PT1907408E - Derivados nad/nadh estáveis - Google Patents
Derivados nad/nadh estáveis Download PDFInfo
- Publication number
- PT1907408E PT1907408E PT67764860T PT06776486T PT1907408E PT 1907408 E PT1907408 E PT 1907408E PT 67764860 T PT67764860 T PT 67764860T PT 06776486 T PT06776486 T PT 06776486T PT 1907408 E PT1907408 E PT 1907408E
- Authority
- PT
- Portugal
- Prior art keywords
- case
- dehydrogenase
- independently
- radical
- compound
- Prior art date
Links
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 35
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 34
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 34
- 239000005515 coenzyme Substances 0.000 claims description 33
- 108010050375 Glucose 1-Dehydrogenase Proteins 0.000 claims description 30
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 27
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 25
- 239000012491 analyte Substances 0.000 claims description 19
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 claims description 17
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 16
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 16
- 125000002467 phosphate group Chemical group [H]OP(=O)(O[H])O[*] 0.000 claims description 16
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 claims description 15
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 14
- 229910052801 chlorine Inorganic materials 0.000 claims description 13
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims description 12
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 11
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 claims description 11
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 claims description 10
- 239000008103 glucose Substances 0.000 claims description 10
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 claims description 10
- 101710088194 Dehydrogenase Proteins 0.000 claims description 9
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 102000003855 L-lactate dehydrogenase Human genes 0.000 claims description 8
- 108700023483 L-lactate dehydrogenases Proteins 0.000 claims description 8
- 229910052731 fluorine Inorganic materials 0.000 claims description 8
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 claims description 7
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 229910052770 Uranium Inorganic materials 0.000 claims description 7
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 claims description 7
- 125000000896 monocarboxylic acid group Chemical group 0.000 claims description 7
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 claims description 6
- 102000004420 Creatine Kinase Human genes 0.000 claims description 6
- 108010042126 Creatine kinase Proteins 0.000 claims description 6
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 6
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 claims description 6
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 claims description 6
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 claims description 6
- RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N glutathione Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N 0.000 claims description 6
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N lactic acid Chemical compound CC(O)C(O)=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 claims description 5
- 125000002837 carbocyclic group Chemical group 0.000 claims description 5
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 claims description 5
- 102000004008 5'-Nucleotidase Human genes 0.000 claims description 4
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 claims description 4
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 claims description 4
- 125000000623 heterocyclic group Chemical group 0.000 claims description 4
- BJEPYKJPYRNKOW-UHFFFAOYSA-N malic acid Chemical compound OC(=O)C(O)CC(O)=O BJEPYKJPYRNKOW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 108010043671 prostatic acid phosphatase Proteins 0.000 claims description 4
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 claims description 4
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 claims description 4
- BJEPYKJPYRNKOW-REOHCLBHSA-N (S)-malic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](O)CC(O)=O BJEPYKJPYRNKOW-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 3
- 108010050201 2-hydroxybutyrate dehydrogenase Proteins 0.000 claims description 3
- 108010021809 Alcohol dehydrogenase Proteins 0.000 claims description 3
- 102000007698 Alcohol dehydrogenase Human genes 0.000 claims description 3
- 101100167062 Caenorhabditis elegans chch-3 gene Proteins 0.000 claims description 3
- 101000892220 Geobacillus thermodenitrificans (strain NG80-2) Long-chain-alcohol dehydrogenase 1 Proteins 0.000 claims description 3
- 108010024636 Glutathione Proteins 0.000 claims description 3
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 3
- 108010009384 L-Iditol 2-Dehydrogenase Proteins 0.000 claims description 3
- LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-M Pyruvate Chemical compound CC(=O)C([O-])=O LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 3
- 102100026974 Sorbitol dehydrogenase Human genes 0.000 claims description 3
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 claims description 3
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 3
- 235000010323 ascorbic acid Nutrition 0.000 claims description 3
- 229960005070 ascorbic acid Drugs 0.000 claims description 3
- 239000011668 ascorbic acid Substances 0.000 claims description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 claims description 3
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 claims description 3
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 claims description 3
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 235000012000 cholesterol Nutrition 0.000 claims description 3
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 claims description 3
- 229960002433 cysteine Drugs 0.000 claims description 3
- 235000019441 ethanol Nutrition 0.000 claims description 3
- 235000001727 glucose Nutrition 0.000 claims description 3
- 229960003180 glutathione Drugs 0.000 claims description 3
- 235000003969 glutathione Nutrition 0.000 claims description 3
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 claims description 3
- 239000004310 lactic acid Substances 0.000 claims description 3
- 235000014655 lactic acid Nutrition 0.000 claims description 3
- 239000001630 malic acid Substances 0.000 claims description 3
- 235000011090 malic acid Nutrition 0.000 claims description 3
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 3
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 3
- 150000003626 triacylglycerols Chemical class 0.000 claims description 3
- 108030000198 L-amino-acid dehydrogenases Proteins 0.000 claims description 2
- 125000005842 heteroatom Chemical group 0.000 claims description 2
- YGSDEFSMJLZEOE-UHFFFAOYSA-M salicylate Chemical compound OC1=CC=CC=C1C([O-])=O YGSDEFSMJLZEOE-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 2
- 229960001860 salicylate Drugs 0.000 claims description 2
- UUFQTNFCRMXOAE-UHFFFAOYSA-N 1-methylmethylene Chemical compound C[CH] UUFQTNFCRMXOAE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 150000008575 L-amino acids Chemical class 0.000 claims 1
- 150000001993 dienes Chemical class 0.000 claims 1
- 229940049920 malate Drugs 0.000 claims 1
- 229930027945 nicotinamide-adenine dinucleotide Natural products 0.000 description 73
- 229950006238 nadide Drugs 0.000 description 54
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 49
- BAWFJGJZGIEFAR-NNYOXOHSSA-N NAD zwitterion Chemical compound NC(=O)C1=CC=C[N+]([C@H]2[C@@H]([C@H](O)[C@@H](COP([O-])(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]3[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O3)N3C4=NC=NC(N)=C4N=C3)O)O2)O)=C1 BAWFJGJZGIEFAR-NNYOXOHSSA-N 0.000 description 48
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 42
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 42
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 41
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 31
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 30
- BOPGDPNILDQYTO-NNYOXOHSSA-N nicotinamide-adenine dinucleotide Chemical class C1=CCC(C(=O)N)=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]2[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O2)N2C3=NC=NC(N)=C3N=C2)O)O1 BOPGDPNILDQYTO-NNYOXOHSSA-N 0.000 description 24
- 239000000047 product Substances 0.000 description 22
- 238000004809 thin layer chromatography Methods 0.000 description 19
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 17
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 17
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 15
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 14
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 14
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 14
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 14
- JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N Pyridine Chemical group C1=CC=NC=C1 JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 13
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 13
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- -1 acetyl NAD Chemical compound 0.000 description 12
- 239000012043 crude product Substances 0.000 description 12
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 11
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 11
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 10
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- DFPAKSUCGFBDDF-UHFFFAOYSA-N Nicotinamide Chemical group NC(=O)C1=CC=CN=C1 DFPAKSUCGFBDDF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 9
- 239000000460 chlorine Substances 0.000 description 9
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 9
- VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N n-Hexane Chemical compound CCCCCC VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- AFABGHUZZDYHJO-UHFFFAOYSA-N 2-Methylpentane Chemical compound CCCC(C)C AFABGHUZZDYHJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical class [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- 238000000862 absorption spectrum Methods 0.000 description 8
- 229960000583 acetic acid Drugs 0.000 description 8
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 8
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 8
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 8
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 8
- 239000012362 glacial acetic acid Substances 0.000 description 7
- 230000008569 process Effects 0.000 description 7
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 7
- VKIGAWAEXPTIOL-UHFFFAOYSA-N 2-hydroxyhexanenitrile Chemical compound CCCCC(O)C#N VKIGAWAEXPTIOL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 6
- LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N N-Butanol Chemical compound CCCCO LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000005481 NMR spectroscopy Methods 0.000 description 6
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N Tetrahydrofuran Chemical compound C1CCOC1 WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 6
- 230000008859 change Effects 0.000 description 6
- 238000011161 development Methods 0.000 description 6
- IJKVHSBPTUYDLN-UHFFFAOYSA-N dihydroxy(oxo)silane Chemical compound O[Si](O)=O IJKVHSBPTUYDLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 6
- UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N pyridine Natural products COC1=CC=CN=C1 UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 6
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 6
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 6
- ZAMOUSCENKQFHK-UHFFFAOYSA-N Chlorine atom Chemical compound [Cl] ZAMOUSCENKQFHK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- JGFZNNIVVJXRND-UHFFFAOYSA-N N,N-Diisopropylethylamine (DIPEA) Chemical compound CCN(C(C)C)C(C)C JGFZNNIVVJXRND-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 5
- 238000004821 distillation Methods 0.000 description 5
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 5
- 238000002189 fluorescence spectrum Methods 0.000 description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 5
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 5
- 238000010992 reflux Methods 0.000 description 5
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 5
- WVLBCYQITXONBZ-UHFFFAOYSA-N trimethyl phosphate Chemical compound COP(=O)(OC)OC WVLBCYQITXONBZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- HMFHBZSHGGEWLO-SOOFDHNKSA-N D-ribofuranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H]1O HMFHBZSHGGEWLO-SOOFDHNKSA-N 0.000 description 4
- QOSSAOTZNIDXMA-UHFFFAOYSA-N Dicylcohexylcarbodiimide Chemical compound C1CCCCC1N=C=NC1CCCCC1 QOSSAOTZNIDXMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N Ribose Natural products OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N 0.000 description 4
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical class [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- XJLXINKUBYWONI-DQQFMEOOSA-N [[(2r,3r,4r,5r)-5-(6-aminopurin-9-yl)-3-hydroxy-4-phosphonooxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl] [(2s,3r,4s,5s)-5-(3-carbamoylpyridin-1-ium-1-yl)-3,4-dihydroxyoxolan-2-yl]methyl phosphate Chemical class NC(=O)C1=CC=C[N+]([C@@H]2[C@H]([C@@H](O)[C@H](COP([O-])(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]3[C@H]([C@@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](O3)N3C4=NC=NC(N)=C4N=C3)O)O2)O)=C1 XJLXINKUBYWONI-DQQFMEOOSA-N 0.000 description 4
- HMFHBZSHGGEWLO-UHFFFAOYSA-N alpha-D-Furanose-Ribose Natural products OCC1OC(O)C(O)C1O HMFHBZSHGGEWLO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- UORVGPXVDQYIDP-UHFFFAOYSA-N borane Chemical compound B UORVGPXVDQYIDP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 4
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 4
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 4
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 4
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 4
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 4
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 4
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 4
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 4
- KQNPFQTWMSNSAP-UHFFFAOYSA-N isobutyric acid Chemical compound CC(C)C(O)=O KQNPFQTWMSNSAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 description 4
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 4
- 239000012074 organic phase Substances 0.000 description 4
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 4
- FHNKBDPGQXLKRW-KAZBKCHUSA-N (1r,2s,3r,5r)-3-amino-5-(hydroxymethyl)cyclopentane-1,2-diol Chemical compound N[C@@H]1C[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O FHNKBDPGQXLKRW-KAZBKCHUSA-N 0.000 description 3
- UYHMQTNGMUDVIY-UHFFFAOYSA-M 1-(2,4-dinitrophenyl)pyridin-1-ium;chloride Chemical compound [Cl-].[O-][N+](=O)C1=CC([N+](=O)[O-])=CC=C1[N+]1=CC=CC=C1 UYHMQTNGMUDVIY-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N Dichloromethane Chemical compound ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 3
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 3
- LNUFLCYMSVYYNW-ZPJMAFJPSA-N [(2r,3r,4s,5r,6r)-2-[(2r,3r,4s,5r,6r)-6-[(2r,3r,4s,5r,6r)-6-[(2r,3r,4s,5r,6r)-6-[[(3s,5s,8r,9s,10s,13r,14s,17r)-10,13-dimethyl-17-[(2r)-6-methylheptan-2-yl]-2,3,4,5,6,7,8,9,11,12,14,15,16,17-tetradecahydro-1h-cyclopenta[a]phenanthren-3-yl]oxy]-4,5-disulfo Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](COS(O)(=O)=O)O[C@@H]([C@@H]([C@H]1OS(O)(=O)=O)OS(O)(=O)=O)O[C@@H]1[C@@H](COS(O)(=O)=O)O[C@@H]([C@@H]([C@H]1OS(O)(=O)=O)OS(O)(=O)=O)O[C@@H]1[C@@H](COS(O)(=O)=O)O[C@H]([C@@H]([C@H]1OS(O)(=O)=O)OS(O)(=O)=O)O[C@@H]1C[C@@H]2CC[C@H]3[C@@H]4CC[C@@H]([C@]4(CC[C@@H]3[C@@]2(C)CC1)C)[C@H](C)CCCC(C)C)[C@H]1O[C@H](COS(O)(=O)=O)[C@@H](OS(O)(=O)=O)[C@H](OS(O)(=O)=O)[C@H]1OS(O)(=O)=O LNUFLCYMSVYYNW-ZPJMAFJPSA-N 0.000 description 3
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 3
- 238000005804 alkylation reaction Methods 0.000 description 3
- 239000012300 argon atmosphere Substances 0.000 description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 3
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 3
- 229910000085 borane Inorganic materials 0.000 description 3
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 description 3
- 239000012230 colorless oil Substances 0.000 description 3
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 3
- 238000000295 emission spectrum Methods 0.000 description 3
- 125000003147 glycosyl group Chemical group 0.000 description 3
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 3
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 3
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 3
- 150000004712 monophosphates Chemical class 0.000 description 3
- 229960003966 nicotinamide Drugs 0.000 description 3
- 235000005152 nicotinamide Nutrition 0.000 description 3
- 239000011570 nicotinamide Substances 0.000 description 3
- FEMOMIGRRWSMCU-UHFFFAOYSA-N ninhydrin Chemical compound C1=CC=C2C(=O)C(O)(O)C(=O)C2=C1 FEMOMIGRRWSMCU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 3
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 3
- 150000003222 pyridines Chemical class 0.000 description 3
- 238000002390 rotary evaporation Methods 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 3
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 3
- AOSZTAHDEDLTLQ-AZKQZHLXSA-N (1S,2S,4R,8S,9S,11S,12R,13S,19S)-6-[(3-chlorophenyl)methyl]-12,19-difluoro-11-hydroxy-8-(2-hydroxyacetyl)-9,13-dimethyl-6-azapentacyclo[10.8.0.02,9.04,8.013,18]icosa-14,17-dien-16-one Chemical compound C([C@@H]1C[C@H]2[C@H]3[C@]([C@]4(C=CC(=O)C=C4[C@@H](F)C3)C)(F)[C@@H](O)C[C@@]2([C@@]1(C1)C(=O)CO)C)N1CC1=CC=CC(Cl)=C1 AOSZTAHDEDLTLQ-AZKQZHLXSA-N 0.000 description 2
- SZUVGFMDDVSKSI-WIFOCOSTSA-N (1s,2s,3s,5r)-1-(carboxymethyl)-3,5-bis[(4-phenoxyphenyl)methyl-propylcarbamoyl]cyclopentane-1,2-dicarboxylic acid Chemical compound O=C([C@@H]1[C@@H]([C@](CC(O)=O)([C@H](C(=O)N(CCC)CC=2C=CC(OC=3C=CC=CC=3)=CC=2)C1)C(O)=O)C(O)=O)N(CCC)CC(C=C1)=CC=C1OC1=CC=CC=C1 SZUVGFMDDVSKSI-WIFOCOSTSA-N 0.000 description 2
- GHYOCDFICYLMRF-UTIIJYGPSA-N (2S,3R)-N-[(2S)-3-(cyclopenten-1-yl)-1-[(2R)-2-methyloxiran-2-yl]-1-oxopropan-2-yl]-3-hydroxy-3-(4-methoxyphenyl)-2-[[(2S)-2-[(2-morpholin-4-ylacetyl)amino]propanoyl]amino]propanamide Chemical compound C1(=CCCC1)C[C@@H](C(=O)[C@@]1(OC1)C)NC([C@H]([C@@H](C1=CC=C(C=C1)OC)O)NC([C@H](C)NC(CN1CCOCC1)=O)=O)=O GHYOCDFICYLMRF-UTIIJYGPSA-N 0.000 description 2
- QFLWZFQWSBQYPS-AWRAUJHKSA-N (3S)-3-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[5-[(3aS,6aR)-2-oxo-1,3,3a,4,6,6a-hexahydrothieno[3,4-d]imidazol-4-yl]pentanoylamino]-3-methylbutanoyl]amino]-3-(4-hydroxyphenyl)propanoyl]amino]-4-[1-bis(4-chlorophenoxy)phosphorylbutylamino]-4-oxobutanoic acid Chemical compound CCCC(NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](Cc1ccc(O)cc1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CCCCC1SC[C@@H]2NC(=O)N[C@H]12)C(C)C)P(=O)(Oc1ccc(Cl)cc1)Oc1ccc(Cl)cc1 QFLWZFQWSBQYPS-AWRAUJHKSA-N 0.000 description 2
- ONBQEOIKXPHGMB-VBSBHUPXSA-N 1-[2-[(2s,3r,4s,5r)-3,4-dihydroxy-5-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]oxy-4,6-dihydroxyphenyl]-3-(4-hydroxyphenyl)propan-1-one Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=CC(O)=CC(O)=C1C(=O)CCC1=CC=C(O)C=C1 ONBQEOIKXPHGMB-VBSBHUPXSA-N 0.000 description 2
- UNILWMWFPHPYOR-KXEYIPSPSA-M 1-[6-[2-[3-[3-[3-[2-[2-[3-[[2-[2-[[(2r)-1-[[2-[[(2r)-1-[3-[2-[2-[3-[[2-(2-amino-2-oxoethoxy)acetyl]amino]propoxy]ethoxy]ethoxy]propylamino]-3-hydroxy-1-oxopropan-2-yl]amino]-2-oxoethyl]amino]-3-[(2r)-2,3-di(hexadecanoyloxy)propyl]sulfanyl-1-oxopropan-2-yl Chemical compound O=C1C(SCCC(=O)NCCCOCCOCCOCCCNC(=O)COCC(=O)N[C@@H](CSC[C@@H](COC(=O)CCCCCCCCCCCCCCC)OC(=O)CCCCCCCCCCCCCCC)C(=O)NCC(=O)N[C@H](CO)C(=O)NCCCOCCOCCOCCCNC(=O)COCC(N)=O)CC(=O)N1CCNC(=O)CCCCCN\1C2=CC=C(S([O-])(=O)=O)C=C2CC/1=C/C=C/C=C/C1=[N+](CC)C2=CC=C(S([O-])(=O)=O)C=C2C1 UNILWMWFPHPYOR-KXEYIPSPSA-M 0.000 description 2
- VHYFNPMBLIVWCW-UHFFFAOYSA-N 4-Dimethylaminopyridine Chemical compound CN(C)C1=CC=NC=C1 VHYFNPMBLIVWCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PWJFNRJRHXWEPT-UHFFFAOYSA-N ADP ribose Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1OC(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(O)C(O)C(O)C=O)C(O)C1O PWJFNRJRHXWEPT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- SRNWOUGRCWSEMX-KEOHHSTQSA-N ADP-beta-D-ribose Chemical compound C([C@H]1O[C@H]([C@@H]([C@@H]1O)O)N1C=2N=CN=C(C=2N=C1)N)OP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H]1O SRNWOUGRCWSEMX-KEOHHSTQSA-N 0.000 description 2
- NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N Ammonium chloride Substances [NH4+].[Cl-] NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N Ammonium hydroxide Chemical compound [NH4+].[OH-] VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101100313763 Arabidopsis thaliana TIM22-2 gene Proteins 0.000 description 2
- XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N Argon Chemical compound [Ar] XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002126 C01EB10 - Adenosine Substances 0.000 description 2
- OJRUSAPKCPIVBY-KQYNXXCUSA-N C1=NC2=C(N=C(N=C2N1[C@H]3[C@@H]([C@@H]([C@H](O3)COP(=O)(CP(=O)(O)O)O)O)O)I)N Chemical compound C1=NC2=C(N=C(N=C2N1[C@H]3[C@@H]([C@@H]([C@H](O3)COP(=O)(CP(=O)(O)O)O)O)O)I)N OJRUSAPKCPIVBY-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 2
- 229940126657 Compound 17 Drugs 0.000 description 2
- RGSFGYAAUTVSQA-UHFFFAOYSA-N Cyclopentane Chemical compound C1CCCC1 RGSFGYAAUTVSQA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- YNAVUWVOSKDBBP-UHFFFAOYSA-N Morpholine Chemical compound C1COCCN1 YNAVUWVOSKDBBP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XXDDQPLHHUHJOU-IDTAVKCVSA-N N-(5'-adenylyl)morpholine Chemical compound C([C@H]1O[C@H]([C@@H]([C@@H]1O)O)N1C=2N=CN=C(C=2N=C1)N)OP(O)(=O)N1CCOCC1 XXDDQPLHHUHJOU-IDTAVKCVSA-N 0.000 description 2
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 2
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N Sodium azide Chemical compound [Na+].[N-]=[N+]=[N-] PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DKGAVHZHDRPRBM-UHFFFAOYSA-N Tert-Butanol Chemical compound CC(C)(C)O DKGAVHZHDRPRBM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DGPLSUKWXXSBCU-UHFFFAOYSA-N [[5-(6-aminopurin-9-yl)-3,4-dihydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl] [4-(3-carbamoylpyridin-1-ium-1-yl)-2,3-dihydroxycyclopentyl]methyl phosphate Chemical compound NC(=O)C1=CC=C[N+](C2C(C(O)C(COP([O-])(=O)OP(O)(=O)OCC3C(C(O)C(O3)N3C4=NC=NC(N)=C4N=C3)O)C2)O)=C1 DGPLSUKWXXSBCU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002250 absorbent Substances 0.000 description 2
- 230000002745 absorbent Effects 0.000 description 2
- OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N adenosine Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 2
- 229960005305 adenosine Drugs 0.000 description 2
- 230000029936 alkylation Effects 0.000 description 2
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 2
- 235000011114 ammonium hydroxide Nutrition 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 2
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 238000011325 biochemical measurement Methods 0.000 description 2
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 2
- 238000002983 circular dichroism Methods 0.000 description 2
- 229940125773 compound 10 Drugs 0.000 description 2
- 229940125797 compound 12 Drugs 0.000 description 2
- 229940126543 compound 14 Drugs 0.000 description 2
- 229940125758 compound 15 Drugs 0.000 description 2
- 229940126142 compound 16 Drugs 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 2
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 2
- 238000000695 excitation spectrum Methods 0.000 description 2
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 2
- SHFJWMWCIHQNCP-UHFFFAOYSA-M hydron;tetrabutylazanium;sulfate Chemical compound OS([O-])(=O)=O.CCCC[N+](CCCC)(CCCC)CCCC SHFJWMWCIHQNCP-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 2
- ZLVXBBHTMQJRSX-VMGNSXQWSA-N jdtic Chemical compound C1([C@]2(C)CCN(C[C@@H]2C)C[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H]2NCC3=CC(O)=CC=C3C2)=CC=CC(O)=C1 ZLVXBBHTMQJRSX-VMGNSXQWSA-N 0.000 description 2
- 229910003002 lithium salt Inorganic materials 0.000 description 2
- 159000000002 lithium salts Chemical class 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 2
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 2
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 2
- RLOWWWKZYUNIDI-UHFFFAOYSA-N phosphinic chloride Chemical compound ClP=O RLOWWWKZYUNIDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IFZDCYWLUQXIAN-UHFFFAOYSA-N phosphoric acid;7h-purin-6-amine;pyridine-3-carboxamide Chemical compound OP(O)(O)=O.NC(=O)C1=CC=CN=C1.NC1=NC=NC2=C1NC=N2 IFZDCYWLUQXIAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XHXFXVLFKHQFAL-UHFFFAOYSA-N phosphoryl trichloride Chemical compound ClP(Cl)(Cl)=O XHXFXVLFKHQFAL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920001467 poly(styrenesulfonates) Polymers 0.000 description 2
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 2
- AOJFQRQNPXYVLM-UHFFFAOYSA-N pyridin-1-ium;chloride Chemical compound [Cl-].C1=CC=[NH+]C=C1 AOJFQRQNPXYVLM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QEVHRUUCFGRFIF-MDEJGZGSSA-N reserpine Chemical compound O([C@H]1[C@@H]([C@H]([C@H]2C[C@@H]3C4=C(C5=CC=C(OC)C=C5N4)CCN3C[C@H]2C1)C(=O)OC)OC)C(=O)C1=CC(OC)=C(OC)C(OC)=C1 QEVHRUUCFGRFIF-MDEJGZGSSA-N 0.000 description 2
- 125000000548 ribosyl group Chemical group C1([C@H](O)[C@H](O)[C@H](O1)CO)* 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 2
- HPALAKNZSZLMCH-UHFFFAOYSA-M sodium;chloride;hydrate Chemical class O.[Na+].[Cl-] HPALAKNZSZLMCH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 2
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 2
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 2
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 2
- 238000010189 synthetic method Methods 0.000 description 2
- DYHSDKLCOJIUFX-UHFFFAOYSA-N tert-butoxycarbonyl anhydride Chemical compound CC(C)(C)OC(=O)OC(=O)OC(C)(C)C DYHSDKLCOJIUFX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N α-D-glucopyranosyl-α-D-glucopyranoside Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OC1C(O)C(O)C(O)C(CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ALNDFFUAQIVVPG-NGJCXOISSA-N (2r,3r,4r)-3,4,5-trihydroxy-2-methoxypentanal Chemical compound CO[C@@H](C=O)[C@H](O)[C@H](O)CO ALNDFFUAQIVVPG-NGJCXOISSA-N 0.000 description 1
- RYHBNJHYFVUHQT-UHFFFAOYSA-N 1,4-Dioxane Chemical compound C1COCCO1 RYHBNJHYFVUHQT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HEWZVZIVELJPQZ-UHFFFAOYSA-N 2,2-dimethoxypropane Chemical compound COC(C)(C)OC HEWZVZIVELJPQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BURBNIPKSRJAIQ-UHFFFAOYSA-N 2-azaniumyl-3-[3-(trifluoromethyl)phenyl]propanoate Chemical compound OC(=O)C(N)CC1=CC=CC(C(F)(F)F)=C1 BURBNIPKSRJAIQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KPVQNXLUPNWQHM-RBEMOOQDSA-N 3-acetylpyridine adenine dinucleotide Chemical compound CC(=O)C1=CC=C[N+]([C@H]2[C@@H]([C@H](O)[C@@H](COP([O-])(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]3[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O3)N3C4=NC=NC(N)=C4N=C3)O)O2)O)=C1 KPVQNXLUPNWQHM-RBEMOOQDSA-N 0.000 description 1
- WDYVUKGVKRZQNM-UHFFFAOYSA-N 6-phosphonohexylphosphonic acid Chemical compound OP(O)(=O)CCCCCCP(O)(O)=O WDYVUKGVKRZQNM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940123378 ADP ribosyl cyclase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 102100036475 Alanine aminotransferase 1 Human genes 0.000 description 1
- 108010082126 Alanine transaminase Proteins 0.000 description 1
- USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N Ammonium acetate Chemical compound N.CC(O)=O USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005695 Ammonium acetate Substances 0.000 description 1
- 108010003415 Aspartate Aminotransferases Proteins 0.000 description 1
- 102000004625 Aspartate Aminotransferases Human genes 0.000 description 1
- 239000007989 BIS-Tris Propane buffer Substances 0.000 description 1
- 235000013912 Ceratonia siliqua Nutrition 0.000 description 1
- 240000008886 Ceratonia siliqua Species 0.000 description 1
- 108010089254 Cholesterol oxidase Proteins 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KAZBKCHUSA-N D-altritol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KAZBKCHUSA-N 0.000 description 1
- 108020005199 Dehydrogenases Proteins 0.000 description 1
- VYZAHLCBVHPDDF-UHFFFAOYSA-N Dinitrochlorobenzene Chemical compound [O-][N+](=O)C1=CC=C(Cl)C([N+]([O-])=O)=C1 VYZAHLCBVHPDDF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004366 Glucose oxidase Substances 0.000 description 1
- 108010015776 Glucose oxidase Proteins 0.000 description 1
- 101000610640 Homo sapiens U4/U6 small nuclear ribonucleoprotein Prp3 Proteins 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 108010026217 Malate Dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 102000013460 Malate Dehydrogenase Human genes 0.000 description 1
- 229910021380 Manganese Chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- GLFNIEUTAYBVOC-UHFFFAOYSA-L Manganese chloride Chemical compound Cl[Mn]Cl GLFNIEUTAYBVOC-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- LFTLOKWAGJYHHR-UHFFFAOYSA-N N-methylmorpholine N-oxide Chemical compound CN1(=O)CCOCC1 LFTLOKWAGJYHHR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910004809 Na2 SO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- BHVJSLYJWDSJMS-UHFFFAOYSA-N O.O.NC1CCCCC1 Chemical compound O.O.NC1CCCCC1 BHVJSLYJWDSJMS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108090000854 Oxidoreductases Proteins 0.000 description 1
- 102000004316 Oxidoreductases Human genes 0.000 description 1
- KUFMXPZUZBPFCT-UHFFFAOYSA-N P(O)(OCOP(O)=O)=O Chemical compound P(O)(OCOP(O)=O)=O KUFMXPZUZBPFCT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000004160 Phosphoric Monoester Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 108090000608 Phosphoric Monoester Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 101001110823 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) 60S ribosomal protein L6-A Proteins 0.000 description 1
- 101000712176 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) 60S ribosomal protein L6-B Proteins 0.000 description 1
- 102000007562 Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- 108010071390 Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108090000340 Transaminases Proteins 0.000 description 1
- 102000003929 Transaminases Human genes 0.000 description 1
- HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N Trehalose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N 0.000 description 1
- ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N Triethylamine Chemical class CCN(CC)CC ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 102100040374 U4/U6 small nuclear ribonucleoprotein Prp3 Human genes 0.000 description 1
- DFPAKSUCGFBDDF-ZQBYOMGUSA-N [14c]-nicotinamide Chemical compound N[14C](=O)C1=CC=CN=C1 DFPAKSUCGFBDDF-ZQBYOMGUSA-N 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 150000003838 adenosines Chemical class 0.000 description 1
- 125000000304 alkynyl group Chemical group 0.000 description 1
- HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N alpha,alpha-trehalose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N 0.000 description 1
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 1
- 150000001414 amino alcohols Chemical class 0.000 description 1
- 229940043376 ammonium acetate Drugs 0.000 description 1
- 235000019257 ammonium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 235000012538 ammonium bicarbonate Nutrition 0.000 description 1
- 229940063284 ammonium salicylate Drugs 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 229910052786 argon Inorganic materials 0.000 description 1
- 229940009098 aspartate Drugs 0.000 description 1
- 238000012742 biochemical analysis Methods 0.000 description 1
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 1
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 1
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 1
- 235000011089 carbon dioxide Nutrition 0.000 description 1
- STNNHWPJRRODGI-UHFFFAOYSA-N carbonic acid;n,n-diethylethanamine Chemical compound [O-]C([O-])=O.CC[NH+](CC)CC.CC[NH+](CC)CC STNNHWPJRRODGI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 description 1
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 1
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 description 1
- 239000012501 chromatography medium Substances 0.000 description 1
- 238000010549 co-Evaporation Methods 0.000 description 1
- 238000004040 coloring Methods 0.000 description 1
- 230000003750 conditioning effect Effects 0.000 description 1
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 1
- 238000002425 crystallisation Methods 0.000 description 1
- 230000008025 crystallization Effects 0.000 description 1
- NISGSNTVMOOSJQ-UHFFFAOYSA-N cyclopentanamine Chemical compound NC1CCCC1 NISGSNTVMOOSJQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002274 desiccant Substances 0.000 description 1
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 1
- XPPKVPWEQAFLFU-UHFFFAOYSA-J diphosphate(4-) Chemical compound [O-]P([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O XPPKVPWEQAFLFU-UHFFFAOYSA-J 0.000 description 1
- 235000011180 diphosphates Nutrition 0.000 description 1
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 1
- 238000006345 epimerization reaction Methods 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- IRXSLJNXXZKURP-UHFFFAOYSA-N fluorenylmethyloxycarbonyl chloride Chemical compound C1=CC=C2C(COC(=O)Cl)C3=CC=CC=C3C2=C1 IRXSLJNXXZKURP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 1
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 235000019420 glucose oxidase Nutrition 0.000 description 1
- 229940116332 glucose oxidase Drugs 0.000 description 1
- 229910052736 halogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000002367 halogens Chemical class 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- DMEGYFMYUHOHGS-UHFFFAOYSA-N heptamethylene Natural products C1CCCCCC1 DMEGYFMYUHOHGS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-UHFFFAOYSA-N hexane-1,2,3,4,5,6-hexol Chemical compound OCC(O)C(O)C(O)C(O)CO FBPFZTCFMRRESA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AFQIYTIJXGTIEY-UHFFFAOYSA-N hydrogen carbonate;triethylazanium Chemical compound OC(O)=O.CCN(CC)CC AFQIYTIJXGTIEY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XMBWDFGMSWQBCA-UHFFFAOYSA-N hydrogen iodide Chemical compound I XMBWDFGMSWQBCA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 1
- 238000003760 magnetic stirring Methods 0.000 description 1
- 235000002867 manganese chloride Nutrition 0.000 description 1
- 239000011565 manganese chloride Substances 0.000 description 1
- 229940099607 manganese chloride Drugs 0.000 description 1
- 238000001819 mass spectrum Methods 0.000 description 1
- 238000000816 matrix-assisted laser desorption--ionisation Methods 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 239000000155 melt Substances 0.000 description 1
- UKVIEHSSVKSQBA-UHFFFAOYSA-N methane;palladium Chemical compound C.[Pd] UKVIEHSSVKSQBA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 239000002808 molecular sieve Substances 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- HWJHZLJIIWOTGZ-UHFFFAOYSA-N n-(hydroxymethyl)acetamide Chemical compound CC(=O)NCO HWJHZLJIIWOTGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LZGUHMNOBNWABZ-UHFFFAOYSA-N n-nitro-n-phenylnitramide Chemical compound [O-][N+](=O)N([N+]([O-])=O)C1=CC=CC=C1 LZGUHMNOBNWABZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940101270 nicotinamide adenine dinucleotide (nad) Drugs 0.000 description 1
- 239000012299 nitrogen atmosphere Substances 0.000 description 1
- 229910000069 nitrogen hydride Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910000489 osmium tetroxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000012285 osmium tetroxide Substances 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 238000005191 phase separation Methods 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 125000003367 polycyclic group Chemical group 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 239000001267 polyvinylpyrrolidone Substances 0.000 description 1
- 235000013855 polyvinylpyrrolidone Nutrition 0.000 description 1
- 229920000036 polyvinylpyrrolidone Polymers 0.000 description 1
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 description 1
- 235000011164 potassium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 239000008057 potassium phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 150000003138 primary alcohols Chemical class 0.000 description 1
- 238000009516 primary packaging Methods 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 125000000719 pyrrolidinyl group Chemical group 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 238000006479 redox reaction Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 239000002002 slurry Substances 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- URGAHOPLAPQHLN-UHFFFAOYSA-N sodium aluminosilicate Chemical compound [Na+].[Al+3].[O-][Si]([O-])=O.[O-][Si]([O-])=O URGAHOPLAPQHLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 description 1
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910000033 sodium borohydride Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000012279 sodium borohydride Substances 0.000 description 1
- 229910001495 sodium tetrafluoroborate Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 235000011149 sulphuric acid Nutrition 0.000 description 1
- YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N tetrahydrofuran Natural products C=1C=COC=1 YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000003536 tetrazoles Chemical class 0.000 description 1
- WROMPOXWARCANT-UHFFFAOYSA-N tfa trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F.OC(=O)C(F)(F)F WROMPOXWARCANT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JOXIMZWYDAKGHI-UHFFFAOYSA-N toluene-4-sulfonic acid Chemical compound CC1=CC=C(S(O)(=O)=O)C=C1 JOXIMZWYDAKGHI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 1
- 238000005292 vacuum distillation Methods 0.000 description 1
- 239000002351 wastewater Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/26—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase
- C12Q1/32—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase involving dehydrogenase
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/531—Production of immunochemical test materials
- G01N33/532—Production of labelled immunochemicals
- G01N33/533—Production of labelled immunochemicals with fluorescent label
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
Description
ΕΡ 1 907 408/ΡΤ
DESCRIÇÃO "Derivados NAD/NADH estáveis" A invenção refere-se a derivados de nicotinamida-adenina-dinucleótido (NAD/NADH) ou nicotinamida-adenina-fosfato de dinucleótido (NADP/ NADPH) estável, complexos enzimáticos destes derivados e a sua utilização no método de detecção bioquímico bem como ao respectivo conjunto de reagentes.
Sistemas de medição para análise bioquímica são componentes importantes de métodos analíticos clinicamente relevantes. Incluem-se aqui em primeiro plano, a medição de analitos, por exemplo, metabolitos (ou metabólitos) ou substratos, os quais são determinados directa ou indirectamente utilizando uma enzima. O analito, neste caso, é convertido com a ajuda de um complexo enzima-coenzima, e depois quantificado. Nesta avaliação, o analito a ser determinado é colocado em contacto com uma enzima e uma co-enzima adequados, sendo que a enzima é normalmente usada em quantidades catalíticas. A co-enzima é alterada pela reacção enzimática, por exemplo, oxidado ou reduzido. Este processo pode ser submetido a detecção electroquímica ou fotométrica, de forma directa ou através de um mediador. A calibração oferece uma relação directa entre o valor medido e a concentração do analito a ser determinado.
Coenzimas são moléculas orgânicas covalentemente ou não covalentemente ligados a uma enzima e podem vir a ser alteradas por meio da conversão do analito a analisar. Exemplos proeminentes de coenzimas são a nicotinamida-adenina-dinucleótido (NAD) ou nicotinamida-adenina-fosfato de dinucleótido (NADP), os quais por meio de redução dão origem aos NADH ou NADPH.
Com base no estado actual da técnica, os sistemas de medição conhecidos são caracterizados por um período de validade limitado, bem como por requisitos de condições de medição especiais, tais como o arrefecimento ou armazenagem a seco, para se permitir obter essa validade. Em certas formas de concretização, por exemplo, com os testes que são 2 ΕΡ 1 907 408/ΡΤ realizados a si mesmos pelo próprio usuário final, como quando se efectua a auto-monitorização de glicemia, podem por vezes ocorrer erros devido ao uso incorrecto e sem que de tal se aperceba devido a deficiente armazenamento dos meios de teste. Em particular, por exemplo o esgotamento do efeito de agentes dessecantes devido a prolongada abertura do acondicionamento primário pode provocar erros nas medições que são difíceis de verificar, em alguns dos sistemas pelo consumidor.
Uma medida conhecida, que é usada para aumentar a estabilidade dos sistemas de medição bioquímicos, é a utilização de enzimas estáveis, tais como por exemplo a utilização de enzimas a partir de organismos termofílicos. Também é possível, por modificação química de enzimas, tais como por exemplo por ligação cruzada ou por mutagénese proceder à sua estabilização. Além disso podem vir a ser adicionados estabilizadores enzimáticos, tais como por exemplo a trealose, polivinilpirrolidona e albumina do soro, ou podem também as enzimas virem a ser incluídas, por exemplo, por foto-polimerização em redes poliméricas.
Outras tentativas foram feitas, para melhorar a durabilidade de validade dos sistemas de medição bioquímicos, utilizando mediadores estáveis. Assim sendo, usando mediadores com potenciais redox reduzidos, dentro do possível, conseguem-se aumentar a especificidade dos testes, e eliminar as interferências e distúrbios durante a reacção. No entanto, um limite inferior para o potencial redox de mediadores é dado pelos potenciais redox dos complexos enzima/coenzima. Se estes forem ultrapassados a reacção com os mediadores torna-se mais lenta ou é mesmo impedida.
Alternativamente, os sistemas de medição bioquímicos podem também ser utilizados sem mediadores, em que por exemplo, a detecção directa de coenzimas, tais como da coenzima NADH pode ocorrer. Uma desvantagem de tais sistemas de medição, no entanto, decorre do facto de coenzimas, como NAD e NADP serem instáveis.
As NAD e NADP são moléculas de base instáveis, cujos processos de degradação são descritos na literatura (N.J. 3 ΕΡ 1 907 408/ΡΤ
Oppenheimer em "The Pyridine Nucleotide Coenzyms" Academic Press New York, London 1982, Hrsg. J. Everese, B. Anderson, K. You, Kapitel 3, pp. 56-65) . Essencialmente a ADP-ribose é formada durante a degradação de NAD ou NADP, na qual são quebradas as ligações glicosilo entre a ribose e a porção de piridina. As formas reduzidas NADH e NADPH são por outro lado, ácidos instáveis, por exemplo a epimerização é um processo de degradação bem conhecido. Em ambos os casos, a instabilidade de NAD/NADP e NADH/NADPH é baseado na instabilidade da ligação glicosilo entre a ribose e a piridina. Mas também sob condições não muito drásticas, como por exemplo em soluções aquosas, pode ocorrer a hidrólise de coenzimas NAD e NADP, apenas e tão simplesmente por meio da humidade ambiente. Essa instabilidade pode conduzir a imprecisões na medição de analitos.
Uma lista de derivados de NAD/NADP vem descrito, por exemplo em B.M. Anderson em "The Pyridine Nucleotide Coenzymes", Academic Press New York, London 1982, Hrsg. J. Everese, B. Anderson, K. You, capítulo 4. A maioria destes derivados não são no entanto bem aceites por parte das enzimas. O único derivado por conseguinte, a ter sido utilizado até agora para testes de diagnóstico, é o 3-acetil-piridina-adenina-dinucleótido (acetil NAD), que foi descrito pela primeira vez em 1956 (N.O. Kaplan, J. Biol. Chem. (1956), 221, 823). Também esta coenzima apresenta um baixo nivel de aceitação de enzimas e uma alteração no potencial redox.
Em WO 01/94370 é descrito ainda o uso de outros derivados NAD com um grupo piridina modificado. As modificações do grupo nicotinamida apresentam no entanto e de forma geral, um efeito directo sobre a reacção catalítica. Na maioria dos casos, este efeito é negativo.
Num outro conceito de estabilização, a unidade de ribose é modificada para afectar assim, a estabilidade da ligação glicosilo. Esta abordagem não interfere directamente com a reacção catalítica do grupo nicotinamida. No entanto, pode ser uma influência indirecta, uma vez que a enzima apresenta uma ligação forte e específica para com a unidade de ribose. Kaufmann et al. divulga a este respeito em WO 98/33936 e US 4 ΕΡ 1 907 408/ΡΤ 5,801,006 ou WO 01/49247 um número de derivados tioribose-NAD. Não foi no entanto até agora demonstrado existir uma correlação entre a alteração da unidade de ribose-nicotinamida e a actividade dos derivados de reacções enzimáticas. O carbaNAD, um derivado sem ligação glicosilo, foi descrito pela primeira vez em 1988 (J.T. Slama, Biochemistry 1989, 27, 183 e Biochemistry 1989, 28, 7688) . A ribose é aqui substituída por uma unidade de açúcar carbacíclico. Embora o carbaNAD tenha sido descrito como um substrato para desidrogenase, a sua actividade não foi até agora demonstrada em clinica, em métodos de detecção bioquímica.
Uma abordagem semelhante foi descrita mais tarde por G.M. Blackburn, Chem. Comm., 1996, 2765, para produzir carbaNAD com um composto bifosfonato de metileno em vez do pirofosfato natural. 0 bifosfonato de metileno apresenta maior estabilidade em relação a fosfatases e foi utilizada como um inibidor da ADP-ribosil-ciclase. Um aumento da estabilidade em relação à hidrólise não era o objectivo (J.T. Slama, G.M. Blackburn). O objectivo subjacente da presente invenção é, portanto fornecer sistemas de medição bioanaliticas estáveis, em particular para a determinação de glucose, que procurem evitar a maior sensibilidade em relação à hidrólise do NAD/NADP e ao mesmo tempo que sejam activos como co-enzimas em reacções enzimáticas.
Este objectivo é assim atingido através de um elemento de teste para a determinação da glucose, que compreende (i) uma glucose desidrogenase (EC 1.1.1.47) e (ii) como uma coenzima, um composto com a seguinte fórmula geral (I):
A
(D 5 ΕΡ 1 907 408/ΡΤ com A= adenina ou um seu análogo, T= em cada caso e de forma independente 0, s, U= em cada caso e de forma independente 0H, SH, BH3“, v= bcnh2”, em cada caso, e de forma independente, 0H ou um grupo fosfato, em que no caso em que um radical V se trate de um grupo OH e um segundo radical V seja um grupo fosfato, o grupo OH e o grupo fosfato possam formar um ciclo com os átomos de carbono aos quais eles estejam ligados, W= COOR, C0N(R)2, COR, CSN(R)2, onde R represente em cada caso e de forma independente H ou alquilo-Ci-C2, XI, X2 = em cada caso e de forma independente 0, CH2, CHCH3, C(CH3)2, NH, nch3, Y= NH, S, 0, CH2, Z= um radical compreendendo um grupo ciclico com cinco átomos de carbono, contendo opcionalmente um heteroátomo seleccionado a partir de 0, S e N bem como opcionalmente um ou mais substituintes e um radical CR42, onde CR42 é ligado ao grupo ciclico e a X2, com R4 = em cada caso e de forma independente, H, F, Cl, ch3, com a condição de que Z e o radical piridina não estejam acoplados por uma ligação glicosidica, ou um sal ou se for o caso uma forma reduzida do mesmo.
Numa forma de concretização preferida, W representa C0NH2 ou coch3.
Os substituintes preferidos de Z são seleccionados a partir do grupo constituído de OH, F, Cl e alquilo-Ci-C2, opcionalmente substituído com grupos fluorados ou clorados e/ou grupos OH, 0-alquilo-Ci-C2.
Numa forma de concretização preferida, um primeiro radical V representa OH e um segundo radical V representa um grupo fosfato.
Surpreendentemente, os compostos no âmbito da presente invenção são estáveis à hidrólise e são bons substratos em 6
ΕΡ 1 907 40 8/PT métodos de detecção enzimática e podem ser utilizados para o diagnóstico bioquímico. Esta descoberta está em contraste com a maior parte dos derivados de NAD/NADP anteriormente conhecidos, uma vez que estes derivados no método de detecção enzimática e de forma geral apresentam uma estabilidade muito reduzida.
As vantagens dos compostos no âmbito da presente invenção em relação aos usados pelo estado actual da técnica, são: • Elevada estabilidade, • Elevada actividade enzimática, • Síntese simples e económica, • Utilização em todos os métodos de detecção bioquímica conhecidos até há data.
Devido à utilização de derivados estáveis NAD/NADP no âmbito da presente invenção, de preferência em combinação com uma formulação de estabilização, tais como por exemplo pela inclusão de enzimas na matriz polimérica, as desvantagens dos métodos de detecção bioquímicas conhecidas podem ser em grande parte evitadas. Além disso, não é necessário o uso de aditivos estabilizantes. E isto é em particular vantajoso, pois quanto menor for o número de substâncias reactivas que participem no processo, maior é a possibilidade de obter uma formulação estável para a determinação do analito.
Com a presente invenção, pretende-se disponibilizar os elementos de teste, compreendendo uma série de derivados de NAD/NADP estáveis, que têm uma actividade enzimática suficiente para o uso como uma coenzima no elemento de teste está disponível.
Os derivados NAD/NADP estáveis podem ser preparados por meio de métodos de síntese em geral bem conhecidos. Para este fim, o grupo amino de um amino álcool cíclico é convertido por meio de reacção de Zincke num derivado de piridina. O grupo OH primário é então fosforilado e por fim acoplado ao derivado NAD com um derivado de AMP activado. Alternativamente pode ainda o grupo OH primário ser em primeiro lugar fosforilado e em seguida, o grupo amino ser convertido em piridina através de uma reacção de Zincke. 7 ΕΡ 1 907 408/ΡΤ
Uma outra via de síntese é a activação do álcool primário em tosilato ou iodeto e a subsequente alquilação de ADP.
Formas de concretização preferidas dos elementos de teste no âmbito da presente invenção incluem, por exemplo os compostos que têm a sequinte fórmula qeral (!' ):
W com A= adenina ou um seu análoqo, T= em cada caso e de forma independente 0, S, U= em cada caso e de forma independente OH, SH, BH3“, BCNH2“, V= em cada caso, e de forma independente, OH ou um qrupo fosfato, W= COOR, C0N(R)2, COR, CSN (R) 2, onde R represente em cada caso e de forma independente H ou alquilo-Ci-C2, X1,X2= em cada caso e de forma independente 0, CH2, CHCH3, C(CH3)2, NH, nch3, Y= NH, S, 0, CH2, Z= um anel carbocíclico saturado ou insaturado ou anel heterocíclico de cinco membros, em particular um composto de fórmula qeral (II) C(R4)2'
Rs. '^6
Re’ R5'“R5' (II) onde entre R5' e R5" pode estar presente uma liqação simples ou dupla, 8 ΕΡ 1 907 408/ΡΤ R4= em cada caso e de forma independente, H, F, Cl, CH3, R5= CR42, se entre R5' e R5" está presente uma ligação simples, R5' = O, S, NH, N-alquilo-C-C2, CR42, CHOH, CHOCH3, R5"= CR42, CHOH, CHOCH3, se entre R5' e R5" está presente uma ligação dupla, então R5' =R5"=CR4, R6,R6' = em cada caso e de forma independente, CH, CCH ou um sal ou, se apropriado, uma forma reduzida do mesmo.
Um outro ulterior objecto da presente invenção é o de obter compostos que têm a seguinte fórmula geral (!"):
A
com A= adenina ou um seu análogo, T= em cada caso e de forma independente O, S, U= em cada caso e de forma independente OH, SH, BH3“, BCNH2“, V= em cada caso, e de forma independente, OH ou um grupo fosfato, em que no caso em que um radical V se trate de um grupo OH e um segundo radical V seja um grupo fosfato, o grupo OH e o grupo fosfato possam formar um ciclo com os átomos de carbono aos quais eles estejam ligados, W= COOR, CON(R)2, COR, CSN(R)2, onde R represente em cada caso e de forma independente H ou alquilo-Ci-C2, X1,X2= em cada caso e de forma independente O ou NH, Y= NH, S, O, CH2, Z= um anel carbocíclico saturado ou insaturado ou anel heterociclico de cinco membros, em particular um composto de fórmula geral (II) 9 ΕΡ 1 907 408/ΡΤ
RS'=R5" (Μ) onde entre R5' e R5" pode estar presente uma ligação simples ou dupla, R4= em cada caso e de forma independente, H, F, Cl, CH3, R5= CR42, se entre R5' e R5" está presente uma ligação simples, R5' = 0, S, NH, N-alquilo-Ç-C2, CR42, CHOH, CHOCH3, R5"= CR42, CHOH, CH0CH3, se entre R5' e R5" está presente uma ligação dupla, então R5' =R5"=CR4, R6,R6' = em cada caso e de forma independente CH, CC|1 com a condição de que quando sejam R5 = CH2, T = 0, U = em cada caso OH, V = OH, A = C0NH2, X = 0 e Y = 0, então R5' e R5" não sejam simultaneamente CHOH, ou um sal ou, se apropriado, uma forma reduzida do mesmo.
Numa forma de concretização preferida, os compostos análogos de adenina, de acordo com a presente invenção, contêm, como por exemplo adenina substituída em C8 e adenina substituída em Νε, variantes deaza, tais como 7-deaza, variantes aza, como o 8-aza, ou combinações tais como 7-deaza ou 8-aza, ou carbocíclico análogos, tal como a formicina, em que as variantes 7-deaza possam vir a sofrer na posição 7 a substituição com halogénio, alcinilo-, alcenilo- ou alquilo-Ci-C6.
Numa outra forma de concretização preferida, os compostos contêm análogos de adenosina, os quais em vez de ribose, podem por exemplo conter 2-metoxi-desoxirribose, 2' -fluoro-desoxirribose, hexitol, altritol ou compostos policíclicos análogos, tais como açúcares biciclo, açúcares LNA, açúcares triciclo.
Em particular pode também o (di-)-fosfato de oxigénio, ser substituído isotronicamente, como por exemplo 0 por S ou BH3 , 0 por NH, NCH3 ou CH2 e =0 por =S. 10 ΕΡ 1 907 408/ΡΤ
Numa forma de concretização preferida, pelo menos um radical de U do composto no âmbito da presente invenção é diferente de OH e mais preferencialmente pelo menos um radical U= BH3”.
Formas de concretização particularmente preferidas são os derivados Borano carba-NAD, c-pentilo-NAD, pirrolilo-NAD, furanilo-NAD, ciclofosfato de carba-NAD, carba-NADP, pirrolidinilo-NAD, bem como elementos de teste, compreendendo os mesmos:
Borano carba NAD
Ciclopentil NAD
Pirrolil NAD 11
ΕΡ 1 907 40 8/PT
Ciclofosfato de carba NAD
12 ΕΡ 1 907 408/ΡΤ A evidência bioquímica de analitos, tais como parâmetros em fluidos corporais, tais como sangue, soro, plasma ou urina, ou amostras de águas residuais ou de alimentos desempenham um papel importante no diagnóstico. Aqui, o analito a ser determinado é colocado em contacto com uma enzima e uma coenzima adequadas.
Um outro objecto da presente invenção é, por conseguinte, um complexo enzima-coenzima consistindo de um composto no âmbito da presente invenção em combinação com uma enzima adequada.
Como analitos podem ser determinadas quaisquer substâncias químicas ou biológicas, que possam ser detectados através de uma reacção redox, por exemplo, as substâncias onde elas são substratos de uma enzima dependente de um coenzima, ou elas mesmo sendo uma enzima dependente de coenzima. Exemplos preferidos de analitos são a glicose, o ácido láctico, o ácido málico, o glicerol, o álcool, o colesterol, triglicéridos, ácido ascórbico, cisteína, glutationa, péptidos, ureia, amónia, salicilato, piruvato, 5' -nucleotidase, a creatina-quinase (CK), lactato desidrogenase (LDH), dióxido de carbono, etc.
As enzimas adequadas são, por exemplo, desidrogenases seleccionadas a partir da desidrogenase da glucose (E.C.1.1.1.47), da desidrogenase de lactato (E.C.1.1.1.27, 1.1.1.28), da desidrogenase de malato (E.C.1.1.1.37), da desidrogenase de glicerol (E.C.1.1.1.6), da desidrogenase de álcool (E.C.1.1.1.1), da desidrogenase de alfa-hidroxibutirato, desidrogenase de sorbitol, ou desidrogenase de aminoácidos, como por exemplo, desidrogenase de L-aminoácido (E.C.1.4.1.5). Outras enzimas adequadas são as oxidases como a oxidase de glucose (E.C.1.1.3.4) ou oxidase de colesterol (E.C.1.1.3.6) e transaminases como por exemplo aminotransferase de aspartato ou alanina, 5' -nucleotidase ou creatina-quinase.
Um outro objecto da presente invenção é a utilização de um composto no âmbito da presente invenção ou de um complexo de enzima-coenzima no âmbito da presente invenção para a detecção de um analito numa amostra por meio de uma reacção 13 ΕΡ 1 907 408/ΡΤ enzimática. Particularmente preferida neste caso é a detecção de glucose utilizando desidrogenase de glucose (GlucDH). A alteração da coenzima, isto é, do composto no âmbito da presente invenção por meio de reacção com o analito (se o analito se trata de um substrato de enzima) ou por meio de uma reacção catalisada por analito (se o analito for neste caso um enzima) pode, em principio, ser detectada por qualquer dos meios e processos existentes. Nestes casos, em principio, todos os métodos conhecidos ao estado actual da técnica, podem ser usados na detecção de reacções enzimáticas. De preferência, no entanto, pode-se proceder à detecção da alteração da coenzima por métodos ópticos. Métodos de detecção ópticos incluem, por exemplo, medição da absorção, fluorescência, dicroismo circular (CD), dispersão rotativo óptica (ORD), refractometria, etc. De forma ainda preferencial, a alteração da coenzima pode ser detectada por meio de medição da fluorescência. A medição da fluorescência é muito sensivel e permite mesmo a detecção de pequenas concentrações de analitos em sistemas miniaturizados.
Para a detecção de um analito pode ser utilizado um liquido de teste, onde o reagente por exemplo é usado na forma de uma solução ou de uma suspensão num liquido aquoso ou não aquoso, ou na forma de um pó ou em forma liofilizado. Pode no entanto ser também usado um ensaio a seco, no qual o reagente é aplicado sobre um meio de transporte, num teste a executar sobre suporte. O meio de suporte pode ser por exemplo, uma tira de teste que compreende um material absorvente e/ou dilatável que se encontre humedecido pela amostra de liquido de ensaio em prova. 0 reagente de detecção a ser utilizado, pode ser também uma matriz de gel com um complexo enzima-coenzima incorporado (ver DE 102 218 45 Al). A enzima pode, quer em conjunto com o composto no âmbito da invenção a ser incorporado por polimerização na matriz são, ou a matriz, após a polimerização na presença do enzima, pode ser posta em contacto com uma solução do coenzima, resultando assim na formação do complexo enzima-coenzima correspondente. 14 ΕΡ 1 907 408/ΡΤ
Um outro objecto da presente invenção compreende a constituição de um kit ou conjunto de reagentes e o uso dos mesmos para a detecção de analitos. 0 kit de reagentes, pode conter um composto no âmbito da presente invenção, uma enzima adequada, bem como uma solução tampão adequada para a reacção. As enzimas adequadas ao uso neste caso foram já apresentadas. O kit de reagentes no âmbito da presente invenção é versátil ao uso nas mais variadas formas e pode ser utilizado para a determinação de analitos, tais como por exemplo glucose, ácido láctico, ácido málico, glicerol, álcool, colesterol, triglicéridos, ácido ascórbico, cisteina, glutationa, péptidos, ureia, salicilato de amónio, piruvato, 5' -nucleotidase, CK, LDH, dióxido de carbono, etc. De preferência, um kit de reagentes, que contenha um composto no âmbito da presente da invenção e glicose desidrogenase (E.C.1.1.1.47 ), para a detecção de glicose no sangue. 0 kit de reagentes de acordo com a presente invenção pode ser usado para a detecção de uma substância a analisar seja num teste em estado seco ou em condições de estado liquido. A presente comunicação e patente descreve ainda e abre a possibilidade de uso de tiras de teste para a detecção fotométrica ou fluorométrica de uma substância a analisar. Essa tira de teste compreende um composto tal como indicado acima como coenzima e uma enzima adequada ou um substrato de enzima imobilizada sobre um material absorvente e/ou passivel de dilatação. Os materiais adequados a esta aplicação podem ser seleccionados, por exemplo, a partir de celulose, plástico, etc.
Um outro objecto da presente invenção compreende um método para detectar um analito, que compreenda os seguintes passos: (a) Colocar em contacto uma amostra com um dispositivo de ensaio ou kit de reagentes de acordo com a presente invenção, que compreenda uma co-enzima, e (b) Detecção da substância a analisar, por exemplo com base na alteração da coenzima. 15 ΕΡ 1 907 408/ΡΤ
Uma outra vantagem da invenção consiste no facto de a emissão de fluorescência das coenzimas, mostrar um deslocamento batocrómico de forma a existir uma ligeira interferência com a emissão de fluorescência de outros materiais dos elementos de teste e/ou da amostra.
Todas as formas de concretização preferidas apresentadas de um objecto da presente invenção devem aplicar-se ainda a outros objectos da invenção, tal como por exemplo, as concretizações preferidas dos compostos no âmbito da presente invenção. A presente invenção é ainda ilustrada de forma mais detalhada com as seguintes figuras e exemplos.
Figuras
Figura 1
Representação do processo de síntese de carbaNAD (cNAD).
Figura 2
Apresentação dos resultados de carga de NAD a 8°C e a 37°C. Figura 3
Apresentação dos resultados de carga de carbaNAD a 8°C e 37°C. Figura 4
Representação do processo de síntese de Borano NAD por alquilação de ADP, com Y=BH3, apenas por alquilação em beta-fosfato do ADP.
Figura 5
Representação do processo de síntese de pirrolidinil-NAD (pNAD). Além das fórmulas estruturais são dados números dos compostos e os rendimentos dos respectivos passos de reacção.
Figura 6A/6B
Espectros de absorção de NAD e pNAD (Figura 6A) e NADH ou pNADH (Figura 6B). 16 ΕΡ 1 907 408/ΡΤ
Figura 7
Espectros de fluorescência de NADH e pNADH como complexo
GlucDH (espectros de emissão).
Figura 8
Espectros de fluorescência de NADH e pNADH como complexo
GlucDH (espectros de excitação).
Figura 9
Comparação de estabilidades de NAD e pNAD.
Figura 10A/10B/10C
Os espectros de absorção de NAD e cNAD (Figura 10A) ou NADH e cNADH (Figs. 10B e 10C).
Figura 11
Espectros de fluorescência de NADH e cNADH como complexos GlucDH.
Exemplos
Produção experimental de derivados estáveis de NAD/NADH A preparação de derivados de NAD/NADH estáveis é apresentado de forma exemplificada na produção de carbaNAD (composto 9, Figura 1) e pirrolidina-NAD (composto 18, Figura 5). Outros derivados podem ser preparados com os métodos de síntese respectivos adequados. Os correspondentes aminoálcoois como reagentes de partida são conhecidos da literatura de especialidade: 2- amino-l,4-anidro-2,3-didesoxi-L-treo-pentitol: Huryn, Donna M.; Sluboski, Barbara C.; Tam, Steve Y.; Todaro, Louis J.; Weigele, Manfred. Tetrahedron Letters (1989), 30(46), 6259-62. 3- amino-, (IR,3S)-ciclopentanometanol, Beres, J.; Sagi, G.; Tomoskozi, I.; Gruber, L.; Gulacsi, E.; Otvos, L.: Tetrahedron Letters (1988), 29(22), 2681-4 17 ΕΡ 1 907 408/ΡΤ
A) Preparaçao de carbaNAD I. IR-(-)-exo-cis-5,6-di-hidroxi-2-azabiciclo[2.2.1]heptan-3-ona (1)
Em um balão de fundo redondo de 1 L, a uma solução de 22,5 g (167 mmol) de N-metilmorf olina-N-óxido em 80 ml de água desionizada é adicionada uma solução de 16,4 g (147 mmol) de IR-(-)-2-azabiciclo[2.2.1]hept-5-en-3-ona em 400 ml de acetona. Com arrefecimento usando gelo, é adicionado entretanto uma solução 2,5% de tetróxido de ósmio em terc-butanol, 15 ml (1,2 mmol) no espaço de tempo de 15 minutos. A mistura é por fim deixada com agitação à temperatura ambiente durante a noite.
Os solventes são separados por destilação num evaporador rotativo. Procede-se então à agitação com 100 ml, e de novo à destilação num evaporador rotativo. Por fim dissolve-se em 600 ml de água desionizada e é misturado com 35 g de carvão activado. A mistura é agitada vigorosamente durante lh e em seguida filtrada por meio de um filtro de profundidade Seitz K 250. A partir do filtrado, a água é removida por destilação em evaporador rotativo. O produto final é usado sem purificação adicional. TLC - cromatografia camada fina (sílica gel Merck 60 F-254): acetato de etilo/metanol/ácido acético glacial 7:2:1 Rf 0,75 (material de partida), 0,53 (1). Coloração com TDM/desenvolvimento em câmara de cloro. *Reagente TDM: Solução 1: 10 g de Ν,Ν,Ν' ,N' -tetrametil-4,4' diaminodifenilmetano, em 40 ml de ácido acético glacial e 200 ml de água desionizada. Solução 2: 20 g de cloreto de potássio em 400 ml de água desionizada. Solução 3: dissolver 0,3 g de ninidrina em 10 ml de ácido acético glacial e adicionar 90 ml de água desionizada. Reagente final: mistura da solução 1 com 2 e adição de 6 ml da solução 3. II. IR-(-)-exo-cis-5,6-dimetilmetilenodioxi-2-azabiciclo-[2.2.1]heptan-3-ona (2) O produto em bruto 1 é aquecido ao ponto de ebulição sob refluxo, durante 1 hora em 200 ml de etanol absoluto. Depois 18 ΕΡ 1 907 408/ΡΤ da adição de 400 ml (3,26 mol) de dimetoxipropano e 250 mg (2,2 mmol) de cloridrato de piridina, a mistura é aquecida durante mais 15 minutos sob refluxo ao ponto de ebulição. Após a adição de 10 ml de solução de bicarbonato de sódio saturada, a solução é concentrada num evaporador rotativo sob vácuo até à completa secagem. O resíduo é então tratado com 500 ml de clorofórmio, 150 ml de solução salina saturada e 75 ml de solução saturada de bicarbonato de sódio e vertida para um funil de separação. Após a extracção é deixada em repouso durante a noite, para permitir a ocorrência da separação de fases. A fase orgânica é separada e a fase aquosa extraída duas vezes com 200 ml de clorofórmio. As fases orgânicas combinadas são secas sobre sulfato de magnésio. Após filtrar o produto desidratado, o solvente é removido por destilação sob pressão reduzida num evaporador rotativo. O produto em bruto (24,9 g = 92%) é utilizado sem purificação adicional. TLC (sílica gel Merck 60 F-254): acetato de etilo/metanol/ ácido acético glacial 7:2:1 Rf 0,84. A coloração com TDM/desenvolvimento em câmara de cloro. III. IR-(-)-4-N-terc-butiloxicarbonil-exo-cis-5, 6-dimetil-metilenodioxi-2-azabiciclo[2.2.1]heptan-3-ona (3) A uma solução de 24,9 g (135,7 mmol) de produto em bruto 2 em 450 ml de clorofórmio absoluto é adicionado, sob atmosfera de árgon 41,5 g (190 mmol) de dicarbonato de di-terc-butilo e 0,83 g (6,8 mmol) de 4-dimetilaminopiridina. A mistura é aquecida em agitação, sob refluxo ao ponto de ebulição até à cessação do desenvolvimento de gás. A mistura é passada então através de uma coluna cheia com 40 g de gel de sílica 60, equilibrada com clorofórmio e filtrada. É lavada então com 100 ml de clorofórmio. A partir do filtrado, o solvente é removido por destilação sob pressão reduzida num evaporador rotativo. O produto em bruto é seco durante 60 minutos a 10 mbar e 40°C. É utilizado então sem purificação adicional. TLC (sílica gel Merck 60 F-254): acetato de etilo/hexano 3:2, Rf=0,85. A coloração é feita com TDM/desenvolvimento em câmara de cloro. 19
ΕΡ 1 907 408/PT IV. (-)-(lR,2R,3S,4R)-4-(N-terc-butiloxicarbonil)amino-2,3-dimetilmetilenodioxi-1-(hidroximetil)ciclopentano (4) À temperatura ambiente, o produto em bruto 3 é dissolvido com agitação em 400 ml de tetra-hidrofurano e 80 ml de água desionizada. Após arrefecimento a 4°C, e adição a 5,3 g de boro-hidreto de sódio e agitação durante a noite, procede-se então ao aquecimento da mistura de forma lenta até atingir a temperatura ambiente. Adicionam-se então 100 ml de etanol e agita-se à temperatura ambiente durante 6 h. Os solventes são removidos por destilação sob pressão reduzida num evaporador rotativo. São adicionados depois 300 ml de solução de cloreto de sódio saturada e 650 ml de acetato de etilo, e vertidos para uma ampola de decantação. A fase orgânica é assim separada e a fase aquosa é lavada mais uma vez com 350 ml de acetato de etilo. As fases orgânicas combinadas são então secas sobre sulfato de magnésio. Após filtrar-se o produto desidratado, o solvente removido é destilado sob pressão reduzida num evaporador rotativo. O produto em bruto (42,2 g) é purificado por cromatografia em coluna e gel de sílica 60 (coluna h=93 cm, d=10 cm) eluente THF/hexano 1:3, em seguida, THF/hexano 2:3) com fluxo de 3 1/h. São recolhidos fracções de 40 ml. As fracções são então controladas por meio de TLC: (Merck sílica gel 60 F-254: acetato de etilo/hexano 3:2, Rf=0,45. Coloração TDM/desenvolvimento em câmara de cloro. A partir das fracções de produto combinadas, o solvente removido é destilado em evaporador rotativo, sob vácuo, rendimento: 24,9 g. V. (-)-(lR,2R,35,4R)-4-amino-2,3-di-hidroxi-l-(hidroximetil)-ciclopentano (5) A 11,09 g (38,6 mmol) de produto em bruto 4 são adicionados 8 ml de água desionizada e em seguida 80 ml de ácido trifluoroacético. A mistura é agitada vigorosamente durante 6h à temperatura ambiente, formando então uma solução amarelo claro, transparente. Adicionam-se 200 ml de água desionizada e procede-se a evaporação sob vácuo num
evaporador rotativo. Juntam-se outros 200 ml de água desionizada e evapora-se novamente sob vácuo num evaporador rotativo. O produto em bruto é então dissolvido em 100 ml de água desionizada num banho de ultra-sons e filtrada. O 20 ΕΡ 1 907 408/ΡΤ filtrado é tratado por meio de uma coluna de permuta iónica Dowex 1X8 (100-200 malhas, forma OH) (15x4,9 cm) e eluido com água, na qual o produto em bruto após aproximadamente 150 ml é eluido num volume de 300 ml (pH 10,4). As fracções são controladas com TLC (Merck sílica gel 60 F-254: butanol/ácido acético glacial/água 5:2:3, Rf=0,42, coloração TDM/desenvolvimento em câmara de cloro. Das fracções combinadas contendo o produto, o solvente é removido por destilação em vácuo em um evaporador rotativo, para produzir 5,2 g de um óleo incolor. VI. Sal Zincke de nicotinamida (6)
Sob atmosfera de azoto, 58,6 g dinitroclorobenzeno é fundido e em seguida, é adicionado à massa fundida 29,32 g de nicotinamida. Aquece-se tudo durante 2,5 h a 110°C. Por meio de um condensador de refluxo são adicionados 500 ml de uma mistura 3:2 (v/v) de etanol/água e procede-se a aquecimento ao ponto de ebulição sob refluxo até que uma solução seja formada. Após agitação durante a noite à temperatura ambiente, e a adição de 150 ml de 50% etanol/água e 100 ml de água, faz-se a transferência para uma ampola de decantação e lava-se por três vezes com 500 ml de clorofórmio. A fase aquosa separada é misturada com 300 ml e 50 g de carvão activado, agitada durante 1 h à temperatura ambiente e em seguida filtrada através de um filtro de profundidade Seitz K 700. O filtrado é concentrado num evaporador rotativo, sob vácuo para cerca de 100 ml, sendo que a temperatura do banho não deve subir acima de 20°C durante esse processo. Dilui-se então no final com 300 ml de água e com agitação à temperatura ambiente, é adicionado 70 g de tetrafluoroborato de sódio. O precipitado é recristalizado a partir de metanol/água. O produto cristalizado é filtrado com um pouco de acetona e em seguida lavado com éter dietílico e seco durante 24 horas, sob vácuo intenso a 40°C. Rendimento: 21,1 g, 23%. As fracções são controladas com TLC: controlados (Merck sílica gel 60 F-254 de butanol/ácido acético glacial/água 5:2:3, Rf=0,56).
VII. (-)-(lR, 2R,3S,4R)-4-(3-carboxamidopiridin-l-il)-2,3-di-hidroxi-1-(hidroximetil)-ciclopentano (6) = carba mononucleósido de nicotinamida = carbaNMN 21 ΕΡ 1 907 408/ΡΤ
Com agitação, à temperatura ambiente a uma solução de 4,5 g (31 mmol) de ciclopentilamina 5 em 110 ml de metanol abs. é adicionada gota a gota num espaço de tempo de 9 0 minutos, uma solução de 15,3 g (40,7 mmol) do sal de Zincke 6 em 110 ml de metanol abs. É então adicionado 1 ml de diisopropiletilamina e depois deixado com agitação durante dois dias à temperatura ambiente. São depois adicionados 500 ml de água, e é tudo transferido para uma ampola de decantação, sendo lavada por duas vezes com 200 ml de cloreto de metileno. A partir da fase aquosa separada, a água é removida por destilação num evaporador rotativo, sob vácuo. 0 residuo é recolhido em 100 ml de água e purificado por cromatografia em coluna Sephadex C25 (forma Na+) : coluna 70x7,5 centímetros de eluição a partir de solução tampão A (água desionizada) para a solução tampão B) 0,35M de NaCl em água com fluxo de 200 ml/h. São recolhidas fracções de 15 ml e monitorizada por TLC (sílica gel Merck 60 F-254: butanol/ácido acético glacial/água 5:2:3, Rf 0,22). O solvente é removido por destilação em evaporador rotativo sob vácuo a partir das fracções do produto combinadas. O resíduo contendo sal é adicionado a 500 ml de etanol quente e fervido. Procede-se a filtração a quente e deixa-se repousar durante 12 h à temperatura ambiente. O precipitado é então separado por filtração e o solvente assim separado é destilado sob vácuo num evaporador rotativo. Rendimento: 7 g.
VIII. (-)-(lR,2R,3S,4R)-4-(3-carboxamidopiridin-l-il)-2,3-di-hidroxi-l-fosfatoílmetil)ciclopentano (6) = monofosfato de carba-NMN A uma suspensão de 7 g (27,7 mmol) de carba NMN em 80 ml de éster trimetílico de ácido fosfórico seco, é adicionado a 0°C uma mistura de 20 ml de oxicloreto de fósforo e 50 ml de éster trimetílico do ácido fosfórico. Procede-se em seguida a agitação durante 2 horas a 0°C e depois outras 2 h à temperatura ambiente. Sob arrefecimento a gelo, são adicionados 300 ml de água e a mistura é então concentrada num evaporador rotativo, sob vácuo até 10 ml. É recolhida em 100 ml de água, filtrada e purificada por meio de cromatografia de coluna sobre Sephadex C25 (forma NEt3H+) : 22 ΕΡ 1 907 408/ΡΤ coluna 66x9cm eluição de solução tampão A (água desionizada) em solução tampão B) 0,60M de acetato de amónio, fluxo de 200 ml/h. São recolhidas fracções de 15 ml e monitorizada por TLC (sílica gel Merck 60 placas F-254: ácido isobutírico/amoníaco/água 66:1:33, Rf 0,25). O solvente removido das fracções combinadas contendo o produto é então destilado em evaporador rotativo, sob vácuo. O resíduo é depois dissolvido em 100 ml de água e liofilizado. Este procedimento é repetido três vezes. Rendimento: 4,0 g. IX. carbaNAD (9) À temperatura ambiente e no espaço de tempo de 1 h, uma solução de 1,25 g (30 mmol) de AMP morfolidato em 40 ml de DMF absoluto, é adicionada gota a gota a uma mistura de uma solução de 3,31 g (10 mmol) monofosfato de carbaNMN em 40 ml de DMF absoluto e 78 ml (39 mmol) 3,5% tetrazole em acetonitrilo absoluto. A mistura é agitada durante 2 dias à temperatura ambiente.
Sob arrefecimento com gelo seco/acetona é adicionada uma solução aquosa de KHCO3 a 10% a fim de ajustar o valor de pH para 6,5. Procede-se a diluição com 500 ml de água e depois cuidadosamente à concentração sob vácuo num evaporador rotativo até à secagem. O resíduo é depois dissolvido em 150 ml de água desionizada e purificado por cromatografia em coluna Sephadex QAE 25 (forma NEt3H+) : Coluna: 65x4,5 cm. A eluição a partir de solução tampão A (água desionizada) para a solução tampão B 1M de carbonato de trietilamónio, fluxo de 200 ml/h: fracções de 15 ml são recolhidas e monitorizadas por TLC (gel de sílica Merck 60 placas F-254: ácido isobutirico/amoniaco/água 66:1:33, Rf 0,47). O solvente removido a partir das fracções do produto combinadas é destilado num evaporador rotativo, sob vácuo. O resíduo é depois dissolvido em 100 ml de água e liofilizado. Este procedimento é repetido três vezes. Rendimento: 1,1 g
Estudo de estabilidade de carbaNAD
Uma solução de 10 mM de carbaNAD ou NAD é carregada e exposta com uma solução tampão de fosfato de potássio 0,1M 23 ΕΡ 1 907 408/ΡΤ até ρΗ 8. Ο teor é determinado após 0,25, 75 e 175 horas, por meio de cromatografia HPLC.
Solução tampão A: 100 mM KHP04 + 10 mM Bissulfato de tetrabutilamónio, pH 6,9
Solução tampão B: solução tampão A + acetonitrilo 1:1
Fluxo de 1,0 ml/min Detecção 254 nm RP18 coluna L 125 de diâmetro 4,6 milímetros
Gradiente: reter solução tampão B, 40 min a 35%, durante 2 minutos em seguida, dentro de 3 min levar a solução tampão A a 0 %.
Nas Figuras 2 e 3 são apresentadas as percentagens de área de HPLC, após carga/exposição, em diferentes momentos.
Com base na ocorrência de produtos de decomposição (nicotinamida, ADP-ribose, AMP, ADP, e os produtos de decomposição desconhecidos para NAD, bem como os produtos de decomposição desconhecidos Y1 e Y2 para cNAD) demonstra-se que cNAD é muito estável quando comparado com NAD.
B) Preparação de pirrolidinil-NAD I. Síntese pNAD, Io Passo (Composto 10)
(10) 0 trans-N-t-BOC-O-mesil-4-hidroxi-L-prolinol (35,4 g, 120 mmol) é inicialmente dissolvido em 500 ml de DMF, é então adicionada azida de sódio (15,6 g, 240 mmol) dissolvida em 75 ml de água e procede-se a aquecimento a 70°C durante 5 h. A mistura é então agitada durante a noite a temperatura ambiente, e depois vertida sobre em 1000 ml de solução salina 24 ΕΡ 1 907 408/ΡΤ saturada, procedendo-se então à extracção com acetato de etilo. O acetato de etilo é depois seco com Na2S04 e em seguida evaporado. São obtidas 32,8 g (> 100%) de resíduo (valor teórico: 29 g) . O produto em bruto é processado e directamente monitorizado por TLC e MS. A fim de se proceder a controlo a cromatografia em camada fina é realizada em uma placa KG 60 F254: (eluente: acetato de etilo/pulverizado com ninidrina): trans-N-t-BOC-O-mesil-4-hidroxi-L-prolinol RF. 0,49 Produto RF. 0,78 MS ESI ES+ 242 A identidade do produto é ainda confirmada por análise de RMN. * trans-N-t-BOC-O-mesil-4-hidroxi-L-prolinol está disponível comercialmente a partir de Sanochemia, Pharmazeutika AG, Kat.-Nr. P -719. II. Síntese pNAD, 2o Passo (Composto 11)
(10) (11)
N O composto 10 (120 mmol) em 500 ml de metanol é misturado com 2,0 g de carvão de Pd (10%) e a mistura hidrogenada a 30 mbar durante 12 h. O balão onde se processa a reacção é então purgado e lavado diversas vezes com H2, o catalisador é filtrado com aspiração em vácuo e evaporado.
Resulta um óleo incolor (deve ser ainda processado imediatamente, devido à elevada sensibilidade com o ar). 25 ΕΡ 1 907 408/ΡΤ MS ESI ES+ 217 disponível TLC (iso-hexano/acetato de etilo 1/1 / KG 254 F/ ninidrina): O produto permanece no início A identidade do produto foi ainda confirmada por análise de RMN. III. Síntese pNAD, 3o Passo (Composto 12)
120 mmol do composto 11 (PM: 216,28) são dissolvidos em 500 ml de dioxano com NaHCCh (11,0 g, 130 mmol) e cloreto de Fmoc (33,8 g, 130 mmol), deixando-se a mistura sob agitação durante a noite à temperatura ambiente. Os sais resultantes são removidos por filtração, a solução é evaporada e o resíduo purificado numa coluna de gel de sílica (iso-hexano e iso-hexano/EE 8/2 - 1/1). A fracção principal origina 39,0 g = 74,1% *(valor teórico = 52,6 g) . TLC (KG 60 F254 eluente iso-hexano/ acetato de etilo 2:1): RF 0,13 MS ESI ES + 439/ + 339 A identidade do produto é ainda confirmada por análise de RMN. * Rendimento baseia-se no material de partida do Io passo IV. Síntese pNAD, 4o Passo (Composto 13) 26 ΕΡ 1 907 408/ΡΤ
Ν y
Ν . y ο ο Λ
ο
(13) (12) Ο composto 12, obtido a partir do 3o Passo (7,08 g, 16,1 mmol) é dissolvido em 80 ml de fosfato de trimetilo e em seguida tudo é arrefecido num banho de gelo a 0°C. Mistura-se POCI3 com fosfato de trimetilo (13 ml de POCI3 obtido em destilação recente, em 13 ml de fosfato de trimetilo) , sendo este depois passado através de um funil de adição por gotejamento e adicionado em pequenas porções à mistura sob atmosfera de árgon, durante 20 minutos. A temperatura aumenta então devido à reacção exotérmica que se produz, até 5°C. Subsequentemente são adicionadas 2,6 ml de piridina e tudo é agitado durante 40 min a 0°C sob atmosfera de árgon. A solução reaccional é adicionada cuidadosamente gota a gota em 800 ml de solução 1 M de bicarbonato de trietilamónio (pH = 8) arrefecida a baixa temperatura com gelo. Após a adição ser completada, a agitação continua ainda durante 1 h. A solução ligeiramente turva é então adicionada gota a gota a 1 L de uma solução saturada de NaCl (de forma rápida) . Para se obter uma melhor cristalização procede-se a agitação durante a noite. O precipitado obtido é então separado por meio de filtração. O resíduo é depois dessalinizado numa coluna Diaion. Para este fim, 500 g de Diaion são colocados em isopropanol/água 1/1, deixando-se dilatar durante a noite. Com o Diaion preenche-se então a coluna e lava-se com água. O resíduo é então mantido em suspensão/pasta em 100 ml de água, pH 3,5 (ácido acético), em seguida é aplicado a uma coluna e lavado com água (pH 3,5) pelo tempo necessário até ficar isento de sal. Em seguida, a substância a partir da coluna é eluída com 25% de isopropanol (pH 3,5) . A solução é então 27 ΕΡ 1 907 408/ΡΤ processada por evaporaçao à temperatura ambiente e em condições de vácuo elevado.
Resíduo = 2,6 g = 31,3 % TLC RP8 F254/ MeOH/água 9/1 MS ESI ES - 517,13 A identidade do produto é confirmada por análise de RMN. V. Síntese pNAD, 5o Passo (Composto 14)
(13) (14)
Uma mistura do composto 13 obtida a partir do 4o Passo (4,10 g, 7,9 mmol) em 250 ml de metanol e 83 ml de 25% de amoníaco coloca-se em agitação durante a noite à temperatura ambiente e levada à evaporação à temperatura ambiente em condições de vácuo. O resíduo é recolhido em 200 ml de água e agitado com 3x100 ml de acetato de etilo. Partes insolúveis são filtradas, a fase clara aquosa é separada e evaporada de novo à temperatura ambiente.
Resíduo = 2,56 g = 100% MS ESI ES - 295
Para retirar os catiões NH3, o resíduo é dissolvido em 2xbase de Hunig (N,N-diisopropiletilamina) e em cada caso, novamente processado por evaporação em condições de vácuo elevado. 28 ΕΡ 1 907 408/ΡΤ VI. Síntese pNAD, 6o Passo (Composto 15) 0 F'
N O I (14) (15)
Sal de Zincke (2,66 g, 8,99 mmol) é dissolvido em 50 ml de metanol e colocado sob agitação ao gual é adicionado então gota a gota a solução do composto 14 obtido a partir do 5o Passo (2,56 g, 8,31 mmol) dissolvida em 50 ml de metanol. A mistura passa a uma coloração avermelhada e de forma gradual entra em solução. A mistura é assim deixada em agitação durante a noite à temperatura ambiente e o precipitado formado é separado por filtração. O filtrado é então evaporado sob vácuo, recolhido em 100 ml de água e extraído com acetato de etilo por três vezes. A fase de acetato de etilo contém o subproduto de dinitroanilina, a fase aquosa contem o produto e sal Zincke residual. A fase aquosa é evaporada no vácuo à temperatura ambiente e o resíduo resultante com 10 ml de água adicionada é sujeito por 10 minutos a uma agitação com agitador magnético sendo os componentes insolúveis removidos por filtração. 0 produto permanece então dissolvido. Esta solução é então adicionada a uma coluna Diaion HP20 lavada com água (1000 ml) e lavado com água por 2x1000 ml. Em seguida, lava-se com água/isopropanol a 5% e fracções positivas (detectadas por TLC RP8 MeOH/ W 9/1) são sujeitas a evaporação à temperatura ambiente. O resíduo é então triturado com isopropanol e filtrado por sucção, em condições de vácuo, com o auxilio de éter etílico.
Resíduo = 1,60 g = 47,9 % TLC RP8 254 MeOH/W 9/1 MS ES - 400,1 / ES + 402,0 - apresenta também massa dupla A identidade do produto é confirmada por análise de RMN. 29 ΕΡ 1 907 408/ΡΤ
Vila. Síntese pNAD, 7a° Passo (Composto 16)
Uma mistura de ácido AMP (ácido livre monofosfato de adenosina) (10 g, 27,5 mmol) em 60 ml de metanol (seco sobre sodio) e 5,3 ml (60 mmol) de morfolina (recentemente destilado) é agitada até que uma solução límpida seja formada. Em seguida adiciona-se 17 g (82,5 mmol) de N,N' -diciclo-hexilcarbodiimida (DCC) e agita-se durante a noite à temperatura ambiente em condições de exclusão de humidade. O precipitado resultante (DCH) é removido por filtração em condições de vácuo e o filtrado é concentrado por evaporação rotativa a 30°C. Em seguida, é colocado sob agitação com 150 ml H2O/150 ml de éter dietílico e de novo filtrado. Após a separação das fases, a fase aquosa é ainda extraída por duas vezes com 75 ml de éter dietílico. A fase aquosa é então concentrada por evaporaçao rotativa a temperatura ambiente. O resíduo é então dissolvido por duas vezes em piridina e em cada uma delas de novo concentrado por evaporação rotativa sob condições de forte vacuo. VII. Síntese pNAD 1° Passo (Composto 17)
30 ΕΡ 1 907 408/ΡΤ
Uma mistura de morfolidato de AMP (composto 16 obtido a partir do 7o Passo) (2,53 g, 3,61 mmol), composto 15 obtido a partir do 6o Passo (1,60 g, 3,98 mmol), solução de MnCl2 em formamida 0,2 M* (27,1 ml, 5,42 mmol) e MgS04 anidro (0,87 g, 7,95 mmol) é agitada durante a noite à temperatura ambiente e após esse tempo, determinado por meio de TLC (RP8 MeOH/W 9/1), como se verifica em grande medida a conversão. A mistura reaccional é então precipitada com acetonitrilo e filtrada em condições de vácuo.
Resíduo = 5,3 g (teoricamente 2,64g)** MS, ESI ES - 729,3 = Produto, ES -415 = catião morfolidato de AMP, ES -400,2/ ES +402,1 resíduos de composto de 15 (6o
Passo) TLC RP 8 F254 RF 0,085 * Para preparar esta solução 2516 mg de MnCl2 anidro é dissolvida com agitação em 100 ml de formamida 99,99% e em seguida colocado em peneiros moleculares de 4A. ** O resíduo é ulteriormente processado como um produto em bruto. VIII. Síntese pNAD 8o Passo (Composto 18, pirrolidinilo NAD)
m (18) 500 mg do composto 17 obtido a partir do 7o Passo (produto em bruto, contendo cerca de 50% de sal) com 5,0 ml de ácido trifluoroacético (TFA) são colocados sob agitação à temperatura ambiente durante lhe por fim concentrados por evaporação. Como resíduo obtém-se cerca de 500 mg de um óleo incolor. MS ESI ES - 729,24 (necessária adição de NH3) A purificação é levada a cabo em duas porções de 200 mg e 300 mg, em cada um dos casos, com duas etapas de separação: 31 ΕΡ 1 907 408/ΡΤ 1° Etapa de separaçao:
Fractogel EMD S03-s coluna: D(interno) = 14 mm L (empacotamento) = 85 milímetros I. Condicionamento (fluxo de 5 ml/ min) a) 100 ml de H20 b) 200 ml de 0,25M de H2S04 c) 100 ml de H20 d) 200 ml de solução 1M de amoníaco e) 100 ml de H20 II. Separação a) 200 mg de substância dissolvidos em 5 ml de H20 b) eluída com gradiente de H20 solução 0,2M de NH4HCO3. (Eluente A = 250 ml de H20 em um balão de Erlenmeyer e agitada com um agitador magnético e bombeado para a coluna com 5 ml/ min Eluente B = solução 0,2 M NH4HCO3 Bombeado para A com 2,5 ml/ min.) III. Fraccionamento: a) Fracções de 3 ml cada b) 1. Pico relativo a impurezas c) 2. Pico após fluxo de cerca de 70 ml de substância IV. Recondicionamento: 2o Etapa de separação: a) 100 ml de solução 1 M de amoníaco. b) 100 ml de H20.
Diaion HP20, Coluna D(interno) = 30 mm L (empacotamento) 130 milímetros
Eluída com 100 ml de H2O e 100 ml de H20/5% de isopropanol Substância vem já com a fase aquosa, na parte relativa ao isopropanol unicamente ainda impurezas. 32 ΕΡ 1 907 408/ΡΤ
De acordo com análise HPLC as três fracções obtidas apresentam: F1 = 13,5 mg F2 = 5,5 mg F3 = 11,5 mg
Total = 30,5 mg = 12,2% A identidade de pirrolidinilo de NAD (Composto 18) é confirmada por estudos de RMN.
Ensaio de glucose desidrogenase para pNAD A fim de investigar o papel do pNAD como um co-factor para a glucose desidrogenase (GlucDH) , é levado a cabo um ensaio de actividade GlucoseDH em solução tampão Tris 0,1M/ NaCl 0,2 M (pH 8,5) . A concentração de glucose é de 80 mM. São usadas concentrações de pNAD ou de NAD de 0,05-0,5 mM. São usados aqui 10 (pNAD) ou 0,002 mg/ml (NAD) [83 ou 0,017 ym] GlucDH. 0 ensaio é conduzido à temperatura ambiente, no qual a reacção enzimática é monitorizada em intervalos de tempo regulares por meio dos espectros de absorção registados. Os valores indicados na Tabela 1 referem-se a uma medição de absorção, após 4 minutos.
Tabela 1 (p)NAD (mM) U/ml % Actividade [GlucDH] usado 0,05 NAD 539 100 0,002 mg/ml 0,4 NAD 1556 100 0,002 mg/ml 0,05 pNAD 0,00017 0,00003 10 μΐ 10 mg/ml 0,4 pNAD 0,0024 0,00015 10 μΐ 10 mg/ml
Espectros de absorçao da pNAD e pNADH
Os espectros de absorção de NAD e pNAD ou NADH e pNADH são apresentados nas Figuras 6A e 6B. NAD e pNAD apresentam um valor máximo de absorção a 260 nm. O pNADH, ou seja pNAD após ensaio de actividade com GlucDH, mostra quando comparado com NADH um desvio para o vermelho do valor de máximo de absorção de aproximadamente 10 nm (Figura 6B). 33 ΕΡ 1 907 408/ΡΤ
Nas figuras 7 e 8 são apresentados os espectros de fluorescência de NADH e pNADH como complexo GlucDH. Os espectros são feitos, cada um deles depois de ensaios de actividade com GlucDH. A Figura 7 mostra os espectros de emissão de NADH/complexos de pNADH-GlucDH com comprimentos de onda de excitação de 340 ou 370 nm. Os espectros de emissão de NADH e pNADH a comprimentos de onda de excitação de 370 nm são semelhantes. A Figura 8 mostra um espectro de excitação para um NADH/complexo pNADH-Gluc-DH a um comprimento de onda de emissão de 460 nm. O pNADH mostra um espectro de excitação mais amplo do espectro do NADH. Novamente, os espectros são feitos após ensaios de actividade com GlucDH.
Estudos de estabilidade de pNAD
Para se investigar a estabilidade do pNAD em comparação com NAD, são colocadas as mesmas quantidades de NAD e pNAD, em cada caso com 0,15 M de KP04 em soluções tampão de NaCl 1M (pH 7,0) e incubadas a 50°C. A degradação do NAD ou pNAD é monitorada por HPLC. A Figura 9 mostra os niveis de área percentual do (p)NAD em comparação com os niveis de (p)NAD relativos ao tempo zero. A figura mostra que a pNAD é muito mais estável que a NAD. C) Preparação de ciclofosfato de carbaNAD (19)
A 0,74 ml de uma solução de 0,2M de cloreto de manganês em formamida absoluta, são adicionados 79 mg (0,1 mmol) 05' -(hidroxi-morfolino-fosforil)-02' ,03' -hidroxi-fosforil-adenosina, di-hidrato de sal de ciclohexilamina de ácido N-ciclo-hexil-morfolina-4-carbonimidico (seco por co-evaporação com piridina (Morphat et al., J. Am. Chem. Soc.; 83; 1961; 663-675), 44 mg (0,105 mmol) de monofosfato de carba-NMN e por fim 25 mg de sulfato de magnésio seco. A 34 ΕΡ 1 907 408/ΡΤ mistura é agitada durante 3 dias num vaso reaccional selado sob atmosfera de árgon e em seguida com agitação recebe 10 ml de acetonitrilo. O precipitado é removido por filtração, purificado por cromatografia-RP em uma coluna RP 18 Hypersil ODS 250x21,2 milímetros, 5 pm durante 60 minutos com um gradiente de 0% de B a 100% de B. Eluente A: 0,1M de acetato de trietilamónio. Eluente B: mistura 1:4 de 0,1M de acetato de trietilamónio e acetonitrilo; Caudal de fluxo: 10 ml/ min. A eluição é monitorizada por detecção a 260 nm. A fracção principal é recolhido e liofilizada por 5 vezes a fim de remover o acetato de trietilamónio. O sal de trietilamónio é então por meio de Dowex 50 WX2 convertido no ácido livre e em seguida no sal de litio. Rendimento: 10 mg . D) Preparação de carbaNADP (20)
HJN] O
O A uma solução de 2,2 mg de sal de litio de ciclofosfato de carbaNAD (19) em 1 ml de solução tampão de bis-Tris propano (0,02M, pH 7,5) é adicionada durante 6 horas por três vezes quatro unidades de ribonuclease T2 a 37°C. A mistura é mantida durante a noite a 37°C. A enzima é desnaturada por aquecimento a 65°C durante 20 min. Após filtração é conduzida uma purificação através de cromatografia RP com uma coluna RP 18 Hypersil ODS 250x21.2 mm, 5 pm usando um gradiente de 0% de B a 100% de B ao longo de 60 min: Eluente A: 0,1M de acetato de trietilamónio, Eluente B: mistura 1:4 de acetato de trietilamónio 0,1M e acetonitrilo; caudal de fluxo: 10 ml/ min. A eluição é monitorizada por meio de detecção a 260 nm. A fracção principal é recolhida e liofilizado por 5 vezes a fim de remover o acetato de trietilamónio.
Espectro de massa (MALDI Applied Biosystems Voyager System 6327: calculado 742,45, encontrado: 743,17 ) 35
ΕΡ 1 907 40 8/PT
Ε) Ensaio da actividade da glucose desidrogenase para cNAD
Tal como descrito para pNAD em B), é realizado um ensaio de actividade da glucose desidrogenase para cNAD em comparação com NAD. Para tal são usados concentrações de glucose desidrogenase de 0,1 (cNAD) ou 0,002 mg/ml (NAD), [0,83 ou 0,017 pm]. As quantidades utilizadas e os resultados obtidos são apresentados na Tabela 2.
Tabela 2 (c)NAD (mM) U/ml % Actividade [GlucDH] usado 0,05 NAD 430 100 0,002 mg/ml 0,1 NAD 556 100 0,002 mg/ml 0,05 cNAD 2,7 0,63 0,1 mg/ml 0,1 cNAD 5,3 0,95 0,1 mg/ml
F) Espectros de absorção de cNAD e cNADH
Nas Figuras 10A, 10B e 10C apresentam-se espectros de absorção de NAD e cNAD. Em ambos os casos, seja com NAD que com cNAD apresenta-se um ponto de máximo de absorção a 260 nm. A figura 10B mostra o espectro de absorção de NADH e cNADH, onde em cada um dos casos os espectros são feitos depois de ensaio de actividade com glucose desidrogenase. O valor do máximo de absorção de cNADH mostra um desvio para o vermelho de 20 nm. Outros ulteriores espectros de absorção de NADH e cNADH são apresentados na Figura 10C, onde como indicado na legenda, foram escolhidas diferentes condições associadas aos ensaios de actividade de glucose desidrogenase. A Figura 11 mostra também um espectro de fluorescência de NADH e cNADH como complexo GlucDH. Os espectros foram realizados de acordo com os ensaios de actividade de glucose de desidrogenase a um comprimento de onda de excitação de 370 nm. Ambos NADH e cNADH mostram quando tratados com GlucDH um aumento no sinal de fluorescência.
Lisboa, 2014-03-21
Claims (22)
- ΕΡ 1 907 408/ΡΤ 1/6 REIVINDICAÇÕES 1. Elemento de teste para a determinação de glucose compreendendo: (i) uma glucose desidrogenase (E.C. 1.1.1.47) e (ii) como coenzima, um composto com a seguinte fórmula geral (I): Acom A= adenina ou um seu análogo, T= em cada caso e de forma independente O, S, U= em cada caso e de forma independente OH, SH, BH3~, BCNH2~, V= em cada caso, e de forma independente, OH ou um grupo fosfato, em que no caso em que um radical V seja um grupo OH e um segundo radical V seja um grupo fosfato, o grupo OH e o grupo fosfato possam formar um ciclo com os átomos de carbono aos quais eles estejam ligados, W= COOR, CON (R) 2, COR, CSN(R)2, onde R representa em cada caso e de forma independente H ou alquilo-Ci-C2, Xi,X2= em cada caso e de forma independente 0, CH2, CHCH3, C(CH3)2, nh, nch3, Y= NH, S, 0, CH2, Z= um radical compreendendo um grupo ciclico com cinco átomos de carbono, contendo opcionalmente um heteroátomo seleccionado a partir de 0, Se N, bem como opcionalmente um ou mais substituintes e um radical CR42, onde CR42 é ligado ao grupo ciclico e a X2, com R4 = em cada caso e de forma independente, H, F, Cl, CH3, com a condição de que Z e o radical piridina não estejam acoplados por uma ligação glicosidica, ou um sal ou se for o caso uma forma reduzida do mesmo. ΕΡ 1 907 408/ΡΤ 2/6
- 2. Elemento de teste de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por os substituintes de Z serem seleccionados a partir do Grupo F, Cl e alquilo-Ci-C2, opcionalmente fluorado ou clorado e/ou OH substituído, 0-alquilo-Ci-C2.
- 3. Elemento de teste de acordo com a reivindicação 1 ou 2, que compreende como co-enzima um composto com a seguinte fórmula geral (!' ): A(Π com A= adenina ou um seu análogo, T= em cada caso e de forma independente O, S, U= em cada caso e de forma independente OH, SH, BH3~, BCNH2~, V= em cada caso, e de forma independente, OH ou um grupo fosfato, W= COOR, CON(R)2, COR, CSN(R)2, onde R representa em cada caso e de forma independente H ou alquilo-Ci-C2, Xi,X2= em cada caso e de forma independente O, CH2, CHCH3, C(CH3)2, nh, nch3, Y= NH, S, O, CH2, Z= um anel carbocíclico saturado ou insaturado ou anel heterocíclico de cinco membros, com a fórmula geral(II) onde entre R5' e R5" pode estar presente uma ligaçao simples ou dupla, com ΕΡ 1 907 408/ΡΤ 3/6 R4= em cada caso e de forma independente, H, F, Cl, CH3, R5= CR42, se entre R5' e R5" está presente uma ligação simples, R5' = 0, S, NH, NÇ-C2-alquilo, CR42, CHOH, CH0CH3, R5"= CR42, CHOH, CHOCH3, se entre R5' e R5" está presente uma ligação dupla, então R5' =R5"=CR4, R6,R6' = em cada caso e de forma independente, CH, CC& ou um sal ou, se apropriado, uma forma reduzida do mesmo.
- 4. Elemento de teste de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3 com W = C0NH2 ou C0CH3.
- 5. Elemento de teste de acordo com uma das reivindicações 1 a 4, sob a forma de uma tira de teste.
- 6. Composto de fórmula geral (!"):com A= adenina ou um seu análogo, T= em cada caso e de forma independente 0, S, U= em cada caso e de forma independente OH, SH, BH3-, BCNHjT, V= em cada caso, e de forma independente, OH ou um grupo fosfato, em que no caso em que um radical V seja um grupo OH e um segundo radical seja um grupo fosfato, o grupo OH e o grupo fosfato possam formar um ciclo com os átomos de carbono aos quais eles estejam ligados, W= C00R, CON (R) 2, COR, CSN(R)2, onde R represente em cada caso e de forma independente H ou alquilo-Ci-C2, Xi,X2= em cada caso e de forma independente 0 ou NH, Y= NH, S, 0, CH2, ΕΡ 1 907 408/ΡΤ 4/6 Ζ= um anel carbocíclico saturado ou insaturado ou anel heterocíclico de cinco membros, de fórmula geral (II)(II) onde entre R5' e R5" pode estar presente uma ligação simples ou dupla, R4= em cada caso e de forma independente, H, F, Cl, CH3, R5= CR42, se entre R5' e R5" está presente uma ligação simples, R5' = 0, S, NH, N-alquilo-Ç-C2, CR42, CHOH, CH0CH3, R5"= CR42, CHOH, CHOCH3, se entre R5' e R5" está presente uma ligação dupla, então R5' =R5"=CR4, R6,R6' = em cada caso e de forma independente CH, CCH com a condição de que quando sejam R5=CH2, T=0, U= em cada caso OH, V=0H, W=C0NH2, Xi,X2=0 e Y=0, então R5' e R5" não sejam simultaneamente CHOH, ou um sal ou, se apropriado, uma forma reduzida do mesmo.
- 7. Composto de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo facto de pelo menos um radical U ser diferente de OH.
- 8. Composto de acordo com a reivindicação 6 ou 7, caracterizado pelo facto de pelo menos um radical U ser BH3~.
- 9. Composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 8, com W = C0NH2 ou C0CH3.
- 10. Composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 9, em que um radical V é um grupo OH e o segundo radical V é um grupo fosfato.
- 11. Composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 9, em que R5' = CR^ ou CHOH. ΕΡ 1 907 408/PT 5/6
- 12. Composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 9, onde R5' = 0.
- 13. Composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 9, em que R5' = NH ou N-alquilo- -c-c2.
- 14. Composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 9, que é carbaNADP ou um sal ou uma forma reduzida do mesmo.
- 15. Complexo enzima-coenzima que consiste em um composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 14, em combinação com uma enzima adequada.
- 16. Complexo de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo facto de a enzima se tratar de uma desidrogenase, seleccionado a partir de uma desidrogenase de glucose (E.C.1.1.1.47), desidrogenase de lactato (E.C.1.1.1.27, 1.1.1.28), desidrogenase de malato (E.C.1.1.1.37), desidrogenase de glicerol (E.C.1.1.1.6), desidrogenase de álcool (E.C.1.1.1.1), desidrogenase de alfa-hidroxibutirato, desidrogenase de sorbitol, ou desidrogenase de aminoácido seleccionado a partir de desidrogenase de L-aminoácido (E.C.1.4.1.5).
- 17. Utilização de um composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 14 ou de um complexo de acordo com a reivindicação 15 ou 16 para a detecção de um analito numa amostra por meio de uma reacção enzimática.
- 18. Conjunto ou kit de reagentes, que compreende um composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 14, e, opcionalmente, uma enzima adequada ou com um complexo enzima-coenzima de acordo com a reivindicação 15 ou 16, bem como uma solução tampão adequada.
- 19. Reagente de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo facto de a enzima ser uma desidrogenase seleccionada a partir de uma desidrogenase de glucose (E.C.1.1.1.47), desidrogenase de lactato (E.C.1.1.1.27, 1.1.1.28), desidrogenase de malato (E.C.1.1.1.37), desidrogenase de glicerol (E.C.1.1.1.6), desidrogenase de ΕΡ 1 907 408/ΡΤ 6/6 álcool (E.C.1.1.1.1), desidrogenase de alfa-hidroxibutirato, desidrogenase de sorbitol, ou desidrogenase de aminoácido, seleccionado a partir da desidrogenase de L-aminoácido (E.C.1.4.1.5).
- 20. Utilização do elemento de teste de acordo com uma das reivindicações 1 a 5 ou do kit de reagentes de acordo com as reivindicações 18 ou 19 para a determinação de analitos seleccionados a partir de glucose, ácido láctico, ácido málico, glicerol, álcool, colesterol, triglicéridos, ácido ascórbico, cisteina, glutationa, péptidos, ureia, amónia, salicilato, piruvato, 5' -nucleotidase, creatina-quinase (CK), desidrogenase de lactato (LDH) e de dióxido de carbono.
- 21. Método para a detecção de um analito, que compreende as fases de: (a) colocar em contacto uma amostra com um elemento de teste de acordo com uma das reivindicações 1 a 5, ou com um conjunto de reagentes de acordo com as reivindicações 18 ou 19, compreendendo uma co-enzima, e (b) detectar o analito.
- 22. Método de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo facto de o analito ser detectado fotometricamente ou fluorometricamente. Lisboa, 2014-03-21
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE102005035461A DE102005035461A1 (de) | 2005-07-28 | 2005-07-28 | Stabile NAD/NADH-Derivate |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PT1907408E true PT1907408E (pt) | 2014-03-28 |
Family
ID=37137552
Family Applications (3)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PT111674768T PT2364989E (pt) | 2005-07-28 | 2006-07-28 | Derivados nad/nadh estáveis |
| PT67764860T PT1907408E (pt) | 2005-07-28 | 2006-07-28 | Derivados nad/nadh estáveis |
| PT111674719T PT2364988E (pt) | 2005-07-28 | 2006-07-28 | Derivados nad/nadh estáveis |
Family Applications Before (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PT111674768T PT2364989E (pt) | 2005-07-28 | 2006-07-28 | Derivados nad/nadh estáveis |
Family Applications After (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PT111674719T PT2364988E (pt) | 2005-07-28 | 2006-07-28 | Derivados nad/nadh estáveis |
Country Status (16)
| Country | Link |
|---|---|
| US (3) | US8809013B2 (pt) |
| EP (3) | EP1907408B1 (pt) |
| JP (2) | JP5129133B2 (pt) |
| KR (4) | KR101035524B1 (pt) |
| CN (2) | CN101233144B (pt) |
| AU (2) | AU2006274140B8 (pt) |
| BR (1) | BRPI0614217A2 (pt) |
| CA (2) | CA2614792C (pt) |
| DE (1) | DE102005035461A1 (pt) |
| DK (3) | DK1907408T3 (pt) |
| ES (3) | ES2461624T3 (pt) |
| MX (1) | MX2008000946A (pt) |
| PL (3) | PL2364988T3 (pt) |
| PT (3) | PT2364989E (pt) |
| SG (1) | SG187511A1 (pt) |
| WO (1) | WO2007012494A1 (pt) |
Families Citing this family (53)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7553615B2 (en) * | 2005-07-28 | 2009-06-30 | Roche Diagnostics Operations, Inc. | Compounds, methods, complexes, apparatuses and uses relating to stabile forms of NAD/NADH |
| DE102005035461A1 (de) * | 2005-07-28 | 2007-02-15 | Roche Diagnostics Gmbh | Stabile NAD/NADH-Derivate |
| EP2022859A1 (de) * | 2007-08-01 | 2009-02-11 | Roche Diagnostics GmbH | Verfahren und Vorrichtung zur Bestimmung der Konzentration eines Analyten mittels Fluoreszenzmessung |
| CN101497638B (zh) * | 2008-01-30 | 2012-09-26 | 中国科学院大连化学物理研究所 | 一种nad+类似物及其合成和应用 |
| EP2093284A1 (de) * | 2008-02-19 | 2009-08-26 | F.Hoffmann-La Roche Ag | Stabilisierung von Dehydrogenasen mit stabilen Coenzymen |
| EP2398909B1 (de) | 2009-02-19 | 2015-07-22 | F. Hoffmann-La Roche AG | Schnelle reaktionskinetik von enzymen mit niedriger aktivität in trockenen chemieschichten |
| EP2226007A1 (de) | 2009-02-19 | 2010-09-08 | Roche Diagnostics GmbH | Testelementmagazin mit abgedeckten Testfeldern |
| EP2226008A1 (de) | 2009-02-19 | 2010-09-08 | Roche Diagnostics GmbH | Verfahren zur Herstellung eines analytischen Magazins |
| CA2750474C (en) | 2009-02-19 | 2017-07-25 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Fast reaction kinetics of enzymes having low activity in dry chemistry layers |
| CN102325496B (zh) * | 2009-02-19 | 2015-10-07 | 霍夫曼-拉罗奇有限公司 | 分析辅助工具的节省空间的储存 |
| CA2769154C (en) * | 2009-07-27 | 2015-10-27 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Method and substances for preparation of n-substituted pyridinium compounds |
| CN102471272B (zh) | 2009-07-27 | 2014-09-10 | 霍夫曼-拉罗奇有限公司 | 制备n-取代吡啶鎓化合物的方法和物质 |
| CN102471793B (zh) * | 2009-07-27 | 2014-04-30 | 霍夫曼-拉罗奇有限公司 | Carba-nad的酶促合成 |
| EP2287605A1 (de) | 2009-08-20 | 2011-02-23 | Roche Diagnostics GmbH | Vereinfachte Magazinierung integrierter Systeme |
| EP2292751A1 (de) | 2009-08-20 | 2011-03-09 | Roche Diagnostics GmbH | Stabilisierung von Enzymen mit stabilen Coenzymen |
| EP2333544A1 (de) | 2009-12-11 | 2011-06-15 | F. Hoffmann-La Roche AG | Sterilisierbare Chemie für Testelemente |
| MX2012006706A (es) | 2009-12-16 | 2012-07-03 | Hoffmann La Roche | Deteccion de la descomposicion de las enzimas en un elemento de prueba mediante la liberacion controlada de analito protegido. |
| KR101252351B1 (ko) * | 2010-05-24 | 2013-04-08 | 동국대학교 산학협력단 | 전기효소적 합성 반응을 위한 ｎａｄ(ｐ) 유도체의 전기화학적 환원 방법 |
| CN102453067B (zh) * | 2010-10-29 | 2015-08-05 | 中国科学院大连化学物理研究所 | 一种nad+类似物的制备方法及其应用 |
| EP2668161B1 (en) | 2011-01-26 | 2014-11-26 | Roche Diagniostics GmbH | Method and substances for preparation of n-substituted pyridinium compounds |
| CN104905799B (zh) | 2011-04-12 | 2018-06-08 | 霍夫曼-拉罗奇有限公司 | 分析辅件 |
| US9752990B2 (en) | 2013-09-30 | 2017-09-05 | Honeywell International Inc. | Low-powered system for driving a fuel control mechanism |
| CN102863495A (zh) * | 2011-07-06 | 2013-01-09 | 上海执诚生物科技股份有限公司 | 一种含有nad+或nadh的稳定的组合物 |
| KR101609083B1 (ko) | 2011-09-28 | 2016-04-04 | 에프. 호프만-라 로슈 아게 | 아조 매개체 |
| JP6128808B2 (ja) * | 2011-11-15 | 2017-05-17 | 栄研化学株式会社 | 酵素活性の検出、測定方法およびこれを利用したキット |
| EP2620507A1 (en) | 2012-01-25 | 2013-07-31 | Roche Diagnostics GmbH | Method for the evaluation of the quality of a test element |
| EP2636750A1 (en) | 2012-03-06 | 2013-09-11 | Roche Diagniostics GmbH | Compatible solute ectoine as well as derivatives thereof for enzyme stabilization |
| CA2865678C (en) | 2012-04-19 | 2018-03-13 | Susanne BALDUS | Method and device for determining an analyte concentration in blood |
| US8921061B2 (en) * | 2012-11-02 | 2014-12-30 | Roche Diagnostics Operations, Inc. | Reagent materials and associated test elements |
| US8920628B2 (en) | 2012-11-02 | 2014-12-30 | Roche Diagnostics Operations, Inc. | Systems and methods for multiple analyte analysis |
| CN104854457B (zh) | 2012-12-20 | 2016-09-14 | 霍夫曼-拉罗奇有限公司 | 用于分析体液样本的方法 |
| HUE034313T2 (en) | 2012-12-20 | 2018-02-28 | Hoffmann La Roche | Procedures for evaluating medical measurement curves |
| EP2770064A1 (de) | 2013-02-22 | 2014-08-27 | F. Hoffmann-La Roche AG | Hocheffiziente Herstellung von Blutglucose-Teststreifen |
| EP2781919A1 (en) | 2013-03-19 | 2014-09-24 | Roche Diagniostics GmbH | Method / device for generating a corrected value of an analyte concentration in a sample of a body fluid |
| EP2994536B1 (en) | 2013-05-08 | 2017-06-14 | Roche Diabetes Care GmbH | Stabilization of enzymes by nicotinic acid |
| HK1213296A1 (zh) * | 2013-06-04 | 2016-06-30 | 豪夫迈‧罗氏有限公司 | 用於fret的新化合物及与其相关的方法 |
| EP2811299A1 (en) | 2013-06-07 | 2014-12-10 | Roche Diagniostics GmbH | Test element for detecting at least one analyte in a body fluid |
| WO2015063025A1 (en) | 2013-10-29 | 2015-05-07 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Nano-enzyme containers for test elements |
| EP3074524B1 (en) | 2013-11-27 | 2019-11-06 | Roche Diabetes Care GmbH | Composition comprising up-converting phosphors for detecting an analyte |
| EP2927319A1 (en) | 2014-03-31 | 2015-10-07 | Roche Diagnostics GmbH | High load enzyme immobilization by crosslinking |
| EP3131882B1 (en) | 2014-04-14 | 2020-07-15 | Roche Diagnostics GmbH | Phenazinium mediators |
| WO2016022604A2 (en) * | 2014-08-05 | 2016-02-11 | Becton Dickinson And Company | Methods and compositions for analyzing glucose-6-phosphate dehydrogenase activity in blood samples |
| EP3757096B1 (en) | 2014-08-22 | 2025-03-12 | Roche Diagnostics GmbH | Redoxindicators for a use in cell viability testing |
| BR112017001444B1 (pt) | 2014-08-25 | 2022-08-16 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Método para detectar pelo menos um analito em uma amostra de teste, elemento sensor, dispositivo de teste, sistema de teste, uso do elemento sensor e portador de dados |
| EP3394252B1 (en) | 2015-12-21 | 2020-04-29 | F. Hoffmann-La Roche AG | Mutant 3-hydroxybutyrate dehydrogenase from alcaligenes faecalis as well as methods and uses involving the same |
| ES2782199T3 (es) | 2016-02-09 | 2020-09-11 | Hoffmann La Roche | 3-Hidroxibutirato deshidrogenasa mutante de Rhodobacter sphaeroides, así como procedimientos y usos que implican la misma |
| KR102372113B1 (ko) | 2016-10-05 | 2022-03-07 | 에프. 호프만-라 로슈 아게 | 다중 분석물 진단 테스트 엘리먼트들을 위한 검출 시약들 및 전극 배열들, 그리고 그것을 사용하는 방법들 |
| EP3339431A1 (en) | 2016-12-22 | 2018-06-27 | Roche Diabetes Care GmbH | Glucose dehydrogenase variants with improved properties |
| CN107966555A (zh) * | 2017-11-23 | 2018-04-27 | 中山市创艺生化工程有限公司 | 一种用于稳定保存nad或其衍生物的存储液 |
| HUE064713T2 (hu) | 2018-02-28 | 2024-04-28 | Hoffmann La Roche | Biokompatibilitási bevonat folyamatos analitméréshez |
| CN111217744A (zh) * | 2018-11-26 | 2020-06-02 | 中国科学院大连化学物理研究所 | 一种d-氨基酸基nad+类似物及其合成和应用 |
| AU2021400588B2 (en) | 2020-12-15 | 2025-04-10 | Abbott Diabetes Care Inc. | Nad(p) depot for nad(p)-dependent enzyme-based sensors |
| WO2025245355A1 (en) | 2024-05-24 | 2025-11-27 | Abbott Diabetes Care Inc. | Dispensed area and drop solid content tunability |
Family Cites Families (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS53107486A (en) * | 1977-02-28 | 1978-09-19 | Wako Pure Chem Ind Ltd | Stabilized nadh aqueous solution |
| JPS61274636A (ja) | 1985-05-30 | 1986-12-04 | 西南自動車工業株式会社 | 活魚水槽 |
| US5801006A (en) | 1997-02-04 | 1998-09-01 | Specialty Assays, Inc. | Use of NADPH and NADH analogs in the measurement of enzyme activities and metabolites |
| JP4260245B2 (ja) * | 1998-06-25 | 2009-04-30 | 株式会社三菱化学ヤトロン | 還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド類の分解を防止する方法及び分解防止用試薬 |
| US6380380B1 (en) | 1999-01-04 | 2002-04-30 | Specialty Assays, Inc. | Use of nicotinamide adenine dinucleotide (NAD) and nicotinamide adenine dinucliotide phosphate (NADP) analogs to measure enzyme activities metabolites and substrates |
| AU2001262702A1 (en) | 2000-06-07 | 2001-12-17 | Asahi Kasei Kabushiki Kaisha | Coenzyme derivatives and enzymes appropriate therefor |
| CN100439513C (zh) | 2002-05-16 | 2008-12-03 | 霍夫曼-拉罗奇有限公司 | 含有非再生酶-辅酶复合体的方法和试剂体系 |
| DE10221845A1 (de) | 2002-05-16 | 2003-11-27 | Roche Diagnostics Gmbh | Verfahren und Reagenzsystem mit nicht-regenerierbarem Enzym-Coenzym-Komplex |
| DE102005035461A1 (de) * | 2005-07-28 | 2007-02-15 | Roche Diagnostics Gmbh | Stabile NAD/NADH-Derivate |
-
2005
- 2005-07-28 DE DE102005035461A patent/DE102005035461A1/de not_active Withdrawn
-
2006
- 2006-07-28 CN CN2006800273591A patent/CN101233144B/zh active Active
- 2006-07-28 PL PL11167471T patent/PL2364988T3/pl unknown
- 2006-07-28 PT PT111674768T patent/PT2364989E/pt unknown
- 2006-07-28 KR KR1020087004422A patent/KR101035524B1/ko not_active Expired - Fee Related
- 2006-07-28 PL PL11167476T patent/PL2364989T3/pl unknown
- 2006-07-28 PT PT67764860T patent/PT1907408E/pt unknown
- 2006-07-28 KR KR20127005354A patent/KR101483829B1/ko not_active Expired - Fee Related
- 2006-07-28 KR KR1020117002057A patent/KR20110028522A/ko not_active Ceased
- 2006-07-28 JP JP2008523257A patent/JP5129133B2/ja active Active
- 2006-07-28 SG SG2013005301A patent/SG187511A1/en unknown
- 2006-07-28 KR KR20137030825A patent/KR101483899B1/ko not_active Expired - Fee Related
- 2006-07-28 CA CA2614792A patent/CA2614792C/en active Active
- 2006-07-28 ES ES11167476.8T patent/ES2461624T3/es active Active
- 2006-07-28 PL PL06776486T patent/PL1907408T3/pl unknown
- 2006-07-28 DK DK06776486.0T patent/DK1907408T3/da active
- 2006-07-28 BR BRPI0614217-6A patent/BRPI0614217A2/pt not_active IP Right Cessation
- 2006-07-28 DK DK11167471.9T patent/DK2364988T3/da active
- 2006-07-28 EP EP06776486.0A patent/EP1907408B1/de active Active
- 2006-07-28 CA CA2737123A patent/CA2737123A1/en active Pending
- 2006-07-28 CN CN201210559220.9A patent/CN103122371B/zh active Active
- 2006-07-28 ES ES06776486.0T patent/ES2461266T3/es active Active
- 2006-07-28 ES ES11167471.9T patent/ES2453150T3/es active Active
- 2006-07-28 EP EP11167471.9A patent/EP2364988B1/de active Active
- 2006-07-28 PT PT111674719T patent/PT2364988E/pt unknown
- 2006-07-28 AU AU2006274140A patent/AU2006274140B8/en not_active Ceased
- 2006-07-28 DK DK11167476.8T patent/DK2364989T3/da active
- 2006-07-28 WO PCT/EP2006/007493 patent/WO2007012494A1/de not_active Ceased
- 2006-07-28 EP EP11167476.8A patent/EP2364989B1/de active Active
- 2006-07-28 MX MX2008000946A patent/MX2008000946A/es active IP Right Grant
-
2008
- 2008-01-25 US US12/020,244 patent/US8809013B2/en active Active
-
2011
- 2011-02-04 AU AU2011200465A patent/AU2011200465B2/en not_active Revoked
-
2012
- 2012-08-03 JP JP2012172878A patent/JP5650695B2/ja active Active
-
2014
- 2014-03-23 US US14/222,645 patent/US9399790B2/en active Active
-
2016
- 2016-07-20 US US15/214,494 patent/US10167497B2/en active Active
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| PT1907408E (pt) | Derivados nad/nadh estáveis | |
| US9139572B2 (en) | Compounds, methods, complexes, apparatuses and uses relating to stabile forms of NAD/NADH | |
| ES2425631T3 (es) | Síntesis enzimática de carba-NAD | |
| AU2012201023B2 (en) | Stable NAD/NADH derivatives | |
| HK1181078A (en) | Stable nad/nadh derivatives | |
| HK1123308B (en) | Stable nad/nadh derivatives |