PT559164E

PT559164E - Metodo imunologico para a determinacao de hbalc

Info

Publication number: PT559164E
Application number: PT93103349T
Authority: PT
Inventors: Karl Dr Johann; Kerscher Dr Lorenz; Schneider Dr Erich
Original assignee: Roche Diagnostics Gmbh
Priority date: 1992-03-05
Filing date: 1993-03-03
Publication date: 2000-10-31
Also published as: EP0559164B1; NZ247054A; FI930975L; JPH0611510A; AU3387193A; SI9300108A; EP0559164A2; JP2637677B2; CA2090981A1; HU9300596D0; HUT70463A; DE59310046D1; ATE193378T1; CA2090981C; AU652092B2; CZ29193A3; DE4206932A1; FI930975A0; EP0559164A3; PL297915A1

Description

55*5- fU

DESCRIÇÃO "MÉTODO IMUNOLÓGICO PARA A DETERMINAÇÃO DE HbAlc" A invenção refere-se a um método para a determinação do teor de um derivado de hemoglobina determinado numa amostra de sangue. Em especial, a invenção refere-se a um método para a determinação do teor em derivados de hemoglobina, como a hemoglobina glicosilada, que efectua a determinação em separado do teor total em hemoglobina e a determinação de derivados de hemoglobina, de modo a determinar a fracção de hemoglobina derivatizada no sangue.

De modo dependente do nível de açúcar no sangue, uma pequena porção da glucose retida pelos eritrócitos liga-se, por uma reacçâo não enzimática, ao resíduo de valina do terminal-N da cadeia β da globina. A reacçâo que origina o derivado de hemoglobina glicosilado, estável, HbAj.c (forma cetoamina) é realizada em duas fases. Primeiro, a glucose liga-se à hemoglobina, através de uma ligação rápida, reversível, com formação de um derivado de hemoglobina glicosilado, lábil (base de Schiff). Através de uma reacçâo de troca irreversível, lenta (troca de Amadori), forma-se a forma estável. A fracção de HbAic da hemoglobina total, monta a 3-6% após estabelecimento da troca de material. Em pacientes com diabetes, a fracção de HbAic pode aumentar até ao valor de 12%, ou mesmo até 20%, durante as 4 a 12 semanas anteriores, de forma proporcional ao nível da concentração de glucose no sangue. A determinação da fracção relativa de HbAic no conteúdo total de hemoglobina proporciona, em especial, um parâmetro integral para o controlo da evolução da subida de açúcar no sangue. 1 Λ c

Γ

Estão descritos vários métodos para a determinação de hemoglobina glicosilada. Os métodos convencionais baseiam-se em técnicas como a electroforese, focagem isoeléctrica e determinação colorimétrica, bem como a cromatografia de permuta iónica e de afinidade. Desde a descrição da preparação de anticorpos policlonais específicos (patente US 4,247,533) e anticorpos monoclonais específicos (EP-A-0 316 306, EP-A-0 201 187), têm sido desenvolvidos vários métodos imunológicos para a identificação de HbAic. A EP-A-0 185 870 descreve um método imunológico para a determinação de proteínas, entre outras a HbAic. Utilizaram-se anticorpos monoclonais, que reconhecem epítopos peptídicos lineares específicos. Para a libertação dos epítopos está descrita uma desnaturação, entre outras através de reagentes caotrópicos. A temperaturas inferiores a 37 °C, este passo de desnaturação tem a duração de uma a mais horas, a temperaturas acima de 50 °C, de um minuto. A determinação simultânea do teor de hemoglobina total na amostra não é descrito em pormenor.

Na EP-A-0 201 187 está descrito um método para a determinação de HbAic, em que se utilizam anticorpos monoclonais contra HbAic, que foram obtidos por imunização com HbAi0 humana nativa. A identificação é realizada a temperaturas de 4 a 37 °C, podendo cada passo de incubação ter a duração de até 72 horas. Não está descrita a determinação do teor de hemoglobina total e de HbAic na mesma amostra.

Na EP-A-0 315 864 está descrito um método para a determinação do teor relativo de HbAic numa amostra de sangue. A hemoglobina é desnaturada com tiocianato e convertida em Meta-hemoglobina, através de um meio de oxidação adicional, de preferência ferricianeto. Na amostra de sangue assim tratada, pode-se determinar tanto o conteúdo em hemoglobina total, como em HbAic. 2

A utilização de sais de litio, em especial de tiocianato de lítio, para a lise dos eritrócitos e desnaturação dos derivados de hemoglobina é descrita na EP-A-0 407 860. O teor em HbAic pode ser determinado imunologicamente. Para a identificação da hemoglobina total, deve-se adicionar, adicionalmente, um meio de oxidação, de preferência ferricianeto, que converta a hemoglobina em meta-hemoglobina.

Uma desvantagem destes dois últimos métodos consiste no facto de ser necessário utilizar cianeto para realizar a conversão de hemoglobina em ciano-meta-hemoglobina. A substituição do cianeto por laurilsulfato de sódio (SLS) para identificação de hemoglobina total, está descrita em Clin. Biochem _15 (1982) 83-88. Neste não é, no entanto, dada nenhuma indicação sobre se o tratamento da amostra com SLS é adequado para a determinação imunológica de um derivado de hemoglobina, em particular a HbAic.

Também na EP-A-0 184 787 está descrito um reagente para a determinação da hemoglobina total numa amostra de sangue, que é isento de cianeto. O reagente é um meio iónico tensioactivo, com um pH no mínimo de 11,3, de preferência superior a 13,7. Não é referida a determinação imunológica de um derivado de hemoglobina. 0 valor tão elevado de pH será uma desvantagem para a determinação imunológica de um derivado de hemoglobina glicosilado, uma vez que em condições de forte alcalinidade, pode ocorrer a separação da fracção de açúcar da hemoglobina. No caso de uma marcação enzimática do anticorpo utilizado, a reacção enzimática pode ser inibida, uma vez que o pH óptimo da maioria das enzimas utilizadas é de 6a 8. Além disso, a reacção imunológica poderá também ser inibida por estes valores elevados de pH. A JP 58061465, Database WPIL, Week 8723, Derwent Publications Ltd., AN 87-159653 descreve um método para a 3

determinação de glicosil-hemoglobina. Um reagente de hemólise, um detergente não iónico ou iónico, estão absorvidos numa membrana porosa. A FR-A 2 559 267 descreve um método para a identificação de hemoglobina, em que uma amostra de sangue é tratada com uma solução de SDS. Em seguida, o resíduo de glucose de HbAiac é separado por tratamento ácido. Após a desproteinização, a glucose é determinada fotometricamente. A EP-A 0 444 241 descreve um método para a identificação de hemoglobina, em que se utiliza um reagente que contém, além de outros componentes, detergentes catiónicos.

Persiste assim a necessidade de um método de identificação imunológico para a determinação de um derivado de hemoglobina no sangue, em que a hemólise possa ser realizada a temperaturas baixas - como por exemplo a temperatura ambiente -, que não necessite de um tempo de incubação longo para preparação da amostra e que evite a utilização de reagentes nocivos para o ambiente, como o cianeto. Além disso, a determinação simultânea da hemoglobina total deverá ser possível no mesmo hemolisado, de modo a poder determinar a fracção de derivados de hemoglobina, em relação ao teor de hemoglobina total do sangue, sem outros passos de hemólise. 0 objecto da presente invenção é o de proporcionar um método de identificação imunológico, para a determinação de um derivado de hemoglobina no sangue. 0 objectivo é atingido através da invenção que está caracterizada em maior pormenor nas reivindicações. No essencial, este objectivo é alcançado através de um método para a determinação do conteúdo de um derivado de hemoglobina numa amostra de sangue, que se caracteriza por a amostra de sangue ser tratada com um reagente de hemólise com um pH de 5 a 9,5, que contém um detergente iónico, e por o derivado de hemoglobina 4

ser determinado imunologicamente na amostra de sangue hemolisado.

Um outro objecto da invenção é um método para a determinação do teor de um derivado de hemoglobina e da hemoglobina total numa amostra de sangue, que consiste em tratar a amostra de sangue com um reagente de hemólise com um pH de 5 a 9,5, que contém um detergente iónico, determinar o teor de hemoglobina total na amostra hemolisada e determinar imunologicamente o derivado de hemoglobina na amostra hemolisada.

Um outro objecto da invenção é um reagente de hemólise com um pH de 5 a 9,5 que contém um detergente iónico, a sua utilização para a preparação de amostras de uma amostra de sangue, para a determinação imunológica do derivado de hemoglobina e, caso desejável, para determinação do teor de hemoglobina total, bem como um kit de teste, que contém o reagente de hemólise.

Por acção do reagente de hemólise, os eritrócitos existentes na amostra de sangue são lisados e a hemoglobina é convertida num cromófero de hemoglobina especifico. 0 cromófero de hemoglobina formado pode ser utilizado para a determinação do teor de hemoglobina total, através da sua absorção característica, e para a determinação do derivado de hemoglobina, através da reacção imunológica do epitopo especifico. Como método de identificação imunológica podem-se utilizar em principio todos os métodos usuais. Podem-se utilizar métodos directos ou indirectos (competitivos), como por exemplo testes sanduíche, testes IEMA, testes de precipitação ou de aglutinação, bem como testes de acordo com o principio FPIA e CEDIA, bem como testes húmidos e secos. 5

;

No reagente de hemólise podem-se utilizar como detergentes iónicos, detergentes aniónicos, de preferência duodecilsulfato de sódio (SDS), dioctilsulfosuccinato de sódio (DONS), detergentes catiónicos, de preferência brometo de tetradeciltrimetilamónio (TTAB), ou brometo de cetiltrimetilamónio (CTAB) ou detergentes zwiteriónicos, de preferência o "Zwittergent" 3-14. 0 reagente de hemólise é adicionado à amostra de sangue, numa quantidade suficiente para lisar os eritrócitos, converter a hemoglobina no cromófero de hemoglobina especifico e libertar o epitopo do derivado de hemoglobina. 0 reagente de hemólise é adicionado à amostra de sangue numa proporção de 1:10 a 1:400, de modo a que a concentração de detergente iónico na mistura resultante seja de 0,01 a 5 % em peso, de preferência 0,5-1,5 % em peso. O valor de pH do reagente de hemólise situa-se na região ligeiramente ácida a fracamente alcalina. De preferência, o pH situa-se entre 5,0 e 9,5, sendo especialmente preferido o valor de pH 7,4. Para ajuste do valor de pH no reagente de hemólise podem-se utilizar todos os tampões usuais. De preferência, utiliza-se tampão HEPES, MES, TRIS ou fosfato. O reagente de hemólise pode conter outros reagentes que, servem por exemplo para eliminar perturbações da reacção imunológica, oxidação da hemoglobina, eliminação da turvação, estabilização ou conservação. Alguns detergentes, entre outros o SDS, poderão prejudicar a reacção imunológica. Nalguns casos, existe turvação ou floculação após a adição do reagente de hemólise que têm diferentes causas. A temperaturas baixas, por exemplo o SDS é pouco solúvel. Verificou-se, de forma surpreendente, que esta perturbações podem ser diminuídas por adição de um detergente não iónico, preferindo-se o éter de polioxietileno, como o Brij®35 e 58 ou o Triton® X100, bem como éster de polioxietileno, como o Myrj®52 e 59 ou o Tween®20. Normalmente, o detergente não iónico do reagente de hemólise é 6

adicionado numa quantidade tal que após adição à amostra a concentração na mistura resultante seja de 0,01 a 5% em peso, de preferência de 0,1-0,5 % em peso. O meio de oxidação que ainda é utilizado, o ferricianeto, por exemplo hexacianoferrato (III), pode estar contido no reagente de hemólise. Juntamente com os detergentes catiónicos, pode surgir no entanto precipitação. Além disso, com a utilização de ferricianeto é necessária uma protecção da luz. Verificou-se, surpreendentemente, que a adição de um meio conservante, cujo mecanismo de acção se baseia num ataque aos grupos tiol, como por exemplo o metilisotiazolon ou Bronidox®K, se pode prescindir completamente da adição de ferricianeto. Juntamente com detergentes catiónicos, estes meios de conservação conduzem a um cromófero de hemoglobina corado de castanho-verde, cujo máximo de absorção se situa a 570 nm. A principal vantagem reside no facto de, resultar, em primeiro lugar, por adição deste meio de conservação, tanto a conversão da hemoglobina num cromófero de hemoglobina especifico, como uma boa conservação do reagente de hemólise e, em segundo lugar, o ponto final da hemólise ser bem reconhecido por uma mudança de cor de vermelho para castanho-verde. Os meios de conservação são adicionados ao reagente de hemólise numa concentração de 0,005 -0,2 % em peso, de preferência de 0,01 - 0,02 % em peso. A hemólise, a conversão da hemoglobina no cromóforo de hemoglobina especifico, bem como a preparação da amostra para identificação do derivado de hemoglobina através do reagente de hemólise são terminadas a temperaturas baixas, de preferência de 4 a 37 °C e em particular à temperatura ambiente (20 °C) , após 1 a 10 minutos. Na maioria dos casos, é suficiente uma incubação de 2 minutos, para a preparação completa da amostra. A amostra de sangue preparada deste modo é em seguida diluída com um tampão de reacção numa proporção de 1:10 a 1:100. 7

Como tampão podem-se utilizar todos os tampões usuais, que não prejudiquem a reacção imunológica. De preferência, utiliza-se o tampão MES ou HEPES, numa concentração de 10 a 20 mmol/1. O valor de pH do tampão de reacção é de 5,0 a 8,0. No caso da identificação imunológica contemplar uma reacção enzimática, o tampão de reacção terá de preferência um valor de pH correspondente ao pH óptimo da reacção enzimática. O tampão de reacção pode também já conter os reagentes para a determinação do derivado de hemoglobina, em particular os parceiros de ligação específicos, de preferência anticorpos poli ou monoclonais de especificidade elevada.

Também se verificou aqui, de forma surpreendente, que a adição de outro detergente, de preferência um detergente não iónico como Brij® ou Myrj®, é vantajosa para proporcionar condições óptimas, tanto para a preparação -da amostra para identificação do derivado de hemoglobina, como para a reacção imunológica e para evitar perturbações. O detergente é adicionado ao tampão de reacção numa quantidade tal, que a concentração na mistura resultante é de 0,01 a 5 % em peso, de preferência 0,5% em peso.

No caso de além da determinação do derivado de hemoglobina se pretender determinar o teor de hemoglobina total na mesma amostra, é preferido medir a absorção a comprimentos de onda de 400 a 650 nm, de preferência de 500 a 650 e em especial a 546 ou 570 nm, após a adição do tampão de reacção para pesquisa do teor de hemoglobina total. No caso de um teste húmido, determina-se fotometricamente a extinção a estes comprimentos de onda na cuvete, no caso de um teste seco, a absorção pode ser determinada por fotometria de reflexão, após colocar a mistura resultante num suporte teste.

Um suporte teste deste tipo para a determinação do teor de hemoglobina total pode ser construído de forma muito simples, 8

uma vez que não necessita de conter quaisquer químicos. Uma manta absorvente aplicada sobre um filme de suporte transparente chega para satisfazer as exigências mais simples, para se conseguir um manuseamento melhor e uma quantificação do grau de maturação do teste, podendo ainda existir outras camadas de suporte, por exemplo uma manta de transporte ou uma manta de dosagem. O teor de hemoglobina total e o teor de derivado de hemoglobina podem também ser determinados em porções diferentes da amostra após adição do reagente de hemólise. Neste caso, o teor de hemoglobina total é determinado fotometricamente numa fracção da mistura de amostra e reagente de hemólise, caso necessário após uma diluição correspondente. Na segunda fracção da mistura adiciona-se o tampão de reacção e em seguida determina-se imunologicamente o derivado de hemoglobina.

Para a determinação do derivado de hemoglobina, como a HbAic, são adequados os princípios de todos os métodos imunológicos usuais. Como anteriormente descrito, podem-se preparar anticorpos poli e monoclonais contra derivados de hemoglobina, em especial de HbAic, que se ligam especificamente ao epítopo característico do derivado de hemoglobina (US 4,247,533, EP-A-0 316 306 e EP-A-0 201 187).

Para a variante da identificação imunológica, o tipo de marcação, bem como o método de detecção do sinal de medida fazem parte de métodos conhecidos no estado da técnica. Por exemplo, são adequados métodos directos ou indirectos (competitivos), como os testes sanduíche com marcação enzimática (ELISA), realização de testes IEMA, testes de RIA, de precipitação e aglutinação, bem como imunoensaios homogéneos, como a tecnologia CEDIA®, EMIT ou FPIA. 9 7

Em testes húmidos a determinação imunológica do derivado de hemoglobina é realizada de preferência pelo princípio TINIA, em que não é necessário nenhum passo de separação. A amostra é misturada com um anticorpo específico do analito e um polihapteno como meio de aglutinação. 0 polihapteno consiste de um material suporte, por exemplo, albumina, dextrano ou IgG, ao qual estão ligados vários epítopos aos quais os anticorpos específicos se podem ligar. Como epítopos utilizam-se de preferência as estruturas específicas de derivados de hemoglobina, isto é, péptidos glicosilados. Dado que a precipitação dos anticorpos aplicados apenas pode ocorrer nos polihaptenos, obtém-se com um teor decrescente de analito na amostra uma turvação crescente, que pode ser determinada por nefelometria ou turbidimetria.

De preferência, o anticorpo especifico para o derivado de hemoglobina já está contido no tampão de reacção. Após adição do tampão de reacção, o teor de hemoglobina total pode ser determinado fotometricamente, em primeiro lugar, na mistura resultante. A reacção de precipitação é iniciada por adição de uma solução que contém o polihapteno. Após um curto tempo de incubação, sendo suficientes 5 minutos, a turbidez resultante pode ser medida a comprimentos de onda adequados, de preferência a comprimentos de onda de 340 a 600 nm, em especial a 340 nm, determinando-se assim a concentração de derivado de hemoglobina. Pelo facto de a medição da hemoglobina total ser realizada a comprimentos de onda de 500 a 650 nm, de preferência de 54 6 a 57 0 nm, não há interferência de ambas as medições e podem ser realizadas numa cuvete, na mesma solução reaccional, uma a seguir à outra.

Na preparação da solução de polihapteno, isto é da forma galénica liquida dó polihapteno, isto é de um material de suporte, ao qual estão ligados péptidos glicosilados, verificou-se que estes não são estáveis no tampão fosfato normalmente 10

«'VAjv -*=*7 utilizado a um pH de 7,0 - 7,5. Esta instabilidade das proteínas glicosiladas no tampão fosfato é conhecida, por exemplo, de Ahmed et al., J. Biol. Chem. 261 (1986), 4889 - 4894. Por utilização de um tampão MES numa concentração de 5 a 200 mmol/1, de preferência de 20 - 50 mmol/1 e um valor de pH de 5,0 - 8,0, de preferência entre 6,0 e 6,5 e uma adição simultânea de EDTA ou de um agente complexante equivalente numa concentração preferida de 1 - 50 mmol/1, em especial de 0,1 - 20 mmol/1, obtém-se uma estabilização do péptido glicosilado, proteína e polihapteno. A adição de albumina de soro bovino (BSA) numa concentração preferencialmente de 0,1 - 2%, em especial de 1%, exerce um efeito positivo na estabilidade da solução de polihapteno. Esta solução de polihapteno pode ser armazenada por mais de 12 meses a 4 °C, sem que se observe uma instabilidade significativa do polihapteno, da proteína glicosilada ou péptido. Com uma sobrecarga de 3 semanas a 35 °C, observa-se apenas um decréscimo de sinal de 15 - 20% no sinal de extinção. Verificou-se que este método pode ser utilizado com sucesso para a estabilização de soluções, também de soluções de glicoproteínas ou péptidos glicosilados.

Como teste seco, a determinação imunológica do derivado de hemoglobina é realizada de preferência de acordo com o princípio do teste IEMA. Após adição do tampão de reacção à amostra de sangue hemolisado, adiciona-se o anticorpo específico marcado com enzima. Numa forma de concretização preferida, o tampão de reacção já contém o anticorpo. Após uma curta incubação, a mistura é colocada num suporte teste. Numa matriz de epítopos, isto é uma zona do suporte teste, na qual estão acoplados vários epítopos, aos quais os anticorpos específicos se podem ligar, os anticorpos marcados com enzimas livres são captados. Numa outra zona da zona de identificação, o complexo de derivado de hemoglobina e de anticorpo marcado é determinado através da utilização de um substrato enzimático adequado por fotometria de reflexão. O substrato pode estar contido na zona de 11

identificação ou ser levado ao contacto da zona de identificação com uma outra zona que contém o substrato.

De forma conveniente, os reagentes necessários para os métodos de acordo com a invenção são comercializados na forma de um kit teste, que contém, no mínimo em duas embalagens separadas uma da outra, além do reagente de hemólise, os outros reagentes na forma de solução ou liofilizados, ou colocados num suporte teste. A presente invenção será ilustrada pelos exemplos seguintes:

Exemplo 1

Determinação simultânea da hemoglobina total e de HbAic num teste húmido

As determinações foram realizadas num Hitachi 717 da Boehringer Mannhein GmbH. 0 teor de hemoglobina total foi medido fotometricamente a um comprimento de onda de 546 nm. A identificação imunológica da HbAic foi realizada pelo princípio do teste TINIA, através de uma medição turbidimétrica a 340 nm. Todas as determinações e incubações foram realizadas a uma temperatura de 37 °C.

Utilizaram-se as seguintes soluções:

Reagente de hemólise 20 mM Tampão fosfato de sódio pH 7,0 1,0 % SDS 0,1 % azida de sódio 0,02 % hexacianoferrato de potássio (III) LO o % Bri j®35 12

Tampão de reacção: 20 mM Tampão MES pH 6,0 150 mM cloreto de sódio 3,0 % PEG 6000 0,5 % Bri j®35 0,1 % albumina de soro bovino 0,1 % azida de sódio 10 mM EDTA 6 mg/ml PAK < HbAic > S-IgG (DE) (Ac de ovelha policlonal contra HbAic) ou 100 μ/ml MAK < HbAic > M-IgG (DE) (Ac de rato monoclonal contra HbAi0) Solução de polihapteno: 20 mM Tampão MES pH 6,0 150 mM Cloreto de sódio 6,0 % PEG 6000 0,5 % Bri j®35 0,1 % albumina de soro bovino 25 μς/πιΐ polihapteno ΗόΑι0-β-1-4 (cys, MHS)-BSA 18:1

Adiciona-se à amostra de sangue, o reagente de hemólise numa proporção de 1:1000 e incuba-se a 25 °C, 2 minutos. A 5 μΐ de amostra hemolisada adicionam-se 250 μΐ de tampão de reacção. Após 4 minutos, determina-se a absorção da hemoglobina total a 546 nm (El). Um minuto mais tarde, determina-se a absorção a 340 nm (E2) e em seguida pipetam-se 50 μΐ de solução de polihapteno e incuba-se 5 minutos. Em seguida mede-se a turbidez a 340 nm

Para a determinação do valor de HbAic em g/dl, faz-se um gráfico da diferença de extinção Δε = E3-k.E2 em função da concentração de HbAic. k = factor de correcção de volume = Volumeamostra + Volumetampão de reacçao volume total A concentração da hemoglobina total é calculada a partir de um factor constante K, por multiplicação por EI (K = coeficiente de extinção molar do cromófero de hemoglobina x factor de diluição). Como padrão pode-se utilizar sangue total-EDTA com um teor de hemoglobina e HbAic conhecido. O sangue total-EDTA é diluído a diferentes concentrações com reagente de hemólise, para construção de uma curva padrão.

As curvas padrão são apresentadas na forma de gráfico nas Figs. 1 e 2. Na Fig. 1 está representada a concentração de hemoglobina total em função de El. Esta curva apresenta uma relação linear. No cálculo basta multiplicar por um factor constante K. Na Fig. 2 está representada a diferença de extinção Δε = E3 -k.E2 em função do teor em HbAic.

Noutras experiências, pipeta-se em primeiro lugar a solução de polihapteno na amostra de sangue hemolisada e após uma incubação de cinco minutos inicia-se a reacção de precipitação, por adição do tampão de reacção, que contém o anticorpo específico. Esta pipetagem é realizada comparativamente com a pipetagem acima realizada, em que se adicionou primeiro o anticorpo e em seguida o polihapteno, obtendo-se uma sensibilidade significativamente menor na determinação de HbAic (Fig. 3).

Exemplo 2

Tiras de teste para a determinação de hemoglobina total e HbAic 14

Adicionam-se 30 μΐ de sangue total a 300 μΐ de reagente de hemólise e incuba-se 10 minutos, a 20°C. O reagente de hemólise consiste de uma solução de SDS a 0,18%, tamponada a pH 7.

Para a determinação da hemoglobina total, colocaram-se 32 μΐ de amostra de sangue hemolisado numa tira de teste. A construção da tira teste é apresentada esquematicamente, na fig. 4. Consiste simplesmente numa manta de dosagem não tratada (1) de fibra de vidro, uma manta de transporte de fibra de vidro não tratada (2), uma malha de poliéster (3) e uma folha de policarbonato transparente (4). A tira de teste não contém nenhuns ingredientes químicos. Por meio desta forma de execução da experiência, é possível determinar de um modo muito preciso o teor de hemoglobina total na amostra de sangue, a um comprimento de onda de 576 nm.

Resultam coeficientes de variação inferiores a 2,5 % (tabela 1)

Tabela 1:

Determinação da hemoglobina total

0 CV foi obtido a partir de 10 determinações individuais concentração-Hb CV

[%] 1,0 2,5 1,9 1,8 [g/dl] 14,1 17,5 13.7 14.7

Para a determinação da concentração de HbAic adicionam-se a 32 μΐ de amostra hemolisada 1200 μΐ de tampão de reacção e 15

incuba-se 10 minutos. 0 tampão de reacção consiste de Hepes 100 mM, pH 7,4, NaCl 100 mM e Brij®35 a 0,1% com o conjugado MAk-enzima. 32 μΐ da mistura são colocados na tira de teste que está representada esquematicamente na Fig. 5. O conjugado anticorpo-enzima livre é captado por uma matriz de epitopo (11) . Na zona subsequente, a manta de transporte (12), o complexo HbAi0-anticorpo-enzima é determinado por fotometria de reflexão (tabela 2) , por transformação do substrato após contacto da manta de substrato (13), que contém o substrato, com a manta de transporte (12) .

Tabela 2

Determinação da concentração de HbAic por meio de uma tira de teste O CV foi obtido a partir de 10 determinações individuais

Concentração de HbAic CV [g/dl] [%] 0,8 6,8 1,1 5,4 1,4 6,0

Exemplo 3

Influência de diferentes detergentes iónicos na determinação de

HbAic

As experiências foram realizadas como descrito no exemplo 1. O reagente de hemólise continha as seguintes composições 20 mM Tampão fosfato de sódio pH 7,2 0,1 % azida de sódio 0,02 Q. Ό hexacianoferrato de potássio (III) 0,5 Q. O Bri j®35 16

Os detergentes iónicos descritos na tabela 3 estavam presentes nas concentrações aí indicadas.

No caso do TTAB e CTAB o reagente de hemólise não continha hexacianoferrato de potássio (III), uma vez que este precipita com estes reagentes. ;

Os ingredientes do tampão de reacção e da solução de polihapteno são de acordo com o exemplo 1

Como amostra de sangue utilizou-se um padrão com um teor de HbAic de 3,2 g/dl. Todos os detergentes iónicos testados originaram uma lise das células e uma libertação do epítopo. 0 detergente aniónico SDS, bem como os detergentes catiónicos TTAB e CTAB provaram ser os mais adequados. i Tabela 3:

Determinação de HbAjC

Influência de vários detergentes iónicos no reagente de hemólise. A absorção foi medida a 340 nm

Detergente concentração EI E2 ΔΕ = EI - E2 no reagente [0 g/dl HbAic] [3,2 g/dl HbAic) de hemólise 17

SDS 0,5% 337 mE 73 mE 264 mE SDS 1,0% 338 mE 80 mE 258 mE Zwittergent® 3-14 0,5% 341 mE 172 mE 169 mE Zwittergent® 3-14 1,0% 343 mE 139 mE 204 mE TTAB 1,0% 377 mE 14 9 mE 228 mE CTAB 1,0% 374 mE 137 mE 237 mE Controlo sem detergente iónico 340 mE 275 mE 65 mE

Exemplo 4

Dependência do intervalo de medição dinâmico de HbAic da concentração de Brij®35 A experiência foi realizada como no exemplo 3. Adicionou-se ao reagente de hemólise 1% de SDS, de forma constante. A concentração de Brij®35 no tampão de reacção variou dentro do intervalo apresentado na tabela 4. Como amostra pode-se utilizar o padrão de HbAic descrito no exemplo 3. 0 intervalo de medição estende-se de 47 mE para o controlo, logo até 233 mE com a adição de 0,1% de Brij®35. A concentração preferida de Brij®35 situa-se entre 0,1 e 1,0%. 18

Tabela 4:

Influência de várias concentrações de Brij® no tampão de reacção, para a concentração de HbAic A absorção foi medida a 340 nm

concentração de Brij®35 no tampão de reacção EI [0 g/dl HbAic] E2 [3,2 g/dl HbAic] ΔΕ = EI - E2 — 240 mE 193 mE 47 mE 0,1% 266 mE 33 mE 233 mE 0,25% 274 mE 40 mE 234 mE 0,5% 302 mE 57 mE 245 mE 1, 0% 351 mE 99 mE 252 mE 2,0% 385 mE 242 mE 143 mE

Exemplo 5

Influência de vários detergentes no tampão de reacção, na determinação de HbAic A experiência foi realizada de modo análogo ao exemplo 4. Utilizaram-se no tampão de reacção os detergentes descritos na tabela 5. Por adição de Brij®35, 56 e 57, bem como de Myrj®52 e 59, o intervalo de medição dinâmico foi ainda mais alargado. No entanto, também outros detergentes não iónicos, como o Triton®, bem como detergentes zwiteriónicos, como o Zwittergent®3-14, mostram um efeito positivo significativo, em comparação com o controlo. 19

Tabela 5

Influência de detergentes no tampão de reacção

Detergente concentração no tampão de reacção EI [0 g/dl HbAic] E2 [3,2 g/dl HbAic] ΔΕ = EI - E2 Controlo — 240 mE 193 mE 47 mE Brij®35 0, 5% 302 mE 57 mE 245 mE Brij®56 0,5% 302 mE 57 mE 245 mE Bri j®58 0, 5% 303 mE 51 mE 252 mE Triton®xll4 0,2% 523 mE 275 mE 248 mE Triton®xl00 0, 5% 298 mE 202 mE 96 mE Tween®80 0,251 277 mE 143 mE 134 mE Tween®60 0,25% 266 mE 75 mE 191 mE Tween®40 0,25% 276 mE 86 mE 189 mE Tween®20 0,1% 266 mE 131 mE 135 mE Zwittergent® 3-14 0,1% 308 mE 155 mE 153 mE Myrj®52 0,5% 308 mE 40 mE 268 mE Myr j®59 0,5% 317 mE 31 mE 286 mE

Exemplo 6

Determinação simultânea da hemoglobina total e de HbAic com o cromófero de hemoglobina castanho-verde especifico A experiência foi realizada num Hitachi 717 da Boehringer Mannheim GmbH. 0 teor em hemoglobina total foi medido

fotometricamente a um comprimento de onda de 570 nm. A identificação imunológica de HbAic foi realizada de acordo com o principio do teste TINIA, por medição turbidimétrica a 340 nm. Todas as determinações e incubações foram realizadas a uma temperatura de 37°C.

Utilizaram-se as seguintes soluções: 20

Reagente de hemólise 20 mM Tampão fosfato de sódio pH 7,4 1,0 % Brometo de tetradeciltrimetilamónio (TTAB) 0,01 % Metilisotiazolon 0,02 % Bronidox® K 0,5 % Bri j ®35 10 mM EDTA Tampão de reacção 20 mM Tampão MES pH 6,0 150 mM Cloreto de sódio 3,0 % PEG 6000 0,5 % Bri j®35 0,01 % Metilisotiazolon 0,02 % Bronidox® K 1,2 mg/ml PAK < HbAic > S-IgG (DE) (Ac de ovelha policlonal contra HbAic) Solução de polihapteno 20 mM Tampão MES pH 6,0 150 mM Cloreto de sódio 6,0 % PEG 6000 0,5 % Brij® 35 20 μg/ml polihapteno 0 reagente de hemólise foi adicionado às amostras de sangue numa proporção de 1:100 e incubado a 25 °C, 2 minutos. A 10 μΐ de amostra hemolisada adicionaram-se 250 μΐ de tampão de reacção. Após 4 minutos mediu-se a absorção da hemoglobina total a 570 nm (El). Um minuto mais tarde mediu-se a absorção a 340 nm 21 (Ε2) e em seguida pipetaram-se 50 μΐ de solução de polihapteno e incubou-se 5 minutos. Em seguida, mediu-se a turbidez a 340 nm (E3) .

Para a determinação do valor de HbAic em g/dl, faz-se um gráfico da diferença de extinção ΔΕ = E3-k.E2 em função da concentração de HbAic. k = factor de correcção de volume = Volumeamostra + Volumetampâo de reacção volume total A concentração da hemoglobina total é calculada a partir de um factor constante K, por multiplicação por EI (K = coeficiente de extinção molar do cromófero de hemoglobina x factor de diluição). O espectro de absorção caracteristico é apresentado na Fig. 6. Como padrão pode-se utilizar sangue total-EDTA com um teor de hemoglobina e HbAic conhecido. 0 sangue total-EDTA é diluído a diferentes concentrações com reagente de hemólise, para construção de uma curva padrão.

As curvas padrão são apresentadas na forma de gráfico nas Figs. 7 e 8. Na Fig. 7 está representada a concentração de hemoglobina total em função de El. Esta curva apresenta uma relação linear. No cálculo basta multiplicar por um factor constante K. Na Fig. 8 está representada a diferença de extinção Δε = E3 -k.E2 em função do teor em HbAic.

Lisboa, 31 de Julho de 2000 AQ^NTE OFICIAL DA PROPRIEDADE INDUSTRIAL

Claims

~~7 Γ\

REIVINDICAÇÕES 1. Método para a determinação do teor em hemoglobina glicosilada numa amostra de sangue, caracterizado por, a) a amostra de sangue ser tratada com um reagente de hemólise com um pH de 5 a 9,5, que contém um detergente iónico, a temperaturas de 4 a 37°C, até 10 minutos, e b) a hemoglobina glicosilada ser determinada imunologicamente na amostra de sangue hemolisado
2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o reagente de hemólise conter adicionalmente um detergente não iónico.
3. Método de acordo com uma das reivindicações 1-2, caracterizado por se adicionar tampão de reacção à amostra hemolisada, o qual contém um detergente não iónico ou zwiteriónico, e por a hemoglobina glicosilada ser determinada imunologicamente na mistura resultante.
4. Método de acordo com uma das reivindicações 1-3, caracterizado por a hemoglobina glicosilada ser HbAic.
5. Método para a determinação do teor de uma hemoglobina glicosilada e de hemoglobina total numa amostra de sangue idêntica, caracterizado por a) a amostra de sangue ser tratada com um reagente de hemólise que contém um detergente iónico com um pH de 5,0 a 9,5. 1

b) o teor de hemoglobina total ser determinado na amostra hemolisada e c) a hemoglobina glicosilada ser determinada imunologicamente na mesma amostra hemolisada.
6. Método de acordo com a reivindicação 5, caracterizado por o teor em hemoglobina total ser determinado por medição da absorção caracteristica do cromófero de hemoglobina especifico.
7. Método de acordo com uma das reivindicações 5 e 6, caracterizado por o reagente de hemólise conter como ingrediente um detergente não iónico.
8. Método de acordo com um das reivindicações 5-7, caracterizado por se adicionar à amostra de hemólise um tampão de reacção que contém um detergente não iónico ou zwiteriónico e por se determinar a hemoglobina glicosilada e a hemoglobina total na mistura resultante.
9. Kit teste para a identificação imunológica de hemoglobina glicosilada, que consiste de pelo menos duas embalagens % separadas, das quais uma contém um reagente de hemólise que contém um detergente iónico e cujo valor de pH é ajustado para 5,0 a 9,5 com um tampão adequado, e a outra contém uma outra mistura de reagentes, que contém os reagentes necessários para a identificação imunológica da hemoglobina glicosilada, bem como um detergente não iónico ou zwiteriónico.
10. Kit teste de acordo com a reivindicação 9, caracterizado por os reagentes necessários para a identificação 2 imunológica serem colocados total ou parcialmente, num suporte teste.

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