PT3125876T - Nova utilização de n, n-bis-2-mercaptoetil isoftalamida - Google Patents
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Description
DESCRIÇÃO
NOVA UTILIZAÇÃO DE N,N-BIS-2-MERCAPTOETIL ISOPTALAMIDA
Campo da Invenção
Esta invenção refere-se â nova utilização de um composto queXante de rmetal peseno conhecido. Técnica Antecedente e Anterior
Doença pulmonar obstrutiva crónica ÍDPOCi} ê uma doença pulmonar obstrutiva que se caraoteriza por flato respiratório cronicamente traoo, per da de fôlego, fosse e produção de espato.
Pensa-se que a DPOC a teta sm todo o mundo quase filé 00D OOP indivíduos. h grande maioria dos pacientes cora DEOC slo fuma d ore s ou ox-fumadores, A DPOC è conhecida por ter mu i tao causas posaiveio, sendo amais comum o tabagismo. (Dutras causas incluem poluição do: ar, particuiarmente da queima de combustível (por exemplo, fumo do lenha) . Também se pensa que existe uma componente: genética no distúrbio.
Entende-se que a DPOC é causada por exposição a longo-prato a estes irritantes,: originando uma resposta inflamatória nos pulmões. Isto resulta na constrição dos: brônquios e doetruíoêo do tecido pulmonar (enfisemaç < ãpoaar de se pensar quo a DPOC è uma doença em grande parte prevenivel ípor exemplo, reduzi ndo a exposição aos: parõgenos que a cansam) , ainda é a terceira cansa de morte mats comum era todo o mundo. õ tratamento· dos doentes coloca um dosa fio Significativo, os tratamentos de ponta atuais incluem broncodilstadores e com: 1 cost oro; des inalados:. Contudo, redução cio; fluxo reap ira tori o em doentes com DlOC em geral não melhora siqnificativamente: com a administração de medicações at da Imante empregues, o que: significa due são empregues, com i requeue i a medidas ma:is drásticas, incluindo: terapêutica de oxigénio e até transplante pulmonar. 0 agravamento dos sintomas requer, com frequência, hospitalização.
Devido à falta de tratamentos eficazes, a carga ............|:p:pdqiti|.C::||dÍ é en;fÍi:§| tendo s i4o|ls t:|i|d:f: |'r||$r.flii(|: I!|m: |ÍíO|(j:|!!|:i|!!!oU:StO Spf jp-eCQn.ÔraÍ:CO}:):):dp ii^r^i^ tiiiiadxci.â: l|il| a longevfladi" aúmelfa Mí ;^m dsêéBõlvimentο . :||;§ OE, :ql.4u:Í:te:':':4ÍÍê;tq!Í i de tratamento dos 2 milhões de pacientes raais afetados é cerca de €30 bilhões por ano (€15,000 por paciente por ano}, Os custos diretos de tratamento dos outros 20 milhões afetados é cerca de €10 bilhões !€S00 por paciente por ano) . O custo total é, .||p s ||m|; cerca de €(ll!p;|: Éliiiifρ|*ρ§........ihdlpihlo|:p.u:| tollind||éfbf1|
Jipi #.:õiês|:|||ie:v:ldii: a §§r:da. dp|i||iib:dut ivi dadelllifedmo rblpezê| ii f i:ii: .illtiuilpr comd:|||||na f;DÒCi|||o qiip|||Í;|:l/aoi:Ona. ||j|f|a pais||§| ouStdlppPl Jlf t:|it|m|n:to'::||||i §.....íÍ:SBÍ4|||ex|ist|||uma. Illiiils idade lih-ormii. ηΊ|| :|||ρ 1 j|h loa íii:n.t a ||||>ρ;| n|§ as dlddlllli 1 .hçrpplit r a fcflten toll d||| O#p0:i.l|:|| Existe também uma necessidade evidente por terapêuticas mslh.ora.das capazes de alvejar processos patológicos chave com o potencial de modificar a progressão da doença, reduzir o número de pacientes que progridem para os estádios mais severos da doença. IIN, N soft a! a||lil|||| (NBMI }|||||||p||| revelada primeiro na Patente US número US 6 586 600 B2. A sua :;Ι||:ύΐ;1:;1;1 como um sup 1 emento dietético p......no alívio do stress......f oxidativo é revelada no pedido de Patente US 2010/0227812. NBMI é conneGida por ser um quelarvte poderoso de metais pesados, incluindo mercúrio, cádmio e chumbo. Ver também Patel et al, Toxicology Mechanisms and Methods, 22, 383 (2012).
Análogos de NBMI foram revelados, entre outros, nos documentos US 8 42 6’ 3 68 B2 e os pedidos de patente |f 2011/038385 e......WO |o;Í|:|ll|||i8l|. |||pp:|:|iudi* nenhum dos dÍoú|5ent.o||p|||ia:fÍÍtÍlmé|ç|dh:ifb.||h|:/::: llll revela p ut ilização potencial de NBMI pu)f dmpostps iip.çipf |ρ:|s^: no tratamento potencial da DPOC.
Era geral sabe-se que ocorre aameato do stress oxidative dentro dos pulmões e sietemicamente em pacientes com DPOC, ambos como resultado da carga oxidativa do próprio fumo de cigarros e da libertação aumentada de espécies de oxigénio reativo {EQR} de células inflamatórias ativadas como um | fe|i|lÍ;|do.v||||||| Células ír::è:^ ' S:;|ííi:i&tt enzimaticos que regeneram ascorbato do seu produto oxidado, ji:débi:irb|;iiexba:|;|;: |' DtíÃ|; 11 ^iidireqindiip..........ápaimf :ials::Slali:OJp:da:Ç:|:l|l|| I |br|f eililiel pliailprodul:bÍ:l W' ^111Ι::ό:Ι'Ι^Ι11ί::,::ΙΙ":: bliípb: II a|il|dx'i|li'té (iiti po,r| :al||::pro:Íl........''B|::|çhg§|ll|||| ||;p;i||.iys|||||| 5UQ Jll.lf 7 (tlil|yi..........iiii|||iébliisi|ii;...... é, póllanly essencial para manter concentrações celulares de ascorbato e pode ocorrer ou enzimaticamente através da ação de lldllidból:ll©rba|l § eduφ^Ρ^ΡΓίΜΡΐ......como glutaredoxina......||pif:
Saaranen et al, Antioxid. Redox Signal., 12, 15 (20iQ,!) e proteína dissulfeto-ísomerase (bardai et al, J. Bioi. Chem., 276, 8825 (2001)), bem como não enzimaticamente através da sua redução por GSR (Winkler et al, Free Radie. Bioi. Med., 17, 333 II (|||# )|||||||
Um estudo recente .mostrou que a infusão de ascorbato IlIniéNtélll^llIlires is f ên cia lâli§id:ig.á||: m§;sdlf a |C ::|;ésq:ue lllaliNutllllóm DPOC I:e||||||||pl:.. J............. |||bfIIIl|||||||uX, Integr. % Íl||||:|l|f JlIfiiF? ’ I Verificámos bpyp:|ól||pfè (Jb|Í ji|l||ã|á^l|||||......i:n||ir"............. |||ib|b|:a||||||é' marcadores ί|ύ||||·ρ||:||a||:.r±| s|pbavé||||||||omo lln|èillé|||||~ 6 i|!|;i| § | MfNlllIt^lMlF (]|l§p> e 1|||||||||^ ||||;lblel||||Í|r;ai IÍ|aNN|(:#Í|||||:||| Í|ã§; eo||é;|idos §11 ............... expressos em pacientes com DPOC (ver, por exemplo, Ruemi, et
Hli.!) li ι|έί^Ι#^^Φ^!!ΙΙΙ|χ·||> l1B: ^ ||t| §1.1 llllllfMelll, I 103, )||||||||l;||| e|T|pg||||:|| intepfexon.......... fc.stJiiSill |||||η||| sj§a|| |||||||^SP|||:,J*> lill||i|| Feb 2:||!!!||s i^íjé^II^IIIIHIINIIMI^IP^Ií^ IÍIlllHí' II la|||: de re|i||||r :|||:g|pã|N||||i|·|| 1° ::|||||õ I8· lllHlJllll*3 IJaM lils resplllllbi|èI§§:§;§§;> ͧ§M|§b#~be q|| b|||||||| !|Μ;|α!!| .es§a .:§||ο· |fu|||iiià nd:o|||||3o d;||||||i||pel elêtrõ es||pi r a ||| ||:|ê:d§.c;lÍgçm|| ||||:de|| |!!!ipc:^rbpi|ii|| libfeeèr^iiíiis^ ||||| |||:u f p r |pndeit:p|)|n ti, |;|:|| N BMI ;p|Í:il s e r 1¾ a p acJippe s !1!1
Jllpafp lll.rat'lp |||fQ|| fc-i slnt díiil: é|||| ,|!!f mg|l||.eandp;||pul||dp||§ progrpiito , | sem opÍ:||dar|||| :g|e ifls ::s||d||di p|ps||i|ve rs o -s ii||ilf' iillii|||l|
Revelação da Invenção
Ilf Í||||iÍpop|i|í :Ci|Í;|| vira prllillo |iipéii|||pá| inv#$|;I| e||||| cs-ri^i^|^|iiip:^MXΙϊϊ^ίνί um: sai :ÍiÍ:||iacpl|lG||||l:fcp| âepjfÉiiit dol|||| ::::|||||sp||| cm dé::Í|bad'©|Pi| mesmo, p|p|||tít|i|adãpli||imli mlibi|i||||a'da |||| :|||||l5tra:|px :J|0£l 'tpIlllldxl/iaapãGlIlIfmpipeadwIlilIrBpnJilliliilll^ma. gpi|t'd:||iií:. farillililcsmeniê élliát ||e dBMl|||| eft.....:|iil|ii|· dm 1| P||:§si§ptspd r a t amáppG''!llllll ||ÍI::':texillll^iill:" se·râ,|||:nteiilld©' com© las cor.diçõe s pito1 óglmas. r e f'ail|pap|:ii|;li terat urillde |lipli|lpiil a da ssjjg "doença pulmonar oM|^|Ílíp||Íló;nloa (BFlff das |||||||1:||:|ÍP ;||||ii:ipiipi:dxl.as |||||ÍÍ1 milip a critlffu |||í (;'1ÍÍÍ€1 .............. ....................................òa:pi.pfiilddad'ii|...................^por:..................illiipliolllllilpox·"·"·"·......f. i uxo...................................... cronicamente fraco, perda de fôlego, tosse e produção de esputo. IIIF Para evitar ^;Í:ídÍb|||ÍÍl!dCHÍ:lÍÍG da presente invenção, θ:|||||| termos "tratamento", "terapêutica" e "método terapêutico" ...................incluem o tratamento terapêutico ou paliativo de pacientes em..................... necessidade de DPOC ou outras condições patológicas relevantes t||||:. menciona da s aqu ||| llSipliPlpl;:" 1® item........pipippt ;ê s|sSum í camente aSltlvllitlIde) que pdii||||ier '':1|||| mililinados· indldêtv alcalino :|:|rros|l|l maÍ||:particu':i|||||itO: 1|||alçá.li, saielÉé P|tÍ:l., tais comlliaís· |!||11 i:i:|||pdio, pob|Í:|§|p, :|||:ubidlo:,; .:,::pi;ildi: e| fi|:ânclo:. ,::il|:|||Í::il|:ppllê: ser1 ©rmaÉI®· polliilios |i:iie:npldnal:|::|i;pd;r.................. llÍ:É|lõ?pipd;r......rêlçã# ddlMlJl com pÉldp raais equivalentes de umi||||| base apro||Í|;Í:Í|:,Ifâpclbdiliieuiê num solvent! ou num me.io no qua;i|||| llissal é insolúvel, de dito solvente, ou ditillll meio, utilizando técnicas padrão (por exemplo, em vácuo, poillll liofilização ou por filtração) . Os sais também podem ser 'Od.fiÍlííí^ti' X SiilP'f;i a ^ fW^MP%IÍk ......:d0li;Uítl|sá 1 ííí|om!í|>.u:fcro :((udb|:raplpq::,: |pp:||||:|i:|;pp::|.p:\ utxiizado............. .......%m$.....gi:p:bI§a iidl t|#:cpl|d« ib|i:. |:|ρρφφ. !||||||||||||! '::1||||::.:Dirlpadds .§ |.rr|§;ceutl:pdpe:i:| e &d@;:; NBMI incluem':: gl. Slid, ioJi:. , di pie |b: A..........ácido ||§ i 1:1::1:1.:1-11. drolipoico p % c is tarn ina, .............. tiolfosfato, 5'-tioladenosina, L~homocisteina, co~enzima A, 2-mercaptoetanol, ditiotreitol, icdoaeetato, bromoacetato, fluoroacetato ou derivados de cioroacetato, Tais derivados podem ser preparados conforme descrito no, por exemplo, pedido de patente US 2011/0::23777 6.. 53BMI, sais farmaceuticamente aceitáveis do mesmo, e derivados farmaceuticamente aceitáveis do mesmo sào doravante coletivamente referidos em conjunto como simplesmente "MBMI".
De acordo com um aspeto adicional da invenção é proporcionado, uma utilização num método de tratar D.POG num paciente administrando NBMI || |||||;|||||||||li;s:f: f suficiente, farmaceuticamente eficaz capaz de regenerar ascorbato (por ...........piempl d>............paciente..........:....... IIIIIA,! piilpdá iibabitliialiii! :| p||AlÍ|::::::::::bo:n$p pui·"""™ |’'psÍ:orlaÍÍ::|| |a||bém||||:ie|i|i;f i^erlillide f:|rm| Jiiippiii^i^pidL^" "ii;·- -=-=-=-=-=--- I ::I.|t.ér:á|diil!!çpip pipo rb pep, ||p||ÍdO' Ij|-i:pdÍrbic.o^|le::/;Í'ú lt;:;l',/::til:tamiba:l €.:| Í;!;P:Dmorblclez:: i iiidpipliplpe. .. respiratória, o risco do qual pode, de acordo com. a invenção, |l ser reduzido com NEiMI. |||||||||
De acordo com um. aspeto adicional da invenção é | |pl:o:|:br:|(íp|l|dd:: ,n'u% risco de jiui.1 lllbto :|.y||||epfn||Í||§||.b:i p xólp:||ipi!! | Ipailliti, gpil^ipiiiidp:......p:|^:iiij:r|'| Ν^^!||§(| itiiájiiP |>^:^±^^:fce--|í|;pi;ps exibe sintomas de DPOC. O termo "morbidez" será entendido pela pessoa habilitada como incluindo qualquer, peio menos, estado da doença | í , ||dÍfidi:Í;n:Gp:|Í ou enfermidade âiUvSÊÊÊ | fraco estadoi:di......respli|ip|-£.a” assim, tais estados exibidos como uma consequência de, por empõ· Ji! DPOÉill
Verificou-se que NBMI é útil no alivio de sintomas de DPOC, incluindo fadiga (por exemplo, fadiga muscular esquelética}, perda de fôlego, tosse e produção de esputo.
De acordo cora um aspeto adicional da invenção é p r o p orei o n a d o uma utilização num 1¾¾¾ |1 ntornas da Df3$té que|f§adêce de .DDGC|||||||· c:ort|f;|:§ηdil || slliadmilistfllll'KBil |a ||i|||||clente|| ppjpar dl! t;a:sio-s!!! -coitío· tal,,!!! llllli zdpde.s jpp § ..........de!!!:|:ddp|l!!!:ill! a infinçâO' i.nci:||m|!||| pptipffi |i|f || ris; nos.|||uais o pac|ln|:||| uí| |f|m.|;|fr ||| dl| ê um: ill.......ip|!ídfÍÉl.Z'|;dôiii(li:i:çii tas ipui., NBMI e|p|:e:i||:|p;ilp llmlllflrada l:d|.a|l|i|i!!:i;u si.s§:|m±cam@ptp|!ii|^.....
Illlllllψ iè o.r a 1,|| in t fIVi,nf. raidr t e r |i|t ;||||ΐ^ ' "Ip. |p:.a.iã:llÍÍÍ:r i!!!d u||||i:|:|||i| ||oti||.s:' dosa gera/dispo sitivo s .............p|flllllllllll!: :!!|^||;!|||||ΐ;!^Γ^!:|-|ρ }J| intramuscular, ;;;!!!%;ul::|i|a::,..............................(por..........exemplo,...............por..............via.................... '''tiip1.} , repi:|||: transdô,r:mica, nasal, pulmonar |||| ....... lp:l:i exomplÍ|!:!:|pr .xnal,a:Ç:ão:|!!l::|a||e:al ou bronquial) , tópica ou ||f :ί;;ίΙ^;!|1ί:ΐΐ::±::ά. via pare:nti'r.|:ia., na forma de uma preparação |1 '|ãpli|Í|:Íl;||:a '(puell comp teend.e: o !::|o:m|d:SÍ:%:.:,numa forma de dosagem || |||||||:. fadiaa'ceutiieffierild uce.i. Ldvei. ||i|Mpd|p. ppildiiddS:.........rilel entrega |; i!!!!!iidiu em... e n f|e.g aldra i| {pa r ti ou,li.rme n te j||.....dililiilvipo s:o||||lll.án 1% jf
Iditdúlpmép :||dpp â:||, iniramuiçular di íll:|lp|lit;pdlÍ;ll X .âdmin.|i'trada.|iá ..fdlÉalpe^íilp. d|||ma.i:iii | Illlllll fpf:mu LaçÔé|:: llflrítloiiticas ná|| mistira. ipt ||ur||||àd;3 uf:|.ntél: I l||d| iilpppip:: oú||v ||cu Iplllirma ceut.i iame n:t |||a c ei| ávfl ||pu e;;|:|p|(f| sil || lldíl-llldilídoll 'ãfplâiPdõ de fôrma |i:|.pto'||r::||:da|::' .||||||i:||||||e 1' |:d|ílpi:ifi||ç:|o pidfiilÉida e prática £ci#Í!j|iftí:|^iPd:^|iifôq:|!i ^|||ϊί^:ί|· * f lil'dilillllVedqulos iitrlac eu t i eaminte ||||á:ceibdf e f d |||po:de|í ||||ér| |
quimicamente inertes I quaisquer efeitos secundários prejudiciais ou toxicidade nas condições de utilização. Tais veículos farmaceutíeamente e||p c ei t áve i s t. arabém podem transitu t i r u ma 1 ifoertação i medi ata ou | !!!!!!!ieil:fi.£a>da de WBMT.
Formniaçoes £arms;|§||^ adequadas podem iiillir comercialmente disponíveis ou de outra forma são descritas na literatura, por exemplo, Remington The Science and Practice of
Mali! Pllptlhglil Company, 11E|Í|§1| Pennsylvania (1995) e Martindale -:¾¾ibt (35a Edição) e os documentes referidos aqui, as revelações relevantes em todas cujos documentos são incorporados aqui por referência. De outra forma, a preparação de formulações adequadas pode ser conseguida de forma não inventiva pela pessoa habilitada utilizando técnicas de rotina. Formulações para utilização com NBMI também sldllj descritas no Pedido de patente US 2010/0227812.. A quantidade de NBMI na formulação dependerão da severidade da condição patológica, e do paciente, a ser tratado, bem como do (s) composto (s) que ê/são empregue (s), mas pode ser determinada de forma não inventiva, pela pessoa . SSi:::: :ha:b::ÍÍ:|:|d.d 1 lipendlhâiild paiiÉnte a ser tratado, bem.....como da via. d.é||| I n !|ͧP Sfif | |ã:|i.Í:Íl siillll' | ·ί^;Ρί(||ίί^ρ·^ίί|ίί!ΐτ ± ||aC:ie:lli||im necelilliilde' :i||| I 'ÍÍ|::||lO .11 111 Cíiiiprit:xacdi^illl^liiiiiiiies3;-^lliiiiiiiMiii)|i^ a :Ílllii.umanplllhÍl(d:õntext.o .dill fill.....prêÉchie. iny|p|ifl. 'd|i|i(iillllpf l(s:h£.i.dll|hte piihillprevocar umllll resposta terapêutica durante idm peliodo dllllêmpo razoa· vê 11111: (conforme descrito aqui anteriormente) . Alguém habilitado na técnica reconhecerá que a seleção da dose exata e composição e o regime de entrega maís apropriado também será influenciado, entre outras coisas, pelas propriedades farmacológicas da 1 Idrmnlapão, .liiiil^luiiip e sevirlidáhalliiiilspdh® .......á................... | |p:|: pratada ellllllphllpâo flsfpáiil. aipida.de mintalillilirecetofllli. I'' ibêíhslpmp......a.......fdáiillpdhd içip:, pis © liiip© $allllitexiilllllbéipos ta d|ll|. paciente a ser tratado e o estádio/severidade da doença, bem corno diferenças genéticas entre pacientes. A administração de NBMX pode ser contínua ou intermitente (por e:xemplo:, por injeçâo em bolus) . A dosagem também pode ser determinada pelo momento e frequência de administração.
Doses adequadas de ESMX estâo, portanto, no intervalo de cerca, de e cerca de 110,0 mg, inclaindo entre cerca de 1 e cerca de 00 mg, por exemplo,: entre cerca de '1, 5 e cerca de 40 mg: dc composto por quilograma do peso corporal total, do paciente por .dia..
Em qualquer case, o: médico clinico ou outra pessoa habilitada, será capaz de determinar de forma rotineira a dosagem real, que será a mats, adequada para um: paciente individual. dosagens anteriermente mencionadas são exemplares: dó: caso médio; pedem existi r, obvlamente, ocasiôes, individuais onde sãe necessários intervalos de dosagem superiores ou inferiores e tais estão dentro do âmbito desta invenção.
Has utilizações descritas aqui, NBMI também pode ser combinada com um ou mais ingredientes ativos que são potenciaimenfe utels> ou foram indicados para utili cação, no tratamento de PFQG. Tais pacientes podem, assim, também vir: :á receber (e/ou estar ji a receber:;: terapêutica com base na administração de um ©u mais de tais ingredientes ativos, pelo qual queremos dizer receber uma dose prescrita de um ou mais daqueles ingredientes ativos aened.onados aqui, antes de, além de e/ou apo:s, tratamento. com KBMI,
Tais ingredientes ativos incliiem br on codi lutadores: de curta ação {tais como saibutamo1/albuterol, levosâlbutamol/lévalbuteroi ,· pirbaterei, epineirinu, efedrina e terfcutalina) , broncodilatadores de longa ação (tais como: salme terei, clenbuterol, f ormoterol, bambutero1 e indacaterol) , antlcoiinérgl.cos (tais come brometo: de tiotrégio e ipratrdpio), corticosteroidos {tais como fluaiselida, propionate de tlutí casona, t. r i ameinolona acetonida, dipropionato de beciometasona e bndesonida) , e outros fármacos utilizados no tratamento de DPDC:, incluindo antibióticos: de longa duração (por exemplo, macròiidos, tais como \\\\\\\\\\\.....lib ^1^111111¾¾ li ιιι
:lill^ .....ii^^iaii|i^iy| I ii||||ifí4| I, ||||||||i!||||j|| yj 1 III VIIVI!' §I;y.$ationa .aco t gidt 1:1%oh§ | fSÍ'Í|lll âbr d§ 1 11111¾ Λaci'do 1 1 po.l.ep:j |Ili|||||: ί|ΐ§ 1 MWfífi......iiiiillEii!.................|^l!ii;;|||lil:|g...............:Í:|m|||I1| IJjdJ ||| ||| dimercaptosuccínico (DMSA), ácido etilenodiaminetetraacéticc :|\Villl|?i|^),l.....e.......misturas........dos mesmos........... oais rarmaceuticamente aceitáveis de outros ingredientes il fí ' úteis no tratamento de DPOC que po dera s er mencion ados f inciuem sais de adição ácidos e sais de adição básicos.·. Tais 11'||fl:lll|PÍÍls;sÍÍÍ formados por meios | convencionaí|.
Doses adequadas de outros ingredientes ativos incluem, aquelas que são úteis no tratamento de DPOC são conhecidas 1111.d:;3L a#:. !ΐ.χ.:3:^11:Β;-2ΐ.3:- 0¾ itã;l f I !II.........li|e:r||dta médica, lllãlll como f| 11111 ;i|á:: t: £ 1 Jdl'te''v:-1'hpsspqilp^ Op q d Reference í 35 f |E dição) e 1 os 1 f ;|)|ίι|ΐ;|ΐ;|φ.|ίρ§1:||;$$||3^......relevantes em todas "t.dúgpsl" ddiQámeátd:l 1'sliSbf .pála, Ipri.s.elite, i rico r por adoSl |por 1)| lilteíiériêhOiia'.
.................iúiP.qúé:gá:piiãf:r i).....,>::di!di!:d::i;’! |e ja erap feqilp aiffúi.f: 1 por;;)J 1/% '::id;xiip;idl idilid;il)iitliidillpuiiliiadesl 1 t|ox exempl |dseI;; 111 ......::ápreciá:d;dligue tais| paliáifeqiillidSd;; '""illlsãpfdX:|iÉdÍ)|i:;eii:: çbÈo "pai........pbdem;......vaiqap Ipf:r ± 1 0 ti| p|;i' f § xil|||:i;q >;;;; ....... í % elipiiiieieúçll^lfcnte:.:.:ji:::l'l 1.xéN|i:o,," i |% liof| hiiliios;; sssssti^ iÍÍÍi::ÍÍu|Ippdfm. ter áf /?i|t:f gfim que 1;;;;i .::|1!::'' nosPratampn'po·. ::dÉ|ÍlÍ)|C:r%dÍém.....seiilítpia pdnpen ie nt 4d pilir'l dl medi co;; ::;::::;!Ϊ:;1::;;:::Ρ::': S:e!é!Íí|l ii®5 iií ^i°a MNl Í|: gÚ§r IpdPÍ®%ll: f iiig.fdde mal 0:1:). Í|| |t:|'VÍd;q|Í%llll li lio ,.gup|llserem páí sl podidipés id|:i|d:il ii ipif Qpu^iirerpiτΐϊ^π;:^ϊ;::% :Í!sÍÍlndͧIÉ:S. |:dl quel. ou que :||ίί|:||^ίί||^τΡ ϊ ii Jl iirrS|odiidiicai: lúpelpiem utá.i|)IÍ)§dédl {t ratament os} seme ihantes ; .lionhepiiilllllli 1 pgdfliea i i“%l lli^)illl terapêutica. Ά invenção é ilustrada pelo, seguinte exemplOv no qual; A Figura 1 ilustra,, num modelo de oxidação1 de ascorbato, oxidação de ascoroato para DBA por ãblQ-fenentrerequinerta £9> 10-FQ1, seguida de reciclagem úé DBA por NMSI e ditiotreltoi (Dl!} . A Figura: 2 ilustra, num modelo de oxidação de ascoroato, oxidação de ascorbato para DBA por CaBCu, seguida de NB1M1 e: DTT reciclagem de DBA. com adição de 10, 20 e 30 minutos, corri a oxidação de ascorbate e cinética. de reciclagem mostrada, no: painel da, esquerda e o salto imediato correspondemte e aumento prolongado nas concentrações de ascoroato após a adição oe BBMI e DTT mostrada no painel da direita.
inibição de I.L--6 e I.L-8 u ti ligando tíBMI
Secreção das oitocinas prb-inflamatorlas interieucina (XL)-6, TL-3 (bem como €M~CSF e MCP-1} em meios celulares em resposta a exposição de partícula foi, medida em: células ASlã e BEAS-2B utilizando b seguinte método. Células epiteiiais pulmonares foram semeadas a :5 x 1Q4: em plâoãs Gora: :.2:4 poços. Após pré-incubação com BBMI, o composto anti-oxidante, B-acetil-L-cisteina (;BAC)::, que foi utilizado como um controlo positivo, ou veiou 1 o, durante 3 horas o: meio foi removido.
Meios frescos contendo várias: partículas (conforme abaixo) em diferentes concentrações ficaram num. volume total de 0,5 mi durante mals 24 horas. Os sorrenadantes foram depois separados das células por centrifugação, IL-B, JL~6, GM-CSF e MCP-1 foram medidas no fluido livre celular ut í 1 liando o kit de desenvolvimento: de ELISA Duo Set (K&D Systems, Abingdon, Reino Unido) .. de acordo com o protocolo do fabric, an te.
Exposição a meío apenas serviu como controlo negativo. Cada experiência foi realizada duas vezes com 4 réplicas.
Em gerai, ambos dioxido de titãnio tipo P25 e pó urbano (referência SRM 1349 b) induziram a produção de oitocinas prô-Inflamaterias nas linhas de células epiteliais: pulmonares AS 49 e Η£Α3-2Β, O efeito da pré-incubsçào com 5:0 μ.Μ fIBMI. na formação de citocinas induzida pelas partieuiaé foi testada a várias concentrações de partículas relevantes. O estudo demonstrou que HBMl pode reduzir a secreção induzida peias partículas de citocinas pró -infiamatérias em ambasclinhas celulares, apesar da redução ser apenas, em alguns casos, reduzida para níveis de fundo.
As concentrações mats elevadas de XL-8 e IL-β foram conseguidas em sobrenadantes de células A 54 9 expostas a TiCc F25 a 15 pg/cro2. & esta dose, 50 çM tíBMI reduziram a secreção de 11,-8 com 29% e .11,—6 com 38%. A 100- pg/cm2 de Pó urbano em células A541, pré-incuéaçãc com 50 pM MBMI .reduziu a secreção de 11,-:8 com 301 e TL-6 com 36%. A 100 ug/cm2 de TiCb P25 em céluIaslBEAS-lB:, pré-incubação com 50; pM MBMI reduziu a secreção de II.-8 com 4 9% e IL-β com 371. Ά 100 çq /cm2 de Pé urbano em células BEAS-28, pré-incubação com 50 pM dBMl reduziu a se ereção: de iL-6 com 47%.
Pré-incubação com 5 mM MC também foi eficaz em reduzir a secreção de citocinas inflama terias.:
Regeneraçâo de Ascorbato utilizando NBHI BBMI foi examinada para verificar se poderia funcionar como um dador de eletrões para reciclagem de ascorbate. A cinética da oxidação de ascorfcato, sustentada por ambos .1 μΜ 9, 10-PQ e 2 pM sulfato de cobre íCuSCd; , foi examinada utilizando o ensaio dé dep] eçâo de ascorbato (Ke 1 1 y et ai, Rés. Rep. Health Xnst., 163, 3 02011) , 9r 10-PQ: foi empregue de modo que a ação de MBMI poderia ser examinada erc isoiamento das suas propriedades quelaties. iodas as experiências foram realizadas em trip.1 içado em placas de fundo raso com 96 poços U¥ (Greiner bio-one} a um volume: final de ISO pi. Is expos .i çdes foram iniciadas pela adição de 20 μΐ de um stock concentrado de ascorbate {2 mM) em cada poço contendo 160 uL de água tratada com resina Cheiex-100 {contendo 10% DMSO), mais ou 10 pL de água, solução stock de CeSO< a 4 mM ou 9, solução stock do 10~PQ. a 2 mM e 10 uL de KM SI { 4 mM e 200 pi},
Todas: as soluções foram preparadas em água tratada com resina: Oliélex-lQsO (contendo 10% DMSO ) . Estas concent raçdes; finais: produzidas nos poços de 200 ul ascorbato, 2 UM CuSCg ou 1 pM S,10~PQ e entre 10 e 200 uM de SBMT.
Imediatamente antes da adição do ascorbato a cada poço do ensaio', a placa foi pré-incubada durante 10 minutos a 3?0Cnure leitor de placa (Spectra Max 190): , Durante a exposição, a placa foi mantida á esta temperatura. Após a adição do ascorbato, a concentração remanescente em cada poço foi monitorizada cada 2 minutos: por um período duas horas medindo a absorvância a 262 nm, 1 concentração de ascorbato foi determinada com referência s uma curva padrão, com a taxa de oxi.dação de aseorfeato determinada realixando uma regressão linear através: da parte inicial de um gráfico de concentração versos tempo utilirando o programa Microoal da ©rigthLab da Limited (versão 5,0) * Isto foi realizado por caca dos triplicados e a taxa de depleçao de ascorbato foi final me nte expressa como mol s 1 x TQ·'- média de depleçao de ascorbato ± desvio padrão.
Para as experiências nas quais o impacto de adicionar Ν8ΜΪ ao ascorbato foi medido, ensaios de depleçâo de CuSCg e 9, 10-FQ foram examinados p o s t e r .t o r me n t e no- per iodo de tempo. As placas foram corridas com 190 pL apenas durante os primeiros 5S:-~€0 minutos,: após os quais foram removidas do leitor de- placas é 10 pL de ou a ΚΜ8.Ϊ ou do agente redutor conhecido., solução stock DTT ou água foi adicionado a- cada poço. ft placa foi depois devolvida, ao leitor de placa e a absorvância a 2 62 nm moultoriaaba durante m&is 60 minutos, C aumento imediato nas concent rações de ascorbato medidas foi determinado o é referido como o 'salto', como uma medida !!!;reciclagem irnedl ata Μ Ο ' aumento' prolongado .............ao longo dos restantes 60 minutos da incubação também foi determinado» A diferença entre os dois reflete a capacidade dos compostos adicionados para inibir subsequentemente a taxa de oxidação de ascorbato sustentada por CuSO* ou 9, 10-PÇ. A Figura i mostra a cinética de oxidação de ascorbato sustentada por incubação com 9,10-PQ ao lonqo dos primeiros 60 minutos da experrencia. Nesta altura, NMBI (200 μΜ) foi adicionada e foi mostrada resultar num aumente de retorno imediato no ascorbato oe 42,8 pM. Depois disso, a taxa de cxídaçao de ascorbato foi reduzida em relação ao período dos
Este aumento de retorno no ascorbato, que indicou a
Meçiblãllllpe' ll|Í :l|l 1 f<i para ascorbato,........foi surpreendente ί. C:|ii:p:|:|||n:| e supe ri or quando comparado com aquele 'll ,|^:ç:pbêp|ÍÍÍi:: uti|:|l:p|l|oi;i DTT, 200 pM} , que........atingiu uma menor recuperação imediata de ascorbato, 5,1 μΜ, que também não foi ......Is A Figura 2 mostra a oapacidade de NMBI de reciclar DHA no modelo de ascorbato CuS0$ a 10, 20 e 30 minutos na incubação. Focando nestes pontos temporais inicias, o aumento de retorno no ascorbato após a adição de NMBI foi mais marcado na maior das duas concentrações testadas, com a taxa subsequente de oxidação extinta., possivelmente devido às propriedades de queração do composto.
Estas experiências foram repetidas com a adição de NMBI e DTT (ambas a 200 μΜ) a 60 minutos. Isto revelou um 'salto' imediato na concentração ds ascorbato de 7,93 ± 6,58 μΜ com DTT comparado com um 24,98 ± 5, 54 pM aumento com NBMI. Ao longo dos restantes 60 minutos da incubação, o 'aumento' prolongado no ascorbato foi 10,79 ± 2,4 5 μΜ versus 2 3,-4:5 ± 2,45 μΜ pâra DTT e NBMI, r e s p e t i v a m e n t e .
Estes resultados indicam a propriedade até aqui desconhecida e surpreendente de NBMI, sugerindo que pode reciclar DHA de volta para ascorbato»
Exemplo 3
Tratamento cie paciente com DPOC
Uma molhem reformada que reside nos EUA, que tinha: sido diagnosticada medicamente com DEQC varloa anos antes, experimentou regul emente ataques de tosse duas a quatro vezes em- qualquer período de 24 horas, começando a qualquer hora do dia ou ucite e durando desde cerca de 19 a 75 minutos.
Como uma consequência destes ataques de tosse, a respiração do pacience tornou-se superfioial, a sua garganta ficou irritada, a sua voz rouca, os seus uiveis de energia muito baixos e a sua qualidade de vida piorou.
Tratamento três vezes ao dia la horas ds refeição) de doses de 1QÕ mg IBM! numa cápsula durante um período de oito dias resultou numa melhoria marcada nos sintomas. Ao oitavo dia de tratamento:, o paciente :n.|.o experimentava: quaisquer ataques oe tosse e melhorou siqnlfiçativamente a respiração.
Exemplo 4
Estudo .1 in vivo de ’’Bati nu o Fumador1'
Estudos mostraram que o f umo de cigarro pode induzir uma resposta pulmonar inflamatória em ambos ratinhos: C5"b 1 /6 e Balb/c quando expostos a 5-6 cigarros por dia, 5 dias por semana (ver, por exemplo, Ohhulst et ai, Eur. Respir. J,, 26, 204 (209:5): e lung et a i, BMC Complement. AI Le rn. . Med, , 13, 219 (1013}}.
Foi desenvolvi dó um modele de ratinho de doença das vias respiratórias induzida por fumo de cigarro :(FC) , no qual quatro grupos de ratinhos B.ALB/c foram expostos a FC (nariz apenas) utilizando uma máquina de fumo de cigarro que produz uma combinação de fumo· de fluxo lateral e de corrente principal de cigarros de pesquisa filtrados, 7 dias por semana ao: longo de 2 semanas.
Como parte de um estudo de pesquisa de dose de 14 dias, três: grupos de ratinhos foram administrados NMBI subcutaneamente: .(.5., 30 ou 1'5D mg /kg} antes de cada exposição a FC. Foram realizadas contagens de células inflamatórias em lavagem broncoaiveclar {BAL·:), .análise de citometrla de fluxo (FACE) e análise de citoeina em RAL.
Materiais e Métodos
Foram utili zados neste escudo ratinhos fêmea BAL3/e (Harlem laboratories, Holanda) :. Foram: alojados em jaulas de plástico com material áe leito absorvente e foram mantidos num: ciclo de lua de 11 horas. Foram proporcionados .alimento e água ad libit um. 0 sou cuidado e os protocolos experimentais foram: aprovados pelo Comité Regional de Ff ica An ima1 Experiências em Umeà. Os ratinhos tinham 12 semanas de idade guando o protocolo: de exposição ao cigarro começou .
Protocolp de exposição a FC
Os animais foram sujeitos a FC inalado: :(ambos fumo de fluxo lateral e de corrente principal), A exposição a FC foi realizada numa máquina de fumo de cigarro cent rolada por microprocessador (TF-IO, Teague Enterprises, CA, EUA) que produa fumo de cigarros de pesquisa (IRSF, Universidade de Kentucky, Lex i ngton, KY, EUA) .
Cigarros são a u t oma t i c a me nc carregados: numa roda, acesos, inchados e e jetados. Cada cigarro foi f irmado durante 10 minutos· e o fluxo respiratório através da máquina foi estabelecido para 12 L/min. Os cigarros foram armazenados a -20cC até serem necessários. Os ratinhos foram sujeitos: a 4 cigarros cada 10 minutos x 3 (isto é, 12 cigarros durante 30 minutos) , uma vez ao dia, 7 dias por semana:, durante duas semanas,: 0 fumo foi transferido para uma torre de fumo ; EMMS, Reino Unido) proporcionando exposição igual e simultânea ao FC,
Os ratinhos foram colocados em câmaras de plástico s sujeitos a FC pôr inalação "acenas peio nariz". Ratinhos controlo foram manejados cada dia e respiraram ar ambiente, mas na o foram retirados das suas jauias.
Em conformidade, os 5 grupos tratamento são como se segue: 1, Exposição diária a ar limpo (grupo Placebo} 2, Exposição diária a FC (grupo Placebo exposto a FC) 3, Exposição diária a FC; tratado com HBMI a uma dose 5 mg / kg (Grupo. IBM I 5 mg/kg] 4... Exposição diária a FQ t. ratado com: MBMl a uma. dos© 30 mg/kg /Grupo NBMl 30 mg /kg) 5:, Exposição diaría a FC; tratado com MBM1 a uraa dose 150 mg /kg ('Grupo NBMI 150 mg/kg)
No dia 15, os ratinhos foram exaanguinados e sujeitos a lavagem Prosed alveolar (BãL) . Os pulmões foram lavados quatro vezes através de tubo traqu&al com um volume total de 1 mL 1 3: x: 1 mL· Ca;· VMg:·* solução de sal equilibrado: de Hanks livre: (HBSS, Sigma-ãidrieh, Steinheim, Mlemanha}« 0 fluido BÃL foi depois centrifugado imediatamente (10 minutos:, 4 *C, 1750 rpm). Depois de remover o sobrenaoante até análise poster lor, a pellet de células f oi re see spans a e depois diluida com Qy5 mL· PBS. Os leu cod tos foram contados manuaimente num .hemoçitómetrQ de medo que 1:Q OOOi céluias pudessem ser carregadas e centrifugadas utilizando uma centri fuga Cytospi n@ (Shandon© çitospina 3/ cito^centrí £uga> sistema de preparação de células).
Preparações citoceatrifugadas foram: coradas com reagente: May-GrQnwald-Giemsa e foram feitas contagens de células diferenciais de células inflamatórias pulmonares (macrcíagos, π eu t ró £1 los, 1 i n f ó e i t os e eosinó £ il os): u t i li za ndo c ri t. éri o s morfológicos padrão e contando 300 células por preparação de cl to spin a.
Medi a dores inflamatórios era: bM., e so.ro foram analisados para a presença de interleucina ill] ~la;f IL-lõ., ÍB-2., IL~3, 11-4:, IL-5, IL-ê, 1IL-10, ΙΒ-ΧΙρ/Ο, IL-llp», 11-13, I.L17, Eotâxina,· S-DSF, INFf, GM-C3F, KC, MCP-1, MIF-lb, MÍF~I|3, ídVNTÊS e TM Fe. Todas as análises; de oitocinas foram realizadas simultaneamente com um kit multiplex (painel BloPlex™ Pro Ratinhe Cltocína 23~plex} de acordo com as instruções do fabricante (Bic~Rad; e analisadas num sistema 51 o-Fl exv* (Sistema Luminex Bio-Piex^ 200, Bio-Rad, Hercules, Cã).
Leucócitos de BãL foram analisados com citometria de fluxo utilizando ma BD iTlCSort™ (Becton Dickinson, San lose, Cã) > Células de 8AL foram ressuspensas era PBS cor:fora·e descrito aiiteriormeBté. Foi reai i tada coloração de ant icorpo em placas corn 16 poços com 2,0 x 10s cé l ula s/amost ra, Células; foram pré-incubadas core Ab bloqueador de 'FcH (ant:-CDl6/CD32 > clone 2.4G2J para reduzir ligação nâo especifica, Os rr.Abs utilizados cara i dent r ficar subtipós de células T for aro: CD3--FTTC Felons 17 A2):, CD4-PE (clame Hl 2 9,19) w CDBa-FE- Cp5 (clone 33-6.1) , Foram utilizados ant zeorpos cor respondi dos por isotipo corno um controlo negat ivo. Foi realizada cí comet ria de f luxo u till cabdc um 3D PACSortl* i Sector Dickinson, San Jose, CA) de acordo com o procedimento padrão e: analisada com o programa SD FACSDiva. Todos os anticorpos foram originados a partir de 3D Sciences Ptarmrngen (San Diego, CA), Células T foram definidas como CDÍt.
Os resultados foram apresentados como a média ± erro: padrão da média ΓΕ,.Ρ,.Μ) < A slgnlficSécIa estatística foi ataliada por métodos paramétricos utilizando uma análise -de variância de duas vias (ANDVA) para detérminár difereaças entre grupos:, seguida de um teste post hoc do Bonferron.I,. Quaftdo apropriado, foi utilizado: uma ANOVA de uma via ou um teste t não emparelhado de Student:, Cím resultado: estai. 1st ico com p<0,05 foi cons f dera do: s i :gn 1 fica 11 vo.
As análises estatísticas foram realizadas e foram preparados gráficos com GraphPad Prism (versão 6.0: programa GraphPad Inc . , San Diecio, CA, BOA.] ,
Resultados
Todos os animais foram pesados d:arlamente do Dia 1 até ao Dia 15, 2í horas após a ultima exposição ao fumo. Os ratinhos nãc tiveram quaisquer diferenças de peso significativas no Dia 1.: Po Dia IS, os animais no Grupo MH1MI 3 mg/kg tiveram um peso final inferior {1:9, 3 i Θ, 3 g) aos ratinhos: espostos a FC (20,3 ± Q, 3 g, p<0,.051 . Todos os ratinhos expostos ao FC independentemente da dose de NBMI peroeram peso si gniíicativamente do Dia 2 a o Dia 15, A contagem de células 3AL totals1 em animais expostos ao
15) nSo fox signi f .i cat ivamente superior aos grupos controlo {296 700 ± 43 650 com FC e 284 670 ± 63 200 céluias/mL ...........................................1 (iffS , P1 |o li|l| Ináulli um aumento ;:jy
ll: b§Õfrgf|ÉÍ| fítllil.g:|ÍÍ;|ÍAL (94 0 1 250 CO.m WZM .......plui nilM ||$, ^||||| i;3|llos' 1............' ||||p:jpp: |jf§M|! 30 '.!t||||| t ivllam
ilimlllo .iiifirto ||g| (d|: 11¾¾ txllill s |ii|: rllllldbl: (I apenas expo5tos a FC„ 11.VUa s;;semanas.............|||ao !Íllllln.ãí> 1111aumllÉÍl|Í|.Ill; signifccativamente os níveis de mediadores inflamatórios exceto para G~CSF em BAL. C Grupo NBKI 5 mg/kg teve niveis interiores de MIP-la comparado com o Grupo Placebo exposto a FC (P<0,Q5). Não existiram quaisquer outras diferenças significativas entre os mediadores inflamatórios analisados. Duas semanas de exposição a FC não aumentaram significativamente os níveis de mediadores inflamatórios no ll llllidp:^ ©:lGr dpp ÍBl f IS D mg /;||;: teve n ívei s s ignificativament e: j|P;
11111111111^¾¾^¾^ ......ilolixina.,..........MIP-lo........e........RANTES ll;lllllllll;ls||^ -lllG·, Q G r ||||1||||:| 3 Oligif : |
lillllllevóli^ ili soro.. ll||;||l|x:i:d|i|iai H 1111(111(1¾¾¾^ (li:g:diíii||a.iliva.s. é-fiti|ifâií^li^;i^liii^ ± 'siii|i: 11 ((11(11(((:(:(1:¾¾ to ........... íillliiiilll# ................lli::lllÍ|;ÓÓl.(lPO II FC d|||liiumeut|;|a|l 11 ((((1:(((:((:( -:1(1¾¾¾¾ S:.idi|i:igg (Igluias cd4: ou ·ο§(|||#:s:-:fip|| .....Não........::sxgridiq§||plill|nl|e|: | quaigner um dos grupos. ll/llllll^ .....nP^iiliÓs NBlil 15 0;·ίΐ|:/ II® t óldliilram Jólii: ddiinl· 1| lllllll:|;|||opg.........os.......l!âHliliÍ^ 1 ulceração nem. os Grupos Placebo* gvemjsio 2 s, „ r u d ο II in vivo de u Ra ti nho ~ Concluiu-se dos resultados do estudo descrito no Exemplo 4 anterior que duas semanas de fumo de cigarro possivexmenre foi temoo suficiente para xnauzix uma resposta ^ !'ϊ<ίν ...... (11111 / ri f |md:t (g ||· a. |;| ........................................................................ c^e dose.....an##«i; 1 l?( (ff dias utilizando essencia.lme.nte ip| | 5.17.10· 6QU I.p3íTlí?.rit Q Θ protOGOiQ titesCTltlò ΠΟ FiX^íripl O à r i Ο Γ >1 :f. desta ocasião, os 5 grupos tratamento foram como se segue: " * aposição dial Λα a ar 1 imp o (Grupo Placebo; Gr. 1) ..............~ > Exposição diàrxa çi^i a ΕΕ|(Ρ'Ρί.. p|| | 3. Exposição diária a FC; tratado com 14ΒΜΪ a uma dose de 30 iiiiiiiiiiiiiiiEpiy: ii gí j§s#iii^ ( i yj j p 4 . Exposição appS |pg|}:; | tPp(ãdP ;C;|iplÉ:pHllll (Ul|á dÓiSÓ d®|Ε01 mg/kg (Grupo N3MI 60 mg/kg; Gr. 4) .3, Exposição diária a cS; tratado com NBHI a uma dose de 150 mg§:|;b 1 (ilipp.....::§iME:sslÓ;Í (mg/ kg;I íGr |1 5'i llllllllllllllll bo ||a|p:||| os animais | fppgpl J| aàpsitesiidddd ::Çdp|i|:
||||||||||^^b|:pb:p J|; J:|> | |J ; JJ/ kg| (pf Sb:, dbpÒÉdfM ij.WL..M átJhhbd:!:!"" I ventilados mecanicamente de uma forma quasi-sínusoidal com um
||||||||||||||n| |||||||||1'||ΟΧ lilf|ii| íflexiVent™, SCIREQ®) :|lla " uma J '''''''''''fbz e uni volume:ícorren1e {vy) de 12 mL/kg p>eso corporal. Uma pressão expiratcria finai positiva de 3 cm de H*0 foi aplicada. | :: O produto cardiaco;;do animal foi monitorizado :ÍI|;|| |§:: Já,|: avaliação da mecânica respiratória. Os ratinhos foram
|||||||||p|||(lX:SadÍÍ com pancurônio (0,1.......mg./kg......II (fornecedores locais}) antes de 4 manobras de suspiro a 3 x VT serem realizadas no inicio da experiência para estabelecer a mecânica respiratória base estável e para assegurar uma história de volume semelhante antes da experiência. ||||||||||||||f''1|FO|. Impiljá! a me||^prii||pu.lm
ÍÍÍÍÍÍÍÍ!É;iÍé.d|ó padSuiiidó' sihniiilpâl irliHelP :::""de co-í|p|rl|Ée.h;:ffi ú:nicg |e:||lo||||if f' $i&|jiJi:ãy; originando fppKs tii:h:c:i:a!rpspi ratbf lp:l|i|||E') liillie 1 11 e c omp 1 a c ê n cia (Cks) · A medição de R*s reflete ambos estreitamento das vias respiratórias condutoras e alterações no pulmão, ã. medição de 111111 |E|| |||f:l'|te |J|na^!!||:v§:gafv;;;pi|rfet|:||ί I ;iJll^onalll:, ...................................plillpl!JlJIJi'fl ej|e|ra| jjt J||| das| | j|pj jjj/ |JsJ|latJl|aJ|||:: conducindo .a desreorutamento da unidade pulmonar. Em contraste, urna alteração seletiva em Cks 4 indicadora de ura local maio distal de ação.
Foram feitas avaliações maia exaustivas da mecânica pulmonar uti11zando técnica de oscilação forçada (FOT) de acordo com Jonasson et al., Respir . Res. , 9, 23 12008) e Respir, Pnvsíol. Neurobioi . , 16 8, 229 (2009) . Os parâmetros obtidos das medições FOT neste estudo foram: resistência Newtoniana (RísD amortecimento do tecido (Gj , que está estreitamente relacionado com a resistência do tecido e reflete dissipação de energia nos tecidos do pulmão; e elastameia do: tecido (B) *. que caracterl.za a rigidez do tecido e reflete o armazenamento de energia nos tecidos.
Foram determinadas curvas pressão ••volume {PV) dinâmicas inflando os pulmões a uma pressão máxima de 30 cm de Rol), permitindo exalação passiva utilizando o ventilador controlado por computador Fiexivemt para medir volume e pressão, foram compilados os resultados individuais de cada anirnal. Todas as medições de ?v foram realiradas em triplicado. Foram; obtidos loops ?v quasi-estáticos por uma inflação passo a passo lenta e defiaçâo dos pulmões. Foram realizados: 1 oops PV para níveis PEEP, 3 cm de HzQ, 0 fator forma (k) db membro descendente do: loop PV for calculado ajustando os dados á equação de Salacar-Knooies. Pensasse qae o valor do parâmetro k muda de forma caractorist ica com ambos fibrose e enfisemao A complacência quasi-estática (Got ) e elastancia (Gst) e c vol ume do ar inspirado suficiente para; atingir 20 cm de água também foram obtidos.
Foi realizada lavagem bronooalveolar (BAD essenciaimente conforme descrito no: Exemplo -I enteriorç como foi a análise de citometria de fluxo de células a partir de BAL e análise de mediadores inflamatórios em BAL. e soro.
Tecido pulmonar congelado foi homogeneizado juntamemte com 1 mL PBS num tubo de 2 raL, utilizando um moinho de mistura (Retch mméQO) durante; 2 minutos a 4'~'C. imediatamente apes a homogeneização:, o tubo foi centrafuçado durante 15 minutos ΙΊδΘΦ rpm, 4 o Cl . o sob rena d an te foi removido e guardado para determinação da concentração proteica utidizandc s® espectrofotômetro NanoDrop: fProteinas A280). Depots de analisar o conteúdo .proteico, quantidades iguais de proteína de cada amostra foram guardadas: para análise do fator de crescimento- transi ocmador beta (TG ;FB| i-3, TGFÕ 1~3 foi: analisado: simultaneamente utilizando um kit multiplex: (imu no ensaio Bi o-Plex Pro TGF-β S-Plex) em homogenado de tecido pulmonar de acordo com as instruções do fabricante (Bio-Rad) e analisado num sistema Blo-Plex™ fSistema Luminex Bio-Plex5** BQíl, Bio-Rad, Hercules:f 0:¾) ,
Animais submetidos a análise histológica não se submeteram & teste da função respiratória: para preservar integridade: teclou!ar. O lóbulo do pulmão direito for removido e fixado em 4% paraformaIdeido até emfoutimento de parafina, Após embixtimento em parafina, o tecido: foi cortado em secções de 3 ;pm de espessura e montado em laminas carregadas positivamente. Para avaliar a infiltração de células inflan&tcrias, as secções foram desparefinadas, desidratadas e coradas com hematoxiilna e eoalna. A avaliação histooatologica das secções coradas for realizada por ura patóiogo profissional especialiaado em pequenos animais no Instituto veterinário dacional (S¥A) em Uppsala, Suécia,
Foi realizada análise estatística essenci almente conforme descrito no Exemplo 4 anterior.
Resultados
Ho Quadro 1 a seguir, são listados os numeros de ratinhos utiiizados para as diferentes análises. Foi amostrado sangue de t odes os ratinhos.
Quadro I
5 ratinhos morreram durante os 90 dias de exposição. Na maioria dos casos foram: eutanasiados devido a agravamento do estado de saúde, Lai como grande diminuição de peso e letargia, ver Quadro 5. Durante a análise, 6 ratinhos foram pontos for a da curva significativos e, portanto, foram excluídos do conjunto de dados (Quadro 2}.
Quadro 2
Todos os ratinhos expostos a WC foram visivelmente afetados pela exposiçlm. tiles sofreram de pelo arrufado e per da de forçai muscular. Os animais que: receberam NSMI (Gr. 3: & Gr. 1. j pareceram, até certo ponte, ma is saudáveis do que os outros grupos que recederam placebo (observação do técnico animal] . O local de injeção para admínistraçSo s.O. de MBMT foi alterado para evitar a formação de cicatrizes e ulceração. ápesar deste esforço, os ratinhos no Gr. 5 estabeleceram feridas e joanetes no pescoço. Qs dois outros grupos NBMI não mostraram quaisquer sinais de ulceração, nem os ^s ÍÍi|:iO:||| receberam DMSO na mesma concentração que NBMI no Gr. 5.
Os animais expostos a FC mostraram uma diferença de peso significativa dos animais controlo no Dia 90, Os ratinhos ||||i:bonl:pÍb aumentaram 15% no peso corpora 1 (2,8 ||||2 g) , ao palio que os|ratinhos expostos lllllnao aumentaram de peso corporal .llllm grau significativo|(-0,1 ± 0,3 g) J|||| animais que receberam NBMI todos ganharam peso comparado cora o peso inicial (Gr. 3: llliii 0, 4 g, Gr. 4 t|lf:>11± 0,2;Ι|||;: O22||;^||1Ι|; A contagem de células BAL totais em animais expostos a FC no Dia 90 foi sígnificativamente superior do que nos grupos controlo (24 6 700 ± 21 980 células/mL com FC e 152 000 ± 20 540 il|lip%t,-;Í® · A. exposição a FC induziu um aumento .......tgps no fluido BAL (229 31||!:!|||2ΐ|||:00: llllllllspiêiuj||3:1:1210 ± l:|l|?|Ís:::lelllls/mL·. sem ^Í|lpÍÍ|llÍl: * islllllp Í;l|:il:iç:|bllli:' FGi^nlo- aumélifillp· número de n:é:Í:ÍÍ;ÍÍ:il:|;i||e sllllllllllocrf.os'::::li:fillrq:Íos;l|nlu i do IfiLllqllldp comparado cbBilllll llllll.......ipppo ............blli.sbiliÊliai!:.....NBMI........(3 0,.............................. ........% 15:0" mf/kglliab: tivifqllhúmeros sijllfipa titamelle inferiores ::: ψ ó:£:ág o slib:.:. J: B J||| 1 lijÇpn t udói ib§u v||úma. ten dên cia par a: 111111111 çp ne:||:li|:|llll:|hdl l'|3· lllll Gr.J|| e ura número.................. infér ί|| lilll:i.n£Ócftolllloiil|li||l:l| t:r;1:|a,Í|ll com NMBI |11111111111111111| lllllllllllllllllllbventlll^ lllé expolipiii: 1 í! :|Í£:' lllibl aumentaram 'v'v'vsig;ri.í fi:|Í:|;|.:val|:ll|: |í:s niveis de li: | $ |nf .......................................p:P|::i::||l31|lÍ|ú bifoΪΦΙίΙΦ lilnb fluido BAL mostrado ............ llIBIPl ίφ:1|||£:&- li· lãtrtbfs tipos de linfõcitos não: foilílibeflilllie:! forma "f iitlfiblflpa apd:lll|:|at:am:ihtP com .............................................iiiliip':, Hl #ο|1ί:|ρβ: ©s llnflclPos foram reduzidos após llllllllliiilliilin'to"lipirn KtB|$||l ipi:ve- "uma,.:;di:mliíluição significat;il|3|qÍ33||
Xlinfócifis cl£||:i|iiq:s T:2l||i3i|ll3 il| P<| t|ui|||||L· em ah|pl|i|||| ....................................tpd;ta:dÓlSsb:lw KBlff :|(ulhi|:p: 1:0||§1111:0;1 ÓPP: Gr , ||3|||| llllilllilllilllilllilll^ aísí|Í' Je :íl|posi.ç:to :| ipf 1 induziram a|te||||||||| estrutulips· :ribi|;ilm|dllooliparadPllçolt 1 oS1 animais contro 1:||||1|3|;ΐ: : 2 vs, G|!!!§!,,. C:é||o|p|||a||te:||||| alterações induzidas pelo FC em ambas vias respiratórias grandes e pequenas
H|| juntarnente com uma Ι|& dim! nu ida. :|)| I coeficiente de histeresividade η diminuido por FC refletiu heterogeneidades diminuídas nos pulmões.
Doses superiores dil|Í|Í:Í:|||||iÍ, ||||| ejlífl, Sl|laumentaran11 sígnificativamente a resistências das vias respiratórias grandes e pequenas {R*s e S:|l|lllllllllll|
Foram medidas curvas de PV era ratinhos expostos a FC (Gr. 2) e foram comparadas com ratinhos expostos ao ar ambiente (Gr. 1; . A e:i|i:i:|:|:|;i:|||a FC tornou sign l.fi cativamente o pulrnáo mais ;i|| rígido e foi necessária maior pressão para inflar o pulmão.: Os :illlllii|. ma i |||[ii|;|:i:iib e r H|| NBMI (fl:|i;0 01|i: 15 ff mg / k|j||||p^ função respiratória significativamente alterada quando comparado com o grupo Placebo (Gr. 2} . Cst, Est e k nâo foram afetados pela exposição ao fumo.
Noventa dias de exposição a FG não aumentaram sighilioatívamente diliiilllid de mediadores inflamatórios f|i.f BAL ilioro. No Grupo NtÍlt:H:Í:Í(li Μ1Ρ-1β f íssssssssff ...........foram.........diminuídos rio soro.........quando llllllí co:i||:ar:|:lll||ÍiS :::l|lii:l:õ PlaceboWxposWÈÊi 'FÈIilillIÉil Não houve JI !!!!!| quiíp q:iii ipu t ras diferenças si gn i f i cativas entre os medi adore s IJ i r. f 1 ama t ó r i o s :::Íh:l:liigdi:S||||l:
An ima i s |ÉÍlIlÍlllllll:llÍ (Sr. 2; não aumentados de pulmonar quando comparados com;;I o grupo controlo (Gr. 1). Os animais que receberam NBMI não llllllPillerãm: quant idade s i gn i f i cat i vament e alterada de |Í:Í:F;|lll:H:|i;:; | comparado com o grupo Placebo que recebeu FC (Gr. 2).
Lumens e alvéolos bronquiais em todos os pulmões mostraram(;f alguns macrófagos. Nos grupos tratados, os macrófagos foram lllll ligeirarnente mais numerosos e exibiram grânulos i= ii.i:i.( amarelado cxtoplasmático ou pigmento negro. O pigmento negro poderia ser possivelmente fuligem da exposição ao tabaco e o pigmento amarelado poderia sé:i||lipofuscxna< |||
Foram observados números baixos de leucócitos (n eutrò f i 1 o & |:||ib:|ih ó:f i® ilHHiHmohfc iiac x gf agos- .} em f :§:|p:Q-s Hi:
divipi areéssssdóa s e· t: am |:|::|:|:a#·: Μ Μ M pulmonares papífericas em animais expostos ã FC, Os numeros: ligeiramente elevados de macréfagos nos grupos expostos a tabaco: foram subtis e os pulmões permaneceram bem abaixo do umbral de ínf lamação, Alterações observadas não foram suficientemente intensas para causar sinais clínicos.
Os animais control<3 neste estudo mostraram uma função das vias respiratórias significativamente melhor e maior ganho de peso do que os ratinhos expostos a FC, mas e< aumento de células celulares no fluido BAL não foi. significativa men te diferente do Gr. 2. Os ratinhos controlo receberam o mesmo tratamento que o Gr. 2 com exceção de não terem sido expostos a fumo de FC. Contudo, todos os animais partilharam as mesmas acomodações no 1aboratório.
Conclusão
Ratinhos expostos a FC mostraram perda de peso (ou perda de aumento de peso) , aumento de muorôfagos e um pulmão mais rijo juntamente com uma diminuição da complacência respiratória.. 0 tratamento com: N3MI (Gr, 3 e Gr, 4} melhora o estado de saúde em ratinhos expostos a FC diariamente: durante 90 dias. Um efeito positivo do tratamento é. suportado pelo peso aumentado e uma tendência para números diminuídos de iinfôcitos e uma diminuição das células GD8+ no fluido BA1 comparado com o Grupo Flacebo exposto a FC (Gr. 2};.
DOCUMENTOS REFERIDOS NA DESCRIÇÃO II .Biba 1.|ilblilbe réiebibqpi.ori Pre&eri!-e ' ||e· fbliiiiilil®brada apenas \para lfb|| leitor. Não é parte integrante do documento de patente europeia. Não obstante o cuidado na sua elaboração·/ o rc-t- nao assume qualquer responsabilidade por eventuais erros ou |Ím:i:||í®;l:|i·.
Documentos d© patente referidos na descrição • US 6586600 B2 [0010] • US 20100227812 A [0010] [0034] • US 8426368 B2 [0011] • WO 2011038385 A [0011] ::: 1||:: Í||2 oi. 2' i.2;j lo· elIJIllllllf :|||||||||||||í II! :o|||2 0Ί .10:2.:|7| 7 liillJ||r
Documentos de não patente citados na descrição • PATEL et ai. Toxicology Mechanisms and Methods, 20i2, vol. 22, 383 [0010] • CORTI et al. Arch. Biochem. Biophys., 2010, vol. 500, 107 [0014] • SAARANEN et al. Anti oxid. Redox Signal., 2010, vol. 12, 15 [0014] • NARDAI et al. J. Biol. Chem., 2001, vol. 276, 8825 [0014] • WINKLER et al. Free Radie. Biol. Med., 1994, vol. 17, 333 [0014] III* alv,;.....áillf> 'F|!#ipi,:, Fi||.|| |bte;|:li|...................... 2013, vol. 305 [0015]
IliillNl et al. :2ê|::3|s.....Bblssssililiigs 315 [0016] • THORLEIFSSON et al. Respir. Med., 2009, vol. 103, 1548 [0016] !!i!!i|! Jt in tlliir|d||p t M ||||| l|| §1||| !||yoa l:':':34.,........................... • DADVAND et al. Fur. Respir. J., 20140220 [0016] illliiig ton ifllilie |c|l a| $ |r |:c |i ||| ο I iPba ri|i|i:l|pãi'k 'Ílili;:li|lllll: Company, 1995 [0034] * Martindale ~ The Complete Drug Reference [0034] [004S] • KELLY et al, Rea. Rep. Health Eff. Inst., 2Q1I,· vol·. 163, 3
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Lisboa,. 1 de Fevereiro de 2Q18:
Claims (7)
- REIVINDICAÇÕES 1, N, N-óis~ 2 ~rae r eaptoet ii isofiaismida, ou um sal .£armaceuticamente aceitável cio mesmo, parra utiiicação no tratamento de doença pulmonar obstrutiva crónica,
- 2< Um composto para utilização conforme reivindicado na Reivindicação: 1, em que a dose de N, N~bis---2---mercaptoet i I i softalamida ou sal do: mesmo que é administrada é capaz de regenerar ascorbate sístemícamente.
- 3. Om composto para utilinação Conforme reivindicado na: Reivindicação· 1 ou Reivindicação 2, em que o tratamento: reduz o risco de morbidez e/çu mortalidade respi rataria num paciente.
- 4:. tl,:K:mdi:a~2~me:roaptoetdl isoftalamida, ou um sal £armaceuticamente: acei tável do mesmo, para utilização num método: de aliviar um ou .má is sintomas da doença pulmonar obstrutiva crónica num paciente que padece dos mesmos.
- 5. um composto para utilização conforme reivindicado na Reivindicaçâo 4, em que o sintoma é fadiga muscular esquelética e/ou produção de cosse/esputo.
- 6. Um composto para utilização: conforme reivindicado em qualquer' uma das Reivindicações 1 a 3, em que o método de tratamento é de paciente que ê um fumador ou è um ex-fumador.
- 7., Um composto para utilização conforme reivindicado na Reivindicação 6, em que o paciente também está :â receber terapêutica que compreende a administração de vm- ingrediente ativo selecionado de um b^rorvcodiiatadó.r., um fárrnaco art: i o o 1 inérçico eu um cor t ieos te rol de < Lisboa,· 7 de Fevereiro de ÍRIS
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