PT2157192E - Composições para diagnóstico e terapia de doenças associadas com a expressão aberrante de futrinas (r-espondinas) - Google Patents

Composições para diagnóstico e terapia de doenças associadas com a expressão aberrante de futrinas (r-espondinas) Download PDF

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PT2157192E PT91702308T PT09170230T PT2157192E PT 2157192 E PT2157192 E PT 2157192E PT 91702308 T PT91702308 T PT 91702308T PT 09170230 T PT09170230 T PT 09170230T PT 2157192 E PT2157192 E PT 2157192E
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Description

ΕΡ 2 157 192/ΡΤ DESCRIÇÃO "Composições para diagnóstico e terapia de doenças associadas com a expressão aberrante de futrinas (R-Espondinas)" 0 presente invento refere-se a composições úteis para a terapia de doenças associadas à expressão aberrante dos genes codificando as proteínas Futrina 2 (= R-Espondina 3) . Estas doenças incluem tumores de e.g. mama, ovário, fígado, útero, cérvix, cólon, pulmão, ovário, recto, testículos, pâncreas, ossos e pele, bem como doenças envolvendo metabolismo de músculo, osso, lípidos e glucose, e obesidade. 0 presente invento refere-se também a um método para identificação de activadores/agonistas ou inibidores/antagonistas de Futrina 2 . A cascata de sinal de Wnt desempenha um papel crucial no que se refere à regulação de sobrevivência, proliferação e diferenciação de células durante a embriogénese, e no adulto conforme mostrado, e.g., em Drosophila, Xenopus e ratinhos (Nusse e Varmus, Cell 69 (1992), 1073-1087). Os genes Wnt codificam glicoproteínas secretoras que activam uma cascata de sinal bem caracterizada através de um receptor de Wnt denominado "frizzled" ("frisado"). A cascata de sinalização de Wnt e os seus componentes desempenham também um papel importante em várias doenças o que torna desejável modular a sua actividade: i) Cancro A tumorigénese representa um processo complexo em múltiplas etapas no qual se pensa que alterações genéticas e factores ambientais desregulam os processos celulares que controlam a proliferação e diferenciação celulares. Vários estudos indicam que uma cascata de sinal de Wnt aberrante está envolvida no desenvolvimento de cancro do cólon, cancro da mama e melanoma (Pfeifer, Science, 275 (1997), 1752-1753; Polakis, Genes Dev. 14 (2000), 1837-1851). O primeiro gene codificando uma proteína da cascata de sinal de Wnt, int-1, foi isolado a partir de vírus do tumor mamário de ratinho (MMTV) e pôde ser mostrado que este é um oncogene. Está assim bem 2 ΕΡ 2 157 192/ΡΤ estabelecido que uma regulação aberrante da actividade de Wnt e/ou de componentes da cascata de sinal de Wnt a jusante do sinal de Wnt, e.g., beta-catenina e APC, estão envolvidos em tumorigénese. ii) Doença óssea
Os sinais de Wnt promovem a formação óssea (e.g. Yang, Development, 130 (2003), 1003-15; Fischer, J. Biol.
Chem. 277 (2002) 30870-30878). Consistente com esta noção, uma mutação com ganho de função do receptor de Wnt LRP5 causa doença óssea grave (Boyden, et al., 346 (2002) N. Engl. J. Med., 1513-21; Little, et al., 70 (2002) Am. J. Hum. Genet., 11-9.). Inversamente, mutações de inactivação em LRP5 conduzem a síndroma de osteoporose-pseudoglioma em humanos (Kato, et al., 157 (2002) J Cell Biol, 303-14; Gong, et al., 107 (2001) Cell, 513-23 . ) . iii) Doença ocular A mutação de inactivação no receptor de Wnt LRP5 conduz a pseudoglioma em humanos e a malformações do olho em ratinhos (Kato, et al., 157 (2002) J. Cell Biol. 303-314; Gong, et al.r 107 (2001) Cell, 513-523). iv) Rim A sinalização de Wnt aberrante está envolvida em fibrose renal (Surendran, Am. J. Physiol. Renal Physiol. 282 (2002) 431-441) e doença renal policística (Saadi-
Kheddouci, Oncogene 20 (2001) 5972-5981). v) Metabolismo de lípidos e glucose, obesidade A deficiência do receptor de Wnt LRP5 em ratinhos conduz a níveis de colesterol no plasma aumentados em ratinhos alimentados com uma dieta de elevado teor em gordura, por causa da depuração hepática diminuída de quilomícrons remanescentes. Adicionalmente, quando alimentados com uma dieta normal, ratinhos deficientes em LRP5 exibem uma tolerância à glucose acentuadamente prejudicada (Fujino, et al., 100 (2003) Proc. Natl.
Acad. Sei. USA, 229-234.) A administração do antagonista de LRP5 Dkkl a ratinhos reduz a absorção de glucose em 3 ΕΡ 2 157 192/ΡΤ várias linhas de células e diminui a deposição de gordura (WO 02/066509). É assim óbvio a partir do anterior que o percurso de sinalização de Wnt está envolvido numa variedade de doenças de humano. No entanto, meios para a terapia ou diagnóstico de doenças associadas a uma cascata de sinal de Wnt desregulada estão insuficientemente disponíveis. Assim, a utilização de marcadores moleculares fiáveis para diagnóstico seria útil para uma compreensão da base molecular de doenças associadas a uma cascata de sinal de Wnt aberrante. É de esperar que estes marcadores sejam também úteis para terapia e para o desenvolvimento de novas vias terapêuticas para tratamento de doenças dependentes da cascata de sinal de Wnt, como detalhado acima.
Assim, o problema técnico subjacente ao presente invento é proporcionar meios para terapia de doenças associadas a uma cascata de sinal de Wnt aberrante. A solução para o referido problema técnico é conseguida proporcionando as concretizações caracterizadas nas reivindicações.
Durante as experiências que resultaram no presente invento pôde ser identificado o gene 2 cujo produto é um modulador do percurso de Wnt. A Futrina 2 foi anteriormente identificada como HPWTSR (Chen et al., 29 (2002), Mol. Biol. Rep. 287-292), uma proteína de papel ou função anteriormente desconhecida, expressa em numerosos tipos de células. Adicionalmente, as Futrina 1, 2, 3 e 4 de humano foram descritas como Polipéptidos Semelhantes a Factor de Crescimento de Células Estaminais (Stem Cell Growth Factor-Like Polypeptides), que são capazes de promover a proliferação de células estaminais hematopoiéticas (WO-A-01/77169; WO-A-O1/07611).
Na descrição seguinte mostra-se pela primeira vez: 1.) As Futrinas melhoram a sinalização de Wnt e isto é de relevância fisiológica uma vez que a inibição de Futrina 1 ou 2 resulta em inibição da cascata de sinal de Wnt (sinalização de Wnt/p-catenina). Estes dados mostram que as Futrinas podem 4 ΕΡ 2 157 192/ΡΤ ser encaradas como moduladores de Wnt. A Futrina 1 (Rspo2) é co-expressa com e é positivamente regulada por sinais de Wnt e gera sinergias com Wnt para activar β-catenina. A análise da interacção funcional com componentes do percurso Wnt/β-catenina sugere que a Rspo2 funciona extracelularmente ao nível da interacção de receptor-ligando. Experiências de morfolino antissentido em embriões de Xenopus e experiências de ARNi em células HeLa revelaram que o Rspo2 é requerido para sinalização de Wnt/^-catenina. Em embriões de Xenopus desprovidos de Rspo2 os marcadores de músculo myoD e myf5 não conseguem ser activados e o desenvolvimento muscular posterior é prejudicado. Os resultados mostram que o Rspo2 é um novo activador da cascata de Wnt/β-catenina. Assim, Futrinas tais como Rspo2 (Futrina 1) são úteis para o diagnóstico e para o desenvolvimento de terapias para doenças mediadas por Wnt-LRP, incluindo supressão de tumores, formação óssea, colesterol e metabolismo da glucose (incluindo diabetes), obesidade, doença renal e doença ocular. 2.) Uma vez que os dados obtidos mostram que a Futrina 1 é requerida para formação de músculo, a Futrina 1 é útil para o diagnóstico e para o desenvolvimento de terapias para doenças relacionadas com o músculo, incluindo regeneração muscular. 3.) Os dados mostram que as Futrinas são expressas de modo aberrante numa variedade de tumores de humano. Assim, as Futrinas são úteis para diagnóstico de tumores e para o desenvolvimento de terapias do cancro. Por exemplo, constatou-se que na maioria dos tumores a expressão de Futrinas 1-3 está dramaticamente diminuída (tumores do cólon, estômago, pulmão, recto para a Futrina 1, tumores da mama, ovário, bexiga, útero, cérvix, recto para a Futrina 2, tumores do útero e cérvix para a Futrina 3). Nalguns casos a expressão de Futrinas 1-3 está regulada de modo ascendente (um caso de tumor do estômago para a Futrina 1 e 2, tumor do ovário para a Futrina 3) . A Futrina 4 mostra um nível de expressão muito baixo na maioria dos cancros estudados, excepto ovário.
Assim, a inibição da cascata de sinal de Wnt por inibição da expressão/actividade de Futrinas ou por estimulação da expressão/actividade das Futrinas terá um efeito terapêutico. Do mesmo modo, a activaçao da cascata de sinal de Wnt por diminuição da expressão de Futrina e/ou por 5 ΕΡ 2 157 192/ΡΤ repressão da actividade do próprio polipéptido ele próprio terá um efeito terapêutico.
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
Figura 1: Identificação de Futrina 1 (Rspo2) de Xenopus
Foram co-transfectados repórter TOP-FLASH, ADN vector a partir de fracções de 250 clones cada e pCSfrizzled8. Ensaios de repórter de luciferase em células 293T foram realizados em placas de 96 poços em duplicado como descrito (Wu et al., Curr. Biol. 10 (2000), 1611-1614). A actividade de luciferase foi normalizada contra actividade de Renilla-luc co-transfectado utilizando um kit comercial (Clonetech). RLU: unidades de luciferase relativas.
Figura 2: Futrina 1 (Rspo2) promove sinalização de Wnt/β-catenina (A) Identificação de Rspo2 de Xenopus por ensaio de expressão. Um ensaio de expressão foi realizado em células 293T transfectadas com um repórter responsivo a Wnt (TOPFLASH) e com fracções de ADN de plasmídeo a partir de uma biblioteca de ADNc de olho de Xenopus. RLU: unidades de luz relativas. (B) O terminal C de Rspo2 medeia a retenção de superfície celular. Rspo2 (wt) ou Rspo2AC (AC) marcados com Myc foram transfectados em células 293T, e o lisado celular e o meio foram analisados por Western blot. Co, células não transfectadas. (C) Rspo2 activa a sinalização de Wnt/p-catenina. Ensaios de repórter de luciferase TOPFLASH foram realizados em células 293T com os ADNs transfectados seguintes: Wntl de ratinho (Wnt), 5 ng; frizzled8 (fz) de ratinho, 1 ng; Rspo2 de Xenopus (Rspo2), 0,1, 0,3, 0,9 e 2,7 ng. (D) Rspo2 melhora a sinalização de Wnt3a. Wnt3a de ratinho, Rspo2AC de Xenopus (Rspo2AC) ou meios condicionados em falso foram adicionados a células 293T seguindo-se ensaios de repórter de luciferase TOPFLASH. (E) Rspo2 estabiliza β-catenina. (em cima) Células 293T foram tratadas com Rspo2AC, Wnt3a ou meios tratados em 6 ΕΡ 2 157 192/ΡΤ falso durante 1 ou 4 horas como indicado. Fracções citosólicas foram submetidas a Western blot e sondadas em relação a β-catenina e α-tubulina (controlo de carga). (em baixo) Coloração imuno-histoquímica de β-catenina em células SHEP após 3 horas de tratamento com os meios condicionados indicados. As cabeças de seta indicam β-catenina nuclear. A percentagem de células mostrando a coloração representada é 90% (Co), 85% (Rspo2), 80% (Wnt3a) e 90% (Wnt3a + Rspo2). (F) Análise de dominio de Rspo2. (em cima) Desenho esquemático de Rspo2 de Xenopus e construções de deleção. sp, péptido de sinal; FUI, 2, domínios do tipo furina; TSP1, dominio de trombospondina tipo 1; C, terminal C carregado positivamente, (em baixo). Ensaios de repórter de luciferase TOPFLASH foram realizados em células 293T com as construções indicadas. Igual produção de proteína foi confirmada por Western blot (dados não mostrados).
Figura 3: Alinhamento de ácidos nucleicos multi-sequência de ADNc codificando Futrina 1, 2, 3 e 4 de humano e Futrina 1 de Xenopus
Nucleótidos idênticos estão destacados a negro. Todas as sequências de ácido nucleico começam com o codão ATG iniciador de tradução indicado com um asterisco.
Figura 4: Alinhamento de aminoácidos multi-sequência de Futrina 1, 2, 3 e 4 de humanos deduzidos a partir de ADNc de humano (ver Figura 3)
Aminoácidos idênticos estão destacados a negro, aminoácidos similares estão a cinzento.
Figura 5: As Futrinas promovem a sinalização de Wnt
Experiências de co-transfecção em células 293T. Ensaios de repórter de luciferase responsivos a Wnt foram realizados em placas de 96 poços em triplicado como descrito (Wu et al., Curr. Biol. 10 (2000), 1611-1614). A actividade de luciferase foi normalizada contra actividade de Renilla utilizando um kit comercial (Clonetech) . Wntl = Wntl de ratinho, fz8 = 7 ΕΡ 2 157 192/ΡΤ frizzled8 de ratinho, Futrina 1 = Futrina 1 de Xenopus, Wnt3A = Wnt3A de ratinho, (0,1 ng) em A indica a quantidade de ADN de plasmideo transfectado por poço, RLU: unidades de luciferase relativas.
Figura 6: Comparação de sequências de proteínas Rspo de humano (hR-Espondina 1 a 4) (A) Alinhamento de proteínas Rspo de humano (h) (correspondendo aos alinhamentos de Futl-4 de humano na Figura 4 excepto que se utilizam diferentes designações). O péptido de sinal, domínios do tipo furina e domínio de trombospondina tipo 1 estão sublinhados e os aminoácidos conservados são mostrados a negro. (B, C) Matriz de homologia de Rspo mostrando uma visão geral da identidade de aminoácidos em % entre proteínas Rspo de humano (B) e entre proteínas Rspo2 de Xenopus (X) ou de ratinho (m) e Rspo de humano, respectivamente (C).
Figura 7: Futrina 1 e 2 de humano são requeridas para sinalização de Wnt Células HeLa foram transfectadas em placas de 24 cavidades com o repórter de Wnt 7LEF-Rev-fosLuc, pRL-TK e plasmídeos pSuper que produzem quer siRNA contra Futrina 1 e 2 de humano quer um controlo em falso. Três dias após transfecção, adicionou-se meio condicionado de Wnt3A de ratinho à cultura para estimular a sinalização de Wnt. 24 horas mais tarde, determinou-se a actividade de luciferase.
Figura 8: Análise de expressão de R-espondinas de Xenopus e ratinho (A) Expressão de Rspo2 durante o desenvolvimento de Xenopus nas fases embrionárias indicadas analisada por RT-PCR. Utilizou-se Histona H4 para normalização. -RT, controlo de transcrição reversa negativo. (B-H) Hibridizaçoes in situ de montagem inteira de Xenopus dos genes indicados. (B) Embrião de fase 11, vista dorso-vegetal; dbl, lábio blastoporal dorsal. (C) Embrião de fase 12, vista dorsal com anterior para cima. Um domínio de expressão neural anterior está indicado 8 ΕΡ 2 157 192/ΡΤ por seta. (D) Embrião de fase 15, vista dorsal com anterior para cima. (E) Embrião de fase 14, vista dorsal com anterior para cima. (F-G) Embriões na fase de broto de cauda; ba, arcos branquiais; cm, musculatura craniana; di, diencéfalo; dnt, tubo neural dorsal; mhb, fronteira mesencéfalo-rombencéfalo; ov, vesícula óptica; pn, prónefro; pdm, proctodeo; s, somitos; tb, mesoderme de broto de cauda. A inserção em (F) mostra uma secção transversal ao nível indicado pela seta, mostrando a expressão no tubo neural dorsal e nas partes mais dorsais e ventrais dos somitos. (H) Cérebro de girino Xenopus dissecado (vista lateral) mostrando a expressão em diencéfalo (di) e zona limitante intratalâmica (zli), onde é expressa um sonic hedgehog (inserção) . dt, vt, tálamo dorsal e ventral, respectivamente, sc, medula espinal; tel, telencéfalo; (I—M) Hibridizações in situ de montagem inteira de ratinho dos genes indicados. (I) brotos dos membros de embriões de ratinho ao dia 12,5. AER, cristã ectodérmica apical. (J) Embrião de ratinho ao dia 7,5 mostrando expressão de Rspo3 na linha primitiva. (K-M) Embriões de ratinho ao dia 9,5. di, diencéfalo; dnt, tubo neural dorsal; inet, metencéfalo; tel, telencéfalo.
Figura 9: Regulação de R-espondinas de Xenopus por sinalização de Wnt (A) Comparação de padrões de expressão de XRspo2, XWnt8 e XWnt3a em embriões da fase de néurula inicial por hibridização in situ de montagem inteira. Vista dorsal, anterior para cima. (B) (em cima) Diagrama da experiência. Embriões na fase de quatro células foram injectados com 50 pg de pCS-ppl (pré-prolactina), pCSXWnt8 ou pCS-$-catenina em cada blastómero, dissecaram-se os DMZs, cultivaram-se até ao equivalente à fase 11 e analisaram-se por RT-PCR. (em baixo) Análise RT-PCR dos genes indicados. -RT, controlo de transcrição reversa negativo. (C-E) Embriões na fase de quatro células foram injectados com 50 pg de pCS-Wnt8, pCS~Wizt3a ou pCS-ppl num blastómero e fixados na fase 11 para hibridização in situ com XRspo2. 9 ΕΡ 2 157 192/ΡΤ
Figura 10: Futrina 2 é requerida para formação de músculo A. A depleção da proteína Futrina 1 causa regulação descendente de marcadores musculares iniciais e defeitos musculares. (A,C,E,G,I,K) Embriões injectados com oligo-morfolino de controlo (5 ng), com Futl-Mo (5 ng). Misturaram-se os oligo com marcador de linhagem de ARNm (LacZ) (coloração azul) em (C, D, E, F, G, H) ou ARN de pré-prolactina (ppl), e visualizaram-se por hibridização in situ (coloração vermelha) (A,B,J,K,L). Hibridização in situ com sondas para Xmyf5 (A,B), XmyoD (C,D), Xbra (E,F), Xnot (G,H) e actina de músculo (I-L) (coloração magenta) . Os embriões em K e L são cortados transversalmente. Note-se a redução de músculo em L (lado direito). B. Futl-Mo actua especificamente para inibir a tradução das suas construções de ADN cognato quando sobre-expresso em embriões. ARNm (futl marcado com myc C-terminal) foi injectado equatorialmente em ambos os blastómeros de embriões na fase de 2 células. Os mesmos embriões foram depois injectados na fase de 8 células com 5 ng de Futl-Mo (pista 3) ou morfolino de controlo (pista 2) em todos os blastómeros vegetais e colhidos na fase 11. Marcados. A proteína Futrina 1 foi depois visualizada com anticorpo a-myc. C. Recuperação da redução de marcador muscular causada por Futl-Mo por co-injecção de ARNm de XFutl contendo mutações pontuais na região 5' correspondendo a oligo morfolino. Os embriões foram co-injectados com 5 ng de Futl-Mo (1,2) com 50 pg de ARNm de ppl ou XFutl radialmente num blastómero na etapa de 4 células.
As expressões de MyoD (1,3) e Myf5 (2,4) foram analisadas por hibridização in situ. Todos os embriões foram agrupados em 3 classes (exemplos para MyoD são apresentados na parte de baixo da figura): embriões com nível de expressão no lado injectado de 1-30% (classe A) ; 30-70% (classe B) e 70-100% (classe C) a partir do nível normal. As barras representam a percentagem dos embriões correspondendo ao tipo A, B ou C. (n para Fut-Mo + ppl: 57 embriões para MyoD, 45 10 ΕΡ 2 157 192/ΡΤ embriões para Myf5; n para Fut-Mo + ARNm Ffutl: 39 embriões para MyoD e 41 embriões para Myf5).
Figura 11: Rspo2 promove a diferenciação neural e muscular em Xenopus (A) Embriões da fase de 4 células foram injectados animalmente com 100 pg de Rspo2, 100 pg de Xwnt8 ou 200 pg de ARNm de β-catenina em cada blastómero. Na fase 8, as cápsulas animais foram dissecadas, cultivadas até ao equivalente da fase 18 e analisadas quanto à expressão dos genes marcadores indicados, -RT, controlo de transcrição reversa negativo. (B) Embriões na fase de 2 células foram injectados com 100 pg de ARNm de Rspo2 ou de pré-prolactina (ppl) em cada blastómero. Notam-se glândulas de cimento ectópico (seta) e um eixo corporal encurtado em embriões injectados com Rspo2. (C-J) Hibridizações in situ de montagem inteira dos genes indicados. Embriões na fase de 8 células foram injectados com 100 pg de ARNm de Rspo2 ou ppl como indicado num blastómero animal. ARNm de LacZ foi co-injectado como marcador de linhagem em todos os painéis excepto C, G e H. (C-H) Néurulas de Fase 15 na vista anterior. (I-J) Gástrulas de Fase 11 em vista vegetal, dorsal para cima. (K-N) O Rspo2 promove a formação de músculo. (K) Diagrama das experiências. Embriões da fase de 4 células foram injectados com 50 pg de construções de ADN de plasmídeo em todos os blastómeros, os fragmentos indicados foram explantados na fase 10,5, cultivados e processados para hibridização in situ de montagem inteira (M) de RT-PCR (N). (L) VMZ equivalente à Fase 40 de explantes LMZ. Notem-se estruturas tipo cauda em VMZs a partir de embriões injectados com Rspo2. (M) Hibridização in situ de VMZs de Fase 25 para actina de músculo. (N) Análise RT-PCR para os genes indicados em explantes de VMZ equivalentes à fase 25 e de DMZ equivalentes à 11 ΕΡ 2 157 192/ΡΤ fase 11. Xdd 1, dominante negativo. Xenopus dishevelled; Co, pré-prolactina.
Figura 12: Rspo2 interfere com BMP-4, Activina e Nodal mas não com FGF em Xenopus (A-D) Embriões da fase de 4 células foram injectados animalmente com os ARN indicados. Na fase 8, as cápsulas animais foram dissecadas, cultivadas até ao equivalente à fase 10 e analisadas quanto à expressão de Vent2 (A) ou Xbra (B-D). -RT, controlo de transcrição reversa negativo. Embriões injectados com 100 pg pré-prolactina (ppl) foram utilizados como controlo. Quantidades de ARNm utilizadas: 100 pg de Rspo2, 50 pg ou 250 pg de BMP - 4, 50 pg de activina, 25 ou 100 pg de Wnt8, 200 pg de fi-catenina, 50 ou 100 pg de Xnrl, 2 ou 20 pg de FGF8.
Figura 13: Rspo2 de Xenopus é requerido para formação de músculo (A) Rspo2Mo inibe especificamente a tradução do seu ADN cognato. Em cima, Diagrama da experiência. Embriões de Xenopus na fase de 2 células foram injectados com 100 pg de ARNm de Rspo2 marcado com Myc na região animal, na fase de 8 células, os mesmos embriões foram depois injectados com 5 ng de Rspo2Mo de CoMo em todos os blastómeros animais, colhidos na fase 11 e processados para análise Western blot de α-tubulina e Rspo2 marcado com Myc. (B) A depleção de proteína Rspo2 causa defeitos musculares e regulação descendente de marcadores miogénicos. Embriões da fase de 4 células foram injectados equatorialmente num blastómero com 5 ng de oligonucleótidos de morfolino de controlo (CoMo) ou Rspo2Mo como indicado em conjunto com 50 pg de ARNm de ppl ou 50 pg de ARN de LacZ como marcador de linhagem e analisados no broto de cauda da fase de gástrula por hibridização in situ para os genes indicados. Utilizou-se hibridização in situ dupla (a-f) para o gene de interesse (azul-escuro) e para ppl (vermelho). (a-d) Embriões de fase 25. 12 ΕΡ 2 157 192/ΡΤ (a-b): miótomos, visualizados por expressão de actina de músculo mostram malformações num lado injectado com Rspo2Mo (b). (c-d) Secção transversal ao nivel do tronco mostrando volume muscular reduzido em (d) . (e-h) : a
expressão de myf5 e myoD (azul-escuro) está regulada de modo descendente na região injectada com Rspo2Mo (vermelho em e,f de azul-claro em g,h). (i-1): A expressão de Xbra e Xnot2 (azul-escuro) não é afectada na região de injecções com Rspo2Mo (azul-claro). (C) Rspo2Mo actua especificamente. Recuperação da redução de myfõ por ARNm de Rspo2 co-injectado. Embriões na fase de quatro células foram injectados num blastómero com 5 ng de morfolino de controlo (CoMo), Rspo2Mo, 5 0 pg de ARNm de ppl e 50 pg de ARNm de Rspo2 contendo desemparelhamentos com Rspo2Mo. A expressão de myf5 foi analisada por hibridização in situ na fase de gástrula. É indicada a percentagem de embriões com expressão de myf5 fortemente afectada (A), moderadamente reduzida (B) e normal (C) conforme exibida nos embriões representativos. O desvio padrão foi calculado a partir de três experiências independentes. (D) Rspo2Mo bloqueia a sinalização de Wnt a montante de dishevelled durante a formação de músculo. Embriões da fase de 4 células foram injectados radialmente com 5 ng de Rspo2Mo ou CoMo, 50 pg de pCS-XWnt8, pCS-dishevelled (Xdsh) , pCS-GSK-3(.3 dominante negativo (dnGSK) ou pCS-β-catenina. Na fase 10,5 DMZs (a) ou VMZs (b) ou LMZs (c-d) foram explantados e cultivados até a fase 11 (a, c) ou 25 (b, d) para análise RT-PCR dos genes indicados. -RT: controlo de transcrição reversa negativo.
Figura 14: R-espondinas são requeridas para sinalização de
Wnt em células HeLa (A) Análise RT-PCR mostrando expressão diferencial de Rspol-4 de humano em linhas de células HeLa e 293T. Utilizou-se actina para normalização. (B) Especificidade de siRNAs. Células 293T foram co-transfectadas com pSUPER-Rspo2 ou -3 (siRNA), Rspo3 marcado com FLAG e GFP (controlo de transfecção) . As expressões de Rspo3 e GFP foram analisadas por Western blot. 13 ΕΡ 2 157 192/ΡΤ (C-D) R-espondinas são necessárias para sinalização de Wnt/β-catenina em células HeLa. Ensaio de repórter de luciferase de Wnt em células HeLa co-transfectadas com as construções indicadas. Adicionou-se Wnt3a como meio condicionado. RLU, unidades de luz relativas.
Figura 15: Expressão de Futrina está desregulada em vários tumores de humano A expressão de Futrina 1, 2, 3 e 4 ou ubiquitina (para mostrar igual carregamento) foi analisada por hibridização radioactiva em arranjos de ARNm (Clontech, Câncer Profiling Array II) a partir de amostras de tecido normal e canceroso a partir de diferentes pacientes. Abreviaturas N, tecidos normais; T, tecidos de tumor.
Figura 16: Expressão de R-espondinas de humano em amostras de tumor
Análise dot-blot de Rspol, 2 e 3 de humano em amostras normais e de tumor. As mesmas amostras de ADNc (Câncer Profiling Array II, Clontech) foram hibridizadas com Rspol, 2, 3 e sondas de ubiquitina. (em cima) 0 Câncer Profiling Array contém pares de ADNc a partir de amostras de tumor e de tecido normal correspondente a partir de pacientes individuais e manchados lado a lado como indicado. As abreviaturas de órgão são: Br, mama; ov, ovário; co, cólon; st, estômago; lu, pulmões; kd, rim; bl, bexiga, vu, vulva; pr, próstata; tr, traqueia; liv, fígado; ut, útero; ce, cérvix; re, recto; th, glândula tiróide; te, testículos; sk, pele; sin, intestino delgado; pa, pâncreas.
Figura 17: Interacção de R-espondinas com componentes do percurso de sinalização de Wnt/P-catenina (A-C) Ensaio de repórter de luciferase de Wnt em células 293T co-transfectadas com as construções indicadas. Os resultados estão indicados como o número de vezes de estimulação em relação ao repórter sozinho. As doses de ADN foram 5 ng de Wntl, 1 ng de Fz8, 3 ng de LRP6, 10 ng de axina, 10 ng de dntcf3, 5 ng de dkkl, 10 ng de Xdsh, 1 ng de Wnt3a. 14 ΕΡ 2 157 192/ΡΤ
Como aqui utilizado o termo "polipéptido" refere-se não apenas a polipéptidos codificados pelas sequências de nucleótidos/aminoácidos como ilustradas nas Figuras 3 e/ou 4 mas também a polipéptidos diferindo na sequência de aminoácidos devido a inserção, deleção e/ou substituição de um ou mais aminoácidos e mostrando pelo menos uma actividade biológica de uma Futrina, e.g. a capacidade para promover a sinalização de Wnt. Preferivelmente, os ácidos nucleicos e/ou polipéptidos relacionados são ácidos nucleicos e/ou polipéptidos cuja sequência mostra uma identidade de pelo menos 40%, em particular uma identidade de pelo menos 65%, preferivelmente de pelo menos 80% e, particularmente preferido, de pelo menos 90% em relação às sequências de aminoácidos dos polipéptidos codificados pelas sequências de nucleótidos mostradas na Figura 3.
As moléculas de ácido nucleico úteis como sondas podem ser moléculas não só de ADN mas também de ARN, preferivelmente são moléculas de ADN de cadeia simples. Estas podem ser isoladas a partir de fontes naturais ou podem ser sintetizadas de acordo com métodos conhecidos.
Como sonda de hibridização, podem-se utilizar moléculas de ácido nucleico, por exemplo, que possuem uma sequência de nucleótidos que é exactamente ou basicamente complementar de uma sequência de nucleótidos como ilustrado nas Figuras 3 e 4 ou 6a, respectivamente, ou partes destas sequências. Os fragmentos utilizados como sonda de hibridização podem ser fragmentos sintéticos que foram produzidos por métodos de síntese convencionais.
Como aqui utilizado, o termo "hibridizar" refere-se a hibridização sob condições de hibridização convencionais, preferivelmente sob condições estringentes como descrito, por exemplo, em Sambrook et ai., Molecular Cloning, A Laboratory Manual 2.a edição (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY. No entanto, em certos casos, uma molécula de ácido nucleico de hibridização pode também ser detectada a condições de hibridização de estringência inferior. Alterações na estringência de hibridização e detecção de sinal são principalmente conseguidas através da 15 ΕΡ 2 157 192/ΡΤ manipulação de concentração de formamida (percentagens inferiores de formamida resultam em estringência diminuída) , condições salinas ou temperatura. Por exemplo, condições de estringência inferiores incluem uma incubação de um dia para o outro a 37°C numa solução compreendendo SSPE 6X (SSPE 20X = NaCl 3 M; NaH2P04 9,2 M; EDTA 0,02M, pH 7,4), 0,5% de SDS, 30% de formamida, 100 pg/ml ADN bloqueador de esperma de salmão, seguindo-se lavagens a 50°C com SSPE IX, 0,1% de SDS. Adicionalmente, para conseguir estringência ainda mais baixa, as lavagens realizadas após hibridização estringente pode ser efectuadas a concentrações de sal mais elevadas (e.g. SSC 5X) . Variações nas condições acima podem ser realizadas através da inclusão e/ou substituição de reagentes bloqueadores alternativos utilizados para suprimir o fundo em experiências de hibridização. A inclusão de reagentes bloqueadores específicos pode requerer a modificação das condições de hibridização descritas acima, devido a problemas com compatibilidade. O termo "ligando", como aqui utilizado, refere-se a qualquer molécula que é capaz de se ligar especificamente a Futrina 2, permitindo assim determinar o nível de moléculas de receptor. Exemplos destas moléculas incluem anticorpos, oligonucleótidos, proteínas ou moléculas pequenas. A molécula pode ser o ligando natural de Futrinas, ou pode estar intimamente relacionado com o referido ligando, e.g., um fragmento do ligando, ou um substrato natural, um mimético estrutural ou funcional; ver, e.g., Coligan, Current Protocols in Immunology 1(2) (1991); Chapter 5. Em qualquer caso, a molécula pode ser isolada ou desenhada racionalmente utilizando técnicas conhecidas; ver também infra.
Preferivelmente, o ligando é um anticorpo. O termo "anticorpo", preferivelmente, refere-se a anticorpos que consistem essencialmente de anticorpos monoclonais reunidos com diferentes especificidades epitópicas, bem como preparações de anticorpos monoclonais distintos. Anticorpos monoclonais são preparados a partir de um antigénio contendo Futrina 1, 2, 3 ou 4 ou seus fragmentos, por métodos bem conhecidos dos peritos na especialidade (ver, e.g., Kõhler et al., Nature 256 (1975), 495). Como aqui utilizado, os termos "anticorpo" (Ab) ou "anticorpo monoclonal" (Mab) pretendem 16 ΕΡ 2 157 192/ΡΤ incluir moléculas intactas bem como fragmentos de anticorpo (tais como, por exemplo, fragmentos Fab e F(ab')2) que são capazes de se ligarem especificamente a Futrina 1, 2, 3 e/ou 4. Fragmentos Fab e F(ab')2 carecem do fragmento Fc de anticorpo intacto, desaparecem mais rapidamente da circulação, e podem ter menos ligação de tecido não específica do que um anticorpo intacto. (Wahl et al., J. Nucl. Med. 24: 316-325 (1983)). Assim, estes fragmentos são preferidos, bem como os produtos de um FAB ou outra biblioteca de expressão de imunoglobulina. Além disso, os anticorpos do presente invento incluem anticorpos quiméricos, de cadeia simples e humanizados.
Para certos propósitos, e.g. métodos de diagnóstico, a molécula de ácido nucleico utilizada como sonda ou o ligando, e.g., anticorpo, pode ser marcada de modo detectável, por exemplo, com um radioisótopo, um composto bioluminescente, um composto quimiluminescente, um composto fluorescente, um quelato de metal ou uma enzima.
As moléculas de ácido nucleico podem ser utilizadas, por exemplo, como sondas ou iniciadores nos ensaios de diagnóstico descritos abaixo e permitem, e.g., a análise da expressão de Futrina 1, 2, 3 ou 4 determinando o nível de ARNm ou a determinação de mutações dentro da região de codificação ou regiões reguladoras conduzindo a moléculas de polipéptido com actividade alterada, e.g. destruída, ou conduzindo a expressão alterada. Preferivelmente, as moléculas de ácido nucleico são oligonucleótidos possuindo um comprimento de pelo menos 10, em particular de pelo menos 15 e particularmente preferido de pelo menos 50 nucleótidos. Estas moléculas de ácido nucleico podem também ser utilizadas, por exemplo, como iniciadores para uma reacção de PCR.
Numa concretização preferida, o alvo com o qual a molécula de ácido nucleico se hibridiza é um ARNm. É também proporcionado um método de diagnóstico de uma doença associada a (a) expressão aberrante de Futrina 1, 2, 3 ou 4 e/ou (b) actividades ou quantidades aberrantes de um polipéptido Futrina 1, 2, 3 ou 4 num sujeito compreendendo: 17 ΕΡ 2 157 192/ΡΤ (a) determinar (a) a quantidade de expressão de Futrina 1, 2, 3 ou 4 e/ou (b) a quantidade de polipéptido Futrina 1, 2, 3 e/ou 4 biologicamente activo numa amostra biológica; e (b) diagnosticar uma doença associada a (a) expressão aberrante de Futrina 1, 2, 3 e/ou 4 e/ou (b) actividades ou quantidades aberrantes de um polipéptido Futrina 1, 2, 3 e/ou 4 ou um risco para o desenvolvimento de uma tal doença com base numa quantidade de expressão alterada de Futrina 1, 2, 3 e/ou 4 e/ou (b) actividades ou quantidades alteradas de polipéptido Futrina 1, 2, 3 e/ou 4 biologicamente activo em comparação com um controlo.
Formatos de ensaio adequados são bem conhecidos de um perito na especialidade e, adicionalmente, são aqui descritos abaixo. Amostras de controlo positivo adequadas expressando proteínas Futrina de humano são, e.g., células HEK 293. 0 polipéptido Futrina 1, 2, 3 ou 4 ou o ARNm correspondente, e.g. em fluidos biológicos ou tecidos, pode ser detectado directamente in situ, e.g. por hibridização in situ, ou pode ser isolado a partir de outros componentes celulares por métodos comuns conhecidos dos peritos na especialidade antes do contacto com uma sonda. Métodos de detecção incluem análise Northern Blot, protecção de RNase, métodos in situ, e.g. hibridização in situ, métodos de amplificação in vitro (PCR, LCR, replicase QRNA ou ARN-transcrição/amplificação (TAS, 3SR), dot blot reversa revelada na EP-B1 0 237 362), imunoensaios, Western Blot e outros ensaios de detecção que são conhecidos dos peritos na especialidade. A sonda (e.g. um anticorpo específico ou oligonucleótido específico) da composição de diagnóstico pode ser marcada de modo detectável. Numa concretização preferida, a referida composição de diagnóstico contém um anticorpo anti-Futrina 1, 2, 3 e/ou 4 e permite o referido diagnóstico, e.g., por ELISA e contém o anticorpo ligado a um suporte sólido, por exemplo, uma placa de microtitulação de poliestireno ou papel de nitrocelulose, utilizando técnicas conhecidas na 18 ΕΡ 2 157 192/ΡΤ especialidade. Alternativamente, as referidas composições de diagnóstico são baseadas num RIA e contêm o referido anticorpo marcado com um isótopo radioactivo. Marcadores adequados para ensaios de anticorpo são conhecidos na especialidade e incluem marcadores enzimáticos, tais como, glucose-oxidase, e radioisótopos, tais como iodo (125I, 121I), carbono (14C) , enxofre (35S) , tritio (3H) , indio (112In) e tecnécio rodamina, e biotina. Para além de ensaiar os niveis de Futrina numa amostra biológica, o polipéptido pode também ser detectado in vivo por imagiologia. Traçadores ou marcadores de anticorpo para imagiologia de proteínas in vivo incluem aqueles detectáveis por radiografia de raios-X, RMN ou ESR. Para radiografia de raios X, marcadores adequados incluem radioisótopos tais como bário ou césio, que emitem radiação detectável mas não são manifestamente prejudiciais para o sujeito. Marcadores adequados para RMN e ESR incluem aqueles com um spin característico, tais como deutério, que podem ser incorporados no anticorpo por marcação de nutrientes para o hibridoma relevante. Um anticorpo ou fragmento de anticorpo específico de proteína que foi marcado com uma porção de imagiologia detectável apropriada, tal como um radioisótopo (por exemplo, 131I, 112In, 99mTc) , uma substância radiopaca, ou um material detectável por ressonância magnética nuclear, é introduzido (por exemplo, parentericamente, subcutaneamente ou intraperitonealmente) no mamífero. Deverá ser entendido na especialidade que o tamanho do sujeito e o sistema de imagiologia utilizado determinarão a quantidade de porção necessária para produzir imagens de diagnóstico. No caso de uma porção de radioisótopo, para um sujeito humano, a quantidade de radioactividade injectada estará normalmente no intervalo de cerca de 5 a 20 milicuries de "mTc. O anticorpo ou fragmento de anticorpo marcado acumular-se-á depois preferivelmente na localização de células que contêm o polipéptido Futrina específico. A imagiologia de tumores in vivo é descrita, e.g., em S.W. Burchiel et al., Immunopharmacokinetics of Radiolabeled Antibodies and Their Fragments". (Chapter 13 em Tumour Imaging: The Radiochemical Detection of Câncer, S.W. Burchiel e B.A. Rhodes, eds., Masson Publishing Inc. (1982)). 19 ΕΡ 2 157 192/ΡΤ É descrito um método para identificar um parceiro de ligação a um polipéptido Futrina 1, 2, 3 e/ou 4 compreendendo: a) pôr em contacto o referido polipéptido com um composto a ser rastreado; e b) determinar se o composto afecta uma actividade do polipéptido . 0 invento inclui também um método de identificação de compostos que se ligam a um polipéptido Futrina 2 compreendendo os passos de: a) incubar um composto de ligação candidato com o referido polipéptido; e b) determinar se a ligação ocorreu.
Os polipéptidos Futrina 1, 2, 3 ou 4 podem ser utilizados para rastrear proteínas ou outros compostos que se ligam a Futrina 1, 2, 3 ou 4 ou para rastrear proteínas ou outros compostos que aos quais Futrina 1, 2, 3 e/ou 4 se ligam. A ligação de Futrina 1, 2, 3 ou 4 e a molécula podem activar (agonista), aumentar, inibir (antagonista) ou diminuir a actividade de Futrina 1, 2, 3 ou 4 ou da molécula ligada. Exemplos destas moléculas incluem anticorpos, oligonucleótidos, proteínas (e.g., ligandos), ou moléculas pequenas.
Vantajosamente a molécula está intimamente relacionada com o ligando natural de Futrina 1, 2, 3 ou 4, e.g., um fragmento do ligando, ou um substrato natural, um ligando, um mimético estrutural ou funcional; ver, e.g., Coligan, Current Protocols in Immunology 1(2) (1991); Chapter 5. 0 rastreio destas moléculas envolve produzir células apropriadas que expressam Futrina 1, 2, 3 e/ou 4 quer como uma proteína segregada quer sobre a membrana celular. Células preferidas incluem células a partir de mamíferos, levedura, Drosophila ou E. coli. Células que expressam Futrina 1, 2, 3 e/ou 4 (ou membrana celular contendo o polipéptido expresso) são depois preferivelmente postas em contacto com um composto de teste contendo potencialmente a molécula para observar ligação, estimulação ou inibição de actividade de Futrina 1, 2, 3 e/ou 4. 20 ΕΡ 2 157 192/ΡΤ Ο ensaio pode simplesmente testar a ligação de um composto candidato a Futrina 1, 2, 3 e/ou 4, onde a ligação é detectada por um marcador, ou num ensaio envolvendo a competição com um competidor marcado. Adicionalmente, o ensaio pode testar se o composto candidato resulta num sinal gerado por ligação a Futrina 1, 2, 3 e/ou 4. Ensaios adequados para analisar a actividade de Futrina 1, 2, 3 e/ou 4 incluem ensaios de repórter de luciferase induzivel por Wnt em células HEK 293 transfectadas, onde Futrina 1, 2, 3 e/ou 4 induzem sinergias com Wnt para melhorar um sinal induzido por Wnt, tal como se mostra na Figura 4.
Alternativamente, o ensaio pode ser realizado utilizando preparações isentas de células, polipéptidos/moléculas afixadas a um suporte sólido, bibliotecas químicas ou misturas de produtos naturais. 0 ensaio pode também compreender simplesmente os passos de misturar um composto candidato com uma solução contendo Futrina 1, 2, 3 e/ou 4, medir a actividade ou ligação de Futrina/molécula e comparar a actividade ou ligação de Futrina/molécula com um padrão.
Um ensaio ELISA pode medir o nível ou actividade de Futrina 1, 2, 3 e/ou 4 numa amostra (e.g., amostra biológica) utilizando um anticorpo monoclonal ou policlonal. 0 anticorpo pode medir o nível ou actividade de Futrina 1, 2, 3 e/ou 4 quer por ligação, directamente ou indirectamente, a Futrina 1, 2, 3 e/ou 4 quer por competição com Futrina 1, 2, 3 e/ou 4 por um substrato. Todos estes ensaios anteriores podem ser utilizados como marcadores de diagnóstico ou prognóstico. As moléculas identificadas utilizando estes ensaios podem ser utilizadas para tratar uma doença ou para conseguir um resultado particular num paciente (e.g., eliminação de um tumor, suporte de processos regenerativos etc.) por modulação, preferivelmente activação da molécula Futrina 1, 2, 3 e/ou 4. Além disso, os ensaios podem identificar agentes que podem inibir ou melhorar a produção de Futrina 1, 2, 3 e/ou 4 a partir de células ou tecidos manipuladas adequadamente. 21 ΕΡ 2 157 192/ΡΤ
Além disso, ο invento inclui um método de identificação de activadores/agonistas ou inibidores/antagonistas de um polipéptido Futrina 2 compreendendo os passos de: a. incubar um composto candidato com o referido polipéptido; b. ensaiar uma actividade biológica, e c. determinar se uma actividade biológica do referido polipéptido foi alterada.
Ensaios adequados para analisar a actividade de Futrina 2 incluem ensaios de repórter de luciferase induzivel por Wnt em células HEK 293 transf ectadas, onde a Futrina 2 induz sinergias com Wnt para melhorar um sinal induzido por Wnt, tal como se mostra na Figura 5.
Numa concretização adicional, o presente invento refere-se a um método de identificação e obtenção de um fármaco candidato para terapia de doenças associadas a (a) expressão aberrante de Futrina 2, e/ou (b) actividades ou quantidades aberrantes de um polipéptido Futrina 2 compreendendo os passos de a) pôr em contacto um polipéptido Futrina 2 ou uma célula expressando o referido polipéptido, e opcionalmente o(s) ligando(s) correspondente (s) na presença de componentes capazes de proporcionar um sinal detectável em resposta à ligação ao referido fármaco candidato a ser rastreado; e b) detectar a presença ou ausência de um sinal ou aumento do sinal gerado, onde a presença ou aumento do sinal é indicativa de um fármaco putativo.
Ensaios para analisar a actividade de Futrina 2 são ensaios de repórter de luciferase induzivel por Wnt em células HEK 293 transfectadas, onde a Futrina 2 induz sinergias com Wnt para melhorar um sinal induzido por Wnt, tal como se mostra na Figura 5. 0 fármaco candidato pode ser um composto individual ou uma pluralidade de compostos. 0 termo "pluralidade de compostos" num método do invento deve ser entendido como uma pluralidade de substâncias que podem ser ou não ser idênticas. 22 ΕΡ 2 157 192/ΡΤ Ο referido composto ou pluralidade de compostos podem ser sintetizados quimicamente ou produzidos microbiologicamente e/ou compreendidos, por exemplo, em amostras, e.g., extractos celulares, e.g., de plantas, animais ou microorganismos. Adicionalmente, o(s) referido(s) composto(s) podem ser conhecidos na especialidade mas até agora não conhecidos como capazes de suprimir ou activar polipéptidos Futrina 2. A mistura reaccional pode ser um extracto livre de células ou pode compreender uma cultura de células ou tecido. Configurações adequadas para o método do invento são conhecidas do perito na especialidade e são geralmente descritas, por exemplo, em Alberts et al., Molecular Biology of the Cell, terceira edição (1994) e nos exemplos apensos. A pluralidade de compostos pode ser, e.g., adicionada à mistura reaccional, meio de cultura, injectada numa célula ou de outro modo aplicada a um animal transgénico. As células ou tecidos que podem ser utilizados no método do invento preferivelmente são preferivelmente uma célula de hospedeiro, uma célula de mamífero ou um animal transgénico não humano.
Se uma amostra contendo um composto ou uma pluralidade de compostos for identificada no método do invento, então é possível isolar o composto a partir da amostra original identificada como contendo o composto capaz de suprimir ou activar um polipéptido Futrina 2, ou pode-se subdividir adicionalmente a amostra original, por exemplo, se esta consistir de uma pluralidade de compostos diferentes, de modo a reduzir o número de substâncias diferentes por amostra e repetir o método com as subdivisões da amostra original. Dependendo da complexidade das amostras, os passos descritos acima podem ser realizados várias vezes, preferivelmente até a amostra identificada de acordo com o método do invento compreender apenas um número limitado de substâncias ou apenas uma. Preferivelmente a referida amostra compreende substâncias de propriedades químicas e/ou físicas similares, e muito preferivelmente as referidas substâncias são idênticas. Vários métodos são conhecidos dos peritos na especialidade para produzir e rastrear grandes bibliotecas 23 ΕΡ 2 157 192/ΡΤ para identificar compostos possuindo afinidade especifica por um alvo. Estes métodos incluem o método de exibição de fago no qual péptidos randomizados são exibidos a partir de fago e rastreadas por cromatografia de afinidade em relação a um receptor imobilizado; ver, e.g., WO 91/17271, WO 92/01047, US-A-5 223 409. Noutra abordagem, são sintetizadas bibliotecas combinatórias de polímeros imobilizados sobre um chip utilizando fotolitografia; ver, e.g., US-A-5 143 854, WO 90/15070 e WO 92/10092. Os polímeros imobilizados são postos em contacto com um receptor marcado e pesquisados quanto ao marcador para identificar polímeros que se ligam ao receptor. A síntese e rastreio de bibliotecas peptídicas sobre suportes de membranas de celulose continuas que podem ser utilizadas para identificação ligandos de ligação dos polipéptidos Futrina 2 e, assim, inibidores e activadores possíveis, são descritos, por exemplo, em Kramer, Methods Mol. Biol. 87 (1998), 25-39. Este método pode também ser utilizado, por exemplo, para determinação dos locais de ligação e dos motivos de reconhecimento no polipéptido Futrina 2. De modo análogo, determinaram-se a especificidade por substrato do chaperon DnaK e os locais de contacto entre interleucina-β de humano e o seu receptor; ver Rudiger, EMBO J. 16 (1997), 1501-1507 e Weiergraber, FEBS Lett. 379 (1996), 122-126, respectivamente. Para além disso, os métodos acima mencionados podem ser utilizados para a construção de supertopos de ligação derivados do polipéptido Futrina 2. Uma abordagem similar foi descrita com sucesso para antigénios de péptido do anticorpo monoclonal anti-p24 (HIV-1); ver Kramer, Cell 91 (1997), 799-809. Uma via geral para análise de impressão digital de interacções péptido-anticorpo utilizando a biblioteca de péptidos de aminoácidos agregados foi descrita em Kramer, Mol. Immunol. 32 (1995), 459-465. Adicionalmente, antagonistas de um polipéptido Futrina 2 podem ser derivados e identificados a partir de anticorpos monoclonais que especificamente reagem com um polipéptido Futrina 2 de acordo com os métodos como descrito em Doring, Mol. Immunol. 31 (1994), 1059-1067. Todos estes métodos podem ser utilizados de acordo com o presente invento para identificar activadores/agonistas e inibidores/antagonistas de um polipéptido Futrina 2. 24 ΕΡ 2 157 192/ΡΤ
Podem-se utilizar várias fontes para a estrutura básica de um tal activador ou inibidor e compreendem, por exemplo, análogos miméticos de um polipéptido Futrina 2. Análogos miméticos de um polipéptido Futrina 2 ou seus fragmentos biologicamente activos podem ser gerados, por exemplo, substituindo os aminoácidos que se espera serem essenciais para a actividade biológica por, e.g., estereoisómeros, i.e. D-aminoácidos; ver e.g., Tsukida, J. Med. Chem. 40 (1997), 3534-3541. Para além disso, no caso de se utilizarem fragmentos para o desenho de análogos biologicamente activos, componentes pró-miméticos podem ser incorporados num péptido para reestabelecer pelo menos algumas das propriedades conformacionais que podem ter sido perdidas na remoção de parte do polipéptido original; ver, e.g., Nachman, Regul. Pept. 57 (1995), 359-370. Para além disso, um polipéptido Futrina 2 pode ser utilizado para identificar miméticos de péptido químicos sintéticos que se ligam a ou podem funcionar como um ligando, substrato ou parceiros de ligação dos referidos polipéptido(s) tão eficazmente quanto o polipéptido natural; ver, e.g., Engleman, J. Clin. Invest. 99 (1997), 2284-2292. Por exemplo, podem ser realizadas simulações de dobragem e redesenho de computador de motivos estruturais de um polipéptido Futrina 2 utilizando programas de computador apropriados (Olszewski, Proteins 25 (1996), 286-299; Hoffman, Comput. Appl. Biosci. 11 (1995), 675-679). A modelação em computador da dobragem de proteínas pode ser utilizada para a análise conformacional e energética de modelos detalhados de péptido e proteína (Monge, J. Mol. Biol. 247 (1995), 995-1012; Renouf, Adv. Exp. Med. Biol. 376 (1995), 37-45). Em particular, os programas apropriados podem ser utilizados para a identificação de locais interactivos de um polipéptido Futrina 2 e seu ligando ou outras proteínas interactuantes por pesquisas assistidas por computador para as sequências peptídicas complementares (Fassina, Immunomethods 5 (1994), 114-120). Sistemas de computador apropriados adicionais para o desenho de proteínas e péptidos são descritos na especialidade anterior, por exemplo em Berry, Biochem. Soc. Trans. 22 (1994), 1033-1036; Wodak, Ann. N. Y. Acad. Sei. 501 (1987), 1-13; Pabo, Biochemistry 25 (1986), 5987-5991. Os resultados obtidos a partir da análise de computador acima descrita podem ser utilizados, e.g., para a preparação de miméticos de péptido de um polipéptido Futrina 2 ou seus 25 ΕΡ 2 157 192/ΡΤ fragmentos. Estes análogos de pseudopéptido da sequência de aminoácidos natural da proteína podem mimetizar muito eficientemente a proteína parental (Benkirane, J. Biol. Chem. 271 (1996), 33218-33224). Por exemplo, a incorporação de resíduos aminoácido ω aquirais facilmente disponíveis num polipéptido Futrina 2 ou num seu fragmento resulta na substituição de ligações amida por unidades polimetileno de uma cadeia alifática, proporcionando por isso uma estratégia conveniente para construção de um mimético de péptido (Banerjee, Biopolymers 39 (1996), 769-777). São descritos na especialidade anterior análogos de peptidomimético superactivos de hormonas de péptido pequeno noutros sistemas (Zhang, Biochem. Biophys. Res. Commun. 224 (1996), 327-331). Miméticos de péptido de um polipéptido Futrina 2 podem também ser identificados pela síntese de bibliotecas combinatórias de miméticos de péptido através de alquilação de amida sucessiva e ensaio dos compostos resultantes, e.g., quanto às suas propriedades de ligação e imunológicas. Métodos para geração e utilização de bibliotecas combinatórias de peptidomiméticos estão descritos na especialidade anterior, por exemplo em Ostresh, Methods in Enzymology 267 (1996), 220-234 e Dorner, Bioorg. Med. Chem. 4 (1996), 709-715. Adicionalmente, pode-se utilizar uma estrutura tridimensional e/ou cristalográfica de um polipéptido Futrina 2 para o desenho de miméticos de péptido, inibidores da actividade biológica do polipéptido (Rose, Biochemistry 35 (1996), 12933-12944; Rutenber, Bioorg. Med. Chem. 4 (1996), 1545-1558). É também bem conhecido de um perito na especialidade, que é possível desenhar, sintetizar e avaliar miméticos de compostos orgânicos pequenos que, por exemplo, podem actuar como um substrato ou ligando para um polipéptido Futrina 2. Por exemplo, foi descrito que miméticos de D-glucose de hapalosina exibiram eficiência similar à da hapalosina em antagonizar proteína associada ao desenvolvimento de resistência a múltiplos fármacos em citotoxicidade; ver Dinh, J. Med. Chem. 41 (1998), 981-987. A molécula de ácido nucleico codificando um polipéptido Futrina 2 pode também servir como um alvo para activadores e inibidores. Activadores podem compreender, por exemplo, 26 ΕΡ 2 157 192/ΡΤ proteínas que se ligam ao ARNm de um gene codificando um polipéptido Futrina 2, estabilizando por isso a conformação nativa do ARNm e facilitando a transcrição e/ou tradução, e.g., de um modo semelhante à actuação da proteína Tat sobre ARN de HIV. Adicionalmente, estão descritos na literatura métodos para identificação de moléculas de ácido nucleico tais como um fragmento de ARN que mimetiza a estrutura de uma molécula de ARN alvo definida ou indefinida à qual um composto se liga no interior de uma célula, resultando em retardamento do crescimento celular ou em morte celular; ver, e.g., WO 98/18947 e referências ai citadas. Estas moléculas de ácido nucleico podem ser utilizadas para identificação de compostos desconhecidos de interesse farmacêutico, e para identificação de alvos de ARN desconhecidos para utilização no tratamento de uma doença. Estes métodos e composições podem ser utilizados para rastreio de novos compostos ou para identificação de compostos úteis para alterar níveis de expressão de polipéptidos codificados por uma molécula de ácido nucleico. Alternativamente, por exemplo, a estrutura conformacional do fragmento de ARN que mimetiza o local de ligação pode ser utilizada no desenho racional de fármacos para modificar fármacos conhecidos, para fazer com que estes se liguem mais avidamente ao alvo. Uma tal metodologia é a ressonância magnética nuclear (RMN), que é útil para identificar estruturas conformacionais de fármacos e de ARN. Ainda outros métodos são, por exemplo, os métodos de desenho de fármacos como descritos em WO 95/35367, US-A-5 322 933, onde a estrutura cristalina do fragmento de ARN pode ser deduzida e são utilizados programas de computador para desenhar novos compostos de ligação.
Os compostos que podem ser testados e identificados de acordo com um método do invento podem ser bibliotecas de expressão, e.g., bibliotecas de expressão de ADNc, péptidos, proteínas, ácidos nucleicos, anticorpos, compostos orgânicos pequenos, hormonas, peptidomiméticos, PNAs ou outros (Milner, Nature Medicine 1 (1995), 879-880; Hupp, Cell 83 (1995), 237-245; Gibbs, Cell 79 (1994), 193-198 e referências citadas supra). Para além disso, genes codificando um regulador putativo de um polipéptido Futrina 2 e/ou que exercem os seus efeitos a montante ou a jusante de um polipéptido Futrina 2 podem ser identificados utilizando, por exemplo, mutagénese 27 ΕΡ 2 157 192/ΡΤ de inserção utilizando, por exemplo, vectores de direccionamento a genes conhecidos na especialidade. Os referidos compostos podem também ser derivados ou análogos funcionais de inibidores ou activadores conhecidos. Estes compostos úteis podem ser por exemplo factores de transacção que se ligam a um polipéptido Futrina 2 ou sequências reguladoras do gene codificando o mesmo. A identificação de factores de transacção pode ser realizada utilizando métodos padrão na especialidade (ver, e.g., Sambrook, supra). Para determinar se uma proteína se liga à própria proteína ou a sequências reguladoras, podem ser realizadas análises de desvios em gel (gelshift) nativo padrão. De modo a identificar um factor de transacção que se liga à proteína ou a uma sequência reguladora, a proteína ou sequência reguladora pode ser utilizada como um reagente de afinidade em métodos padrão de purificação de proteína, ou como uma sonda para rastreio de uma biblioteca de expressão. A identificação de moléculas de ácido nucleico que codificam polipéptidos que interactuam com um polipéptido Futrina 2 descrito acima pode também conseguida, por exemplo, como descrito em Scofield (Science 274 (1996), 2063-2065) por utilização do assim denominado "sistema de dois híbridos" de levedura. Neste sistema o polipéptido Futrina 2 ou uma sua parte mais pequena é ligado ao domínio de ligação de ADN do factor de transcrição de GAL4. Uma estirpe de levedura expressando este polipéptido de fusão e compreendendo um gene de repórter lacZ actuado por um promotor apropriado, que é reconhecido pelo factor de transcrição de GAL4, é transformado com uma biblioteca de ADNc que irão expressar proteínas de planta ou seus péptidos fundidos a um domínio de activação. Assim, se um péptido codificado por um dos ADNc é capaz de interactuar com o péptido de fusão compreendendo um péptido de um polipéptido Futrina 2, o complexo é capaz de dirigir a expressão do gene repórter. Deste modo as moléculas de ácido nucleico codificando Futrina 2 respectivamente, e o péptido codificado, podem ser utilizadas para identificar péptidos de proteínas interactuando com um polipéptido Futrina 2.
Uma vez identificado o factor de transacção, a modulação da sua ligação ou a regulação de expressão de um polipéptido Futrina 2 podem ser prosseguidos, começando, por exemplo, com 28 ΕΡ 2 157 192/ΡΤ ο rastreio de inibidores contra a ligação do factor de transacção a um polipéptido Futrina 2. A activação ou a repressão de um polipéptido Futrina 2 poderão ser conseguidas em animais aplicando o factor de transacção (ou o seu inibidor) ou o gene codificando o mesmo, e.g. num vector de expressão. Adicionalmente, se a forma activa do factor de transacção é um dimero, poderão ser preparados mutantes negativos dominantes do factor de transacção de modo a inibir a sua actividade. Para além disso, pela identificação do factor de transacção, podem depois ser identificados componentes adicionais na cascata de sinal conduzindo a activação (e.g. transdução de sinal) ou a repressão de um gene envolvido no controlo de um polipéptido Futrina 2. A modulação das actividades destes componentes pode depois ser prosseguida, de modo a desenvolver fármacos e métodos adicionais para modulação do metabolismo da degradação de proteína em animais. Assim, é também descrita a utilização do sistema de dois híbridos como definido acima para a identificação de activadores ou inibidores de um polipéptido Futrina 2.
Os compostos isolados pelos métodos acima servem também como compostos guia para o desenvolvimento de compostos análogos. Os análogos deverão ter uma configuração electrónica estabilizada e uma conformação molecular que permite que grupos funcionais chave sejam apresentados a um polipéptido Futrina 2 ou seu ligando substancialmente do mesmo modo que o composto guia. Em particular, os compostos análogos possuem propriedades electrónicas que são comparáveis com a região de ligação, mas podem ser moléculas mais pequenas do que o composto guia, frequentemente possuindo um peso molecular inferior a cerca de 2 kD e preferivelmente inferior a cerca de 1 kD. A identificação de compostos análogos pode ser realizada através da utilização de técnicas tais como análise de campo auto-consistente (SCF, self-consistent field) , análise de interacção de configuração (Cl) e análise dinâmica de modo normal. Estão disponíveis programas de computador para implementar estas técnicas; e.g., Rein, Computer-Assisted Modeling of Receptor-Ligand Interactions (Alan Liss, New York, 1989). Métodos para a preparação de derivados químicos e análogos são bem conhecidos dos peritos na especialidade e são descritos, por 29 ΕΡ 2 157 192/ΡΤ exemplo, em Beilstein, Handbook of Organic Chemistry, Springer edition New York Inc., 175 Fifth Avenue, New York, N.Y. 10010 U.S.A. e Organic Synthesis, Wiley, New York, USA. Para além disso, os referidos derivados e análogos podem ser testados quanto aos seus efeitos de acordo com métodos conhecidos na especialidade; ver também supra. Para além disso, podem-se utilizar peptidomiméticos e/ou desenho assistido por computador de derivados e análogos apropriados, por exemplo, de acordo com os métodos descritos acima.
Uma vez identificado e obtido o composto descrito, este é preferivelmente fornecido numa forma terapeuticamente aceitável.
Por conseguinte, é descrita uma composição farmacêutica compreendendo uma molécula de ácido nucleico codificando um polipéptido Futrina 2, um polipéptido Futrina 2 ele próprio, vector recombinante (por exemplos, ver abaixo), anticorpo, activador/agonista, inibidor/antagonista e/ou parceiro de ligação de um polipéptido Futrina 2 e um excipiente, diluente ou transportador farmaceuticamente aceitável.
Para fins terapêuticos, o polipéptido Futrina 2 é produzido de modo recombinante por utilização das sequências de ácido nucleico que se mostram nas Figuras 1 e 2. Vectores adequados para expressão recombinante são conhecidos do perito na especialidade. Preferivelmente, estes são plasmideos, cosmideos, vírus, bacteriófagos e outros vectores habitualmente utilizados no campo da engenharia genética. Vectores adequados para utilização incluem, mas não estão limitados ao vector de expressão baseado em T7 para expressão em células de mamífero e vectores derivados de baculovírus para expressão em células de insecto. Preferivelmente, a molécula de ácido nucleico é ligada operativamente aos elementos reguladores no vector recombinante que garantem a transcrição e síntese de um ARNm em células procarióticas e/ou eucarióticas que pode ser traduzido. A sequência de nucleótidos a ser transcrita pode ser ligada operavelmente a um promotor tal como um promotor de T7, metalotioneina I ou poliedrina. As células hospedeiras utilizadas para expressão recombinante são células procarióticas ou eucarióticas, por exemplo células de mamífero, células bacterianas, células de 30 ΕΡ 2 157 192/ΡΤ insecto ou células de levedura. O polipéptido é isolado a partir das células cultivadas e/ou do meio de cultura. 0 isolamento e purificação do polipéptido produzido de modo recombinante pode ser realizado por meios convencionais incluindo cromatografia preparativa e separações por afinidade e imunológicas utilizando, e.g., um anticorpo anti-Futrina 2, ou, e.g., pode ser substancialmente purificado pelo método num só passo descrito em Smith e Johnson, Gene 67; 31-40 (1988) .
Exemplos de transportadores farmacêuticos adequados etc. são bem conhecidos na especialidade e incluem soluções salinas tamponadas com fosfato, água, emulsões, tais como emulsões de óleo/água, vários tipos de agentes molhantes, soluções estéreis etc. Estes transportadores podem ser formulados por métodos convencionais e podem ser administrados ao sujeito numa dose adequada. A administração das composições adequadas pode ser efectuada por diferentes vias, e.g. por administração intravenosa, intraperitoneal, subcutânea, intramuscular, tópica ou intradérmica. A via de administração depende, obviamente, da natureza da doença e do tipo de composto contido na composição farmacêutica. O regime de dosagem será determinado pelo médico assistente e por outros factores clínicos. Como é bem conhecido nas especialidades médicas, a dosagem para qualquer paciente depende de muitos factores, incluindo o tamanho, área superficial corporal, idade, sexo do paciente, o composto particular a ser administrado, o tempo e via de administração, o tipo e fase da doença, e.g., tumor, estado de saúde geral e outros fármacos que estão a ser administrados concorrentemente. A entrega das moléculas de ácido nucleico codificando um polipéptido Futrina 2 pode ser conseguida por aplicação directa ou, preferivelmente, utilizando um vector de expressão recombinante tal como um vírus quimérico contendo estes compostos ou um sistema de dispersão coloidal. A aplicação directa ao local alvo pode ser realizada, e.g., por entrega balística, como um sistema de dispersão coloidal ou por cateter a um local numa artéria. Os sistemas de dispersão coloidal que podem ser utilizados para entrega das moléculas de ácidos nucleicos anteriores incluem complexos de 31 ΕΡ 2 157 192/ΡΤ macromolécula, nanocápsulas, microsferas, pérolas e sistemas baseados em lípido incluindo emulsões de óleo em água (mistas), micelas, lipossomas e lipoplexos. 0 sistema coloidal preferido é um lipossoma. Podem ser utilizados lipossomas específicos de órgãos ou específicos de células de modo a conseguir a entrega apenas ao tecido desejado. 0 direccionamento de lipossomas pode ser realizado pelo perito na especialidade por aplicação de métodos vulgarmente conhecidos. Este direccionamento inclui direccionamento passivo (utilizando a tendência natural dos lipossomas para distribuição às células do RES em órgãos que contêm capilares sinusoidais) ou direccionamento activo (por exemplo por acoplamento do lipossoma a um ligando especifico, e.g., um anticorpo, um receptor, açúcar, glicolípido, proteína etc., por métodos bem conhecidos). Utilizam-se preferivelmente anticorpos monoclonais para direccionar lipossomas a tecidos específicos, e.g. tecido de tumor, através de ligandos específicos da superfície celular.
Vectores recombinante úteis para terapia génica são vectores virais, e.g. adenovírus, vírus herpes, vacínia, ou, mais preferivelmente, um vírus de ARN tal como um retrovírus. Ainda mais preferivelmente, o vector retroviral é um derivado de um retrovírus murino ou aviário. Exemplos destes vectores retrovirais que podem ser utilizado são: vírus da leucemia de murino de Moloney (MoMuLVj, vírus de sarcoma murino de Harvey (HaMuSV), vírus de tumor mamário de murino (MuMTVj e vírus de sarcoma de Rous (RSV). Muito preferivelmente, utiliza-se um vector retroviral de primata não humano, tal como o vírus de leucemia de macaco gibão (GaLVj, proporcionando uma gama de hospedeiros mais vasta em comparação com os vectores de murino. Uma vez que estes retrovírus recombinantes são deficientes, é necessária assistência de modo a produzir partículas infecciosas. Esta assistência pode ser proporcionada, e.g., utilizando linhas de células auxiliares que contêm plasmídeos codificando todos os genes estruturais do retrovírus sob o controlo de sequências reguladoras dentro da LTR. Linhas de células auxiliares adequadas são bem conhecidas dos peritos na especialidade. Os referidos vectores podem conter adicionalmente um gene codificando um marcador seleccionável tal que as células transduzidas podem ser identificadas. Para além disso, os vectores retrovirais 32 ΕΡ 2 157 192/ΡΤ podem ser modificados de um modo tal que se tornam específicos do alvo. Isto pode ser conseguido, e.g., por inserção de um polinucleótido codificando um açúcar, um glicolípido ou uma proteína, preferivelmente um anticorpo. Os peritos na especialidade conhecem métodos adicionais para gerar vectores específicos de alvos. Vectores e métodos adequados adicionais para terapia génica in vitro ou in vivo são descritos na literatura e são conhecidos dos peritos na especialidade; ver, e.g., WO 94/29469 ou WO 97/00957.
De modo a conseguir a expressão apenas no órgão alvo, e.g., um tumor a ser tratado, as moléculas de ácido nucleico codificando um polipéptido Futrina 2 podem ser ligadas a um promotor específico de tecido e utilizadas para terapia génica. Estes promotores são bem conhecidos dos peritos na especialidade (ver e.g. Zimmermann et al., (1994) Neuron 12, 11-24; Vidal et al.; (1990) EMBO J. 9, 833-840; Mayford et al., (1995), Cell 81, 891-904; Pinkert et al., (1987) Genes & Dev. 1, 268-76). 0 presente invento refere-se também à utilização dos compostos do invento acima para a preparação de uma composição farmacêutica para tratamento de uma doença associada a (a) expressão aberrante de Futrina 2 e/ou de genes envolvidos na cascata de sinal de Wnt, e/ou (b) actividades ou quantidades aberrantes de um polipéptido Futrina 2 e/ou de um polipéptido envolvido na cascata de sinal de Wnt. Numa concretização preferida, a referida doença é uma doença ou tumor do rim, osso ou músculo, preferivelmente cancro da mama, um carcinoma do cólon ou um melanoma.
Por último, o presente invento refere-se à utilização de uma molécula de nucleótido codificando um polipéptido possuindo uma actividade biológica de polipéptido Futrina 2, um activador/agonista de um polipéptido Futrina 2 ou parceiro de ligação do(s) referido(s) polipéptido(s) para a preparação de uma composição farmacêutica para inibir a cascata de sinal de Wnt o que poderá ser útil para suportar processos regenerativos num paciente, e.g. crescimento de tecidos tais como músculo, osso, cabelo, etc. 33 ΕΡ 2 157 192/ΡΤ
Os exemplos seguintes ilustram o invento.
Exemplo 1
Materiais e métodos (A) Isolação de Futrinas (= R-espondinas) e construções
Utilizou-se uma biblioteca de ADNc de olho de Xenopus adulto em pCS2+ para preparar fracções de cerca de 250
colónias. ADN de plasmídeo a partir de cada fracção foi transfectado transientemente em células 293T em conjunto com o receptor de Wnt frizzled8, o repórter de Wnt TOPFLASH (Korinek et al., Science 275 (1997), 1784-7) e pRL-TK (Promega) utilizando o reagente de transfecção FuGENE6 (Roche). O ensaio de luciferase foi realizado 24 horas após transfecção. Um clone positivo foi isolado a partir da fracção por selecção sib. ADNc de Rspo2 e 3 de humano foram obtidos a partir de RZPD. Fragmentos de hRspol e 4 foram amplificados por RT-PCR a partir de ARNm de células 293T e utilizados como sondas de hibridização. Rspol e 2 de ratinho a todo o comprimento foram isolados a partir de uma
biblioteca de ADNc de embrião de ratinho ao dia 13,5. A sequência de Rspo3 de X. tropicalis foi obtida a partir da base de dados do Sanger Institute e um fragmento de ADNc foi clonado por RT-PCR a partir de embriões de X. tropicalis. As construções marcadas C-terminalmente com Myc ou FLAG e todas as construções de deleção foram criadas por PCR. Rspo2AC de Xenopus foi clonado por deleção dos últimos 37 aminoácidos. Os ADNc de Rspo3 foram clonados em vectores pCS2+ e Bluescript para utilização em expressão génica e como sondas, respectivamente. (B) Cultura de células, proteínas recombinantes e ensaios de repórter de luciferase
Linhas de células HER293T, SHEP e HeLa foram mantidas em DMEM, 10% de FCS e 10% de CO2. Meio condicionado de Rspo2AC de Xenopus foi produzido por transfecção transiente em células 293T. Meio condicionado de Wnt3a de ratinho foi produzido a partir de células L de ratinho transfectadas de modo estável com Wnt3a (ATCC#CRL-2647) (Shibamoto et al., 34 ΕΡ 2 157 192/ΡΤ
Genes Cells 3 (1998), 659-670). Os ensaios de repórter de luciferase em células 293T foram realizados em placas de 96 poços como descrito (Wu et al. , Curr. Biol. 10 (2000), 1611-1614). Os ensaios de repórter de luciferase em células HeLa foram realizados em placas de 24 poços em triplicados utilizando reagente de transfecção Lipofectamine Plus (Invitrogen). Por poço foi transfectado um total de 400 ng de ADN, incluindo 80 ng de 7lef-fos-Luc (Novak et al., PNAS 95 (1998), 4374-4379), 10 ng de pRL-TK, 10 ng de frizzled8 de ratinho, 2 ng lefl de ratinho e 300 ng ADN de plasmideo pSuper. Decorridos 3 dias após a transfecção, adicionou-se quer meio condicionado de Wnt3a de ratinho quer meio contendo LiCl 30 mM para estimular a sinalização de Wnt. 24 horas mais tarde, determinou-se a actividade de luciferase utilizando o sistema de luciferase Dual (Promega).
(C) Embriões, explantes, hibridizações in situ e síntese de ARN
Fertilização in vitro, culturas de embriões, preparação, micro-injecção e cultura de explantes de embrião de Xenopus foram realizados como descrito (Gawantka et al., EMBO J. 14 (1995), 6268-79). A hibridização in situ de montagem inteira com marcação dupla ou simples foi realizada de acordo com (Bradley et al., Development 122 (1996), 2739-50). Utilizou-se um fragmento de PCR de ADNc Rspo3 de tropicalis para hibridização in situ em embriões Xenopus laevis. Para seccionamento de vibratomo, colocaram-se os embriões em meio de incorporação (0,4% de gelatina, 30% de albumina, 20% de sacarose em PBS) e montaram-se na presença de 2% de glutaraldeido. O seccionamento foi realizado utilizando um vibratomo VT100E (Leica). Cérebros de embriões de Xenopus com 4 dias foram excisados em solução de Barth lx e fixados para hibridização in situ. A hibridização in situ de montagem inteira de embriões de ratinho foi realizada de acordo com procedimentos anteriormente descritos (Koop et al., Mech. Dev. 59 (1996), 73-78). A preparação de ARNm para injecções de Xenopus foi realizada utilizando o kit de transcrição in vitro (Ambion), de acordo com as instruções do fabricante. 35 ΕΡ 2 157 192/ΡΤ
(D) Oligonucleótidos de morfolino antissentido e construções de siRNA A sequência de nucleótidos 5' de um (pseudo-) alelo adicional para o gene Rspo2 de Xenopus foi obtido utilizando 5' RACE (kit GeneRacer, Invitrogen) . Com base nestas sequências, foi desenhado um oligonucleótido de morfolino antissentido direccionado a ambos os pseudoalelos à volta do codão de inicio ATG (Rspo2Mo): GCCGTCCAAATGCAGTTTCAAC.
Construções pSuper produzindo siRNA contra Rspo 2,3 de humano ou um controlo sem sentido foram preparadas de acordo com Brummelkamp et al., Science 296 (2002), 550-3. As sequências são: Rspo2 de humano, TCCCATTTGCAAGGGTTGT; Rspo3 de humano, AGCTGACTGTGATACCTGT; controlo sem sentido, ACTACCGTTGTTATAGGTG. (E) Imuno-histoquímica, Western blot e análise dot blot A imuno-histoquimica para detectar β-catenina em células SHEP foi realizada de acordo com (Scheiffele et al., J. Cell. Biol. 140 (1998), 795-806) utilizando anticorpo anti-β- catenina (Transduction laboratories, Newington). Para
detecção de proteínas Rspo marcadas ou de controlos de carregamento em Western blot, utilizaram-se anti-Myc (clone 9E10), anticorpos monoclonais anti-FLAG (M2, SIGMA), anti-GFP de pinto (Chemicon, Hampshire) e anticorpos anti-a-tubulina de ratinho (SIGMA). A detecção de quimiluminescência (solução SuperSignal®, Pierce) foi realizada de acordo com as instruções do fabricante após incubação de blots com IgG anti-ratinho-HRP (Pierce). Para análise de expressão de Rspo em amostras de tumor foi utilizado o Câncer Profiling Array II (Clontech, Paio Alto) e a hibridização foi realizada de acordo com as instruções do fabricante.
(F) RT-PCR
Os ensaios de RT-PCR foram realizados como descrito (Dosch et al., Development 124 (1997), 2325-34; Glinka et al., Nature 389 (1997), 517-519); iniciadores adicionais foram: Xenopus Rspo2 (directo, GAATGCCCAGAAGGATTTGC; reverso, GGGATGGTGTCTTTTGCTGG); Rspo3 de Xenopus (directo, GAAGCAAATTGGAGTCTGTCG; reverso, GATTGTTCTCAAACCCTTCAGG); 36 ΕΡ 2 157 192/ΡΤ
Rspol de humano (directo, ACAGACACAAGACACACACGC; reverso, TGTCTTCTGGTGGCCTCAG); Rspo2 de humano (directo, CCGAGCCCCAGATATGAAC; reverso, TGACCAACTTCACATCCTTCC); Rspo3 de humano (directo, AGGGACTGAAACACGGGTC; reverso, TGTCTTCTGGTGGCCTCAG); Rspo4 de humano (directo, AAGCTGGGACACAGCACAG; reverso, GAAGCCTTGGAGCCTTGTC).
Exemplo Comparativo 2
Isolamento de vim ADNc codificando Futrina 1 de Xenopus
Na expressão de vector pCS2+ utilizou-se uma biblioteca de ADNc de olho de Xenopus adulto para preparar fracções de cerca de 250 colónias, e o ADN de plasmideo de cada fracção foi transfectado transientemente em células 293T em conjunto com o receptor de Wnt frizzled8, o repórter de Wnt TOP-FLASH (Korinek et al. Science 275 (1997) 1784-1787) e Renilla- luciferase para normalização, em placas de 96 poços utilizando FuGENE 6 (Roche, Basel). Após 24 horas determinou-se a actividade relativa de luciferase. Foi identificada uma fracção produzindo um sinal acima do sinal de fundo (Figuras 1 e 2A) e um gene alojando esta actividade foi isolado a partir da fracção por selecção sib. A análise de sequenciação mostrou que este representa Futrina 1 de Xenopus. Pesquisas de bases de dados revelaram quatro genes intimamente relacionados em humanos, denominados hFutrina 1, 2, 3 e 4 (Figuras 3 e 4 ou 6a).
Prevê-se que Futrina 1 (Rspo2) de Xenopus codifique uma proteína segregada com 243 aminoácidos (proteína madura) e um ponto isoeléctrico de 9,8. Todas as R-espondinas contêm um péptido de sinal (SP) N-terminal, dois domínios do tipo furina (FU), um domínio de trombospondina tipo 1 (TSP1) e uma região de baixa complexidade C-terminal enriquecida com aminoácidos carregados positivamente (C) (Figura 2F). O domínio tipo furina rico em cisteína é encontrado e.g. em endoproteases tipo furina, receptor de EGF e receptor de insulina. Em transdução de sinal por certas tirosina-quinases de receptor são requeridas repetições de furina para agregação de receptor. As repetições de TSP1 são encontradas em trombospondinas e noutras proteínas de matriz extracelular tais como mindina, F-espondina, SCO-espondina bem como em 37 ΕΡ 2 157 192/ΡΤ várias proteínas envolvidas na cascata de complemento. Proteínas contendo repetições de TSP1 estão envolvidas em interacção célula-célula, inibição de angiogénese e apoptose (Adams e Tucker, Dev. Dyn. 218 (2000), 280-99).
Enquanto a Rspo2 de Xenopus contém um péptido de sinal N-terminal previsto, a proteína segregada é quase indetectável no meio de células 293T transfectadas transientemente. Uma vez que o terminal C está enriquecido com aminoácidos básicos, o que promove a retenção da superfície celular, testou-se uma proteína truncada C-terminalmente. A Rspo2AC é efectivamente segregada para o meio a partir de células 293T (Figura 2B) e é funcionalmente activa (Figura 2F). Uma vez que todas as R-espondinas partilham o terminal C básico e uma vez que não existem quaisquer sinais óbvios de retenção por ER ou Golgi, isto sugere que as proteínas estão normalmente associadas com a superfície celular.
Exemplo 3
As futrinas promovem a sinalização de Wnt A Futrina 1 de Xenopus e as Futrinas 1, 2 e 3 de humano são capazes de estimular a expressão de repórter responsivo a Wnt em células HEK 293T quando proporcionadas por transfecção transiente (Figuras 2C e 5A). Adicionalmente, são capazes de melhorar a expressão de repórter induzida por Wnt (Wntl/3A de ratinho) sinergicamente (Figuras 2D e 5B) . Realizaram-se experiências de cotransfecção em células HEK239T com os genes indicados e o repórter de Wnt TOP-FLASH (Korinek et al. Science 275 (1997) 1784-1787) e Renilla-luciferase para normalização, em placas de 96 poços utilizando FuGENE 6 (Roche). Após 24 horas determinou-se a actividade relativa de luciferase.
Todos os membros testados da família Rspo (e.g. Rspol-3 de murino, Rspo2, 3 de humano) mostram efeitos equivalentes (Figura 6A e dados não mostrados). A sinalização de Rspo2 é sensível aos inibidores do percurso de Wnt/p-catenina dominantes negativos TCF e dickkopfl (Figura 6B). Observa-se um efeito de sinalização sinérgico quando Rspo2 é co- 38 ΕΡ 2 157 192/ΡΤ transfectado com componentes extracelulares mas não com componentes intracelulares do percurso de Wnt/β-catenina (Figura 6C) . A cooperação mais elevada é observada reprodutivelmente entre Rspo2 e Wnts, quer utilizando meios condicionados (Figura 2D) quer após co-transfecção (Figura 6C) . A marca da activação da sinalização de Wnt/β-catenina é a acumulação citosólica de β-catenina devida à sua estabilização. 0 tratamento de células 293T com meio condicionado de Wnt3a induz β-catenina citosólica após 1 hora e, embora o recombinante sozinho Rspo2AC não seja capaz de estabilizar β-catenina durante este intervalo, melhora fortemente a actividade de Wnt3a para o fazer (Figura 2E, em cima) . Após 4 horas de tratamento, ambos os meios condicionados de Wnt3a e Rspo2AC são capazes de induzir a acumulação de β-catenina a níveis similares (Figura 2E, em cima). A β-catenina é conhecida por entrar nos núcleos em resposta a estimulação de Wnt e activa a expressão génica em conjunto com factores de transcrição Lef/Tcf. 0 tratamento de células SHEP por meios condicionados quer de Wnt3a quer de Rspo2AC induz fracamente a localização nuclear de β-catenina, enquanto o co-tratamento com Wnt3a e Rspo2AC melhora a acumulação nuclear (Figura 2E, em baixo). Pode-se concluir que as R-espondinas representam uma nova família de proteínas segregadas capazes de promover a sinalização de Wnt/β-catenina.
Para estudar funcionalmente os seus domínios de sinalização, foram criadas deleções em série de Rspo2 de Xenopus (Figura 2F). Como discutido, o terminal C básico pode ser removido sem perda de actividade e isto é também verdade para o domínio TSP1 (Figura 2F) . No entanto, os domínios do tipo furina são necessários para sinalização de Wnt/β-catenina uma vez que a deleção de qualquer dos domínios furina-1 ou -2 anula a actividade em ensaios de repórter (Figura 2F). 39 ΕΡ 2 157 192/ΡΤ
Exemplo 4 A Futrinas são requeridas para sinalização plena de Wnt
Para testar a necessidade de Futrinas na sinalização de Wnt, utilizou-se knock-out génico mediado por siRNA (Brummelkamp et al., Science. 2002, 296 (5567) : 550-3) . Células HeLa foram transfectadas utilizando Lipofectamine Plus com 80 ng de repórter de Wnt 7LEF-Rev-fosLuc, 10 ng de pRL-TK (Promega) e 300 ng de construções pSuper (Brummelkamp et al.) que produzem quer siRNA contra Futrina 1 e 2 de humano, ou um controlo sem sentido. A construção de repórter 7LEF-Rev-fosLuc contendo sete locais de ligação LEF em frente de promotor fos minimo seguido por ORF de luciferase de pirilampo foi gentilmente fornecida por R. Grosschedl (Howard Hughes Medicai Institute). As construções pSuper contêm sequências de 19 nucleótidos de Futrina 1 de humano (sequência: TCCCATTTGCAAGGGTTGT), Futrina 2 de humano (sequência: AGCTGACTGTGATACCTGT) ou sequência sem sentido de controlo (ACTACCGTTGTTATAGGTG).
Um dia após transfecção o meio foi alterado de 10% para 0,5% de FCS. Decorridos três dias após transfecção, adicionou-se meio condicionado de Wnt3A de ratinho ou meio de controlo de células 293 à cultura para estimular a sinalização de Wnt. 24 horas mais tarde, determinou-se a actividade de luciferase. Como se mostra na Figura 7, as células HeLa mostram níveis reduzidos de Futrina 1 e 2, e a sinalização de Wnt caiu para 50%, indicando que as Futrinas são requeridas para sinalização plena de Wnt. Este efeito pode ser eficientemente recuperado por 5 ng de Futrina 1 de ratinho recombinante, testando a sua especificidade. Os dados estão normalizados em relação à actividade de luciferase Renilla.
Exemplo 5
Expressão de genes de R-Espondina em embriões de Xenopus e de ratinho
Em embriões de Xenopus, não é detectado por RT-PCR qualquer ARN de Rspo2 materno. A sua expressão zigótica 40 ΕΡ 2 157 192/ΡΤ começa na fase de gástrula inicial e permanece constante ao longo da neurulação e organogénese (Figura 8A) . Por hibridização in situ de montagem inteira, observa-se a expressão fraca de Rspo2 através da ectoderme de gástrulas iniciais (não mostrado). Durante a gastrulação é detectada a expressão forte na zona marginal nas camadas tanto profundas como superficiais, mas é excluída do organizador Spemann (Figura 8B). Na fase tardia de gástrula a expressão de Rspo2 persiste na mesoderme de placa lateral e torna-se detectável na placa neural anterior (Figura 8C). Na fase 15 observa-se a expressão em duas tiras longitudinais ao longo da placa neural (futura placa de telhado), na placa neural anterior e na mesoderme lateral e posterior (Figura 8D). A expressão de Rspo2 na fase de broto da cauda (Figura 8F) está restringida a várias regiões do cérebro, incluindo diencéfalo e fronteira mesencéfalo-rombencéfalo, prónefro e tubo neural dorsal. A expressão é também detectada nas porções mais ventrais e dorsais de somitos, na barbatana dorsal e no proctodeo. A expressão de Rspo2 no cérebro de girinos tardios está principalmente restringida ao diencéfalo, incluindo a zona limitante intratalâmica (zli) (Figura 8H). A expressão de Rspo3 de Xenopus está relacionada com a de Rspo2. É primeiro detectada na fase de gástrula (não mostrado) e em néurulas é expressa na borda anterior da placa neural e na mesoderme posterior (Figura 8E). Na fase de broto da cauda, é co-expressa com Rspo2 no sistema nervoso central mas mostra expressão adicional em arcos branquiais e no broto da cauda (Figura 8G).
Em ratinho, os transcritos de Rspo3 são detectados por hibridização in situ ao dia 7,5 na linha primitiva (Figura 8J) enquanto a expressão de Rspol e 2 não é detectável. Ao dia 9,5, os Rspol-3 mostram expressão diferencial em vários derivados neurais e mesodérmicos (Figura 8K-M), principalmente ao longo do tubo neural dorsal (Rspol e 3) , diencéfalo (Rspol, 2, 3), somitos (Rspo3) e mesoderme do broto da cauda (Rspo3). Nos brotos dos membros todos os três genes mostram expressão diferencial proeminente (Figura 81), particularmente, na região morfogenicamente activa tal como a cristã ectodérmica apical (AER) (Rspo2). 41 ΕΡ 2 157 192/ΡΤ
Exemplo 6
As R-espondinas são co-expressas com e reguladas por Wnts
As R-espondinas não apenas mostram interacção funcional com a sinalização de Wnt, mas também co-expressão com genes Wnt em muitas regiões durante o desenvolvimento embrionário de Xenopus e de ratinho. Em mesoderme de gástrula tanto de Xenopus como de ratinho, Rspo2 e -3 são co-expressos com XWnt8 e mWnt3, respectivamente. Similarmente, em fases tardias, os membros da família de R-espondina são amplamente co-expressos com vários genes de Wnt e.g. na fronteira mesencéfalo-rombencéfalo, tubo neural dorsal e broto dos membros e broto da cauda. Uma comparação directa entre os padrões de expressão de Rspo2 de Xenopus e Wnt8 e Wnt3a mostra uma grande sobreposição (Figura 9A).
De facto, os Wnts são capazes de induzir a expressão de Rspo uma vez que embriões de Xenopus injectados com ADN pCS-Wnt8 ou pCS-$-catenina regulam de modo ascendente Rspo2 e Rspo3 por RT-PCR (Figura 9B) . Do mesmo modo, embriões injectados com ADN pCS-Wnt8 ou pCS-Wnt3a mostram expressão de Rspo2 ectópica por hibridização in situ (Figura 8C-E) . Os resultados indicam que a co-expressão observada é devida a regulação de R-espondinas por Wnts. Isto é consistente com a observação de que a expressão de Rspol está reduzida na medula espinal dorsal de embriões de ratinho knockout em Wntl ou Wnt3a.
Exemplo Comparativo 7 A Futrina 1 (R-Espondina 2) activa marcadores neurais e regula (promove) a formação de músculo A análise de perda de função de embriões de Xenopus mostra que a Futrina 1 é requerida para formação de músculo. Injecções de oligo morfolino antissentido contra Futrina 1 (Futl-Mo) causam regulação descendente de marcadores musculares iniciais MyoD e Myf5 e induzem defeitos musculares (Figura 10A) . A especificidade deste efeito foi documentada, em primeiro lugar, pela capacidade de Futl-Mo em inibir a tradução da construção de ADN cognata quando sobre-expressa 42 ΕΡ 2 157 192/ΡΤ em embriões (Figura 10B) e, em segundo lugar, pela capacidade de ARNm XFutl em recuperar o efeito de Futl-Mo (Figura 10C).
Quando o percurso de Wnt/β-catenina é sobre-activado em embriões de Xenopus observa-se uma variedade de respostas: i) a injecção de ARNm de activadores de percurso induz tipicamente eixos embrionários secundários em embriões inteiros e marcadores neurais anteriores em cápsulas animais e embriões inteiros; ii) a injecção de ADN de activadores de percurso conduzindo a expressão após MBT, posterioriza o sistema nervoso central (SNC). Para testar se o Rspo2 é capaz de mimetizar qualquer destes efeitos ARNm sintético foi microinjectado em embriões de Xenopus. Porém, a injecção com ARNm de Rspo2 não induz eixos secundários em embriões inteiros e a injecção de ADN de pCS-Rspo2 não posterioriza o SNC, uma vez que as cabeças são de tamanho normal, a expressão de Otx2 está expandida e a en2 não é afectada (Figura 11D, H).
Em cápsulas animais o Rspo2 induz os marcadores pan-neurais NCAM e N-tubulina e o marcador neural anterior, Otx2, tal como o fazem Xwnt8 e β-catenina (Figura 11A) . Similarmente, em embriões inteiros injectados com ARN de Rspo2, observam-se glândulas de cimento ectópico e expansão lateral da placa neural no lado injectado, como mostrado por expressão de marcadores neurais Sox3, 0tx2, not2, en2 e Rxl (Figuras 11B-H). A expressão de 0tx2 ectópica é observada já em embriões na fase de gástrula (Figura 11I+J). Estes resultados são consistentes com a capacidade de sinalização de Wnt/β-catenina em bloquear a expressão de BMP4 e desse modo activar o desenvolvimento neural.
Para analisar adicionalmente o efeito de sobre-expressão de ARNm de Rspo2 na sinalização de BMP4, Activina, Nodal e FGF, realizaram-se ensaios em cápsula de animal e testou-se quanto à indução de genes alvo por três sinais de factor de crescimento (Figura 12) . 0 Rspo2 bloqueia como esperado a expressão de Xvent2 mediada por BMP4 mas surpreendentemente inibe também a indução de Xbra mediada por Activina e Nodal (Figura 12A-C) . Isto é contrário às injecções de ARNm de XWnt8 e β-catenina, que não afectam a indução de Xbra por Activina (Figura 12B) . Em contraste à sinalização por três 43 ΕΡ 2 157 192/ΡΤ factores de crescimento tipo TGF-β, a expressão de Xbra induzida por FGF8 não é afectada por Rspo2 sobre-expresso (Figura 12D) . Pode-se concluir que, para além de activar o percurso de Wnt/p-catenina, uma sobre-expressão de Rspo2 é também capaz de interferir com a sinalização por três factores de crescimento da família TGF-β.
Outro efeito bem conhecido da sinalização de Wnt/β-catenina zigótica é a sua capacidade para promover a miogénese. Por exemplo, o XWnt8 pode induzir a formação de músculo em células mesodérmicas ventrais. Quando zonas marginais ventrais (VMZs) a partir de embriões injectados com Rspo2 são dissecados e cultivados até à fase 40, estas alongam-se, formam estruturas tipo cauda e são contrácteis. Este fenótipo é indistinguível dos explantes de zona marginal lateral de controlo (LMZs), que tipicamente diferenciam músculo (Fig. 4K-L). A hibridização in situ confirmou a indução de actina de músculo em ambos os VMZs injectados com Wnt8 e Rspo2 mas não em VMZs de controlo (injectados com pré-prolactina) (Figura 11M). Uma vez que as R-espondinas são capazes de melhorar a sinalização de Wnt em células 293T, testou-se a sua cooperação na miogénese de Xenopus. O Myf5 é um marcador miogénico expresso de modo característico em mesoderme lateral. No entanto, está excluído da mesoderme dorsal, e os explantes da zona marginal dorsal (DMZ) expressam apenas pouco myf5 como determinado por RT-PCR (Figura 11N) . Em DMZs de embriões injectados com construções de ADN conduzindo a pós-expressão de MBT, o myf5 é fracamente induzido por Rspo2, moderadamente por Wnt8 e fortemente pela sua combinação (Figura 11N, em cima). O efeito de promoção da miogénese de Rspo2 é reprimido por dishevelled negativo dominante (Xddl), dkkl e 63Κ-3β, que bloqueiam todos a sinalização de Wnt (Figura 11N, em baixo) . Em resumo, os resultados sugerem que Rspo2 pode promover a miogénese via o percurso de Wnt/β-catenina. 44 ΕΡ 2 157 192/ΡΤ
Exemplo Comparativo 8 Ο R-Espondina2 é requerido para miogénese mediada por Wnt/β-catenina
Para investigar o papel fisiológico de Rspo2 durante a embriogénese de Xenopus, injectaram-se oligonucleótidos de morfolino antissentido (Rspo2Mo). A capacidade de Rspo2Mo para bloquear a produção de proteína Rspo2 é demonstrada por Western blot (Figura 13A) . A injecção deste morfolino num blastómero dorso-animal na fase de oito células resulta em defeitos de olho, ainda que a expressão de marcadores de olho iniciais (Rxl, Pax6), anterior neural (0tx2) e pan-neural (Sox3) não seja obviamente afectada (não mostrado). A injecção equatorial de Rspo2Mo num blastómero na fase de oito células conduz a defeitos musculares no local injectado (Figura 13B). A hibridização in situ para actina de músculo e secções de tronco transversal mostram que a injecção de Rspo2Mo causa somitos desorganizados (painéis a-b) e miótomos reduzidos (painéis c-d). Experiências de traçado de linhagem mostraram que células injectadas com Rspo2Mo contribuem para a mesoderme de placa lateral em vez de somitos ou sofrem morte celular (dados não mostrados). Na fase de gástrula a expressão dos marcadores miogénicos myf5 e myoD está fortemente regulada de modo de modo descendente no lado injectado com Rspo2Mo (painéis e-h), enquanto o marcador pan-mesodérmico Xhra e o marcador organizador Xnot2 não são afectados (painéis i-i).
Para testar a especificidade de Rspo2Mo, realizaram-se experiências de recuperação por co-injecção de Rspo2Mo em conjunto com um ARN de Rspo2, no qual seis nucleótidos não codificantes foram mutados de modo a este não ser atingido por este morfolino. A expressão de myf5 (Figura 13C) e myoD (dados não mostrados) é efectivamente recuperada por este ARN de Rspo2 mutante, indicando que o efeito de Rspo2Mo na miogénese é específico.
Utilizou-se Rspo2Mo como uma ferramenta para examinar a posição epistática de Rspo no percurso de Wnt/β-catenina. Como leitura para a sinalização de Wnt/β-catenina, utilizou- 45 ΕΡ 2 157 192/ΡΤ se a expressão de myf5 e de actina de músculo em explantes de zona marginal (Figura 13D). Em explantes de DMZ e VMZ, o ADN de Wnt8 induz myf5 e actina de músculo e esta indução é significativamente bloqueada por Rspo2Mo (Figura 13D, painéis a-b, pistas 3-4) . No entanto, a indução de myfõ e actina de músculo por activadores intracelulares do percurso de Wnt tais como dishevelled, dnGSK-3/3 e β-catenina não é afectada por Rspo2Mo (a-b, pistas 5-10) . Em explantes de LMZ, a injecção com Rspo2Mo regula de modo descendente a expressão de myfõ e actina de músculo (Figura 13D, painéis c-d, pistas 1-2). Em co-injecções de ADN este efeito é recuperado efectivamente por β-catenina mas apenas fracamente por XWnt8 (pistas 3-6). O efeito residual de xWnt8 é provavelmente devido à sua acção autónoma não celular sobre células que não receberam Rspo2Mo. Considerados em conjunto estes resultados indicam que o Rspo2 afecta o percurso de Wnt/β-catenina ao nivel ou a montante do dishevelled.
Exemplo 9
As R-espondinas são requeridas para sinalização de Wnt/β-catenina em células HeLa A seguir testou-se o requisito de Rspo2 para sinalização de Wnt em células de mamífero utilizando siRNA. Uma vez que existem quatro R-espondinas com função aparentemente redundante, seleccionaram-se células HeLa, que apenas expressam Rspo3 e muito fracamente Rspo2 (Figura 14A). Várias outras linhas de células, tais como células 293T, expressam todos os quatro genes, complicando uma abordagem de siRNA. A neutralização (knock-down) génica mediada por siRNA foi realizada por transfecção de construções pSUPER (Brummelkamp et al., Science 296 (2002), 3286-3305) para produzir siRNAs dirigidos contra Rspo2 e -3 (siRNA Rspo 2,3) . Como controlo, utilizou-se um siRNA sem sentido. Para testar a eficiência de siRNA, Rspo3 de humano marcado com FLAG foi co-transfectado com siRNAs e a sua produção foi reprimida por siRNA Rspo3 mas não por siRNA Rspo2 (Figura 14B).
Em ensaios de repórter-Wnt, ambos os siRNAs Rspo2 e -3 diminuíram a actividade de luciferase induzida por Wnt3a em 46 ΕΡ 2 157 192/ΡΤ comparação com siRNA de controlo (Figura 14C) . Quando siRNA Rspo2 e -3 são co-transfectados, a actividade de repórter cai para 40%. Este efeito é específico uma vez que a sinalização diminuída de Wnt pode ser recuperada por Rspo2 de ratinho co-transfectado, que não é atingido por siRNAs contra R-espondinas de humano (Figura 14C). Para além disso, ao contrário da actividade de repórter induzida por Wnt3a, os siRNA Rspo2+3 não afectam a sinalização induzida por Li+ de WntΖβ-catenina (Figura 14D) . Uma vez que o Li+ actua por inibição da actividade de GSK3p, isto é mais uma vez consistente com Rspo2 a actuar ao nível de ou a montante de dishevelled. Conclui-se que em células HeLa as R-espondinas são requeridas para a total sinalização de Wnt/3-catenina.
Exemplo 10 A expressão de Futrina está desregulada em tumores de humano A desregulação da sinalização de Wnt/P-catenina está implicada em tumorigénese, e.g., cancro do cólon, cancro da mama e melanoma (Barker et al., 2000; Bienz e Clevers, 2000; Polakis, 2000). Uma vez que as R-espondinas (futrinas) promovem sinalização de Wnt/3-catenina podem também desempenhar um papel tumorigénese. Assim, estudou-se a expressão de Futrina 1-4 em vários tecidos humanos normais e cancerosos utilizando hibridização radioactiva num Clontech Câncer Profiling Array II. Utilizou-se hibridização com sonda de ubiquitina para normalização. Os resultados mostram que a expressão de Futrinas 1-3 está drasticamente desregulada em tecidos humanos cancerosos (Figura 15). Na maioria dos tumores a expressão de Futrinas 1-3 está drasticamente diminuída (tumores do cólon, estômago, pulmão, recto para Futrina 1, tumores da mama, ovário, bexiga, útero, cérvix, recto para Futrina 2, tumores do útero e cérvix para Futrina 3). Em alguns casos a expressão de Futrina 1-3 está regulada de modo ascendente (um caso de tumor do estômago para Futrina 1 e 2, tumor de ovário para Futrina 3). A Futrina 4 mostra um nível de expressão muito baixo na maioria dos tecidos estudados, excepto no ovário. Na Figura 16 mostram-se resultados adicionais mostrando também que o hRspol é fracamente expresso em órgãos de adulto. Mostra regulação ascendente em tumores de ovário de dois pacientes e numa 47 ΕΡ 2 157 192/ΡΤ amostra de tumor de estômago. 0 hRspo2 é expresso em órgãos de origem endodérmica, incluindo cólon, recto, intestino delgado e pulmão. A sua expressão está diminuída em amostras de tumor correspondentes. 0 hRspo3 é expresso amplamente e diminui em muitas amostras de tumor. Em geral, a expressão de hRspol-3 está desregulada em vários tumores, enquanto a expressão de hRspo4 é muito fraca tanto em órgãos de adulto humano como em tumores (dados não mostrados).
Outros aspectos são revelados como parte do fascículo no seguinte: 1. Uma composição de diagnóstico compreendendo: (a) pelo menos uma molécula de ácido nucleico compreendendo a sequência de nucleótidos codificando Futrina 1, 2, 3 ou 4 como ilustrado na Figura 3; e/ou (b) pelo menos uma molécula de polipéptido compreendendo a sequência de aminoácidos codificando Futrina 1, 2, 3 ou 4 como ilustrado na Figura 4 ou 6a; e/ou (c) pelo menos uma molécula de ácido nucleico cuja cadeia complementar se hibridiza com uma molécula de ácido nucleico de (a) e que codifica um polipéptido com a actividade biológica de Futrina 1, 2, 3 ou 4; e/ou (d) pelo menos um fragmento de (a), (b) ou (c) possuindo a actividade biológica de Futrina 1, 2, 3 ou 4; (e) pelo menos uma molécula de ácido nucleico cuja sequência difere da sequência da molécula de ácido nucleico de (a), (c) ou (d) devido à degenerescência do código genético, e/ou (f) pelo menos um ligando que é capaz de se ligar especificamente à molécula de (a), (b), (c), (d) ou (e). 2. A composição de diagnóstico do item 1, onde o ligando é um anticorpo. 3. A composição de diagnóstico do item 1, onde a molécula de ácido nucleico da parte (d) tem um comprimento de pelo menos 10 nucleótidos. 4. A composição de diagnóstico dos itens 1 ou 2, onde o ligando está marcado de modo detectável. 48 ΕΡ 2 157 192/ΡΤ 5. A composição de diagnóstico do item 4, onde o marcador é seleccionado entre o grupo consistindo de um radioisótopo, um composto bioluminescente, um composto quimiluminescente, um composto fluorescente, um quelato de metal ou uma enzima. 6. A composição de diagnóstico de qualquer um dos itens 1 a 3, onde a molécula de ácido nucleico, polipéptido ou ligando estão ligados a um suporte sólido. 7. Utilização de uma molécula de ácido nucleico, polipéptido e/ou ligando para a preparação de uma composição de diagnóstico como definida em qualquer dos itens 1 a 6 para o diagnóstico de uma doença associada a (a) expressão aberrante de Futrina 1, 2, 3 e/ou 4 e/ou (b) actividades ou quantidades aberrantes de um polipéptido Futrina 1, 2, 3 e/ou 4. 8. Utilização de acordo com o item 7, onde o alvo ao qual a molécula de ácido nucleico se hibridiza é um ARNm. 9. A método de diagnóstico de uma doença associada a (a) expressão aberrante de Futrina 1, 2, 3 e/ou 4 e/ou (b) actividades ou quantidades aberrantes de um polipéptido Futrina 1, 2, 3 e/ou 4 num sujeito compreendendo: (a) determinar (a) a quantidade de expressão de Futrina 1, 2, 3 e/ou 4 e/ou (b) a quantidade de polipéptido Futrina 1, 2, 3 e/ou 4 biologicamente activo numa amostra biológica; e (b) diagnosticar uma doença associada a (a) expressão aberrante de Futrina 1, 2, 3 e/ou 4 e/ou (b) actividades ou quantidades aberrantes de um polipéptido Futrina 1, 2, 3 e/ou 4 ou um risco do desenvolvimento de uma tal doença com base numa quantidade de expressão alterada de Futrina 1, 2, 3 e/ou 4 e/ou (b) uma quantidade alterada de polipéptido Futrina 1, 2, 3 e/ou 4 biologicamente activo em comparação com um controlo. 10. Um método para identificação de um parceiro de ligação para um polipéptido Futrina 1, 2, 3 e/ou 4 compreendendo: 49 ΕΡ 2 157 192/ΡΤ (a) pôr em contacto o referido polipéptido com um composto a ser rastreado; e (b) determinar se o composto afecta uma actividade do referido polipéptido ou se a ligação do composto ao referido polipéptido ocorreu. 11. Um método para identificação de activadores/agonistas ou inibidores/antagonistas de um polipéptido Futrina 1, 2, 3 e/ou 4 compreendendo os passos de: (a) incubar um composto candidato com o referido polipéptido; (b) ensaiar uma actividade biológica, e (c) determinar se uma actividade biológica do referido polipéptido foi alterada. 12. Um método de identificação e obtenção de um fármaco candidato para terapia de uma doença associada a (a) expressão aberrante do gene codificando Futrina 1, 2, 3 e/ou 4 e/ou (b) actividades ou quantidades aberrantes de Futrina 1, 2, 3 e/ou 4 compreendendo os passos de (a) pôr em contacto um polipéptido Futrina 1, 2, 3 e/ou 4 ou uma célula expressando o referido polipéptido, e opcionalmente o(s) ligando(s) correspondente(s) , na presença de componentes capazes de proporcionar um sinal detectável em resposta à ligação ao referido fármaco candidato a ser rastreado; e (b) detectar a presença ou ausência de um sinal ou aumento do sinal gerado, onde a presença ou aumento do sinal é indicativa de um fármaco putativo. 13. Um activador/agonista ou inibidor/antagonista de um polipéptido Futrina 1, 2, 3 e/ou 4 ou parceiro de ligação do(s) referido(s) polipéptido(s) obteníveis pelo método de qualquer um dos itens 10 a 12. 14. Uma composição farmacêutica compreendendo um composto que é capaz de modular a expressão de um gene codificando Futrina 1, 2, 3 e/ou 4 ou a actividade de Futrina 1, 2, 3 e/ou 4 e um excipiente, diluente ou transportador farmaceuticamente aceitável. 50 ΕΡ 2 157 192/ΡΤ 15. A composição farmacêutica do item 14, onde o composto estimula a expressão do gene codificando Futrina 1, 2, 3 e/ou 4 ou a actividade de Futrina 1, 2, 3 e/ou 4. 16. A composição farmacêutica do item 15, onde o composto é uma molécula de nucleótido codificando um polipéptido possuindo uma actividade biológica de Futrina 1, 2, 3 e/ou 4, um polipéptido Futrina 1, 2, 3 e/ou 4, um activador/agonista ou inibidor/antagonista de um polipéptido Futrina 1, 2, 3 e/ou 4 ou parceiro de ligação do(s) referidos polipéptido(s) obteníveis pelo método de qualquer um dos itens 10 a 12. 17. Utilização de um composto como definido no item 16 para a preparação de uma composição farmacêutica para o tratamento de uma doença associada a (a) expressão aberrante de Futrina 1, 2, 3 e/ou 4 e/ou um gene envolvido na cascata de sinal de Wnt e/ou (b) actividades ou quantidades aberrantes de um polipéptido Futrina 1, 2, 3 e/ou 4 e/ou polipéptido envolvido na cascata de sinal de Wnt. 18. Utilização de acordo com os itens 7 ou 17, onde a doença é um tumor ou uma doença dos rins, músculo, ossos e olhos. 19. Utilização de uma molécula de nucleótido codificando um polipéptido possuindo uma actividade biológica de Futrina 1, 2, 3 e/ou 4, um polipéptido Futrina 1, 2, 3 e/ou 4, um activador/agonista de um polipéptido Futrina 1, 2, 3 e/ou 4 polipéptido ou parceiro de ligação do(s) referido(s) polipéptido(s) para a preparação de uma composição farmacêutica para activar ou inibir a cascata de sinal de Wnt. 20. Utilização de acordo com o item 19 para suportar processos regenerativos. 51 ΕΡ 2 157 192/ΡΤ
LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110> Deutsches Krebsforschungszentrum stiftung des õffentlichen Rechts Niehrs, christof Wu, Wei Glinka, Andrei Kazanskay, Olga <120> Composições para diagnóstico e terapia de doenças associadas com a expressão aberrante de futrinas (R-Espondinas) <13 0> K 3195 <140> PCT/EP 2004/011269 <141> 2004-10-08 <150> EP 03 023 000.7 <151> 2003-10-10 <160> 32 <1 7 0> Patentln version 3.2 <210> 1 <211> 22 <212> ADN <213> artificial <220> <223> Oligonucleótido Rspo2Mo <400> 1 gccgtccaaa tgcagtttca ac 22 <210> 2 <211> 19 <212> ADN <213> artificial <220> <223> Oligonucleótido Rspo2 de humano antissentido 52 ΕΡ 2 157 192/ΡΤ <400> 2 tcccatttgc aagggttgt 19 <210> 3 <211> 19 <212> ADN <213> artificial <220> <223> Oligonucleótido Rspo3 antissentido <400> 3 agctgactgt gatacctgt 19 <210> 4 <211> 19 <212> ADN <213> artificial <220> <223> Oligonucleótido de controlo sem sentido <400> 4 actaccgttg ttataggtg 19 <210> 5 <211> 20 <212> ADN <213> artificial <220> <223> Iniciador Rspo2 directo <400> 5 gaatgcccag aaggatttgc 20 <210> 6 <211> 20 <212> ADN <213> artificial 53 ΕΡ 2 157 192/ΡΤ <220> <223> Iniciador Rspo2 reverso <400> 6 gggatggtgt cttttgctgg 20 <210> 7 <211> 21 <212> ADN <213> artificial <220> <223> Iniciador Rspo3 directo <400> 7 gaagcaaatt ggagtctgtc g 21 <210> 8 <211> 22 <212> ADN <213> artificial <220> <223> Iniciador Rspo3 reverso <400> 8 gattgttctc aaacccttca gg 22 <210> 9 <211> 21 <212> ADN <213> artificial <220> <223> Iniciador Rspol de humano directo <400> 9 acagacacaa gacacacacg c 21
<210> 10 <211> 19 <212> ADN 54 ΕΡ 2 157 192/ΡΤ <213> artificial <220> <223> Iniciador Rspol humano reverso <400> 10 tgtcttctgg tggcctcag 19 <210> 11 <211> 19 <212> ADN <213> artificial <220> <223> Iniciador Rspo2 de humano directo <400> 11 ccgagcccca gatatgaac 19 <210> 12 <211> 21 <212> ADN <213> artificial <220> <223> Iniciador Rspo2 de humano reverso <400> 12 tgaccaactt cacatccttc c 21 <210> 13 <211> 19 <212> ADN <213> artificial <220> <223> Iniciador Rspo3 de humano directo <400> 13 agggactgaa acacgggtc 19 <210> 14 55 ΕΡ 2 157 192/ΡΤ 55 ΕΡ 2 157 192/ΡΤ <211> <212> <213> 19
ADN artificial <220> <223> Iniciador Rspo3 de humano reverso <400> 14 tgtcttctgg tggcctcag 19 <210> 15 <211> 19 <212> ADN <213> artificial <220> <223> Iniciador Rspo4 de humano directo <400> 15 aagctgggac acagcacag 19 <210> 16 K3195.txt <211> 19 <212> ADN <213> artificial <220> <223> Iniciador Rspo4 de humano reverso <400> 16 gaagccttgg agccttgtc 19 <210> 17 <211> 19 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 17 tcccatttgc aagggttgt 19 <210> 18 <211> 19 19 56 ΕΡ 2 157 192/ΡΤ
<212> ADN <213> Homo sapiens <400> 18 agctgactgt gatacctgt <210> 19 <211> 19 <212> ADN <213> artificial <220> <223> Sequência sem sentido da construção pSuper <400> 19 19 actaccgttg ttataggtg
<210> 20 <211> 843 <212> ADN <213> Homo sapiens ggtggccctg gttctgagct ggacgcacct caccatcagc 60 aaggcagagg cggatcagtg ccgaggggag ccaggcctgt 120 ctctgaagtc aacggctgcc tcaagtgctc acccaagctg 180 cgacatccgc caggtgggcg tctgcttgcc gtcctgccca 240 caaccccgac atgaacaagt gcatcaattc ctctgcagta 300 tcctgccctc catgtagaat gcaagatcga gcactgtgag 360 ctgcaccaag tgtaaggagg gcttgtacct gcacaagggc 420 cgagggctcc tcagctgcca atggcaccat ggagtgcagt 480 gagcgagtgg tctccgtggg ggccctgctc caagaagcag 540 gggctccgag gagcggacac gcagggtgct acatgcccct 600 ctctgacacc aaggagaccc ggaggtgcac agtgaggaga 660 gaagaggagg aagggaggcc agggccggcg ggagaatgcc 720 ggagagcaag gaggcgggtg ctggctctcg aagacgcaag 780 gcaagggaca gtggggccac tcacatctgc agggcctgcc 840 <400> 20 atgcggcttg ggctgtgtgt agccggggga tcaaggggaa gccaaaggct gtgagctctg ttcatcctgc tggagaggaa cctggatact tcgacgcccg cctgcagctc taggccaggg gcctgcttca gccataactt cgctgctatc cagcttgtcc agtcctgcgc aatgtgaaat cagctctgtg gtttccggag gtgggggacc atgctgcctg gtgccgtgtc ctgaggggca aacaggaacc tggccaggaa gggcagcaac agcagcagca tag
<210> 21 <211> 732 <212> ADN 843 57 ΕΡ 2 157 192/ΡΤ <213> Homo sapiens <400> 21 atgcagtttc gccttttctc ctttgccctc atcattctga actgcatgga ttacagccac 60 tgccaaggca accgatggag acgcagtaag cgagctagtt atgtatcaaa tcccatttgc 120 aagggttgtt tgtcttgttc aaaggacaat gggtgtagcc gatgtcaaca gaagttgttc 180 ttcttccttc gaagagaagg gatgcgccag tatggagagt gcctgcattc ctgcccatcc 240 gggtactatg gacaccgagc cccagatatg aacagatgtg caagatgcag aatagaaaac 300 tgtgattctt gctttagcaa agacttttgt accaagtgca aagtaggctt ttatttgcat 360 agaggccgtt gctttgatga atgtccagat ggttttgcac cattagaaga aaccatggaa 420 tgtgtggaag gatgtgaagt tggtcattgg agcgaatggg gaacttgtag cagaaataat 480 cgcacatgtg gatttaaatg gggtctggaa accagaacac ggcaaattgt taaaaagcca 540 gtgaaagaca caataccgtg tccaaccatt gctgaatcca ggagatgcaa gatgacaatg 600 aggcattgtc caggagggaa gagaacacca aaggcgaagg agaagaggaa caagaaaaag 660 aaaaggaagc tgatagaaag ggcccaggag caacacagcg tcttcctagc tacagacaga 720 gctaaccaat aa 732
<210> 22 <211> 819 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 22 atgcacttgc gactgatttc ttggcttttt atcattttga actttatgga atacatcggc 60 agccaaaacg cctcccgggg aaggcgccag cgaagaatgc atcctaacgt tagtcaaggc 120 tgccaaggag gctgtgcaac atgctcagat tacaatggat gtttgtcatg taagcccaga 180 ctattttttg ctctggaaag aattggcatg aagcagattg gagtatgtct ctcttcatgt 240 ccaagtggat attatggaac tcgatatcca gatataaata agtgtacaaa atgcaaagct 300 gactgtgata cctgtttcaa caaaaatttc tgcacaaaat gtaaaagtgg attttactta 360 caccttggaa agtgccttga caattgccca gaagggttgg aagccaacaa ccatactatg 420 gagtgtgtca gtattgtgca ctgtgaggtc agtgaatgga atccttggag tccatgcacg 480 aagaagggaa aaacatgtgg cttcaaaaga gggactgaaa cacgggtccg agaaataata 540 cagcatcctt cagcaaaggg taacctgtgt cccccaacaa atgagacaag aaagtgtaca 600 gtgcaaagga agaagtgtca gaagggagaa cgaggaaaaa aaggaaggga gaggaaaaga 660 aaaaaaccta ataaaggaga aagtaaagaa gcaatacctg acagcaaaag tctggaatcc 720 agcaaagaaa tcccagagca acgagaaaac aaacagcagc agaagaagcg aaaagtccaa 780 gataaacaga aatcggtatc agtcagcact gtacactag 819
<210> 23 <211> 672 <212> ADN <213> Homo sapiens 58 ΕΡ 2 157 192/ΡΤ <400> 23 atgcgggcgc cactctgcct gctcctgctc gtcgcccacg ccgtggacat gctcgccctg 60 aaccgaagga agaagcaagt gggcactggc ctggggggca actgcacagg ctgtatcatc 120 tgctcagagg agaacggctg ttccacctgc cagcagaggc tcttcctgtt catccgccgg 180 gaaggcatcc gccagtacgg caagtgcctg cacgactgtc cccctgggta cttcggcatc 240 cgcggccagg aggtcaacag gtgcaaaaaa tgtggggcca cttgtgagag ctgcttcagc 300 caggacttct gcatccggtg caagaggcag ttttacttgt acaaggggaa gtgtctgccc 360 acctgcccgc cgggcacttt ggcccaccag aacacacggg agtgccaggg ggagtgtgaa 420 ctgggtccct ggggcggctg gagcccctgc acacacaatg gaaagacctg cggctcggct 480 tggggcctgg agagccgggt acgagaggct ggçcgggctg ggcatgagga ggcagccacc 540 tgccaggtgc tttctgagtc aaggaaatgt cccatccaga ggccctgccc aggagagagg 600 agccccggcc agaagaaggg caggaaggac cggcgcccac gcaaggacag gaagctggac 660 cgcaggctgg ac 672 <210> 24 <211> 732 <212> ADN <213> Espécie Xenopus <400> 24 atgcagtttc aactcttttc attcgccctg atcatcctga actgtgtgga ttacagtcac 60 tgccaagcct cccgctggag acggagcaag agagccagct atgggaccaa cccgatatgc 120 aaaggttgcc tgtcctgctc aaaagataat gggtgcctcc gctgccagcc aaaactgttt 180 ttctttctgc gaagagaagg tatgaggcag tatggagagt gtctgcagtc ctgccctccg 240 ggatactatg gagtcagagg acctgatatg aacaggtgtt ccagatgcag aattgaaaat 300 tgcgactctt gttttagtag agatttttgc ataaagtgca aatcgggctt ttactccctc 360 aaggggcaat gctttgaaga atgcccagaa ggatttgcac cactggatga taccatggtg 420 tgtgtggatg gctgcgaagt agggccatgg agtgaatggg gcacatgcag ccgaaataac 480 agaacgtgcg gtttcaaatg gggcctggag accagaacgc gacaaattgt gaagaaacca 540 gcaaaagaca ccatcccctg cccaactatt gctgaatcca gaagatgtaa gatggcaata 600 agacactgcc ctggaggaaa gagaactaca aagaagaagg acaagaggaa caagaagaag 660 aaaaagaagt tactggagag ggcccaagag cagcacagcg tcgtccttgc tacagaccgg 720 tctagccaat ag 732
<210> 25 <211> 262 <212> PRT <213> Homo sapiens 59 ΕΡ 2 157 192/ΡΤ <400> Met Arg 1 25 Leu Gly Leu 5 cys vai vai Leu Thr lie ser 20 ser Arg Gly Ile Ser Ala Glu 35 Gly Ser Gin Ala cys 40 Glu vai 50 Asn Gly Cys Leu Lys 55 Cys Glu 65 Arg Asn Asp Ile Arg 70 Gin vai pro Gly Tyr Phe Asp 85 Ala Arg Asn Lys lie Glu His 100 cys Glu Ala Cys cys Lys Glu 115 Gly Leu Tyr Leu HiS 120 pro Glu 130 Gly Ser Ser Ala Ala 135 Asn Ala 145 Gin cys Glu Met Ser 150 Glu Trp Lys Gin Gin Leu cys Gly 165 Phe Arg Arg Vai Leu His 180 Ala Pro vai Gly Lys Glu Thr 195 Arg Arg Cys Thr vai 200 Gin Lys 210 Arg Arg Lys Gly Gly 215 Gin Α5Π 225 Leu Ala Arg Lys Glu 230 ser Lys Arg Lys Gly Gin Gin 245 Gin Gin Gin Thr Ser Ala Gly 260 Pro Ala <210> 26 <211> 243 <212> PRT <213> Homo sapiens
Ala Leu 10 vai Leu ser Trp Thr 15 His W Gly Lys Arg Gin Arg 30 Arg Ile Ala Lys Gly cys Glu 45 Leu Cys ser Ser Pro Lys Leu 60 Phe XI e Leu Leu Gly vai cys 75 Leu Pro Ser Cys Pro 80 Pro ASp 90 Met Asn Lys cys ile 95 cys Phe 105 ser His Asn Phe cys 110 Thr Lys Lys Gly Arg cys Tyr 125 Pro Ala Cys Gly Thr Met Glu 140 Cys Ser Ser Pro ser pro Trp 155 Gly Pro cys Ser Lys 160 Arg Gly 170 Ser Glu Glu Arg Thr 175 Arg ASp 185 His Ala Ala Cys Ser Asp 190 Thr Arg Arg vai Pro Cys 205 pro Glu Gly Gly Arg Arg Glu 220 Asn Ala Asn Arg Glu Ala Gly 235 Ala Gly Ser Arg Arg 240 Gin Gin 250 Gly Thr vai Gly Pro 255 Leu 60 60 ΕΡ 2 157 192/ΡΤ <400> 26
Met Gin phe Arg Leu Phe Ser phe Ala Leu ile Ile Leu Asn cys Met 1 5 10 15 Asp Tyr Ser His cys Gin Gly Asn Arg Trp Arg Arg ser Lys Arg Ala 20 25 30 Ser Tyr val Ser Asn Pro Ile Cys Lys Gly Cys Leu Ser cys Ser Lys 35 40 45 Asp Asn Gly Cys Ser Arg cys Gin Gin Lys Leu Phe Phe Phe Leu Arg 50 55 60 Arg Glu Gly Met Arg Gin Tyr Gly Glu cys Leu His ser Cys Pro Ser 65 70 75 80 Gly Tyr Tyr Gly His 85 Arg Ala Pro Asp Met 90 Asn Arg cys Ala Arg 95 Cys Arg xle Glu Asn cys Asp ser Cys phe Ser Lys Asp Phe cys Thr Lys 100 105 UO cys Lys val Gly Phe Tyr Leu His Arg Gly Arg Ser phe ASp Glu Cys 115 120 125 pro ASp Gly Phe Ala Pro Leu Glu Glu Thr Met Glu cys val Glu Gly 130 135 140 Cys Glu Val ciy His Trp Ser Glu Trp Gly Thr cys Ser Arg Asn Asn 145 150 155 160 Arg Thr Cys Gly Phe 165 Lys Trp Gly Leu Glu 170 Thr Arg Thr Arg Gin 175 Xle vai Lys Lys Pro Val Lys A5P Thr Ile Pro Cys Pro Thr Ile Ala Glu 180 185 190 Ser Arg Arg 195 Cys Lys Met Thr Met 200 Arg His Cys Pro Gly 205 Gly Lys Arg Thr Pro Lys Ala Lys Glu Lys Arg Asn Lys Lys Lys Lys Arg Lys Leu 210 215 220 Ile 225 Glu Arg Ala Gin Glu 230 Gly His Ser val Phe 235 Leu Ala Thr Asp Arg 240
Ala Asn Gin
<210> 27 <211> 272 <212> PRT <213> Homo sapiens 61 ΕΡ 2 157 192/ΡΤ <400> 27 Met 1 His Leu Arg Leu 5 Ile Ser Trp Leu phe 10 Ile ile Leu Asn Phe 15 Met Glu Tyr Ile Gly 20 Ser Gin Asn Ala Ser 25 Arg Gly Arg Arg Gin 30 Arg Arg Met His pro Asn val Ser Gin Gly cys Gin Gly Gly Cys Ala Thr Cys 35 40 45 Ser Asp 50 Tyr Asn Gly cys Leu 55 Ser Cys Lys pro Arg 60 Leu Phe Phe Ala Leu 65 Glu Arg ile Gly Met 70 Lys Gin Ile Gly val 75 cys Leu ser Ser cys 80 Pro Ser Gly Tyr Tyr Gly Thr Arg Tyr pro ASp Ile Asn Lys Thr 85 90 95 Lys cys Lys Ala Asp Cys Asp Thr Cys Phe Α5Π Lys Asn Phe Cys Thr 100 105 110 Lys Cys Lys ser Gly Phe Tyr Leu His Leu Gly Lys Cys Leu A5P Asn 115 120 125 Cys Pro Glu Gly Leu Glu Ala Asn Asn His Thr Met Glu cys val Ser 130 135 140 Ile Vai HÍS Cys Glu. val ser Glu Trp Asn Pro Trp Ser Pro Cys Thr 145 150 155 160 Lys Lys Gly Lys Thr· Cys Gly Phe Lys Arg Gly Thr Glu Thr Arg Val 165 170 175 Arg Glu ile Ile Gin HiS pro ser Ala Lys Gly Asn Leu cys Pro Pro 180 185 190 Thr Asn Glu Thr Arg Lys cys Thr val Gin Arg Lys Lys cys Gin Lys 195 200 205 Gly Glu Arg Gly Lys Lys Gly Arg Glu Arg. Lys Arg Lys Lys Pro Asn 210 215 220 Lys Gly Glu ser Lys Glu Ala Ile Pro Asp Ser Lys Ser Leu Glu Ser 225 230 235 240 ser Lys Glu Ile Pro Glu Gin Arg Glu Asn Lys Gin Gin Gin Lys Lys 245 250 255 Arg Lys vai Gin Asp Lys Gin Lys Ser val ser Val ser Thr val His 260 265 270 <21 0> 28 <21 1> 224 <21 2> PRT <213> Homo sapiens 62 62 ΕΡ 2 157 192/ΡΤ <400> 28
Met Arg Ala Pro Leu cys Leu Leu Leu Leu Val Ala His Ala val Asp 1 5 10 15 Met Leu Ala Leu Asn Arg Arg Lys Lys Gin Vai Gly Thr Gly Leu Gly 20 25 30 Gly Asn Cys Thr Gly Cys lie Ile cys Ser Glu Glu Asn Gly cys Ser 35 40 45 Thr cys Gin Gin Arg Leu Phe Leu Phe Ile Arg Arg Glu Gly Ile Arg 50 55 60 Gin Tyr Gly Lys cys Leu His ASp cys Pro Pro Gly Tyr phe Gly Ile 65 70 75 80 Arg Gly Gin GlU vai Asn Arg cys Lys Lys cys Gly Ala Thr cys Glu 85 90 95 ser Cys Phe ser 100 Gin ASP Phe cys Ile 105 Arg cys Lys Arg Gin 110 Phe Tyr Leu Tyr Lys Gly Lys Cys Leu Pro Thr cys pro pro Gly Thr Leu Ala 115 120 125 His Gin Asn Thr Arg Glu cys Gin Gly Glu cys Glu Leu Gly Pro Trp 130 135 140 Gly Gly Trp Ser Prô cys Thr His Asn Gly Lys Thr Cys Gly Ser Ala 145 150 155 160 Trp Gly Leu Glu Ser 165 Arg vai Arg Glu Ala 170 Gly Arg Ala Gly His 175 Glu Glu Ala Ala Thr Cys Gin Vai Leu Ser Glu Ser Arg Lys cys Pro Ile 180 185 190 Gin Arg pro 195 Cys Pro Gly Glu Arg 200 ser Pro Gly Gin Lys 205 Lys Gly Arg Lys ASp 210 Arg Arg Pro Arg Lys 215 Asp Arg Lys Leu Asp 220 Arg Arg Leu ASp
<210> 29 <211> 262 <212> PRT <213> Homo sapiens 63 ΕΡ 2 157 192/ΡΤ <400> 29
Met Arg Leu Gly Leu Cys Vai Vai Al a Leu Vai Leu Ser Trp Thr His 1 5 10 15 Leu Thr Ile ser Ser Arg Gly Ile Lys Gly Lys Arg Gin Arg Arg Ile 20 25 30 Ser Ala Glu Gly Ser Gin Ala cys Ala Lys Gly Cys Glu Leu Cys ser 35 40 45 Glu Vai Asn Gly Cys Leu Lys cys Ser Pro Lys Leu Phe Ile Leu Leu 50 55 60 Glu Arg Asn Asp Ile Arg Gin vai Gly Vai cys Leu Pro ser cys Pro 65 70 75 80 Pro Gly Tyr Phe Asp Ala Arg Asn pro Asp Met Asn Lys cys Ile Cys 85 90 95 Lys lie Gl u His Cys Glu Ala Cys Phe Ser HÍS Asn phe cys Thr Lys 100 105 110 Cys Lys Glu Gly Leu Tyr Leu His Lys Gly Arg Cys Tyr Pro Ala cys 115 120 125 Pro Glu Gly Ser Ser Ala Ala Asn Gly Thr Met Glu cys Ser Ser Pro 130 135 140 Ala Gin Cys Glu Met ser Glu Trp Ser Pro Trp Gly pro cys Ser Lys 145 150 155 160 Lys Gin Gin Leu Cys Gly Phe Arg Arg Gly Ser Glu Glu Arg Thr Arg 165 170 175 Arg Vai Leu His 180 Ala Pro Vai Gly His Ala Ala cys Ser 190 Asp Thr Lys Glu Thr Arg Arg Cys Thr vai Arg Arg vai Pro cys Pro Glu Gly 195 200 205 Gin Lys Arg Arg Lys Gly Gly Gl n Gly Arg Arg Glu Asn Ala Asn Arg 210 215 220 Asn Leu Ala Arg Lys Glu Ser Lys Glu Ala Gly Ala Gly Ser Arg Arg 225 230 235 240 Arg Lys Gly Gin Gin Gin Gin Gin Gin Gin Gly Thr Vai Gly Pro Leu 245 250 255 Thr ser Ala Gly pro Ala 260 <210> 30 <211> 243
<212> PRT <213> Homo sapiens 64 64 ΕΡ 2 157 192/ΡΤ <4Ο Ο> 30
Met Gin Phe Ara Leu Phe ser Phe Ala Leu He lie Leu Asn cys Met 1 5 10 15
Asp Tyr ser His cys Gin Gly Asn Arg Trp Arg Arg ser Lys Arg Ala 20 25 30
Ser Tyr vai Ser Asn Pro lie cys Lys Gly cys Leu Ser cys ser Lys 35 40 45
Asp Asn Gly Cys Ser Arg Cys Gin Gin Lys Leu Phe Phe Phe Leu Arg 50 55 60
Arg Glu Gly Met Arg Gin Tyr Gly Glu cys Leu His ser cys Pro ser 65 70 75 80
Gly Tyr Tyr Gly His Arg Ala Pro Asp Met Asn Arg Cys Ala Arg Cys 85 90 95
Arg lie Glu Asn cys Asp ser cys Phe ser Lys Asp Phe Cys Thr Lys 100 105 110
Cys Lys vai Gly Phe Tyr Leu His Arg Gly Arg Ser Phe Asp Glu cys 115 120 125
Pro Asp Gly Phe Ala Pro Leu Glu Glu Thr Met Glu Cys vai Glu Gly 130 135 140
Cys Glu vai Gly His Trp Ser Glu Trp Gly Thr cys Ser Arg Asn Asn 145 150 155 160
Arq Thr Cys Gly Phe Lys Trp Gly Leu Glu Thr Arg Thr Arg Gin lie 165 170 175 vai Lys Lys Pro Vai Lys Asp Thr ile Pro cys pro Thr ile Ala Glu 180 185 190
Ser Arq Arq Cys Lys Met Thr Met Arg His Cys Pro Gly Gly Lys Arg 195 200 205
Thr Pro Lys Ala Lys Glu Lys Arg Asn Lys Lys Lys Lys Arg Lys Leu 210 215 220
Ile Glu Arg Ála Gin Glu Gly His Ser Vai Phe Leu Ala Thr Asp Arg 225 230 235 240
Ala Asn Gin <210> 31 <211> 272 <212> PRT <213> Homo sapiens 65 ΕΡ 2 157 192/ΡΤ <40 0> 31 Met 1 HlS Leu Arg Leu 5 Ile Ser Trp Glu Tyr ile Gly Ser Gin Asn Ala 20 Met Hi s >ro Asn Vai Ser Gin Gly 35 40 Ser Asp 50 Tyr Asn Gly Cys Leu 55 Ser Leu Glu Arg Ile Gly Met Lys Gin 65 70 pro Ser Gly Tyr Tyr 85 Gly Thr Arg Lys cys Lys Ala Asp Cys Asp Thr 100 Lys cys Lys Ser Gly Phe Tyr Leu 115 120 cys Pro Glu Gly Leu Glu Ala Asn 130 135 Ile vai His cys Glu vai Ser Glu 145 150 Lys Lys Gly Lys Thr 165 Cys Gly Phe Arg Glu Ile ile Gin His pro ser ISO Thr Asn Glu Thr Arg Lys cys Thr 195 200 Gly Glu Arg Gly Lys Lys Giy Arg 210 215 Lys Gly Glu Ser Lys Glu Ala Ile 225 230 Ser Lys Glu Ile Pro Glu Gin Arg 245 Arg Lys vai Gin Asp Lys Gin Lys 260 <21 0> 32 <21 1> 224 <212> PRT <213> Homo sapiens
Leu Phe 10 ile ile Leu Asn Phe 15 Met Ser Arg Gly Arg 25 Arg Gin 30 Arg Arg cys Gin Gly Gly Cys 45 Ala Thr Cys Cys Lys Pro Arg 60 Leu Phe Phe Ala ile Gly vai 75 cys Leu Ser Ser cys 80 Tyr Pro 90 ASp Ile Asn Lys cys 95 Thr Cys 105 Phe Asn Lys Asn phe 110 cys Thr His Leu Gly Lys Cys 125 Leu ASp Asn Asn His Thr Met 140 Glu cys val ser Trp Asn Pro Trp 155 Ser Pro cys Thr 160 Lys Arg 170 Gly Thr Glu Thr Arg 175 val Ala 185 Lys Gly Asn Leu cys 190 pro Pro Vai Gin Arg Lys Lys 205 cys Gin Lys Glu Arg Lys Arg 220 Lys Lys Pro Asn Pro Asp ser 235 Lys Ser Leu Glu Ser 240 Glu Asn 250 Lys Gin Gin Gin Lys 255 Lys ser 265 vai Ser Vai ser Thr 270 val His 66 ΕΡ 2 157 192/ΡΤ <40 0> 32 Met 1 Arg Ala Pro Leu 5 Cys Leu Leu Leu Leu 10 val Ala His Ai» val 15 Asp Met Leu Ala Leu Asn Arg Arg Lys Lys Gin val Gly Thr dy Leu Gly 20 25 30 Gly Asn Cys Thr Gly cys Ile Ile cys Ser Glu Glu Asn Gly cys Ser 35 40 45 Thr Cys Gin Gin Arg Leu Phe Leu Phe Ile Arg Arg Glu Gly Ile Arg 50 55 60 Gin Tyr Gly Lys cys Leu His Asp Cys Pro Pro Gly Tyr phe Gly Ile 65 70 75 80 Arg Gly Gin Glu Val Asn Arg Cys Lys Lys Cys Gly Ala Thr Cys Glu 85 90 95 ser cys Phe Ser Gin Asp Phe cys ile Arg cys Lys Arg Gin Phe Tyr 100 105 110 Leu Tyr Lys Gly Lys Cys Leu pro Thr Cys pro Pro Gly Thr Leu Ala 115 120 125 ΗΊ S Gin 130 Asn Thr Arg Glu ίϊΐ Gin Gly Glu cys Glu 140 Leu Gly Pro Trp Gly Gly Trp Ser Pro cys Thr His Asn Gly Lys Thr Cys Gly Ser Ala 145 150 155 160 Trp Gly Leu Glu Ser Arg Val Arg Glu Ala Gly Arg Ala Gly His Glu 165 170 175 Glu Ala Ala Thr cys Gin val Leu Ser Glu Ser Arg Lys cys Pro Ile 180 185 190 Gin Arg Pro Cys Pro dy Glu Arg Ser Pro Gly Gin Lys Lys Gly Arg 195 200 205 Lys Asp Arg Arg Pro Arg Lys ASp Arg Lys Leu Asp Arg Arg Leu Asp 210 215 220
Lisboa 2013-11-21

Claims (16)

  1. ΕΡ 2 157 192/ΡΤ 1/3 REIVINDICAÇÕES 1. Utilização de uma molécula de nucleótido codificando um polipéptido Futrina 2 de acordo com a SEQ ID NO: 27 para a preparação de uma preparação farmacêutica para activar a cascata de sinal de Wnt.
  2. 2. Utilização de um ligando que se liga especificamente a um polipéptido Futrina 2 de acordo com a SEQ ID NO: 27 para a preparação de uma composição farmacêutica para inibir a cascata de sinal de Wnt, onde o ligando é um anticorpo.
  3. 3. Utilização de um ligando que se liga especificamente a um ácido nucleico codificando um polipéptido Futrina 2 de acordo com SEQ ID NO: 27 para a preparação de uma composição farmacêutica para inibir a cascata de sinal de Wnt, onde o ligando é uma molécula de nucleótido que se liga a um ácido nucleico de Futrina 2 codificando o polipéptido Futrina de acordo com a SEQ ID NO: 27.
  4. 4. Utilização de acordo com a reivindicação 2, onde o ligando é um anticorpo monoclonal.
  5. 5. Utilização de acordo com a reivindicação 4, onde o anticorpo é um anticorpo quimérico, de cadeia simples e/ou humanizado.
  6. 6. Utilização de acordo com a reivindicação 1 para suportar processos regenerativos.
  7. 7. Utilização de acordo com a reivindicação 1 para promover o crescimento muscular.
  8. 8. Utilização de acordo com a reivindicação 2 ou 3 para utilização no tratamento de tumores.
  9. 9. Utilização de acordo com a reivindicação 8 para utilização no tratamento de tumores da mama, ovário, fígado, cérvix, cólon, pulmão, recto, testículos, pâncreas, osso e pele. ΕΡ 2 157 192/ΡΤ 2/3
  10. 10. Utilização de acordo com a reivindicação 1, 2 ou 3 para modulação da formação óssea.
  11. 11. Método para identificação de activadores/agonistas ou inibidores/antagonistas de um polipéptido Futrina 2 de acordo com SEQ ID NOD: 2 7 ou de um polipéptido exibindo uma identidade de pelo menos 80% com o mesmo compreendendo os passos de: (a) incubar um composto candidato com o referido polipéptido; (b) ensaiar a actividade biológica de Futrina 2 de acordo com a SEQ ID NO: 27 ou de um polipéptido exibindo uma identidade de pelo menos 80% com a mesma, num ensaio de repórter de luciferase induzivel por Wnt em células HEK 293 transfectadas, e (c) determinar se a actividade biológica do referido polipéptido foi alterada.
  12. 12. Método para identificação e obtenção de um fármaco candidato para terapia de uma doença associada a actividades aberrantes de Futrina 2 de acordo com SEQ ID NO: 27 ou de um polipéptido exibindo uma identidade de pelo menos 80% com a mesma, compreendendo os passos de (a) pôr em contacto um polipéptido Futrina 2 de acordo com SEQ ID NO: 2 7 ou um polipéptido exibindo uma identidade de pelo menos 80% com a mesma ou uma célula expressando o referido polipéptido, e opcionalmente o(s) ligando(s) correspondente(s) , na presença de componentes capazes de proporcionar um sinal detectável em resposta à ligação ao referido fármaco candidato a ser rastreado; e (b) detectar a presença ou ausência de um sinal ou aumento do sinal gerado, onde a presença ou aumento do sinal é indicativa de um fármaco putativo, onde a actividade de Futrina 2 de acordo com SEQ ID NO: 27 ou de um polipéptido exibindo uma identidade de pelo menos 80% com a mesma é analisada por um ensaio de repórter de luciferase induzivel por Wnt em células HEK 293 transfectadas. ΕΡ 2 157 192/ΡΤ 3/3
  13. 13. Método de acordo com a reivindicação 12, onde o fármaco candidato é um composto individual ou uma pluralidade de compostos.
  14. 14. Método de acordo com as reivindicações 12-13, onde o composto é sintetizado quimicamente, produzido microbiologicamente e/ou está compreendido em extractos celulares.
  15. 15. Método de acordo com a reivindicação 11, onde os activadores/agonistas ou inibidores/antagonistas são seleccionados entre anticorpos, oligonucleótidos, proteínas ou moléculas pequenas.
  16. 16. Método de acordo com as reivindicações 12-14, onde a doença é um tumor ou uma doença dos rins, músculos, ossos e olhos. Lisboa, 2013-11-21
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Families Citing this family (29)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7294704B2 (en) 2003-08-15 2007-11-13 Diadexus, Inc. Pro108 antibody compositions and methods of use and use of Pro108 to assess cancer risk
EP2093298A3 (en) 2003-10-10 2009-09-23 Deutsches Krebsforschungszentrum Compositions for diagnosis and therapy of diseases associated with aberrant expression of Futrins (R-Spondins)
RU2343158C2 (ru) * 2004-01-27 2009-01-10 Ньювело, Инк. Желудочно-кишечный пролиферативный фактор и его применения
US7439327B2 (en) 2005-01-18 2008-10-21 Nuvelo, Inc. Stem cell factor-like proteins and uses thereof
DK2081586T4 (en) 2006-10-20 2019-01-21 Deutsches Krebsforschungszentrum Stiftung Des Oeffentlichen Rechts Rspondins as modulators of angiogenesis and vasculogenesis
WO2008088524A2 (en) * 2006-12-28 2008-07-24 Nuvelo, Inc. Thrombospondin-domain-deficient r-spondin 1 protein as gastrointestinal tract epithelial proliferation factor
AU2013203352B2 (en) * 2007-07-02 2016-10-27 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for treating and diagnosing cancer
HRP20151261T1 (hr) * 2007-07-02 2016-01-01 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. Sastavi i postupci za lijeäśenje i dijagnosticiranje raka
CN102439135B (zh) 2009-02-03 2014-04-30 荷兰皇家科学院 用于上皮干细胞和包含所述干细胞的类器官的培养基
EP2412800A1 (en) 2010-07-29 2012-02-01 Koninklijke Nederlandse Akademie van Wetenschappen Liver organoid, uses thereof and culture method for obtaining them
US9752124B2 (en) 2009-02-03 2017-09-05 Koninklijke Nederlandse Akademie Van Wetenschappen Culture medium for epithelial stem cells and organoids comprising the stem cells
EP2419133A1 (en) * 2009-04-15 2012-02-22 Deutsches Krebsforschungszentrum Rspondin-3 inhibition in bone disorders
AU2010300713A1 (en) * 2009-09-29 2012-04-26 Dart Neuroscience (Cayman) Ltd Genes, methods, and compositions related to neurogenesis and its modulation
EP2977060A1 (en) * 2009-12-23 2016-01-27 Deutsches Krebsforschungszentrum Receptors of rspo2 and rspo3
AU2013204484B2 (en) * 2011-07-15 2016-05-12 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. RSPO binding agents and uses thereof
JP6185463B2 (ja) * 2011-07-15 2017-08-23 オンコメッド ファーマシューティカルズ インコーポレイテッド Ｒｓｐｏ結合剤およびその使用法
HK1211037A1 (en) 2012-02-11 2016-05-13 霍夫曼-拉罗奇有限公司 R-spondin translocations and methods using the same
EA032038B1 (ru) 2012-07-13 2019-03-29 Онкомед Фармасьютикалс, Инк. Rspo3-связывающие агенты и их применение
CA2905830C (en) 2013-03-12 2022-01-18 Curegenix Inc. Quinazoline and naphthyridine derivatives useful in the treatment of cancer
TW201940514A (zh) 2013-10-18 2019-10-16 美商建南德克公司 抗-rspo抗體及使用方法
JP2017528523A (ja) 2014-09-16 2017-09-28 オンコメッド ファーマシューティカルズ インコーポレイテッド 線維性疾患の治療
WO2017095918A2 (en) * 2015-12-01 2017-06-08 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. Methods for treating cancer using rspo3 antagonists
EP3443004A1 (en) 2016-04-14 2019-02-20 H. Hoffnabb-La Roche Ag Anti-rspo3 antibodies and methods of use
EP3568158A4 (en) 2017-01-11 2020-11-18 The Board of Trustees of the Leland Stanford Junior University R-SPONDIN SUBSTITUTION MOLECULES (RSPO)
WO2018140821A1 (en) * 2017-01-26 2018-08-02 Surrozen, Inc. Tissue-specific wnt signal enhancing molecules and uses thereof
GB201721615D0 (en) 2017-12-21 2018-02-07 Koninklijke Nederlandse Akademie Van Wetenschappen Immune cell organoid co-cultures
EP3820499A4 (en) 2018-07-09 2022-07-13 Surrozen Operating, Inc. TISSUE SPECIFIC WNT SIGNAL ENHANCEMENT MOLECULES AND USES
CN110218740A (zh) * 2019-05-17 2019-09-10 深圳先进技术研究院 一种用于快速检测经典Wnt信号通路活性的脑血管内皮细胞系
CA3198268A1 (en) 2020-11-16 2022-05-19 Surrozen Operating, Inc. Liver-specific wnt signal enhancing molecules and uses thereof

Family Cites Families (54)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA1284931C (en) 1986-03-13 1991-06-18 Henry A. Erlich Process for detecting specific nucleotide variations and genetic polymorphisms present in nucleic acids
US5223409A (en) 1988-09-02 1993-06-29 Protein Engineering Corp. Directed evolution of novel binding proteins
US5143854A (en) 1989-06-07 1992-09-01 Affymax Technologies N.V. Large scale photolithographic solid phase synthesis of polypeptides and receptor binding screening thereof
US5427908A (en) 1990-05-01 1995-06-27 Affymax Technologies N.V. Recombinant library screening methods
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
ES2155822T3 (es) 1990-12-06 2001-06-01 Affymetrix Inc Compuestos y su utilizacion en una estrategia de sintesis binaria.
US5322933A (en) 1992-05-07 1994-06-21 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Crystal structure of TGF-β-2
ATE301201T1 (de) 1993-06-07 2005-08-15 Vical Inc Für die gentherapie verwendbare plasmide
US5856116A (en) 1994-06-17 1999-01-05 Vertex Pharmaceuticals, Incorporated Crystal structure and mutants of interleukin-1 beta converting enzyme
AU723325B2 (en) 1995-06-23 2000-08-24 President And Fellows Of Harvard College Transcriptional regulation of genes encoding vascular endothelial growth factor receptors
WO1998018947A1 (en) 1996-10-31 1998-05-07 Smithkline Beecham Corporation Methods for the characterization and selection of rna target motifs that bind compounds of pharmaceutical use
WO1998041539A2 (en) 1997-03-19 1998-09-24 Genetics Institute, Inc. Secreted proteins and polynucleotides encoding them
EP0977853A1 (en) 1997-04-25 2000-02-09 Genetics Institute, Inc. Secreted proteins and polynucleotides encoding them
US20020065394A1 (en) 1998-03-18 2002-05-30 Kenneth Jacobs Secreted proteins and polynucleotides encoding them
US6485972B1 (en) * 1998-10-15 2002-11-26 President And Fellows Of Harvard College WNT signalling in reproductive organs
GB9828419D0 (en) 1998-12-23 1999-02-17 Smithkline Beecham Plc Novel compounds
AU6117000A (en) 1999-07-26 2001-02-13 Genentech Inc. Novel polynucleotides and method of use thereof
WO2001009316A1 (en) 1999-07-29 2001-02-08 Helix Research Institute Novel genes encoding protein kinase/protein phosphatase
US6824973B2 (en) 2000-02-03 2004-11-30 Kirin Beer Kabushiki Kaisha Method of promoting stem cell proliferation or survival by contacting a cell with a stem cell factor-like polypeptide
US6653448B1 (en) * 2000-03-29 2003-11-25 Curagen Corporation Wnt-7B-like polypeptides and nucleic acids encoding same
AU2001253012B2 (en) 2000-03-31 2006-02-23 The General Hospital Corporation Methods of modulating hair growth
WO2001077169A2 (en) 2000-04-05 2001-10-18 Kirin Beer Kabushiki Kaisha Methods and materials relating to stem cell growth factor-like polypeptides and polynucleotides
US20030022255A1 (en) 2000-12-22 2003-01-30 Morris David W. Novel compositions and methods for breast cancer
US20040077048A1 (en) 2002-01-30 2004-04-22 Warren Bridget A. Protein modification and maintenance molecules
JP2005503108A (ja) * 2001-01-31 2005-02-03 インサイト・ゲノミックス・インコーポレイテッド タンパク質修飾およびメンテナンス分子
EP1360199A2 (en) 2001-02-16 2003-11-12 Genentech, Inc. Treatment involving dkk-1 or antagonists thereof
US20100305003A1 (en) * 2001-03-05 2010-12-02 Arca Biopharma Inc. Methods and materials relating to stem cell growth factor-like polypeptides and polynucleotides
US7411052B2 (en) 2001-03-05 2008-08-12 Nuvelo, Inc. Methods and materials relating to stem cell growth factor-like polypeptides and polynucleotides
WO2003029405A2 (en) * 2001-08-30 2003-04-10 Nuvelo Methods and materials relating to stem cell growth factor-like polypeptides and polynucleotides
CA2443713A1 (en) 2001-04-06 2002-12-05 Incyte Genomics, Inc. Proteins associated with cell growth, differentiation, and death
WO2002100898A2 (en) 2001-06-11 2002-12-19 Kirin Beer Kabushiki Kaisha Polypeptide having an activity to support proliferation or survival of hematopoietic stem cell and hematopoietic progenitor cell, and dna coding for the same
US20030022217A1 (en) 2001-07-02 2003-01-30 Pe Corporation (Ny) Isolated human secreted proteins, nucleic acid molecules encoding human secreted proteins, and uses thereof
WO2003027230A2 (en) 2001-08-03 2003-04-03 Incyte Genomics, Inc. Cell adhesion and extracellular matrix proteins
WO2003025142A2 (en) 2001-09-16 2003-03-27 Nuvelo, Inc. Novel nucleic acids and secreted polypeptides
AU2002339946A1 (en) 2001-09-19 2003-04-01 The Goverment Of The United States Of America, Represented By The Secretary, Dept. Of Health And Hum Maxp1
JP4224624B2 (ja) 2002-04-26 2009-02-18 協和発酵キリン株式会社 造血幹細胞または造血前駆細胞の増殖または生存を支持し得るポリペプチドおよびそれをコードするｄｎａ
AU2003228872A1 (en) 2002-05-10 2003-11-11 Incyte Corporation Cell adhesion and extracellular matrix proteins
JP2006517094A (ja) 2002-10-22 2006-07-20 ヌベロ， インコーポレイテッド 新規核酸およびポリペプチド
WO2004099408A1 (ja) 2003-05-09 2004-11-18 Research Association For Biotechnology 新規蛋白質およびそれをコードするｄｎａ
US20050054829A1 (en) 2003-07-22 2005-03-10 Wiley Steven R. Compositions and methods relating to TSP-30a, b, c and d
EP2093298A3 (en) 2003-10-10 2009-09-23 Deutsches Krebsforschungszentrum Compositions for diagnosis and therapy of diseases associated with aberrant expression of Futrins (R-Spondins)
RU2343158C2 (ru) 2004-01-27 2009-01-10 Ньювело, Инк. Желудочно-кишечный пролиферативный фактор и его применения
US20060147946A1 (en) 2004-01-27 2006-07-06 Pinchas Akiva Novel calcium channel variants and methods of use thereof
US7439327B2 (en) 2005-01-18 2008-10-21 Nuvelo, Inc. Stem cell factor-like proteins and uses thereof
US20090036369A1 (en) 2005-07-26 2009-02-05 Kirin Pharma Kabushiki Kaisha Anti-tumor agents comprising r-spondins
US7541431B2 (en) 2005-09-07 2009-06-02 Maine Medical Center Cristin/R-spondin ligands active in the Wnt signaling pathway and methods, compositions and kits relating thereto
US20090118176A1 (en) 2005-10-07 2009-05-07 Emtage Peter C R Stem Cell Factor-Like Protein Scfa1 and Uses Thereof
DK2081586T4 (en) 2006-10-20 2019-01-21 Deutsches Krebsforschungszentrum Stiftung Des Oeffentlichen Rechts Rspondins as modulators of angiogenesis and vasculogenesis
HRP20151261T1 (hr) 2007-07-02 2016-01-01 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. Sastavi i postupci za lijeäśenje i dijagnosticiranje raka
EP2419133A1 (en) 2009-04-15 2012-02-22 Deutsches Krebsforschungszentrum Rspondin-3 inhibition in bone disorders
WO2010129284A1 (en) 2009-04-27 2010-11-11 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Inhibition of hair follicle growth by the wnt inhibitor dkk1
EP2977060A1 (en) 2009-12-23 2016-01-27 Deutsches Krebsforschungszentrum Receptors of rspo2 and rspo3
GB201106395D0 (en) * 2011-04-14 2011-06-01 Hubrecht Inst Compounds
JP6185463B2 (ja) 2011-07-15 2017-08-23 オンコメッド ファーマシューティカルズ インコーポレイテッド Ｒｓｐｏ結合剤およびその使用法

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