75 80 gaa gac ctg gea gat tat ctc tgt cag caa tat age age tat tta acg 288 Glu Asp Leu Ala Asp Tyr Leu Cys Gin Gin Tyr Ser Ser Tyr Leu Thr 85 90 95 ttc ggt ggt ggg acc aag ctg gag ctg aaa c 319 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 100 105 <210> 77 <211> 107

<212> PRT <213> Homo sapiens 118 ΕΡ 1 876 236/ΡΤ <400> 77

Asp Ile Vai Met Thr Gin Ser His Lys Phe Met Ser Thr Ser Vai Gly 15 10 15

Asp Arg Vai Ser ile Thr Cys Lys Ala Ser Gin Asn Vai Gly Thr Ala 20 25 30

Vai Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ser Pro lys Leu leu Ile 35 40 45

Tyr Trp Ala Ser Thr Arg His Thr Gly Vai Pro Asp Arg Phe Thr Gly 50 55 60

Ser Arg Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Vai Gin Ser 65 70 75 80

Glu Asp Leu Ala Asp Tyr Leu Cys Gin Gin Tyr Ser Ser Tyr Leu Thr 85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg 100 105

<210> 78 <211> 319 <212> ADN <213> Homo sapiens <22 0> <221> CDS <222> (1)..(318) <400> 78 48 gat att gtg atg acc cag tct cac aaa ttc atg tcc aca tca gta gga Asp Ile Vai Met Thr Gin Ser His Lys Phe Met Ser Thr Ser Vai Gly 15 10 15 gac agg gtc age ate acc Asp Arg Vai Ser Ile Thr 20 tgc aag gee agt cag gat gtg ggg act gct Cys Lys Ala Ser Gin Asp Vai Gly Thr Ala 25 30 96 119 ΕΡ 1 876 236/ΡΤ gta çcc tgg tat caa cag aaa cca ggg caa tct cct aaa cta ctg att 144 Vai Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ser Pro Lys Leu Leu ile 35 40 45 tac tcg gca tcc tac cgg tac agt gga gtc cct gat ege ttc aca ggc 192 Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser Gly Vai Pro Asp Arg Phe Thr Gly 50 55 60 agt aga tat g gg aca gat ttc act ctc acc att age aat gtg cag tct 240 Ser Arg Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Vai Gin Ser 65 70 75 80 gaa gac ctg gca gat tat ctc tgt cag caa tat age age tat tta acg 288 Glu Asp Leu Ala Asp Tyr Leu Cys Gin Gin Tyr Ser Ser Tyr Leu Thr 85 90 95 tte ggt ggt ggg acc aag ctg gag ctg aaa c 319 Phe Sly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 100 105

<210> 79 <211> 107 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 79

Asp He Vai Met Thr Gin Ser Hia Lys Ph.e Met Ser Thr Ser Vai Gly 15 10 15

Asp Arg Vai Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gin Asp Vai Gly Thr Ala 20 25 30

Vai Ala Trp Tyr Gin Gin lys Fro Gly Gin Ser Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser Gly Vai Pro Asp Arg Phe Thr Gly 50 55 60

Ser Arg Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Vai Gin Ser 65 70 75 80

Glu Asp Leu Ala Asp Tyr Leu Cys Gin Gin Tyr Ser Ser Tyr Leu Thr 85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg 100 105 <210> 80 <211> 319 <212> ADN <213> Homo sapiens <22 0> <221> CDS <222> (D · (318) 120 ΕΡ 1 876 236/ΡΤ <4 0 0> 80 gat att gtg atg acc cag tot cac aaa ttc atg tcc aca tea ata gga 48 Asp Ι1θ vai Met Thr Gin Ser Hl 3 Lys Phe Met Ser Thr Ser Ile Gly 1 5 10 15 gac agg gtc age ate acc tgc aag gee agt cag aat gtg ggg act gct 96 Asp Arg Vai Ser ile Thr Cys Lys Ala Ser Gin Asn Vai Gly Thr Ala 20 25 30 gta gco tgg tat eaa cag aaa cca ggg caa tet cct aaa eta ctg att 144 Vai Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ser Pro lye Leu Leu Ile 35 40 45 tae teg gca tec tae cgg tac agt gga gtc cct gat ege ttc aca ggc 192 Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser Gly Vai Pro Asp Arg Phe Thr Gly 50 55 60 agt aga tat ggg aca gat ttc act ctc acc att age aat gtg cag tet 240 Ser Arg Tyr Gly Thr Asp Phe Thr leu Thr ile Ser Asn Val Gin Ser 65 70 75 80 gaa gac ctg gca gat tat ctc tgt cag caa tat age age tat tta acg 288 Slu Asp leu Ala Asp Tyr Leu Cys Gin Gin Tyr Ser Ser Tyr Leu Thr 85 90 95 ttc ggt ggt ggg acc aag ctg gag ctg aaa c 319 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 100 105 <210> 81 <211> 107 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 81 Asp Ile vai Met Thr Gin Ser His Lye Phe Met Ser Thr Ser Ile Gly 1 5 10 15 Asp Arg Vai Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gin Asn val Gly Thr Ala 20 25 30 Vai Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ser Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser Gly Vai Pro Asp Arg phe Thr Gly 50 55 60 Ser Arg Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr ile Ser Asn Val Gin Ser 65 70 75 80 Glu Asp Leu Ala Asp Tyr Leu Cys Gin Gin Tyr Ser Ser Tyr Leu Thr 85 90 95 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg 100 105 <210> 82 121 ΕΡ 1 876 236/ΡΤ <211> 319 <212> ADN <213> Homo sapiens <22 0> <221> CDS <222> (1) .. (318) <4 0 0> 82 gat att gtg atg acc cag tet cac aaa ttc atg tcc aca tea gta gga 48 Asp He Val Met Thr Gin Ser His Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly 1 5 10 15 gac agg gtc age ate acc tgc aag gee agt cag gat gtg agt act gct 96 Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gin Asp val Ser Thr Ala 20 25 30 gta gcc tgg tat caa cag aaa cca ggg caa tet cot aaa cta ctg att 144 val Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pr o Gly Gin Ser Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 tac tgg gca tcc acc cgg cac act gga gtc eet gat ege ttc aca ggc 192 Tyr Trp Ala Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly 50 55 60 agt aga tat ggg aca gat ttc act ctc acc att age aat gtg cag tet 240 Ser Arg Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Val Gin Ser 65 70 75 80 gaa gac ctg gca gat tat ctc tgt cag caa tat age aac tat ate acg 288 Glu Asp Leu Ala Asp Tyr Leu Cys Gin Gin Tyr Ser Asn Tyr Ile Thr 85 90 95 ttc ggt ggt ggg acc aag ctg gag ctg aaa c 319 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 100 105 <210> 83 <211> 107 <212> PRT <213> Homo sapiens <4 0 0> 83 Asp ile vai Met Thr Gin Ser His Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gin Asp Val Ser Thr Ala 20 25 30 vai Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ser Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 u >1 H Trp Ala Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly 50 55 60 122 ΕΡ 1 876 236/ΡΤ

Ser Arg 65 Tyr Gly Thr Asp 70 Phe Thr Leu Glu Asp Leu Ala Asp 85 Tyr Leu Cys Gin Phe Gly Gly Gly 100 Thr Lys Leu Glu Leu 105 <210> 84 <211> 319 <212> ADN <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (D .. (318) <400> 84 gat att Asp Ile 1 gtg atg Val Met acc Thr 5 cag Gin tct Ser cac Hls aaa Lys gac agg Asp Arg gtc age Val Ser 20 ate Ile acc Thr tgc aag Cys Lys gee Ala 25 gta gee Val Ala tgg tat Trp Tyr 35 caa Gin cag Gin aaa Lys cca Pro 40 ggg Gly tac teg Tyr Ser 50 gea tcc Ala Ser tac Tyr cgg Arg tac Tyr 55 agt gga Ser Gly agt aga Ser Arg 65 tat ggg Tyr Gly aca Thr gat Asp 70 ttc Phe act Thr ctc Leu gaa gac slu Asp ctg gea Leu Ala gat Asp 85 tat Tyr ctc Leu tgt Cys cag Gin ttc ggt Phe Gly ggt ggg Gly Gly 100 acc Thr aag Lys ctg Leu gag ctg Glu Leu 105 <210> 85 <211> 107 lys Arg

Thr Ile Ser Asn Vai Gin Ser 75 80

Gin Tyr Ser Asn Tyr Ile Thr 90 95

ttc atg tcc aca tca gta gga 4B

Phe Met Ser Thr Ser Vai Gly 10 15 agt cag gat gtg agt act gct 96

Ser Gin Asp Vai Ser Thr Ala 30 caa tct cct aaa cta ctg att 144 .Gin Ser Pro LyS Leu Leu Ile 45 gtc cct gat egc ttc aca ggc 192 val Pro Asp Arg Phe Thr Gly 60 ace att age aat gtg cag tct 240

Thr Ile Ser Asn Val Gin Ser 75 80 caa tat age aac tat ate acg 288

Gin Tyr Ser Asn Tyr Ile Thr 90 95 aaa c 319

Lys

<212> PRT <213> Homo sapiens 123 ΕΡ 1 876 236/ΡΤ <4Ο0> 85

Asp Ile Val Met Thr Gin Ser His Lys Phe Met Ser Thr Ser Vai Gly 15 10 15

Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gin Asp Val Ser Thr Ala 20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gin Gin lys Pro Gly Gin Ser Pro lys Leu leu Ile 35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly 50 55 60

Ser Arg Tyr Gly Thr Asp Phe Thr leu Thr Ile Ser Asn Val Gin Ser 65 70 75 30

Glu Asp leu Ala Asp Tyr Leu Cys Gin Gin Tyr Ser Asn Tyr Ile Thr 85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr lys Leu Glu leu Lys Arg 100 105

<210> 86 <211> 322 <212> ADN <213> Homo sapiens <22 0> <221> CDS <222> (1)..(321) <400> 8 6 gat att gtg atg acc cag tet cac aaa ttc atg tcc aca tea gta gga Asp ile Val Met Thr Gin Ser His Lys Phe Met Ser Thr Ser val Gly 1 5 10 15 gac agg gtc age ate acc tgc aag gcc agt cag gat gtg ggg act gct Asp Arg val ser ile Thr Cys Lys Ala Ser Gin Asp Val Gly Thr Ala 20 25 30 gta gcc tgg tat caa cag aaa cca ggg caa tet cct aaa cta ctg att val Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ser Pro Lys Leu leu ile 35 40 45 tac tgg gea tcc acc cgg cac act gga gtc cct gat age ttc aca ggc Tyr Trp Ala Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly 50 55 60 agt aga tat ggg aca gat ttc act Ctc acc att age aat gtg cag tet Ser Arg Tyr Gly Thr Asp Phe Thr leu Thr Ile Ser Asn val Gin Ser 65 70 75 80 gaa gac ctg gea gat tat etc tgt cag caa tat age aac tat ate acg Glu Asp leu Ala Asp Tyr leu Cys Gin Gin Tyr Ser Asn Tyr Ile Thr 85 90 95 ttc ggt ggt ggg acc aag ctg gag ctg aaa cga g Phe Gly Gly Gly Thr Lys leu Glu leu lys Arg 100 105 48 96 144 192 240 288 322 124 ΕΡ 1 876 236/ΡΤ

<210> 87 <211> 108 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 87

Asp He Vai Met Thr Gin Ser fila Lys Phe Met Ser Thr Ser Vai Gly 15 10 15

Asp Arg Vai Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gin Asp Vai Gly Thr Ala 20 25 30

Vai Ala Tip Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ser Pro Lys Leu. Leu Ile 35 40 45

Tyr Trp Ala Ser Thr Arg His Thr Gly Vai Pro Asp Arg Phe Thr Gly 50 55 60

Ser Arg Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Vai Gin Ser 65 70 75 30

Glu Asp Leu Ala Asp Tyr Leu Cys Gin Gin Tyr Ser Asn Tyr Ile Thr 85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr Lys leu Glu Leu Lys Arg Gly 100 105 <210> 88 <211> 322 <212> ADN <213> Homo <22 0> <221> CDS <222> (D . sapiens (321) 48 125 ΕΡ 1 876 236/ΡΤ <4Ο0> 88 gat att gtg atg ace cag tet cac aaa ttc atg tcc aca tea gta gga Asp Ile Vai Met Thr Gin Ser His Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly 1 5 10 15 gac agg gtc age ate acc tgc aag gee agt cag aat gtg ggg act gct Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gin Asn Val Gly Thr Ala 20 25 30 gta gcc tgg tat caa cag aaa cca ggg caa tet cct aaa cta ctg att vai Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ser Pro lya Leu Leu Ile 35 40 45 tac tcg gea tee tac egg tac agt gga gtc cct gat ege ttc aca ggc Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly 50 55 60 agt aga tat ggg aca gat ttc act ctc acc att age aat gtg cag tet Ser Arg Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn val Gin Ser 65 70 75 80 gaa gac ctg gea gat tat ctc tgt cag caa tat age aac tat ate acg Glu Asp leu Ala Asp Tyr Leu Cys Gin Gin Tyr Ser Asn Tyr ile Thr 96 144 192 240 288 85 90 95 ttc ggt ggt ggg acc aag ctg gag ctg aaa cga g Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Acg 100 105 322

<210> 89 <211> 108 <212> PRT <213> Homo sapiens <4Ο0> 89

Asp Ile Val Met Thr Gin Ser His Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys LyS Ala Ser Gin Asn Val Gly Thr Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ser Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly 50 55 60 Ser Arg Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn val Gin Ser 65 70 75 30 Glu Asp Leu Ala Asp Tyr Leu Cys Gin Gin Tyr Ser Asn Tyr Ile Thr 85 90 95 Phe Gly Gly Gly Thr lys Leu Glu Leu Lys Arg Gly 100 105 <210> 90 126 ΕΡ 1 876 236/ΡΤ <211> 322 <212> ADN <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1) · ,. (321) <4 0 0> 90 gat att gtg atg acc cag tet cac aaa tte atg tcc aca tea gta gga 48 Asp ile Vai Met Thr Gin Ser His Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly 1 5 10 15 gac agg gtc age ate acc tgc aag gcc agt cag aat gtg ggg act gct 96 Asp Arg Vai Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gin Asn VaL Gly Thr Ala 20 25 30 gta gcc tgg tat caa cag aaa cca ggg caa tet cot aaa cta ctg att 144 Vai Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ser Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 tac tgg gca tcc acc cgg eac act gga gtc cct gat ege ttc aca ggc 192 Tyr Trp Ala Ser Thr Arg HlS Thr Gly Vai Pro Asp Arg Phe Thr Gly 50 55 60 agt aga tat ggg aca gat ttc act ctc acc att age aat gtg cag tet 240 Ser Arg Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn. Val Gin Ser 65 70 75 80 gaa gac ctg gca gat tat ctc tgt cag caa tat age aac tat ate acg 288 Glu Asp Leu Ala Asp Tyr Leu Cys Gin Gin Tyr Ser Asn Tyr Ile Thr B5 90 95 ttc ggt ggt ggg acc aag ctg gag ctg aaa cga g 322 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg 100 105

<210> 91 <211> 108 <212> PRT <213> Homo sapiens 127 ΕΡ 1 876 236/ΡΤ <400> 91

Asp Ile Vai Met Thr Gin Ser His Lys Phe Met Ser Thr Ser Vai Gly 15 10 15

Asp Arg Vai Ser Ile Thr Cys lys Ala Ser Gin Asn Vai Gly Thr Ala 20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gin Gin lys Pro Gly Gin Ser Pro lys Leu leu Ile 35 40 45

Tyr Trp Ala Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly 50 55 60

Ser Arg Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Asn Val Gin Ser 65 70 75 80

Glu Asp Leu Ala Asp Tyr leu Cys Gin Gin Tyr Ser Asn Tyr Ile Thr 85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Gly 100 105 <210> 92 <211> 322 <212> ADN <213> Homo sapiens <22 0> <221> CDS <222> (D . · , (321) <400> 92 gat att gtg atg acc cag tct cac aaa ttc atg tce aea tea gta gga Asp Ile Val Met Thr Gin Ser His Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly 48 128 128 1 5 10 15 gac agg gtc age ate acc tge aag gcc agt cag gat gtg ggg act gct 96 Asp Arg Vai Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gin Asp Vai Gly Thr Ala 20 25 30 gta gcc tgg tat caa cag aaa cca ggg caa tet cct aaa cta ctg att 144 Vai Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ser Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 tac bcg gca tcc tac egg tac agt gga gtc cct gat ege ttc aca gge 192 Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser Gly vai Pro Asp Arg Phe Thr Gly 50 55 60 agt aga tat ggg aca gat ttc act ctc acc att age aat gtg cag tet 240 Ser Arg Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Vai Gin Ser 65 70 75 80 gaa gac ctg gca gat tat ctc tçft cag caa tat age aae tat ate acg 288 Glu Asp Leu Ala Asp Tyr leu Cys Gin Gin Tyr Ser Asn Tyr Ile Thr 85 90 95 ttc ggt ggt ggg acc aag ctg gag ctg aaa cga g 322 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg íoo 105 <210> 93 <211> 108 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 93 Asp Ile Vai Met Thr Gin Ser His Lys Phe Met Ser Thr Ser Vai Gly 1 5 10 15 Asp Arg Vai Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gin Asp Vai Gly Thr Ala 20 25 30 Vai Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ser Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser Gly Vai Pro Asp Arg Phe Thr Gly 50 55 60 Ser Arg Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Vai Gin Ser 65 70 75 80 Glu Asp Leu Ala Asp Tyr Leu Cys Gin Gin Tyr Ser Asn Tyr Ile Thr 85 90 95 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Gly ΕΡ 1 876 236/ΡΤ 100 <210> 94 <211> 322 <212> ADN <213> Homo sapiens 129 ΕΡ 1 876 236/ΡΤ <220>

<221> CDS <222> (1) (321) <4 0 0> 94 gat att gtg atg acc cag tet cac aaa ttc atg tcc aca tea gta gga 48 Asp ile Vai Met Thr Gin Ser His Lys Phe Met Ser Thr Ser val Gly 1 5 10 15 gac agg gtc age ate acc tgc aag gee agt cag gat gtg ggg act gct 96 Asp Arg Vai Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gin Asp Val Gly Thr Ala 20 25 30 gta gcc tgg tat caa cag aaa cca ggg caa tet cct aaa cta ctg att 144 Vai Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ser Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 tac tgg gca tcc acc cgg cac act gga gtc cct gat ege ttc aca ggc 192 Tyr Trp Ala Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly 50 55 60 agt aga tat ggg aca gat ttc act ctc acc att age aat gtg cag tet 240 Ser Arg Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Val Gin Ser 65 70 75 80 gaa gac ctg gca gat tat ctc tgt cag caa tat age age tat tta acg 298 Glu Asp leu Ala Asp Tyr leu Cys Gin Gin Tyr Ser Ser Tyr Leu Thr 85 90 95 ttc ggt ggt ggg acc aag ctg gag ctg aaa cga g 322 phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg 100 105 <210> 95 <211> 108 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 95 Asp Ile Val Met Thr Gin Ser His Lya Phe Met Ser Thr Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Vai Ser Ile Thr Cys Lya Ala Ser Gin Asp Val Gly Thr Ala 20 25 30 vai Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ser Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Trp Ala Ser Thr Arg His Thr Gly val Pro Asp Arg Phe Thr Gly 50 55 60 Ser Arg Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr ile Ser Asn Val Gin Ser 65 70 75 80 Glu Asp Leu Ala Asp Tyr leu Cys Gin Gin Tyr Ser Ser Tyr Leu Thr 130 ΕΡ 1 876 236/ΡΤ 85

Phe Gly Gly Gly 100 Thr lys Leu Glu Leu 105 <210> 96 <211> 322 <212> ADN <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (D .. (321) <400> 96 gat att Asp ile 1 gtg atg Val Met acc Thr 5 eag Gin tct Ser cac His aaa Lys gac agg Asp Arg gtc age Val Ser 20 ate Ile acc Thr tgc aag gee Cys Lys Ala 25 gta gee Vai Ala tgg tat Trp Tyr 35 caa Gin cag Gin aaa Lys cca ggg Pro Gly 40 tac tgg Tyr Trp 50 gea tcc Ala Ser acc Thr cgg Arg cac HiS 55 act gga Thr Gly agt aga Ser Arg 65 tat ggg Tyr Gly aca Thr gat Asp 70 ttc Phe act Thr ctc Leu gaa gac Glu Asp ctg gea Leu Ala gat Asp 85 tat Tyr ctc Leu tgt Cys cag Gin ttc ggt Phe Gly ggt ggg Gly Gly 100 acc Thr aag Lys ctg gag ctg Leu Glu Leu 105 <210> 97 <211> 108 <212> PRT <213> Homo sapiens 90 95

Lys Arg Gly ttc atg tcc aca tca gta gga 48

Phe Mefc Ser Thr Ser Vai Gly 10 15 agt eag aat gtg ggg act gct 96

Ser Gin Asn Vai Gly Thr Ala 30 caa tct cct aaa cta ctg att 144

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Vai Pro Asp Arg Phe Thr Gly 60 acc att age aat gtg eag tct 240

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Lys Arg 131 ΕΡ 1 876 236/ΡΤ <400> 97

Asp Ile Vai Met Thr 61η Ser Bis Lys Phe Hat Ser Thr Ser Vai Gly 15 10 15

Asp Arg Vai Ser Ile Thr Cys lys Ala Ser Gin Asn Vai Gly Thr Ala 20 25 30

Vai Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ser Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45

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Ser Arg Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Vai Gin Ser 65 70 75 80

Glu Asp Leu Ala Asp Tyr Leu Cys Gin Gin Tyr Ser Ser Tyr Leu Thr 85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Gly 100 105

<210> 98 <211> 322 <212> ADN <213> Homo sapiens <22 0> <221> CDS <222> (1)..(321) <400> 98 gat att gtg atg acc cag tet cac aaa fctc atg tcc aca tca gta gga 48

Asp Ile Vai Het Thr Gin Ser His Lys Phe Met Ser Thr Ser Vai Gly 15 10 15 gac agg gtc age ate acc tgc aag gee agt cag gat gtg ggg act get 96

Asp Arg Vai Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gin Asp vai Gly Thr Ala 20 25 30 gta gee tgg tat caa cag aaa cca ggg caa tet cct aaa cta ctg att 144

Vai Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ser Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 tac teg gea tcc tac cgg tac agt gga gtc cct gat ege ttc aca ggc 192

Tyr Ser Ala ser Tyr Arg Tyr Ser Gly vai Pro Asp Arg Phe Thr Gly 50 55 60 agt aga tat ggg aca gat ttc act ctc acc att age aat gtg cag tet 240

Ser Arg Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Vai Gin Ser 65 70 75 80 gaa gac ctg gea gat tat ctc tgt cag caa tat age age tat tta acg 288

Glu Asp leu Ala Asp Tyr Leu Cys Gin Gin Tyr Ser Ser Tyr Leu Thr 95 90 95 ttc ggt ggt ggg acc aag ctg gag ctg aaa cgt g Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg 100 105 322 132

ΕΡ 1 876 236/ΡΤ <210> 99 <211> 108 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 99

Asp Ile Val Met Thr Gin Ser His Lys Phe Met Ser Thr Ser Vai Gly 15 10 15

Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys lys Ala Ser Gin Asp Val Gly Thr Ala 20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gin Gin lys Pro Gly Gin Ser Pro lys Leu Leu Ile 35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly 50 55 60

Ser Arg Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Val Gin Ser 65 70 75 80

Glu Asp leu Ala Asp Tyr leu Cys Gin Gin Tyr Ser Ser Tyr leu Thr B5 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr Lys leu Glu Leu Lys Arg Gly 100 105

<210> 100 <211> 322 <212> ADN <213> Homo sapiens <22 0> <221> CDS <222> (1). (321) 133 ΕΡ 1 876 236/ΡΤ <400> 100 gat att gtg atg acc cag tet cac aaa ttc atg tcc aca tea ata gga 48 Asp Ile Vai Met Thr Gin Ser His Lys Phe Met Ser Thr Ser Ile Gly 1 5 10 15 gac agg gtc age ate acc tgc aag gcc agt cag aat gtg ggg act gct 96 Asp Arg Val Ser ile Thr Cys Lys Ala Ser Gin Asn val Gly Thr Ala 20 25 30 gta gcc tgg tat caa cag aaa cca ggg caa tet cct aaa cta ctg att 144 Vai Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ser Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 tac tcg gca tcc tac □gg tac agt gga gtc cct gat ege ttc aca ggc 192 Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly 50 55 60 agt aga tat ggg aca gat ttc act ctc acc att age aat gtg cag tet 240 Ser Arg Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr ile Ser Asn Val Gin Ser 65 70 75 80 gaa gac ctg gca gat tat etc tgt cag caa tat age age tat tta acg 288 Glu Asp Leu Ala Asp Tyr Leu Cys Gin Gin Tyr Ser Ser Tyr Leu Thr 85 90 95 ttc ggt ggt ggg acc aag ctg gag ctg aaa cgt g 322 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg íoo 105

<210> 101 <211> 108 <212> PRT <213> Homo sapiens <4 0 0> 101

Asp Ile Vai Met Thr Gin Ser Hia Lys Phe Met Ser Thr Ser Ile Gly 15 10 15

Asp Arg Vai Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gin Asn Vai Gly Thr Ala 20 25 30

Vai Ala Tfp Tyr Gin. Gin Lys Pro Gly Gin Ser Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser Gly Vai Pro Asp Arg Phe Thr Gly 50 55 60

Ser Arg Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Vai Gin Ser 65 70 75 80

Glu Asp Leu Ala Asp Tyr Leu Cys Gin Gin Tyr Ser Ser Tyr Leu Thr 85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Gly 100 105 <210> 102 <211> 322 134

ΕΡ 1 876 236/ΡΤ <212> ADN <213> Homo sapiens <22 0> <221> CDS <222> (1)..(321) <4 Ο 0> 102 gat att gtg atg acc cag tet cac aaa Asp 1 Ile Vai Met Thr 5 Gin Ser His Lys gac agg gtc age ato acc tgc aag gcc Asp Arg Vai Ser 20 Ile Thr Cys Lys Ala 25 gta gcc tgg tat eaa cag aaa cca TOS Vai Ala Trp 35 Tyr Gin Gin Lys Pro 40 Gly tac tgg gca tcc acc cgg cac act gga Tyr Trp 50 Ala Ser Thr Arg His 55 Thr Gly agt aga tat ?TO aca gat ttc act etc Ser 65 Arg Tyr Gly Thr Asp 70 Phe Thr Leu gaa gac ctg gca gat tat ctc tgt cag Glu Asp Leu Ala ASp 85 Tyr Leu Cys Gin ttc ggt ggt STO acc aag ctg gag ctg Phe Gly Gly Gly 100 Thr Lys Leu Glu Leu 105 ttc atg tcc aca tea gta gga 48 Phe Met Ser Thr Ser val Gly 10 15 agt cag gat gtg agt act gct 96 Ser Gin Asp Vai Ser Thr Ala 30 caa tat act aaa cta ctg att 144 Gin Ser Pro Lys Leu Leu Ile 45 gtc cct gat ege ttc aca ggc 192 Vai Pro Asp Arg Phe Thr Gly 60 acc att age aat gtg cag tet 240 Thr Ile Ser Asn Vai Gin Ser 75 80 caa tat age aac tat ate acg 288 Gin Tyr Ser Asn Tyr Ile Thr 90 95 aaa egt g 322 Lys Arg

<210> 103 <211> 108 <212> PRT <213> Homo sapiens 135 ΕΡ 1 876 236/ΡΤ <4 Ο 0> 103

Asp Ile Vai Ket Thr Gin Ser His Lys Phe Met Ser Thr Ser Vai Gly 15 10 15

Asp Arg Vai Ser ile Thr Cys Lys Ala Ser Gin Asp Vai Ser Thr Ala 20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ser Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45

Tyr Trp Ala Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly 50 55 60

Ser Arg Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Val Gin Ser 65 70 75 30

Slu Asp Leu Ala Asp Tyr Leu Cys Gin Gin Tyr Ser Asn Tyr Ile Thr 85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Gly 100 105

<210> 104 <211> 322 <212> ADN <213> Homo sapiens <22 0> <221> CDS <222> (1)..(321) <4 0 0> 104 gat att gtg atg acc cag tct cac aaa ttc atg tcc aca tca gta gga 48

Asp Ile Val Met Thr Gin Ser His Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly 1 5 10 15 gac agg gtc age ate ace tgc aag gee agt cag gat gtg agt aet get 96

Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gin Asp Val Ser Thr Ala 20 25 30 144 136ΕΡ 1 876 236/ΡΤ gta gcc Val Ala tgg tat Trp Tyr 35 caa Gin cag Gin aaa Lys cca Pro 40 tac tcg Tyr Ser 50 gca tcc Ala Ser tac Tyr cgg Arg tac Tyr 55 agt Ser agt aga Ser Arg 65 tat ggg Tyr Gly aca Thr gat Asp 70 ttc Phe act Thr gaa gac Glu Asp ctg gca Leu Ala gat Asp 85 tat Tyr ctc tgt Leu Cys ttc ggt Phe Gly ggt ggg Gly Gly 100 acc Thr aag Lys ctg gag Leu Glu <210> 105 <211> 108 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 105 Asp Ile 1 vai Met Thr 5 Gin Ser His Asp Arg Val Ser 20 ile Thr Cys Lys Val Ala Trp Tyr 35 Gin Gin Lys Pro 40 Tyr Ser 50 Ala Ser Tyr Arg Tyr 55 Ser Ser Arg 65 Tyr Gly Thr Asp Phe 70 Thr Glu Asp Leu Ala Asp 85 Tyr Leu Cys Phe Gly Gly Gly 100 Thr Lys Leu Glu <210> 106 <211> 1215 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 106 Leu Lys Arg Gly 105 ggg caa tct cct aaa cta ctg att Gly Gin Ser Pro Lys Leu Leu ile 45 gga gtc cet gat ege ttc aca ggc Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly 60 ctc acc att age aat gtg cag tct Leu Thr Ile Ser Asn Val Gin Ser 75 80 cag caa tat age aac tat ate acg Gin Gin Tyr Ser Asn Tyr ile Thr 90 95 ctg aaa cga g Leu Lys Arg 105

Lys Phe Met Ser Thr Ser Vai Gly 10 15

Ala Ser Gin Asp Vai Ser Thr Ala 25 30

Gly Gin Ser Pro Lys Leu Leu Ile 45

Gly Vai Pro Asp Arg Ehe Thr Gly 60

Leu Thr Ile Ser Asn Vai Gin Ser 75 80

Gin Gin Tyr Ser Asn Tyr Ile Thr 90 95 ggcctcgggg gccagctttc tggggcaggc caggcctgac cttggctttg gggcagggag 192 240 288 322 60 137 ΕΡ 1 876 236/ΡΤ ggggctaagg tgaggcaggt ggcgccagcc aggtgcacae ceaatgccca tgagcccaga 120 cactggacgc tgaacctcgc ggacagttaa gaacccaggg gcctctgcgc cctgggccca 180 gctctgtccc acaccgcggt cacatggcac cacctctctt gcagcttcca ccaagggccc 240 atccgtcttc cccctggcgc cctgctccag gagcacctcc gagagcacag ccgccctggg 300 ctgcctggtc aaggactact tccccgaacc ggtgacggtg tcgtggaact caggcgccct 360 gaccagcggc gtgcacacct tcccggctgt cctacagtcc tcaggactct actccctcag 420 cagcgtggtg acogtgccct ccagcagctt gggcacgaag acctacacct gcaacgtaga 480 tcacaagccc agcaacacca aggtggacaa gagagttgag tccaaatatg gtcccccatg 540 cccaccatgc ccagcacctg agttoctggg gggaocatoa gtcttcctgt tccccccaaa 600 acccaaggac actctcatga tctcccggac ccctgaggtc aegtgcgtgg tggtggacgt 660 gagccaggaa gaccccgagg tccagttcaa ctggtacgtg gatggcgtgg aggtgcataa 720 tgccaagaca aagccgcggg aggagcagtt caacagcacg taacgtgtgg tcagcgtcct 780 caccçtcctg caccaggact ggctgaacgg caaggagtac aagtgcaagg tctccaacaa 840 aggceteeGg tccteeatcg agaaaaceat ctccaaagee aaagggcagc cccgagagce 900 acaggtgtgc accctçcccc catcccagga ggagatgacc aagaaccagg tcagcctgtg 960 gtgcctggtc aaaggcttct accceagcga catcgccgtg gagtgggaga gcaatgggca 1020 gccggagaac aactacaaga coacgcctcc cgtgctçgac tccgacggct ccttcttcct 1080 ctacagcagg ctaaccgtgg aeaagagcag gtggcaggag gggaatgtct tctcatgctc 1140 cgtgatgcat gaggctctgc acaaccacta cacacagaag agcctctccc tgtctctggg 1200 haaafcgagcg gccgc 1215

<210> 107 <211> 684 <212> ADN <213> Homo sapiens <4 0 0> 107 ggcctcgggg gccgaattcc taaactctga gggggfccgga tgacgtggcc attctttgcc 60 taaagcattg agtttactgc aaggtcagaa aagcatgcaa agccctcaga atggctgcaa 120 agageteeaa caaaacaatt tagaaettta ttaaggaata gggggaagct aggaagaaac 180 tcaaaacatc aagattttaa atacgcttct tggtctcctt gctataatta tctgggataa 240 gcatgctgtt ttctgtctgt ooctaacatg ccctgtgatt atccgcaaac aacacaccca 300 agggcagaac tttgttactt aaacaacate ctgtttgctt ctttcctGag gaactgfcggc 360 tgcaccatct gtattcatct tcccgocatc tgatgagcag ttgaaatctg gaactgcctc 420 tgttgtgtgc ctgctgaata acttctatcc cagagaggcc aaagtacagt ggaaggtgga 480 taacgccctc caatagggta actcccagga gagtgtcaca gagcaggaca gcaaggacag 540 138 ΕΡ 1 876 236/ΡΤ cacctacagc ctcagcagca ccetgaeget gageaaagea gaetâcgaga aanacaaagt £00 ctacgcctgc gaagtcaccc atcagggcct gagctcgccc gtcacaaaga gcttcaacag 660 gggagagtgt tagagggcgg nege 684

<210> 108 <211> 1215 <212> ADN <213> Homo sapiens <4 0 0> 108 ggectcgggg gcctcccagg etctgggcag gcacaggcta ggtgccccta acccaggccc 60 tgcacacaaa ggggcaggtg ctgggctcag acctgccaag agccatatcc gçgaggaccc 120 tgcccctgac ctaagcccac cccaaaggcc aaactctcca ctccctcagc tcggacacct 180 tctctcctcc cagattccag taactcccaa tcttctctct gcagcttcca ccaagggccc 240 atccgtcttc ecectggcgc cctgctccag gagcacctcc gagagcacag eegeeetggg 300 ctgcctggtc aaggactact tccccgaacc ggtgacggtg tcgtggaact caggcgccct 360 gaccagcggc gtgoacacct tcccggctgt cctacagtco tcaggactct actocctcag 420 cagcgtggtg accgtgccct ccagcagctt gggcacgaag acctacacct gcaacgtaga 480 tcaoaagocc agcaaoacca aggtggacaa gagagttgag tccaaatatg gtcoccaatg 540 cccaccatgc ccagcacctg agttcctggg gggaccatca gtcttcctgt tccccccaaa 600 acccaaggac actctcatga tcteccggae eeetgaggtc acgtgcgtgg tggtggacgt 660 gagccaggaa gacecogagg tccagttcaa otggtacgtg gatggcgtgg aggtgcataa 720 tgccaagaca aagccgcggg aggagcagtt caacagcacg taccgtgtgg tcagcgtcet 780 caccgtcctg oaocaggact ggctgaaogg oaaggagtac aagtgcaagg tctccaacaa 840 aggcctcccg tcctccatcg agaaaaccat ctccaaagcc aaagggcage cccgagagcc 900 acaggtgtac accctgcccc catcccagtg cgagatgacc aagaaccagg tcagcctgtc 960 ctgcgcggto aaaggcttct atcccagcga catcgccgtg gagtgggaga gcaatgggca 1020 gccggagaac aactacaaga ccacgcctcc cgtgctggac tccgacggct ccttcttcct 1080 egtgageagg otaaeegtgg aeaagageag gtggcaggag gggaatgtct tctcatgctc 1140 cgtgatgcat gaggctctgc acaaccacta cacacagaag agcctctccc tgtctctggg 1200 taaatgagcg gccgc 1215

<210> 109 <211> 15 <212> ADN <213> Mus musculus <4 0 0> 109 acctactgga tgcac 15 ΕΡ 1 876 236/ΡΤ 139 <210> 110 <211> 51 <212> ADN <213> Mus musculus <4 0 0> 110 tacattaatc ctagcagtgg ttatactaag tacaatcaga agttcaaggt c 51 <210> 111 <211> 27 <212> ADN <213> Mus musculus <4 0 0> 111 ggtaacctcg gctacttctt tgactac 27 <210> 112 <211> 15 <212> ADN <213> Mus musculus <4 0 0> 112 gactactata tgcac 15 <210> 113 <211> 51 <212> ADN <213> Mus musculus <4 0 0> 113 tacattaatc ctagcagtgg ttatactaag tacaatcgga agttcaggga c 51 <210> 114 <211> 27 <212> ADN <213> Mus musculus <4 0 0> 114 gggggtaacg gttactacct tgactac 27 <210> 115 140 ΕΡ 1 876 236/ΡΤ

<211> 106 <212> PRT <213> Mus musculus <4 0 0> 115

Asp 1 ile val Met Thr 5 Gin Ser HiS Lys Phe 10 Ket Ser Thr Ser Val Gly 15 Asp Arg vai Ser 20 Ile Thr Cys Lys Ala 25 Ser Gin Asp Val Gly 30 Thr Ala Vai Ala Trp Tyr 35 Gin Gin Lys Pro Gly 40 Leu Ser Pro Lys 45 Leu Leu ile Tyr Trp 50 Ala Ser Thr Arg His 55 Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe 60 Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr He Ser Asn val Gin Ser 65 70 75 80 Glu Asp Leu Ala Asp 85 Tyr Phe Cys Gin Gin 90 Tyr Ser Ser Tyr Leu 95 Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105

<210> 116 <211> 106 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 116

Asp Ile Gin Met Thr Gin Ser Bis Lys Phe Met Ser Thr Ser val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gin Asp Val Ser Thr Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ser Pro Lys Leu Leu ile 35 40 45 Tyr Trp Ala Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn val Gin Ser 65 70 75 80 Glu Asp Leu Ala Asp Tyr Leu Cys Gin Gin Tyr Ser Asn Tyr Ile Thr Β5 90 95

Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 100 105 <210> 117 <211> 33 <212> ADN <213> Mus musculus 141 ΕΡ 1 876 236/ΡΤ <4 Ο 0> 117 aaggccagtc aggatgtggg tactgctgta gcc 33 <210> 118 <211> 21 <212> ADN <213> Mus musculus <4 0 0> 118 tgggcatcca cccggcacac t 21 <210> 119 <211> 24 <212> ADN <213> Mus musculus <4 0 0> 119 cagcaatata gcagctatct cacg 24 <210> 120 <211> 33 <212> ADN <213> Mus musculus <4 0 0> 120 aaggccagtc aggatgtgag tactgctgta gcc 33 <210> 121 <211> 21 <212> ADN <213> Mus musculus <4 0 0> 121 tgggcatcca cccggcacac t 21 <210> 122 <211> 24 <212> ADN <213> Mus musculus <4 0 0> 122 cagcaatata gcaactatat cacg 24 142 ΕΡ 1 876 236/ΡΤ <210> 123 <211> 57 <212> ADN <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (D .. (57) <400> 123 atg gac Mot Asp 1 tgg acc tgg aga ate Trp Thr Trp Arg Ile 5 ete leu ttt Phe gcc cac Ala His tcc Ser <210> 124 <211> 19 <212> PRT <213> Homo sapiens <4 0 0> 124 Met Asp 1 Trp Thr Trp Arg Ile 5 Leu Phe Ala HiS Ser <210> 125 <211> 57 <212> ADN <213> Homo sapiens <22 0> <221> CDS <222> (D · · (57) <4 0 0> 125 atg gac Met Asp 1 tgg acc tgg age ate Trp Thr Trp Ser Ile 5 ctt Leu ttc Phe gcc cac Ala hís tcc Ser ttg gtg gca gca gcc aaa ggt leu Val Ala Ala Ala lys Gly 4 8 10 15

Leu Val Ala Ala Ala lys Gly 10 15 57 ttg gtg gca gca gca aca ggt 48 leu Val Ala Ala Ala Thr Gly 10 15 <210> 126 <211> 19 57 143

ΕΡ 1 876 236/ΡΤ <212> PRT <213> Homo sapiens <4 Ο 0> 126

Met Aep Trp Thr Trp Ser Ile leu Phe Leu vai Ala Ala Ala Thr Gly 15 10 15

Ala His Ser

<210> 127 <211> 66 <212> ADN <213> Homo sapiens <22 0>

<221> CDS <222> (1)..(66) <4 0 0> 127 atg gac atg agg gtc ccc gct cag ctc ctg ggg ctc ctg cta ctc tgg

Met Asp Met Arg Vai Pro Ala Sln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp 15 10 15 ctc cga ggt gcc aga tgt Leu Arg Gly Ala Arg Cys 20

<210> 128 <211> 22 <212> PRT <213> Homo sapiens <4 0 0> 128

Met Asp Met Arg Vai Pro Ala Gin Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp 15 10 15

Leu Arg Gly Ala Arg Cys 20 48 66 <210> 129 <211> 354 <212> ADN <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (D · . . (354) 144 ΕΡ 1 876 236/ΡΤ <400> 129 cag gtc cag ctt gtg cag tet 999 gct gag gtg aag aag cct ggg tcc 48 Gin Vai Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 tca gtg aag gtt tcc tgc aag gee tet gga ggc acc ttc agt gac tac 96 Ser Vai Lys Vai Ser Cys Lys Ála Ser Gly Gly Thr Phe Ser Asp Tyr 20 25 30 tat atg cac tgg gtg ege cag gee ccc gga caa 999 ctt gag tgg at? 144 Tyr Met His Trp val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 gga tac att aat cct age agt ggt tat act aag tac aat cgg aag ttc 192 Gly Tyr He Asn Pro Ser Ser Gly Tyr Thr Lys Tyr Asn Arg Lys Phe 50 55 60 agg gac aga gtc acc att acc gcg gac aaa tcc acg age aca gee tac 240 Arg Asp Arg val Thr ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr €5 70 75 SO atg gag ctg age age ctg aga tet gaa gac acg gct gtg tat tac tgt 288 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 gcg aga 99? ggt aac 99t tac tac ctt gac tac tgg ggc cag ggc acc 336 Ala Arg Gly Gly Asn Gly Tyr Tyr Leu Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr 100 105 110 acg gtc acc gtc tcc tca 354 Thr Vai Thr Val Ser Ser 115 <210> 130 <211> 118 <212> PRT <213> Homo sapiens <4 0 0> 130 Gin Vai Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Vai Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Asp Tyr 20 25 30 Tyr Met His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 145 ΕΡ 1 876 236/ΡΤ

Gly Tyr Ile Asa fro Ser Ser Gly Tyr Thr Lys Tyr Asn Arg Lys Phe 50 55 60

Arg Asp Arg Vai Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys B5 30 95

Ala Arg Gly Gly Asn Gly Tyr Tyr Leu Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr 100 105 110

Thr Vai Thr Vai Ser Ser 115 <210> 131 <211> 357 <212> ADN <213> Homo sapiens <22 0> <221> CDS <222> (D . · (357) <4 0 0> 131 cag gtg cag ctg gtg cag tct gga cct Gin vai Gin Leu Val Gin Ser Gly Pro 1 5 tea gtg aag gtc tcc tgc aag gcc tct Ser vai lys Vai Ser Cys Lys Ala Ser 20 25 aac atg gac tgg gcg cga cag gcc cct Asn Met Asp Trp Ala Arg Gin Ala Pro 35 40 gga gat att aat act aaa agt ggt ggt Gly Asp Ile Asn Thr Lys Ser Gly Gly 50 55 aag ggc aga gtc ate atg acc ata gac Lys Gly Arg Val ile Met Thr Ile Asp 65 70 atg gaa ttg agg age Ctg aga tea gac Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp 85 gcg agg agg agg age tac ggc tac tac Ala Arg Arg Arg Ser Tyr Gly Tyr Tyr 100 105 acc ctg gtc acc gtc tcc tea Thr Leu Vai Thr Val Ser Ser 115 <210> 132 gac gtg aag aag ccg ggg gcc 48

Asp Vai Lys Lys Pro Gly Ala 10 15 ggc tac atg ttt tcc gac aac 96

Gly Tyr Met Phe Ser Asp Asn 30 gga caa ggg ctt gag tgg atg 144

Gly Gin Gly Leu Glu Trp Met 45 tct ate tac aac cag aag ttc 192

Ser Ile Tyr Asn Gin Lys Phe 60 aaa tcc acg ggc aca gcc tac 240

Lys Ser Thr Gly Thr Ala Tyr 75 80 gac acg gcc ata tat tac tgt 288

Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys 90 95 ttt gac tac tgg ggc cag gga 336

Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly 110 357 146 ΕΡ 1 876 236/ΡΤ

<211> 119 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 132

Gin Vai Gin Leu Vai Gin Ser Gly Pro Asp Vai Lys Lys Pr© Gly Ala 15 10 15

Ser Vai lys Vai Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Met Phe Ser Asp Asn 20 25 30

Asn Met Asp Trp Ala Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly leu Glu Trp Met 35 40 45

Gly Asp Ile Asn Thr Lys Ser Gly Gly Ser Ile Tyr Asn Gin Lys Phe 50 55 60

Lys Gly Arg Vai Ile Met Thr Ile Asp Lys Ser Thr Gly Thr Ala Tyr 65 70 75 80

Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala ile Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg Arg Arg Ser Tyr Gly Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly 100 105 110

Thr Leu Vai Thr Vai Ser Ser 115

<210> 133 <211> 318 <212> ADN <213> Homo sapiens <22 0> <221> CDS <222> (1)..(318) <400> 133 gac ate gtg atg acc cag tet cea tcc tcc ctg tet gea tet gta gga 48 Asp 1 rie val Met Thr 5 Gin Ser Pro Ser Ser 10 Leu Ser Ala Ser Val 15 Gly gac aga gtc acc ate act tgc aag gee agt cag aat gtg ggg act gct 96 Asp Arg Val Thr 20 Ile Thr Cys Lys Ala Ser 25 Gin Asn val Gly Thr 30 Ala gta gee tgg tat cag cag aaa cca ggg aaa gee cct aag ctc ctg ate 144 val Ala Trp 35 Tyr Gin Gin Lys Pro 40 Gly Lys Ala Pro Lys 45 Leu Leu Ile tat teg gea tcc tac cgg tac agt ggg gtc cca tea agg ttc agt ggc 192 Tyr Ser 50 Ala Ser Tyr Arg Tyr 55 Ser Gly Val Pro Ser 60 Arg Phe Ser Gly 147 ΕΡ 1 876 236/ΡΤ agt cga tat ggg aea gat ttc act ctc acc ate tea age ttg caa cct 24 0 Ser Arg Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80 gaa gat tta gca act tac tac tgt cag caa tat age aac rt ft ate acg 288 Glu Asp Leu Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Tyr Ser Asn Tyr Ile Thr 85 90 95 ttc ggc gga ggg acc aag gtg gag ate aaa 318 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105

<210> 134 <211> 106 <212> PRT <213> Homo sapiens <4 0 0> 134

Asp Ile Vai Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Vai Gly 15 10 15

Asp Arg Vai Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gin Asn Vai Gly Thr Ala 20 25 30

Vai Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser Gly Vai Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60

Ser Arg Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 SO

Glu Asp Leu Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Tyr Ser Asn Tyr Ile Thr 85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Vai Glu Ile Lys 100 105

<210> 135 <211> 354 <212> ADN <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1).. (354) 148 ΕΡ 1 876 236/ΡΤ <400> 135 gag gtc cag ctt gtg cag tet ggg gct gag gtg gtg aag cct ggg tcc 48 Glu Vai Gin Leu val Gin Ser Gly Ala Glu val Val Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 tca gtg aag Çftt tcc tgc acg gee tet gga tac acc ttc agt gac tac 96 Ser Vai lys vai Ser Cys Thr Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Asp Tyr 20 25 30 tat atg cac tgg gtg ege cag gee ccc gga gaa ggg ctt gag tgg atg 144 Tyr Met His Trp Val Arg Gin Ala pro Gly Glu Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 gga tac att aat cct age agt ggt tat a et aag tac aat «gg aag ttc 192 Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Ser Gly Tyr Thr Lys Tyr Asn Arg Lys Phe 50 55 60 agg gac aga gtc acc att acc gcg gac aaa tcc acg age a ca gee tac 240 Arg Asp Arg Val Thr ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 atg gag etg age age ctg aga tet gaa gac acg gct gtg tat tac tgt 288 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 gcg aga ggg ggt ctc ggt tac tac ctt gac tac tgg ggc gag ggc acc 336 Ala Arg Gly Gly Leu Gly Tyr Tyr Leu Asp Tyr Trp Gly Glu Gly Thr 100 105 110 acg gtc acc gtc tcc tca 354 Tbr Vai Thr Val Ser Ser 115

<210> 136 <211> 118 <212> PRT <213> Homo sapiens 149 ΕΡ 1 876 236/ΡΤ <4 Ο 0> 136

Glu Vai Gin Leu Vai Gin Ser Gly Ala Glu Vai Vai Lys Pro Gly Ser 15 10 15

Ser Vai Lys Vai Ser Cys Thr Ala Ser Gly Tyr Thr phe Ser Asp Tyr 20 25 30

Tyr Met His Trp Vai Arg Gin Ala Pro Gly Glu Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45

Gly Tyr Ile Aan Pro Ser Ser Gly Tyr Thr Lys Tyr Asn Arg Lys Phe 50 55 60

Arg Asp Arg Vai Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80

Met Glu leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg Gly Gly Leu Gly Tyr Tyr Leu Asp Tyr Trp Gly Glu Gly Thr 100 105 110

Thr Vai Thr Vai Ser Ser 115

<210> 137 <211> 357 <212> ADN <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(357) 150 ΕΡ 1 876 236/ΡΤ <400> 137 gag gtg cag ctg gtg cag tet gga gct cag gtg aag aag ccg ggg gee 48 Glu Vai Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Gin Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 tca gtg aag gtc tcc tgc aag gee tet ggc tac acg ttt tcc gac aac 96 ser Vai Lys Vai Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Asp Asn 20 25 30 aac atg gac tgg gtg cga cag gee cct gga aaa ggg ett gag tgg atg. 144 Asn Met Asp Trp val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 gga gat att aat act aaa agt ggt ggt tet ate tae &&C cag aag ttc 192 Gly Asp Ile Asn Thr Lys Ser Gly Gly Ser Ile Tyr Asn Gin Lys Phe 50 55 60 aag ggc aga gtc ate atg acc ata gac aaa tcc acg ggc aca gee tac 240 LyS Gly Arg Val ile Mtet Thr ile Asp Lys Ser Thr Gly Thr Ala Tyr 65 70 75 80 atg gaa ttg agg age ctg aga tca gac gac acg gee ãta tat tac tgt 288 Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala ile Tyr Tyr Cys 85 90 95 gcg agg agg agg age tac ggc tac tac ttt gac tac tgg ggc cgg gga 336 Ala Arg Arg Arg Ser Tyr Gly Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Arg Gly 100 105 110 acc ctg gtc acc gtc tcc tca 357 Thr Leu Vai Thr Val Ser Ser 115 <21 0> 138 <21 1> 119 <212> PRT <213> Homo sapiens <4 0 0> 138 Glu Vai Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Gin Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Vai Lys val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Asp Asn 20 25 30 Asn Met Asp Trp val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Asp Ile Asn Thr Lys Ser Gly Gly Ser Ile Tyr Asn Gin Lys Phe 151 ΕΡ 1 876 236/ΡΤ 50 55 60

Lys Gly Arg Vai Ile Met Thr lie Aap lys Ser Thr Gly Thr Ala Tyr 65 70 75 30

Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Agp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg Arg Arg Ser Tyr Gly Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Arg Gly 100 105 110

Thr Leu Val Thr Vai Ser Ser 115 <210> 139 <211> 318 <212> ADN <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (D .. (318) <4 0 0> 139 gac ate gtg atg acc cag tet cca tcc tcc ctg tet gca tet gta gga 48 Asp Ile val Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 gac aga gtc acc ate act tgc aag gcc agt cag aat gtg ggg act gct 96 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gin Asn val Gly Thr Ala 20 25 30 gta gcc tgg tat cag cag aaa cca ggg aaa gcc cct aag ctc ctg ate 144 Val Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 tat tcg gca tcc tac cgg tac agt ggg gtc cca tea agg ttc agt ggc 192 Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 agt cga tat ggg aca gat ttc act etc acc ate tea age ttg caa cct 240 Ser Arg Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 30 ?aa gat tta gca act tac tac tgt cag caa tat age aac tat ate acg 288 Glu Asp Leu Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Tyr Ser Asn Tyr ile Thr 85 90 95 ttc ggc caa ggg acc aag gtg gag ate aaa 318 Phe Gly Gin Gly Thr Lys val Glu ile Lya 100 105

<210> 140 <211> 106 <212> PRT <213> Homo sapiens 152 ΕΡ 1 876 236/ΡΤ <400> 140

Asp ile Vai Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Vai Gly 15 10 15

Asp Arg Vai Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gin. Asn Vai Gly Thr Ala 20 25 30

Vai Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser Gly Vai Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60

Ser Arg Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80

Glu Asp Leu Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Tyr Ser Asn Tyr Ile Thr 85 90 95

Phe Gly Gin Gly Thr Lys Vai Glu Ile Lys 100 105 <210> 141 <211> 354

<212> ADN <213> Homo sapiens <22 0> <221> CDS <222> (1).. (354) 153 ΕΡ 1 876 236/ΡΤ <400> 141 gag gtc cag ctt gtg cag tet ggg gct gag gtg cag aag cct ggg gee 48 Glu Vai Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu val Gin Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 tca gtg aag gtt tcc tgc aag gee tet gga tac acc ttc a et gac tac 96 Ser Vai Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 tat atg cac tgg gtg ege cag gee ccc gga gaa ggg ctt gag tgg atg 144 Tyr Met His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Glu Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 gga tac att aat cct age agt ggt tat a et aag tac aat cgg aag ttc 192 Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Ser Gly Tyr Thr lys Tyr Asn Arg Lys Phe 50 55 60 agg gac aga gtc acc att acc gcg gac aaa tcc acg age aca gee tac 240 Arg Asp Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 atg gag ctg age age ctg aga tet gaa gac acg gct gtg tat tac tgt 288 Met Glu leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 gcg aga ggg ggt caa ggt tac tac ctt gac tac tgg ggc gag ggc acc 336 Ala Arg Gly Gly Gin Gly Tyr Tyr Leu Asp Tyr Trp Gly Glu Gly Thr 100 105 110 acg gtc acc gtc tcc tca 354 Thr Val Thr val Ser Ser 115

<210> 142 <211> 118 <212> PRT <213> Homo sapiens 154 ΕΡ 1 876 236/ΡΤ <4 Ο 0> 142

Glu Vai Gin Leu Vai Gin Ser Gly Ala Glu Vai Gin Lys Pro Gly Ala 15 10 15

Ser Vai Lys Vai Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30

Tyr Met Bis Trp Vai Arg Gin Ala Pro Gly Glu Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45

Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Ser Gly Tyr Thr Lys Tyr Asn Arg Lys Phe 50 55 60

Arg Asp Arg Vai Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg Gly Gly Gin Gly Tyr Tyr Leu Asp Tyr Trp Gly Glu Gly Thr 100 105 110

Thr Val Thr Vai Ser Ser 115 <210> 143 <211> 318 <212> ADN <213> Homo sapiens <22 0> <221> CDS <222> (D .. 1 [318) <4 0 0> 143 gac ate gtg atg acc cag tet Asp ile Val Met Thr Gin Ser 48 10 15 gac aga gtc acc ate act tgc aag gee agt cag aat gtg ggg act gct Asp Arg Val Thr ile Thr Cys Lys Ala Ser Gin Asn Val Gly Thr Ala 20 25 30 96 155 ΕΡ 1 876 236/ΡΤ gta gee tgg tat cag cag aaa cca ggg aaa gee cct aag ctc ctg ate 144 vai Ala Trp Tyr Gin Gin lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 tat teg gea tcc tac cgg gee agt ggg gtc cca tea agg ttc agt ggc 192 Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Ala Ser Gly Vai Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 agt ega tat ggg aca gat ttc act ctc acc ate tea age ttg caa cot 240 Ser Arg Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80 gaa gat tta gea act tac tac tgt cag caa tat age aac tat ate acg 288 Glu Asp Leu Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Tyr Ser Asn Tyr Ile Thr 85 90 95 ttc ggc caa ggg acc aag gtg gag ate aaa 318 Phe Gly Gin Gly Thr Lys Vai Glu Ile Lys íoo 105

<210> 144 <211> 106 <212> PRT <213> Homo sapiens <4 0 0> 144

Asp Ile Vai Met The Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Vai Gly 15 10 15

Asp Arg Vai Thr ile Thr Cys Lys Ala Ser Gin Asn Vai Gly Thr Ala 20 25 30

Vai Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Ala Ser Gly vai Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 €0

Ser Arg Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gin Pro €5 70 75 80

Glu Asp Leu Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Tyr Ser Asn Tyr Ile Thr 85 90 95

Phe Gly Gin Gly Thr Lys Vai Glu Ile Lys 100 105

Lisboa, 2014-10-13

Claims (12)

1. ΕΡ 1 876 236/ΡΤ 1/3 REIVINDICAÇÕES 1. Anticorpo biespecífico que pode substituir funcionalmente o factor de coagulação VIII e que tem a actividade de aumentar a activação do factor X, que compreende: um primeiro domínio reconhecendo o factor de coagulação IX e/ou o factor de coagulação IX activado; e um segundo domínio reconhecendo o factor de coagulação X, em que o primeiro domínio compreende um primeiro polipéptido compreendendo a cadeia H de um anticorpo contra o factor de coagulação IX e/ou o factor de coagulação IX activado; o segundo domínio compreende um segundo polipéptido compreendendo a cadeia H de um anticorpo contra o factor de coagulação X; e o primeiro e segundo domínios compreendem ambos um terceiro polipéptido compreendendo uma cadeia L comummente partilhada de um anticorpo contra o factor de coagulação IX, factor de coagulação IX activado, ou factor de coagulação X, em que o terceiro polipéptido compreende um local de ligação ao antigénio compreendendo CDR1, 2, e 3 individualmente seleccionadas a partir de CDR1, 2, e 3 de cada cadeia L de dois ou mais anticorpos.
2. 2. Anticorpo biespecífico da reivindicação 1, em que o primeiro polipéptido compreende um local de ligação ao antigénio compreendendo as sequências de aminoácidos das CDR de (al), (a2), ou (a3), e o segundo polipéptido compreende um local de ligação ao antigénio compreendendo as sequências de aminoácidos de (b), em que: (al) as CDR1, 2, e 3 da cadeia H compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 3, 5, e 7, respectivamente; (a2) as CDR1, 2, e 3 da cadeia H compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 21, 5, e 22, respectivamente; (a3) as CDR1, 2, e 3 da cadeia H compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 16, 17, e 18, respectivamente; e (b) as CDR1, 2, e 3 da cadeia H compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 26, 28, e 30, respectivamente.
3. 3. Anticorpo biespecífico da reivindicação 1 que reconhece o factor de coagulação IX e/ou factor de coagulação IX activado, e factor de coagulação X, em que a função ΕΡ 1 876 236/ΡΤ 2/3 substitutiva do factor de coagulação VIII é reduzir o tempo de coagulação em 50 segundos ou mais em comparação com o tempo de coagulação observado na ausência de um anticorpo num teste de tempo de tromboplastina parcial activada (APTT) que envolve o aquecimento de uma solução mista de 50 μΐ de solução de anticorpo, 50 μΐ de plasma deficiente em F. VIII (Biomerieux), e 50 μΐ de reagente de APTT (Dade Behring) a 37°C durante 3 minutos, adição de 50 μΐ de CaCl2 20 mM à solução mista, e depois medição do tempo de coagulação.
4. 4. Composição compreendendo o anticorpo de qualquer uma de reivindicações 1 a 3, e um transportador farmaceuticamente aceitável.
5. 5. Composição farmacêutica compreendendo um transportador farmaceuticamente aceitável e o anticorpo de qualquer uma de reivindicações 1 a 3, para utilização em prevenção e/ou tratamento de hemorragia, uma doença acompanhando hemorragia, ou uma doença causada por hemorragia, em que a hemorragia, doença acompanhando hemorragia, ou doença causada por hemorragia é uma doença que se desenvolve e/ou progride devido a redução ou deficiência na actividade do factor de coagulação VIII e/ou factor de coagulação VIII activado.
6. 6. Utilização do anticorpo de qualquer uma de reivindicações 1 a 3 para produção de uma composição farmacêutica contendo um transportador farmaceuticamente aceitável para prevenção e/ou tratamento de hemorragia, uma doença acompanhando hemorragia, ou uma doença causada por hemorragia, em que a hemorragia, doença acompanhando hemorragia, ou doença causada por hemorragia é uma doença que se desenvolve e/ou progride devido a redução ou deficiência na actividade do factor de coagulação VIII e/ou factor de coagulação VIII activado.
7. 7. Composição para utilização da reivindicação 5 ou utilização da reivindicação 6, em que a doença que se desenvolve e/ou progride devido a redução ou deficiência na actividade do factor de coagulação VIII e/ou factor de coagulação VIII activado é hemofilia A. ΕΡ 1 876 236/ΡΤ 3/3
8. 8. Composição para utilização da reivindicação 5 ou utilização da reivindicação 6, em que a doença que se desenvolve e/ou progride devido a redução ou deficiência na actividade do factor de coagulação VIII e/ou factor de coagulação VIII activado é uma doença envolvendo o aparecimento de um inibidor contra o factor de coagulação VIII e/ou factor de coagulação VIII activado.
9. 9. Composição para utilização da reivindicação 5 ou utilização da reivindicação 6, em que a doença que se desenvolve e/ou progride devido a redução ou deficiência na actividade do factor de coagulação VIII e/ou factor de coagulação VIII activado é hemofilia adquirida.
10. 10. Composição para utilização da reivindicação 5 ou utilização da reivindicação 6, em que a doença que se desenvolve e/ou progride devido a redução na actividade do factor de coagulação VIII e/ou factor de coagulação VIII activado é a doença de von Willebrand.
11. 11. Estojo compreendendo pelo menos o anticorpo de qualquer uma das reivindicações 1 a 3, ou a composição da reivindicação 4.
12. 12. Estojo da reivindicação 11 compreendendo ainda o factor de coagulação VIII. Lisboa, 2014-10-13