BRPI0614217A2 - derivados de nadh/nad estáveis - Google Patents
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Abstract
DERIVADOS DE NADH/NAD ESTáVEIS. A presente invenção refere-se a derivados de dinucleotídeo de adenina de nicotinamida (NAD/NADH) e fosfato de dinucleotídeo de adenina de nicotinamida (NADP/NADPH) da fórmula (1), complexos de enzima desses derivados e a seu uso em métodos de detecção bioquímica e a kit de reagentes.
Description
Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "DERIVADOSDE NADH/NAD ESTÁVEIS".
Descrição
A presente invenção refere-se a dinucleotídeo de adenina denicotinamida estável (NAD/NADH) e derivados de fosfato de dinucleotídeode adenina de nicotinamida (NADP/NADPH), complexos de enzima dessesderivados e a seu uso em métodos de detecção bioquímica e a kits de rea-ge nte.
Sistemas de medição analíticos bioquímicos são componentesimportantes de métodos analíticos clinicamente relevantes. Isto principal-mente refere-se à medição de analitos, por exemplo, metabólitos ou substra-tos que são determinados diretamente ou indiretamente com o auxílio deuma enzima. Os analitos são convertidos com o o auxílio de um complexode enzima-coenzima e subseqüentemente são quantificados. Nesse proces-so o analito a ser determinado é posto em contato com uma enzima e umacoenzima adequadas onde a enzima é usualmente usada em quantidadecatalíticas. A coenzima é mudada, por exemplo, oxidada ou reduzida pelareação enzimática. Este processo pode ser detectado eletroquimicamente oufotometricamente ou diretamente ou por meio de um mediador. Uma calibra-ção provê uma correlação direta entre o valor medido e a concentração doanalito a ser determinada.
Coenzimas são moléculas orgânicas que estão covalentementeou não covalentemente ligadas a uma enzima e são mudadas pela conver-são do analito. Exemplos proeminentes de coenzimas são dinucleotídeo deadenina de nicotinamida (NAD) e fosfato de dinucleotídeo de adenina denocitinamida (NADP) a partir dos quais NADH e NADPH são formados porredução respectivamente.
Sistemas de medição conhecidos da técnica anterior são carac-terizados por uma vida de prateleira limitada e por exigências especiais parao ambiente tal como resfriamento ou armazenagem por via seca a fim dealcançar esta vida de armazenagem. Portanto, resultados errôneos causa-dos por armazenagem incorreta, despercebida, imperfeita pode, portanto,ocorrer para certas formas de aplicação, por exemplo, no caso de testes quesão realizados pelos próprios usuários finais tal como automonitoração deglicose. Em particular a remoção de dissecantes devido à remoção da emba-lagem primária por períodos excessivos pode resultar em erros de mediçãoque em alguns sistemas podem ser dificilmente reconhecidos pelo consumidor.
Uma medida conhecida que pode ser usada para aumentar aestabilidade de sistemas de medição bioquímica é o uso de enzimas está-veis, por exemplo, o uso de enzimas oriundas de organismos termofílicos. Étambém possível estabilizar enzimas pela modificação química, por exemplo,reticulação ou por mutagênese. Além do mais, estabilizadores de enzimatais como trealose, polivinilpirrolidona e albumina do soro podem tambémser adicionados ou as enzimas podem ser encerradas em redes de políme-ro, por exemplo, fotopolimerização.
Também foi tentado aperfeiçoar a vida de armazenagem de sis-temas de medição bioquímica por uso de mediadores estáveis. Assim a es-pecificidade de testes é aumentada e interferências durante a reação sãoeliminadas por uso de mediadores tendo o mais baixo potencial redox possí-vel. No entanto, os potenciais redox dos complexos de enzima/coenzimaconstituem um limite inferior para o potencial redox. Se cair-se abaixo destelimite, esta reação com os mediadores é diminuída ou ainda evitada.
Alternativamente é também possível usar sistemas de mediçãobioquímica sem mediadores em que, por exemplo, coenzimas tal como acoenzima NADH são diretamente detectadas. No entanto, uma desvantagemde tais sistemas de medição é que as coenzimas tais como NAD e NADPsão instáveis.
NAD e NADP são moléculas de base instáveis cujas trajetóriasde degradação são descritas na literatura (N. J. Oppenheimer in The Pyridi-ne Nucleotide Coenzymes Academic Press, New York, London 1982, J. Eve-rese, B. Anderson, K. You, Editores, capítulo 3, pp. 56-65). EssencialmenteADP-ribose é formado durante a degradação de NAD ou NADP por clivagemdas ligações de glicosila entre a ribose e a unidade de piridina. As formasreduzidas de NADH e NADPH são, no entanto, ácido instável: por exemplo,epimerização é uma trajetória de degradação conhecida. Em ambos os ca-sos a instabilidade de NAD/NADP e NADH/NADPH é devido à instabilidadeda ligação de glicosila entre a ribose e a unidade de piridina. Mas mesmosob condições que não são drásticas tal como solução aquosa, as coenzi-mas NAD e NADP já são hidrolisadas unicamente pela umidade ambiente. Ainstabilidade pode resultar em imprecisões quando da medição de analitos.
Numerosos derivados de NAD/NADP são descritos, por exem-plo, em B.M. Anderson in the Piridina Nucleotide Coenzymes, AcademicPress New York, London 1982, J. Everese, B. Anderson, K. Vou, Editors,Capítulo 4. No entanto, a maioria desses derivados não são bem-aceitos porenzima. O único derivado que, portanto, foi anteriormente usado para testede diagnóstico é dinucleotídeo de adenina de 3-acetilpiridina (acetil NAD)que foi primeiramente descrito em 1956 (N.O. Kaplan, J. Biol. Chem. (1956)221, 823). Esta coenzima também não é bem aceita por enzimas e exibeuma mudança no potencial de redox.
O uso de outros derivados de NAD com um grupo de piridina modificada édescrito na WO 01/94370. No entanto, modificações do grupo nicotinamidausualmente têm efeito na reação catalítica. Na maioria dos casos este efeitoé negativo.
Em um outro conceito de estabilização a unidade de ribose foimodificada a fim de influenciar a estabilidade da ligação de glicosila. Esseprocesso não diretetamente interfere com a reação catalítica do grupo nico-tinamida. No entanto, pode haver um efeito indireto assim que a enzima seliga fortemente e especialmente à unidade de ribose. Nesta ligação Kauf-mann e outros descrevem numerosos derivados de tioribose-NAD na WO98/33936 e a patente U.S. nQ 5.801.006 e/ou WO 01/49247. No entanto, umacorrelação entre a modificação da unidade de ribose de nicotinamida e aatividade dos derivados em reações enzimáticas foi anteriormente demons-trada.
CarbaNAD, um derivado sem uma ligação de glicosila foi descri-to pela primeira vez em 1988 (J.T. Slama1 Biochemistry 1989,27, 183 andBiochemistry 1989, 28, 7866). Neste derivado a ribose está substituída poruma unidade de açúcar carbaxílica. Embora carbaNAD fosse descrito comoum substrato para desidrogenases, sua atividade já foi provada em métodosde detecção bioquímica.
Uma abordagem similar foi descrita mais tarde por G.M. Black-burn, Chem. Comm., 1996, 2765 a fim de sintetizar carbaNAD com uma li-gação de bisfosfonato de metileno ao invés do pirofosfato natural. O bisfos-fonato de metileno mostra estabilidade mais alta em relação a fosfatases efoi usado como um inibidor para ciclase de ribosila de ADP. O objetivo nãoera para torná-lo mais resistente a hidrólise (J.T. Slama, G.M. Blackburn).
Portanto, o objetivo da presente invenção é prover sistemas demedição bioanalíticos estáveis especialmente para a determinação de glico-se que evitam a sensibilidade a hidrólise de NAD/NADP e ao mesmo temposão ativos como coenzimas em reações de enzima.
Este objetivo é alcançado por um elemento de teste para a de-terminação de um analito compreendendo (i) lima enzima dependente decoenzima ou um substrato para tal enzima e (ii) um composto da seguintefórmula geral (I) como a coenzima:
<formula>formula see original document page 5</formula>
em que
A = adenina ou um análogo da mesma,
T = em cada caso independentemente significa O, S1
U = em cada caso independentemente significa OH, SH, BH3", BCNH2",V = em cada caso independentemente significa OH ou um grupo fosfato,
W = COOR, CON(R)2, COR, CSN(R)2 em que R em cada caso independen-temente significa H ou Ci-2alquila,
X1, X2 = em cada caso independentemente significam O, CH2, CHCH3lC(CH3)2lNH1NCH3,
Y = NH1 S, O, CH2l
Z = um resíduo compreendendo um grupo cíclico com 5 átomos de carbonoque opcionalmente contém um heteroátomo selecionado de O1 S e N e op-cionalmente um ou mais substituintes, e um resíduo CR42 em que CR42 estáligado ao grupo cíclico e a X2
onde R4 = em cada caso independentemente significa H, F, Cl, CH3,com a condição de que Zeo resíduo de piridínio não estejam ligados poruma ligação glicosídica, ou um sal ou opcionalmente uma forma reduzidados mesmos.
Em uma concretização preferida W = CONH2 ou COCH3.
Substituintes preferidos em Z são selecionados do grupo queconsiste em OH1 F, Cl e CrC2 alquila que estão opcionalmente fluorados ouclorados e/ou OH-substituídos, O-C1-C2 alquila.
Em uma concretização preferida um primeiro resíduo V é OH eum segundo resíduo V é um grupo fosfato. Opcionalmente aquele do grupoOH e aquele grupo fosfato podem formar um anel juntamente com os áto-mos de carbono aos quais eles estão ligados.
Em uma concretização preferida um elemento de teste é providopara determinar glicose que compreende uma desidrogenase glicose e umcomposto da fórmula geral (I) como mencionado acima ou um seu sal.
Surpreendentemente os compostos de acordo com a invençãosão estáveis em relação a hidrólise e são bons substratos em métodos dedetecção enzimática e podem ser usados para diagnósticos bioquímicos.Esta constação está em contraste com aquele da maioria dos derivados deNAD/NADP anteriormente conhecidos uma vez que esses derivados sãousualmente estáveis por apenas períodos muito curtos em métodos de de-tecção enzimática.As vantagem dos compostos de acordo com a invenção compa-radas com a técnica anterior são:
- alta estabilidade,
- alta atividade enzimática,
- síntese simple e econômica,
- eles podem ser usados em todos os métodos de detecção bioquímicos an-teriormente conhecidos.
As desvantagens dos métodos de detecção bioquímica anterior-mente conhecidos podem ser largamente evitados pela provisão de deriva-dos de NAD/NADP estáveis usando-se a presente invenção de preferênciaem combinação com uma formulação de estabilização tal como, por exem-plo, por encerramento de enzimas em redes de polímero. Além do mais, nãoé necessário usar aditivos de estabilização. Isto é particularmente vantajosouma vez que quanto mais baixo o número de substâncias reativas envolvi-das, maior é a chance de se obter uma formulação estável para a determi-nação de analito.
A presente invenção provê elementos de teste compreendendonumerosos derivados de NAD/NADP estáveis que têm uma atividade enzi-mática adequada para o uso como uma coenzima no elemento de teste.
Derivados de NAD/NADP estáveis podem ser produzidos emprocessos de síntese em geral conhecidos. Para esse o grupo amino de umamino álcool cíclico é convertido em um derivado de piridínio por química deZincke. O grupo OH primário é subseqüentemente fosforilado e é acoplado aum derivado de AMP para formar um derivado de NAD. Alternativamente ogrupo OH primário pode também ser primeiramente fosforilado e então ogrupo amino pode ser convertido em uma piridina por meio da reação deZincke.
Uma outra rota sintética é ativar o álcool primário para formar umtosilato ou iodeto e subseqüentemente ADP de alquilato.
Concretizações preferidas do elemento de teste de acordo com ainvenção compreendem, por exemplo, compostos tendo a seguinte fórmulageral (I'):<formula>formula see original document page 8</formula>
em que
A = adenina ou um análogo da mesma,
T = em cada caso independentemente significa O, S,
U = em cada caso independentemente significa OH, SH, BH3", BCNH2",
V = em cada caso independentemente significa OH ou um grupo fosfato,
W = COOR, CON(R)2, COR, CSN(R)2 em que R em cada caso independen-temente significa H ou CrC2 alquila,
Xi, X2 = em cada caso independentemente significam O, CH2, CHCH3,C(CH3)2, NH, NCH3,
Y = NH, S, O, CH2,
Z = um anel de cinco membros heterocíclico ou carbocíclico saturado ou in-saturado, em particular um composto da fórmula geral (II)
em que uma ligação simples ou dupla pode estar presente entre R51 e R5",R4 = em cada caso independentemente significa H, F, Cl, CH3,R5 = CR42,
se uma ligação simples estiver presente entre R5' e R5", entãoR5' = O, S, NH, NCi-C2 alquila, CR42, CHOH, CHOCH3,R5" = CR42, CHOH, CHOCH3,
se uma ligação dupla estiver presente entre R51 e R5", entãoR5' = R5" = CR4,
R6, R61 = em cada caso independentemente significam CH1 CCH3 ou um salou opcionalmente uma forma reduzida dos mesmos.
Compostos da seguinte fórmula geral (I") são um outro objetivoda invenção:
<formula>formula see original document page 9</formula>
em que
A = adenina ou um análogo da mesma,
T = em cada caso independentemente significa O, S,
U = em cada caso independentemente significa OH, SH, BH3", BCNH2",
V = em cada caso independentemente significa OH ou um grupo fosfato,
W = COOR, CON(R)2, COR, CSN(R)2 em que R em cada caso independen-temente significa H ou CrC2 alquila,
X1, X2 = em cada caso independentemente significam O, CH2, CHCH3,C(CH3)2, NH, NCH3,
Y = NH, S, O, CH2,
Z = um anel de 5 membros saturado ou insaturado carbocíclico ou heterocí-clico, em particular compostos da fórmula geral (II)<formula>formula see original document page 10</formula>
em que uma ligação simples ou dupla pode estar presente entre R51 e R5",R4 = em cada caso independentemente significa H, F, Cl, CH3,R5 = CR42,
se uma ligação simples estiver presente entre R5' e R5", entãoR5' = O, S, NH1 NCrC2 alquila, CR42> CHOH, CHOCH3,R5" = CR42> CHOH1 CHOCH3,
se uma ligação dupla estiver presente entre R5' e R5", entãoR5' = R5" = CR4,
R6, R6' = em cada caso independentemente significam CH, CCH3com a condição de que se R5 = CH2, T = O, U = em cada caso significa OH,V = OH, W = CONH2, X = OeY = O então R5' e R5" não são simultanea-mente CHOH, ou um sal ou opcionalmente uma forma reduzida dos mesmos.
Em uma concretização preferida os compostos de acordo com ainvenção contêm análogos de adenina tal como adenina C8-substituída eN6-substituída, variantes de desaza tais como 7-desaza, variantes de azatais como 8-aza ou combinações tais como 7-desaza ou 8-aza ou análogoscarbocíclicos tal como formicina onde as variantes de 7-desaza podem estarsubstituídas na posição 7 com halogênio, C1-C6 alquinila, C1-C6 alquenila ouCrC6 alquila.
Em uma outra concretização preferida os compostos contêmanálogos de adenosina que contêm, por exemplo, 2-metoxidesoxirribose, 2'-fluorodesoxirribose, hexitol, altritol ou análogos policíclicos tais como açúca-res tricíclicos, LNA e bicíclicos, ao invés de ribose.
Em particular oxigênios de (di)fosfato podem também estar isoe-Ietricamente substituídos tais como, por exemplo, O- por S- e/ou por BH3", Opor NH, NCH3 e/ou por CH2 e =O por =S.
Em uma concretização preferida pelo menos um resíduo U docomposto de acordo com a invenção é diferente de OH e particularmente depreferência pelo menos um resíduo U = BH3".
Concretizações especialmente preferidas são os derivados bora-no carbaNAD, c-pentil NAD, pirrolil NAD, furanil NAD1 carbaNADciclofosfato,carbaNADP, pirrolildinil NAD bem como elementos de teste que os contêm:<formula>formula see original document page 12</formula>
pirrolil NAD
<formula>formula see original document page 12</formula>
furanil NAD
<formula>formula see original document page 12</formula>
carbaNAD ciclofosfato<formula>formula see original document page 13</formula>
pirrolidinil NAD
Detecções bioquímicas de analitos, por exemplo, parâmetros emfluidos de corpo tal como sangue, soro, plasma ou urina ou em amostras deágua servida ou alimentos são de principal importância em diagnósticos.Nesses testes o analito a ser determinado é posto em contato com uma en-zima ou uma coenzima adequada.
Portanto, um outro objetivo da presente invenção é um complexode enzima-coenzima que consiste em um composto de acordo com a inven-ção em combinação com uma enzima adequada.
Quaisquer substâncias biológicas ou químicas que podem serdetectadas por uma reação de redox podem ser determinadas como anali-tos, por exemplo, substâncias que são substratos de uma enzima dependen-te de coenzima ou as próprias enzimas dependente de coenzima. Exemplospreferidos de analitos são glicose, ácido láctico, ácido málico, glicerol, álcool,colesterol, triglicerídeos, ácido ascórbico, cisteína, glutationa, peptídeos, u-réia, amônio, salicilato, piruvato, 5'-nucleotidase, cinase de creatina (CK),Iactado desidrogenase (LDH), dióxido de carbono etc.
Para a detecção de substratos de enzima o elemento de teste depreferência contém uma enzima que é adequada para a detecção do subs-trato, além da coenzima. Enzimas adequadas são, por exemplo, desidroge-nase selecionada de glicose desidrogenase (E.C.1.1.1.47), Iactato desidro-genase
(E.C. 1.1.1.27, 1.1.1.28), malato desidrogenase (E.C. 1.1.1.37), glicerol desi-drogenase (E.C. 1.1.1.6), álcool desidrogenase (E.C. 1.1.1.1), alfa-hidroxibutirato desidrogenase, sorbitol desidrogenase ou aminoácido desi-drogenase, por exemplo, L-aminoácido desidrogenase (E.C. 1.4.1.5). Outrasenzimas adequadas são oxidases tal como glicose oxidase (E.C. 1.1.3.4) oucolesterol oxidase (E.C.1.1.3.6) ou aminotransferases tal como aspartato oualanina aminotransferase, 5'-nucleotidase ou cinase de creatina.
Para a detecção de enzimas o elemento de teste de preferênciacontém um substrato de enzima adequado para a detecção da enzima, alémda coenzima.
Um outro objetivo da presente invenção é o uso de um compostode acordo com a invenção ou de um complexo de enzima-coenzima de a-cordo com a invenção para detectar um analito em uma amostra por umareação enzimática. Nesta ligação a detecção de glicose com o auxílio deglicose desidrogenase (GIucDH) é particularmente preferida.
A mudança na coenzima, isto é, no composto de acordo com ainvenção por reação com o analito (se o analito for um substrato de enzima)ou por uma reação catalisada por analito (se o analito for uma enzima) podeem princípio ser detectada de qualquer modo desejado. Basicamente todosos métodos para a detecção das reações enzimáticas que são conhecidosda técnica anterior podem ser usados. No entanto, a mudança na coenzimaé de preferência detectada por método óticos. Métodos de detecção ótica,por exemplo, incluem a medição de absorção, fluorescência, dicroismo circu-lar (CD), dispersão rotativa ótica (ODR), refractometria etc. A mudança nacoenzima é particularmente de preferência detectada por medição da fluo-rescência. Medição de fluorescência é altamente sensível e permite a detec-ção mesmo de baixas concentrações do analito em sistemas miniaturizados.
Um teste líquido pode ser usado para detectar um analito emque o reagente está, por exemplo, presente na forma de uma solução ouuma suspensão em um líquido aquoso ou não aquoso ou está presente co-mo um pó ou liofilizado. É, no entanto, também possível usar um teste seco,caso esse em que o reagente é aplicado a um veículo, uma tira de teste. Oveículo pode, por exemplo, ser uma tira de teste compreendendo um materi-al absorvente e/ou inchável que é umidecido pelo líquido da amostra a serexaminado.
Uma matriz de gel em que um complexo de enzima-coenzima éincorporado pode, no entanto, também ser usado como um reagente de de-tecção (conforme DE 102 218 45 A1).
Neste caso a enzima pode ou ser polimerizada na matriz junta-mente com o composto de acordo com a invenção ou, depois da polimeriza-ção, a matriz pode ser contatada com uma solução da coenzima na presen-ça da enzima para formar o complexo de enzima-coenzima correspondente.
Um outro objetivo da presente invenção refere-se a um kit dereagente e a seu uso para detectar analitos. O kit de reagente pode conterum composto de acordo com a invenção, uma enzima adequada e um tam-pão de reação adequado. Enzimas adequadas já foram descritas. O kit dereagente de acordo com a invenção pode ser usado em uma ampla varieda-de de meios e pode ser usado para determinar analitos tais como glicose,ácido láctico, ácido málico, glicerol, álcool, colesterol, triglicerídeos, ácidoascórbico, cisteína, glutationa, peptídeos, uréia, amônio, salicilato, piruvato,5'-nucleotidase, CK, LDH e dióxido de carbono etc. Um kit de reagente épreferido que contém um composto de acordo com a invenção e glicose de-sidrogenase (E.C.1.1.47) para detectar glicose no sangue.
O kit de reagente de acordo com a invenção pode ser usado pa-ra detectar um analito em um teste seco ou líquido.
Um outro objetivo da presente invenção refere-se a uma tira deteste para a detecção fotométrica ou fluorométrica de um analito. Tal tira deteste contém um composto como afirmado acima como uma coenzima euma enzima adequada ou um substrato de enzima imobilizado sobre ummaterial absorvente e/ou inchável. Materiais adequados podem, por exem-plo, ser selecionados de celulose, plásticos etc.
Um outro objetivo da presente invenção compreende um métodopara a detecção de um analito compreendendo as etapas:
(a) contato de uma amostra com um elemento de teste ou kit de reagente deacordo com a invenção compreendendo uma coenzima e
(b) detecção do analito, por exemplo, com base na mudança na coenzima.
Uma outra vantagem da invenção é que a emissão de fluores-cência das coenzimas exibe um deslocamento batocrômico e, portanto, hábaixa interferência com a emissão de fluorescência de outros materiais doelemento de teste e/ou da amostra.
Todas as concretizações preferidas de um objetivo da presenteinvenção que são mostradas também destinam-se a aplicar a outros objeti-vos da invenção tais como, por exemplo, concretizações preferidas doscompostos de acordo com a invenção.
A invenção deve ser elucidada em mais detalhes pelas seguin-tes figuras e exemplos.
Figuras
Figura 1
Diagrama do processo para a sintetização de carbaNAD (cNAD).
Figura 2
Gráfico dos resultados de esforço de NAD a 8°C e 37°C.
Figura 3
Gráfico dos resultados de esforço de carbaNAD a 8°C e 37°C.
Figura 4
Diagrama do processo para a sintetização de borano NAD poralquilação de ADP, no caso em que de Y = BH3, apenas o beta fosfato deADP foi alquilado.
Figura 5
Diagrama do processo para a sintetização de pirrolidinil NAD(pNAD). Números de composto e rendimentos das etapas de reação respec-tivas são a seguir afirmados para as fórmulas estruturais.Figura 6A/6B
Espectros de absorção de NAD e pNAD (figura 6A) e NADH e/oupNADH (figura 68).
Figura 7
Espectros de fluorescência de NADH e pNADH como um com-plexo de GIucDH (espectros de emissão).
Figura 8
Espectros de fluorescência de NADH e pNADH como um com-plexo de GIucDH (espectros de excitação).
Figura 9
Comparação da estabilidade de NAD e pNAD.
Figura 10A /10B/1OC
Espectros de absorção de NAD e cNAD (figura 10A) e de NADHe/ou cNADH (figuras 10B e 10C).
Figura 11
Espectros de fluorescência de NADH e cNADH como um com-plexo de GlucDH.
Exemplos
Preparação experimental de derivados de NAD/NADH estáveis
A preparação de derivados de NAD/NADH estáveis é mostrada na base decarbaNAD (composto 9, figura 1) e pirrolidina NAD (composto 18, figura 5)como os exemplos. Derivados adicionais podem ser preparados usando-seprocessos de síntese apropriados. Os amino álcoois correspondentes usa-dos como reagentes de partida são conhecidos na literatura:
2-amino-1,4-anidro-2,3-didesóxi-L-treo-pentitol: Huryn, DonnaM.; Sluboski, Barbara C.; Tam, Steve Y.; Todaro, Louis J.; Weigele, ManfredTetrahedron Letters (1989), 30(46), 6259-62.
3-amino-,(1R,3S)-ciclopentanometanol, Beres, J.; Sagi, G.; To-moskozi, I.; Gruber, L.; Gulacsi, E.; atvos, L.; Tetrahedron Letters (1988),29(22), 2681-4.
A) Preparação de carbaNADI. 1 R-(-)-exo-cis-5,6-diidróxi-2-azabiciclo[2.2.1]heptan-3-ona (1)Uma solução de 16,4 g (147 mmols) de 1R-(-)-2-azabiciclo[2.2.1]hept-5-en-3-ona em 400 ml de acetona é adicionada a uma solução de 22,5 g (167mmols) de N-metil-morfolina-N-óxido em 80 ml de água desionizada em umfrasco de fundo redondo de 1 L. 15 ml de (1,2 mmols) de uma solução de2,5% de tetraóxido de ósmio em terc-butanol são adicionados no período de15 min enquanto se resfriando no gelo. A mistura subseqüentemente agitadade um dia para o outro à temperatura ambiente.
O solvente é removido por destilação em um evaporador rotati-vo. É agitado com 100 ml e novamente e separado por destilação em umevaporador rotativo. Posteriormente, é dissolvido em 600 ml de água desio-nizada e 35 g de carvão ativado são adicionados. A mistura é agitada vigo-rosamente por 1 h e então é filtrada sobre um filtro de leito profundo Seitz K250. Água è removida do filtrado por destilação em um evaporador rotativo.
O produto é usado sem outra purificação.
TLC (Merck sílica-gel 60 F-254): acetato de etila/metanol/ácidoacético glacial 7:2: 1 Rf 0,75 (material de partida), 0,53 (1). Manchamentocom TDM/desenvolvimento em uma câmara de cloro.
* Reagente de TDM: Solução 1: 10 g de N.N.Isr.N-tetrametil-M'-diamino-difenil metano em 40 ml de ácido acético glacial e 200 ml de águadesionizada. Solução 2: 20 g de cloreto de potássio em 400 ml de de águadesionizada. Solução 3: Dissolve 0,3 g de ninidrina em 10 ml de ácido acéti-co glacial e adicionam 90 ml de água desionizada.
Reagente acabado: Uma mistura de solução 1 e 2 e adição de 6ml de solução 3.
Il 1 R-(-)-exo-cis-5,6-dimetilmetilenodióxi-2-azabiciclo[2.2.1] hep-tan-3-ona (2)
O produto bruto 1 é fervido sob refluxo por 1 h em 200 ml de e-tanol absoluto. Depois da adição 400 ml de (3,26 moles) dimetoxipropano e250 mg (2,2 mmols) de cloridrato de piridina, a mistura é fervida sob refluxopor uns outros 15 min. Depois da adição de 10 ml dé solução de carbonatode hidrogênio de sódio saturada, a solução é evaporada até a secura sobum vácuo em um evaporador rotativo. 500 ml de Clorofórmio, 150 ml de so-lução de cloreto de sódio saturada e 75 ml de solução de carbonato de hi-drogênio de sódio saturada são adicionados ao resíduo e é transferido paradentro de um funil de separação. Depois da extração por agitação é permiti-do que se repouse de um dia para o outro durante o qual fase de separaçãoocorre.
A fase orgânica é separada e a fase aquosa é extraída por umaoutras duas vezes com 200 ml de clorofórmio em cada caso. As fases orgâ-nicas combinadas são secas sobre sulfato de magnésio. Depois da remoçãodo dissecante por filtração, o solvente é removido por destilação sob pressãoreduzida em um evaporador rotativo. O produto bruto (24,9 g = 92%) é usa-do sem outra purificação.
TLC (Merck sílica-gel 60 F-254): acetato de etila/metanol/ácidoacético glacial 7:2:1 Rf 0,84. Manchamento com TDM/desenvolvimento emuma câmara de cloro).
III. 1 R-(-)-4-N-terç-butiloxicarbonil-exo-cis-5,6-dimetilmetileno-dióxi-2-2-azobiciclo[2.2.1 ]heptan-3-ona (3)
41,5 g (190 mmols) de dicarbonato de di-terc-butila e 0,83 g (6,8mmols) de 4-dimetil-aminopiridina são adicionados sob argônio a uma solu-ção de 24,9 g (135,7 mmols) de produto bruto 2 em 450 ml de clorofórmioabsoluto. A mistura é fervida sob refluxo enquanto se agitando até que aprodução de gás cessasse. A mistura é filtrada sobre uma coluna que é en-chida com 40 g de sílica-gel 60 e é equilibrada com clorofórmio. É lavadacom 100 ml de clorofórmio. O solvente é removido do filtrado por destilaçãosob pressão reduzida em um evaporador rotativo. O produto bruto é secopor 60 min a 1 kpa (10 mbar) e 40°C. É usado sem outra purificação.
TLC (Merck sílica-gel 60 F-254): acetato de etila/hexano 3:2 Rf0,85. Manchamento com TDM/desenvolvimento em uma câmara de cloro).
IV. (-)-(1 R,2R,35,4R)-4-(N-terc-butiloxicarbonil)amino-2,3-dimetil-metilenodióxi-1-(hidroximetil)ciclopentano (4)
O produto bruto 3 é dissolvido à temperatura ambiente em 400ml de tetraidrofurano enquanto se agitando e 80 ml de água desionizada sãoadicionados. Depois do resfriamento para 4°C. 5,3 g de boroidreto de sódiosão adicionados uma vez e são agitados de um dia para o outro durante oqual a mistura é deixada lentamente se aquecer até à temperatura ambiente.100 ml de etanol são adicionados e são agitados por 6 h à temperatura am-biente. Os solventes são removidos por destilação sob pressão reduzida emum evaporador rotativo. 300 ml de solução de cloreto de sódio saturada e650 ml de acetato de etila são adicionados e são transferidos para um funilde separação. A fase orgânica é separada e a fase aquosa é novamentelavada com 350 ml de acetato de etila. As fases orgânicas combinadas sãosecas sobre sulfato de magnésio. Depois da remoção do dissecante por fil-tração, o solvente é removido por destilação sob pressão reduzida em umevaporador rotativo. O produto bruto (42,2 g) é purificado por meio de cro-matografia de coluna e sílica-gel 60 (coluna h = 93 cm, d = 10 cm) eluenteTHF/hexano 1:3, então THF/hexano 2:3), taxa de fluxo 3 l/h. 40 ml de fra-ções são coletados. As frações são monitoradas por TLC (Merck sílica-gel60 F-254: acetato de etila/hexano 3:2 Rf 0,45. Manchamento comTDM/desenvolvimento em uma câmara de cloro). O solvente é removido apartir das frações de produtos combinadas por destilação em um vácuo emum evaporador rotativo, rendimento: 24,9 g.
V. (-)-(1 R,2R,3S,4R)-4-amino-2,3-diidróxi-1-(hidroximetil) ciclo-pentano (5) 8 ml de Água desionizada e então 80 ml de ácido trifluoroacéticosão adicionados a 11,09 (38,6 mmols) 4. São agitados vigorosamente por 6h à temperatura ambiente durante a qual uma solução amarela pálida claraforma. 200 ml de água desionizada são adicionados e são evaporados sobum vácuo em um evaporador rotativo. 200 ml de água desionizada são no-vamente adicionados e são novamente evaporados sob um vácuo em umevaporador rotativo. O produto bruto é dissolvido em 100 ml de água desio-nizada em um banho ultrassônico e é filtrado. O filtrado é aplicado a umacoluna de troca de íons Dowex 1X8 malha 100-200, forma de OH) (15 χ 4,9cm) e é eluído com água durante o qual o produto elui depois de cerca de150 ml em um volume de 300 ml de (pH 10,4). As frações são monitoradaspor TLC (Merck sílica-gel 60 F-254: butanol/ácido acético glacial/água 5:2:3Rf 0,42, manchamento com TDM/desenvolvimento em uma câmara de clo-ro). O solvente é removido a partir das frações de produto combinadas pordestilação em um vácuo em um evaporador rotativo,rendimento: 5,2 g de óleo incolor.
VI. Sal de Zincke da nicotinamida (6)
58,6 g de Dinitroclorobenzeno são fundidos sob nitrogênio e en-tão 29,32 g de nicotinamida são adicionados à massa fundida. É aquecidapor 2,5 h a 1100C. 500 ml de uma mistura de 3:2 (v/v) etanol/água são adi-cionados através de um resfriador de fluxo e são fervidos sob refluxo até quea solução seja formada. Depois da agitação de um dia para o outro à tempe-ratura ambiente, 150 ml de 50% de etanol/água e 100 ml de água são adi-cionados, são transferidos para um funil de separação e são lavados trêsvezes com 500 ml de clorofórmio cada vez. 300 ml e 50 g de carvão ativosão adicionados à fase aquosa separada que é separada por 1 h à tempera-tura ambiente e então é filtrada sobre um filtro de leito profundo Seitz K 700.
O filtrado é concentrado em um vácuo a cerca de 100 ml de em um evapo-rador rotativo durante o qual a temperatura de banho não deve exceder a20°C. Ele é diluído com 300 ml de água e 70 g de tetrafluoroborato de sódioé adicionado à temperatura ambiente enquanto se agitando. O precipitado érecristalizado a partir de metanol/água. O cristalizado é removido por filtra-ção, é lavado com uma quantidade pequena de acetona e então com éter dedietila e é seco por 24 h em um alto vácuo a 40°C (rendimento 21,1 g 23%).As frações são monitoradas por TLC (Merck sílica-gel 60 F-254: buta-nol/ácido acético glacial/água 5:2:3 Rf = 0,56).
VII. (-)-(1 R,2R,3S,4R)-4-(3-carboxamidopiridin-1-il)-2,3-diidróxi-1- (hidroximetil)ciclopentano (6) = carba nicotinamida mononucleosídeo =carbaNMN
Uma solução de 4,5 g (31 mmols) de ciclopentilamina 5 em 110ml de metanol absoluto é adicionada gota a gota no período de 90 minutos auma solução de 15,3 g (40,1 mmols) do sal 6 Zincke em 110 ml de metanolabsoluto enquanto se agitando à temperatura ambiente. 1 ml de diisopropile-tilamina é adicionado e é então agitado por dois dias à temperatura ambien-te. 500 ml de água são adicionados, são transferidos para dentro de um funilde separação e são lavados duas vezes com 200 ml de cloreto de metilenocada vez. A água é removida a partir da fase aquosa separada por destila-ção sob um vácuo em um evaporador rotativo. O resíduo é colocado em 100ml de água e é purificado por cromatografia de coluna em Sephadex C25(forma de Na+): coluna 70 χ 7,5 cm eluição de tampão A (água desionizada)a tampão B NaCI a 0,35 M em água, taxa de fluxo 200 ml/h. 15 ml de fraçõessão coletados e são monitorados por TLC (Merck sílica-gel 60 F-254: buta-nol/ácido acético glacial/água 5:2:3 Rf 0,22).
O solvente é removido a partir das frações de produtos combina-das por destilação em um vácuo em um evaporador rotativo. O resíduo con-tendo sal é fervido com 500 ml de etanol quente. É filtrado quente e é deixa-do repousar por 12 h à temperatura ambiente. O precipitado é removido porfiltração e o solvente é removido a partir do filtrado por destilação sob umvácuo em um evaporador rotativo. Rendimento 7 g.
VIII. (-)-(1 R,2R,35,4R)-4-(3-carboxamidopiridin-1 -il)-2,3-diidróxi-1 -fosfatoilmetil)ciclopentano (6) = carba NMN-monofosfato
Uma mistura de 20 ml de cloreto de fosforóxi e 50 ml de fosfatode trimetila é adicionada a 0°C a uma suspensão de 7 g (27,7 mmols) car-baNMN em 80 ml de fosfato de trimetila anidra. É agitada por 2 h a 0°C eentão por 2 h à temperatura ambiente. 300 mi de água são adicionados en-quanto se resfriando no gelo e a mistura é evaporada para dar 10 ml de sobum vácuo em um evaporador rotativo. É colocada em 100 ml de água, é fil-trada e é purificada por meio de cromatografia de coluna em Sephadex C25(forma de NEt3H+): coluna 66 χ 9 cm, eluição de tampão A (água desioniza-da) a tampão B) acetato de amônio a 0,60 M, taxa de fluxo 200 ml/h. 15 mlde frações são coletados e são monitorados por TLC
(Merck placas de sílica-gel 60 F-254: ácido isobutírico/amônia/água 66:1:33, Rf 0,25). O solvente é removido a partir das frações de produ-tos combinadas por destilação em um vácuo em um evaporador rotativo. Oresíduo é dissolvido em 100 ml de água e é liofilizado. Este procedimento érepetido três vezes. Rendimento 4,0 g.IX. carbaNAD (9).
Uma solução de 1,25 g (30 mmols) de morfolidato de AMP em40 ml de DMF absoluto é adicionada gota a gota no período de 1 h à tempe-ratura ambiente a uma mistura de uma solução de 3,31 g (10 mmols) de car-baNMN monofosfato em 40 ml de DMF absoluto e 78 ml de (39 mmols) te-trazol a 3,5% em acetonitrila absoluto. A mistura é agitada por 2 dias à tem-peratura ambiente.
O pH é ajustado para 6,5 usando-se uma solução aquosa deKHCO3 a 10% enquanto resfriando sobre gelo seco/acetona. É diluída com500 ml de água e cuidadosamente é concentrada até a secura em um vácuoem um evaporador rotativo. O resíduo é dissolvido em 150 ml de água desi-onizada e é purificado por cromatografia de coluna
em Sephadex QAE 25 (forma de NEt3H+): coluna 65 χ 4,5 cm,eluição de tampão A (água desionizada) a tampão B) carbonato de trimeti-lamônio a 1 M, taxa de fluxo 200 ml/h: 15 ml de frações são coletados e sãomonitorados por TLC (Merck placas de sílica-gel 60
F-254: ácido isobutírico/amônia/água 66:1:33, Rf 0,47).O solvente é removido por destilação a partir das frações de pro-dutos combinadas por destilação em um vácuo em um evaporador rotativo.
O resíduo é dissolvido em 100 ml de água e é liofilizado. Este procedimentoé repetido três vezes. Rendimento 1,1 g.
Exame da estabilidade de carbaNAD
Uma solução a 10 mM de carbNAD e/ou NAD é acetuada a pH 8em tampão de fosfato de potássio a 0,1 Μ. O teor é determinado por meio decromatografia de HPLC depois de 0,25, 75 e 175 h.
Tampão A: KHPO4 a 100 mM + sulfato de hidrogênio de tetrabu-tilamônio a 10 mM,pH 6,9
tampão B: tampão A + acetonitrila 1:1taxa de fluxo 1,0 ml/min detecção: 254 nmcoluna de RP18 L 125 diâmetro 4,6 mm
gradiente: em 40 min a 35% de tampão B, manter por 2 min e então mudarem 0% de tampão A no período de 3 min.
As percentagem de área de HPLC depois do esforço pelos vá-rios tempos são mostrados nas figuras 2 e 3.
A ocorrência de produtos de composição (nicotinamida, ADP-ribose, AMP, ADP e os produtos de decomposição desconhecidos para NADe os produtos de decomposição desconhecidos Y1 e Y2 para cNAD) mos-tram que cNAD é muito estável comparada com NAD.8) Preparação de pirrolidinil-NADI. Síntese de primeiro estágio de pNAD (composto 10)
<formula>formula see original document page 24</formula>
Trans-N-t-BOC-O-mesil-4-hidroxil-L-prolinol (35,4 g, 120 mmols)foi dissolvido em 500 ml de DMF e azida de sódio (15,6 g, 240 mmols) é dis-solvida em 75 ml de água foi adicionada e foi aquecida por 5 h a 70°C. Foisubseqüentemente agitada ulteriormente de um dia para o outro à tempera-tura ambiente, a mistura foi despejada para dentro de 1000 ml de solução de15 cloreto de sódio saturada e foi extraída com acetato de etila. O acetato deetila foi seco com Na2SO4 e subseqüentemente foi evaporado.
32,8 g (> 100 %) de resíduo foram formados (valor teórico: 29 g).O produto bruto foi diretamente processado ulteriormente depoisde monitoração de MS e TLC. Uma cromatografia de camada fina em umaplaca KG 60 F-254 (solvente móvel: acetato de etila/borrifada com ninidrina)foi realizada para a monitoração:trans-N-t-BOC-O-mesil-4-hidróxi-L-prolinol Rf: 0,49Rf de produto: 0,78
MS ESI ES+ 242
A identidade do produto foi também confirmada por análise deRMN.
*trans-N-t-BOC-0-mesil-4-hidroxil-L-prolinol está comercialmente disponívelda Sanochemia Pharmazeutika AG, Cato No. P-719.
II. Síntese de segundo estágio de pNAD (composto 11)
<formula>formula see original document page 25</formula>
Composto 10 (120 mmols) foi misturado em 500 ml de metanolcom 2,0 g de Pd-carbono (10%) e é hidrogenado por 12 h a 3 kpa (30mbar). Nesse processo o frasco de reação foi lavado várias vezes com H2, ocatalisador foi removido por filtração por sucção e ele foi concentrado.
Um óleo incolor foi formado (o óleo seria imediatamente proces-sado ulteriormente devido a sua alta sensibilidade a ar).
MS ESI ES+ 217 presente
TLC (isoexano/acetato de etila 1/1/KG 254 F/ninidrina): produtopermanece no início.
A identidade do produto foi também confirmada por análise deRMN.
III. Síntese de terceiro estágio de pNAD (composto 12)<formula>formula see original document page 26</formula>
120 mmols do composto 11 (PM: 216,28) foram misturados em 500 ml dedioxano contendo NaHCO3 (11,0 g, 130 mmol) e cloreto de Fmoc (33,8 g,130 mmols) e foram agitados de um dia para o outro à temperatura ambien-te. Os sais resultantes foram removidos por filtração, a solução foi evapora-da e o resíduo foi purificado sobre uma coluna de sílica-gel (isoexano e isoe-xano/EE 8/2 - 1/1). A fração principal forneceu 39,0 g = 74,1% * (valor teóri-co = 52,6 g). TLC (KG 60 F254 solvente móvel isoexano/acetato de etila2:1): Rf 0,13 MS ESI ES+ 439/+ 339
A identidade do produto foi também confirmada por análise deRMN.
* Rendimento refere-se a o extrato do primeiro estágio.
IV. Síntese de quarto estágio de pNAD (composto 13)<formula>formula see original document page 27</formula>
Composto 12 oriundo do estágio 3 (7,08 g, 16,1 mmols) foi dis-solvido em 80 ml de fosfato de trimetila e subseqüentemente foi resfriadopara 0°C em um banho com gelo. POCI3 misturado com fosfato de trimetila(13 ml de POCI3 frescamente destilado em 13 ml de fosfato de trimetila) foiadicionado a um funil de gotejamento e foi adicionado em porções no perío-do 20 min sob argônio. A temperatura aumentou em uma reação exotérmicapara até 5°C. Subseqüentemente 2,6 ml de piridina foram adicionados e fo-ram agitados por uns outros 40 min a 0°C e sob argônio.
A solução de reação foi cuidadosamente adicionada gota a gotaa 800 ml de solução de carbonato de hidrogênio de tretilamônio a 1 M resfri-ada com gelo (pH = 8). Depois que a adição foi completada, ela foi agitadapor mais 1 h. A solução levemente turva foi subseqüentemente adicionada(rapidamente) gota a gota a solução de NaCI saturada a 1 I. Foi agitada ulte-riormente de um dia para o outro para aperfeiçoar a cristalização. O precipi-tado foi removido por filtração. O resíduo foi dessalinizado sobre uma colunade Diaion. Para esta finalidade 500 g de Diaion foram adicionados a isopro-panol/água 1/1 e foram deixados se inchar de um dia para o outro. Diaion foiintroduzido na coluna e foi exaguado com água. Uma pasta do resíduo foiformado em 100 ml de água pH 3,5 (ácido acético) que foi subseqüentemen-te aplicada a uma coluna e foi enxaguada com água (pH 3,5) até que elaesteja livre de cloreto de sódio. A substância foi então eluída a partir da co-Iuna com 25% de isopropanol (pH 3,5). A solução foi evaporada em um altovácuo à temperatura ambiente.
Resíduo = 2,6 g = 31,3%
TLC RP8 F254/MeOH/água 9/1 MS ESI ES-517,13
A identidade do produto foi também confirmada por análise deRMN.
V. Síntese de quinto estágio de pNAD (composto 14)
<formula>formula see original document page 28</formula>
Uma mistura de composto 13 oriundo do estágio 4 (4,10 g, 7,9mmols) em 250 ml de metanol e 83 ml de 25% de amônia foi agitada de umdia para o outro à temperatura ambiente e foi evaporada em um vácuo àtemperatura ambiente. O resíduo foi colocado em 200 ml de água e foi agi-tado três vezes com 100 ml de acetato de etila. Componentes insolúveis fo-ram removidos por filtração; a fase aquosa clara foi separada e novamentefoi evaporada à temperatura ambiente.
Resíduo = 2,56 g = 100%
MS ESI ES - 295
A fim de remover os cátions de NH3, o resíduo foi dissolvido 2 χem base de Hünig's e novamente foi evaporado cada vez em um alto vácuo.
VI. Síntese de sexto estágio de pNAD (composto 15)<formula>formula see original document page 29</formula>
O sal de Zincke (2,66 g, 8,99 mmols) foi apresentado parcial-mente dissolvido em 50 ml de metanol e composto 14 oriundo do estágio 5(2,56 g, 8,31 mmols) foi dissolvido em 50 ml de metanol foi adicionado gotaa gota enquanto se agitando. A mistura colorida de vermelho e lentamentedissolvida. Foi agitada ulteriormente de um dia para o outro à temperaturaambiente
e o precipitado foi removido por filtração. O filtrado foi evaporado em um vá-cuo, foi colocado em 100 ml de água e foi extraído três vezes com acetatode etila.
A fase de acetato de etila contém o subproduto dinitroanilina, a fase aquosacontém o produto e o sal de Zincke restante. A fase aquosa foi evaporadaem um vácuo à temperatura ambiente e 10 ml de água foram adicionados aoresíduo que foi obtido, que foi agitada por 10 min em um agitador magnéticoe componentes insolúveis foram removidos por filtração. O produto perma-neceu dissolvido. Esta solução foi aplicada a uma coluna Diaion HP20 (1000ml) que tinha sido enxaguada com água e foi enxaguada duas vezes com1000 ml de água. Subseqüentemente foi enxaguada com água/5% de iso-propanol e frações positivas (detectadas por TLC RP8 MeOH/W 9/1) foramevaporadas à temperatura ambiente. O resíduo foi triturado com isopropanole filtrada por sucção com o auxílio de éter de dietila.
Resíduo = 1,60 g = 47,9%
TLC RP8 254 MeOH/W 9/1
MS ES - 400,1/ES + 402,0 também exibe a massa dupla.
A identidade do produto foi também confirmada por análise deRMN.Vila. Síntese de estágio 7a de pNAD (composto 16)
<formula>formula see original document page 30</formula>
Uma mistura de ácido AMP (ácido livre de adenosina monofosfa-to) (10 g, 27,5 mmols) em 60 ml de metanol (seca com sódio) e 5,3 ml de (60mmols) de morfolina (frescamente destilada) foi agitada até que uma soluçãoclara fosse formada.
Subseqüentemente 17 g (82,5 mmols) de Ν,Ν'-dicicloexil carbo-diimida (DCC) foram adicionados e foram agitados de um dia para o outro àtemperatura ambiente enquanto se excluindo umidade. O precipitado (DCH)que foi formado foi filtrado por sucção e o filtrado foi evaporado rotativo a30°C. Subseqüentemente foi agitado com 150 ml de H20/150 ml de éter dedietila e novamente foi filtrado. Depois da separação de fases foi novamenteextraída duas vezes com 75 ml de éter de dietila cada vez. A fase aquosa foisubseqüentemente evaporada rotativa à temperatura ambiente. O resíduo foidissolvido umas outras duas vezes em piridina e cada vez novamente foievaporado roativo em um alto vácuo.
VII. Síntese de sétimo estágio de pNAD (composto 17)<formula>formula see original document page 31</formula>
Uma mistura de morfolidato de AMP (composto 16 oriundo doestágio 7a) (2,53 g, 3,61 mmols), composto 15 oriundo do estágio 6 (1,60 g,3,98 mmols), solução de MnCI2 em formamida a 0,2 M* (27,1 ml, 5,42mmols) e MgSO4 anidro (0,87 g, 7,95 mmols) foram agitados de um dia parao outro à temperatura ambiente e depois desse tempo foram largamenteconvertidos como determinado por TLC (RP8 MeOH/W 9/1). A mistura dereação foi precipitada com acetonitrila e foi filtrada por sucção.
Resíduo = 5,3 g (rendimento teórico 2,64 g)**
MS ESI ES - 729,3 = produto, ES - 415 = cátion de morfolidato de AMP, ES -400,2/ ES + 402,1 resíduos do composto 15 (estágio 6) TLC RP 8 F254 Rf0,085
* A fim de preparar esta solução de 2516 mg de MnCI2 anidro foi dissolvidaem 100 ml de 99,99% de formamida enquanto se agitando e subseqüente-mente uma peneira molecular 4A foi adicionada.
** O resíduo foi ulteriormente processado como um produto bruto.
VIII. Síntese de oitavo estágio de pNAD (composto 18,pirrolidinil-NAD)
<formula>formula see original document page 31</formula>5,0 ml de ácido trifluoroacético (TFA) foram adicionados a 500 mg de com-posto 17 do estágio 7 (produto bruto, contém cerca de 50% de sais) é foramagitados por 1 h à temperatura ambiente e subseqüentemente foram con-centrados por evaporação. 500 ml de óleo incolor foram formados como o resíduoMS ESI ES-729,24 (adição de NH3 necessário)
2 Porções de 200 mg e 300 mg foram cada uma purificadas em2 etapas de separação:
Primeira etapa de separação:coluna de Fractogel EMD S03-s: D (interno) = 14 mm L (embalagem) = 85mm
I. Condicionamento
(taxa de fluxo 5 ml/min) a) 100 ml de H2O
b) 200 ml de 0,25 M H2SO4
c) 100 ml de H2O
d) 200 ml de solução de amônica a 1 M
e) 100 ml de H2O
II. Separação: a) aplicar 200 ml de substância dissolvido em 5 ml deH2O
b) eluir com a gradiente de H2O -> solução de NH4HCO3 a 0,2 M. (solventemóvel A = 250 ml de H2O apresentado em um frasco Erlenmeyer e agitadoem um agitador magnético, bombeado sobre a coluna a uma taxa de ml/minsolvente móvel B = solução de NH4HCO3 a 0,2 M bombeado a 2,5 ml/minpara A).
III. Fracionação:
a) frações de cada um de 3 ml
b) impurezas de primeiro pico de primeiro
c) segundo pico depois de cerca de 70 ml de eluato preliminar = substância
IV. Recondicionamento:
a) 100 ml de solução de amônia a 1 M
b) 100 ml de H2O
Segunda etapa de separação:Diaion ΗΡ20, coluna D (interna) = 30 mm L (embalagem) 130mm eluída com 100 ml de H2O e 100 ml de H20/5% de isopropanol.
A substância já elui com a fase aquosa; apenas impurezas estãopresentes na fração de isopropanol.
3 Frações foram obtidas de acordo com HPLC analítico:
F1 = 13,5 mgF2 = 5,5 mgF3 = 11,5 mgTotal = 30,5 mg = 12,2 %
A identidade do pirrolidinil NAD (composto 18) foi confirmada poranálises de RMN.
Ensaio de desidrogenase de glicose para pNAD
A fim de examinar a regra de pNAD como um cofator para desi-drogenase de glicose (GlucDH), um ensaio de atividade de glicoseDH emTris a 0,1 M/NaCI a 0,2 M (pH 8,5) tampão foi realizado. A concentração deglicose era de 80 mM. Concentrações de pNAD e NAD a 0,05-0,5 mM foramusadas. A isso, 10 mg/ml (pNAD) ou 0,002 mg/ml (NAD) [83 ou 0,017 μΜrespectivamente] GIucDH foi adicionado. O ensaio foi realizado à temperatu-ra ambiente e a reação enzimático foi monitorada por registro de espectrosde absorção a intervalos de tempo regular. Os valores mostrados na tabela 1referem-se a uma medição de absorção depois de 4 min.
Tabela 1
<table>table see original document page 33</column></row><table>
Espectros de absorção de pNAD e pNADH
Espectros de absorção de NAD e pNAD e/ou NADH e pNADHsão mostrados nas figuras 6A e 6B. NAD e pNAD exibem uma máxima ab-sorção a 260 nm. pNADH, isto é, pNAD depois do ensaio de atividade deGlucDH exibe um deslocamento vermelho da absorção máxima por cerca de10 nm (figura 6B) em comparação com NADH.
Espectros de fluorescência de NADH e pNADH como complexosde GIucDH são adicionalmente mostrados nas figuras 7 e 8. Os espectrosforam em cada caso registrados depois do ensaio de atividade de GlucDH.Figura 7 mostra espectros de emissão de complexos de NADH/pNADH-GIucDH a comprimentos de onda de excitação de 340 e 370 nm. Os espec-tros de emissão de NADH e pNADH a comprimento de onda de excitação de370 nm são similares. Figura 8 mostra um espectro de excitação para umcomplexo de NADH/pNADH-GlucDH a um comprimento de onda de emissãode 460 nm. pNADH exibe um espectro de excitação mais amplo do que NA-DH. Os espectros foram também registrados depois do ensaio de atividadede GlucDH.
Investigação da estabilidade de pNAD.
A fim de examinar a estabilidade de pNAD em comparação comNAD, as mesmas quantidades de NAD e pNAD foram cada uma colocadasem KP04 a 0,15 M, tampão de NaCI a I M (pH 7,0) e foram incubadas a50°C. A decomposição de NAD e/ou pNAD foram monitoradas por HPLC.Figura 9 mostra a percentagem de áreas das quantidades de (p)NAD emcomparação com as quantidades de (p)NAD na hora zero. A figura mostraque pNAD é muito estável em comparação com NAD.
C) Preparação de carbaNAD ciclofosfato (19)
<formula>formula see original document page 34</formula>
79 mg (0,1 mmol) de 05'-(hidróxi-morfolino-fosforil)-02',03'-hidróxi- fosforil-adenosina, diidrato de cicloexilamina de ácido N-cicloexil-morfolina-4-carbonimídico (secos por coevaporação com piridina (Morphat e outros, J.Am. Chem. Soe. 83; 1961; 663-675), 44 mg (0,105 mmol) carbaNMN mono-fosfato e subseqüentemente 25 mg sulfato de magnésio seco foram adicio-nados a 0,74 ml de uma solução de cloreto de manganês a 0,2 em formami-da absoluto. A mistura foi agitada sob argônio por três dias em um recipientede reação encerrado e subseqüentemente foi adicionada a 10 ml de acetoni-trila enquanto se agitando.
O precipitado foi removidoremoved por filtração, foi purificadopor cromatografia de RP em um RP 18 Hipersil ODS, 250 χ 21,2 mM, colunade 5 μΜ usando-se um gradiente de 0% de B a 100% de B por 60 min: Elu-ente A: trietilacetato de amônio a 0,1 M1 eluente B: mistura de 1:4 de 0,1 Mde trietilacetato de amônio e acetonitrila, taxa de fluxo: 10 ml/min. A eluiçãofoi monitorada por detecção a 260 nm. A fração principal foi coletada e foiIiofilizada 5 vezes a fim de remover o trietilacetato de amônio. O sal de trieti-lamônio foi convertido no ácido livre com Dowex 50 WX2 e subseqüente-mente no sal de lítio Rendimento: 10 mg.
D) Preparação de carbaNADP (20)
<formula>formula see original document page 35</formula>
Três vezes quatro unidades de ribonuclease T2 foram adiciona-das no período de 6 h a 37°C a uma solução de 2,2 mg de sal de lítio decarbaNAD ciclofosfato (19) em 1 ml de tampão de Bis-tris-propano (0,02 M,pH 7,5). A mistura foi mantida de um dia para o outro a 37°C. A enzima foidesnaturada por aquecimento para 65°C por 20 min. Depois da filtração umapurifiação foi realizada por cromatografia de RP em um RP 18 Hipersil ODS,250 χ 21,2 mm, coluna de 5 μΜ usando-se um gradiente de 0% de B a 100% de B por 60 min. Eluente A: trietilacetato de amônio a 0,1 M; eluente B:1:4 mistura de 0,1 ml de trietilacetato de amônio e acetonitrila; taxa de fluxo:10 ml/min. A eluição foi monitorada por detecção a 260 nm. A fração princi-pai foi coletada e foi Iiofilizada 5 vezes a fim de remover o acetato de trieti-lamônio.
Espectro de massa (MALDI Applied Biosystems Voyager System6327: calculado 742,45, encontrado: 743,17).
Ε) Desidrogenase de ensaio de atividade de glicose para cNAD
A desidrogenase de ensaio de atividade de glicose para cNADem comparação com NAD foi realizada como descrita sob B) para pNAD.
Para essa finalidade concentrações de desidrogenase de glicose de 0,1(cNAD) e 0,002 mg/ml (NAD) [0,83 e 0,017 μΜ respectivamente] foram usa-das. As quantidades usadas e os resultados são mostrados na tabela 2.
Tabela 2
<table>table see original document page 36</column></row><table>
F) Espectros de absorção de cNAD e cNADH
Figuras 10A, 10B e 10C mostram espectros de absorção deNAD e cNAD. NAD bem como cNAD têm uma absorção máxima a 260 nm.Figura 10B mostra espectros de absorção de NADH e cNADH onde os es-pectros foram em cada caso registrados depois de um ensaio de atividadede desidrogenase de glicose. A absorção máxima de cNADH exibe um des-locamento vermelho de 20 nm. Outros espectros de absorção para NADH ecNADH são mostrados na figura 10C em que condições diferentes para osensaio de atividade desidrogenase de glicose associado foram selecionadoscomo afirmado nas legendas.
Figura 11 adicionalmente mostra espectros de fluorescência deNADH e cNADH como complexos de GlucDH. Os espectros foram registra-dos a um comprimento de onda de excitação de 370 nm depois de um deensaio de atividade de desidrogenase de glicose. NADH bem como cNADHexibe um aumento de sinal de fluorescência quando tratado com GlucDH.
Claims (26)
1. Elemento de teste para a determinação de um analito com-preendendo (i) uma ezima dependente de coenzima ou um substrato para talenzima e (ii) um composto da seguinte fórmula geral (I) como a coenzima:<formula>formula see original document page 37</formula>em queA = adenina ou um análogo da mesma,T = em cada caso independentemente significa O, S,U = em cada caso independentemente significa OH, SH, BH3", BCNH2",V = em cada caso independentemente significa OH ou um grupo fosfato.W = COOR, CON(R)2, COR, CSN(R)2 em que R em cada caso independen-temente significa H ou CrC2 alquila,X1, X2 = em cada caso independentemente significam O, CH2, CHCH3,C(CH3)2, NH, NCH3,Y = NH, S1O1CH2,Z = um resíduo compreendendo um grupo cíclico com 5 átomos de carbonoque opcionalmente contém um heteroátomo selecionado de O, S e N e op-cionalmente um ou mais substituintes, eum resíduo CR42 em que CR42 está ligado ao grupo cíclico e a X2onde R4 = em cada caso independentemente significa H, F, Cl, CH3,com a condição de que Zeo resíduo de piridina não estejam ligados poruma ligação glicosídica, ou um sal ou opcionalmente uma forma reduzidados mesmos.
2. Elemento de teste de acordo com a reivindicação 1, para adeterminação de glicose compreendendo desidrogenase de glicose e umcomposto de acordo com a fórmula geral (I) ou um sal como uma coenzima.
3. Elemento de teste de acordo com a reivindicação 1 ou 2, ca-racterizado pelo fato de que os substituintes no Z são selecionados do grupoque compreende F, Cl e C1-C2 alquila que está opcionalmente fluorada ouclorada ou/e OH-substituída, O-CrC2 alquila.
4. Elemento de teste de acordo com uma das reivindicações de-1 a 3, compreendendo um composto da seguinte fórmula-(Γ) como a coenzima: <formula>formula see original document page 38</formula> em queA = adenina ou um análogo da mesma,T = em cada caso independentemente significa O, S1U = em cada caso independentemente significa OH1 SH, BH3', BCNH2", V =em cada caso independentemente significa OH ou um grupo fosfato,W = COOR, CON(R)2, COR, CSN(R)2 em que R em cada caso independen-temente significa H or CrC2 alquila,Xi, X2 = em cada caso independentemente significam O, CH2, CHCH3,C(CH3)2, NH, NCH3,Y = NH, S1 O, CH2,Z = um anel de cinco membros carbocílico ou heterocíclico saturado ou insa-turado, em particular um composto da fórmula geral (II)<formula>formula see original document page 39</formula>em que uma ligação simples ou dupla pode estar presente entre R5' e R5"R4 = em cada caso independentemente significa H, F, Cl, CH3, R5 = CR42,se uma ligação simples estiver presente entre R5' e R5", então R5' = O, S,NH, NCrC2 alquila, CR42, CHOH, CHOCH3,R5" = CR42, CHOH, CHOCH3, se uma ligação dupla estiver presente entreR5' e R5", então R5' = R5" = CR4, R6, R6' = em cada caso independente-mente significam CH, CCH3 ou um sal ou opcionalmente uma forma reduzi-da dos mesmos.
5. Elemento de teste de acordo com uma das reivindicações de 1 a 4, em que W = CONH2 ou COCH3.
6. Elemento de teste de acordo com uma das reivindicações 1 a 5, na forma de uma tira de teste.
7. Elemento de teste de acordo com uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que a enzima é uma desidrogenase seleciona-da de desidrogenase de glicose (E.C. 1.1.1.47), Iactato desidrogenase(E.C. 1.1.1.27, 1.1.1.28), malato desidrogenase (E.C.1.1.1.37), glicerol desi-drogenase (E.C.1.1.1.6), álcool desidrogenase (E. C.1.1.1.1), alfa-hidroxibutirato desidrogenase, sorbitol desidrogenase ou aminoácido desi-drogenase tal como L-aminoácido desidrogenase (E.C.1.4.1.5).
8. Elemento de teste de acordo com uma das reivindicações 1 a 7, para detectar glicose, caracterizado pelo fato de que a enzima é desidro-genase de glicose.
9. Composto da fórmula geral (I"):<formula>formula see original document page 40</formula>em queA = adenina ou um análogo da mesma,T = em cada caso independentemente significa O, S,U = em cada caso independentemente significa OH, SH, BH3", BCNH2",V = em cada caso independentemente significa OH ou um grupo fosfato,W = COOR, CON(R)2, COR, CSN(R)2 em que R em cada caso independen-temente significa H or Ci-C2-alquila,X1, X2 = em cada caso independentemente significam O, CH2, CHCH3,C(CH3)2, NH, NCH3,Y = NH, S, O, CH2,Z = um anel de cinco membros carbocílico ou heterocíclico saturado ou insa-turado, em particular compostos da fórmula geral (II)<formula>formula see original document page 40</formula>em que uma ligação simples ou dupla pode estar presente entre R51 e R5",R4 = em cada caso independentemente significa H, F, Cl, CH3,R5 = CR42,se uma ligação simples estiver presente entre R51 e R5", entãoR5' = O, S, NH, NCi-C2-alquila, CR42, CHOH1 CHOCH3lR5" = CR42> CHOH, CHOCH3,se uma ligação dupla estiver presente entre R51 e R5", então R5' = R5" = CR4R6, R6' = em cada caso independentemente significam CH1 CCH3com a condição de que se R5 = CH2, T = O, U = em cada caso OH1 V = OH,W = CONH2, X = O e Y = O, então R5' e R5" não sejam simultaneamenteCHOH, ou um sal ou opcionalmente uma forma reduzida dos mesmos.
10. Composto de acordo com a reivindicação 9, caracterizadopelo fato de que pelo menos um resíduo U é diferente de OH.
11. Composto de acordo com a reivindicação 9 ou 10, caracteri-zado pelo fato de que pelo menos um resíduo U = BH3".
12. Composto de acordo com uma das reivindicações de 9 a 11,em que W = CONH2 ou COCH3.
13. Composto de acordo com uma das reivindicações de 9 a 12,que é borano NAD, borano NADP ou um sal ou uma forma reduzida dosmesmos.
14. Composto de acordo com uma das reivindicações de 9 a 12,que é c-pentil NAD, c-pentil NADP ou um sal ou uma forma reduzida dosmesmos.
15. Composto de acordo com uma das reivindicações de 9 a 12,que é pirrolil NAD, pirrolil NADP ou um sal ou uma forma reduzida dos mesmos.
16. Composto de acordo com uma das reivindicações de 9 a 12,que é furanil NAD, furanil NADP ou um sal ou uma forma reduzida dosmesmos.
17. Composto de acordo com uma das reivindicações de 9 a 12,que é pirrolidinil NAD, pirrolidinil NADP ou um sal ou uma forma reduzidados mesmos.
18. Composto de acordo com uma das reivindicações de 9 a 12,que é carbaNAD ciclofosfato, carbaNADP ou um sal ou uma forma reduzidados mesmos.
19. Complexo de enzima-coenzima constituída de um compostocomo definido em uma das reivindicações 9 a 16, em combinação com umaenzima adequada.
20. Complexo de acordo com a reivindicação 19, caracterizadopelo fato de que a enzima é uma desidrogenase selecionada de desidroge-nase de glicose (E.C.1.1.1.47), Iactato desidrogenase (E.C.1.1.1.27,- 1.1.1.28), malato desidrogenase (E.C.1.1.1.37), glicerol desidrogenase(E.C. 1.1.1.6), álcool desidrogenase (E.C. 1.1.1.1), alfa-hidroxibutirato desi-drogenase, sorbitol desidrogenase ou aminoácido desidrogenase seleciona-da de L-aminoácido desidrogenase (E.C. 1.4.1.5).
21. Uso de um composto como definido em uma das reivindica-ções de 9 a 18 ou de um complexo de acordo com a reivindicação 19 ou 20,para detectar um analito em uma amostra por uma reação enzimática.
22. Kit de reagente contendo um composto como definido emuma das reivindicações 9 a 18, e opcionalmente uma enzima adequada ouum complexo de enzima-coenzima como definido na reivindicação 19 ou 20,bem como um tampão de reação adequado.
23. Kit de reagente de acordo com a reivindicação 22, caracteri-zado pelo fato de que a enzima é um desidrogenase selecionada de desi-drogenase de glicose (E.C.1.1.1.47), Iactato desidrogenase (E.C.1.1.1.27,- 1.1.1.28), malato desidrogenase (E.C.1.1.1.37), glicerol desidrogenase(E.C.1.1.1.6)* álcool desidrogenase (E.C.1.1.1.1), alfa-hidroxibutirato desi-drogenase, sorbitol desidrogenase ou aminoácido desidrogenase seleciona-da de L-aminoácido desidrogenase (E.C.1.4.1.5).
24. Uso de um elemento de teste como definido em uma das rei-vindicações de 1 a 8, ou do kit de reagente como definido na reivindicação 22 ou 23, para determinar analitos selecionados de glicose, ácido láctico,ácido málico, glicerol, álcool, colesterol, triglicerídeos, ácido ascórbico, ciste-ína, glutationa, peptídeos, uréia, amônio, salicilato, piruvato, 5'-nucleotidase,cinase de creatina (CK), Iactato desidrogenase (LDH) e dióxido de carbono.
25. Método para a detecção de um analito compreendendo asetapas:(a) contato de uma amostra com um elemento de teste como de-tinido em uma das reivindicações 1 a 8, ou um kit de reagente como definidona reivindicação 22 ou 23, compreendendo uma coenzima e (b) detecção doanalito.
26. Método de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelofato de queo analito é detectado fotometricamente ou fluorometricamente.
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