PT522880E

PT522880E - Sequencias geneticas codificadoras de enzimas da via dos flavonoides e sua utilizacao

Info

Publication number: PT522880E
Application number: PT92306379T
Authority: PT
Inventors: Timothy Albert Holton; Edwina Cecily Cornish; Filippa Kovacic; Yoshikazu Tanaka; Diane Ruth Lester
Original assignee: Int Flower Dev Pty Ltd
Priority date: 1991-07-11
Filing date: 1992-07-10
Publication date: 2001-06-29
Also published as: AU639393B2; SG45187A1; JPH06500239A; EP0522880A2; DK0522880T3; AU1953092A; DE69231745D1; WO1993001290A1; US5861487A; IE922272A1; IL102450A; US5349125A; AU2273392A; JP2000023686A; ES2155438T3; PL298239A1; CA2112373C; EP0522880B1; IL102450A0; ATE199937T1

Description

DESCRIÇÃO "SEQUÊNCIAS GENÉTICAS CODIFICADORAS DE ENZIMAS DA VIA DOS FLAVONÓIDES E SUA UTILIZAÇÃO" O presente invento está relacionado, de um modo geral, com sequências genéticas codificadoras de enzimas da via metabólica dos flavonóides e sua utilização como seja na manipulação da pigmentação de plantas e outros organismos. A floricultura tem-se esforçado por desenvolver variedades novas e diferentes de plantas que dão flores. Uma maneira eficaz de criar tais variedades novas é através da manipulação da cor da flor tendo sido usadas, com algum sucesso, técnicas de cruzamento clássicas para produzir uma gama larga de cores para a maior parte das variedades de flores comerciais. Esta abordagem tem, no entanto, sido limitada pelas restrições do conjunto de genes de cada espécie particular e por este motivo é raro que uma única espécie possua todo o espectro de uma variedade de cores. De facto, devido à disponibilidade limitada de flores azuis, menos de cinco por cento dos pés de flores vendidas pelo sistema de leilão na Holanda, em 1988, eram azuis. Entre as doze flores dos topos de venda, apenas as íris e as frésias oferecem variedades de cor azul e estas variedades constituem menos de quatro por cento de todas as vendas de flores. O desenvolvimento de variedades azuis das principais espécies de flores, por exemplo, rosa, crisântemo, cravo e gerbéria, constituem uma oportunidade importante nos mercados de flores de corte e ornamentais. A cor das flores é, predominantemente, devido a dois tipos de *

V -2-

«Ί pigmentos: flavonóides e carotenóides. Os flavonóides contribuem para uma gama larga de cores desde o amarelo até ao vermelho e ao azul. Os carotenóides conferem um tom laranja ou amarelo e são normalmente o único pigmento nas flores amarelas ou laranjas. As moléculas dos flavonóides que constituem o principal contributo para a cor das flores são as antocianinas, as quais são derivados glicosilados de cianidina, delfínidina, petunidina, peonidina, malvidina e pelargonina, e estão localizadas no vacúolo. As diferentes antocianinas podem produzir diferenças significativas na cor. A cor das flores é também influenciada pela copigmentação com flavonóides incolores, complexação com metais, glicosilação, acilação, metilação e pH vacuolar (Forkmann, 1991). A via de biossíntese dos pigmentos flavonóides (daqui em diante referida como a "via dos flavonóides") está bem estabelecida e está apresentada na Figura 1 (Ebel e Hahlbrock, 1988; Hahlbrock r Grisebach, 1979; Wiering e de Vlaming, 1984; Schram et al., 1984; Stafford, 1990). O primeiro passo da via envolve a condensação de três moléculas de malonil-CoA com uma molécula de p-coumaroil-CoA. Esta reacção é catalisada pela enzima sintetase de chalcona (CHS). O produto desta reacção, 2',4,4',6'-tetra-hidroxichalcona, normalmente, é rapidamente isomerizado pela enzima isomerase de chalcone flavanona (CHI) para produzir naringenina. A naringenina é subsequentemente hidroxilada na posição 3 do anel central pela hidroxilase da posição 3 da flavanona (F3H) para produzir di-hidrocaempferol (DHK).

O anel B de di-hidrocaempferol pode ser hidroxilado na posição 3', ou nas posições 3' e 5', para produzir di-hidroquercetina (DHQ) e di-hidromiricetina (DHM), respectivamente. Duas enzimas chave envolvidas nesta via são a hidroxilase da posição 3' dos flavonóides (daqui em diante referida como 3-hidroxilase) e a hidroxilase das posições 3' e 5' dos flavonóides (daqui em diante referida como 3',5'-hidroxilase). A 3'-hidroxilase actua sobre DHK para produzir DHQ c sobre a iieringeniiia para produzir eriodieliol. A 3’,5'-hidroxilase é uma enzima de espectro largo que catalisa a hidroxilação da naringenina e DHK nas posições 3' e 5' e de eriodictiol e DHQ na posição 5' (Stotz e Forkmann, 1982), em ambos os casos produzindo respectivamente penta-hidroxiflavanona e DHM. O padrão de hidroxilação do anel B desempenha um papel chave na determinação da cor das pétalas. A 3'-hidroxilação de flavonóides em extractos de microssomas requere NADPH e (¾ assim como a aglicona de naringenina ou DHK. A enzima da cultura de células de salsa tem sido bem estudada (Hagmann et al, 1983). A inibição pelo monóxido de carbono, citocrómio c e NADP+ indicou que a enzima é uma enzima dependente do citocrómio P450. Uma actividade enzimática semelhante foi demonstrada no milho (Larson e Bussard, 1986). A 3',5'-hidroxilase é também da classe de enzimas do citocrómio P450. As enzimas do tipo citocrómio P450 estão largamente distribuídas na natureza e foram caracterizadas nos vertebrados, insectos, leveduras, fungos, bactérias e numa planta. Foram determinadas as sequências de pelo menos 154 genes do citocrómio P450 e os genes agrupados em 27 famílias de genes diferentes (Nebert et al., 1991). Dentro de uma única família, as sequências da proteína P450 são geralmente >40% idênticas enquanto as sequências dentro da mesma subfamília são >46% idênticas (Nebert et al, 1991). A informação sobre os citocrómios P450 de plantas é limitada. A capacidade para controlar nas plantas a actividade de 3'-hidroxilase ou de 3',5'-hidroxilase, ou outras enzimas envolvidas na via dos flavonóides, proporcionará um meio para manipular a cor das pétalas, permitindo assim que uma única espécie expresse um espectro mais largo de cores das flores. De acordo com o presente invento, foram identificadas e clonadas sequências genéticas codificadoras das enzimas da via dos flavonóides, tais como 3',5'-hidroxilase. Estas sequências recombinantes permitem a modulação do metabolismo de DHK assim como do metabolismo de outros substratos, tais como DIIQ, naringenina c críodictiol, determinando assim o padrão de hidroxilação das antocianinas e proporcionando um meio para manipular a cor das pétalas. No entanto, o presente invento estende-se das flores aos frutos e dos vegetais às folhas de, por exemplo, plantas ornamentais.

Assim, um aspecto do presente invento proporciona um isolado de ácido nucleico compreendendo uma sequência de nucleótidos codificadores, ou complementares de uma sequência codificadora, de uma enzima de hidroxilação de di-hidrocaempferol (DHK), ou um seu derivado ou fragmento.

Apenas por conveniência e por questões de notação, a referência a " enzima de hidroxilação de DHK" inclui as enzimas de hidroxilação da via dos flavonóides actuando sobre um ou mais dos seguintes substratos: DHK, DHQ, naringenina, eriodictiol.

Preferencialmente, a enzima de hidroxilação é 3',5'-hidroxilase. No entanto, os métodos empregues para clonar as sequências genéticas codificadoras desta enzima poderão ser usados para isolar outras sequências genéticas codificadoras de enzimas, tais como a 3'-hidroxilase. Assim, a referência ao isolamento e clonagem da 3',5'-hidroxilase deverá ser considerada como incluindo a referência a outras enzimas de hidroxilação dos flavonóides tais como 3'-hidroxilase. O termo "isolado de ácido nucleico" pretende significar uma sequência genética num estado não natural. De um modo geral, isto significa isolado relativamente ao seu estado natural ou formado por processos não necessariamente encontrados no seu ambiente natural. Mais especificamente, ele inclui moléculas de ácido nucleico formadas ou mantidas irt vitro, moléculas recombinantes ou sintéticas e ácidos nucleicos em combinação com ácidos nucleicos heterólogos. O termo também engloba sequências naturais após pelo menos uma purificação parcial relativamente a outras sequências de ácido nucleico.

Por "sequências genéticas" como aqui é usado pretende-se significar quaisquer séries contíguas de bases de nucleótidos especificando directamente, ou via uma série de bases complementares, uma sequência de aminoácidos de uma enzima de hidroxilação de DHK, por exemplo 3',5'-hidroxilase. O ácido nucleico ou a sua forma complementar podem codificar a totalidade da enzima ou um seu derivado. Por "derivado" pretende-se significar quaisquer substituições, deleções e/ou adições de aminoácidos, simples ou múltiplas, relativamente à enzima natural. Assim, o ácido nucleico inclui a sequência nucleotídica natural codificadora da 3',5'-hidroxilase ou pode conter uma ou mais substituições, deleções e/ou adições de nucleótidos relativamente à sequência natural.

Os derivados obtidos por inserção de aminoácidos da enzima de hidroxilação de DHK e, em particular, a 3',5'-hidroxilase do presente invento incluem fusões nos extremos amina e/ou carboxilo assim como inserções de um ou mais aminoácidos dentro da sequência. As variantes da sequência obtidas por inserção de aminoácidos são aquelas em que um ou mais resíduos de aminoácidos são introduzidos num sítio pré-determinado da proteína, se bem que a inserção ao acaso seja também possível com um despiste adequado do produto resultante. As variantes obtidas por deleção são caracterizadas pela remoção de um ou mais aminoácidos da sequência. As variantes de aminoácidos obtidas por substituição são aquelas em que pelo menos um resíduo na sequência foi removido e um resíduo diferente inserido no seu lugar. São substituições típicas as realizadas de acordo com a Tabela 1 que se segue. -6- TABELA 1

Resíduos adequados para substituições de aminoácidos

Resíduo original Exemplos de substituições

Ala Ser Arg Lis Asn Gin; His Asp Glu Cis Ser Gin Asn Glu Asp Gli Pro His Asn; Gin Ile Leu; Vai Leu Ile; Vai Lis Arg; Gin; Glu Met Leu; Fen Met; Leu; Tir Ser Tre Tre Ser Tip Tir Tir Trp; Fen Vai Ile; Leu

Sempre que a 3',5'-hidroxilase seja obtida por substituição de aminoácidos, os aminoácidos são geralmente substituídos por outros aminoácidos tendo propriedades semelhantes, tais como hidrofobicidade, hidrofilicidade, electronegatividade, cadeias laterais volumosas e similares. As substituições de aminoácidos são tipicamente de resíduos isolados. As inserções de aminoácidos são geralmente na ordem de cerca de 1-10 resíduos de aminoácidos e as deleções variarão entre cerca de 1 e 20 resíduos. Preferencialmente, as deleções ou inserções são feitas em pares adjacentes, i.e. uma deleção de dois resíduos ou uma inserção de dois resíduos.

As variantes de aminoácidos referidas atrás podem ser facilmente realizadas usando técnicas de peptídeos sintéticos bem conhecidas, tais como síntese de peptídeos em fase sólida (Merrifield, 1964) e similares, ou por manipulações de DNA recombinante. As técnicas para fazer as mutações por substituição em locais pré-determinados no DNA, tendo uma sequência conhecida ou parcialmente conhecida, são bem conhecidas e incluem, por exemplo, mutagénese com Ml3. A manipulação de uma sequência de DNA para produzir proteínas variantes que se manifestem como variantes de substituição, inserção ou deleção estão convenientemente descritas, por exemplo, em Sambrook et ai, (1989).

Outros exemplos de mutantes recombinantes ou sintéticos e derivados da 3',5'-hidroxilase do presente invento incluem uma ou mais substituições, deleções e/ou adições de qualquer molécula associada à enzima tais como açúcares, lípidos e/ou proteínas ou polipeptídeos.

Os termos "análogos" e "derivados" também incluem qualquer equivalente químico funcional da 3',5'-hidroxilase e também qualquer derivado de aminoácido descrito atrás.

Os ácidos nucleicos do presente invento podem ser ácidos ribonucleicos ou ácidos desoxirribonucleicos, moléculas de cadeia simples ou dupla e lineares ou covalentemente fechadas. Preferencialmente, a molécula de ácido nucleico é cDNA. O presente invento também compreende um isolado de ácido nucleico, compreendendo uma sequência de nucleótidos codificadora de uma enzima de hidroxilação do di-hidrocaempferol, ou seu derivado, que hidroxile uma ou mais moléculas de entre DHK, DHQ, naringenina e eriodicitol, ou a sua sequência complementar, a referida sequência compreendendo: a sequência de nucleótidos descrita na Figura 9 ou 10, ou a sua sequência complementar, ou uma sequência nucleotídica capaz de hibridar com a sequência nucleotídica descrita na Figura 9 ou 10, ou com a sua sequência complementar, em condições de restringência de 20% de formamida, 6xSSC,l% p/v de SDS a 42°C durante 16 horas seguido de lavagem em 6XSSC, 1% p/v de SDS a 65°C durante 1 hora.

As moléculas de ácido nucleico aqui incluídas podem existir sozinhas ou em combinação com uma molécula de vector e preferencialmente um vector de expressão. Tais moléculas de vector replicam-se ou expressam-se em células eucarióticas e/ou procarióticas. Preferencialmente, as moléculas de vector ou partes delas são capazes de se integrarem no genoma da planta. A molécula de ácido nucleico pode ainda conter uma sequência de promotor capaz de dirigir a expressão da molécula de ácido nucleico numa célula vegetal. A molécula de ácido nucleico e o promotor podem ser introduzidos na célula através de qualquer um de vários métodos, tais como electroporação ou transferência mediada por Agrobacterium. O presente invento é exemplificado usando sequências de ácido nucleico derivadas de petúnia, uma vez que esta representa, até à data, a fonte de -9- C~ material mais conveniente e preferida. No entanto, os familiarizados com a matéria facilmente apreciarão que podem ser isoladas sequências semelhantes a partir de uma série de fontes, tais como plantas ou certos microorganismos. A genética das 3'-hidroxilases é conhecida nas flores de Antirrhinum, Verbena e Petunia e em plantas jovens derivadas de sementes e camadas de aleurona das sementes de milho (Heller e Forkmann, 1988). O gene eos controla a 3'-hidroxilase em Antirrhinum (Forkmann e Stotz, 1981), enquanto que os genes Htl e Pr controlam enzimas semelhantes em Petunia (Stotz et ai, 1985) e na camada de aleurona de milho, respectivamente (Larson e Bussard, 1986). Estudos quimiogenéticos de Verbena hybrida, por exemplo, demonstraram que nesta planta a hidroxilação do anel B das antocianinas na posição 3' e 5' é controlada por um gene (Beale, 1940). A actividade enzimática de hidroxilação das posições 3' e 5' está presente apenas em extractos de flores de estirpes produtoras de delfinidina (Stotz e Forkmann, 1982). A actividade enzimática microssomal dependente de NADPH de hidroxilação das posições 3' e 5' foi também demonstrada nos extractos de flores de Callistephus e Lathyrus (Forkmann, 1991). Tal como em V. hybrida, a actividade enzimática de hidroxilação nas posições 3' e 5' das flavanonas e di-hidroflanóis foi encontrada apenas nos extractos de flores das estirpes que contêm nas flores compostos flavonóides hidroxilados nas posições 3', 4' e 5' (ou seus derivados metilados). Assim, a formação dos flavonóides hidroxilados nas posições 3', 4' e 5' está claramente dependente da actividade de hidroxilase de flavonóides nas posições 3' e 5'.

Os genes codificadores da 3',5'-hidroxilase foram identificados numa série de plantas ornamentais incluindo Callistephus (R), Petunia (Hfl. HG) e Verbena (P) pela presença dos respectivos mutantes incapazes de produzir delfinidina. Ainda, foram demonstradas também as respectivas actividades enzimáticas (Forkmann, 1991). A 3',5'-hidroxilase foi também considerada como sendo uma enzima microssomal do tipo citocrómio P450 (Heller e Forkmann, 1988). No entanto, não existem publicações sobre a clonagem do gene da 3',5'-hidroxilase desta ou doutra espécie vegetal.

Outras espécies vegetais capazes de produzir flavonóides hidroxilados nas posições 3',4',5' ou seus derivados incluem hortênsia (Takeda et al., 1985), espora dos jardins (Asen et al., 1975), lisianto (Asen et al., 1986), tomateiro (von Wettstein-Knowles, 1968) e batateira (Harbome e Simmonds, 1962). Estas espécies ou outras plantas capazes de produzir flavonóides hidroxilados nas posições 3', 4' e 5', constituirão igualmente fontes adequadas para o isolamento do gene da 3',5'-hidroxilase. Todas essas sequências de ácido nucleico que codificam directa ou indirectamente uma enzima da via dos flavonóides (e.g. 3',5'-hidroxilase) estão incluídas no presente invento independentemente da fonte de origem.

Igualmente, a estratégia de clonagem dos genes aqui descrita pode ser usada para isolar um gene da 3',5'-hidroxilase a partir de outras plantas que produzam flavonóides hidroxilados nas posições 3' e 5'. Os clones e oligonucleótidos aqui descritos podem ser usados para detectar, isolar e clonar sequências genéticas semelhantes usando a mesma tecnologia aqui descrita, se bem que possam ser necessárias algumas modificações dos processos experimentais. Todas essas pequenas variações estão englobadas no presente invento. Exemplos de outras fontes de enzimas adequadas, tais como 3',5'-hidroxilase, incluem, mas não estão limitadas a verbena, espora dos jardins, videira, íris, frésia, hortênsia, cíclame, batateira, amor perfeito e beringela.

De acordo com o presente invento, uma sequência de ácido nucleico codificadora de uma enzima de hidroxilação de DHK, como seja 3',5'-hidroxilase pode ser introduzida e expressa numa planta transgénica proporcionando assim um meio para converter DHK e/ou outros substratos adequados, se sintetizados na célula vegetal, em derivados de antocianinas tais como delfinidina, petunidina ou malvidina. A produção destas antocianinas contribuem para a produção de uma variedade de intensidades da cor azul ou de tons de azul. A expressão da sequência de ácido nucleico na planta pode ser constitutiva, induzível ou desenvolvente.

Assim, um outro aspecto do presente invento proporciona um método para a produção de uma planta transgénica capaz de expressar uma enzima recombinante de hidroxilação de DHK, ou seus mutantes ou derivados activos, o referido método compreendendo a introdução, numa célula de uma planta adequada, de uma molécula de ácido nucleico que compreende uma sequência de nucleótidos codificadora da referida enzima de hidroxilação de DHK, em condições que permitam a eventual expressão da referida molécula de ácido nucleico, regenerando uma planta transgénica a partir da célula e crescendo a referida planta transgénica durante tempo e condições suficientes para permitir a expressão do ácido nucleico.

Numa realização preferida, o presente invento engloba um método para a produção de uma planta transgénica que produza flores apresentando propriedades alteradas da infloscência, o referido método compreendendo a introdução numa célula de uma planta adequada da sequência de ácido nucleico do presente invento nas condições que permitem a eventual expressão da referida sequência de ácido nucleico, regeneração de uma planta transgénica a partir da célula e crescimento da referida planta transgénica durante o tempo e em condições suficientes para permitir a expressão da sequência de ácido nucleico da enzima de hidroxilação de DHK.

Preferencialmente, a enzima de hidroxilação de DHK é 3',5'-hidroxilase, é regulada ao longo do desenvolvimento e a inflorescência alterada inclui a produção de flores azuis ou vermelhas ou outras intensidades de cor dependendo das condições fisiológicas da planta receptora. Por "planta adequada" pretende-se significar uma planta capaz de produzir um substrato da enzima 3',5'-hidroxilase e possuindo as propriedades fisiológicas adequadas e o genótipo necessário para o desenvolvimento da cor pretendida. Esta pode incluir, mas não está limitada a rosa, petúnia, cravo, crisântemo e gerbéria. Em determinadas espécies de plantas pode ser preferível seleccionar uma "linha de pH alto", tal sendo definido como uma variedade tendo um pH vacuolar médio das pétalas superior à média. A origem da 3',5'-hidroxilase recombinante ou seus mutantes e derivados são como aqui descritos e incluem enzimas de petúnia, verbena, espora dos jardins, videira, íris, frésia, hortênsia, ciclâme, batateira, amor perfeito ou beringela.

Os familiarizados com a matéria facilmente reconhecerão as variações aplicáveis a este método, como seja um aumento ou decréscimo da expressão da enzima natural presente numa planta alvo. Isto conduzirá a diferentes intensidades de cores tais como diferentes intensidades de azul ou de vermelho.

Para diminuir a actividade de uma enzima alvo, como seja a 3',5'-hidroxilase, a sequência de ácido nucleico codificadora desta enzima ou várias partes dela poderão ser usadas na orientação anticodão. Não querendo limitar o presente invento a qualquer teoria, é provável que tal sequência de ácido nucleico anticodão forme uma cadeia dupla com a totalidade ou parte do mRNA natural que especifica a enzima, evitando assim a tradução do mRNA em enzima activa. Como alternativa, as ribozimas poderão ser usadas para inactivar as sequências de ácido nucleico alvo.

Assim, o presente invento estende-se a um método para a produção dc uma planta transgénica capaz de expressar uma enzima de hidroxilação do di-hidrocaemfterol (DHK) ou que dirige a transcrição de uma sequência de ácido nucleico que é substancialmente complementar da totalidade ou de parte da molécula de mRNA traduzível na enzima, o referido método compreendendo a introdução do isolado de ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 1 ou 6, numa célula de uma planta adequada em condições que permitam a eventual expressão do referido isolado de ácido nucleico, regeneração de uma planta transgénica a partir da célula e crescimento da referida planta transgénica durante o tempo e em condições suficientes para permitir a expressão do isolado de ácido nucleico. Nesta realização, as plantas recipientes adequadas englobam inter alia, íris, tulipa, lírio, lisianto, frésia, espora dos jardins, limónio e pelargónio.

Os métodos de produção de plantas transgénicas atrás referidos, englobam assim a alternativa de introdução de um gene, ou fragmento de DNA, codificador de um mRNA ou oligonucleótido anticodão para a totalidade, ou parte, de uma sequência de nucleótidos codificadores, ou complementares de uma sequência codificadora, de uma 3',5'-hidroxilase.

Consequentemente, o presente invento engloba todas as plantas transgénicas do presente invento, ou suas formas anticodão e/ou quaisquer formas homólogas ou relacionadas, e em particular as plantas transgénicas que apresentem propriedades alteradas das inflorescências. As plantas transgénicas, contêm assim, uma molécula de ácido nucleico estavelmente introduzida compreendendo uma sequência nucleotídica codificadora ou complementar de uma sequência codificadora de uma enzima de hidroxilação de DHK e em particular linhas de plantas de pH elevado portadoras de tais moléculas de ácido nucleico introduzidas conforme referido atrás. O invento também engloba sementes de tais plantas transgénicas. Tais sementes, especialmente se coloridas, serão úteis como indicador das propriedades das plantas.

Um outro aspecto do presente invento é dirigido às formas recombinantes das enzimas de hidroxilação de DHK e em particular 3',5'-hidroxilase recombinante. As formas recombinantes das enzimas proporcionarão uma fonte de material para pesquisa para desenvolver, por exemplo, enzimas mais activas e podem ser úteis no desenvolvimento de sistemas in vitro para a produção de compostos corados.

Um outro aspecto do presente invento contempla um método para a clonagem de uma molécula de ácido nucleico compreendendo uma sequência de nucleótidos que codifica, ou é complementar de uma sequência codificadora, de uma molécula de citocrómio P450 ou molécula semelhante de uma planta, o referido método compreendendo a amplificação de sequências nucleotídicas do citocrómio P450, ou sequências complementares, a partir de uma preparação adequada de moléculas de ácido nucleico derivadas de células da referida planta, por reacções em cadeia com polimerase usando uma ou mais oligonucleotídeos iniciadores, estes oligonucleotídeos iniciadores tendo uma sequência nucleotídica derivada de uma ou mais sequências de consenso de moléculas de citocrómio P450 microssomal.

Numa realização relacionada, o método para a clonagem das moléculas de ácido nucleico do citocrómio P450, ou suas sequências complementares, compreende a selecção a partir de uma biblioteca de cDNA adequada de um clone capaz de hibridar com uma ou mais sequências de oligonucleotídeos iniciadores correspondendo a uma ou mais sequências de consenso ou moléculas de citocrómio P450 conhecidas.

Preferencialmente, uma das sequências de consenso é do domínio de ligação a heme das moléculas de citocrómio P450 e é mais preferencialmente -15- F(G,S) XGXRXCXG (em que X é qualquer aminoácido) ou é PGFAGRRICPG. Numa realização mais preferida, as sequências de nucleotídeo a serem clonadas codificam ou são complementares de sequências que codificam uma enzima de hidroxilação de DHK e em particular 3',5'-hidroxilase. Mesmo mais preferencialmente, a 3',5'-hidroxilase é como aqui descrito e, mais particularmente, tem uma sequência de aminoácidos ou é codificada por uma sequência de nucleotídeos substancialmente como descrito nas Figuras 9 ou 10, ou semelhante, como definido atrás. O presente invento é ainda descrito com referência à Figuras e Exemplos não limitantes que se seguem.

Figuras 1(A) e (B) são representações esquemáticas da via de biossíntese dos pigmentos flavonóides. As enzimas envolvidas na primeira parte da via foram indicadas como se segue: PAL = Fenilalanina amónia-liase; C4H = 4-Hidroxilase de cinamato; 4CL = ligase de 4-cumarato: CoA; CHS = Sintetase de chalcona; CHI = Isomerase de chalcona flavonona; F3H - 3-Hidroxilase de flavononas; DFR = Di-hidroflavonol-4-reductase; UFGT = UDP-glucose:flavonóide-3-0-glucosiltransferase. Os últimos passos correspondem a conversões que ocorrem nas flores de P. hybrida e incluem: 1 = adição de um açúcar ramnose ao resíduo glucosilo de cianidina-3-glucósido; 2 = acilação e 5-O-glicosilação; 3 = metilação da posição 3'; 4 = metilação da posição 5'; 5 = metilação das posições 3' e 5'.

Figura 2(A) mostra a actividade de 3',5'-hidroxilase em extractos de pétalas de P. hybrida cv V23 (Hfl/Hfl, HÍ2/HÍ2) e a ausência de actividade de 3',5'-hidroxilase em P. hybrida cv R51 (Hfl/Hfl, Hf2/H£2). A actividade de 3',5'-hidroxilase foi detectada por conversão de 3H-naringenina nos derivados 3'-e 3',5'-hidroxilados eriodictiol e penta-hidroxiflavanona. No lado esquerdo da r% -16- figura estão apresentadas as estruturas bioquímicas do substrato, naringenina e o produto da reacção da hidroxilase da posição 3', eriodictiol e da reação da hidroxilase das posições 3' e 5', penta-hidroxiflavanona. A localização do substrato e dos produtos hidroxilados na placa de TLC está indicada do lado direito da Figura que mostra da esquerda para a direita as autorradiografias dos produtos de reacção produzidos pelos extractos de pétalas de flores de P. hybrida cv V23 e P. hybrida vc R51 e o controlo mostrando a ausência de hidroxilação da naringenina quando NADPH é omitido da mistura de reacção.

Figura 2(B) mostra a actividade de 3',5'-hdroxilase em extractos de pétalas de flores de P. hybrida cv Old Glory Blue (OGB) em diferentes fases de desenvolvimento. Da esquerda para a direita as autorradiografias das placas de TLC mostram (1) “Flores da Fase 1 [Botão fechado não pigmentado (<25 mm de comprimento)]: conversão limitada de naringenina no derivado 3',5'-hidroxilado penta-hidroxiflavanona, (2) Flores da Fase 2 [Botão fechado pigmentado (25-35 mm de comprimento)]: aumento da conversão em penta-hidroxiflavanona indicador de níveis mais elevados de 3',5'-hidroxilase, (3) Flores da fase 3: [Botão púrpura escuro com corola emergente (> 35 mm de comprimento)]: actividade máxima de hidroxilase das posições 3' e 5', (4) Flores da Fase 4 [Flor aberta púrpura escuro deiscência da pré-antera (>50 mm de comprimento)]: actividade máxima de hidroxilase das posições 3' e 5' (5) Flores da Fase 5 [Flor completamente aberta com deiscência de todas as anteras]: ausência de níveis detectáveis de hidroxilase das posições 3' e 5'.

Figura 3(A) é uma representação esquemática de uma molécula de mRNA codificador de um citocrómio P450. A região sombreada indica a posição relativa de sequências codificadoras do domínio de ligação a heme. Está apresentada uma sequência de aminoácidos consenso para a região mais conservada deste domínio usando o código de uma só letra. Os aminoácidos que i -17- & estão presentes em 100% das sequências de citocrómio P450 presentes nas bases de dados SWISS-PROT foram inseridos dentro de uma caixa e X indica as posições onde existe um nível baixo de conservação da sequência.

Figura 3(B) mostra a posição dos oligonucleótidos usados para amplificação por PCR das moléculas de citocrómio P450 pCGP450 e pCGP454 da biblioteca de cDNA #1. Os oligonucleótidos 1 e 3 cobrem as sequências no domínio conservado de ligação a heme, enquanto que os oligonucleótidos 2 e 4 correspondem ao pBluescript (Stratagene) -20 e sequências iniciadoras reversas, respectivamente. Os oligonucleótidos 1 e 2 foram usados para sintetizar o inserto de cDNA em pCGP450; os oligonucleótidos 3 e 4 foram usados para sintetizar o inserto de cDNA em pCGP454. A representação de uma molécula de cDNA generalizada é idêntica à apresentada na Fig. 3A; As sequências de vector foram indicadas por sombreado claro.

Figura 4(A) é uma representação esquemática dos fragmentos de DNA usados no despiste de uma biblioteca de cDNA #1 para identificar homólogos do citocrómio P450, incluindo pCGP174 e pCGP175. P450: clone genérico de cDNA do citocrómio P450 com o domínio de ligação a heme (Haem) indicado por uma caixa a sombreado; Fragmento 1: um fragmento de 900 pb foi obtido por PCR com os oligonucleótidos 5 e 6 usando como molde o DNA de pCGP142; Fragmento 2: um fragmento de 1,3 Kb foi isolado a partir de uma digestão de pCGP147 com SalI-EcoRI; Fragmento 3: um fragmento de 750 pb foi obtido por PCR com os oligonucleótidos 4 e 7 usando como molde DNA de pCGP158; Fragmento 4: um fragmento de 670 pb foi isolado a partir da digestão de pCGPlóO com PstI-EcoRV; Fragmento 5: um fragmento de 150 pb foi obtido por PCR com os oligonucleótidos 3 e 4 usando DNA de pCGP454 como molde. Todos os fragmentos purificados foram marcados com 32P-dCTP como descrito nos Materiais e Métodos.

Figuras 4(B) a (H) mostram sequências de nucleótidos parciais e os correspondentes produtos de tradução de aminoácidos deduzidos para os insertos de cDNA de (i) pCGP142, (ii) pCGP147, (iii) pCGP158, (iv) pCGPlóO e (v) pCGP454. As regiões usadas no despiste da biblioteca de cDNA #1 para isolar pCGP 174 e pCGP157 estão demarcadas pelas setas.

Figuras 5 (A) e (B) são representações esquemáticas dos plasmídeos pCGP174 e pCGP175, respectivamente. Os insertos de cDNA estão indicados como caixas abertas com a região codificadora do domínio putativo de ligação a heme apresentado como uma região a sombreado. No extremo 5' está um sítio EcoRI e no extremo 3' está um sítio Xhol de ambos os insertos de cDNA.

Figura 6(A) é uma autorradiografia de uma transferência de RNA despistada com a região 3' do inserto de cDNA de pCGP174. Cada uma das pistas continha uma amostra de 20 pg de RNA total isolado a partir dos seguintes tecidos de petúnia 1-5: tecido do limbo de OGB de flores em cinco fases diferentes (1-5) do desenvolvimento das flores descrito nos Materiais e Métodos; T: tecido do tubo de OGB das flores nas fases 3-4; L: tecido foliar de plantas jovens derivadas de semente de OGB com 6 semanas de idade; IL: tecido foliar tratado com glucose/luz elevada de plantas jovens derivadas de semente de OGB com 6 semanas de idade; V23 tecido do limbo V23 de flores na fase 3-4; R51: tecido da corola de R51 de flores nas fases 3-4; VR: tecido do limbo de pétalas de flores da fase 3-4 do híbrido Fj de V23xR51; Sw63: tecido do limbo das pétalas das flores de Sw63 na fase 3-4; Th7: tecido do limbo das pétalas de flores Th7 na fase 3-4.

Figura 6(B) é uma autorradiografia representativa da análise por RFLP das plantas F2 V23xR51 (V/R). DNA gcnómico digerido com Xbal foi despistado com a região 3' de pCGP174. O fragmento V23 que hibrida fortemente com a sonda foi detectado em todas as plantas F2 que tinham actividade de hidroxilase das posições 3' e 5' no tecido do tubo das flores (+). A designação de RFLP para as bandas que hibridam fortemente (RFLP#1) estão indicadas para as diferentes plantas. V: RFLP tipo V23, R: RFLP tipo R51, H: heterozigótico (VR).

Figura 7(A) é uma autorradiografía de uma transferência de RNA hibridada com a região 3' do inserto de cDNA de pCGP175. Cada uma das pistas continha uma amosta de 20 pg de RNA total isolado a partir do seguinte - 1-5: tecido do limbo de OGB nas cinco fases diferentes (1-5) do desenvolvimento de flores descrito nos Materiais e Métodos; T: tecido do tubo de OGB derivado de flores da fase 3-4; L: tecido foliar derivado de seedlings de OGB com 6 semanas de idade; IL: tecido foliar tratado com glucose/luz intensa derivado de plantas jovens derivadas de semente de OGB com 6 semanas de idade; V23: tecido do limbo de V23 derivado de flores da fase 3-4; R51: tecido da corola de R51 derivada de flores da fase 3-4; VR: tecido do limbo das pétalas derivado de flores da fase 3-4 do híbrido Fi V23xR51; Sw63: tecido do limbo das pétalas derivado de flores na fase 3-4 de Sw63; Th7: tecido do limbo de pétalas de flores na fase 3-4 de Th7.

Figura 7(B) é uma autorradiografía representativa da análise por RFLP das plantas F2 de V23xR51 (V/R). O DNA genómico digerido com Xbal foi despistado com a região 3' do pCGP175. A designação de RFLP obtida usando a sonda pCGP175 foi idêntica à designação po atribuída usando a sonda chi-A . V: EFLP tipo V23; R: RFLP tipo 51; H: RFLP heterozigótico (VR).

Figura 8 mostra uma representação esquemática de um mapa de enzimas cie restrição do pCGP602. Os comprimentos parciais do inserto de cDNA estão indicados por linhas a cheio com extremos contínuos (em oposição a setas). Estes foram subclonados em M13-mpl8 e mpl9 e sequenciados usando sequências oligonucleotídicas iniciadoras, conforme indicado para se obter informação se sequências sobreponíveis. O grau e direcção da informação sobre as sequências obtidas de cada fragmento subclonado estão apresentados por linhas com meias setas. SI = sequência iniciadora 1; S2 = sequência iniciadora 2; S3 = sequência iniciadora 3; ATG indica o codão de iniciação da metionina e está também indicado o comprimento total do clone em pares de bases.

Figuras 9(A) a (D) são as sequências de nucleótidos e sequências de aminoácidos deduzidas para os insertos de cDNA de pCGP176 e pCGP602. O inserto de pCGP602 inclui toda a sequência apresentada. O extremo 5' do inserto de pCGP176 está indicado com uma seta.

Figuras 10(A) a (C) representam a sequência nucleotídica e a sequência de aminoácidos deduzida para o inserto de cDNA de pCGP175.

Figura 11 é uma representação esquemática da construção de pCGP618. pCGP618 foi construído por clonagem do inserto de cDNA de pCGP175 no sentido directo a seguir ao promotor da desidrogenase do gliceraldeído-3-fosfato (PGPD) novector de expressão pYGA22m. O inserto de cDNA derivado do pCGP175 foi ligado como um fragmento EcoRI-Kpnl com o fragmento grande que resultou de uma digestão de pYGA22m com EcoRI/Kpnl. E = EcoRI. H = HindIII, K, ΚρηΙ. X = Xhol. IR = repetição invertida do plasmídeo 2 pm, Trpl = gene Trpl, Ap = marca de resistência à ampicilina.

Figura 12(A) mostra um ensaio de hidroxilase das posições 3' e 5' dos extractos de levedura usando como substrato 3H-naringenina. As autorradiografias mostram a conversão de 3H-naringenina no derivado 3',5'-hidroxilado, penta-hidroxiflavanona, pelos extractos de leveduras transformadas com o plasmídeo pCGP618 (1 e 2). Não foi detectada actividade de hidroxilase das posições 3' e 5' em leveduras não transformadas (C). A conversão de naringenina em penta-hidroxiflavanona pela hidroxilase das posições 3' e 5’ de OGB está também apresentado (OGB C).

Figura 12(B) mostra um ensaio de hidroxilase das posições 3' e 5' dos extractos de levedura usando como substrato H-di-hidroquercetma. As autorradiografias mostram a conversão de 3H-di-hidroquercetina (DHQ) em 3H-di-hidromiricetina (DHM) pelos extractos de levedura transformados com o plasmídeo pCGP618 (1 e 2). Não foi detectada actividade de hidroxilase das posições 3' e 5' em leveduras não transformadas (C). A conversão de DHQ em DHM pela hidroxilase das posições 3' e 5' de OGB está também apresentada (OGB C).

Figura 13 mostra um ensaio de hidroxilase das posições 3' e 5' de extractos de levedura usando como substrato 3H-naringenina. A autorradiografia mostra a conversão de 3H-naringenina no seu derivado 3',5'-hidroxilado penta- hidroxiflavanona pelos extractos de levedura transformados com os plasmídeos pCGP618 e pCGP620 (1 e 2, respectivamente). Os produtos de reacção obtidos a partir dos extractos de pCGP620 também incluiram o derivado 3'-hidroxilado eriodictiol assim como algum substrato original naringenina indicando conversão incompleta no produto final 3',5-hidroxilado. Não foi detectada actividade de hidroxilase das posições 3' e 5' na levedura não transformada (C).

Figura 14 é uma representação esquemática do plasmídeo pCGP90. O inserto de cDNA do pCGP602 foi clonado na orientação directa a seguir ao promotor Mac do vector de expressão pCGP293 como ilustrado. -22-

Μ h^rh í *-A

Figura 15 mostra um ensaio de hidroxilase das posições 3' e 5' de extractos de pétalas de petúnia. A autorradiografia mostra a presença de níveis baixos de actividade de hidroxilase das posições 3' e 5' (conversão de 3H-naringenina em 3H-penta-hidroxiflavanona) em tecido de limbo das pétalas (L) de Sk4 x Sw63. Foram detectados níveis significativamente mais elevados no tecido do limbo (L) de duas transgénicas Skr4 x Sw63/pCGP90 (T/G 1602 e T/G 1603). Não foi detectada actividade de 3',5'-hidroxilase nos extractos de tubo das pétalas (T) do híbrido não transgénico Skr4 x Sw63 ou nos dois transgénicos de pCGP90. Está também apresentada a conversão de naringenina em penta-hidroxiflavanona pelos extractos de tecido do limbo (L) e do tubo (T) de pétalas de OGR.

Figura 16 é uma representação fotográfica de uma autorradiografia de uma transferência de RNA despistada com cDNA Hfl marcado com 32P. Cada uma das pistas continha uma amostra de 20 pg de RNA total isolado a partir de (1) pétalas de P. hybrida cv. OGB; (2) pétalas de amor perfeito, (3) caules de batateira; (4) pele de beringela; (5) flores de Nicotiana alata; (6) flores de Ageratum. A sonda usada para A e B derivou de um fragmento de DNA Bali de 660 pb, usou-se um fragmento EcoRI/HindIII de 1,4 Kb para C. As condições de lavagem usadas foram: (A) 6X SSC a 50°C; (B) 2X SSC a 50°C; (C) 0,2X SSC a 65°C.

Figura 17 é uma representação fotográfica da autorradiografia de transferências Southern despistadas com cDNA Hfl marcado com P. Cada uma das pistas continha 10 pg de DNA digerido com EcoRI. As amostras de DNA foram isoladas a partir de (1) beringela , (2) íris holandesa; (3) batateira,(4) violetas e (5) anénoma. As condições de lavagem foram: (A) 6X SSC a 50°C; (B) 2X SSC a 65°C. -23 -

EXEMPLO

1. MATERIAIS Ε MÉTODOS

Reagentes, enzimas e isótopos radioactivos O eriodictol e a di-hidroquercetina foram adquiridos à Cari Roch KG e a naringenina foi adquirida à Sigma. A di-hidromiricetina foi obtida por síntese química a partir da miricetina (Extra Synthese, França) pelo método de Vercruysse et al., (1985). [3H]-naringenina (5,7 Ci/mmole) e [3H]-di-hidroquercetina (12,4 Ci/mmole) foram adquiridos à Amersham. Todas as enzimas foram adquiridas comercialmente e usadas de acordo com as recomendações do fabricante.

Estirpes bacterianas

As estirpes de Escherichia coli usadas foram: DH5a supE44, Δ (lacZYA-ArgF)U169, <|)801acZ Δ Ml5, hsdR17 (rk', m^, recAl, endAl, gyrA96. thi'l. relAl, deoR. (Hanahan, 1983 e BRL, 1986). XLl-Blue supE44. hsdR17 (rk, recAl. endAl, gyrA96, thi' 1, relAl, laç, [FproAB, laçlq, laçZ ΔΜ15, TnlO(tetr)] (Bullockeí al, 1987). PLK-F' recA, hsdR17 (rk', mk+), mcrA'. mcrB',supE44, galK2. galT22. metBl. fF^roAB. laclq. lacZ ΔΜ15, TnlO(tef)] (Stratagene). A estirpe AGLO de Agrobacíerium tumefaciens sem plasmídeos (Lazo et al., 1991) foi obtida de R. Ludwig (Department of Biology, University of Califórnia, Santa Cruz).

Os vectores de clonagem pBluescript e pBluescribe foram adquiridos à Stratagene.

Transformação de E. coli e de A. tumefaciens A transformação de células de E. coli estirpe DH5a foi realizada de acordo com o método de Inoue et al (1990). O plasmídeo pCGP90 (Fig. 14) foi introduzido em Agrobacíerium tumefaciens estirpe AGLO através da adição de 5 pg de DNA de plasmídeo a 100 μΐ de células AGLO competentes, preparadas por inoculação de 50 ml de uma cultura MG/L (Garfmkel e Nester, 1980) e crescimento durante 16 horas com agitação a 28°C. As células foram então sedimentadas e ressuspensas em 0,5 ml de 85% (v/v) de CaCl2 100 mM/15% (v/v) de glicerol. A mistura de DNA-Agrobacterium foi congelada por incubação em N2 líquido durante 2 minutos e depois descongelada por incubação a 37°C durante 5 minutos. A mistura de DNA/bactérias foi então colocada em gelo durante mais 10 minutos. As células foram depois misturadas com lml de meio MG/L e incubadas com agitação durante 16 horas a 28°C. As células de A. tumefaciens portadoras de pCGP90 foram seleccionadas em placas de agar MG/L contendo 100 pg/ml de gentamicina. A presença de pCGP90 foi confirmada por análise Southern do DNA isolado a partir de transformantes resistentes à gentamicina.

As variedades de Petunia hybrida usadas estão apresentadas na

Tabela 2. **X -25-

TABELA 2 Material Vegetal

Variedade da planta Propriedades

Fonte/Referência

Old Glory Blue (OGB) Híbrido F1 Bali Seed, USA V30 V23 R51

Sw63

Th7

Anl, An2, An3, An4, An6, Koes et al. (1986) An8, An9, AnlO, Anil, Phl, Ph2, Ph3, Ph4, Ph5, Hfl, Hf2, Htl, Ht2, Rt, Mtl, Mt2, mfl, po, Gf Anl,An2, An3, An4, An6, An8, Wallroth et al., (1986) An9, AnlO, phl, Hfl, Hf2, htl,Doodeman et al. (1984) Rt, Po, Bl, F1 Anl, An2, An3, an4, An6, An8, Wallroth et al (1986) An9, AnlO, Anil, Phl, Hfl, vanTunen et al. (1990) H£2, Htl, rt, po, bl, fl Doodeman et al. (1984) Anl, An2, An3, an4, An6, An8,1.N.R.A., Dijon, Cedex, An9, AnlO, Anil, Phl, Ph2,França Ph5, Hfl, Hf2, htl, ht2, rt, po, mfl, fl, Gf Anl, An2, An3, An4, An6," An9, AnlO, Anil, Hfl, Hf2, Htl, Ht2, Phl, Ph2, Ph5, Rt, po, mfl, mf2, Gf, fl

H

V -26- V -26- TABELA 2 (continuação) Variedade da planta Propriedades Fonte/Referência Skr4 Anl, An2, An3, An4, An6," Anil, Hfl, Hf2, htl, Phl, Ph2, Ph5, rt, Po, Mfl, Mf2, Ph5, rt, Po, Mfl, Mf2, fl Skr4 x Sw63 Híbrido Fl de Skr4 x Sw63 Rwl4 Anl, An2, An4, Phl, ph2, Ph5,1.N.R.A., Dijon, Cedex Hfl, Hf2, Htl, Rt, Po, Bl, Lgl, França Lul, Vsl, Vs3, Vs5, la, Ygl, ws, Gf, Mtl, Mf2, fl Rp57 Anl, An2, An4, Phl, ph2, Ph5," Hfl, Hf2, Htl, Rt, Po, Mt, Mf, fl, Gf, Bl, Lgl, Lul, Vsl, Vs3, Vs5, Ygl, Ws. Rp57 x Rwl4 Híbrido Fl de Rp57 x Rwl4

As plantas foram crescidas em estufas especializadas com 14 horas de luz com uma intensidade luminosa de 10 000 lux e uma temperatura de 22 a 26°C. As flores de OGB foram colhidas nas fases de desenvolvimento definidas como se segue:

Fase 1: Botão fechado não pigmentado (<25 mm de comprimento)

Fase 2:

Botão fechado pigmentado (25-35 mm de comprimento)

Fase 3: Botão púrpura escuro com corola emergente (> 35 mm de comprimento)

Fase 4: Flor aberta púrpura escuro deiscência da pré-antera (>50 mm de comprimeto)

Fase 5: Flor completamente aberta com deiscência de todas as anteras.

As flores das outras variedades, como descrito na Tabela 2, foram colhidas antes da deiscência das anteras na fase de acumulação máxima de pigmento.

Preparação de extractos de plantas para ensaio da actividade de hidroxilase das posições 3' e 5'

Homogeneizou-se tecido vegetal em 2 a 5 volumes de tampão de extracção arrefecido em gelo (fosfato de potássio 100 mM (pH 7,5), EDTA 1 rnM, sucrose 0,25M, manitol 0,25 M, 0,1% (p/v) de BSA, pepstatina 100 nM, leupeptina 100 nM, 0,1 mg/ml de PMSF, 2-mercaptoetanol 20 mM e 10 mg/ml de policiar AT). O homogenato foi centrifugado a 10 000 rpm num rotor JA20 (Beckman) durante 10 minutos a 4°C e uma alíquota do sobrenadante foi testado relativamente à actividade de hidroxilase das posições 3' e 5'.

Ensaio da 3',5'-hidroxilase A actividade da enzima 3',5'-hidroxilase foi medida usando uma versão modificada do método descrito por Stotz e Forkmann (1982). A mistura de reacção do ensaio tipicamente contem 100 μΐ do extracto de plantas, 5 μΐ de NADPH 50 iiiM ein tampão de ensaio (fosfato de potássio 100 mM (pH 8,0), EDTA 1 mM e 2-mercaptoetanol 20 mM), 10 pCi de [3H]-naringenina ou 5 pCi de [^Hj-di-hidroquercetina e foi ajustada a um volume final de 210 μΐ com o tampão de ensaio. Após incubação a 23°C durante 2-16 horas, a mistura de reacção foi extraída com 0,5 ml de acetato de etilo. A fase de acetato de etilo foi seca sob vácuo e depois ressuspensa em 10 μΐ de acetato de etilo. As moléculas de flavonóides triciadas foram separadas em placas de camada fina de celulose (Merck Art 5577, germany) usando um sistema solvente de clorofórmiorácido acético:água (10:9:1, v/v). Após completada a cromatografia, as placas de TLC foram vaporizadas com7% (v/v) de 2,5-difeniloxazol em éter dietílico. Os produtos de reacção foram localizados por autorradiografia e identificados por comparação com padrões de naringenina, eriodictiol, di-hidroquercetina e di-hidromiricetina não radioactivos, os quais correram juntamente com os produtos de reacção, e visualizados sob luz UV.

Indução da síntese de delfinidina em folhas com glucose/inten-sidade de luz alta

Colheram-se folhas de P. hybrida cv. OGB e cortaram-se secções de 1 cm2 em água estéril. As secções das folhas ficaram então a flutuar numa solução de glucose a 2% (p/v) e expôs-se a uma intensidade de luz de 24 000 lux durante 96 horas.

Construção da biblioteca de cDNÂ #1

Vinte gramas de limbos de flores de OGb na fase 3 a 4 foram homogenizados em 100 ml de PEB (Tris-HCl 200 mM (pH 8,6), KC1 60 mM, MgCl2 30 mM, EGTA 25 mM) contendo complexo vanadil ribonucleósido 10 mM. Os detritos celulares foram removidos por filtração do homogenato através -29- u de Miracloth estéril (Calbiochem). O filtrado foi colocado no topo de um gradiente descontínuo de 6 ml de PEB contendo 25% (p/v) de sucrose, 250 unidades de InhibitAce (Extremo 5' e Extremo 3') e 6 ml de PEB contendo 50% (p/v) de sucrose e 250 unidades de InhibitAce em tubos de centrífuga Ultra-Clear™ Quick-Seal™ (Beckman). Os tubos foram centrifugados durante 3,5 horas a 26 000 rpm num rotor 70Ti. Os polissomas ligados a membrana foram colhidos da interface de 25% (p/v) de sucrose/50% (p/v) de sucrose e adicionados a uma solução de isotiocianato de guanidina 4M. O RNA foi isolado a partir de polissomas desnaturados sedimentando através de uma almofa de CsCl 5,7M, como descrito por Turpen e Griffith (1986).

Usou-se um estojo de vector Uni-ZAP™ XR (Stratagene) para construir uma biblioteca de cDNA direccional em λΖΑΡ usando 25 pg de RNA polissomal como molde. A biblioteca primária, que continha 250 000 unidades formadoras de placa (pfu), foi amplificada por crescimento durante a noite em placas de NZY (Sambrook et al., 1989) e o lote de fagos amplificado foi eluido em PSB 8NaCl 100 mM, MgS04 8 mM, Tris-HCl 50 mM (pH 7,5), 0,01% (p/v) de gelatina) como descrito por Sambrook et al., (1989).

Construção da biblioteca de cDNA #2

Isolou-se RNA total a partir de tecido da pétala de flores de P. hybrida v. OGB fase 3 a 4 usando o método de Turpen e Griffith (1986). Seleccionou-se RNA poli (A)+ a partir de RNA total através de três ciclos de cromatografia de oligo-dT celulose (Aviv e Leder, 1972).

Dois microgramas de RNA poli(A)+ foi submetido a transcrição reversa num volume de 20 μΐ contendo tampão de reacção Superscript™ IX, ditiotreitol 10 mM, dATP 500 μΜ, dGTP 500 μΜ, dTTP 500 μΜ, 5-metil-dCTP 500 μΜ, 0,75 μg do oligonucleótido #8 e 2 μΐ de transcriptasc reversa Superscript™ (BRL). A mistura de reacção foi incubada a 37°C durante 50 minutos, 44°C durante 10 minutos, depois colocada em gelo. A reacção da primeira cadeia (140 μΐ) foi adicionada à mistura de reacção da segunda cadeia. A mistura de reacção da segunda cadeia consistiu em Tris-HCl 21 mM, KC1 104 mM, MgCl2 5,3 mM, β-NAD 171 μΜ, (NH4)2S04 11,4 mM, dATP 214 pm, dCTP 642 μΜ, dGTP 214 μΜ, dTTP 214 μΜ, DTT 4 mM, 10 pCi 32P-XTP (3000 Ci/mMole), 15 unidades de ligase do DNA de E. coli, 40 unidades de polimerase do DNA (Boehringer) e 0,8 unidades de RNAse Η. A mistura final foi incubada durante 150 minutos a 16°C. Para remover extremos protuberantes ao cDNA de cadeia dupla, adicionou-se 10 unidades de polimerase do DNA de T4 e a reacção continuou durante mais 15 minutos a 16°C. A reacção foi parada e o cDNA purificado por extracção com fenol/clorofórmio, seguido de extracção com clorofórmio e precipitação com etanol.

Adaptadores EcoRI (Promega) foram então ligados com o cDNA e depois desfosforilados usando as condições recomendadas pelo fabricante. As enzimas foram desnaturadas pelo calor (70°C, 20 minutos) e o DNA foi purificado por extracção com fenol/clorofórmio e precipitação com etanol. O cDNA foi digerido com 50 unidades de Xhol (Boehringer) num volume de reacção de 100 μΐ, usando as condições recomendadas pelo fornecedor. A enzima foi inactivada pelo calor (70°C, 20 minutos) e a mistura passada através de uma coluna S400 (Pharmacia) que tinha sido equilibrada em tampão STE (Sambrook et al., 1989). O eluato foi extraído com fenol/clorofórmio e precipitado com etanol.Após microcentrifugação a 4°C durante 30 minutos o sedimento de cDNA foi lavado com etanol a 70% (v/v), seco ao ar e ressuspenso em 10 μΐ de tampão TE (Tris-HCI 10 mM (pH 7,5), EDTA 1 mM).

Usou-se membrana NA-45 (Schleicher and Schuell) para isolar o cDNA na gama de tamanho de 1,3 a 2,5 Kb a partir de 7,5 μΐ de amostra que foi sujeita a electroforese num gel de 1% (p/v) de agarose. O cDNA fraccionado pelo tamanho foi ligado com 1 μg de vector λ ZAPII tratado com EcoRI/Xhol/CIAP (Stratagene) em 5 μΐ de tampão de reacção consistindo em Tris-HCl 50 mM (pH 7,0), MgC^ 10 mM, ditiotreitol 10 mM, ATP 1 mM e 2 unidades de ligase do DNA de T4. A reacção foi realizada a 4°C durante 2 dias.

Após permanência à temperatura ambiente durante duas horas, a mistura de reacção de ligação foi encapsidada usando o sistema Packagene (Promega). O número total de recombinantes foi de 270 000 pfu.

Uma quantidade de 150 000 pfu do cDNA encapsidado foi semeado a 10 000 pfu por placa de 15 cm de diâmetro após transfecção de células PLK-F'. As placas foram incubadas a 37°C durante oito horas, depois guardadas. Réplicas das placas em duplicado foram transferidos para filtros Colony/Plaque Screen™ (Dupont) e tratados conforme recomendado pelo fabricante. Síntese de oligonucleótidos

Sintetizaram-se oligonucleótidos num sintetizador de DNA Applied Biosystems PCR-Mate usando métodos recomendados pelo fabricante. Os oligonucleótidos sintetizados foram 5'-3':

Oligo 1: GGAAGCTTATICCITT(T/C)GGIGCIGG Oligo 2: GGATGACTCAGTAAAACGACGGCCAGT

Oligo 3: CCIGG(A/G)CAIATIC(G/T)(C/T)TICCIGCICC(A/G)AAIGG

Oligo 4: GGATGACTCAAACAGCTATGACCATG Oligo 5: GTTCAATTCGGAATGATG Oligo 6: GCTGCACTTAATCCATAT Oligo 7: TGCATAGCTTTTGGG

Oligo 8: GAGAGAGAGAGAGAGAGAGATCTCGAGTTTTITITITITnTTTT Oligo 9: ATGTCTCCTCCAGTG Oligo 1 OrCTAGACTCCAATCAC

Os oligos 2 e 4 incluem um sítio de ligação a GCN4 (indicado através do sublinhado) que se demonstrou facilitar o enriquecimento dos produtos de PCR de cadeia dupla (Lew e Kemp, 1989). A base para a projecção do oligo 3 foi a seguinte: As sequências de aminoácidos do domínio putativo de ligação a heme de um citocrómio P450 de abacateiro (Bozak et al., 1990) e as correspondentes sequências codificadas pelos dois homólogos do citocrómio P450 de petúnia pCGP142 e pCGP147 foram alinhadas:

abacateiro P F G A G R R G c P G pCGP142 P F G A G K R I c P G p CGP147 P F G S G R R I c P G A sequência de aminoácidos de consenso da região de ligação a heme para os três citocrómios P450 de planta pode ser considerada: P F G A(S) G R(K) R I(G) C P G.

Possíveis permutações da sequência de nucleótidos que poderão codificar os aminoácidos encontrados no domínio de ligação a heme das três moléculas de citocrómio P450 podem ser então deduzidas:

-33- 51 - CCX TTT GGX GCX GGX AGX CGX ATX TGT CCX GGX -3'

C AG CA A GG C

T X indica as posições de nucleótidos onde podem ser usados os quatro nucleótidos (A, C, G e T). O oligonucleótido 3 foi projectado para complementar uma subsérie da sequência de consenso derivada dos três citocrómicos P450 de plantas. Desoxinosina (I) foi usado predominantemente quando a degeneração de bases é superior a três. A sequência de oligonucleótidos resultante é como mostrado atrás.

Reacções de PCR

Usou-se o fago auxiliar R408 (Stratagene) para fazer saltar os fagemídeos pBluescript contendo insertos de cDNA de petúnia a partir de 200 000 pfu da biblioteca de cDNA em λΖΑΡ #1 usando métodos descritos pelo fabricante. Escherichia coli XLl-Blue foram transfectadas com a mistura de fagemídeos e 250 000 colónias foram semeadas em meio contendo ampicilina. As células foram ressuspensas em LB (Sambrook et al., 1989) e o DNA de plasmídeo foi isolado usando o processo de lise alcalina (Sambrook et ah, 1989). O DNA de plasmídeo foi ainda purificado por sedimentação num gradiente de CsCl. Este DNA foi usado como molde para PCR.

As reacções de PCR para amplificação de homólogos do citocrómio P450 continham 5 a 100 ng de DNA excisado, Tris-HCl 10 mM (pH 8,3), KC1 50 mM, MgCl2 1,5 mM, 0,01% (ρ/v) de gelatina, dNTP 0,2 mM cada, 0,4 μΜ para cada sequência iniciadora e 1,25 unidades de Taq polimerase (Cetus). As misturas de reacção (50 μΐ) foram sujeitas a 30 ciclos entre 94°C, 48°C e 72°C durante 1 minuto a cada uma das temperaturas. Os produtos amplificados foram -34-

ί^~- purificados em gel usando Geneclean (Bio 101 Inc.), reamplificados para se obter material suficiente para clonagem e depois reparados os extremos usando polimerase do DNA de T4. O DNA amplificado usando os oligos 1 e 2 foi digerido com HindIII e Xhol antes da clonagem em pBluescript. O produto de PCR gerado por amplificação entre os oligos 3 e 4 foi clonado directamente no vector pBluescript com caudas ddT descrito por Holton e Graham (1991).

Despiste das bibliotecas de cDNA Réplicas de placas em duplicado foram hibridadas e lavadas como se segue: Condições de elevada restringência (hibridação: 50% (v/v) de formamida, SSC 6x, 1% (p/v) de SDS a 42°C durante 16 horas e lavagem: 2 x SSC, 1% (p/v) de SDS a 65°C durante 2x15 minutos seguido de 0,2 x SSC, 1% (p/v) de SDS a 65°C durante 2x15 minutos), foram usados para detectar clones irmãos e condições de restringência baixas (hibridação: 20% (v/v) de formamida, SSC 6x, 1% (p/v) de SDS a 42°C durante 16 horas e lavagem: SSC 6x, 1% (p/v) de SDS a 65°C durante 1 hora) foram usados para detectar sequências relacionadas.

Análise Northern

Isolou-se RNA total a partir de tecido que tinha sido congelado em N2 líquido e triturou-se para dar um pó fino usando um almofariz e pistão. Adicionou-se ao tecido um tampão de extracção de isotiocianato de guanidina 4 M, Tris-HCl 50 mM (pH 8,0), EDTA 20 M, 0,1% (v/v) de Sarkosyl, e a mistura foi homogenizada durante 1 minuto usando um Polytron à velocidade máxima. A suspensão foi filtrada através de um Miracoth (Calbiochem) e centrifugado num rotor JA20 durante 10 minutos a 10 000 rpm. O sobrenadante foi colhido e ajustado a 0,2 g/ml de CsCl (p/v). As amostras foram então sedimentadas sobre uma almofada de 10 ml de CsCl 5,7 M, EDTA 50 mM (pH 7,0) em tubos de centrífuga Quick-seal de 38,5 ml (Beckman) e centrifugadas a 42 000 rpm durante 12-16 horas a 23°C num rotor Ti-70. Os sedimentos foram ressuspensos em TE/SDS (Tris-HCl 10 mM (pH 7,5), EDTA 1 mM, 0,1% (p/v) de SDS e extraídos com fenol:clorofórmio:álcool isoamílico (25:24:1) saturado em EDTA 10 mM (pH 7,5). Após precipitação com etanol os sedimentos de RNA foram ressuspensos em TE/SDS.

As amostras de RNA foram sujeitas a electroforese através de géis de 1,2% (p/v) de agarose com formaldeído 2,2 M, usando tampão de corrida contendo ácido morfolinopropanossulfónico (pH 7,0), acetato de sódio 5 mM, EDTA 0,1 mM (pH 8,0). O RNA foi transferido para filtros Hybond-N (Amersham) como descrito pelo fabricante e despistado com um fragmento de cDNA marcado com 32P (108 cpm/pg, 2 x 106 cpm/ml). A pré-hibridação (lha 42°C) e hibridação (16 horas a 42°C) foram realizadas em 50% (v/v) de formamida, NaCl 1M, 1% (p/v) de SDS, 10% (p/v) de sulfato de dextrano. Adicionou-se DNA degradado de esperma de salmão (100 pg/ml) juntamente com a sonda marcada com 32P para o passo de hibridação.

Os filtros foram lavados em SSC 2x/l% (p/v) a 65°C durante 0,5 a 1 hora. Os filtros foram expostos a filme Kodak XAR com um écran intensificador a -70°C durante 48 horas.

Análise por RFLP a. Isolamento de DNA genómico

Isolou-se DNA a partir de tecido foliar essencialmente como descrito por Dellaporta et al., (1983). As preparações de DNA foram ainda purificadas por centrifugação isopicnica em CsCl (Sambrook et al., 1989). b. Transferências Southern O DNA genómico (10 μg) foi digerido durante 16 horas com 16 unidades de Xbal e sujeito a electroforese através de um gel de 0,7% (p/v) de agarose num tampão de corrida TAE (Tris-acetato 40 mM, 50 mM EDTA). O DNA foi então desnaturado numa solução desnaturante (NaCl l,5M/NaOH 0,5M) durante 1 a 1,5 horas, neutralizado em Tris-HCl 0,5M (pH 7,5)/NaCl 1,5M durante 2 a 3 horas e o DNA foi então transferido para um filtro Hybond N (Amersham) em SSC 20x.

c. Isolamento da sonda chi-A

Sintetizou-se um clone de cDNA de chi-A (van Tunen et al., 1998) por PCR usando como molde cDNA obtido a partir de RNA de pétalas de OGB na fase 3 e duas sondas oligonucleotídicas: #9, que cobriu os nucleótidos 6-20 e #10, que é complementar dos nucleótidos 711-725 da sequência de cDNA chi-A publicada (van Tunen et al., 1988). O produto de PCR resultante foi ligado ao sítio Smal de pBluescript M13' (Stratagene) e sequenciado para confirmar que o fragmento clonado correspondia à sequência publicada.

Marcação de Sondas de DNA com 32P

Fragmentos de DNA (50 a 100 ng) foram marcados radioactivamente com 50 pCi de [a-32P]-dCTP usando um estojo de marcação de oligonucleótidos (Bresatec). O [a-32P]-dCTP não incorporado foi removido por cromatografia numa coluna de Sephadex G-50 (Fine). -37-

Análise da sequência de DNA A sequenciação de DNA foi realizada essencialmente pelo método de Sanger et al, (1977) usando a enzima Sequenase (USB, versão 2.1). A sequência completa dos clones pCGP602, pCGP176 epCGP175 foi determinada por compilação de sequências de diferentes subclones em M13 -mpl8 e -mpl9 (Norrander et al., 1983; Yanisch-Perron, 1985) obtidos usando processos de clonagem convencionais (Sambrook et al., 1989). Para algumas regiões foi necessário sintetizar sondas oligonucleotídicas específicas para obter dados de sequências sobreponíveis. As seis sequências iniciadoras que se seguem foram sintetizadas com aquela finalidade: 5' CGTGCCAATGAGCTAGG 3’ sequência iniciadora 1 5' GATGTTGGTTGTACTGAG 3' sequência iniciadora 2 5' GGAAACCAGATTTTCTTG 3’ sequência iniciadora 3 5' TTTTTTTTTTTTTTTTT (AGC) 3’ sequência iniciadora 4 5' GTTTTCCCAGTCACGAC 3' sequência iniciadora -40 5’ AAC AGCT ATG ACC ATG 3' sequência iniciadora reversa

Na Figura 8 pode-se observar um mapa de restrição de pCGP602 mostrando a posição de várias destas sequências.

As pesquisas de homologia contra as bases de DNA Genbank, SWISS-PROT e EMBL foram realizadas usando os programas FASTA e TFASTA (Pearson e Lipman, 1988).

Construção de pCGP293 O vector de expressão binário pCGP293 derivado do vector binário

Ti pCGN1559 (McBride e Sumiiierfelt, 1990). O plasmídeo pCGN1559 foi digerido com Kpnl e os extremos salientes 3' foram removidos com ligase do DNA de T4 de acordo com protocolos convencionais (Sambrook et al., 1989). O vector foi ainda digerido com Xbal e o extremo saliente 5' resultante foi reparado usando o fragmento Klenow da polimerase I do DNA. O vector foi então religado para dar pCGP67. Um fragmento PstI de 1,97 pb contendo o promotor Mac, o terminador mas e vários sítios de clonagem (Cornai et al., 1990) foi isolado a partir de pCGP40 e inserido no sítio PstI de pCGP67 para dar pCGP293. O plasmídeo pCGP40 foi construído através da remoção do gene GUS (Jefferson et al., 1987) como um fragmento BamHI-SacI do pCGN7334 e substituindo-o com o fragmento BamHI-SacI do pBluescript M13 que inclui o sítio de multiclonagem. O plasmídeo pCGN7334 (obtido da Calgene , Inc. CA, USA) foi construído por inserção do fragmento contendo o gene de fusão Mac-GUS-mas no sítio Xhol de pGN7329 (Cornai et al., 1990).

Construção de pCGP90 O plasmídeo pCGP90 foi construído por clonagem do inserto de cDNA a partir de pCGP602 na orientação correcta a seguir ao promotor Mac (Cornai et al, 1990) de pCGP293. O fragmento BamHI-Kpnl contendo o inserto de cDNA foi isolado a partir de pCGP602 e ligado a pCGP293 digerido com BamHI/Kpnl. A inserção correcta do inserto em pCGP90 foi estabelecida por análise de restrição do DNA isolado a partir de transformantes resistentes à gentamicina.

Construçãodo vector de expressão de levedura pYGA22m M13-mpl8 foi digerido com EcoRI e BglII para produzir um fragmento de 700 pb que continha um sítio de multielonagem. Esle fragmento foi ligado ao fragmento EcoRI-BglII de 9 Kb derivado de pYGA2269 (Ashikari et al., 1989). A construção resultante, designada pYGA22m, continha o sítio de clonagem múltipla inserido a jusante do promotor da desidrogenase do gliceraldeído-3-fosfato (Fig. 11).

Construção de pCGP618

Um fragmento EcoRI-Kpnl de 1,8 Kb que incluiu a totalidade do insertode cDNA do pCGP175 foi ligado ao fragmento EcoRI-Kpnl de 9 Kb derivado do pYGA22m. O plasmídeo resultante, pCGP618, continha o fragmento de cDNA de pCCP175 ligado na orientação correcta a seguir ao promotor da desidrogenase do gliceraldeído-3-fosfato (Figura 11).

Construção de pCGP620

Um fragmento EcoRI-Kpnl de 1,8 Kb que inclui a totalidade do inserto de cDNA derivado do pCGP176 foi ligado ao fragmento EcoRI-Kpnl de 9 Kb derivado de pYGA22m (como descrito para a construção de pCGP618). O plasmídeo resultante, pCGP620, continha o fragmento de cDNA do pCGP176 ligado na orientação correcta a seguir ao promotor da desidrogenase do gliceraldeído-3-fosfato.

Transformação de levedura A estirpe de levedura G-1315 (Mat a, trpl) (Ashikari et al., 1989) foi transformada com pCGP618 e pCGP620 de acordo com Ito et al., (1983). Os transformantes foram seleccionado relativamente à sua capacidade para restaurar G-1315 em prototrofía para o triptofano.

Preparação de extractos de levedura para ensaio de actividade de 3',5’-hidroxilase a. G-1315/pCGP618

Isolados de G-1315/pCGP618 e um revertente G-1315 que cresceu em meio sem triptofano foram usados para inocular 50 ml de YNBC [1,2% (p/v) de base azotada de levedura sem aminoácidos (Difco), 2% (p/v) de glucose e 0,3% (p/v) de casaminoácidos (Difco)] e incubados com agitação durante 2 dias a 30°C. As células foram sedimentadas por centrifugação e obteve-se uma fracção de microssomas de acordo com Oeda et al, (1985) excepto os esferoplastos serem rebentados no tampão de extracção usado para o ensaio da actividade de 3',5'-hidroxilase no tecido vegetal. Os sedimentos microssomais foram ressuspensos em 400 μΐ de tampão A (Tris-HCl 10 mM (pH 7,5), sorbitol 0,65M, DTT 0,1 mM, EDTA 0,1 mM) e uma amostra de 100 μΐ foi testada relativamente à actividade de 3',5'-hidroxilase. b. G-1315/pCGP620

Um único isolado de G-1315/pCGP620 foi usado para inocular 20 ml de YNBC que foi subsequentemente incubado durante 2 dias a 30°C. As células foram colhidas por centrifugação, lavadas uma vez com TE, uma vez com tampão A e depois ressuspensas em tampão B (Tris-HCl 10 mM (pH 7,5), sorbitol 1,2 M, DTT 0,1 mM, EDTA 0,1 mM) contendo zimoliase (0,1 mg/ml) (Seikagakukogyo, Japão). Após incubação durante 1 hora a 30°C as células foramsedimentadas por centrifugação e ressuspensas em 400 μΐ de tampão A. A suspensão de células foi então agitada por vortex juntamente com esferas de vidro (diâmetro = 0,4 mm) durante 2 minutos e uma amostra de 200 μΐ foi testada relativamente à actividade de 3',5'-hidroxilase.

Transformação de Petunia a. Material vegetal

Sementes de Petunia hybrida (Skr4 x Sw63 e Rp57 x Rwl4) foram esterilizadas em 1,25% (p/v) de hipoclorito de sódio durante 10 min e lavadas três vezes em água estéril. As sementes esterilizadas foram embebidas numa solução de 100 mg/1 de ácido giberélico (GA3) durante 16 a 20 horas. Elas foram então germinadas durante 2 semanas em 10% (p/v) de meio MS (Murashige e Skoog, 1962) suplementado com 1% (v/v) de sucrosee 0,8% (p/v) de agar Bacto Difco. As plantas jovens derivadas de sementes foram transferidas para meio MS suplementado com 3% (p/v) de sucrose durante 3 semanas antes de serem transferidas para pastilhas de turfa Jiffy (Jiffy Products Ltd, Noruega), mantidas em atmosfera húmida e iluminadas (luz de haleto de mecúrio 135 μΕ., 22°C) durante 2 a 3 semanas. Estas plantas jovens foram então transferidas para uma câmara de crescimento (luz fluorescentes branca fria 68 μΕ, 25°C). Para a cocultura, folhas jovens foram colhidas e esterilizadas em 1,35% (p/v) de hipoclorito de sódio durante 2 min seguido de três lavagens com água esterilizada. O tecido foliar foi então cortado em quadrados de 25 mm2 e ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D) durante 24 horas. b. Cocultura de Agrobacterium e tecido de Petunia

Agrobacterium tumefaciens estirpe AGL0 (Lazo et al., 1991) contendo o vector binário pCGP90 (Fig. 14) foi mantida a 4°C em placas de agar MG/L (Garfínkeí e Nester, 1980) com 100 mg/1 de gentamicina. Uma colónia isolada foi crescida durante a noite em meio líquido contendo 1% (p/v) de peptona Bacto, 0,5% (p/v) de extracto de levedura Bacto e 1% (p/v) de NaCl. No dia seguinte preparou-se uma concentração final de 5 x 108 células/ml, diluindo em meio líquido MS contendo 3% (p/v) de sucrose (BPM). Os discos foliares foram imersas durante 5 minutos em BPM contendo AGL0/pcGP90. Os discos foliares foram depois secos com papel de filtro e colocados em meio de cocultura durante 4 dias. O meio de cocultura consistiu em meio SH (Schenk e Hildebrandt, 1972) suplementado com 0,05 mg/1 de cinetina e 1,0 mg/1 de 2,4-D e incluída uma camada de suporte de suspensão de células de tabaco espalhada sobre o meio de cocultura, com um papel de filtro colocado no topo da suspensão de células de tabaco. c. Recuperação de plantas de petúnia transgénicas

Após cocultura, os discos foliares foram transferidos para o seguinte meio de selecção: discos Skr4 x Sw63 para meio MS fresco suplementado com 3% (p/v) de sucrose, 2 mg/1 de a-benzilaminopurina (BAP), 100 mg/1 de canamicina, 350 mg/1 de cefatoxima, 0,3% (p/v) de Gelrite Gellan Gum (Schweizerhall); discos Rp57 x Rwl4 para o mesmo meio, contendo 0,5 mg/1 de BAP e ácido de α-naftaleno-acético (NAA) em vez de 2 mg/1 de BAP. Após 3 semanas, os explantes em regeneração foram transferidos para meio fresco. Os rebentos adventícios que sobreviveram à selecção com canamicina foram isolados e transferidos para BPM contendo 100 mg/1 de canamicina e 350 mg/1 de cefotaxima para a indução de raízes. Todas as culturas foram mantidas sob um fotoperíodo de 16 horas (luz fluorescente branca fria 60 μΕ) a 23±2°C. Quando os rebentos atingiram 2-3 cm de comprimento as plântulas de petúnia transgénicas foram transferidas para mistura de envasamento autoclavada Debco 51410/2 em tubos de 8 cm. Após 4 semanas as plantas foram replantadas em vasos de 15 cm, usando a mesma mistura de envasamento, e mantidas a 23 °C sob um fotoperíodo de 14 horas (luz de haleto de mercúrio 300 μΕ.).

Transformação de plantas do tabaco a. Material vegetal

Plantas de Nicotiana tabacum (cv. Xanthi) foram mantidas em meio MS suplementado com 1 mg/1 de ácido indolobutírico (IBA) e solidificado com 0,25% (p/v) de Gelrite. O tecido foliar foi cortado em quadrados de 25 mm e colocado em meio MS contendo 1 mg/1 de BAP e 0,5 mg/1 de ácido indolacético (IAA) durante 24 horas. b. Cultura de Agrobacterium e tecido de tabaco A cocultura foi realizada como anteriormente descrito para petúnia. c. Recuperação de plantas do tabaco transgénicas

Após cocultura, discos foliares foram transferidos para meio MS suplementado com 1 mg/1 de BAP, 0,5 mg/1 de IAA, 100 mg/1 de canamicina e 350 mg/1 de cefotaxima (meio de selecção). Os explantes em regeneração foram transferidos para meio de selecção fresco após 2-3 semanas. Os rebentos adventícios que sobreviveram à selecção com canamicina foram isolados e transferidos para meio MS contendo 1 mg/1 de IBA, 100 mg/1 de canamicina e 350 mg/1 de cefotaxima para a indução de raízes. Quando as raízes atingiram 2-3 cm de comprimento as plântulas de tabaco transgénicas foram transplantadas para o solo como descrito para a petúnia.

Análise de antocianidinas

Antes da análise por HPLC, as moléculas de antocianina presentes nos extractos de pélalas foram hidrolisadas com ácido para remover os grupos glicosilo do núcleo de antocianidina. O padrão de hidroxilação no anel B dos pigmentos de antocianina foi determinado por análise por HPLC da molécula nuclear de antocianidina. O sistema de HPLC usado nesta análise foi um Hewlett-Packard 1050 equipado com um detector múltiplos comprimentos de onda (MWD). As separações por cromatografia em fase reversa foram realizadas numa coluna com uma cassete Spherisorb S5 ODS2,250 mm x 4 mm Dl. a. Extracção de antocianinas e flavonóides

Os pigmentos das flores foram extraídos de segmentos de pétalas (ca. 50 mg) com 5 ml de metanol contendo 1% (v/v) de ácido clorídrico aquoso 6M. Os extractos foram diluídos com água (1:9) e filtrados (Millex HV, 0,45 μ) antes da injecção no sistema de HPLC. b. Hidrólise de antocianinas

Extractos metanólicos brutos (100 μΐ) obtidos em a. atrás foram evaporados até secagem em Pierce Reacti-Vials usando uma corrente de azoto seco à temperatura amiente. Os resíduos foram dissolvidos em 200 μΐ de HC1 2M, os contentores foramtapados e depois aquecidos a 100°C durante trinta minutos. As misturas de hidrólise foram diluídas em água (1:9) e filtradas (Millex HV, 0,45 μτη) antes da análise por HPLC. c. Cromatografia A separação dos pigmentos das flores foi efectuada através de um gradiente de eluição usando os seguinte sistema:

í vi -45-

Solvente A: (trietilamina: cone. H3P04:H20) (3:2,5:1000)

Solvente B: acetonitrilo

Condições do gradiente: 5% B a 40%B durante 20 minutos Fluxo: 1 ml/min Temperatura: 35°C

Detecção: MWD com aquisição simultânea de de dados a 280, 350 e 546 nm.

Os picos de antocianina foram identificados por referência a padrões conhecidos. 2. Clonagem e análise de 3',5'-hidroxilase Caracterização da enzima 3',5'-hidroxilase a. Regulação durante o desenvolvimento

Extractos de pétalas de P. hybrida cv. OGB colhidas de flores em diferentes fases do desenvolvimento definidas atrás foram testadas relativamente à actividade de 3',5'-hidroxilase.

Encontrou-se que a actividade da enzima 3',5'-hidroxilase em pétalas de OGB é regulada ao longo do desenvolvimento durante a maturação da corola (Figura 2B). Este perfil de desenvolvimento é paralelo à expressão de outos genes envolvidos na biossíntese dos flavonóides. A actividade da enzima 3',5'-hidroxiIase e a expressão dos genes da sintetase de chalcona (CHS), isomerase de chalcona flavanona (CHI) e redutase de di-hidroflavonol (DFR) tiveram picos por volta das fases 3 a 4 do desenvolvimento das flores. b. Indução da actividade 3',5'-hidroxilase no tecido foliai

Os genes da via de biossíntese dos pigmentos flavonóides não são normalmente expressos no tecido foliar. No entanto, a síntese dos pigmentos delfinidina foi induzida em folhas de OGB por incubação numa solução de glucose a 2% (p/v) com luz intensa. Nestas condições a actividade da enzima 3',5'-hidroxilase pode ser detectada em tecido foliar de OGB. A indução máxima da actividade enzimática ocorreu após 96 horas de tratamento com glucose/luz intensa. Nestas condições a expressão de vários outros genes da biossíntese de pigmentos foi também induzida apra níveis comparáveis aos observados nas pétalas em emergência. Concluiu-se destes resultados que os genes Hfl e/ou Hf2 são induzidos em tecido foliar tratado com glucose/luz intensa. c. Evidência de que a hidrolase das posições 3' e 5' pertence à classe de enzimas do citocrómio P450

Mostrou-se que a actividade de 3',5'-hidroxilase em pétalas de OGB está associada à fraeção de microssomas e dependente da presença de NADPH. A actividade pode ser inibida pelo tratamento dos microssomas com monóxido de carbono e por dois inibidores que especificamente inactivam as enzimas do tipo citocrómio P450: tetciclases e 1-aminobenzotriazina (Taton et al., 1988; Matthews et al., 1985; Rademacher etal., 1987).

Construção de uma biblioteca de cDNA enriquecida em sequências de citocrómio P450 A tradução de mRNAs do citocrómio P450 ocorre nos polissomas ligados às membranas (Takemori e Kominami, 1989). Assim, para enriquecimento em sequências de citocrómio P450 (incluindo sequências de 3',5'- hidroxilase) construiu-se uma biblioteca dc cDNA usando RNA de polissomas ligados a membranas isolados a partir de pétalas de OGB de flores da fase 3 a 4. O isolamento do RNA das pétalas das flores na fase 3 a 4, assegurando que as sequências de 3',5'-hidroxilase estavam representadas no seu máximo na biblioteca uma vez que a actividade de 3',5'-hidroxilase é máxima nesta fase do desenvolvimento (ver atrás na figura 2B). A biblioteca resultante, designada biblioteca de cDNA #1, continha 250 000 recombinantes primários.

Amplificação por PCR de um cDNA do citocrómio P450 das pétalas de petúnia Já foi sequenciado um grande número de citocrómios P450, de organismos tão diversos como vertebrados, fungos, insectos, bactérias e uma planta (Nebert et ai, 1991. Bozak et ai, 1990). Uma característica de todas estas enzimas é a existência de uma série de pequenas regiões de sequências conservadas, especialmente à volta do resíduo cisteína envolvido na ligação a haem. A sequência de aminoácidos F(G,S)XGXRXCXG está presente no dominío de ligação a heme de quase todos os citocrómios P450 microssomais sequenciados até agora, onde X pode ser qualquer aminoácido (Figura 3). Esta sequência de consenso foi comparada com a base de dados de proteínas NBRF, usando o programa FASTA (Pearson e Lipman, 1988), para determinar a frequência de ocorrência de aminoácidos à volta desta área para todas as sequências de citocrómio P450 na base de dados. Esta análise mostrou que a sequência de aminoácidos mais comum para cada uma das posições à volta do domínio heme era:

FMPF G AGXRXCLG

Projectou-se um oligonucleótido para hibridar com um gene («-a codificador da sequência sublinhada e sequências semelhantes. Este oligonucleótido, designado oligo 1, está apresentado abaixo: 5,-GGAAGCTTATICCITT(T/C)GGIGCIGG-3' O segmento sublinhado é uma sequência adicional que inclui um sítio de reconhecimento HindlII para facilitar a clonagem direccionada dos produtos de PCR. A inclusão de desoxinosina (I) cobre as diferentes possibilidades de frequência de utilização de codões onde mais de dois codões poderão codificar o mesmo aminoácido. Os pares de desoxinosina com eficiência semelhante para A, T, G e C (Martin et ai, 1985; Ohtsuka et al., 1985). O DNA de plasmídeo obtido a partir da biblioteca de cDNA #1 como descrito nos Materiais e Métodos foi usado como molde para a amplificação de uma sequência de 360 pb relacionada com o citocrómio P250 usando oligos 1 e 2 (Figura 3). O oligo 2 correspondia à sequência iniciadora -20 (Stratagene) mais um sítio de ligação a GCN4 (Lew e Kemp, 1989) no extremo 5'. O fragmento de PCR foi clonado em pBluescript e o plasmídeo resultante foi designado pCGP450. A região 5' do pCGP450 codifica uma sequência polipeptídica com homologia significativa com as moléculas de citocrómio P450 já sequenciadas.

Isolamento de homólogos do citocrómio P450 a partir de uma biblioteca de cDNA de pétalas de petúnia O plasmídeo pCGP450 foi usado no despiste da biblioteca de cDNA #1 (60 000 placas) relativamente a clones relacionados. Usaram-se duas hibridações consecutivas em condições de restringência alta e baixa para detectar ambos os clones irmãos de pCGP450 e um segundo grupo de cDNAs do citocrómio P450. Um clone de cDNA representativo de cada um dos grupos irmãos foi seleccionado para análise subsequente. O clone irmão de pCGP450 foi designado pCGP142 e o representante do segundo grupo foi designado pCGP147. Um fragmento SalI-EcoRI que incluiu apenas sequências codificadoras de pCGP147 foi então usado para novo despiste de 16000 placas da biblioteca de cDNA #1 a baixa restringência. Foram sequenciados um total de 20 clones que hibridaram com a sonda, permitindo a identificação de mais dois homólogos do citocrómio P450: pCGP158 e pCGP160 (figura 4A).

Isolamento de um homólogo adicional do citocrómio P450 de pétalas por PCR A informação sobre a sequência à volta do domínio de ligação a heme putativo dos clones de petúnia pCGP142, pCGP147 e uma sequência previamente sequenciada do citocrómio P450 de abacate (0'Keefe e Leto, 1989; Bozak et al., 1990) foi usada, como descrito nos Materiais e Métodos, para projectar um segundo oligonucleótido degenerado (oligo 3) que cobriu as sequências de aminoácidos codificadas por pelo menos dois dos três clones de citocrómio P450. Este oligonucleótido foi usado para amplificar por PCR sequências relacionadas, usando a biblioteca de cDNA #1 como molde e o oligo 4 como segunda sequência iniciadora (Fig. 3B). Os produtos de reacção na gama de tamanhos 250-500 pb foram isolados como descrito nos Materiais e Métodos e clonados no vector pBluescript com caudas ddT descrito por Holton e Graham (1991). Os fragmentos de PCR clonados foram sequenciados e mostrou-se codificarem um quinto homólogo do citocrómio P450. Um clone, designado pCGP454, foi escolhido para posterior análise. -50 - y4t rfr *. í <~x

Isolamento de outros homólogos do citocrómio P450 a partir da biblioteca de cDNA #1

Uma sonda mista de fragmentos de DNA marcados com P que incluíram as regiões codificadoras dos homólogos do citocrómio P450 pCGP142, pCGP147, pCGP158 e pCGPlóO e o inserto de cDNA de pCGP454 (Figuras 4B e 4H) foi usado para o despiste de 50 000 recombinantes a partir da biblioteca de cDNA #1 relativamente a sequências relacionadas. Detectou-se um total de 152 clones que hibridaram em condições de hibridação e lavagem de restringência baixa. Identificaram-se mais 13 homólogos diferentes do citocrómio P450 por análise da sequência de DNA isolado a partir do clones que deram hibridação positiva. Entre estes clones distinguiram-se dois grupos irmãos estreitamente relacionados. As regiões codificadoras de cada um dos dois grupos mostrou 94% de homologia ou semelhança ao nível do DNA. Dois representantes de um grupo irmão, pCGP174 (Figura 5A) e pCGP176 e um representante de outro grupo irmão, pCGP175 (Figura 5B), foram escolhidos para posterior estudo.

Análise Northern e RFLP dos homólogos do citocrómio P450

As análises Northern e RFLP foram usadas para distinguir quais os homólogos do citocrómio P450 que tinham as características moleculares de um cDNA codificador de uma hidroxilase da posição 3' e 5'. Existem dois loci genéticos em P. hybrida, Hfl e Hf2. que controlam a actividade de 3',5'-hidroxilase (de Vlaming et al., 1984; Wiering, 1974). Hfl é expresso no limbo e no tubo das flores de P. hybrida e dá origem a níveis muito mais elevados de actividade de 3',5'-hidroxilase do que Hf2. o qual é expresso apenas no limbo. A actividade de 3',5'-hidroxilase de Petunia é também regulada em termos de desenvolvimento e em termos espaciais. Em condições de crescimento normais a -51 -enzima pode ser detectada apenas em tecidos das pétalas, aumentando para níveis máximos à volta das fases 3-4 do desenvolvimento das flores e depois declinando na flor totalmente aberta (fase 5; ver Figura 2(B)). A actividade pode ser também induzida no tecido foliar em determinadas condições de tensão tais como o tratamento com glucose/luz intensa descrito atrás. Assim, esperava-se que um clone de cDNA codificador de uma 3',5'-hidroxilase possuísse um perfil de expressão nas transferências de RNA paralelo ao perfil de actividade enzimática. Também era de esperar que um clone de cDNA codificador de uma 3',5'-hidroxilase de P. hybrida mapeasse nos loci Hfl ou Hf2. Hfl foi mapeado no cromossoma I do genoma de P. hybrida e está ligado ao locus Phl (Comu, 1984; Comu et al., 1990) enquanto Hf2 está estreitamente ligado a Po no cromossoma V (Wallroth et al, 1986). A análise por RFLP do DNA isolado a partir da população F2 de plantas derivadas de um cruzamento entre as linhas singeneicas V23 (Hfl/Hfl. Hf2/Hf2) e R51 (Hfl/Hfl. Hf2/Hf2) foi usado para obter dados de ligação para vários homólogos do citocrómio P450. Um genótipo Hfl/- foi atribuído às plantas de F2 que tinham actividade de 3',5'-hidroxilase no tubo das flores. Ainda, foi possível atribuir um genótipo Hfl/Hfl às plantas na população F2 baseado na ligação ao gene phl que influencia o pH do vacúolo das pétalas (Wiering e de Vlaming, 1984). A linha parental V23 (Hfl/Hfl) também tinha um genótipo phl/phl que resulta num pH de homogenato de pétalas de aproximadamente 6,2. Uma vez que as plantas Phl/- possuem um pH do homogenato de pétalas de 5,3, foi possível distinguir plantas phl/phl (Hfl/Hfl) dentro da popualção F2 de R51xV23 testando o pH dos homogenatos de pétalas. A ligação entre os loci Hf2 e Po foi usada para distinguir os clones Hf2 candidatos. O locus Po corresponde ao gene chiA de P. hybrida que codifica -52-

a enzima isomerase de chalcona flavanona (van Tuncn et al., 1991). Um clonc de cDNA de chi-A pode assim ser usado na análise por RFLP para atribuir o genótipo Po ou po a indivíduos na população F2. Uma vez que V23 tinha um genótipo Hf2/Hf2, po/po foi possível determinar a ligação ao locus Hf2 por co-segregação dos padrões de RFLP tipo V23 e tipo R51 com os padrões po e Po detectados pela sonda chi-A.

Os fragmentos de cDNA que correspondiam à região 3' não traduzida dos homólogos do citocrómio P450 foram usados para o despiste das transferências de RNA e transferências Southern de DNA genómico isolado a partir de plantas individuais na população F2 V23 x R51. Através desta análise demonstrou-se que os genes correspondendo aos clones de cDNA pCGP174 e pCGP175 foram expressos de forma paralela à actividade de 3',5'-hidroxilase. Ainda, demonstrou-se que o gene correspondendo ao pCGP174 está estreitamente ligado ao locus Hfl e pCGP175 está ligado ao locus Hf2. a. pCGP174

Um fragmento HindIII-Kpnl 3' de 330 pb derivado do clone pCGP174 (Fig. 5A) deu um padrão de hibridação nas transferências de RNA e DNA que sugeriu que este clone corresponde ao locus Hfl (Figura 6). O gene foi expresso tanto nos tecido do limbo como do tubo. e possui um perfil de desenvolvimento paralelo ao de actividade de 3',5'-hidroxilase, sendo máxima nos limbos das pétalas da fase 3. Não se detectou qualquer expressão na folha, mas foi induzida neste tecido pelo tratamento com glucose/luz intensa. Ainda, não houve expressão detectável do gene no tecido das pétalas das linhas mutantes Hfl /Hfl R51 ou Sw63. Pelo contrário, foram detectados níveis de expressão relativamente elevados nas linhas Hfl /Hfl V23 e Th7 e no híbrido V23xR51 (Fig. 6A).

Nas transferências Southern do DNA genómico digerido com Xbal, o fragmento 3' HindIII-Kpnl do pCGP174 detectou dois RPLPs que segregaram independentemente na população F2 V23xR51. RFLP#1 corresponde às bandas de DNA que hibridam fortemente enquanto que RFLP#2 corresponde às bandas de DNA com hibração fraca (ver Fig. 6B). Onze de doze plantas a que tinha sido atribuído um fenótipo ghl/phl tinham um padrão do tipo V23 para RFLP#1 e 49 de 49 plantas que tinham actividade de 3',5'-hidroxilase no tubo tinham um padrão do tipo V23 ou Vr para RFLP #1. Ainda, para um total de 32 plantas, houve co-segregação completa dos padrões de RFLP V23, VR e R51 para chi-A (po) com os correspondentes padrões de RFLP#2.

Estes dados proporcionam forte evidência de que pCGP174 codifica uma 3',5'-hidroxilase e corresponde ao locus Hfl (RFLP #1) e que a sonda 3' dá hibridação cruzada com o locus Hf2 (RFLP#2). b. pCGP175

Um fragmento 3' HindIII/Xhol de 320 pb derivado do clone pCGP175 (fig. 5B) deu um padrão de hibridação nas transferências de RNA e de DNA que sugeriu que este clone corresponde ao locus Hf2 (Fig. 7). A análise Northern mostrou que o gene é regulado em termos de desenvolvimento de forma semelhante a pCGP174, com expressão máxima nos limbos das pétalas de OGB na Fase 3, no entanto não se detectou expressão o tecido do tubo de OGB. O gene foi também expresso no tecido das pétalas de V23 (Hf2/Hf2), Th7 (Hf2/Hf2) e no híbrido V23 x R51 (fig. 7A).

Nas transferências Southern, o fragmento Hindin/Xhol de 320 pb produziu por digestão com Xbal do DNA genómico de V23 e R51 que hibridou fracamente com a sonda 3' de pCGP174 (RFLP #2). Houve segregação completa dos padrões do tipo V23, VR e R51 detectados pela sonda pCGP175 e os correspondentes padrões de RFLP para chi-A (Po) (Fig. 7B).

As experiências de expressão em levedura (ver abaixo) subsequentemente confirmaram que pCGP175 e um clone irmão de pCGP174 (pCGP176) codificam ambos uma 3',5'-hidroxilase. Ainda, a expressão de uma versão de tamanho completo de pCGP174 num mutante Hfl/Hfl. Hf2/Hf2 de Petunia resultou num aumento de actividade de 3',5'-hidroxilase e produção de antocianinas hidroxiladas em 3' e 5' acima dos níveis basais baixos normalmente encontrados na planta não transgénica. Considerando também os resultados de RFLP, concluiu-se a partir destes dados que pCGP174 corresponde ao locus Hfl e pCGP175 corresponde ao locus Hf2.

Isolamento de clones de cDNA Hfl de tamanho completo e análise da sequência A partir da análise preliminar das sequências demonstrou-se que pCGP174 não representa um clone de tamanho completo do transcripto correspondente, enquanto que pCGP175 inclui um codão de iniciação putativo e presumivelmente é um cDNA de tamanho completo. A análise das sequências também mostrou que pCGP176 é uma versão mais longa de pCGP174 e inclui um codão ATG a 17 pb do extremo 5'. No entanto, a partir desta análise por si só não foi possível prever com confiança se pCGP176 inclui toda a região codificadora deste gene. assim, a biblioteca de cDNA #2 foi despistada relativamente a clones maiores do grupo irmão pCGP174/pCGP176. Aproximadamente 1,5 x 105 recombinantes da biblioteca de cDNA #2 foram despistados relativamente a clones que hibridam com o fragmento HindIII-Kpnl de 0,33 Kb derivado do pCGP174. Dois clones que deram hibridação positiva, designados pCGPóOl e pCGP602 foram escolhidos para posterior análise. Tanto pCGP601 como pCGP602 incluem presumíveis codões de iniciação da tradução, mas pCGP602 codifica uma região 5' não traduzida mais longa.

Na Figura 8 está apresentado um mapa de enzimas de restrição de pCGP602, indicando a metodologia adoptada para sequenciação do clone e as sequências iniciadoras oligonucleotídicas usadas para obter informação de sequências sobreponíveis, está apresentado na Figura 8.

Na Figura 9 estão apresentadas a sequência de nucleótidos e sequência de aminoácidos deduzida dos clones irmãos de pCGP176 e pCGP602. De forma semelhante, a Figura 10 mostra a sequência de nucleótidos e produto de tradução deduzido de pCGP175.

Usando um alinhamento gerado pelo programa LFASTA (Pearson e Lipman, 1988), as sequências de aminoácidos codificadas pelos genes da 3',5'-hidroxilase partilham 94% de identidade das posições. As sequências de nucleótidos são 94% idênticas. Baseado no esquema de classificação dos citocrómios P450, esta sequência de forma semelhante coloca ambos os genes na mesma famíli/sub-família. Devido às sequências de aminoácidos da 3',5'-hidroxilase partilharem menos de 40% de identidade com qualquer membro anteriormente caracterizado da superfamília do citocrómio P450, os gene correspondentes pertencem a uma nova família P450 separada de todos os genes

Expressão do cDNA de pCGP175 em levedura O inserto de cDNA derivado de pCGP175 foi ligado na orientação correcta a seguir ao promotor da desidrogenase do gliceraldeído-3-fosfato no vector de levedura pYGA22m. A construção resultante, designada pCGP618 (Fig. 11) foi usada para transformar a estirpe de levedura G-1315 (Ashikari et ai, 1989). Um único transformante foi crescido em 50 ml de YNBC a 30°C durante 2 dias. Uma fracção de microssomas preparada a partir desta cultura possui actividade de 3',5'-hidroxilase enquanto que uma fracção equivalente preparada a partir de levedura não transformada não possui actividade (Fig. 12). Assim, concluiu-se que o inserto de cDNA derivado de pCGP175 codifica uma 3',5'-hidroxilase.

Expressão do cDNA de pCGP176 em levedura O inserto de cDNA derivado de pCGP176 foi ligado na orientação correcta a seguir ao promotor da desidrogenase do gliceraldeído-3-fosfato no vector de levedura pYGA22m. A construção resultante, designada pCGP620 foi usada para transformar a estirpe de levedura G-1315. Um extracto preparado a partir de levedura transformada mostrou possuir actividade de 3',5'-hidroxilase enquanto uma fracção equivalente preparada a partir de levedura não transformada não tinha actividade (Fig. 13). Assim, concluiu-se que o inserto de cDNA derivado de pCGP176 codificava uma 3',5'-hidroxilase. 5. Expressão de um cDNA de Hfl a. Expressão no híbrido Fi Sk4 x Sw63 Hfl/Hfl, Hf2/Hf2 de P. hybrida O inseriu de eDNA de pCGP602 foi ligado a seguir ao promotor Mac do vector binário Ti pCGP293. A construção resultante, designada pCGP90 (Fig. 14), foi introduzida no híbrido Fj Skr4 x Sw63 de Petunia usando a transferência de genes mediada por Agrobacterium. Discos das folhas de Skr4 x Sw63 foram cocultivados com AGL0/pCGP90 e a integração do inserto de cDNA de pCGP602 no genoma de Skr4 x Sw63 foi confirmado por análise Southern de plantas obtidas após selecção com canamicina.

As plantas transgénicas tinham níveis significativamente mais elevados de actividade enzimática de 3',5'-hidroxilase (Fig. 15) e antocianinas hidroxiladas nas posições 3' e 5' (Tabela 3A) relativamente ao híbrido Skr4 x Sw63 não transgénico. Se bem que Skr4 x Sw63 seja homozigótico recessivo para ambos os genes Hfl e Hf2, estas mutações não bloqueiam completamente a produção de enzima uma vez que foram detectados níveis baixos de actividade de 3',5'-hidroxilase em extractos de pétalas de Skr4 x Sw36 (Figura 15). Ainda, foram detectados níveis baixos de malvidina (100 pg/g) em extractos de pétalas de Skr4 x Sw63 hidrolisado com ácido (Tabela 3A). A introdução do cDNA de Hfl aumentou significativamente o nível de actividade de 3',5'-hidroxilase no tecido do limbo de pétalas (fig. 15) e os extractos de pétalas hidrolisados com ácido derivados de plantas transgénicas tinham quatro vezes o nível de malvidina detectados no controlo não transgénico (Tabela 3A). b. Expressão em Nicotiana tabacum cultivar Xanthi

Flores de tabaco (N. tabacum cv Xanthi) produzem cianidina como a única antocianidina. A transformação de tabaco com pCGP90 conduziu à acumulação de quantidadessignifícativas de delfínidina nas flores, para além de cianidina (mostrado na Tabela 3A). -58- I^U, tf O ( **·! TABELA3A Análise de pigmentos Níveis de antocianidina encontrados nos extractos de pétalas hidrolisados com ácido Planta Malvidina Cianidina Delfinidina (pg/g de pétalas) (pg/g de pétalas) (pg/g de pétalas) Petunia Sr44 x Sw63 100 nd1 nd Skr4 x Sw63/pCGP90 410 nd nd Tabaco não cultivado nd 272 nd (controlo) Tabaco transgénico nd 229 36 1 não detectado c. Expressão no híbrido Ft de P. hybrida Hfl/Hfl. Hf2/Hf2 Rp57 x

Rwl4 A linha Rp57 x Rwl4 de petúnia foi transformada usando pCGP90 e um processo semelhante ao usado para Sk4 x Sw63. As flores transgénicas produziram quantidades consideráveis de petunidina e de malvidina que não foram detectáveis nas plantas não transformadas (Tabela 3B). A petunidina e a malvidina são ambas derivados da delfinidina.

TABELA 3B

Análise de pigmentos da linha Rp57xRwl4 de pH alto

Percentagens de antocianidinas encontradas em extractos de pétalas hidrolisados com ácido

Planta Cianidina (%) Peonidina (%) Petunidina (%) Malvidina (%) Petunia Rp57 xRw14 5,0 95,0 0 0 Rp57xRw14/pCGP90 0 45,2 7,8 47,0 A expressão do cDNA de Hfl introduzido no híbrido Skr4xSw63 teve um efeito marcado na cor da flor. Os tecidos do carpelo e do estame nas plantas não transgénicas são brancos, enquanto os mesmos tecidos nas plantas transgénicas são azul/púrpura. Ainda, a expressão do cDNA de Hfl no híbrido Skr4xSw63 conferiu uma cor rosa escuro/matiz violeta à corola que normalmente é rosa muito pálido.No caso do tabaco, a produção de derivados de delfinidina conduziu a um azulamento das flores senescentes. A expressão do cDNA de Hfl no híbrido Rp57xRwl4 deu novamente um efeito marcado na cor da flor. As flores R57xRwl4 não transgénicas são cor de rosa, com peonidina sendo o principal componente presente (ver Tabela 3B). A transformação com cDNA de Hfl conduziu a um azulamento marcado da cor da flor.

As alterações da cor observadas podem ser também descritas em termos de números do Royal Horticultural Society's Colour Chart. Em geral, as alterações podem ser descritas como indo da cor pálido a matiz médio de 60C/D65C/D, a azul mais escuro/matiz mais púrpura representado por muitos, mas não todos, dos quadrados de cor entre 70 e 85. Ainda que não querendo -60- í/fl 5 * limitar as alterações possíveis de eor que podem ser conseguidas, algumas das cores observadas no híbrido Skr4xSw63 podem ser descritas, aproximadamente, como tendo mudado de 65B (não transformado) para 7B e para 74B (ambos transformados). Igualmente, vários híbridos Rp57xRwl4 devem ser descritos como movendo-se de 64C para 77B e para 82B. Deverá se lembrado que outras condições bioquímicas e fisiológicas afectarão o resultado e a citação de cores específicas conseguidas não deverá ser interpretado como definindo agama possível.

Detecção de sequências de genes putativos de 3',5'-hidroxilase noutras espécies de plantas A presença de flavonóides hidroxilados nas posições 3', 4' e 5' está relacionada com a presença de actividade de 3',5'-hidroxilase e portanto com o gene da 3',5'-hidroxilase. Será de esperar que estes genes de outras espécies hibridem com o o gene da 3',5'-hidroxilase em condições de baixa restringência. O RNA (Figura 16) e/ou DNA (Figura 17) foi isolado a partir de uma série de plantas produtoras de delfmidina, despistadas com cDNA Hfl marcado com 32P e lavado em condições de baixa restringência. Foram detectadas em todos os exemplos bandas que hibridam. Assim, o isolamento dos genes da 3',5'-hidroxilase a partir de outras plantas produtoras e delfmidina deverá ser possível usando um gene da 3',5'- hidroxilase de petúnia como sonda.

Os familiarizados com a matéria poderão avaliar que o invento aqui descrito é susceptível de outras variações e modificações para além das especifícamente descritas. Deve-se entender que o invento inclui todas essas variações e modificações. O invento também inclui todos os passos, características, composições e compostos referidos ou indicados nesta especificação, individualmente ou colectivamente, e qualquer uma das combinações de dois ou mais dos referidos passos ou características.

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Lisboa, 4 de Abril de 2001

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ALBERTO CANELAS Agente Oficial da Propriedade Industrial RUA VICTOR CORDON, 14 1200 LISBOA

Claims

REIVINDICAÇÕES 1. Um ácido nucleico compreendendo uma sequência de nucleótidos codificadora de uma enzima de hidroxilação do di-hidrocaempferol (DHK), ou um seu derivado, que hidroxila um ou mais de DHK, DHQ, naringenina e eriodicitol, ou a sua sequência complementar, a referida sequência compreendendo: a sequência de nucleótidos descrita na Figura 9 ou 10, ou a sua sequência complementar, ou uma sequência de nucleótidos capaz de hibridar com a sequência de nucleótidos descrita na Figura 9 ou 10, ou a sua sequência complementar, em condições de restrição elevada de 20% de formamida, 6xSSC, 1% p/v de SDS a 42°C durante 16 horas seguido de lavagem em 6xSSC, 1% p/v SDS a 65°C durante 1 hora.
2. Um isolado de ácido nucleico de acordo com a reivindicação 1, em que a sequência de aminoácidos da enzima de hidroxilação de DHK ou seu derivado compreende a sequência de aminoácidos FGA/SGRRICAG e em que o referido isolado de ácido nucleico é obtido a partir de plantas.
3. Um isolado de ácido nucleico de acordo com a reivindicação 2, em que a sequência de aminoácidos da enzima de hidroxilação de DHK ou seu derivado compreende FGAGRRICAG.
4. Um isolado de ácido nucleico de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, em que a enzima é a 3',5'-hidroxilase de flavonóides. -2-
5. Um isolado de ácido nucleico de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, em que a sequência de nucleótidos é como descrita na Figura 9 ou 10.
6. Um isolado de ácido nucleico de acordo com a reivindicação 4, em que a 3',5'-hidroxilase de flavonóides é originária de petúnia, verbena, espora dos jardins, videira, íris, frésia, hortênsia, cíclame, batateira, amor perfeito ou beringela.
7. Um isolado de ácido nucleico de acordo com a reivindicação 6, em que a 3',5'-hidroxilase de flavonóides é derivada de petúnia.
8. O isolado de ácido nucleico de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7 quando presente numa célula vegetal transgénica.
9. O isolado de ácido nucleico de acordo com a reivindicação 8, em que a planta transgénica é uma roseira, petúnia, crisântemo, craveiro, gerbéria, gerânio ou alstroeméria.
10. O isolado de ácido nucleico de acordo com a reivindicação 9, em que a planta transgénica é uma roseira ou petúnia.
11. O isolado de ácido nucleico de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7 contido numa molécula de vector capaz de transferir o referido isolado de ácido nucleico para uma célula ou tecido vegetal.
12. O isolado de ácido nucleico de acordo com a reivindicação 11, em que a transferência requere cocultura com Agrobacterium.
13. 0 isolado de ácido nucleico de acordo com a reivindicação 11, em que o vector e o isolado de ácido nucleico é pCGP90 como se mostra na Figura 14.
14. Um método para a produção de uma planta transgénica capaz de expressar uma enzima recombinante de hidroxilação de di-hidro-caempferol (DHK), ou que dirige a transcrição de uma sequência de ácido nucleico, que é substancialmente complementar da totalidade ou de parte de uma molécula de mRNA traduzível numa enzima de hidroxilação de DHK, o referido método compreendendo a introdução numa célula de uma planta adequada do isolado de ácido nucleico de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, em condições que permitem a eventual expressão do referido isolado de ácido nucleico, regeneração de uma planta transgénica a partir da célula e crescimento da referida planta transgénica durante tempo e em condições suficientes para permitir a expressão do isolado de ácido nucleico, em que a referida planta transgénica apresenta propriedades alteradas da inflorescência como resultado da introdução da referida molécula de ácido nucleico isolada.
15. Um método de acordo com a reivindicação 14, em que a enzima recombinante é a 3',5'-hidroxilase de flavonóides.
16. O método de acordo com a reivindicação 14 ou 15, em que a expressão do isolado de ácido nucleico é regulada ao longo do desenvolvimento.
17. O método de acordo com a reivindicação 16, em que a enzima recombinante é originária de petúnia, verbena, espora dos jardins, videira, íris, frésia, hortênsia, ciclâme, batateira, amor perfeito ou beringela. -4-
18. O método de acordo com a reivindicação 17, em que a enzima recombinante é derivada de petúnia.
19. O método de acordo com qualquer uma das reivindicações 14 a 18, em que a planta transgénica é uma roseira, petúnia, crisântemo, craveiro, gerbériaou tabaco.
20. O método de acordo com a reivindicação 19, em que a planta transgénica é uma roseira ou petúnia.
21. Uma célula vegetal transgénica portadora de uma molécula de ácido nucleico estavelmente introduzida compreendendo uma sequência nucleotídica como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 13, em que a referida planta apresenta propriedades alteradas da inflorescência como resultado da introdução da referida sequência nucleotídica.
22. A célula vegetal transgénica de acordo com a reivindicação 21, em que a referida planta é uma roseira, petúnica, crisântemo, craveiro, ger-béria, íris, tulipa, lírio, lisianto, ffésia, espora dos jardins, limónio ou pelargónio.
23. A célula vegetal transgénica de acordo com a reivindicação 22, em que a planta transgénica é uma roseira ou petúnia.
24. Um método para a clonagem de uma molécula de ácido nucleico compreendendo uma sequência de nucleótidos codificadora de uma enzima de hidroxilação do di-hidrocaempferol (DHK), ou um seu derivado, que hidroxila uma ou mais de entre os compostos DHK, DHQ, naringenina e erio-dicit.nl, ou a sua sequência complementar, a referida sequência compreendendo: a sequência de nucleótidos descrita na Figura 9 ou 10, ou a sua sequência complementar, ou uma sequência de nucleótidos capaz de hibridar com a sequência de nucleótidos descrita na Figura 9 ou 10, ou com a sua sequência complementar, em condições de restringência de 20% de formamida, óxSSC, 1% p/v de SDS a 42°C durante 16 horas, seguido de lavagem em 6xSSC, 1% p/v de SDS a 65°C durante 1 hora, o referido método compreendendo a amplificação das sequências nucleotídicas das enzimas de hidroxilação de DHK ou sequências complementares a partir de uma preparação adequada de moléculas de ácido nucleico derivada de células da referida planta através de uma ou mais reacções em cadeia com polimerase usando uma ou mais sequências oligonucleotídicas iniciadoras baseadas na sequência de aminoácidos FGA/SGRRICAG.
25. O método de acordo com a reivindicação 24, em que a sequência de aminoácidos é FGAGRRICAG.
26. O método de acordo com qualquer uma das reivindicações 24 a 25, em que a enzima de hidroxilação de DHK é uma 3',5'-hidroxilase de flavonóides.
27. Uma célula vegetal transgénica obtida pelo método de qualquer uma das reivindicações 14 a 20.
28. Utilização de uma molécula de ácido nucleico, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 13, na produção de uma planta com a cor da flor alterada.
29. Uma planta transgénica compreendendo as células vegetais de qualquer uma das reivindicações 21 a 23.
30. Uma planta transgénica obtida pelo método de qualquer uma das reivindicações 14 a 20.
31. Uma planta transgénica portadora de uma molécula de ácido nucleico, estavelmente introduzida, compreendendo uma sequência de nucleó-tidos conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 13, em que a referida planta apresenta propriedades alteradas das inflorescências como resultado da introdução da referida sequência nucleotídica.
32. Uma flor transgénica de uma planta transgénica conforme definido em qualquer uma das reivindicações 29 a 31.
33. Partes reprodutoras transgénicas de uma planta transgénica conforme definido em qualquer uma das reivindicações 29 a 31.
34. Partes vegetativas transgénicas de uma planta transgénica conforme definido em qualquer uma das reivindicações 29 a 31.
35. Método para a produção de uma célula vegetal transgénica capaz de expressar uma enzima recombinante de hidroxilação do di-hidrocaem-pferol (DHK) ou que dirige a transcrição de uma sequência de ácido nucleico que é substancialmente complementar da totalidade ou de parte de uma molécula de mRNA traduzível numa enzima de hidroxilação de DHK, o referido método compreendendo a introdução numa célula de uma planta adequada do isolado de ácido nucleico de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13 em condições que permitem a eventual expressão do referido isolado de ácido nucleico.
36. O método de acordo com a reivindicação 14, em que o -7- referido método ainda compreende o passo de obtenção de uma flor transgénica a partir da referida planta transgénica.
37. O método de acordo com a reivindicação 14, em que o referido método compreende ainda o passo de obtenção de partes reprodutoras transgénicas a partir da referida planta transgénica.
38. O método de acordo com a reivindicação 14, em que o referido método compreende ainda o passo de obtenção de partes vegetativas transgénicas a partir das plantas transgénicas.
39. O método de acordo com a reivindicação 24, em que o referido método compreende ainda o passo de isolamento da referida molécula de ácido nucleico. Lisboa, 4 de Abril de 2001

ALBERTO CANELAS Agente Oficial da Propriedade Industrial RUA VICTOR CORDON, 14 1200 LISBOA