PT638089E - Sintese de coleccoes uteis e diversas de oligonucleotidos - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO

"RÍNTTr.íÇií nR C^LEC^ÕES TTTEIS E DI^^EP-SAS DE OLIGONUCLEÓTIDOS" CAMPO DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se à síntese de oligonucleótidos, e especificamente a um novo método para criar misturas de oligonucleótidos numa única síntese automatizada. A técnica permite a criação de misturas diversas de ADN que pode ser utilizado para preparar grandes colecções de oligo- ou polipéptidos e/ou proteínas.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

Os métodos de preparação de ADN de composição mista estão a tornar-se progressivamente importantes no estudo da função biomolecular, bem como na pesquisa de substâncias com propriedades novas e úteis. À medida que a tecnologia da síntese de ADN melhorou no início dos anos 80, tornou-se possível realizar sínteses múltiplas como um meio de criar misturas de oligonucleótidos. Em princípio, podiam ser realizadas colecções grandes e diversas em sínteses múltiplas. Na prática, vários investigadores verificaram que grandes números de oligonucleótidos podem ser criados numa única síntese através do acoplamento de misturas de mononucleótidos, em vez de blocos monoméricos únicos de construção. A complexidade da colecção resultante ou "biblioteca" de oligonucleótidos é determinada pelo número de monómeros acoplados, e pelo número de sítios nos quais as misturas de monómeros são introduzidas.

Os oligonucleótidos de composição mista estão a ser progressivamente utilizados em mutagénese de proteínas para o estudo da estrutura e função. Através da expressão de sequências de ADN de composição mista é criada uma biblioteca de proteínas mutantes correspondentes. Tais bibliotecas, aliadas a técnicas de pesquisa apropriadas, podem ser pesquisadas em relação a substâncias com propriedades alteradas, e são por isso úteis no 1 t >

estudo da função biomolecular. A classe mais geral de métodos de mutagénese emprega oligonucleótidos baseados na sequência do

Cf O n CS Oísl TTOCfAfYl 1 f ΐ Λ3ΛΛΛΟ Cfl 1 d ClTTCin f 1 1 d 1 m Q V» Ή originarão quaisquer alterações de aminoácidos desejadas. Estes métodos foram recentemente revistos no número de Agosto de 1991 de Current Opinion in Structural Biology.

Virtualmente todos os estudos genéticos de estrutura e actividade de proteínas empregam mutações de substituição: são substituídas uma ou várias cadeias laterais de aminoácidos, mas o comprimento da proteína e o espaçamento dos resíduos são conservados. De modo a facilitar a criação de um número grande de mutações de substituição numa experiência única foi desenvolvido anteriormente um número de técnicas (para revisão, ver Botstein, D. & Shortle, D. (1985) Science 229, 1193-1201 e

Zoller, M. J. (1991) Curr. Opin. Struct. Biol. 1, 605-610), a mais popular das quais envolve a síntese química de misturas complexas de oligonucleótidos que são utilizados quer como iniciadores mutagénicos para a síntese de ADN (ver Hermes, J. D., Parekh, S. M., Blacklow, S. C., Koster, H., & Knowles, J. R. (1989) Gene 84, 143-151) ou como fragmentos de cadeia dupla mutagénicos para ligação a fragmentos de restrição (ver

Matteucci, M. D. & Heynecker, H. L. (1983) Nucl. Acids Res. 11, 3113-3121) . Para criar as substituições de aminoácidos requeridas, cada monómero utilizado para a síntese de oligonucleótidos é "adulterado" com pequenas quantidades dos três tipos de mononucleótidos não selvagens. Em princípio este método pode proporcionar todas as substituições de nucleótidos possíveis num segmento de gene numa única experiência. Uma vez que a distribuição das substituições de nucleótidos segue a estatística de Poisson, duas substituições de mononucleótidos no mesmo codão será relativamente raro a níveis de adulteração que produzem uma ou apenas algumas substituições de aminoácidos por gene mutante. Consequentemente, para objectivos práticos, pode esperar-se que esta estratégia para criar misturas de 2 t

*“7 oligonucleótidos mutagénicos produza apenas um terço de todas as substituições de aminoácidos possíveis, sendo os tipos de Substituições de aillilluácxdiJS inuuiiuaa nuíúã pGSÃÇãC particular determinadas através da sequência do codão selvagem. Deve também ser notado que a técnica anterior de adulteração de oligonucleótidos não pode ser utilizada para induzir outros tipos de alterações na sequência de ADN, tais como inserções ou delecções.

Uma aplicação relacionada de síntese mista de ADN utiliza vastas colecções de oligonucleótidos diversos em processos dirigidos à descoberta de substâncias com propriedades novas e úteis. Foram pesquisadas bibliotecas de péptidos (Cwirla, S. E., Peters, E. A., Barrett, R. W., & Dower, W. J. (1990) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 87, 6378-6382), de ARN (Tsai, D., Kenan, D., & Keene, J. (1992) Proc. Natl. Acad. Sei.,. USA 89, 8864-8868) e de ADN (Bock, L., Griffin, L., Latham, J., Vermaas, E., & Toole, J. (1992) Nature 355, 564-566), tendo sido todas criadas a partir de colecções de oligonucleótidos preparados por síntese mista de monómeros, para localizar moléculas que se ligam a substâncias alvo particulares. Nesta abordagem, a utilidade de bibliotecas de péptidos está dependente de forma crítica do modo como a mistura de oligonucleótidos é criada. Isto acontece devido à degeneração do código genético: os aminoácidos não são representados por iguais números de codões trinucleotídicos, sendo alguns aminoácidos codificados apenas por um codão, alguns por tantos quantos seis. Por isso, embora oligonucleótidos preparados a partir de misturas iguais de todos os quatro monómeros possam conter cada um dos 64 trinucleótidos, os aminoácidos codificados estão representados de forma desigual e os codões "stop" são inevitavelmente criados. Como resultado, os aminoácidos que são codificados pelo maior número de codões estão sobre-representados à custa dos codificados por apenas um ou dois codões. Como exemplo, se é desejado um tipo de mutação particular (por exemplo a substituição apenas de aminoácidos 3

hidrofóbicos), a biblioteca resultante conterá uma proporção elevada de espécies indesejáveis. Esta desvantagem é parricuiarmente critica d uisuiua ljuc aumenta o ãUmSrc dcc posições nas quais as substituições são feitas.

Numa tentativa de melhorar a eficiência de sequências de ADN sintetizado em mistura para preparação de bibliotecas de péptidos e de proteínas, foram introduzidos esquemas nos quais são misturados monómeros de um modo racional. Por exemplo, Youvan calculou as misturas óptimas de monómeros para especificar sub-conjuntos particulares de aminoácidos (Arkin, A. P., & Youvan, D. C. (1992) Bio/Technology, 10, 297-300). A utilização destas misturas aumenta a proporção de aminoácidos desejados numa biblioteca de péptidos ou proteínas. Todavia, não exclui a criação de substituições indesejáveis que surgem de combinações particulares de monómeros. Mesmo com este método, as substituições desejadas são geralmente uma fracção das introduzidas em cada sítio. Consequentemente, à medida que o número de sítios alterados aumenta, a proporção de mutantes desejados na biblioteca diminui.

Reconhecendo os problemas associados à utilização de misturas de monómeros, Huse descreveu um método (revelado em WO 92/03461) no qual a síntese de ADN é realizada de modo a emular sínteses múltiplas. Isto é alcançado realizando a síntese em suportes sólidos múltiplos que podem ser misturados e re-divididos quando necessário. Deste modo, podem ser realizadas misturas diversas de oligonucleótidos utilizando monómeros, e os problemas associados com a degenerescência do código genético podem ser evitados. 0 método possui duas desvantagens: (i) para cada síntese é necessário trabalho intenso para a divisão e re-mistura do material de suporte, e (ii) o número total de sequências diferentes que pode ser sintetizado é limitado pelo número de suportes fisicamente separáveis utilizados na síntese,

Q que é tipicamente da ordem de 10 .

Wells, J. A., Vasser, M., & Powers, P. B. (1985) Gene 34, 4 315-323 descreveram um método de misturas de trinucleótidos de fosfotriéster para a criação de oligonucleótidos em mistura e ^"ί oor ^rn-^n o t Av>^qo ^2 . f Cdllc f PC· j\./

Samson, C. J., Shao, K.-L., Summers, M. F. , & Byrd, R. A. (1985) Nucl. Acids Res. 13, 8181-8196, descobriram o comportamento de acoplamento de monómeros de fosforamidite desenvolvidos recentemente e constataram que podem ser esperados acoplamentos selectivos.

Em resumo, os métodos existentes de síntese de sequências múltiplas de ADN sofrem de várias desvantagens: 1. Embora possa ser criada qualquer substituição nucleotídica possível utilizando oligonucleótidos adulterados com monómeros mistos, são extremamente raras duas ou três substituições mononucleotídicas contíguas. Isto é uma desvantagem em relação a mutagénese de proteínas uma vez que cada aminoácido numa proteína é especificado por três nucleótidos contíguos, e esta estratégia pode criar eficientemente apenas aproximadamente um terço de todas as substituições de aminoácidos possíveis para cada aminoácido selvagem numa única síntese. 2. Nenhuma estratégia que envolva a síntese de misturas de oligonucleótidos, como transmitido na técnica anterior, permite a criação de proteínas mutantes com inserções de um ou mais codões em mais do que apenas um sítio único no oligonucleótido sintetizado. 3. A degenerescência do código genético significa que qualquer mistura de mononucleótidos utilizada em síntese mista de ADN produz inevitavelmente oligonucleótidos contendo codões indesejáveis ou não proporciona todos os codões desejados. Este problema torna-se crítico à medida que aumenta o número de posições nas quais as misturas são introduzidas. 4. Métodos que estimulam sínteses múltiplas implicam trabalho intensivo, e a diversidade de sequências que pode ser criada está limitada pelo número de suportes separados 5

fisicamente utilizados. A presente invenção proporciona soluções para estes problemas e permite a preparação cie uiiyuniujxcúCiCios em misture com uma variedade de aplicações na Biologia Molecular moderna. Por exemplo, os oligonucleótidos mistos preparados de acordo com a presente invenção podem ser utilizados para criar genes que codificam bibliotecas de péptidos e/ou de proteínas. Adicionalmente, os trinucleótidos são úteis na preparação de iniciadores degenerados para a reacção de polimerase em cadeia. A invenção é particularmente útil para mutagénese de proteínas; os iniciadores de mutagénese de cadeia simples e as "cassettes" de cadeia dupla que codificam para qualquer combinação de aminoácidos podem ser prontamente preparados aplicando o método aqui revelado. A presente invenção também permite a mutagénese de substituição e de inserção. 0 método baseia-se na utilização de trinucleótidos pré-sintetizados que são compatíveis com os métodos mais eficientes de síntese de ADN. Os blocos de construção trinucleotídicos foram previamente utilizados na síntese de ADN (ver, por exemplo, Hirose, T., Crea, R. & Itakura, K. (1978) Tet. Lett., 2449-2452; Miyoshi, K., Miyake, T., Hozumi, T., & Itakura, K. (1980) Nucl. Acids Res., 8, 5473-5489) em que os rendimentos do acoplamento passo a passo foram baixos e era mais desejável incorporar o maior número de blocos oligonucleotídicos possível a cada passo. Este trabalho prévio difere da presente invenção, na medida em que (i) baseia-se na química de fosfodiéster ineficiente e desactualizada e por isso não deve permitir os acoplamentos múltiplos, (ii) não foi dirigido para criar colecções diversas e úteis de oligonucleótidos mistos, e (iii) não permitiu a mutagénese de inserção.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO A presente invenção supera as limitações da técnica anterior e proporciona uma técnica nova para criar misturas de oligonucleótidos numa única síntese automatizada. O método é 6

útil na mutagénese sistemática de proteínas ou de outros elementos genéticos importantes. As colecções diversas de oligonucleótidos que podem ser nriarias aplicando a prcccntc invenção são particularmente úteis na preparação de bibliotecas de péptidos que podem ser pesquisadas em relação a moléculas que se ligam a uma substância alvo particular. A presente invenção também pode ser utilizada em mutagénese de proteínas para codificar todas as substituições de aminoácidos possíveis, todas as inserções de aminoácidos únicos possíveis, ou qualquer mistura desejada de substituições e inserções.

Na sua forma mais geral a presente invenção permite a síntese de moléculas de ADN utilizando blocos de construção trinucleotídicos, que correspondem a codões de aminoácidos.

Os trinucleótidos são preparados de modo a serem compatíveis com métodos convencionais de síntese automatizada de ADN. De um modo mais conveniente, a posição 5' livre é protegida com um grupo de protecção ácido lábil (tipicamente 4,4'-dimetoxitritilo, DMT), os fosfatos são protegidos como ésteres de metilo ou cianoetilo, as bases são protegidas como benzoílo (A e C) ou amidas de isobutirilo (G) , e a posição 3' livre é activada para acoplamento quer como N,N-diisopropilaminofosforamidite de O-metilo ou O-cianoetilo. Como descrito abaixo, nalguns casos é desejável que a posição 5' seja protegida diferentemente. Isto é prontamente alcançado durante a síntese de trinucleótidos. 0 método não exclui a utilização de trinucleótidos protegidos e activados de formas alternativas. A presente invenção pode ser utilizada quer para acoplamento de trinucleótidos estequiométrica como sub-estequiométrica. Em qualquer dos casos, o sintetizador automatizado prossegue passo a passo para sintetizar um oligonucleótido através do acoplamento de uma sequência de monómeros especificando a sequência de ADN selvagem. No sítio desejado, o programa de síntese é suspenso, e é realizada uma sequência alterada de passos, como descrito abaixo. 7 1. Acoplamento Estequiométrico

Numa primeira realização, um ou mais trinucleótidos são utilizados em vez de monómeros ςί nfoco C1112_m2_Cci. CÍS ADN. OS trinucleótidos acoplam de uma forma essencialmente quantitativa, e podem por isso ser utilizados para síntese automatizada de ADN do mesmo modo que blocos de construção monoméricos. Numa única síntese, o acoplamento estequiométrico de misturas de trinucleótidos proporciona ADN de qualquer complexidade desejada com controlo completo sobre a sua composição. Os codões de interrupção podem ser evitados, e qualquer combinação de aminoácidos pode ser codificada a cada posição. A substituição de um codão selvagem por qualquer combinação de trinucleótidos é prontamente realizada direccionando o sintetizador de ADN para aceder a uma mistura apropriada no passo desejado da síntese. O método é por isso ideal para a criação de bibliotecas de péptidos de composição definida. É também adequado para preparar oligopéptidos ou proteínas mutantes nos quais é introduzida uma classe particular de aminoácidos (p. ex. hidrofóbicos) em um ou mais sítios. 2. Acoplamento Sub-estequiométrico

Reduzindo o nível de trinucleótido utilizado durante a síntese de ADN, o acoplamento sub-estequiométrico de trinucleótidos adequadamente protegidos e activados pode ser utilizado de modo a atingir mutagénese de substituição, inserção ou delecção. Neste formato, a presente revelação é adequada para criar proteínas mutantes contendo substituições de aminoácidos únicos para o estudo de relações estrutura-função. São adicionados um ou mais trinucleótidos numa quantidade que é sub-estequiométrica em relação ao número de terminais 5' no suporte sólido. Se se pretende inserir um codão, a extremidade 5' do trinucleótido adicionado é protegida do mesmo modo que os monómeros utilizados na síntese. Se se deseja uma substituição ou delecção, a extremidade 5' do trinucleótido contém um grupo de protecção estável escolhido especialmente, de aqui em diante 8

I

referido como X. Neste contexto, um grupo X de protecção estável é qualquer funcionalidade capaz de se opor às condições de -i.- J ._- I - . . _.1_ _* .1 _ _1 _ T\ ΛΠ — ___ _ Λ .. — siiiLCDC auLUiiidLi^aua uc nuiv t ma o v^uc <3 o <3 j_ jcxçuc j. vuuioul.v- clivada quando necessário. 0 trinucleótido pode ser adicionado em diferentes pontos na sequência do gene selvagem. 0 produto final é uma mistura complexa de oligonucleótidos baseada na sequência selvagem mas aleatoriamente adulterada com misturas de trinucleótidos únicos ou degenerados. As mutagéneses de inserção, substituição ou delecção são alcançadas durante o acoplamento sub-estequiométrico como se segue: (i) Inserção (ver Figura 1)

Numa segunda realização para criar mutações de inserção, o trinucleótido é escolhido de modo a possuir um dos grupos normalmente utilizados na posição 5', tal como DMT. A pequena fracção de cadeias em crescimento que sofre adição do trinucleótido em condições de acoplamento sub-estequiométricas são imediatamente desbloqueadas e então elongadas em todos os passos subsequentes. O resultado final é a adição de três nucleótidos correspondentes a um codão que foi inserido numa sequência que de outro modo seria selvagem. A sintese prossegue. A cada sitio onde deve ser inserido um aminoácido, é realizado outro acoplamento sub-estequiométrico ou com um trinucleótido único (para criar um tipo de aminoácido inserido) ou com uma mistura de fosforoamidites de trinucleótido (em que devem ser inseridos num único sitio até 19 resíduos diferentes). (ii) Substituição (ver Figura 2)

Numa terceira realização para criar mutações de substituição durante o acoplamento sub-estequiométrico, é escolhido o trinucleótido para possuir um grupo X estável de protecção 5' (como definido acima), e é aplicado um esquema de desprotecção diferencial. Após a incorporação do trinucleótido, durante as seguintes três adições de monómeros o grupo de protecção 5' no trinucleótido não é removido pelo tratamento com ácido que cliva o grupo 5'-DMT dos monómeros acoplados. 9 \

Consequentemente, a pequena fracção de cadeias em crescimento que sofrem uma adição do trinucleótido não são elongadas. Após a '-a -i- ^ \_y ^ ^ c. -i- ntw i i omo -i- ' ι_» L>ou v u-iiO± viiuxut^n uu W. U» 'w' uu outras cadeias, que correspondem em sequência ao codão selvagem, é realizado um passo adicional para remover o grupo de protecção X no final do trinucleótido. A síntese prossegue. Em cada codão em que se querem criar substituições de aminoácidos é realizado outro acoplamento ou com um trinucleótido único (para criar um tipo de aminoácido substituído) ou com uma mistura de fosforamidites de trinucleótido (em que devem ser inseridos num único sítio até 19 resíduos diferentes). (iii) Delecção (ver Figura 3)

Como aqui também descrito, as delecções podem ser realizadas utilizando um mononucleótido com um grupo X estável de protecção 5'. 0 grupo X estável de protecção 5' (como definido acima) delineia uma fronteira da delecção e impede o acoplamento subsequente a uma percentagem pequena de cadeias que o adquiram. 0 acoplamento estequiométrico de monómeros normais ocorre apenas às cadeias que são desprotegidas durante o curso da síntese. A remoção do grupo estável de protecção permite o acoplamento subsequente a todas as cadeias e define a segunda fronteira da delecção. Este processo pode ser repetido muitas vezes durante um processo de síntese de oligonucleótidos, produzindo populações de oligonucleótidos com muitas delecções diferentes. (iv) Substituição e Inserção

Numa quarta realização, tanto as substituições como as inserções podem ser realizadas durante uma síntese única. Neste caso, tanto os trinucleótidos 5'-X como 5'-DMT são utilizados durante a síntese de um único oligonucleótido. Após a incorporação dos trinucleótidos protegidos diferentemente, o trinucleótido 5'-DMT é desprotegido e por isso sofre extensão subsequente, enquanto que o trinucleótido 5'-X permanece protegido e não é elongado. A clivagem do grupo 5'-X das cadeias 10

que o adquiriram permite a sua extensão subsequente. Deste modo, tanto as substituições como as inserções podem ser criadas numa síntese única.

As sequências misturadas criadas utilizando trinucleótidos para síntese de ADN podem ser utilizadas em reacções convencionais de mutagénese de oligonucleótidos para produzir uma mistura muito complexa de genes mutantes. A selecção genética, a pesquisa genética e a sequenciação nucleotídica dos genes mutantes identificarão mutações individuais, e sistemas de expressão apropriados permitirão a produção dos correspondentes oligo- ou polipéptidos ou proteínas mutantes.

Os trinucleótidos (em oposição aos oligonucleótidos que não são múltiplos de 3 em comprimento) oferecem a vantagem de estarem apenas acoplados no oligonucleótidos a posições que correspondem a fronteiras de codões. Por isso, todas as alterações de sequências estarão na grelha de leitura correcta. Outra vantagem é que tanto a substituição como a inserção de trinucleótidos pode ser utilizada na mesma síntese, permitindo a criação de misturas extremamente complexas de oligonucleótidos capazes de codificar muitos milhões de formas mutantes da proteína que sofre a mutagénese. Embora o acoplamento de trinucleótidos na sequência selvagem seja útil na mutagénese de proteínas, o presente método também pode ser utilizado para acoplar oligonucleótidos de vários comprimentos. Isto é uma vantagem em relação a técnicas anteriores, nas quais apenas eram possíveis substituições de monómeros.

Na sua forma mais geral, a invenção envolve acoplar trinucleótidos activados, modificados para produzir a degeneração da sequência. Os trinucleótidos adicionados são de particular interesse na mutagénese de proteínas. Para a criação de mutações de inserção pode ser utilizado um grupo de protecção 5'-DMT convencional. Para a criação de mutações de substituição é utilizado um grupo de protecção 5' estável, com um esquema de desprotecção diferencial ou ortogonal. 11

Um primeiro objectivo desta invenção é criar uma mistura de oligonucleótidos numa síntese única automatizada. ΓΤττη QôminHn nKn ort1 ^πττοπγ·5α á q >- » c» v~ >ιτ«λ 0^1 w»-»-í c· substituições de aminoácidos numa sequência selvagem.

Um terceiro objectivo desta invenção é criar uma ou mais inserções de aminoácidos numa sequência selvagem.

Um quarto objectivo desta invenção é criar uma mistura de substituições e de inserções de aminoácidos numa sequência selvagem.

Um quinto objectivo desta invenção é produzir variações de sequência de aminoácidos enormes numa sequência selvagem, tais como a aleatorização in vitro das regiões variáveis de genes de imunoglobulina clonados, para produzir anticorpos catalíticos mais eficientes.

Um sexto objectivo desta invenção é adicionar trinucleótidos em sítios seleccionados numa sequência de um gene como substituições e/ou inserções.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS A Figura 1 é um desenho esquemático dos passos utilizados para sintetizar uma mistura de oligonucleótidos contendo inserções de codões únicos durante o acoplamento sub-estequiométrico. 0 trinucleótido é apresentado por três círculos a cheio rodeados por um rectângulo. Os blocos de construção monoméricos utilizados antes do acoplamento do trinucleótido são círculos a cheio. Os adicionados após o trinucleótido são indicados por círculos com um traço diagonal. A Figura 2 é um desenho esquemático dos passos utilizados para sintetizar uma mistura de oligonucleótidos contendo substituições de um único codão durante o acoplamento sub-estequiométrico. Os blocos de construção trinucleotídicos e monoméricos são como definidos para a Figura 1. X é um grupo de protecção particularmente estável como definido no texto. A Figura 3 é um desenho esquemático dos passos utilizados para sintetizar uma mistura de oligonucleótidos contendo 12

delecções de um único codão durante o acoplamento sub-estequiométrico. 0 círculo a cinzento rodeado por um quadrado é Λ V"\ 1 ΑΛΆ /-} <—\ sy\ *w /-N v-» Λ ^ λλ -----— 'T - * - “ — ~ w —v vtw mviiViuv^ x w V_/l ll l\ f Cllt V^UC A Ç U1U grupo de protecção particularmente estável como definido no texto. Os círculos a cheio são blocos de construção monoméricos convencionais acoplados antes da adição do monómero X, os círculos com uma linha diagonal são os três blocos de construção monoméricos acoplados após a adição do monómero X que definem um codão. Os círculos a cinzento são blocos de construção monoméricos acoplados após a desprotecção do monómero X. A Figura 4 é um histograma apresentando a distribuição e as frequências das mutações das inserções dos codões de alanina e de glicina recuperadas no gene para nuclease estafilocócica. Foram realizadas duas experiências, direccionando as inserções para partes diferentes do gene (4A e 4B) . 0 eixo horizontal define as fronteiras do codão, o eixo vertical os números dos mutantes. Os mutantes de alanina são sombreados e os mutantes de glicina são a porção aberta das barras.

DESCRIÇÃO DETALHADA DAS REALIZAÇÕES PREFERIDAS A presente invenção proporciona um método eficiente para sintetizar oligonucleótidos de sequências mistas, e também para criar inserções e substituições em genes de sequência selvagem. A invenção permite a utilização de sintetizadores de fase-sólida convencionais para produzir uma mistura de oligonucleótidos numa única síntese automatizada. A invenção permite a inserção e/ou substituição de trinucleótidos, ao longo de um segmento definido de um gene clonado. Quando é utilizado um trinucleótido (ou um oligonucleótido pequeno possuindo um comprimento de nucleótidos com um múltiplo de 3), as inserções ou substituições de codão em fase são alcançadas na grelha de leitura correcta. automatizado A primeira realização da presente invenção é o acoplamento estequiométrico de um ou mais trinucleótidos durante a síntese de ADN automatizada. Tipicamente, a síntese é realizada utilizando um sintetizador automatizado disponível 13

comercialmente. É utilizado um programa de síntese normal até que seja necessário acoplar o trinucleótido. Neste ponto, o proqrama é suspendido e o si zador é instruído pera acoder a um frasco ligado a uma saída adicional contendo uma solução preparada do trinucleótido. O trinucleótido contém grupos de protecção e uma posição 3' activada que são compatíveis com a síntese química convencional de ADN. Por exemplo, a posição 5' do trinucleótido pode ser protegida como um éter de DMT, e a posição 3' pode ser activada como uma fosforamidite. Posteriormente a síntese pode prosseguir da forma usual. Na finalização da síntese, o oligonucleótido é libertado da coluna e as bases e ésteres de fosfato são desprotegidos. Se as bases são protegidas com o benzoíl e isobutiroílamidas convencionais, e os fosfatos como ésteres de β-cianoetilo, pode ser utilizado o tratamento com amónia quente concentrada para promover a desprotecção completa. Se os fosfatos são protegidos como ésteres de metilo, deve ser incluído um passo adicional antes do tratamento com amónia quente, no qual a desprotecção do fosfato é realizada através de, por exemplo, tiofenol, utilizando condições bem estabelecidas. Numa realização preferida, podem ser preparados oligonucleótidos mistos utilizando misturas de trinucleótidos em vez de um único trinucleótido durante o protocolo de síntese. A síntese de oligonucleótidos de composição mista é alcançada exactamente como acima descrito, excepto que a solução contendo dois ou mais trinucleótidos é acedida quando desejado. A segunda realização da presente invenção, apresentada na Figura 1, é utilizada para inserir trinucleótidos numa sequência selvagem durante acoplamento sub-estequiométrico. Esta realização é valiosa na produção de inserções de codão em fase que podem ser utilizadas para originar proteínas com estruturas modificadas e actividades funcionais. Como apresentado na Figura 1, a síntese de oligonucleótidos é iniciada a partir de um nucleótido ligado a um suporte de fase sólida e continua da 14 ~7 esquerda para a direita através do acoplamento de mononucleótidos. Quando a síntese alcança uma posição na seauência spivsrj^m pm que se quer realizar uma inserção (i.c. numa fronteira de codão), um trinucleótido correspondendo a um codão específico é acoplado a uma percentagem pequena (~1 %) de todas as cadeias de oligonucleótido em crescimento. 0 grupo de protecção DMT na extremidade 5' do trinucleótido é então removido, e são adicionados mais três mononucleótidos a todas as cadeias de oligonucleótido. Neste ponto, a síntese avançou para a fronteira de codão seguinte na sequência selvagem, e o ciclo de (i) acoplamento sub-estequiométrico do trinucleótido seguido por (ii) remoção do grupo de protecção DMT é repetido, inserindo assim um trinucleótido no sítio alvo seguinte na cadeia. Com efeito, a sequência selvagem "de fundo" é sintetizada com acoplamento de mononucleótido, enquanto que todos os acoplamentos envolvendo um trinucleótido produziram um mutante de inserção.

Assim, através da sobreimposição de acoplamentos sub-estequiométricos da mistura de trinucleótidos nas posições de fronteira de codão numa síntese automatizada em tudo o resto convencional de um oligonucleótido selvagem de comprimento n, é criada uma mistura heterogénea de oligonucleótidos. A composição exacta desta mistura dependerá do número de acoplamentos de trinucleótidos e da sua eficiência de acoplamento. Qualquer que seja a sua composição, pode ser utilizada electroforese em gel de poliacrilamida na presença de ureia para fraccionar a mistura na base de comprimento, permitindo que a banda de n + 3 codificando todas as inserções de codão único seja separada da banda selvagem e de outras bandas codificando inserções múltiplas. Se desejável, os oligonucleótidos que codificam inserções múltiplas podem também ser separados em géis de poliacrilamida na presença de ureia.

Uma terceira realização da presente invenção é o acoplamento sub-estequiométrico de trinucleótidos para a criação 15

de mutações de substituição. Embora esta realização também possa funcionar bem para a substituição de um oligonucleótido pequeno ut: qudiqutii udiujjí- liuen Lu, é uisuuLiuu um LiiimuicúLiuu ucviuu ã sua utilidade em mutagénese de proteínas. Como ilustrado na Figura 2, a única modificação requerida é a substituição do grupo de protecção 5'-DMT no trinucleótido com um grupo de protecção 5'-X que é estável para ácido fraco e as outras condições utilizadas na síntese de ADN, mas lábil para outras condições de desprotecção suaves. (Podem ser utilizados vários grupos de protecção, a lista seguinte é parcial: (i) levulinato (ver van Boom, J. H. & Burgers, P. M. J. (1976) Tetrahedron Lett. 4875-4878), (ii) éter de sililo (ver Ogilvie, K. K., Schifman, A. L., & Penny, C. (1979) Can. J. Chem. 57, 2230- 2238), (iii) fluoreno-9-ilmetoxicarbonilo(Fmoc)(ver Xu, Y., Lehmann, C., Slim, G., Christodoulou, C., Tan, Z., & Gait, M. J. (1989) Nucl. Acids Res. Symp. Ser. 21, 39-40), (iv) terc- butildimetilsililo, (v) aliloxicarbonilo, (vi) dibromometilbenzoílo, (vii) etilsulfonilo 5'-O-b-substituído, (viii) tetrahidropiranilo (Thp), (ix) metoxitetrahidropiranilo (Mthp), (x) 1-[(2-cloro-4-metil)fenil]-4-metoxipiperidin-4- il(Ctmp), (xi) tritiloxiacetilo e (xii) tetraisopropildissiloxilo). Após acoplamento de um trinuleótido bloqueado com X para 1-3% das cadeias, os três acoplamentos de monómero subsequentes adicionam o codão selvagem seguinte para os 97-99% das cadeias que não adquiriram o trinucleótido, mas não para as cadeias que acoplaram o trinucleótido. Neste ponto da síntese, a desprotecção de todas as cadeias (ácido suave para libertar DMT; hidrazida aquosa diluída se X é levulinato; fluoreto se X é um éter de sililo; base diluída se X é Fmoc) produz 1-3% de cadeias com uma substituição do codão especificado pelo trinucleótido e 97-99% das cadeias que ainda são selvagens em sequência. Como com a estratégia de criação de inserções, pode ser utilizada a repetição do ciclo básico de acoplamento de 1 trinucleótido sub-estequiométrico seguido por 16 Γ\ \ , 5 % três acoplamentos de monómeros estequiométricos, para introduzir mutações a cada posição ao longo do segmento de gene definido QOnnanp-i a Wo λΊ -i ΓΤΛηπηΙ _ _ -------- — — ^ — ; j α viavci purificação de oligonucleótidos mutagénicos separando-os daqueles com sequência selvagem com base no tamanho, é possível utilizar blocos de trinucleótidos contendo uma ou duas ligações fosfonato ou tiofosfato, permitindo a purificação com base na carga ou nas propriedades cromatográficas.

Também aqui descrita está a utilização de monómeros diferentemente protegidos para mutagénese de delecção. Como apresentado na Figura 3, as delecções de codão podem ser criadas através da utilização de mononucleótidos protegidos com X por acoplamentos sub-estequiométricos seguidos por quatro ciclos de adição de DMT-monómeros antes da desprotecção total. Novamente, a síntese prossegue normalmente até que a fronteira de um codão que se quer removido seja atingida. Na fronteira do codão é acoplada uma quantidade sub-estequiométrica de uma fosforamidite de 5'-X-mononucleótido capaz de preservar a sequência aminoacídica selvagem do codão adjacente. Quatro ciclos de acoplamento de mononucleótido convencional, estequiométrico a todas as cadeias não receberam o mononucleótido diferentemente protegido servem para adicionar o codão que será eventualmente removido, mais um mononucleótido adicional. Neste ponto, o grupo de protecção 5'-X é removido e mais dois ciclos de acoplamento de mononucleótidos convencionais terminam a síntese do codão que delimita o sítio de delecção. 0 ciclo inteiro pode então ser repetido. Eventualmente, será produzida uma população grande de oligonucleótidos codificando delecções de codão único, que pode ser utilizada para dirigir as mutações como previamente descrito.

Estes esquemas gerais podem ser úteis em casos em que é desejável uma variação enorme de sequência, tal como a aleatorização in vitro das regiões variáveis de genes de imunoglobulina clonados, para produzir anticorpos catalíticos 17 mais eficientes. De forma semelhante, os projectos que buscam o desenvolvimento de ligandos de ligação apertada através de

/-\ -t- /TW --. Λ £____ _ __... . - »

a- tayuo c apicociita^au uc s>eyilUíllLU peptidico em enzimas podem fazer uso da enorme complexidade de sequências que pode ser criada utilizando trinucleótidos, especialmente em estádios tardios de optimização de uma sequência de ligação apertada inicialmente modesta. Para efeitos de simplicidade, a realização de substituição e a realização de inserção descritas acima explicam uma inserção ou substituição de trinucleótido. Como discutido anteriormente, a utilização de um trinucleótido é de particular interesse quando se realiza uma substituição ou inserção de aminoácido. Contudo, é possível introduzir a degenerescência de sequência com pequenos oligonucleótidos de qualquer comprimento. A revelação acima descreve a presente invenção de um modo geral. Uma compreensão mais completa pode ser obtida por referência aos seguintes exemplos específicos que são aqui fornecidos para objectivos apenas de ilustração e não se pretende que limitem o âmbito da invenção.

Exemplo 1: Síntese de Trinucleótidos1 A. Síntese de 5'-DMT-dCBz-[PO(OMe)]-dT-[PO(OMe)]-dT-3'-[P(OMe) (NiPr2)] ._

Foi adicionado tetrazole (150 mg, 2,1 mmol) a uma solução de dT-3'-Fmoc (930 mg, 2,0 mmol), (preparada a partir do correspondente derivado 5'-DMT através de destritilação catalisada por ácido tricloroacético) e 5'-DMT-dT-3'- [P(OMe)(NiPr2)] (1,5 g, 2,1 mmol) em acetonitrilo anidro. Após 30 minutos à temperatura ambiente, o fosfito foi oxidado com hidroperóxido de t-butilo (0,31 mL de uma solução a 80% em hidroperóxido de di-t-butilo, 2,5 mmol), e a tetrazolo- 18 1

Abreviaturas: Me = metilo, Bz = benzoílo, NiPr2 = N,N-diisopropilo. Por conveniência os trinucleótidos são em alguns casos abreviados como, por exemplo, dTdTdT. fosforamidite era excesso foi inibida com metanol. A solução foi

ώ T73 V“\ A V“ O rí O A A AT V 1 1 A ΓΛΙνΛ φ ·Ρ A Λ AT 1 -i T T —» aÍ a Ά\ AN ta 4- v *N Ί- a mn λ « 4— λ. Ατ A WN ι T «1 *N solução de ácido tricloroacético (0,82 g, 5,0 ramol) em diclorometano. 0 catião DMT foi inibido com solução de bicarbonato de sódio a 10 mM, e o 5'-HO-dT-[PO(OMe)]-dT-3'-Fmoc foi extraído com diclorometano. A camada orgânica foi seca (Na2SC>4) , filtrada e evaporada, e o resíduo foi purificado por cromatografia em gel de sílica utilizando um gradiente de 0-8% de metanol em diclorometano (Rf = 0,30 em metanol a 10%/diclorometano), produzindo 1,1 g (70%) de 5'-HO-dT-3'-[PO(OMe)]-dT-3'-Fmoc.

Foi adicionado tetrazole (83 mg, 1,2 mmol) a uma solução de 5'-HO-dT-3'-[PO(OMe)]-dT-3'-Fmoc purificado (780 mg, 1,0 mmol) e 5' -DMT-dCBz-3' - [P (OMe) (NiPr2) ] (950 mg, 1,2 mmol) em acetonitrilo anidro. Após 30 minutos à temperatura ambiente o fosfito foi oxidado com hidroperóxido de t-butilo (0,19 mL de uma solução a 80% em hidroperóxido de di-t-butilo, 1,5 mmol) e a tetrazolofosforamidite em excesso foi inibida com metanol. A solução foi evaporada, e o resíduo foi purificado por cromatografia em alumina básica utilizando um gradiente de 0-8% de metanol em diclorometano (Rf = 0,42 em metanol a 10%/diclorometano), produzindo 790 mg (53%) de 5'-DMT-dCBz-[PO(OMe)]-dT-[PO(OMe)]-dT-3'-Fmoc. O trinucleótido purificado, totalmente protegido (300 mg, 0,2 mmol) em diclorometano foi tratado com trietilamina (100 mg, 1,0 mmol) à temperatura ambiente durante 90 minutos para remover o grupo 3'-Fmoc. 0 trinucleótido 3'-OH (Rf = 0,26 em metanol a 10%/diclorometano) foi então tratado com cloro-N,N-diisopropilaminometoxifosfina (40 mg, 0,3 mmol) à temperatura ambiente durante 30 minutos. A clorofosfina em excesso foi inibida com metanol, a solução foi lavada com água, seca (MgSC>4) , e a fosforamidite de trinucleótido foi recuperada por precipitação com hexano, produzindo 230 mg (80%) de 5'-DMT-dCBz- 19 φ [PO(OMe)]-dT-[PO(OMe)]-dT-3'-[P(OMe)(NiPr2)]. B. Preparação de ADN utilizando 5'-DMT-dCBz-[PO(OMe)]-dT- [PQ(OMe)1-dT-3'-fP (OMe) (Ni Pr?] ._

Em todos os casos a síntese automatizada de ADN foi realizada num Sintetizador da Applied Biosystems ABI 340B ou 380B. A fosforamidite foi dissolvida em acetonitrilo anidro para uma concentração de 10 mM, e ligada à quinta saída do sintetizador. Após o acoplamento dos três monómeros à coluna o trinucleótido foi distribuído num procedimento de acoplamento duplo. O rendimento do acoplamento foi determinado através da medição da libertação do catião DMT. Foi obtido um rendimento superior a 95%. No final da síntese, foi libertado o heptanucleótido do suporte sólido e as bases foram desprotegidas por tratamento com amónia aquosa concentrada no processo normal. A electroforese em gel de poliacrilamida (20%) e a HPLC (coluna C18, acetato de trietilamónio a 0,1 M/acetonitrilo) confirmaram a formação de heptanucleótido e a ausência de quaisquer sequências falhadas.

Exemplo 2: Mutagénese de Inserção A. Procedimento geral para Inserção de um Único Trinucleótido no Gene para a Nuclease Estafilocócica A síntese utilizou a rotina de síntese de 0,2 mmol convencional, modificada para eliminar o passo de protecção após a adição sub-estequiométrica do trinucleótido. A fosforamidite de trinucleótido (25 mg) foi dissolvida em acetonitrilo anidro e o frasco foi ligado à quinta entrada de injecção do sintetizador. As eficiências de acoplamento das adições de monómero individual e de trinucleótido foram monitorizadas pela libertação do grupo 5'-DMT. A concentração do oligonucleótido não purificado foi estimada a partir da absorvência a 260 nm.

Após a síntese, foram extraídos com fenol 10-15 nmol de oligonucleótido impuro, secos sob vácuo e ressuspendidos em 5 μΐι de NaCl a 5 mM, EDTA a 1 mM, Tris.HCl a 10 mM, pH 8,1 a 65°C durante 30 minutos. Foram adicionados um volume igual de 20

formamida a 95%, EDTA a 20 mM, azul de bromofenol a 0,1% e xilenocianol a 0,1%, as amostras foram aquecidas a 100°C durante

2 mi nivtriQ 1 aw ^ ^3 - — 1 r r\ n .1 * a _i_ uiiu ua a i j_ z. u'o tac iJlll de comprimento de 0,4 mm de espessura, e sujeitas a electroforese a 750 V até que o xilenocianol tivesse percorrido metade do gel. 0 gel foi corado com brometo de etidio a 2 mg/mL durante 30 minutos, as bandas de oligonucleótido foram visualizadas por iluminação com UV, e foi excisada uma secção de 0,5-1,0 cm de gel imediatamente acima da banda maior e eluida durante a noite em acetato de sódio a 300 mM, EDTA a 5 mM a 37°C. Após uma breve centrifugação para remover particulados, a mistura de oligonucleótidos foi precipitada com etanol. A mistura de oligonucleótidos impura foi marcada radioactivamente com [γ-32Ρ]ΑΤΡ utilizando quinase de polinucleótido, de modo a confirmar a presença da banda n + 3 e para quantificar a sua recuperação. Aproximadamente 1 pmol de oligonucleótido n + 3 purificado foi utilizado para mutagenizar um fago derivado de M13 contendo uracilo transportando o gene para a nuclease estafilocócica. As placas mutantes foram identificadas utilizando um agar indicador cromogénico, e o gene da nuclease de cada fago mutante foi sequenciado na sua totalidade pelo método de didesoxi. B. Técnica Geral para Inserção de Um ou Dois Codões

Um acoplamento sub-estequiométrico de uma mistura de DMT-dGdCdT-fosforamidite e DMT-dGdGdT-fosforamidite foi realizado durante a síntese de oligonucleótidos mutagénicos para o gene da nuclease estafilocócica. Após esta reacção, que produziu 1-3% de acoplamento, o passo de protecção convencional com anidrido acético foi omitido. (Por outro lado, os 97-99% das cadeias que não sofreram a reacção teriam sido inactivadas para acoplamentos adicionais). Os passos subsequentes da oxidação de fosfito e da desprotecção do grupo 5'-DMT foram realizados exactamente como nos ciclos de adição de monómero convencional. Neste ponto na síntese, 1-3% de cadeias possuem um codão adicional dGdCdT ou 21 1

^7 dGdGdT nas suas extremidades 5', enquanto as 97-99% restantes foram selvagens em sequência. Em seguida, foram realizados três Π pl HC Ho ís Η τ z·"· 5 /"% Ho mor% Amo v>/-\ e» H/-v rr»/-I — — — — — - — — —l —

--- -----— γ----— — — -w* S«- mvv^v «-* V^VXV-. CUULV^ UO V_>Cl\-A<3 X Cl O UC comprimento normal como as cadeias com um codão extra receberam o codão selvagem seguinte. Novamente, foi alcançada uma fronteira de codão; de modo a induzir inserções de um único codão nesta posição, foi realizado outro ciclo de acoplamento sub-estequiométrico da mistura de trinucleótido com a omissão da reacção de protecção 5'. Neste ponto na síntese, 1-3% de cadeias adquiriram a segunda inserção de dGdCdT ou dGdGdT, 1-3% adquiriram a primeira, menos de 0,1% possuem ambas as inserções, e a restante maioria possui a sequência selvagem. Foram então realizados mais três ciclos de adição de monómeros para ligar o codão selvagem seguinte a todas as cadeias. Foram realizados outros acoplamentos da mistura de trinucleótidos após cada terceiro acoplamento de monómero até que os codões tivessem sido inseridos em todos os sítios alvo. Seguiram-se então uns 6-9 acoplamentos de monómero finais para aumentar a quantidade de homologia com a sequência selvagem necessária para a iniciação pelo trinucleótido da síntese da segunda cadeia num ADN molde de cadeia simples. C. Utilização de Trinucleótido dGdCdT para Mutagénese de Inserção de Codão Único_

As inserções do trinucleótido dGdCdT foram realizadas nas fronteiras de codão 64/65, 65/66, 66/67 do gene da nuclease estafilocócica. Quando a mistura de oliginucleótidos purificada foi utilizada para mutagenizar o fago de cadeia simples, 15% das placas fágicas resultantes eram deficientes em actividade de nuclease. Dos 24 mutantes que foram sequenciados, 11 possuíam inserção dGdCdT a 65/66, 11 uma inserção dGdCdT a 66/67, um era selvagem e um possuía uma delecção de um único nucleótido na sequência de oligonucleótidos, presumivelmente devido a contaminação com oligonucleótido n-1 não removido pelo passo de purificação em electroforese em gel. Uma experiência idêntica 22 que tomou como alvo as inserções dGdGdT para estes mesmos três sítios produziu cinco inserções dGdGdT em 64/65, dez em 65/66, três em 66/fi7. nm selvagem, uma dclccçãc dc nucleótido único, c quatro mutações devidas a mau emparelhamento do oligonucleótido noutros sítios no gene da nuclease. D. Utilização de Trinucleótidos dGdCdT e dGdGdT para Mutagénese de Inserção de Codões Múltiplos_ A Figura 4 apresenta os resultados de duas experiências nas quais misturas equimolares (4,1 mM) de 5'-DMT-dGdCdT-fosforamidite e de 5'-DMT-dGdGdT-fosforamidite foram utilizadas para mutagénese de inserção. 0 histograma apresenta a distribuição e frequências de mutações de inserção de codão de alanina (apresentadas na porção sombreada do gráfico de barras) e de glicina (apresentadas na porção aberta do gráfico de barras) recuperadas no gene para nuclease estafilocócica. Na primeira experiência, foi produzido um oligonucleótido de comprimento selvagem n = 29, com inserções tendo como alvo cada uma das cinco fronteiras de codão entre os codões 98 e 103 do gene da nuclease estafilocócica. Vinte e quatro das 38 placas mutantes continham inserções de codão único, com todos os sítios representados excepto 99/100 (Figura 4A) . Treze dos mutantes restantes apresentavam uma delecção de nucleótido único na sequência do oligoucleótido consistente com a mutagénese por um oligonucleótido a partir da banda n-1 contaminante. Adicionalmente, foi observada uma inserção de uma única base.

Na segunda experiência, um oligonucleótido do comprimento do selvagem n = 46 foi sintetizado para direccionar inserções no limite de nove de dez codões entre os codões 33 e 43 do gene da nuclease estafilocócica. Neste caso, 21 das 37 placas mutantes sequenciadas continham uma inserção única dGdGdT ou dGdCdT num sítio alvo; a distribuição destas inserções é apresentada na Figura 4B. De novo, delecções de um único nucleótido no oligonucleótido foram os maiores contaminantes (doze isolados), com duas inserções de um só nucleótido e duas delecções maiores 23 1 a preencherem o restante.

Exemplo 3: Mutaqénese de Substituição A. Síntese de Fosforamidite de Trinucleótido Codificando para Leucina com um Grupo de Protecção Fmoc (fluoren- 9-ilmetoxicarbonilo) ._

Um trinucleótido especificando o codão da leucina pode ser sintetizado a pedido utilizando uma química de fase em solução convencional. A ressuspensão do trinucleótido 5'-OH em piridina seca seguida por incubação com 1,5 equivalentes de Fmoc-Cl a 0°C durante uma hora pode produzir o 5'-Fmoc trinucleótido protegido num rendimento superior a 50%. Pode ser utilizada RP-HPLC para purificar o 5'-Fmoc trinucleótido e a sua estrutura pode ser justificada utilizando espectroscopia de 1H-RMN (Lehmann, C., Xu, Y., Christodoulou, C., Tan, Z. e Gait, M. J. (1989) Nucl. Acid Res. 17, 2379-2389). Métodos convencionais (ver, Balgobin, N. e Chattopadhyaya, J. (1987) Nucleosides and Nucleotides 6, 461-463) pode ser utilizado para fosfotilar o 5'-Fmoc trinucleótido e purificar a fosforamidite resultante. A estrutura do produto final, 5' -Fmoc-dCBz-[PO (OMe) ]-dT-[PO (OMe) ]-dT-3' -[P (OMe) (NiPr2) ] pode ser justificado utilizando espectroscopia 1H e 31P-RMN e pode ser confirmada por sequenciação de ADN das mutações induzidas pelo trinucleótido. O produto liofilizado pode ser armazenado em porções de 25 mg sob argon em frascos âmbar a -70°C. B. Substituição de codões com a Fosforamidite 5'-0-Fmoc- dCdTdT_

Os oligonucleótidos podem ser sintetizados num sintetizador de ADN 340B de Applied Biosystems utilizando a rotina de síntese de 0,2 μπιοί fornecida comercialmente. A rotina é modificada para eliminar o passo de protecção após a adição sub-estequiométrica do trinucleótido. É adicionado um passo no qual DBU (1,8— diazabicico-[5.4.0]-undec-7-ene) a 100 mM é adicionado a partir 24

de um frasco separado para realizar a remoção do grupo de protecção 5'-Fmoc do trinucleótido acoplado após três ciclos substiqufciiiLfc: ue duu^idiueiiÍu de munuuuuicú Liuu. As cf ii-iêin^icis Cie acoplamento de mononucleótido e de trinucleótido podem ser medidas através da monitorização de absorvência dos grupos DMT e Fmoc libertados a 4 98 e 305 nm, respectivamente. 0 produto de oligonucleótido final contendo um grupo 5'-DMT pode ser clivado a partir do suporte sólido e purificado a partir do produto truncado através de RP-HPLC antes da remoção convencional dos grupos de protecção restantes. A concentração de oligonucleótidos pode ser estimada a partir da absorvência a 260 nm. Pode ser utilizado aproximadamente 1 pmol de oligonucleótido purificado para mutagenizar um fago M13 contendo uracilo (ver Kunkel, T. A. (1985) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 82, 488-492) transportando o gene para nuclease estafilocócica. As placas mutantes podem ser identificadas utilizando um agar indicador cromogénico (ver Shortle, D. (1983) Gene 22, 181-189), e o gene da nuclease de cada fago mutante pode ser sequenciado na sua totalidade pelo método da terminação de cadeia com didesoxinucleótido (ver Sanger, F., Nicklen, S. e Coulson, A. R. (1977) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 74, 5463-5467).

Exemplo 4: Mutaqénese de Delecção (não reivindicado) A. Síntese de Fosforamidite de Mononucleótido de

Desoxitimidina com um Grupo de Protecção 5'-

Fmoc(fluoren-9-ilmetoxicarbonilo)_ A suspensão de desoxitimidina em piridina seca seguida por incubação com 1,5 equivalentes de Fmoc-Cl a 0°C durante uma hora pode produzir o mononucleótido protegido por 5'-Fmoc num rendimento superior a 50%. Pode ser utilizada RP-HPLC para purificar o mononucleótido de 5'-Fmoc e a sua estrutura pode ser justificada utilizando espectroscopia de H-RMN (Lehmann, C., Xu, Y., Christodoulou, C., Tan, Z. e Gait, M. J. (1989) Nucleic 25

Acids Res. 17, 2379-2389). Podem ser utilizados os métodos convencionais (ver, Balgobin, N. e Chattopadhyaya, J. (1987) Nucleosides and Munl^ni-iHes 6, 461-483) para fosfitilar o 5'-Fmoc mononucleósido e purificar a 3'-fosforamidite resultante. A estrutura do produto final, 5'-FmocO-dT-3'-[P(OMe)(NiPr2)] pode ser justificada utilizando espectroscopia de H-RMN e de 31P-RMN e pode ser confirmada por sequenciação de ADN das mutações induzidas utilizando o mononucleótido. 0 produto liofilizado deve ser armazenado em 25 porções sob argon em frascos de vidro âmbar a -70°C. B. Síntese de Oligonucleótidos com Delecção de Codões.

Os oligonucleótidos podem ser sintetizados num sintetizador de ADN 340B de Applied Biosystems utilizando uma síntese de rotina de 0,2 pmol fornecida comercialmente. A rotina é modificada para eliminar o passo de protecção após adição sub-estequiométrica do mononucleótido. É incluído um passo em que é adicionado DBU a 100 mM a partir de um recipiente separado para efectuar a remoção do grupo de protecção 5'-Fmoc do trinucleótido acoplado após quatro ciclos subsequentes de acoplamento de mononucleótidos. As eficiências de acoplamento do 5'-Fmoc mononucleótido e o 5'-DMT mononucleótido podem ser medidas por monitorização da absorvência dos grupos DMT e Fmoc libertados a 498 e 305 nm respectivamente. O oligonucleótido produto final pode ser clivado do suporte sólido e purificado com base no tamanho antes da remoção dos grupos de protecção que permaneceram. A concentração de oligonucleótido pode ser estimada a partir da absorvência a 260 nm. Pode ser utilizada aproximadamente 1 pmol de oligonucleótido purificado para mutagenisar um fago M13 contendo uracilo como acima. As placas mutantes podem ser identificadas utilizando um agar com um indicador cromogénico, e o gene da nuclease de cada fago mutante pode ser sequenciado na sua totalidade pelo método da terminação 26 em cadeia por didesoxinucleótidos como acima.

Lisboa, 12 de Junho de 2001 ^^\GENTE OFICIAL DA PROPRIEDADE INDUSTRIAL

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Claims (10)

1. REIVINDICAÇÕES 1. HéLodu de preparação de uma população de moléculas de AUN de sequências mistas compreendendo: empregar uma população mista de trinucleótidos, compreendendo cada um dos referidos trinucleótidos uma 3' -fosforamidite, para incorporação estequiométrica numa ou mais fronteiras de codão numa síntese de ADN automatizada, para formar a referida população de moléculas de ADN de sequências mistas.
2. 2. Método para inserir uma sequência de trinucleótido numa ou mais fronteiras de codão durante a síntese química de ADN, compreendendo o referido método os passos de: (a) acoplamento sub-estequiométrico de uma sequência de trinucleótido contendo uma 3'-fosforamidite, e um grupo de protecção 5' que é clivado sob as condições utilizadas para remover os grupos de protecção 5' dos blocos monoméricos da construção, (b) clivagem de todos os grupos de protecção 5', (c) continuar a síntese de ADN por acoplamento ou de monómeros ou de sequências de trinucleótidos adicionais.
3. 3. Método de acordo com a reivindicação 2, em que é utilizada uma mistura de trinucleótidos.
4. 4. Método de acordo com qualquer das reivindicações 1-3, em que a referida sequência de trinucleótido contém um grupo 5'-DMT. 1
5. 5. Método para substituição de uma sequência de trinucleótido numa ou mais fronteiras de codãn Hurante 2 sír.tccc química de ADN, compreendendo o referido método os passos de: (a) acoplamento sub-estequiométrico de uma sequência de trinucleótido contendo uma 3'-fosforamidite, e um grupo de protecção 5' que é estável às condições utilizadas para remover os grupos de protecção 5' dos blocos monoméricos da construção, (b) adição em três ciclos de síntese de mononucleótidos de monómeros seleccionados contendo grupos de protecção 5' convencionais aos das moléculas de ADN que não adquiriram o referido trinucleótido contendo um grupo de protecção 5' estável, (c) clivagem do grupo de protecção 5' nas moléculas de ADN que adquiriram a referida sequência de trinucleótido, e ou acoplamento adicional de monómeros, ou, repetição da sequência dos passos a partir de (a).
6. 6. Método de acordo com a reivindicação 5, em que é utilizada uma mistura de trinucleótidos.
7. 7. Utilização de um trinucleótido num método de acordo com qualquer das reivindicações 5 ou 6, contendo o referido trinucleótido uma posição 5' protegida, ésteres de fosfato protegidos, bases protegidas e uma 3'-fosforamidite, em que os referidos grupos de protecção são compatíveis com a síntese química de ADN convencional, e em que o grupo de protecção 5' é estável nas condições utilizadas durante a síntese química de ADN, mas que pode ser selectivamente 2 clivado quando desejado.
8. 8. Util i 7.λο5<~> uma mistura de trinu^ieúLiuos num método de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 4, contendo cada trinucleótido uma posição 5' protegida, ésteres de fosfato protegidos, bases protegidas e uma 3'-fosforamidite, em que os referidos grupos de protecção são compatíveis com síntese química de ADN convencional.
9. 9. Utilização de uma mistura de trinucleótidos num método de acordo com qualquer das reivindicações 5 ou 6, contendo cada trinucleótido uma posição 5' protegida, ésteres de fosfato protegidos, bases protegidas e uma 3'- fosforamidite, em que os referidos grupos de protecção são compatíveis com a síntese química de ADN convencional, e em que o referido grupo de protecção é estável nas condições utilizadas para remover os grupos de protecção 5' dos blocos monoméricos da construção.
10. 10. Utilização de um trinucleótido na preparação de uma mistura de trinucleótidos para utilização num método de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 4, contendo cada trinucleótido uma posição 5' protegida, ésteres de fosfato protegidos, bases protegidas e uma 3'-fosforamidite, em que os referidos grupos de protecção são compatíveis com a síntese química de ADN convencional. Lisboa, 12 de Junho de 2001

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