ES2156869T5 - Sintesis de colecciones diversas y utiles de oligonucleotidos. - Google Patents

Abstract

UNA NUEVA TECNICA PARA GENERAR MEZCLAS DE OLIGONUCLEOTIDOS EN UNA UNICA SINTESIS AUTOMATIZADA ES CONSEGUIDA. EL METODO PUEDE SER USADO PARA PREPARAR MEZCLAS OLIGONUCLEOTIDAS IDEALMENTE ADECUADAS PARA CREACION DE MEZCLAS BENEFICIOSAS DE OLIGO POLIPEPTIDAS O PROTEINAS. ADICIONALMENTE, LA TECNICA HABILITA LA INSERCION Y/O SUSTITUCION Y/O SUPRESION DE UNA SECUENCIA NUCLEOTIDA EN UNO O MAS PUNTOS. PARA MUTAGENESIS DE PROTEINA, UN TRINUCLEOTIDO PUEDE SER INSERTADO O SUSTITUIDO EN CODONES LIMITROFES. LA TECNICA INVENTADA HACE POSIBLE LA CODIFICACION DE TODAS LAS POSIBLES INSERCIONES DE AMINO ACIDOS INDIVIDUALES, O CUALQUIER MEZCLA DESEADA DE SUSTITUCIONES O INSERCIONES.

Description

Síntesis de colecciones diversas y útiles de oligonucleótidos.

La presente invención se refiere a la síntesis de oligonucleótidos, y de forma específica a un nuevo método para generar mezclas de oligonucleótidos en una única síntesis automática. La técnica permite la generación de distintas mezclas de DNA que pueden utilizarse para preparar grandes combinaciones de oligopéptidos o polipéptidos y/o proteínas.

Antecedentes de la invención

Los métodos para preparar DNA de composición mixta están cobrando importancia en el estudio de la función biomolecular, así como en la búsqueda de sustancias con propiedades nuevas y útiles. A medida que la tecnología de la síntesis de DNA fue mejorando en el principio de la década de los ochenta, fue resultando posible llevar a cabo síntesis múltiples como medio de generar mezclas de oligonucleótidos. En un principio podían prepararse combinaciones grandes y diversas en síntesis múltiples. En la práctica, varios investigadores comprendieron que podría generarse gran cantidad de oligonucleótidos en una única síntesis mediante el acoplamiento de mezclas de mononucleótidos, en lugar de utilizar los componentes básicos de monómeros exclusivos. La complejidad de la combinación resultante o "banco" de oligonucleótidos se determina por el número de monómeros acoplados, y el número de sitios en los que se introducen las mezclas de monómeros.

Cada vez se utilizan más oligonucleótidos de composición mixta en la mutagénesis de proteínas, para el estudio de la estructura y función. Mediante la expresión de secuencias de DNA de composición mixta, se genera el correspondiente banco de proteínas mutantes. Aliados con las técnicas de búsqueda apropiadas, estos bancos pueden investigarse para detectar sustancias con propiedades alteradas y, por tanto, resultan útiles en el estudio de la función biomolecular. La clase más general de métodos de mutagénesis emplea oligonucleótidos basados en la secuencia del gen de tipo salvaje, e incorpora modificaciones que finalmente producen cualquier cambio deseado en la secuencia de aminoácidos. Estos métodos se analizaron recientemente en el número de agosto de 1991 de Current Opinion in Structural
Biology.

Casi todos los estudios genéticos de la estructura y actividad de las proteínas emplean mutaciones de sustitución: se sustituyen una o varias cadenas laterales de los aminoácidos, pero se conserva la longitud de la proteína y el espaciamiento de los restos. Con el fin de facilitar la generación de un gran número de mutaciones de sustitución en un único experimento, se han desarrollado una serie de técnicas en la técnica anterior (para un análisis, véase Botstein D. y Shortle, D. (1985), Science, 229, 1193-1201, y Zoller, M.J. (1991), Curr. Opin. Struct. Biol., 1, 605-610). La más popular implica la síntesis química de mezcla complejas de oligonucleótidos que se utilizan como cebadores mutagénicos para la síntesis de DNA (véase Hermes, J.D., Parekh, S.M., Blacklow, S.C., Koster, H. y Knowles, J.R. (1989), Gene, 84, 143-151), o como fragmentos dúplex mutagénicos para el acoplamiento a fragmentos de restricción (véase Matteucci, M.D. y Heynecker, H.L. (1983), Nucl. Acids Res., 11, 3113-3121). Para generar la sustituciones de aminoácidos únicas requeridas, cada monómero utilizado para la síntesis de oligonucleótidos se "dopa" con pequeñas cantidades de tres monomucleótidos de tipo no salvaje. En principio, este método puede suministrar cada sustitución de nucleótidos posible en un segmento de un gen en un único experimento. Puesto que la distribución de las sustituciones de nucleótidos sigue la estadística de Poisson, dos sustituciones de mononucleótidos en el mismo codón serán relativamente raras, a unos niveles de dopaje que proporcionan una o unas pocas sustituciones de aminoácidos por gen mutante. Por consiguiente, para fines prácticos, se espera que esta estrategia para generar mezclas de oligonucleótidos mutagénicos produzca sólo una tercera parte de todas las sustituciones posibles de aminoácidos, y el tipo de sustituciones de aminoácidos inducidas en una posición concrete viene determinada por la secuencia del codón de tipo salvaje. También debe advertirse que el dopaje con monómeros de oligonucleótidos de la técnica anterior no puede utilizarse para inducir otros tipos de cambios en la secuencia de DNA, como inserciones o deleciones.

Una aplicación relacionada de la síntesis de DNA mixto utiliza vastas combinaciones de oligonucleótidos distintos en procesos dirigidos a descubrir sustancias con propiedades nuevas y útiles. Se han investigado bancos de péptidos (Cwirla, S.E., Peters, E.A., Barrett, R.W. y Dower, W.J. (1990), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, 6378-6382), de RNA (Tsai, D. Kenan, D. y Keene, J. (1992), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 8864-8868) y de DNA (Bock, L., Griffin, L., Latham, J., Vermaas, E. y Toole, J. (1992), Nature, 355, 564-566), generados a partir de combinaciones de oligonucleótidos preparadas mediante síntesis de monómeros mixtos, para descubrir moléculas que se unen a sustancias diana concretas. En este enfoque, la utilidad de los bancos de péptidos depende de modo crítico de la forma en que se genera la mezcla de oligonucleótidos. Esto surge debido a la degeneración del código genético: los aminoácidos no están representados por un número igual de codones de trinucleótidos, sino que algunos aminoácidos están codificados sólo por un codón y otros por hasta seis. Por tanto, aunque los oligonucleótidos preparados a partir de una mezcla igual de los cuatro monómeros pueden contener cada uno de los 64 trinucleótidos, los aminoácidos codificados no están representados de modo uniforme, e inevitablemente se generan codones de terminación. Como resultado, los aminoácidos que están codificados por el mayor número de codones están sobrerrepresentados, a expensas de los que están codificados por sólo uno o dos codones. Como ejemplo, si se desea un tipo concreto de mutación (por ejemplo, sólo sustituciones de aminoácidos hidrófobos), el banco resultante contendrá una elevada proporción de especies no deseadas. Este incoveniente es particularmente crítico a medida que aumenta el número de posiciones en las que se producen las sustituciones.

En un esfuerzo para mejorar la eficacia de la síntesis de secuencias de DNA mixtas para la preparación de bancos de péptidos y proteínas, se han introducido combinaciones en las que los monómeros están mezclados de una manera racional. Por ejemplo, Youvan ha calculado mezclas óptimas de monómeros para especificar subseries concretas de aminoácidos (Arkin, A.P. y Youvan, D.C. (1992), Bio/Technology, 10, 297-300). El uso de estas mezclas aumenta la proporción de aminoácidos deseados en un banco de péptidos o proteínas. Sin embargo, no excluye la generación de sustituciones no deseadas, que surgen de combinaciones particulares de monómeros. Incluso con este método, las sustituciones deseadas normalmente son una fracción de las introducidas en cada sitio. Por consiguiente, a medida que aumenta el número de sitios alterados, disminuye la proporción de mutantes deseados en el banco.

Reconociendo los problemas asociados con el uso de mezclas de monómeros, Huse ha descrito un método (descrito en el documento WO 92/03461) en el que la síntesis de DNA se lleva a cabo de modo que imite la síntesis múltiple. Esto se logra llevando a cabo la síntesis en múltiples soportes sólidos, que pueden mezclarse y volverse a dividir cuando sea necesario. De esta forma, pueden realizarse diversas mezclas de oligonucleótidos utilizando monómeros, y se evitan los problemas asociados con la degeneración del código genético. El método tiene dos inconvenientes: (i) para cada síntesis, se requiere un trabajo intensivo de dividir y volver a mezclar el material de soporte, y (ii) el número total de secuencias diferentes que pueden sintetizarse está limitado por el número de soportes físicamente separables utilizados en la síntesis, que típicamente es del orden de 10^{8}.

Wells, J.A., Vasser, M. y Powers, P.B. (1985), Gene, 34, 315-323, han descrito un método para utilizar mezclas de fosfotriéster trinucleótidos para la generación de oligonucleótidos mixtos y la obtención de resultados sesgados. Zon, G., Gallo, K.A., Samson, C.J., Shao, K.-L., Summers, M.F. y Byrd, R.A. (1985), Nucl. Acids Res., 13, 8181-8196, han descrito el comportamiento de acoplamiento de monómeros de la fosforamidita recién desarrollados, e indicaron que se espera un acoplamiento selectivo.

En resumen, los métodos existentes para la síntesis de secuencias múltiples de DNA tienen varios inconvenientes:

1. Aunque pueden generarse todas las sustituciones posibles de nucleótidos utilizando oligonucleótidos dopados con monómeros mixtos, las sustituciones de dos y tres mononucleótidos contiguos son muy raras. Esto resulta desventajoso con respecto a la mutagénesis de proteínas, puesto que cada aminoácido en una proteína viene especificado por tres nucleótidos contiguos, y esta estrategia sólo puede generar con eficacia aproximadamente una tercera parte de todas las sustituciones posibles de aminoácidos para cada aminoácido de tipo salvaje en una única síntesis.

2. Ninguna de las estrategias de la técnica anterior que implique la síntesis de mezclas de oligonucleótidos permite la generación de proteínas mutantes con inserciones en uno o más codones en más de un único sitio en el oligonucleótido sintetizado.

3. La degeneración del código genético significa que cualquier mezcla de mononucleótidos utilizada en la síntesis de DNA mixto inevitablemente produce oligonucleótidos que contienen codones no deseados, o no suministra todos los codones deseados. Este problema resulta crítico a medida que aumenta el número de posiciones en las que se introducen las mezclas.

4. Los métodos que imitan la síntesis múltiple requieren mucho trabajo, y la diversidad de secuencias que pueden generarse está limitada por el número de soportes físicamente separables utilizados.

La presente invención proporciona soluciones a estos problemas y permite la preparación de oligonucleótidos mixtos con una multitud de aplicaciones en la biología molecular moderna. Por ejemplo, los oligonucleótidos mixtos preparados según la presente invención pueden utilizarse para generar genes que codifican bancos de péptidos y/o proteínas. Además, los trinucleótidos resultan útiles para preparar cebadores degenerados para la reacción en cadena de la polimerasa. La invención resulta particularmente útil para la mutagénesis de proteínas; pueden prepararse con facilidad cebadores de mutagénesis monocatenarios y "módulos" bicatenarios que codifican cualquier combinación de aminoácidos, mediante la aplicación del método descrito en la presente. La presente invención también permite realizar la mutagénesis de sustitución e inserción.

El método se basa en el uso de trinucleótidos presintetizados que son compatibles con los métodos más eficaces de síntesis de DNA. Los componentes básicos de trinucleótidos se han utilizado previamente en la síntesis de DNA (véase, por ejemplo, Hirose, T., Crea, R. e Itakura, K. (1978), Tet. Lett., 2449-2452; Miyoshi, K., Miyake, T., Hozumi, T. e Itakura, K. (1978), Nucl. Acids Res., 8, 5473-5489), cuando los rendimientos del acoplamiento discontinuo son bajos y resultaba más deseable incorporar los componentes de oligonucleótidos más grandes posibles en cada etapa. Este trabajo anterior se diferencia de la presente invención, puesto que (i) se basa en la qúimica de fosfodiésteres, ineficaz y obsoleta, y por tanto no permite acoplamientos múltiples, (ii) no está dirigido a la generación de combinaciones diversas y útiles de oligonucleótidos mixtos, y (iii) no permite la mutagénesis de inserción.

Sumario de la invención

La presente invención supera las limitaciones de la técnica anterior y suministra una nueva técnica para generar mezclas de oligonucleótidos en una única síntesis automática. El método resulta útil en la mutagénesis sistemática de proteínas u otros elementos genéticos importantes. Las distintas combinaciones de oligonucleótidos que pueden generarse mediante la aplicación de la presente invención resultan particularmente útiles en la preparación de bancos de péptidos, que pueden investigarse para detectar moléculas que se unen a una sustancia diana concreta. La presente invención también puede utilizarse en la mutagénesis de proteínas para codificar todas las posibles sustituciones de aminoácidos, todas las posibles inserciones de aminoácidos, o cualquier mezcla deseada de sustituciones e inserciones.

En su forma más general, la presente invención permite la síntesis de moléculas de DNA utilizando componentes básicos de trinucleótidos, que se corresponden con los codones de los aminoácidos.

Los trinucleótidos se preparan de forma que sean compatibles con los métodos convencionales de síntesis de DNA automática. De modo más conveniente, la posición 5' libre se protege con un grupo protector lábil a los ácidos (de forma típica, 4,4'-dimetoxitritilo, DMT), los fosfatos se protegen como ésteres metílicos o cianoetílicos, las bases se protegen como amidas de benzoílo (A y C) o isobutirilo (G), y la posición 3' libre se activa para el acoplamiento como una N,N-diisopropilaminofosforamidita de O-metilo u O-cianoetilo. Como se describe a continuación, en algunos casos resulta deseable que la posición 5' se protega de forma diferente. Esto se logra con facilidad durante la síntesis de los trinucleótidos. El método no excluye el uso de trinucleótidos protegidos y activados de otras formas.

La presente invención puede utilizarse para el acoplamiento estequiométrico o subestequiométrico de trinucleótidos. En cada caso, el sintetizador automático funciona de modo discontinuo para sintetizar un oligonucleótido mediante el acoplamiento de una secuencia de monómeros que especifica la secuencia de DNA de tipo salvaje. En el sitio deseado, se suspende el programa de síntesis y se lleva a cabo una secuencia alterada de etapas, como se describe a continuación.

1. Acoplamiento estequiométrico

En una primera realización, se utilizan uno o más trinucleótidos, en lugar de monómeros, para la síntesis química de DNA. Los trinucleótidos se acoplan esencialmente de modo cuantitativo, y por tanto, pueden utilizarse para la síntesis automática de DNA de la misma forma que los componentes básicos de monómeros. En una única síntesis, el acoplamiento estequiométrico de las mezclas de trinucleótidos suministra DNA de cualquier complejidad deseada, con un control completo sobre su composición. Los codones de terminación pueden evitarse, y cualquier combinación de aminoácidos puede codificarse en cada posición. La sustitución de un codón de tipo salvaje por cualquier combinación de trinucleótidos puede llevarse a cabo con facilidad dirigiendo el sintetizador de DNA para que acceda a una mezcla apropiada en una etapa deseada de la síntesis. Por tanto, el método resulta ideal para la generación de bancos de péptidos de una composición definida. También resulta adecuado para preparar olipéptidos o proteínas mutantes, en las cuales se introduce una clase concreta de aminoácidos (por ejemplo, hidrófobos) en uno o más sitios.

2. Acoplamiento subestequiométrico

Mediante la reducción del nivel de trinucleótidos durante la síntesis de DNA, puede utilizarse el acoplamiento subestequiométrico de trinucleótidos protegidos y activados de modo adecuado con el fin de lograr la mutagénesis de sustitución, inserción o deleción. En este formato, la presente descripción resulta adecuada para generar proteínas mutantes que lleven sustituciones únicas de aminoácidos, para el estudio de relaciones de estructura-función. Uno o más trinucleótidos se añaden en una cantidad que es subestequiométrica con respecto al número de terminales-5' sobre el soporte sólido. Si se va a insertar un codón, el extremo 5' del trinucleótido añadido se protege de la misma forma que los monómeros utilizados en la síntesis. Si se desea una sustitución o deleción, el extremo 5' del trinucleótido llevará un grupo protector estable especialmente elegido, en lo sucesivo denominado X. En este contexto, un grupo protector estable X es cualquier funcionalidad capaz de soportar las condiciones de la síntesis automática de DNA, pero que puede retirarse de modo selectivo cuando resulte necesario. El trinucleótido puede añadirse en diferentes puntos de la secuencia del gen de tipo salvaje. El producto final es una mezcla compleja de oligonucleótidos que se basan en la secuencia de tipo salvaje, pero que están dopados al azar con mezclas de trinucleótidos exclusivos o degenerados. La mutagénesis de inserción, sustitución o deleción se logra durante el acoplamiento subestequiométrico como sigue:

(i) Inserción (véase la figura 1)

En una segunda realización para generar mutaciones de inserción, se elige el trinucleótido que tiene uno de los grupos protectores utilizados habitualmente en la posición 5', como DMT. La pequeña fracción de cadenas en crecimiento que se somete a la adición de los trinucleótidos bajo condiciones de acoplamiento subestequiométricas se desbloquea inmediatamente, y después se alarga en todas las etapas posteriores. El resultado neto es la adición de tres nucleótidos, que se corresponden con un codón que se ha insertado en una secuencia, que de otro modo es de tipo salvaje. La síntesis continúa. En cada sitio en el que se va a insertar un aminoácido, se lleva a cabo otro acoplamiento subestequiométrico con un trinucleótido exclusivo (para generar un tipo de aminoácido insertado), o con una mezcla de las fosforamiditas de los trinucleótidos (cuando van a insertarse hasta 19 restos diferentes en un único sitio).

(ii) Sustitución (véase la figura 2)

En una tercera realización para generar mutaciones de sustitución durante el acoplamiento subestequiométrico, se elige el trinucleótido que tiene un grupo 5'-protector estable X (como se ha definido anteriormente), y se aplica un esquema de desprotección diferencial. Después de la incorporación del trinucleótido, durante las siguientes tres adiciones de monómero, el grupo 5'-protector sobre el trinucleótido no se elimina por el tratamiento ácido que rompe el grupo 5'-DMT de los monómeros acoplados. Por consiguiente, la pequeña fracción de cadenas en crecimiento que se somete a la adición del trinucleótido no se alarga. Después de la adición de tres monómeros protegidos de modo convencional a todas las demás cadenas, que se corresponden en secuencia con el codón de tipo salvaje, se lleva a cabo otra etapa para eliminar el grupo protector X en el extremo del trinucleótido. La síntesis continúa. En cada codón en el que se van a genera las sustituciones de aminoácidos, se lleva a cabo otro acoplamiento con un trinucleótido exclusivo (para generar un tipo de aminoácido sustituido), o con una mezcla de las fosforamiditas de los trinucleótidos (cuando van a introducirse hasta 19 restos diferentes en un único sitio).

(iii) Deleción (véase la figura 3)

Como también se describe en la presente, las deleciones pueden realizarse utilizando un mononucleótido con un grupo 5'-protector estable X. El grupo 5'-protector estable X (como se ha definido anteriormente) establece un límite de la deleción, y evita el posterior acoplamiento del pequeño porcentaje de cadenas que lo adquiere. El posterior acoplamiento estequiométrico de los monómeros normales sólo se produce en las cadenas que estan desprotegidas durante el desarrollo de la síntesis. La eliminación del grupo protector estable permite el posterior acoplamiento a todas las cadenas, y define el segundo límite de la deleción. Este proceso puede repetirse muchas veces durante una ronda de síntesis de oligonucleótidos, produciendo poblaciones de oligonucleótidos con muchas deleciones diferentes.

(iv) Sustitución e inserción

En una cuarta realización, las sustituciones e inserciones pueden realizarse durante una síntesis única. En este caso, se utilizan los trinucleótidos 5'-X y 5'-DMT durante una única síntesis de oligonucleótidos. Después de la incorporación de trinucleótidos protegidos de distinta forma, el trinucleótido 5'-DMT se desprotege y, por tanto, se somete a una extensión posterior, mientras que el trinucleótido 5'-X permanece protegido y no se alarga. La eliminación del grupo 5'-X de las cadenas que lo adquieren permite su posterior extensión. De esta forma pueden generarse tanto sustituciones como inserciones en una única síntesis.

Las secuencias mixtas generadas utilizando trinucleótidos para la síntesis de DNA pueden utilizarse en reacciones de mutagénesis de oligonucleótidos convencionales, para producir una mezcla muy compleja de genes mutantes. La selección genética, la búsqueda genética y la secuenciación de los nucleótidos de los genes mutantes identificará las mutaciones individuales, y los sistemas de expresión apropiados permitirán la producción de los correspondientes oligopéptidos, polipéptidos o proteínas mutantes.

Los trinucleótidos (en oposición a los oligonucleótidos que no múltiplos de 3 con respecto a su longitud) ofrecen la ventaja de que sólo se acoplan sobre los oligonucleótidos en las posiciones que se corresponden con los límites del codón. Por tanto, todos los cambios de las secuencias se producirán en el marco de lectura correcto. Otra ventaja es que los trinucleótidos de sustitución e inserción pueden utilizarse en la misma síntesis, permitiendo la generación de mezclas muy complejas de oligonucleótidos capaces de codificar muchos millones de formas mutantes de la proteína que sufre la mutagénesis. Aunque el acoplamiento de trinucleótidos en la secuencia de tipo salvaje resulta útil en la mutagénesis de proteínas, el presente método también puede utilizarse para acoplar oligonucleótidos de diversas longitudes. Ésta es una ventaja frente a las técnicas de la técnica anterior, en las cuales sólo eran posibles sustituciones de monómeros.

En su forma más generalizada, la invención implica acoplar trinucleótidos modificados y activados, para producir una degeneración de la secuencia. Los trinucleótidos añadidos resultan de particular interés en la mutagénesis de proteínas. Para la generación de mutaciones de inserción, puede utilizarse un grupo protector 5'-DMT convencional. Para la generación de mutaciones de sustitución se utiliza un grupo 5'-protector estable, con un esquema de desprotección diferencial u ortogonal.

Un primer objeto de esta invención es generar una mezcla de oligonucleótidos en una única síntesis automática.

Un segundo objeto de esta invención es generar una o más sustituciones de aminoácidos en una secuencia de tipo salvaje.

Un tercer objeto de esta invención es generar una o más inserciones de aminoácidos en una secuencia de tipo salvaje.

Un cuarto objeto de esta invención es generar una mezcla de sustituciones e inserciones de aminoácidos en una secuencia de tipo salvaje.

Un quinto objeto de esta invención es producir enormes variaciones en la secuencia de aminoácidos en una secuencia de tipo salvaje, como la aleatorización in vitro de las regiones variables de genes de inmunoglobulina clonados para producir anticuerpos catalíticos más eficaces.

Un sexto objeto de esta invención es añadir trinucleótidos en sitios seleccionados en una secuencia de genes como sustituciones e/o inserciones.

Breve descripción de las figuras

La figura 1 es un perfil esquemático de las etapas utilizadas para sintetizar una mezcla de oligonucleótidos que contienen inserciones únicas de codones durante un acoplamiento subestequiométrico. El trinucleótido aparece como tres círculos punteados rodeados por un rectángulo. Los componentes básicos monoméricos utilizados antes del acoplamiento del trinucleótido son círculos de punteado más grueso. Los que se añaden después del trinucleótido aparecen como círculos rayados.

La figura 2 es un perfil esquemático de las etapas utilizadas para sintetizar una mezcla de oligonucleótidos que contienen sustituciones únicas de codones durante un acoplamiento subestequiométrico. El trinucleótido y los componentes básicos monoméricos son como se define en la figura 1. X es un grupo protector particularmente estable como se ha definido en el texto.

La figura 3 es un perfil esquemático de las etapas utilizadas para sintetizar una mezcla de oligonucleótidos que contienen deleciones únicas de codones durante un acoplamiento subestequiométrico. El círculo punteado rodeado de un cuadrado es el componente básico de mononucleótido protegido con X, mientras que X es un grupo protector particularmente estable como se ha definido en el texto. Los círculos de punteado más grueso son los componentes básicos monoméricos convencionales acoplados antes de la adición del X-monómero, y los círculos rayados son los tres componentes básicos monoméricos acoplados después de la adición del X-monómero que definen un codón. Los círculos punteados son componentes básicos monoméricos acoplados después de la desprotección del X-monómero.

La figura 4 es un histograma que muestra la distribución y frecuencias de las mutaciones de inserción del codón de alanina y glicina recuperadas en el gen para la nucleasa estafilocócica. Se llevaron a cabo dos experimentos, dirigiendo las inserciones a distintas partes del gen (4A y 4B). El eje horizontal define los límites del codón, y el eje vertical el número de mutantes. Los mutantes de alanina están rayados, y los mutantes de glicina aparecen en la parte blanca de las barras.

Descripción detallada de las realizaciones preferidas

La presente invención suministra un método eficaz para sintetizar oligonucleótidos de secuencia mixta, y también para generar inserciones y sustituciones en genes de secuencias de tipo salvaje. La invención permite el uso de sintetizadores de fase sólida convencionales para producir una mezcla de oligonucleótidos en una única síntesis automática. La invención permite la inserción y/o sustitución de trinucleótidos, a lo largo de un segmento definido de un gen clonado. Cuando se utiliza un trinucleótido (o un oligonucleótido pequeño que tiene una longitud de nucleótidos que es múltiplo de 3), se logran inserciones o sustituciones de codones en fase en el marco de lectura correcto.

La primera realización de la presente invención es el acoplamiento estequiométrico de uno o más trinucleótidos durante una síntesis de DNA automática. De forma típica, la síntesis se lleva a cabo utilizando un sintetizador automático disponible en el mercado. Se utiliza el programa de síntesis normal hasta que resulta necesario acoplar el trinucleótido. En este momento, el programa se suspende y se da la orden al sintetizador para que acceda a una botella colocada en un orificio de entrada adicional que contiene la disolución preparada del trinucleótido. El trinucleótido porta grupos protectores y una posición 3' activada, que son compatibles con la síntesis química de DNA convencional. Por ejemplo, la posición 5' del trinucleótido puede protegerse como un DMT éter, y la posición 3' puede activarse con una fosforamidita. Después, la síntesis continúa de manera normal. Cuando acaba la síntesis, el oligonucleótido se libera de la columna, y las bases y los ésteres de fosfato se desprotegen. Si las bases están protegidas con unas amidas de benzoílo y isobutiroílo convencionales, y los fosfatos en forma de \beta-cianoetil ésteres, puede utilizarse un tratamiento con amoniaco concentrado y caliente para lograr la desprotección completa. Si los fosfatos están protegidos en forma de ésteres metílicos, debe incluirse otra etapa antes del tratamiento con amoniaco caliente, en la cual se logra la desprotección del fosfato, por ejemplo, con tiofenol utilizando condiciones bien establecidas. En una realización preferida, los oligonucleótidos mixtos pueden prepararse utilizando mezclas de trinucleótidos, en lugar de un único trinucleótido, durante el protocolo de síntesis. La síntesis de oligonucleótidos de composición mixta se logra exactamente como se ha descrito arriba, excepto que se accede a una disolución que contiene dos o más trinucleótidos cuando se desea.

La segunda realización de la presente invención, mostrada en la figura 1, se utiliza para insertar trinucleótidos en una secuencia de tipo salvaje durante un acoplamiento subestequiométrico. Esta realización resulta valiosa para producir inserciones de codones en fase, que pueden utilizarse para generar proteínas con estructuras y actividades funcionales modificadas. Tal como aparece en la figura 1, la síntesis del oligonucleótido se inicia a partir de un nucleótido unido a un soporte de fase sólida, y continúa de izquierda a derecha mediante el acoplamiento de mononucleótidos. Cuando la síntesis alcanza una posición en la secuencia de tipo salvaje en la que se va realizar una inserción (es decir, en un límite de un codón), se acopla un trinucleótido que se corresponde con un codón específico a un pequeño porcentaje (aproximadamente 1%) de todas las cadenas de oligonucleótidos en crecimiento. Entonces el grupo protector DMT en el extremo 5' del trinucleótido se retira, y se añaden tres mononucleótidos más a todas las cadenas de oligonucleótidos. En este punto, la síntesis ha avanzado hasta el siguiente límite de codón en la secuencia de tipo salvaje, y el ciclo de (i) acoplamiento subestequiométrico del trinucleótido, seguido de (ii) la eliminación del grupo protector DMT se repite, insertando con ello un trinucleótido en el siguiente sitio diana de la cadena. En efecto, la secuencia "de fondo" del tipo salvaje se sintetiza con el acoplamiento de mononucleótidos, mientras que todos los acoplamientos que implican un trinucleótido producen un mutante de inserción.

Por tanto, la sobreimposición de acoplamientos subestequiométricos de la mezcla de trinucleótidos en posiciones de límites de codones, en una síntesis automática de un oligonucleótido de tipo salvaje de longitud n, que por lo desmás es convencional, genera una mezcla heterogénea de oligonucleótidos. La composición exacta de esta mezcla dependerá del número de acoplamientos de trinucleótidos y su eficacia de acoplamiento. Cualquiera que sea su composición, puede utilizarse una electroforesis en gel de poliacrilamida-urea para fraccionar la mezcla basándose en la longitud, permitiendo separar la banda n + 3 que codifica todas las inserciones únicas de codones, de la banda de tipo salvaje y de otras bandas que codifican inserciones múltiples. Si se desea, en los geles de poliacrilamida-urea pueden separarse también los oligonucleótidos que codifican inserciones múltiples.

Una tercera realización de la presente invención es el acoplamiento subestequiométrico de trinucleótidos para generar mutaciones de sustitución. Aunque esta realización también podría funcionar para la sustitución de un pequeño oligonucleótido de cualquier longitud, se analiza un trinucleótido por su utilidad en la mutagénesis de proteínas. Tal como se perfila en la figura 2, la única modificación requerida es la sustitución del grupo protector 5'-DMT sobre el trinucleótido por un grupo protector 5'-X que sea estable frente a los ácidos débiles y las otras condiciones utilizadas en la síntesis de DNA, pero lábil frente a otras condiciones de desprotección suaves (pueden utilizarse varios grupos protectores, y la siguiente es una lista parcial: (i) levulinato (véase Boom, J.H. y Burgers, P.M.J. (1976), Tetrahedron Lett., 4875-4878), (ii) silil éter (véase Ogilvie, K.K., Schifman, A.L. y Penny, C. (1979), Can J. Chem., 57, 2230-2238), (iii) fluoren-9-ilmetoxicarbonilo (Fmoc) (véase Xu, Y., Lehmann, C., Slim, G., Christodoulou, C., Tan, Z. y Gait, M.J. (1989), Nucl. Acids Res. Symp. Ser., 21, 39-40), (iv) terc-butildimetilsililo, (v) aliloxicarbonilo, (vi) dibromometilbenzoílo, (vii) etilsulfonilo 5'-O-b-sustituido, (viii) tetrahidropiranilo (Thp), (ix) metoxitetrahidropiranilo (Mthp), (x) 1-[(2-cloro-4-metil)fenil]-4-metoxipiperidin-4-ilo (Ctmp), (xi) tritiloxiacetilo y (xii) tetraisopropildisiloxi). Después de acoplar un trinucleótido X-bloqueado a 1-3% de las cadenas, los tres acoplamientos siguientes de monómeros añaden el siguiente codón de tipo salvaje a 97-99% de las cadenas que no han adquirido el trinucleótido, pero no a las cadenas que están acopladas con el trinucleótido. En este momento de la síntesis, la desprotección de todas las cadenas (ácido suave para liberar el DMT; hidrazida acuosa diluida si X es levulinato; fluoruro si X es un silil éter; base diluida si X es Fmoc) produce 1-3% de las cadenas con una sustitución en el codón especificado por el trinucleótido, y 97-99% de las cadenas que áun mantienen la secuencia de tipo salvaje. Al igual que en la estrategia de generar inserciones, la repetición del ciclo básico de un acoplamiento de trinucleótido subestequiométrico, seguido de tres acoplamientos de monómeros estequiométrico, puede utilizarse para introducir mutaciones en cada posición a lo largo del segmento del gen definido por la secuencia del oligonucleótido. Aunque no es posible purificar los oligonucleótidos mutagénicos de los de secuencia de tipo salvaje basándose en el tamaño, sí es posible utilizar componentes básicos de trinucleótido que contienen uno o dos enlaces fosfonato o tiofosfato, permitiendo la purificación basándose en la carga o las propiedades cromatográficas.

También se describe en la presente el uso de monómeros diferencialmente protegidos para la mutagénesis de deleción. Tal como aparece en la figura 3, las deleciones de codones pueden generarse mediante el uso de mononucleótidos X-protegidos, con acoplamientos subestequiométricos seguidos de cuatro ciclos de adiciones de DMT-monómeros antes de la desprotección total. De nuevo, la síntesis se desarrolla con normalidad hasta que se alcanza el límite de un codón que va a ser delecionado. En el límite del codón, se acopla una cantidad subestequiométrica de una fosforamidita del 5'-X-mononucleótido capaz de conservar la secuencia de aminoácidos de tipo salvaje del codón adyacente. Cuatro ciclos de acoplamiento de mononucleótidos convencionales y estequiométricos a todas las cadenas que no han recibido el mononucleótido diferencialmente protegido, sirven para añadir el codón que finalmente será delecionado, más un mononucleótido adicional. En este momento, se elimina el grupo protector 5'-X, y dos rondas más de acoplamiento de mononucleótidos convencional finalizan la síntesis del codón junto al sitio de deleción. Entonces puede repetirse el ciclo completo. Finalmente, se producirá una gran población de oligonucleótidos que codifican deleciones únicas de codones, que entonces pueden utilizarse para dirigir mutaciones como se ha descrito previamente.

Estos esquemas generales pueden resultar útiles en casos en los que se desea una enorme variación de la secuencia, como en la aleatorización in vitro de las regiones variables de genes de inmunoglobulina clonados, para producir anticuerpos catalíticos más eficaces. De forma semejante, los proyectos que buscan desarrollar ligandos de unión fuerte mediante bancos de presentación de fagos, y de presentación de segmentos peptídicos sobre enzimas, pueden utilizar la enorme complejidad de secuencia que puede generarse utilizando trinucleótidos, en especial en las etapas posteriores de optimización de una secuencia de unión inicialmente modesta. Por razones de simplicidad, la realización de la sustitución y la realización de la inserción descritas anteriormente indican una sustitución o inserción de un trinucleótido. Tal como se ha analizado previamente, el uso de un trinucleótido resulta de particular interés cuando se lleva a cabo una sustitución o inserción de un aminoácido. Sin embargo, es posible introducir la degeneración de la secuencia con oligonucleótidos pequeños de cualquier longitud.

La descripción anterior describe en general la presente invención. Puede obtenerse una comprensión más profunda haciendo referencia a los siguientes ejemplos específicos que se incluyen en la presente sólo con fines de ilustración, y no se pretende que limiten el alcance de la invención.

Abreviaturas: Me = metilo, Bz = benzoílo, NiPr2 = N,N-diisopropilo. Por conveniencia, en algunos casos se abrevian los trinucleótidos, por ejemplo, dTdTdT.

Ejemplo 1 Síntesis de trinucleótidos A. Síntesis de 5'-DMT-dCBz-[PO(OMe)]-dT-[PO(OMe)]-dT-3'-[P(OMe)(NiPr2)]

A una disolución de dT-3'-Fmoc (930 mg, 2,0 mmol) (preparada a partir del correspondiente derivado 5'-DMT mediante destritilación catalizada por ácido tricloroacético) y 5'-DMT-dT-3'-[P(OMe)(NiPr2)] (1,5 g, 2,1 mmol) en acetonitrilo anhidro, se añadió tetrazol (150 mg, 2,1 mmol). Después de 30 minutos a temperatura ambiente, el fosfito se oxidó con hidroperóxido de t-butilo (0,31 ml de una disolución al 80% en hidroperóxido de di-t-butilo, 2,5 mmol), y el exceso de tetrazolofosforamidita se extinguió con metanol. La disolución se evaporó, y el grupo DMT se escindió mediante un tratamiento con una disolución de ácido tricloroacético (0,82 g, 5,0 mmol) en diclorometano. El catión DMT se extinguió con una disolución de bicarbonato de sodio 10 mM, y el 5'-HO-dT-[PO(OMe)]-dT-3'-Fmoc se extrajo con diclorometano. La capa orgánica se secó (Na_{2}SO_{4}), se filtró y se evaporó, y el residuo se purificó mediante cromatografía en gel de sílice, utilizando un gradiente de 0-8% de metanol en diclorometano (Rf = 0,30 en metanol al 10%/diclorometano), produciendo 1,1 g (70%) de 5'-HO-dT-3'-[PO(OMe)]-dT-3'-Fmoc.

A una disolución de 5'-HO-dT-3'-[PO(OMe)]-dT-3'-Fmoc purificado (780 mg, 1,0 mmol) y 5'-DMT-dCBz-3'-[P(OMe)(NiPr2)] (950 mg, 1,2 mmol) en acetonitrilo anhidro, se añadió tetrazol (83 mg, 1,2 mmol). Después de 30 minutos a temperatura ambiente, el fosfito se oxidó con hidroperóxido de t-butilo (0,19 ml de una disolución al 80% en hidroperóxido de di-t-butilo, 1,5 mmol), y el exceso de tetrazolofosforamidita se extinguió con metanol. La disolución se evaporó, y el residuo se purificó mediante cromatografía sobre alúmina básica, utilizando un gradiente de 0-8% de metanol en diclorometano (Rf = 0,42 en metanol al 10%/diclorometano), produciendo 790 mg (53%) de 5'-DMT-dCBz-[PO(OMe)]-dT-[PO(OMe)]-dT-3'-Fmoc.

El trinucleótido purificado, totalmente protegido (300 mg, 0,2 mmol), en diclorometano se trató con trietilamina (100 mg, 1,0 mmol) a temperatura ambiente durante 90 minutos, para eliminar el grupo 3'-Fmoc. El trinucleótido 3'-OH (Rf = 0,26 en metanol al 10%/diclorometano) entonces se trató con cloro-N,N-diisopropilaminometoxifosfina (40 mg, 0,3 mmol) a temperatura ambiente durante 30 minutos. El exceso de clorofosfina se extinguió con metanol, la disolución se lavó con agua, se secó (MgSO_{4}), y se recuperó la fosforamidita del trinucleótido mediante precipitación en hexano, produciendo 230 mg (80%) de 5'-DMT-dCBz-[PO(OMe)]-dT-[PO(OMe)]-dT-3'-[P(OMe)(NiPr2)].

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B. Preparación de DNA utilizando 5'-DMT-dCBz-[PO(OMe)]-dT-[PO(OMe)]-dT-3'-[P(OMe)(NiPr2)]

En todos los casos, la síntesis de DNA automática se llevó a cabo en un sintetizador Applied Biosystems ABI 340B o 380B. La fosforamidita se disolvió en acetonitrilo anhidro hasta una concentración de 10 mM, y se colocó en el quinto orificio de entrada del sintetizador. Después del acoplamiento de los tres monómeros a la columna, se suministró el trinucleótido en un procedimiento de acoplamiento doble. Se determinó el rendimiento del acoplamiento midiendo la liberación del catión DMT. Se obtuvo un rendimiento mayor que 95%. Cuando finalizó la síntesis, el heptanucleótido se retiró del soporte sólido, y las bases se desprotegieron mediante tratamiento con amoniaco concentrado acuoso de la manera normal. Una electroforesis en gel de poliacrilamida (20%) y una HPLC (columna C18, acetato de trietilamonio 0,1 M/acetonitrilo) confirmó la formación del heptanucleótido y la ausencia de cualquier secuencia fallida.

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Ejemplo 2 Mutagénesis de inserción A. Procedimiento general para la inserción de un único trinucleótido en el gen para la nucleasa estafilocócica

La síntesis utilizó la rutina de síntesis de 0,2 mmol convencional, modificada para eliminar la etapa de formación del casquete después de la adición subestequiométrica del trinucleótido. Se disolvió la fosforamidita del trinucleótido (25 mg) en acetonitrilo anhidro, y el vial se colocó en el quinto orificio de inyección del sintetizador. Se controlaron las eficacias de acoplamiento de las adiciones del trinucleótido y los monómeros individuales mediante la liberación del grupo 5'-DMT. Se estimó la concentración del oligonucleótido sin purificar a partir de la absorbancia a
260 nm.

Después de la síntesis, 10-15 nmol del oligonucleótido impuro se extrajeron con fenol, se secaron al vacío y se resuspendieron en 5 \mul de NaCl 5 mM, EDTA 1 mM, Tris.HCl 10 mM, pH 8,1 a 65ºC durante 30 minutos. Se añadió un volumen igual de formamida al 95%, EDTA 20 mM, azul de bromofenol al 0,1% y xilenocianol al 0,1%, las muestras se calentaron a 100ºC durante 2 minutos, se cargaron en un gel de poliacrilamida al 15-20% de 0,4 mm de espesor por 42 cm de longitud, y se sometieron a una electroforesis a 750 V hasta el el xilenocianol se encontraba a mitad de camino del gel. El gel se tiñó en bromuro de etidio 2 mg/ml durante 30 minutos, las bandas de oligonucleótidos se visualizaron mediante iluminación UV, se escindió una sección de 0,5-1,0 cm de gel inmediatamente por encima de la banda principal, y se eluyó durante la noche en acetato de sodio 300 mM, EDTA 5 mM a 37ºC. Después de una breve centrifugación para eliminar el material en partículas, la mezcla de oligonucleótidos se precipitó con etanol.

La mezcla de oligonucleótidos impura se marcó de modo radiactivo con [\gamma-^{32}P]ATP utilizando polinucleótido-quinasa, con el fin de confirmar la presencia de la banda n + 3, y para cuantificar su recuperación. Se utilizó aproximadamente 1 pmol de oligonucleótido n + 3 purificado para mutagenizar un fago M13 derivado que contiene uracilo, que porta el gen para la nucleasa estafilocócica. Las placas mutantes se identificaron utilizando un agar indicador cromogénico, y el gen de la nucleasa de cada fago mutante se secuenció en su totalidad mediante el método didesoxi.

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B. Técnica general para la inserción de uno o dos codones

Se llevó a cabo un acoplamiento subestequiométrico de una mezcla de DMT-dGdCdT-fosforamidita y DMT-dGdGdT-fosforamidita durante la síntesis de oligonucleótidos mutagénicos para el gen de la nucleasa estafilocócica. Después de esta reacción, que produjo un acomplamiento de 1-3%, se omitió la etapa convencional de formación de casquete con anhídrido acético (si no fuera así, el 97-99% de las cadenas que no sufrieron reacción se habrían inactivado para más acoplamientos). Las posteriores etapas de oxidación de fosfita y desprotección del grupo 5'-DMT se llevaron a cabo exactamente como en los ciclos de adición de monómeros convencionales. En este momento de la síntesis, 1-3% de las cadenas tenían un codón dGdCdT o dGdGdT adicional en sus extremos 5', mientras que el 97-99% restante tenían una secuencia de tipo salvaje. Después se llevaron a cabo tres ciclos de adición de monómeros, de forma que las cadenas de longitud normal y las cadenas con un codón de más recibieron el siguiente codón de tipo salvaje. De nuevo, se alcanzó un límite de un codón; con el fin de inducir inserciones únicas de codones en esta posición, se llevó a cabo otra ronda de acoplamiento subestequiométrico de la mezcla de trinucleótidos, con la omisión de la reacción de formación de casquete 5'. En este momento de la síntesis, 1-3% de las cadenas había adquirido la segunda inserción de dGdCdT o dGdGdT, 1-3% había adquirido la primera, menos de 0,1% tenía ambas inserciones, y la mayoría restante tenía la secuencia de tipo salvaje. Entonces se llevaron a cabo tres ciclos más de adición de monómeros para unir el siguiente codón de tipo salvaje a todas las cadenas. Se realizaron más acoplamientos de la mezcla de trinucleótidos después de cada tercer acoplamiento de monómeros, hasta que los codones se insertaron en todos los sitios diana. Después se realizaron 6-9 acoplamientos finales de monómeros para aumentar la cantidad de homología con la secuencia de tipo salvaje, necesaria para cebar la síntesis de la segunda cadena sobre un molde de DNA monocatenario por el oligonucleótido.

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C. Uso del trinucleótido dGdCdT para la mutagénesis de inserción de un único codón

Las inserciones del trinucleótido dGdCdT se realizaron en los límites de codones 64/65, 65/66 y 66/67 del gen de la nucleasa estafilocócica. Cuando se utilizó la mezcla de oligonucleótidos purificada para mutagenizar el fago monocatenario, 15% de las placas del fago resultante no tenían actividad nucleasa. De los 24 aislados mutantes que se secuenciaron, 11 tenían una inserción dGdCdT en 65/66, 11 tenían una inserción dGdCdT en 66/67, uno era de tipo salvaje, y uno tenía una única deleción de nucleótido dentro de la secuencia del oligonucleótido, presumiblemente debida a que el oligonucleótido n-1 contaminante no fue eliminado por la etapa de purificación mediante electroforesis en gel. Un experimento idéntico que buscaba las inserciones dGdGdT en estos mismos tres sitios produjo cinco inserciones dGdGdT en 64/65, diez en 65/66, tres en 66/67, uno de tipo salvaje, uno con la deleción de un único nucleótido, y cuatro mutaciones debidas a que el oligonucleótido se apareó en otros sitios del gen de la nucleasa.

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D. Uso de los trinucleótidos dGdCdT y dGdGdT para la mutagénesis de inserción de múltiples codones

La figura 4 muestra los resultados de dos experimentos en los cuales se utilizaron mezclas equimolares (4,1 mM) de 5'-DMT-dGdCdT-fosforamidita y 5'-DMT-dGdGdT-fosforamidita para la mutagénesis de inserción. El histograma muestra la distribución y frecuencias de las mutaciones de inserción de codones de la alanina (que aparece en la parte rayada de la gráfica de barras) y de la glicina (que aparece en la parte en blanco de la gráfica de barras) recuperadas en el gen para la nucleasa estafilocócica. En el primer experimento, se preparó un oligonucleótido de longitud de tipo salvaje n = 29, con las inserciones dirigidas a cada uno de los 5 límites de codones entre los codones 98 y 103 del gen de la nucleasa estafilocócica. Veinticuatro de las 38 placas mutantes contenían inserciones únicas de codones, estando todos los sitios representados menos 99/100 (figura 4A). Trece de los mutantes restantes mostraron una única deleción de un nucleótido dentro de la secuencia del oligonucleótido, que era coherente con una mutagénesis de un oligonucleótido de la banda n-1 contaminante. Además, se descubrió una única inserción de un nucleótido.

En el segundo experimento, se sintetizó un oligonucleótido de longitud de tipo salvaje n = 46 para dirigir inserciones a nueve de los diez límites de codones entre los codones 33 y 43 del gen de la nucleasa estafilocócica. En este caso, 21 de las 37 placas mutantes secuenciadas contenían una única inserción dGdGdT o dGdCdT en un sitio diana; la distribución de estas inserciones aparece en la figura 4B. De nuevo, los principales contaminantes fueron deleciones de un único nucleótido dentro del oligonucleótido (doce aislados), y el resto eran dos inserciones de un sólo nucleótido más dos deleciones mayores.

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Ejemplo 3 Mutagénesis de sustitución A. Síntesis de la fosforamidita del trinucleótido que codifica la leucina con un grupo protector Fmoc (fluoren-9-ilmetoxicarbonilo)

Un trinucleótido que especifica un codón de leucina puede sintetizarse normalmente utilizando la química de fase en disolución convencional. La resuspensión del trinucleótido 5'-OH en piridina seca seguida de la incubación con 1,5 equivalentes de Fmoc-Cl a 0ºC durante una hora, puede producir el trinucleótido 5'-Fmoc protegido con un rendimiento mayor que 50%. Puede utilizarse una RP-HPLC para purificar el trinucleótido 5'-Fmoc, y su estructura puede determinarse utilizando espectroscopía de RMN de ^{1}H (Lehmann, C., Xu, Y., Christodoulou, C., Tan, Z. y Gait, M.J. (1989), Nucl. Acids Res., 17, 2379-2389). Pueden utilizarse los métodos convencionales (véase Balgobin, N. y Chattopadhyaya, J. (1987), Nucleosides and Nucleotides, 6, 461-463) para fosfitilar el trinucleótido 5'-Fmoc y purificar la fosforamidita resultante. La estructura del producto final, 5'-Fmoc-dCBz-[PO(OMe)]-dT-[PO(OMe)]-dT-3'-[P(OMe)(NiPr2)], puede determinarse utilizando espectroscopía de RMN de ^{1}H y ^{31}P, y puede confirmarse mediante secuenciación de DNA de las mutaciones inducidas por el trinucleótido. El producto liofilizado debe almacenarse en porciones de 25 mg bajo una atmósfera de argón, en viales de color ámbar a -70ºC.

B. Sustitución de codones con la 5'-O-Fmoc-dCdTdT-fosforamidita

Los oligonucleótidos pueden sintetizarse en un sintetizador de DNA Applied Biosystems 340B, utilizando la rutina de síntesis de 0,2 \mumol disponible en el mercado. La rutina se modifica para eliminar la etapa de formación de casquete después de la adición subestequiométrica del trinucleótido. Se añade una etapa en la cual se añade DBU (1,8-diazabiciclo-[5.4.0]-undec-7-eno) 100 mM de un vial separado para llevar a cabo la eliminación del grupo protector 5'-Fmoc del trinucleótido acoplado después de tres ciclos de acoplamiento de mononucleótidos posteriores. Las eficacias del acoplamiento de los mononucleótidos y trinucleótidos pueden medirse controlando la absorbancia de los grupos DMT y Fmoc liberados a 498 y 305 nm, respectivamente. El producto final de oligonucleótido que contiene el grupo 5'-DMT puede escindirse del soporte sólido y purificarse del producto truncado mediante RP-HPLC, antes de la eliminación convencional del resto de los grupos protectores.

Puede estimarse la concentración de oligonucleótido a partir de la absorbancia a 260 nm. Puede utilizarse aproximadamente 1 pmol de oligonucleótido purificado para mutagenizar un fago M13 que contiene uracilo (véase Kunkel, T.A. (1985), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 488-492) que porta el gen para la nucleasa estafilocócica. Las placas mutantes pueden identificarse utilizando un agar indicador cromogénico (véase Shortle, D. (1983), Gene, 22, 181-189), y el gen de la nucleasa de cada fago mutante puede secuenciarse en su totalidad mediante el método de terminación de cadena de didesoxinucleótidos (véase Sanger, F., Nicklen, S. y Coulson, A.R. (1977), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 5463-5467).

Ejemplo 4 Mutagénesis de deleción (no se reivindica) A. Síntesis de una fosforamidita del mononucleótido de desoxitimidina con un grupo protector 5'-Fmoc (fluoren-9-ilmetoxicarbonilo)

Una suspensión de desoxitimidina en piridina seca, seguida de una incubación con 1,5 equivalentes de Fmoc-Cl a 0ºC durante una hora, puede producir el mononucleótido 5'-Fmoc protegido con un rendimiento mayor que 50%. Puede utilizarse una RP-HPLC para purificar el mononucleótido 5'-Fmoc, y su estructura puede determinarse utilizando espectroscopía de RMN de ^{1}H (Lehmann, C., Xu, Y., Christodoulou, C., Tan, Z. y Gait, M.J. (1989), Nucl. Acids Res., 17, 2379-2389). Pueden utilizarse los métodos convencionales (véase Balgobin, N. y Chattopadhyaya, J. (1987), Nucleosides and Nucleotides, 6, 461-463) para fosfitilar el mononucleósido 5'-Fmoc y purificar la fosforamidita resultante. La estructura del producto final, 5'-FmocO-dT-3'-[P(OMe)(NiPr2)], puede determinarse utili-zando espectroscopía de RMN de ^{1}H y ^{31}P, y puede confirmarse mediante secuenciación de DNA de las mutaciones inducidas por el mononucleótido. El producto liofilizado debe almacenarse en porciones de 25 mg bajo una atmósfera de argón, en viales de color ámbar a -70ºC.

B. Síntesis de oligonucleótidos con deleción de codón

Los oligonucleótidos pueden sintetizarse en un sintetizador de DNA Applied Biosystems 340B, utilizando la rutina de síntesis de 0,2 \mumol disponible en el mercado. La rutina se modifica para eliminar la etapa de formación de casquete después de la adición subestequiométrica del mononucleótido. Se incluye una etapa en la cual se añade DBU 100 mM de un vial separado para llevar a cabo la eliminación del grupo protector 5'-Fmoc del trinucleótido acoplado después de cuatro ciclos de acoplamiento de mononucleótidos posteriores. Las eficacias del acoplamiento del mononucleótido 5'-Fmoc y del mononucleótido 5'-DMT pueden medirse controlando la absorbancia de los grupos DMT y Fmoc liberados a 498 y 305 nm, respectivamente. El producto final de oligonucleótido puede escindirse del soporte sólido y purificarse en base al tamaño, antes de la eliminación convencional del resto de los grupos protectores.

Puede estimarse la concentración de oligonucleótido a partir de la absorbancia a 260 nm. Puede utilizarse aproximadamente 1 pmol de oligonucleótido purificado para mutagenizar un fago M13 que contiene uracilo, como anteriormente. Las placas mutantes pueden identificarse utilizando un agar indicador cromogénico, y el gen de la nucleasa de cada fago mutante puede secuenciarse en su totalidad mediante el método de terminación de cadena de didesoxinucleótidos, como anteriormente.

Claims (10)

1. \global\parskip0.950000\baselineskip

   1. Un método para preparar una población de moléculas de DNA de secuencias mixtas en una única síntesis de DNA automática, que comprende:

   suspender el acoplamiento de monómeros paso a paso, y

   emplear una población mixta de trinucleótidos, comprendiendo cada uno de dichos trinucleótidos una 3'-fosforamidita, para la incorporación estequiométrica en uno o más límites de codones, para formar dicha población de moléculas de DNA de secuencias mixtas.
2. 2. Un método para insertar una secuencia de trinucleótido en uno o más límites de codones durante la síntesis química de DNA, comprendiendo dicho método las etapas de:

   (a) acoplar subestequiométricamente una secuencia de trinucleótido que porta una 3'-fosforamidita, y un grupo 5'-protector que se escinde bajo las condiciones utilizadas para eliminar los grupos 5'-protectores de los componentes básicos de monómeros,

   (b) escindir todos los grupos 5'-protectores,

   (c) continuar la síntesis de DNA mediante el acoplamiento de, o bien monómeros, o bien secuencias adicionales de trinucleótidos.
3. 3. El método según la reivindicación 2, en el cual se utiliza una mezcla de trinucleótidos.
4. 4. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el cual dicha secuencia de trinucleótido porta un grupo 5'-DMT.
5. 5. Un método para sustituir una secuencia de trinucleótido en uno o más límites de codones durante la síntesis química de DNA, comprendiendo dicho método las etapas de:

   (a) acoplar subestequiométricamente una secuencia de trinucleótido que porta una 3'-fosforamidita, y un grupo 5'-protector que es estable bajo las condiciones utilizadas para eliminar los grupos 5'-protectores de los componentes básicos de monómeros,

   (b) añadir, en tres ciclos de síntesis de mononucleótidos, monómeros seleccionados que portan grupos 5'-protectores convencionales a las moléculas de DNA que no han adquirido dicho trinucleótido que porta un grupo 5'-protector estable,

   (c) escindir el grupo 5'-protector de las moléculas de DNA que han adquirido dicha secuencia de trinucleótido, y, o bien

   - acoplar monómeros adicionales, o

   - repetir la secuencia de etapas desde (a).
6. 6. El método según la reivindicación 5, en el cual se utiliza una mezcla de trinucleótidos.
7. 7. El uso de un trinucleótido en un método según una cualquiera de las reivindicaciones 5 ó 6, portando dicho trinucleótido una posición 5'-protegida, ésteres fosfato protegidos, bases protegidas y una 3'-fosforamidita, en el que dichos grupos protectores son compatibles con la síntesis química convencional de DNA, y en el que dicho grupo 5'-protector es estable frente a las condiciones utilizadas durante la síntesis química de DNA, pero puede escindirse selectivamente cuando se desee.
8. 8. El uso de una mezcla de trinucleótidos en un método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, portando cada trinucleótido una posición 5'-protegida, ésteres fosfato protegidos, bases protegidas y una 3'-fosforamidita, en el que dichos grupos protectores son compatibles con la síntesis química convencional de DNA.
9. 9. El uso de una mezcla de trinucleótidos en un método según la reivindicación 5 ó 6, portando cada trinucleótido una posición 5'-protegida, ésteres fosfato protegidos, bases protegidas y una 3'-fosforamidita, en el que dichos grupos protectores son compatibles con la síntesis química convencional de DNA, y en el que dicho grupo 5'-protector es estable frente a las condiciones utilizadas para eliminar los grupos 5'-protectores de componentes básicos de monómeros.
10. 10. El uso de un trinucleótido en la preparación de una mezcla de trinucleótidos para su uso en un método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, portando cada trinucleótido una posición 5'-protegida, ésteres fosfato protegidos, bases protegidas y una 3'-fosforamidita, en el que dichos grupos protectores son compatibles con la síntesis química convencional de DNA.