PT672136E - Polipeptidos derivados da endonexina 2 tendo actividade receptora do virus da hepatite b e sua utilizacao em diagnostico e composicoes farmaceuticas - Google Patents

Polipeptidos derivados da endonexina 2 tendo actividade receptora do virus da hepatite b e sua utilizacao em diagnostico e composicoes farmaceuticas Download PDF

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Description

Τ' - 692130 r~ U, ^—ç. DESCRIÇÃO "POLIPÉPTIDOS, DERIVADOS DA ENDONEXINA 2, TENDO ACTIVIDADE RECEPTORA DO VÍRUS DA HEPATITE B E SUA UTILIZAÇÃO EM DIAGNÓSTICO E COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS" A invenção refere-se a polipéptidos tendo actividade receptora do vírus da hepatite B (HBV). A invenção refere-se também a novas composições farmacêuticas direccionadas contra a infecção por HBV, bem como a novas composições de vacina contra o HBV. O vírus da hepatite B é um vírus de distribuição mundial, causando importantes problemas médicos tais como doenças de fígado crónicas e carcinoma hepatocelular (Ganem, 1982; Schrõder e Zentgraf, 1990). Juntamente com as viroses de hepatite do pato, esquilo e marmota, ele pertence à família dos Hepadnaviridae com o qual partilha hepatotropismo significativo e especificidade de espécie (Summers e col., 1981; Ganem e Varmus 1987; Leenders e col., 1992). O invólucro de HBV consiste de três glicoproteínas relacionadas (antigénios de superfície ou HBsAg) que diferem no tamanho, sendo todos o produto de um único gene S: (1) uma pequena trans-membrana (glico)proteína de 226 AA, designada "principal" ou pequena proteína S; (2) a "média" proteína ou pequena proteína S com 55 AAs adicionais no N-terminal correspondente à região preS2 do gene S; e (3) a "grande" (glico) proteína de 389 ou 400 AAs consistindo de regiões S + preS2 + preSl (108-119 AA no N-terminal) (Heerman e col., 1984; Robinson e col., 1987). 1 V Γ u
Ο mecanismo pelo qual o HBV se fixa e finalmente entra na célula alvo é pouco conhecido. Foram realizadas várias tentativas para elucidar as interacções das proteínas de invólucro do HBV com a membrana da superfície de célula. Foi sugerido que o HBV reconhece moléculas específicas na superfície de hepatócitos humanos e que o invólucro virai (HBsAg principal, média e grande) pode jogar um papel importante no reconhecimento destas moléculas receptoras.
Theilmann e Goesser (1991) fizeram uma revisão geral da técnica anterior em que são apresentadas provas acrescidas que mostram que a ligação do HBV é mediada pelos epitopos das proteínas pré-S do invólucro do HBV. Com efeito, foi relatado que a região préSl (resíduos de AA 21-47) de HBsAg grande contém um local de ligação para membranas de plasma, derivado da células HepG2 bem como do tecido do fígado humano (Neurath e col., 1986; Pontisso e col., 1989a; Pontisso e col., 1989b; Neurath e col., 1990; Dash e col., 1992; Petit e col., 1992). Além disso, verificou-se que a HBsAg média se ligava especificamente à albumina de soro humano polimerizada (pHSA), dentro da região préS2 (Machida e col, 1984; Pontisso e col., 1989a; Dash e col., 1991). Adicionalmente, o pHSA liga-se aos hepatócitos, embora esta ligação não seja específica da espécie. Foi também demonstrada uma ligação específica da HBsAg principal às células Vero e HepG2 (Kaiser e col., 1986; Peeples e col, 1987), embora esta proteína de superfície do HBV não tenha sido considerada com jogando um papel significativo na entrada virai nos hepatócitos (Pontisso e col., 1989a; Pontisso e col., 1989b).
Foi observado num estudo prévio que a HBsAg principal era susceptível de se ligar especificamente a hepatócitos humanos intactos (Leenders e col., 1990). Pelo contrário, não ocorre ligação específica entre os hepatócitos intactos e a HBsAg grande recombinante, embora seja evidente a ligação específica entre a HBsAg grande e as vesículas da membrana de plasma (Leenders e col., 1990). Além disso, os indivíduos vacinados 2 f u ^ com HBsAg principal são resistentes à infecção por HBV. Adicionalmente, um anticorpo monoclonal de murina, RF-HBs-1, direccionado a uma sequência cíclica dentro do HBsAg principal (Waters e col., 1986) revelou neutralizar a infecção por HBV em chimpanzés (Iwarson e col., 1985) e os anticorpos deste epitopo cíclico estão sempre presentes no soro de pacientes vacinados e pacientes convalescentes a recuperar da infecção por HBV (Waters e col., 1987). Acresce que, os anticorpos monoclonais anti-HBsAg principal mostraram inibir a ligação de partículas virais às células HepG2 com mais eficácia que os anticorpos monoclonais direccionados para o péptido préSl (Petit e col., 1991). Por fim, verificou-se também uma ligação específica de HBsAg principal a células intactas em células do rim de macacos verdes africanos (linha de célula Vero) e linhas de célula HepG2 do hepatoblastoma humano (Peeples e col., 1987; Kaiser e col., 1986). A endonexina II (Anexina V) é um membro da família de proteínas de ligação fosfolípida dependente de Ca2+ estruturalmente relacionadas conhecidas como anexinas, possuindo pesos moleculares compreendidos entre 32 e 67 kDa (Klee, 1988; Zahs e Creutz, 1990). As proteínas individuais nesta família foram descobertas por investigadores que tinham aparentemente os objectivos não relacionados de identificar mediadores de exocitose, componentes do citoesqueleto, inibidores da fosfolipase A2, inibidores da coagulação e da proteína quinase tirosina. As análises de sequência parcial ou integral estabeleceram que existiam pelo menos doze anexinas distintas. Estas proteínas não possuem semelhança estrutural com outras proteínas de ligação a Ca2+ conhecidas tal como a família de proteínas "EF-Hand" (Zaks e Creutz, 1990) .
Os dados de um grande número de laboratórios também mostraram que as anexinas são encontradas em vários tecidos de diferentes espécies (tais como humanos, de rato, bovino, de galinha...) , por exemplo, a sinexina é habitualmente isolada do fígado, mas também está presente na medula adrenal, no 3
V
U t cérebro, no baço e nos leucócitos de sangue periférico (Klee, 1988). A endonexina II é encontrada na placenta, no fígado, no baço, no pulmão e no intestino (Comera e col., 1989; Walker e col., 1990). A endonexina II foi inicialmente detectada como uma proteína intracelular principal que sofreu a ligação dependente de Ca2+ reversível às membranas da placenta (Haigler e col, 1987; Schlaepfer e col., 1987; Funakoshi e col., 1987). Independentemente, a mesma proteína foi identificada como um inibidor in vitro da coagulação sanguínea (Funakoshi e col., 1987; Iwasaki e col., 1987; Grundmann e col., 1988) e da actividade da fosfolipase A2 (Pepinsky e col., 1988). A comparação de sequência mostrou que as proteínas respectivamente referidas como endonexina II (Kaplan e col., 1988) , proteína anticoagulante placental ou PAP (Funakoshi e col., 1987), PP4 (Grundmann e col., 1988), lipocortina V (Pepinsky e col., 1988) e anexina V (Blanchi e col., 1992) são com efeito uma e a mesma proteína que adiante será referida como endonexina II. A utilização clínica da endonexina II para o tratamento de várias condições em que é desejado um efeito anti-inflamatório sem os efeitos secundários adversos dos esteróides bem como a sua utilização no diagnóstico e tratamento de condições clínicas em que é desejável interferir com a estrutura ou função fosfolípida normal (tal como na coagulação sanguínea) foi sugerida no Pedido de Patente Europeia n° EP-A 0 339 285. Além disso, a Patente Europeia n° EP-A 0 330 396 descreve a utilização da lipocortina V no tratamento de doenças artríticas, alérgicas, dermatológicas, oftálmicas e colagénicas. A utilização da proteína anticoagulante vascular (VAC=endonexina II), uma proteína anticoagulante da família anexina, como um agente para a prevenção de metastases de tumores é descrita na Patente n° WO 91/07187. 4
Neste pedido de patente é descrita uma composição farmacêutica contendo VAC como ingrediente activo, de preferência variando entre cerca de 0,01 e cerca de 0,1 mg/kg e mais preferivelmente variando entre cerca de 0,01 a 0,05 mg/kg de peso corporal, administrada por via intravenosa, intramuscular ou subcutânea. A inibição observada in vitro da coagulação sanguínea e da actividade da fosfolipase A2 parece ser devida ao sequestro do substracto fosfolípido para estas enzimas (Haigler e col., 1987; Funakoshi e col., 1987) e pode não reflectir uma função fisiológica da endonexina II. Em Pepinsky e col., 1987, é referido que os ensaios de fosfolipase A2 in vitro, as proteínas do tipo lipocortina são inibitórias; contudo, o mecanismo de inibição permanece controverso. Consequentemente, a função fisiológica real da endonexina II permanece largamente indefinida. Além disso, várias observações suportam o conceito de um papel activo das anexinas na modulação da estrutura da membrana (para revisão ver Karshikov e col., 1992) . A este respeito a anexina V foi descrita como comportando-se como uma proteína de membrana integral (Bianchi e col., 1992). Além disso, provou-se que a endonexina II, quando ligada à membrana, forma canais de catião de tensão controlada selectivos ao cálcio e selecção proeminente para iões Ca2+ (Rojas e col., 1990). A endonexina II possui homologia de sequência extensiva com outros membros da família anexina/lipocortina, particularmente dentro das sequências de consentido que são repetidas 4 vezes dentro de cada proteína. A principal diferença estrutural nestas proteínas é o comprimento variável da região terminal amino (para revisão ver Crompton e col., 1988). As proteínas endonexina II humana e do rato partilham 92% da homologia de sequência (Kaplan e col., 1988; Pepinsky e col., 1988). Além disso, a endonexina II humana e a ancorina CII da galinha (Pfaffle e col., 1988), . uma proteína que se pensa actuar na superfície de célula e que medeia a adesão ao colagénio do componente de matriz extra-celular, possui também surpreendentes semelhanças estruturais (Haigler e col., 1989).
Tal como acima descrito, muitas investigações relacionaram-se com a elucidação de um possível receptor para o HBV presente nos hepatócitos humanos, baseadas principalmente na prova de que a ligação do vírus é mediada por epítopos das proteínas pré-S do invólucro de HBV. Contudo, não foi encontrada prova bioquímica directa quanto à existência de tal receptor. Em oposição a esta teoria, alguns dos dados acima mencionados apontam para a ligação da HBsAg principal (S-proteína) aos hepatócitos humanos intactos bem como às células Vero e HEPG2.
Consequentemente, o objecto da presente invenção consiste em elucidar a natureza de um possível receptor do HBV presente nos hepatócitos humanos, que se liga especialmente à HBsAg grande e/ou principal recombinante e derivada de soro. 0 objecto da invenção é proporcionar polipéptidos e elementos deles derivados tendo actividade de receptor de HBV.
Outro objecto da invenção é proporcionar composições farmacêuticas úteis para a prevenção e tratamento da infecção do vírus da hepatite B.
Outro objecto da invenção é proporcionar novas composições de vacina contra a infecção por HBV.
Outro objecto da invenção é proporcionar novos meios para diagnosticar algumas categorias de infecção por HBV (isto é, indivíduos que se espera desenvolverem uma infecção de fígado crónica).
Outro objecto da invenção é proporcionar um processo de escrutínio que permita a determinação dos ligantes de receptores de HBV incluindo possíveis medicamentos que possam ser utilizados no tratamento da infecção por HBV. 6 U . A invenção refere-se mais particularmente a um processo para a determinação in vitro da ligação entre a endonexina II humana e a HBsAg grande e/ou principal compreendendo a utilização de: um polipéptido tendo a propriedade de ser o receptor da HBsAg grande e/ou principal e contendo ou sendo constituído por: • endonexina II humana; • ou uma muteína derivada da endonexina II humana, sendo a referida muteína de forma a ser susceptível de se ligar à HBsAg grande e/ou principal, • ou um fragmento da endonexina II, * sendo o referido fragmento de forma a ser susceptível de se ligar à HBsAg grande e/ou principal, * ou sendo o referido fragmento de forma a poder ser reconhecido por anticorpos criados contra a endonexina II e susceptível de neutralizar a infecção por HBV, * ou sendo o referido fragmento de forma a ser susceptível de gerar anticorpos susceptíveis de reconhecer a endonexina II ou a HBsAg grande e/ou principal acima mencionadas, ou um polipéptido variante que corresponde ao polipéptido acima mencionado, compreendendo mutações localizadas de forma a que o polipéptido não perca a sua propriedade de ser receptor da HBsAg grande e/ou principal, mais particularmente com péptidos de endonexina II DHTLIRVMVSRSEID, DAYELKHALKGAGTNEKVLTEIIASRTPEELRAIKQVYEEEYGSSLE e DEEKFITIFGTRSVSHLRKVFDKYMTISGFQIEETI, 7 ou um ligante de receptor ou péptido anti-sentido em relação à endonexina II acima mencionada, as suas muteinas, ou os seus fragmentos, ou anticorpos policlonais ou monoclonais direccionados contra a endonexina II, ou contra as muteinas acima definidas ou contra os fragmentos acima definidos, ou anticorpos policlonais ou monoclonais direccionados contra os ligantes de receptores ou péptidos anti-sentido acima mencionados, ou anticorpos anti-idiotipo criados contra a endonexina II, ou contra as muteinas acima definidas, ou contra os fragmentos acima definidos, ou anticorpos anti-anti-idiotipo criados contra a endonexina II, ou contra as muteinas acima definidas, ou contra os fragmentos acima definidos, ou anticorpos anti-idiotipo criados contra o ligante de receptor ou péptido anti-sentido acima definidos, ou anticorpos anti-anti-idiotipo criados contra o ligante de receptor ou péptido anti-sentido acima definidos, ou substâncias que sejam activas nas células que sejam transferidas pelos genes ou fragmentos de gene que codificam pelo menos um dos polipéptidos tendo uma propriedade de ser um receptor da HBsAg grande e/ou principal, ou que codificam pelo menos uma das muteinas ou fragmentos acima definidos.
Os presente inventores foram capazes de isolar ' e caracterizar o receptor de HBV presente na membrana de plasma hepatócito humano como sendo a endonexina II. As partículas de HBV infecciosas purificadas são apenas susceptíveis de obtenção em pequenas quantidades a partir do sangue de indivíduos infectados. 0 procedimento de purificação para a obtenção de quantidades suficientes de partículas de HBV infecciosas purificadas é difícil sem a perda das propriedades destas partículas. Por conseguinte, a presente invenção utilizou de preferência partículas derivadas de plasma de 22 nm não infeccioso e partículas consistindo de HBsAg recombinante derivada de levedura, que estão disponíveis em quantidade muito superiores (McAleer e col., 1984). Estas 8 (p U ^^ partículas contêm apenas a proteína de invólucro de HBsAg grande e/ou principal do HBV. A endonexina II humana é, por exemplo, descrita em Kaplan e col. (1988).
Na presente invenção, a expressão "endonexina II humana" refere-se à "endonexina II do fígado humano". A expressão "polipéptido tendo a propriedade de ser o receptor da HBsAg grande e/ou principal" corresponde ao facto de o polipéptido poder ligar-se à HBsAg grande e/ou principal sob as condições acima definidas. A natureza da ligação é por exemplo determinada pela possibilidade do DSS (suberato de disuccinimidilo) poder actuar como um ligante transversal ideal. Em consequência, a interacção de ligação entre a endonexina II e a HBsAg grande e/ou principal é de modo a que as moléculas possam interagir com uma distância de interacção de 11,4 Á.
Deverá notar-se que as condições de ligação acima mencionadas são dadas a título de exemplo e podem ser modificadas pelo especialista dentro dos limites de modo a que a função de ligação permaneça equivalente à definida para as condições acima mencionadas. 0 termo "muteína derivada da endonexina II humana" que é susceptível de se ligar à HBsAg grande e/ou principal pode ser experimentalmente identificado nas seguintes condições: aproximadamente 15 ng (0,44 pmoles) de muteína marcada como 125I são incubados durante 1 hora à temperatura ambiente com 1 pg de HBsAg grande e/ou principal, que foi revestida por furo de uma placa de micro-titulação; a ligação específica é considerada como ocorrendo se for obtida pelo menos 40%, de preferência 50% ou mais de inibição com um excesso de endonexina II humana não 9
marcada (2 pg); a inibição de ligação é medida lavando-se primeiro os furos da placa de microtitulação e contando-se subsequentemente a quantidade de radioactividaderesidual. A expressão "fragmento de endonexina II" que é susceptivel de se ligar à HBsAg grande e/ou principal pode ser experimentalmente identificado nas seguintes condições: aproximadamente 0,44 pmoles de fragmento marcado com 125I são incubados durante 1 hora à temperatura ambiente com 1 pg de HBsAg grande e/ou principal, que foi revestida por furo de uma placa de microtitulação; a ligação especifica é considerada como ocorrendo se for obtida pelo menos 40%, de preferência 50% ou mais de inibição com um excesso de endonexina II humana não marcada (2 pg) ; a inibição de ligação é medida lavando-se primeiro os furos da placa de microtitulação e contando-se subsequentemente a quantidade de radioactividade residual.
Os exemplos de fragmentos de endonexina II susceptíveis de se ligarem à HBsAg grande e/ou principal estão incluídos na secção de exemplos do presente pedido e incluem mais particularmente os péptidos designados como F e S tendo as seguintes sequências de aminoácidos: Péptido F : DHTLIRVMVSRSEID (pico F) Péptido S : DAYELKHALKGAGTNEKVLTEIIASRT-PEELRAIKQVYEEEYGSSLE (pico S) e péptido : DEEKFITIFGTRSVSHLRKVFDKYMTISGFQIEETI (picos L e N) O termo "ligante receptor" corresponde a um ligante específico, ou parte de um ligante, tendo a propriedade de ligação a uma endonexina II de fígado humano; a propriedade de ligação a uma endonexina II de fígado humano pode ser testada da seguinte forma: 10 rr U, HBsAg grande e/ou principal radiomarcada é incubada durante 1 hora à temperatura ambiente com uma suspensão contendo aproximadamente 50.000 hepatócitos humanos; a ligação especifica é considerada como ocorrendo se for obtida pelo menos 40%, de preferência 50% ou mais de inibição adicionando quantidades acrescidas de um ligante receptor; a inibição de ligação é medida lavando-se primeiro a suspensão de hepatócitos e contando-se subsequentemente a quantidade de radioactividade residual; como um controlo negativo, as células omissas de endonexina II humana - por exemplo, hepatócitos de rato - são incubadas com o ligante receptor radiomarcado tal como acima descrito.
As ilustrações preferidas de ligantes receptores incluem por exemplo péptidos anti-sentido tal como abaixo definido, bem como possíveis medicamentos que se liguem especificamente à endonexina II do fígado humano presente nas membranas de plasma de hepatócitos. 0 termo "péptido anti-sentido" é revisto por Blalock (1990) e por Roubos (1990) . A este respeito, a teoria de reconhecimento molecular (Blalock, 1990) refere que não apenas interagem as sequências de ácido nucleico complementares mas que, além disso, os locais de interacção nas proteínas são compostos por sequências de aminoácido complementares (ligante sentido-receptor ou péptidos sentido-anti-sentido). Assim, dois péptidos derivados das sequências de ácido nucleico complementares na mesma estrutura de leitura mostrarão uma permuta total dos seus aminoácidos hidrofóbicos e hidrofílicos quando a terminação amino de um está alinhada com a terminação carboxi do outro. Este padrão hidropático invertido pode permitir que dois desses péptidos assumam conformações complementares responsáveis para interacção especifica. O termo "ligante receptor" corresponde a qualquer ligante susceptível de reconhecer a endonexina II humana presente nas 11 f u membranas de plasma de hepatócitos humanos. 0 termo anticorpos anti-hidiotipo contra endonexina II humana refere-se a anticorpos monoclonais criados contra determinantes antigénicos da região variável de anticorpos monoclonais criados contra a endonexina II humana. Estes determinantes antigénicos de imunoglobulinas são conhecidos como idiotipos (conjuntos de idiotipos) e podem, por conseguinte, ser considerados como a "impressão digital" de um anticorpo (para revisão ver de Préval, 1978; Fleishmann e Davie, 1984). Os métodos para a produção de anticorpos anti-idiotipicos monoclonais foram descritos por Gheuens e Macfarlin (1982) e estão documentados na secção de Exemplos do presente pedido. Os anticorpos anti-idiotipicos monoclonais possuem a propriedade de formarem um complexo imunológico com o idiotipo do anticorpo monoclonal contra o qual eles foram criados. A este respeito, o anticorpo monoclonal é referido como Abl, e o anticorpo anti-idiotípico é referido como Ab2. 0 Ab2 para a endonexina II humana, ou para muteínas ou fragmentos dela derivados podem assim reconhecer o local de ligação receptor no HBV, e podem consequentemente bloquear este local de ligação HBV, prevenindo assim a anexação e infecção do HBV.
Os anticorpos anti-idiotipicos (Ab2) podem eles próprios ser utilizados como antigénios para produzir anticorpos anti-anti-idiotípicos (Ab3) para estes polipéptidos que podem servir como substitutos para Abl. A expressão "anticorpos anti-anti-idiotipo contra a endonexina II humana" refere-se a anticorpos criados contra a região variável de anticorpos anti-idiotipo contra a endonexina II humana. A invenção refere-se também a uma composição farmacêutica para utilização na infecção da hepatite contendo, como substância activa, pelo menos um dos seguintes produtos: 12
um polipéptido tendo a propriedade de ser o receptor da HBsAg grande . e/ou principal, contendo o receptor ou sendo constituído por: • uma muteína derivada da endonexina II humana, sendo a referida muteina de forma a ser susceptível de se ligar à HBsAg grande e/ou principal, • ou um fragmento da endonexina II humana, * sendo o referido fragmento de forma a ser susceptível de se ligar à HBsAg grande e/ou principal; * ou sendo o referido fragmento de forma a poder ser reconhecido por anticorpos criados contra a endonexina II humana e susceptível de neutralizar a infecção por HBV, * ou sendo o referido fragmento de forma a ser susceptível de gerar anticorpos susceptíveis de reconhecer a endonexina II acima referida ou um polopéptido variante que corresponda ao polipéptido acima definido, compreendendo mutações localizadas de forma a que o polipéptido não perca a sua propriedade de ser receptor da HBsAg grande e/ou principal, mais particularmente com péptidos de endonexina DHTLIRVMVSRSEID, DAYELKHALKGAGTNEKVLTEIIASRTPEELRAIKQVYEEEYGSSLE e DEEKFITIFGTRSVSHLRKVFDKYMTISGFQIEETI, ou um ligante ou péptido anti-sentido em relação ao receptor acima definido, sendo o referido ligante acima definido ou anticorpos policlonais ou monoclonais, de preferência anticorpos monoclonais humanos, contra os ligantes ou péptidos anti-sentido tal como acima definidos, ou anticorpos anti-idiotipo criados contra a endonexina II humana, ou contra as muteínas acima definidas, ou contra os 13
ΐ fragmentos acima definidos, ou anticorpos anti-anti-idiotipo criados contra a endonexina II humana, ou contra as muteinas acima definidas, ou contra os fragmentos acima definidos, ou anticorpos anti-idiotipo criados contra o ligante receptor ou péptido anti-sentido acima definidos, ou anticorpos anti-anti-idiotipo criados contra o ligante tal como acima definido ou péptido anti-sentido tal como acima definido, ou substâncias que sejam activas nas células que sejam transfectadas pelos genes ou fragmentos de gene que codificam pelo menos um dos polipéptidos tendo uma propriedade de ser um receptor da HBsAg grande e/ou principal, ou que codificam pelo menos uma das muteinas tal como acima definidas ou fragmentos tal como acima definidos. A expressão "versões humanizadas de anticorpos monoclonais de rato" corresponde a anticorpos monoclonais realizados por meio de tecnologia de ADN recombinante, a partir de partes de sequências de ADN genómicas de rato e/ou humanas que codificam para cadeias H e L ou a partir de clones de ADNc que codificam para cadeias H e L. A expressão "anticorpos monoclonais humanos contra os ligantes receptores ou péptidos anti-sentido" refere-se a anticorpos monoclonais preparados por exemplo por meio de linfócitos sanguíneos periféricos humanos (PBL) repopulação de imuno deficiência combinada severa (SCID) de ratinho (para revisão recente ver Duchosal e col., 1992). Em resumo, os ratinhos-SCID são repopulados com um sistema hematopoiético humano (susceptível de gerar todas as células B humanas). Após a repopulação, estes ratinhos-SCID são por exemplo imunizados com HBV, induzindo a formação de anticorpo monoclonal humano. Alternativamente, os anticorpos monoclonais humanos podem ser preparados retirando células B de um paciente convalescente a recuperar da infecção por HBV, contendo possivelmente células B que tenham reagido ao HBV, e de preferência, transportando ou guardando Ig com capacidade de neutralização, e 14 ι f U κ—^ imortalizando estas células B com a utilização do virus de Eppstein-Barr (EBV) ou a transfecção de retrovírus. Alternativamente, as mesmas células B ou uma reserva de células de glóbulos brancos de diferentes pessoas, não necessariamente infectadas com HBV, são retiradas e é preparada uma biblioteca de ADNc (ou total mas preferencialmente por PCR de modo a que seja formada apenas a cadeia H de ADNc e a cadeia C de ADNc) a partir de mARN isolado. Por fim, os fagos CADNH e os fagos cADNL são combinados e pode ser executado um escrutínio para IgG anti-HBV recombinante.
Os anticorpos monoclonais humanos contra a endonexina II humana, ou as suas muteínas, ou os seus fragmentos, podem ser obtidos imunizando-se em primeiro lugar um paciente com um fragmento ou uma muteína da endonexina II humana - susceptível de induzir uma resposta imune no paciente -, retirando células B deste paciente e repopulando os ratinhos-SCID com estas células B. Aquando da imunização destes ratinhos-SCID repopulados com a mesma endonexina II fragmentada ou mutada, podem ser obtidas grandes. quantidades de anticorpos monoclonais humanos da endonexina II, tal como acima definido.
Nas muteínas da endonexina II na presente invenção, podem ser substituídos os seguintes aminoácidos, tal como mostrado no Quadro 1. 15
QUADRO I
Amino ácidos Grupos sinónimos Ser Ser, Thr, Gly, Asn Arg Arg, His, Lys,. Glu, Gin Leu Leu, Ile, Met, Phe, Vai, Tyr Pro Pro, Ala, Thr, Gly Thr Thr, Pro, Ser, Ala, Gly, His, Gin Ala Ala, Pro, Gly, Thr, Vai Vai, Met, Ile, Tyr, Phe, Leu, Vai Gly Gly, Ala, Thr, Pro, Ser Ile Ile, Met, Leu, Phe, Vai, Ile, Tyr Phe Phe, Met, Tyr, Ile, Leu, Trp, Vai Tyr Tyr, Phe, Trp, Met, Ile, Vai, Leu Cys Cys, Ser, Thr His His, Gin, Arg, Lys, Glu, Thr Gin Gin, Glu, His, Lys, Asn, Thr, Arg Asn Asn, Asp, Ser, Gin Lys Lys, Arg, Glu, Gin, His Asp Asp, Asn, Glu Glu Glu, Gin, Asp, Lys, Asn, His, Arg Met Met, Ile, Leu, Phe, Vai
As substâncias de acordo com esta realização preferida da invenção competem com a endonexina II humana presente na membrana de plasma de hepatócitos para o local de ligação da endonexina II no HBV. Estes polipéptidos, muteinas e fragmentos são farmacologicamente activos na medida em que bloqueiam o local de ligação HBV da endonexina II humana presente nos hepatócitos humanos, e protegem assim o hepatócito da anexação e infecção pelo virus. 0 ligante receptor ou péptidos anti-sentido da invenção possuem as propriedades de competição com o virus para a ligação de HBV presentes na(s) molécula(s) do receptor de HBV de endonexina II. Este ligante receptor ou péptidos anti- sentido são farmacologicamente activos na medida em que bloqueiam o ponto de ligação do HBV da endonexina II humana presente nos hepatócitos humano, e protege assim o hepatócito da fixação e infecção do vírus.
Os anticorpos anti-idiotipo criados contra a endonexina II ou contra as suas muteínas ou contra os fragmentos tal como acima definidos reconhecem o local de ligação receptor no HBV e podem consequentemente bloquear este local de ligação do HBV, prevenindo assim a anexação e infecção pelo HBV.
Os anticorpos anti-anti-idiotipo criados contra a endonexina II humana ou contra as suas muteínas ou contra os fragmentos tal como acima definidos são concorrentes com o vírus e são farmacologicamente activos na medida em que eles bloqueiam o local de ligação de HBsAg da endonexina II humana dos hepatócitos, e protegem os hepatócitos do vírus. A expressão "o local de ligação de HBV" refere-se mais especificamente ao local de ligação de HBsAg.
Os anticorpos anti-idiotipo criados contra o ligante receptor ou péptidos anti-sentido são concorrentes com o vírus e são farmacologicamente activos na medida em que eles bloqueiam o local de ligação da HBsAg da endonexina II humana dos hepatócitos e protege os hepatócitos do vírus.
Os anticorpos policlonais ou monoclonais bem como os anticorpos anti-anti-idiotipo criados contra o ligante receptor ou péptidos anti-sentido concorrem com a endonexina II humana nos hepatócitos e são farmacologicamente activos na medida em que eles bloqueiam o local de anexação daendonexina II do vírus e impedem que ele ataque os hepatócitos.
As versões humanizadas de anticorpos monoclonais de rato bem como anticorpos monoclonais humanos criados contra a endonexina II, ou as suas muteínas, ou os seus fragmentos, 17
concorrem com o HBV para o local de ligação de HBV do receptor HBV, endonexina II, e podem ser farmacologicamente eficazes para o tratamento ou prevenção de doenças e/ou infecções causadas pelo HBV na medida em que eles bloqueiam o local de ligação HBV da endonexina II, e protegem assim os hepatôcitos da anexação e infecção pelo HBV. Este tipo de composição farmacêutica pode ser bastante útil para pacientes com HBV crónicos que tenham de sofrer transplante de fígado. A composição farmacêutica da invenção pode ser preferencialmente utilizada para o tratamento de portadores de HBV crónicos ou portadores que estejam infectados de forma crónica e/ou aguda com HBV.
De acordo com uma realização preferida, a quantidade de substância activa nas composições farmacêuticas da invenção é equivalente a uma dosagem de endonexina II compreendida entre cerca de 0,6 e cerca de 50 mg/kg de peso corporal, e de preferência entre cerca de 1 e cerca de 30 mg/kg de peso corporal e mais preferivelmente entre 10 e 15 mg/kg de peso corporal. O modo de administração destas composições farmacêuticas é enteral ou parenteral, isto é, intravenoso, intraperitoneal, intramuscular ou subcutâneo, sendo preferida a administração intravenosa.
As substâncias activas destas composições farmacêuticas podem ser administradas sozinhas, sem um veículo; contudo, elas podem também ser administradas com veículos ou diluentes não tóxicos farmaceuticamente aceitáveis, cujas proporções são determinadas pela adequação e natureza química do veículo particular. A invenção refere-se também a composições de vacina contendo, como substância activa, muteínas ou fragmentos de endonexina tal como acima definida, mais particularmente os 18
V péptidos de endonexina DHTLIRVMVSRSEID, DAYELKHALKGAGTNEKVLTEIIASRTPEELRAIKQVYEEEYGSSLE e DEEKFITIFGTRSVSHLRKVFDKYMTISGFQIEETI. A invenção refere-se também a composições de vacina contendo, como substância activa, * ligantes receptores ou péptidos anti-sentido tal como acima definidos, * ou anticorpos anti-idiotipo criados contra o ligante receptor ou péptidos anti-sentido tal como acima definidos.
As composições de vacina de HBV de acordo com a presente invenção que contêm quer muteinas quer fragmentos de endonexina tal como acima definidos ou ligantes receptores ou péptidos anti-sentido ou anticorpos anti-idiotipico contra os ligantes receptores e péptidos anti-sentido possuem certas vantagens sobre as composições de vacina para HBV já conhecidas, dado que são mais susceptíveis de originar uma resposta imune naqueles pacientes infectados pelo HBV que não respondiam às composições de vacina para HBV já conhecidas.
As composições de vacina da técnica anterior são, por exemplo, descritas em Hilleman e col. (1983) (partículas preparadas a partir de soro de portadores de HBV cronicamente infectados), em McAleer e col. (1984) (vacina de levedura recombinante) e são revistas por Theilmann e Goesser (1991).
Nas composições de vacina da presente invenção, a substância activa está presente numa quantidade de locais de ligação de endonexina II equivalente a 10-100 μg de HBsAg ou aproximadamente 0,1 nmoles a 1 fimole de substância activa por kg de peso corporal por imunização, de preferência 0,1 nmoles a 100 nmoles, mais preferivelmente 1 nmoles a 100 nmoles. 19
De acordo com uma realização vantajosa da invenção, os ánticorpos estão presentes de preferência numa quantidade compreendida entre 10 μς e 1 mg/kg de peso corporal.
Os polipéptidos da invenção podem ser preparados pela cultura de uma célula hospedeira num meio adequado que tenha sido previamente transformado por um vector recombinante que codifica para os polipéptidos produzidos pelo referido hóspede celular transformado da cultura acima referida.
Os polipéptidos e mais particularmente os péptidos da invenção podem também ser preparados por síntese química clássica. A síntese pode ser efectuada numa solução homogénea ou numa fase sólida.
Por exemplo, a técnica de síntese em solução homogénea que pode ser utilizada é a descrita por Houbenweyl no livro intitulado "Methode der organischen chemie" (Método de química orgânica) editado por E. Wunsh, vol. 15-1 e II, THIEME, Estugarda, 1974.
Os polipéptidos da invenção podem ser preparados na fase sólida de acordo com os métodos descritos por Atherton e Shepard no seu livro intitulado "Solid phase peptide synthesis" (IRL Press, Oxford, 1989).
Os péptidos anti-sentido podem ser preparados tal como descrito em Ghiso e col. (1990). Por meio desta tecnologia é possível construir logicamente um péptido tendo uma relevante interacção fisiológica com um péptido conhecido por análise de sequências de nucleótidos simples para complementaridade, e síntese do péptido complementar ao local de ligação.
Os anticorpos monoclonais da invenção podem ser produzidos por qualquer hibridoma susceptível de ser formado de acordo com métodos clássicos para células do baço de um 20 p U, ^^ animal, particularmente um rato ou ratazana, imunizado contra a endonexina II ou suas muteínas ou seus fragmentos ou ligante receptor ou péptidos anti-sentido acima definidos por um lado e de células de uma linha de células de mieloma por outro lado, e a serem escolhidos pela capacidade do hibridoma em produzir os anticorpos monoclonais que reconhecem os polipéptidos que foram inicialmente utilizados para a imunização dos animais.
Os anticorpos envolvidos na invenção podem ser marcados com uma marca adequada do tipo enzimática, fluorescente ou radioactiva.
Os anticorpos anti-idiotipo criados contra a endonexina II humana ou contra as suas muteínas, ou contra os fragmentos tal como acima definido, ou anticorpos anti-anti-idiotipo criados contra a endonexina II humana ou contra as suas muteínas, ou contra os fragmentos tal como acima definido, ou as versões humanizadas de anticorpos monoclonais de rato ou anticorpos monoclonais humanos contra a endonexina II humana, ou contra as suas muteínas, ou contra os fragmentos tal como acima definido, podem ser preparados tal como acima mencionado.
Os anticorpos anti-idiotipo criados contra o ligante receptor ou péptidos anti-sentido tal como acima definido, ou anticorpos anti-anti-idiotipo criados contra o ligante receptor ou péptidos anti-sentido tal como acima definido ou anticorpos monoclonais humanos criados contra os ligantes receptores ou os péptidos anti-sentido, podem ser preparados tal como acima mencionado.
Para efectuar a expressão dos polipéptidos da invenção numa bactéria, tal como Eh coli ou numa célula eucariótica tal como cerevisiae, ou em hóspedes vertebrados ou invertebrados tais como células de insecto, "Chinese Hamster 21 t ^ ^^
Ovary" (CHO), células COSI, BHK e MDCK, são realizados os seguintes passos: transformação de um hóspede celular adequado com um vector, em particular um plasmídio, um cosmidio, um fago ou um virus (vacina A ou B), em que é inserida uma sequência de nucleótidos que codifica para um dos polipéptidos da invenção (suplemento) sob o controlo de elementos reguladores adequados, particularmente um promotor reconhecido pela polimerase do hóspede celular e, no caso de um hóspede procariótico, um local de ligação do ribosomas adequado (RBS), permitindo a expressão no referido hóspede celular da referida sequência de nucleótidos, cultura do referido hóspede celular transformado em condições que permitam a expressão do referido suplemento.
Para a expressão em leveduras, os elementos reguladores podem compreender os promotores de 3-fosfoglicerato quinase ou outras enzimas glicoliticas, poliadenilação adequada e sinais de terminação, bem como uma origem adequada de replicação. Os vectores de expressão para células cultivadas incluem uma origem de replicação, um promotor localizado em frente ao gene a ser expresso, um local de início de translacção, locais de união de ARN, um local de poliadenilação, e sinais de terminação transcripcional.
Para a expressão em E, coli, os elementos reguladores deverão compreender todos os sinais necessários para transcrição e translação. Eles podem compreender um promotor, quer sintético quer derivado de uma fonte natural, que é funcional em E. coli. Os exemplos de promotores largamente utilizados para a expressão em E. coli são os promotores lac, trp, tac e lambda PI e Pr. Eles podem também compreender um local de ligação de ribosoma, quer sintético quer derivado de uma fonte natural, que permite a translação e consequentemente a expressão de uma sequência codificadora a jusante. 22
A invenção refere-se também a um processo para a detecção da capacidade de uma molécula em se comportar como um ligante receptor em relação a qualquer um dos polipéptidos receptores tal como acima definidos ou a qualquer dos péptidos de endonexina II tal como acima mencionado e caracterizado por: colocar-se em contacto a molécula com um hóspede celular que tenha sido previamente transformado por um vector ele próprio modificado por um suplemento que codifica para um dos polipéptidos acima referidos, suportando o hóspede na sua superfície um ou mais locais específicos para este polipéptido, se necessário após contactar-se a expressão do referido suplemento, sendo o referido contacto efectuado sob condições que permitam a formação de uma ligação entre pelo menos um dos locais específicos acima referidos e a referida molécula, se esta última apresentar uma afinidade em relação ao referido polipéptido, detectar-se o complexo possivelmente formado do tipo ligante-polipéptido ou dos péptidos da endonexina II tal como acima mencionado.
Deverá compreender-se que na presente invenção a expressão "ligante" significa "ligante receptor". A este respeito pode ser desenvolvido um processo de escrutínio para novos medicamentos anti-hepatite. A invenção refere-se também a um processo para a detecção da afinidade dos polipéptidos tal como definidos ou dos péptidos da endonexina II tal como acima mencionados para um vários ligantes receptores, caracterizado por: transformar-se uma célula hospedeira adequada com um vector, em particular um plasmídio ou um fago, em que foi previamente inserida uma sequência de nucleótidos que codifica para um dos polipéptidos ou péptidos acima definidos (suplemento) sob o controlo de elementos reguladores, 23 ( ^ ^ particularmente um promotor reconhecido pela polimerase da célula hóspede e permitindo a expressão da referida sequência de nucleótidos na referida célula hóspede, cultivar-se a célula hospedeira transformada sob condições que permitam a expressão do referido suplemento, e o transporte do referido polipéptido que foi expresso em direcção à membrana de modo a que as sequências necessárias para interacção com o ligante sejam expostas à superfície da célula hospedeira transformada, contactar-se esta célula hospedeira com ligantes determinados, detectar-se uma reacção de afinidade entre a referida célula hospedeira transformada e os referidos ligantes determinados. 0 processo acima descrito permite também a identificação dos fragmentos acima definidos e que contém apenas parte da sequência da endonexina II.
Esta identificação consiste em utilizar-se suplementos mais pequenos do que o ácido nucleico que codifica para endonexina II na realização das fases relativas à expressão, transporte do produto de expressão e exposição do produto de expressão à membrana da célula hospedeira transformada. Quando forem obtidos a expressão, o transporte do produto da expressão e a sua exposição à membrana, bem como a reacção com os ligantes tal como previamente definidos, é possível determinar os referidos fragmentos. Consequentemente a ausência de reacção com os ligantes, tal como previamente definida, por utilização de fragmentos de tamanho mais pequeno que o tamanho da sequência completa, mostraria que alguns locais essenciais tinham sido eliminados. A invenção refere-se também a um dispositivo de detecção da possível afinidade de um ligante em relação a qualquer um dos polipéptidos da invenção, contendo o referido dispositivo: 24 p Ui jfes*.—^ uma cultura de hospedeiras celulares transformados por um vector modificado tal como acima definido ou a preparação de membranas dos referidos hospedeiros celulares, meio físico ou químico para induzir a expressão da sequência nucleotidica contida no vector modificado quando o promotor colocado a montante desta sequência é um promotor susceptivel de ser induzido pelo referido meio físico ou químico, e para se obter uma proteína, um ou vários ligantes de controlo tendo determinadas afinidades para o polipéptido acima referido, meios físicos ou químicos para a caracterização da actividade biológica da proteína expressa. A invenção refere-se também a um processo para o escrutínio de medicamentos susceptíveis de serem utilizados no tratamento da infecção por HBV. A invenção refere-se também a um processo para a detecção in vitro da HBsAg grande e/ou principal compreendendo: contactar-se uma amostra biológica susceptivel de conter HBV com uma quantidade fixa de (i) endonexina II humana; ou suas muteínas, ou um seu fragmento tal como acima definido e mais particularmente os péptidos de endonexina: DHTLIRVMVSRSEID, DAYELKHALKGAGTNEKVLTEIIASRT- PEELRAIKQVYEEEYGSSLE e DEEKFITIFGTRSVSHLRKVFDKYMTISGFQIEETI e uma quantidade fixa de (ii) um de entre o ligante receptor, ou o péptido anti-sentido tal como acima definido e actuando como um concorrente da HBsAg, sob condições que permitam a formação de um complexo entre (i) a endonexina II humana ou a sua contraparte funcional tal como acima definida e (ii) o ligante receptor ou o péptido anti-sentido e entre a endonexina humana II e a HBsAg grande e/ou principal, e cada componente (i) ou (ii) transportando uma marca detectável e sendo cada componente possivelmente imobilizado, detecção da qualidade de complexo possivelmente formado entre (i) endonexina II humana ou a sua contraparte funcional 25 f ^ ^-- e (ii) ο ligante receptor, ou os péptidos anti-sentido, e o complexo formado entre (i) a endonexina II humana ou a sua contraparte funcional e (ii) a HBsAg grande e/ou principal, deduzir-se a quantidade de HBV que está presente na referida amostra à medida que diminui a formação de complexo em relação a uma amostra de controlo conhecida como sendo isenta de HBV. A amostra biológica que pode ser utilizada inclui todo o tipo de fluidos corporais ou materiais de biópsia de preferência amostras sanguíneas, mais preferivelmente amostras de soro e/ou de plasma. A invenção refere-se também a um processo para a determinação in vitro de danos hepato-celulares numa amostra biológica tomada a partir de um tecido corporal (biópsia), plasma ou soro compreendendo: contactar-se uma amostra biológica susceptivel de conter endonexina II humana a partir de hepatócitos danificados, * quer com uma placa revestida com um ligante receptor ou péptidos anti-sentido tal como acima definidos, * ou com uma placa revestida com anticorpos policlonais e/ou monoclonais, de preferência monoclonais humanos ou versões humanizadas de monoclonais de rato, dirigidas contra a endonexina II humana ou contra as muteínas da endonexina II humana tal como acima definidas, ou contra os fragmentos derivados da endonexina II humana tal como acima definidos, • ou com uma placa revestida com anticorpos anti-idiotipo criados contra a endonexina II humana, ou contra as muteínas da endonexina II humana tal acima definido, ou contra os fragmentos derivados endonexina II humana tal como acima definido, 26 jl· ^ • ou com uma placa revestida com anticorpos anti-idiotipo criados contra o ligante receptor, ou péptidos anti-sentido tal como acima definido, detectar-se o complexo formado quer entre a endonexina II humana e o ligante receptor ou péptidos anti-sentido, quer entre a endonexina II humana e os anticorpos monoclonais ou policlonais, quer entre a endonexina II humana e os anticorpos anti-anti-idiotipo acima definidos quer entre a endonexina II humana e os anticorpos anti-idiotipo acima definidos. A este respeito, o dano hepatocelular é conhecido como ocorrendo por mecanismos imunológicos ou patogénicos tóxicos e em particular no caso de infecção de fígado crónica causada pelo HBV, e mais especificamente, no caso de cirrose do fígado e carcinoma hepatocelular. Consequentemente, a técnica de determinação in vitro pode ser utilizada para diagnosticar e monitorizar o estado da doença. A invenção refere-se também a um dispositivo de diagnóstico para a determinação in vitro de HBV contendo: pelo menos uma microplaca para a deposição na mesma de um produto compreendendo: * endonexina II humana ou as suas muteínas tais como acima definidas, ou fragmentos derivados da endonexina II humana tais como acima definidos, e mais particularmente os péptidos de endonexina: DHTLIRVMVSRSEID, DAYELKHALKGAGTNEKVLTEIIASRTPEELRAIKQVYEEEYGSSLE e DEEKFITIFGTRSVSHLpVFDKYMTISGFQIEETI, * ou anticorpos anti-idiotipo criados contra a endonexina II humana, ou contra as suas muteínas tais como acima definidas, ou contra os fragmentos derivados da endonexina II humana tais como acima definidos, 27
Lr t uma preparação contendo a amostra a ser diagnosticada e susceptivel de conter a HBsAg, juntamente com um concorrente da HBsAg, tal como: * um ligante receptor ou péptido anti-sentido tal como acima definidos ou, * anticorpos monoclonais ou policlonais, . de preferência monoclonais humanos ou versões humanizadas de monoclonais de rato, contra a endonexina II humana, ou contra as muteinas da endonexina II humana tal como acima definidas, ou contra os fragmentos derivados da endonexina II humana tal como acima definidos, e mais particularmente os péptidos de endonexina: DHTLIRVMVSRSEID, DAYELKHALKGAGTNEKVLTEIIASRTPEELRAIKQVYEEEYGSSLE e DEEKFITIFGTRSVSHLRKVFDKYMTISGFQIEETI, * ou anticorpos anti-anti-idiotipo criados contra a endonexina II humana, * ou anticorpos anti-idiotipo criados contra o ligante receptor ou péptidos anti-sentido tal como acima definidos, soluções tampão adequadas para efectuar a reacção entre a HBsAg e o produto depositado na placa, marcadores adequados para a determinação do complexo formado ente a HBsAg e o produto depositado na placa.
De acordo com uma realização alternativa, a microplaca pode também conter nela depositado: ou anticorpos policlonais ou monoclonais, de preferência monoclonais humanos, dirigidos contra o ligante receptor ou péptidos anti-sentido tal como acima definidos, ou anticorpos anti-anti-idiotipo criados contra o ligante receptor ou péptidos anti-sentido tal como acima definidos. A invenção refere-se também a um dispositivo de diagnóstico para a determinação in vitro da endonexina II contendo: 28 pelo menos uma microplaca para deposição na mesma de um produto contendo: * um ligante receptor ou péptidos anti-sentido tal como acima definidos ou, * anticorpos monoclonais ou policlonais, de preferência monoclonais humanos ou versões humanizadas de monoclonais de rato, dirigidos contra a endonexina II humana, ou contra as muteinas da endonexina II humana tal como acima definidas, ou contra os fragmentos derivados da endonexina II humana tal como acima definidos e mais particularmente os péptidos de endonexina: DHTLIRVMVSRSEID, DAYELKHALKGAGTNEKVLTEIIASRTPEELRAIKQVYEEEYGSSLE e DEEKFITIFGTRSVSHLRKVFDKYMTISGFQIEETI,
* anticorpos anti-anti-idiotipo criados contra a endonexina II humana, ou contra as muteinas da endonexina II humana tal como acima definidas, ou contra os fragmentos derivados da endonexina H humana tal como acima definidos e mais particularmente os péptidos de endonexina: DHTLIRVMVSRSEID, DAYELKHALKGAGTNEKVLTEIIASRTPEELRAIKQVY-EEEYGSSLE e DEEKFITIFGTRSVSHLRKVFDKYMTISGFQIEETI uma preparação contendo a amostra a ser diagnosticada, possivelmente em conjunto com um concorrente da endonexina II humana, tal como: ' * anticorpos policlonais ou monoclonais criados contra o ligante receptor ou péptidos anti-sentido tal como acima definidos, * ou anticorpos anti-idiotipo criados contra' a endonexina II humana, ou contra as muteinas da endonexina II humana, ou contra os fragmentos derivados da endonexina II humana tal como acima definidos e mais particularmente os péptidos de endonexina: DHTLIRVMVSRSEID, DAYELKHALKGAGTNEKVLTEIIASRTPEELRAIKQVYEEEYGSSLE e DEEKFITIFGTRSVSHLRKVFDKYMTISGFQIEETI ou, 29
* anticorpos anti-idiotipo criados contra o ligante receptor ou péptidos anti-sentido tal como acima definidos, uma preparação contendo a amostra a ser diagnosticada, possivelmente em conjunto com um concorrente da endonexina II humana que é procurado, tal como: * anticorpos policlonais ou monoclonais, de preferência anticorpos monoclonais humanos, criados contra o ligante receptor ou péptidos anti-sentido tal como acima definidos, * ou anticorpos anti-idiotipo criados contra a endonexina II humana, ou contra as muteinas da endonexina II humana tal como acima definidas, ou contra os fragmentos derivados da endonexina II humana tal como acima definidos, * ou anticorpos anti-anti-idiotipo criados contra o ligante receptor ou péptidos anti-sentido tal como acima definidos, solução tampão adequada para efectuar as reacções imunológicas entre a endonexina II humana e o produto depositado na placa, marcador adequado para detectar a formação de um complexo ente a endonexina II humana e o produto depositado na placa.
Este tipo de dispositivo seria útil para o diagnóstico e monitorização do estado de doença de infecções de fígado crónicas. A invenção refere-se também à utilização de: • um polipéptido tal como acima definido, • ou um ligante receptor ou péptido anti-sentido tal como acima definidos, • ou de anticorpos policlonais ou monoclonais, de preferência anticorpos monoclonais humanos ou versões humanizadas de anticorpos monoclonais de rato, criados contra a endonexina II humana tal como acima definida, ou 30
V
U contra as suas muteinas tal como acima definidas, ou contra os seus fragmentos tal como acima definidos e mais particularmente os péptidos de endonexina: DHTLIRVMVSRSEID, DAYELKHALKGAGTNEKVLTEIIASRTPEELRAIK- QVYEEEYGSSLE e DEEKFITIFGTRSVSHLRKVFDKYMTISGFQIEETI, ou de anticorpos anti-idiotipo contra a endonexina II humana tal como acima definida, ou contra as suas muteinas tal como acima definidas, ou contra os seus fragmentos tal como acima definidos e mais particularmente os . péptidos de endonexina: DHTLIRVMVSRSEID, DAYELKHALKGAGTNEKVLTEIIASRTPEELRAIK- QVYEEEYGSSLE e DEEKFITIFGTRSVSHLRKVFDKYMTISGFQIEETI, ou anticorpos anti-anti-idiotipo contra a endonexina II humana tal como acima definida, ou contra as suas muteinas tal como acima definidas, ou contra os seus fragmentos tal como acima definidos e mais particularmente os péptidos de endonexina: DHTLIRVMVSRSEID, DAYELKHALKGAGTNEKVLTEIIASRTPEELRAIK- QVYEEEYGSSLE e DEEKFITIFGTRSVSHLRKVFDKYMTISGFQIEETI, ou anticorpos anti-idiotipo criados contra os péptidos anti-sentido tal como acima definidos, ou anticorpos anti-anti-idiotipo contra o ligante receptor ou os péptidos anti-sentido tal como acima definidos, ou as substâncias tal como acima definidas, para a preparação de um medicamento útil para o tratamento da hepatite B. A invenção refere-se também à utilização de: um polipéptido tal como acima definido, ou um ligante receptor ou péptido anti-sentido tal como acima definidos, ou de anticorpos policlonais ou monoclonais, de preferência anticorpos monoclonais humanos ou versões humanizadas de anticorpos monoclonais de rato, criados contra a endonexina II humana tal como acima definida, ou 31 contra as suas muteinas tal como acima definidas, ou contra os seus fragmentos tal como acima definidos e mais particularmente os péptidos de endonexina: DHTLIRVMVSRSEID, DAYELKHALKGAGTNEKVLTEIIASRTPEELRAIK- QVYEEEYGSSLE e DEEKFITIFGTRSVSHLRKVFDKYMTISGFQIEETI,
• ou de anticorpos anti-idiotipo contra a endonexina II humana tal como acima definida, ou contra as suas muteinas tal como acima definidas, ou contra os seus fragmentos tal como acima definidos e mais particularmente os péptidos de endonexina: DHTLIRVMVSRSEID, DAYELKHALKGAGTNEKVLTEIIASRTPEELRAIK- QVYEEEYGSSLE e DEEKFITIFGTRSVSHLRKVFDKYMTISGFQIEETI,
• ou anticorpos anti-anti-idiotipo contra a endonexina II humana tal como acima definida, ou contra as suas muteinas tal como acima definidas, ou contra os seus fragmentos tal como acima definidos e mais particularmente os péptidos de endonexina: DHTLIRVMVSRSEID, DAYELKHALKGAGTNEKVLTEIIASRTPEELRAIK- QVYEEEYGSSLE e DEEKFITIFGTRSVSHLRKVFDKYMTISGFQIEETI, • ou anticorpos anti-idiotipo criados contra os péptidos anti-sentido tal como acima definidos, • ou anticorpos anti-anti-idiotipo contra o ligante receptor ou os péptidos anti-sentido tal como acima definidos, • ou as substâncias tal como acima definidas, para a preparação de uma vacina contra a infecção da hepatite B. A invenção refere-se também à utilização de: • um polipéptido tal como acima definido, • ou um ligante receptor ou péptido anti-sentido tal como acima definidos, • ou de anticorpos policlonais ou monoclonais contra a endonexina II humana tal como acima definida, ou contra as suas muteinas tal como acima definidas, ou contra os seus fragmentos tal como acima definidos e mais 32
u, particularmente os péptidos de endonexina: DHTLIRVMVSRSEID, DAYELKHALKGAGTNEKVLTEIIASRTPEELRAIK- QVYEEEYGSSLE e DEEKFITIFGTRSVSHLRKVFDKYMTISGFQIEETI,
• ou de anticorpos anti-idiotipo contra a endonexina II humana tal como acima definida, ou contra as suas muteinas tal como acima definidas, ou contra os seus fragmentos tal como acima definidos e mais particularmente os péptidos de endonexina: DHTLIRVMVSRSEID, DAYELKHALKGAGTNEKVLTEIIASRTPEELRAIK- QVYEEEYGSSLE e DEEKFITIFGTRSVSHLRKVFDKYMTISGFQIEETI,
• ou anticorpos anti-anti-idiotipo contra a endonexina II humana tal como acima definida, ou contra as suas muteinas tal como acima definidas, ou contra os seus fragmentos tal como acima definidos e mais particularmente os péptidos de endonexina: DHTLIRVMVSRSEID, DAYELKHALKGAGTNEKVLTEIIASRTPEELRAIK- QVYEEEYGSSLE e DEEKFITIFGTRSVSHLRKVFDKYMTISGFQIEETI, • ou anticorpos anti-idiotipo criados contra os péptidos anti-sentido tal como acima definidos, • ou anticorpos anti-anti-idiotipo contra o ligante receptor ou os péptidos anti-sentido tal como acima definidos, • ou as substâncias tal como acima definidas, para a preparação de meios de diagnóstico da infecção do virus da hepatite B.
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
Figura 1 Autoradiograma de uma análise SDS-PAGE de proteínas ligadas à HBsAg principal recombinante revestida numa placa de microtitulação (linhas 1-4) e à BSA revestida na mesma placa (linhas 5-6).
Linhas 1-2: Ligação de proteínas de membrana de plasma humano marcadas com 125I, na ausência (linha 1) e na presença (linha 2) de excesso de proteínas de membrana de plasma não marcadas. 33
Linhas 3-4: Ligação de proteínas de membrana de plasma de ratazana marcadas com 125I, na ausência (linha 3) e na presença (linha 4) de excesso de proteínas de membrana de plasma não marcadas.
Linhas 5-6: Ligação de proteínas de membrana de plasma humano marcadas com 1Z5I a furos revestidos com BSA na ausência (linha 5) e na presença (linha 6) de excesso de proteínas de membrana de plasma não marcadas.
Figura 2A Electroforese de gel de duas dimensões de uma fracção de proteína de 34 kD, isolada por PAGE preparativo de proteínas de membrana de plasma humano. A proteína relativamente ácida, com um valor pH de 4,1 (seta) foi identificada como a proteína de ligação HBsAg principal, (ver também a figura 2B)
Figura 2B Autoradiograma de análise IEF/SDS-PAGE de proteína de membrana de plasma humano marcada com 125I após a ligação à HBsAg principal imobilizada em pratos ELISA de ligação forte, lavagem e eluição. 0 ponto único na figura corresponde à proteína com PM de 34 kD e valor pH de 4,1. (ver também a figura 2A)
Figura 3 Padrão de eluição de péptidos separados por HPLC de fase invertida após hidrólise ácida limitada de proteína de 34 kD numa matriz de gel. Esta proteína de 34 kD foi obtida a partir de electroforese de gel de duas dimensões tal como indicado na figura 2. As fracções de pico indicadas pelas setas foram analisadas para sequências de aminoácidos e utilizadas para pesquisa de bases de dados.
Figura 4 Autoradiograma de análise de SDS-PAGE da E-II do fígado humano ligada à HBsAg principal recombinante, imobilizada em pratos ELISA de ligação forte na ausência ou presença de concorrentes. Foi utilizado E-II de fígado humano marcada com 125I na ausência (linha 1) de ou na presença (linha 2) de excesso de E-II não marcada e, noutras experiências, na 34 y ^ ^ presença de excesso de HBsAg principal recorabinante (linha 3), ou excesso de proteínas de plasma de fígado humano não marcadas (linha 4) . A pré-incubação de E-II marcada com IgG anti-E-II de coelho (1:200) inibiu a ligação da E-II à HBsAg principal (linha 5). Não foi verificada inibição quando a pré-incubação foi efectuada com IgG pré-imune (linha 6) . A E-II representa a endonexina II.
Figura 5 Ligação da E-II radiomarcada (cpm) à HBsAg principal na presença de concentrações variadas de IgG anti-E-II de coelho (·-·) ou concentrações comparáveis de IgG pré-imune de coelho (—) .
Figura 6 Ligação de endonexina II radiomarcada (cpm) à HBsAg principal e à BSA, imobilizada na fase sólida. As linhas 1 e 2 representam a ligação de 10 ng de endonexina II de fígado humano radiomarcada à HBsAg principal e à BSA respectivamente. As linhas 3 e 4 representam os resultados da mesma experiência com 10 ng de endonexina II de fígado de ratazana radiomarcada.
Figura 7 Ligação específica de HBsAg principal radiomarcada a hepatócitos humanos cultivados na presença e na ausência de concorrentes. A linha 1 representa a ligação específica de HBsAg radiomarcada na ausência de concorrente (controlo). A linha 2 representa a ligação de HBsAg principal radiomarcada na presença de endonexina II. A linha 3 representa a ligação de HBsAg radiomarcada na presença de uma proteína de controlo (IgG de rato).
Figura 8
Painel esquerdo. Autoradiograma de análise SDS-PAGE de experiências de ligação cruzada utilizando endonexina II marcada com 125I e HBsAg principal recombinante ou derivada de soro imobilizada na fase sólida. A ligação cruzada da endonexina II à HBsAg principal recombinante 35
(linha 3) ou derivada de soro (linha 4) na presença de DSS resultou num complexo de proteína marcada adicional com um peso molecular de aproximadamente 90 kD. A linha 1 (HBsAg recombinante) e a linha 2 (HBsAg derivada de soro) representam experiências de controlo na ausência de ligante cruzado.
Painel direito. Autoradiograma de análise SDS-PAGE de experiências de ligação cruzada utilizando endonexina II radiomarcada e endonexina II não marcada (linha 1), BSA (linha 3), Asialof etuina (linha 4) ou HBsAg (linha 2) respectivamente em solução. Apenas na experiência em que se utilizou a HBsAg principal foi observada na SDS-PAGE uma banda adicional com um peso molecular aparente de 90 kD. As bandas com um peso molecular de 68 kD representam um dímero da endonexina II de fígado humano. Este dímero não foi visto na PAGE, quando foram realizadas as experiências de ligação cruzada utilizando HBsAg imobilizada na fase sólida.
Figura 9 Ligação de 15 ng da endonexina II de fígado humano radiomarcada a hepatócitos humanos (Barras 1 a 4) e de ratazana (Barras 5 a 8) em suspensão como percentagem de controlo (Barra 1 e 5) . As barras 2-4 e 6-8 expressam a ligação da endonexina II de fígado humano radiomarcada na presença de excesso de (2 μg) de endonexina II não marcada (Barras 2 e 6), excesso (2 μg) de HBsAg principal não marcada (Barras 3 e 7) e excesso (2 μg) de BSA não marcada (Barras 4 e 8) .
Figura 10 Mostra a ligação da endonexina II humana radiomarcada a hepatócitos humanos (quadrados) e de ratazana (+) como percentagens de controlo na presença de concentrações variadas de endonexina II humana não marcada.
Figura 11 Ligação de HBsAg principal radiomarcada a hepatócitos (50.000) intactos humanos (Barras 1 a 5) e de ratazana (Barras 6 a 10) na presença e ausência de concorrentes. As barras 1 (1.500 cpm) e 6 (500 cpm) 36
representam a ligação de HBsAg radiomarcada na ausência de concorrente. As barras 2 (600 cpm) e 7 (480 cpm) representam a ligação na presença de excesso (2 μg) de HBsAg não marcada. A barra 3 (900 cpm) e a barra 8 (900 cpm) representam a ligação da HBsAg radiomarcada quando os hepatócitos foram primeiramente incubados com HBsAg radiomarcada previamente à adição de excesso (7 μg para hepatócitos humanos, 2 μg para hepatócitos de ratazana) de E-II de fígado humano não marcada. As barras 4 (960 cpm) e 9 (1.000 cpm) representam os resultados quando a HBsAg radiomarcada e o excesso (7 μg, 2 μg) de E-II de fígado humano não marcada foram pré-incubados previamente à adição às células. A barra 5 (600 cpm) e a barra 10 (500 cpm) representam os resultados quando os hepatócitos foram incubados com excesso (7 μg, 2 μg) de E-II previamente à adição da HBsAg às células. Embora a ligação seja apresentada como percentagem, deverá notar-se que existe uma diferença significativa entre os hepatócitos humanos e de ratazana para a ligação de HBsAg radiomarcada. E-II representa endonexina II.
Figura 12 Análise SDS-PAGE de endonexina II expressa de levedura. As células foram colhidas, rompidas e centrifugadas. A linha 1 mostra a presença de grandes quantidades de uma proteína de 34 kD (endonexina II) na fracção citoplasmática. Após tratamento EGTA e re-centrifugação das pastilhas de células, a endonexina II associada à membrana é também libertada no sobrenadante (linha 2) . As linhas 3 a 8 mostram fracções que foram eluídas a partir de uma coluna de permuta de iónica de celulose DE-52.
Figura 13 Análise de manchas de "western" da endonexina II de fígado humano purificada (linha 1) e endonexina II recombinante (linha 2) . A detecção foi realizada com anticorpos anti-endonexina II humana de coelho e um anticorpo anti-peroxidase de porco conjugada com coelho. O soro pré-imune do mesmo coelho não reagiu com a endonexina II recombinante (linha 3). 37 t' u
Figura 14 Autoradiograma de análise IEF/SDS-PAGE de endonexina II de fígado humano radiomarcada (painel esquerdo) e endonexina II derivada de levedura recombinante (painel direito). Não podem ser demonstradas diferenças no peso molecular (34 kD) ou ponto iso-eléctrico (4,1).
Figura 15 Autoradiograma de análise SDS-PAGE de endonexina II de fígado humano (linha 1) e recombinante (linha 2) ligada à HBsAg principal de fase' sólida. Foi adicionada endonexina II recombinante radiomarcada na presença de excesso de HBsAg principal não marcada (linha 3) ou endonexina II de fígado humano não marcada (linha 4) para determinar a especificidade de ligação. Não foi observada nestes casos a ligação da endonexina II recombinante, nem após pré-incubação com anticorpos de anti-endonexina II (linha 5) nem quando a Albumina de Soro de Bovino foi imobilizada na fase sólida (linha 6) . A pré-incubação da proteína radiomarcada com soro pré-imune não afectou a ligação à HBsAg (linha 7).
Figura 16 análise SDS-PAGE de experiências de ligação cruzada entre a endonexina II de fígado humano radiomarcada (linha 1) ou recombinante (linha 2) e HBsAg principal de fase sólida. A ligação cruzada resultou num complexo marcado específico com um peso molecular de aproximadamente 90 kD. A linha 3 representa experiências de controlo sem ligante cruzado.
Figura 17 Resposta anti-endonexina II (Painel A) e anti-HBs (painel B) em coelhos pré-imunizados (círculo aberto, quadrado aberto, triângulo aberto) e em coelhos imunizados com endonexina II de fígado humano (· nativa, recombinante) ou endonexina II de fígado de ratazana (Δ preto) tal como determinado por ensaios ELISA.
Figura 18 Especificidade da actividade anti-HBs (Painel B) e anti-endonexina II (Painel A) em soro de coelho imunizado com endonexina II de fígado humano. Painel A: quando o 38
u antisoro foi incubado com HBsAg principal (·-·) , com endonexina II (-) ou com BSA (Δ preto) respectivamente antes do ensaio ELISA utilizando HBsAg principal imobilizada na fase sólida. Painel B: experiências similares quando antisoro foi incubado com endonexina II de fígado humano (- -) , com HBsAg (·—·) ou com BSA (Δ—Δ) respectivamente antes do ensaio ELISA utilizando endonexina II de fígado humano imobilizada na fase sólida.
Figura 19 Separação de anticorpos, fazendo reagir com HBsAg principal ou endonexina II recombinante, por cromatografia de afinidade em endonexina II recombinante purificada, ligada à Sepharose activada por CNBr. A reactividade anti-HBs (0—0) foi verificada predominantemente nas fracções de passagem de fluxo (1-6) enquanto que a reactividade anti-endonexina II (·--·) foi verificada exclusivamente nas fracções eluídas (14-17) tal como determinado pelo ensaio ELISA.
Figura 20 Reactividade de soro de coelho imunizado com endonexina II de fígado humano em mancha-ponto imune. Painel A: HBsAg recombinante (1) e endonexina II de fígado humano (2). Painel B: soro pré-imune do mesmo coelho. Painel C: após separação de anticorpos utilizando cromatografia de afinidade (coluna de endonexina II), a actividade anti-endonexina II foi capturada. Painel D: Anticorpos anti-HBs purificados por afinidade (Ab2) reconhecem a HBsAg recombinante (1) bem como a derivada de soro (2).
Figura 21
Painel esquerdo: Imunoprecipitação de HBsAg principal radiomarcada por soro de coelho imunizado com E-II de fígado humano. A linha 1 representa a imunoprecipitação de controlo de HBsAg principal radiomarcada com anticorpos anti-HBs de ovelha. A imunoprecipitação de HBsAg principal radiomarcada por anticorpos anti-HBs 39 ^ (AB2) purificados por afinidade (linha 2; com soro pré-imune (linha 3) ou com anticorpos anti-HBs (Ab2) de coelho purificados por afinidade na presença de excesso de HBsAg não marcada (linha 4) está representada como uma percentagem de imunoprecipitação com anticorpos anti-HBs policlonais.
Painel direito: Imunoprecipitação de endonexina II de fígado humano radiomarcada por anticorpos anti-E-II de coelho. A linha 1 representa imunoprecipitação de E-II de fígado humano radiomarcada com anticorpos anti-E-II purificados por afinidade. A imunoprecipitação da E-II de fígado humano radiomarcada com soro pré-imune (linha 2) ou com anticorpos anti-E-II de fígado humano na presença de excesso de HBsAg não marcada (linha 3) está representada como uma percentagem de imunoprecipitação utilizando anticorpos anti-E-II purificados. E-II refere-se à endonexina II.
Figura 22 Concorrência entre a HBsAg radiomarcada e não marcada para a ligação a anticorpos anti-idiotípicos e entre anticorpos anti-idiotípicos e a E-II de fígado humano para ligação à HBsAg principal radiomarcada. A pré-incubação de anticorpos anti-idiotípicos na fase sólida com diluição em série de HBsAg não marcada (0—0), previne a ligação da HBsAg radiomarcada (cpm) ao anticorpo anti-idiotípico. Quando a HBsAg radiomarcada é pré-incubada com diluições em série de E-II (·-·) na presença de Ca2+ e Mg2+ foi observada uma inibição comparável para a ligação da HBsAg radiomarcada ao anticorpo anti-idiotípico. Os valores de cpm médios de ligação nas experiências de controlo estão representadas por um losango preto cruzado por uma barra vertical.
Figura 23A Ensaio de inibição de pico F: Ligação de E-II de fígado humano radiomarcada à HBsAg principal, imobilizada na fase sólida, na presença de fracções de péptido obtidas por HPLC de fase inversa da E-II de fígado humano hidrolisada. As linhas (+) e (-) representam a ligação de E-II radiomarcada na 40 Γ ^ ^^ ausência e na presença de E-II de fígado humano intacta respectivamente. As linhas (A) a (Y) representam a ligação de E-II radiomarcada na presença da respectiva fracção separada por HPLC. E-II refere-se à endonexina II.
Figura 23B Desenvolvimento da actividade anti-HBs numa galinha imunizada com fragmento Fab de IgG anti-E-II de coelho.
Actividade anti-HBs (Ab2) () e anti-IgG de coelho (·) de imunoglobulinas da gema (IgY) de ovos de galinhas imunizadas com fragmento Fab de , imunoglobulinas de gema pré-imunes anti-E-II de coelho. Para estes ensaios, a HBsAg e a IgG de coelho foram respectivamente imobilizadas na fase sólida. As absorvâncias são lidas a A450 nm. E-II refere-se à endonexina II.
Figura 23C Concorrência entre Ab2 radiomarcada (cpm), gerada por E-II nativa (Ab2/E-II), e outra Ab2 para ligação à HBsAg principal.
Ligação da Ab2 radiomarcada (cpm), gerada por imunização de coelhos com E-II (Ab2/E-II), à HBsAg principal na fase sólida na presença ou ausência de Ab2 gerada pela imunização de coelhos com péptido F sintético ou IgG anti-Hbs de galinha ocorrida após imunização com fragmento Fab de IgG anti-E-II de coelho. A pré-incubação da HBsAg principal imobilizada com diluições em série de Ab2/E-II () ou Ab2/F (·) (gerada por péptido F sintético), previne a ligação de Ab2/E-II radiomarcada à HBsAg principal. A IgG de coelho (Δ) irrelevante não previne a ligação. E-II refere-se à endonexina II.
Figura 23D Pré-incubação da HBsAg principal com Ab2/Fab () (gerada por IgG anti-E-II de coelho), ou ligação na presença de diluições em série da HBsAg principal (·) , também previne a ligação da Ab2/E-II radiomarcada (cpm) à HBsAg principal. E-II refere-se à endonexina II. 41
V
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EXEMPLOS
MATERIAIS E MÉTODOS
Isolamento das membranas do plasma do figado humano
Foi obtido tecido de figado humano a partir de dadores de órgãos falecidos. O tecido de figado humano foi mantido a 4°C, cortado em pedaços de 1 cm3, congelado rapidamente em azoto liquido, e guardado a -80°C até ao processamento. 0 isolamento das membranas de plasma foi efectuado de acordo com o método de Hubert e col. (1983) com pequenas modificações como descrito por Leenders e col. (1990).
De um modo resumido, foram descongelados 30 g de tecido de figado a 4°C em tampão de 0,25 M de STM (0,25 M) e homogeneizou-se num "Warner-Blendor" seguido de uma homogeneização de Dounce. O homogeneizado foi filtrado através de um filtro de "nylon" de malha 100, o filtrado foi ajustado a 20% (p/v) com tampão de 0,25 M de STM e centrifugou-se a 300 g (4°C) durante 10 min. A pastilha resultante foi re-suspensa num volume mínimo de tampão de 0,25 M de STM, homogeneizou-se num homogeneizador de Dounce e centrifugou-se de novo durante 10 min a 300 g. Foram combinados ambos os sobrenadantes e centrifugou-se a 1500 g (4°C) durante 10 min. A pastilha resultante foi re-suspensa num volume mínimo de tampão de 0,25 M de STM e foi adicionado tampão de 2 M de STM (2 M de sacarose; 5 mM de Tris pH 7,2; 1 mM de MgCl2; 0,1 mM de PMSF) até se ter atingido uma densidade de 1,18 g/mL. Para se obter um volume duplo do volume inicial da suspensão foi adicionado tampão de 1,42 M de STM (1,42 M de sacarose; 5 mM de Tris pH 7,2; 1 mM de MgCl2; 0,1 mM de PMSF).
Foi colocada uma camada de quatro mililitros do tampão de 0,25 M de STM em 25 ml da suspensão e submeteu-se o conjunto a centrifugação, utilizando um rotor SW 27, a 82000 g (4°C) durante 1 h. Foram recolhidas as membranas de plasma, as quais 42
V
Lsj flutuavam na interfase, levou-se o conjunto a uma densidade de 1,05 g/ml com o auxílio de tampão de 0,25 M de STM e submeteu- se o conjunto a centrifugação a 20000 g (4°C) durante 25 min, utilizando um rotor TÍ50.2. A pastilha resultante foi re- suspensa num volume mínimo de tampão de 0,25 M de STM, congelada em azoto líquido e guardada a -80°C até ser utilizada.
Extracção das proteínas da membrana de plasma
Foram extraídas proteínas das membranas de plasma utilizando o detergente não-desnaturante CHAPS (Hjelmeland, 1980) (1-propanossulfonato de 3-[(3-colamidopropil)dimetil-amónio] (Bio-Rad, Richmond, CA, EUA). A suspensão de membranas de plasma foi tratada com um volume igual de CHAPS-tampão de extracção (40% de glicerol; 0,2 M de tampão de fosfato de potássio pH 7,2; 20 mM de CHAPS) durante 30 min à temperatura ambiente. O sobrenadante, obtido por meio de centrifugação a 10, 000 rpm durante 10 min, foi dialisado durante a noite (4°C) contra uma solução salina tamponada com fosfato (PBS). A concentração de proteínas do extracto foi medida de acordo com Bradford (Bradford, 1976), utilizando o Ensaio de Proteínas Bio-Rad.
Radiomarcação das proteínas de membranas de plasma
Foram marcados dois microgramas de proteínas de membrana de plasma extraídas com CHAPS, com 1,37 x 106 Bq de Na 125 I (Amersham, Bucks, England) por incubação durante 17 min. à temperatura ambiente com Iodogéneo (1,3,4,6-tetrqacloro-3a,6a-difenilglicouril)(Pierce, Rockford, IL, EUA) de acordo com o método de Salacinski e col., 1981. A reacção foi parada por meio de adição de 100 μΐ de uma solução 1 M de Kl à mistura e foi removido o iodo livre por meio de passagem da mistura 43 V Γ u
reaccional sobre uma coluna de Sephadex G25 (Pharmacia, Upsala, Suécia), bloqueada com 1% de BSA (Sigma, St. Louis, EUA) em PBS. As proteínas de membrana de plasma foram guardadas a 4°C durante não mais do que 1 semana, antes da utilização. A incorporação da proteína precipitável com 125I em cada uma das fracções foi determinada por meio de precipitação de 5 μΐ destas fracções com ácido tricloroacético (TCA) a 25% (Janssen, Beerse, Bélgica) na presença de 500 pg de BSA. Apenas foram utilizadas para estudos adicionais as fracções que precipitavam em mais de 80% com 125I.
Produção de anticorpos policlonais de coelho contra a endonexina II de figado humano
Foi levada a um volume de 1 ml com PPS uma solução de 20 pg de endonexina II de fígado humano purificada e misturou-se intensivamente com 1 ml de adjuvante Completo de Freund BSA (Sigma, St. Louis, MO, EUA). Antes de se injectar o antigénio, foram tomados 5 ml de sangue de cada um dos coelhos e foi investigado o soro por imunodifusão de Ouchterlony para excluir a imunidade natural contra a endonexina II humana. Foram injectados subcutaneamente dois coelhos por quatro vezes com 0,5 ml de solução contendo antigénio (20 pg de endonexina II de fígado humano/coelho durante quatro injecções). Após duas injecções reforçadas no dia 16 e no dia ,40, ambos os coelhos revelaram uma resposta imune à endonexina II como demonstrado por imunodifusão de Ouchterlony.
Ensaio Imunoabsorvente Ligado a Enzima (ELISA).
Foram imobilizados 100 ng de cada antigénio em pratos de ELISA de alta ligação (Greiner, Labortechnik, Nurtingen, Alemanha) por meio de incubação durante a noite a 4°C. Após o bloqueamento dos locais de ligação não específicos, por meio de incubação dos furos com solução salina tamponada com 44
V
Lcj ^
Fosfato (PBS)/Blotto a 1%, os furos foram incubados com diluições em série de anticorpos, seguido de incubação com anti-soro anti-coelho de peroxidase conjugada de porco (Dakopatts A/S, Glostrup, Dinamarca). 0 produto da reacção foi revelado com a utilização de tetrametilbenzidina (TMB) (Boehringer, Manheim, Alemanha) na presença de peróxido de hidrogénio e foram medidas as densidades ópticas a 450 nm.
Análise de Imuno-revelação de Manchas.
Foi colocado um micrograma de cada antigénio em PBS num filtro de nitrocelulose (Schleicher e Schuell, Dassel,
Alemanha). Foram bloqueados os locais de ligação não especifica por meio de incubação dos filtros com PBS/Blotto a 1%. Posteriormente, os filtros foram incubados com uma diluição de 1:500 de anti-soro de coelho. Após lavagem com PBS/Tween 20 a 0,05%, os filtros foram incubados com anti-soro anti-coelho de peroxidase conjugada de porco (Dakopatts A/S, Glostrup). 0 produto da reacção foi revelado com a utilização de diaminobenzidina a 0,06% (Sigma) em 50 mM de Tris (pH 7,5) na presença de peróxido de hidrogénio.
Purificação e Separação de Anticorpos.
Foram inicialmente purificados os anticorpos por meio de cromatografia de coluna em A-Sepharose (Pharmacia, Upsala, Suécia). A proteína IgG resultante (5 mg) foi em seguida aplicada a uma coluna de afinidade, preparada por meio de acoplamento de endonexina II de fígado humano recombinante purificada a Sepharose (Pharmacia). Foram eluídos os anticorpos com MgCl2 a 4,5 M.
Radiomarcação com HBsAg Principal.
Foram marcados dois microgramas de proteína com 1,37 x 106 Bq de Na 125 I (Amersham, Buckinghamshire, England) por incubação durante 17 min à temperatura ambiente com Iodogéneo 45 V f u
(1,3, 4,6-tetracloro-3oi, 6a-difenilglicouril) (Pierce, Rockford, IL, EUA) de acordo com o método de Salacinski e col., 1981. Foi removido o iodo livre por meio de passagem da mistura reaccional sobre uma coluna de Sephadex G25 (Pharmacia), bloqueada com 1% de albumina de soro de bovino (BSA) (Sigma) em PBS. A actividade especifica atingia l,7xl07 cpm/pg de HBsAg. A HBsAg principal recombinante foi uma oferta amável do Dr. W. J. Miller (Analytical Research and Development, Merck Sharp and Dohme Laboratories, West Point, PA, EUA; McAleer e col., 1984). A HBsAg principal derivada do soro foi uma oferta amável do Dr. N. Lelie (Central Laboratory of the Netherlands Red Cross Blood Transfusion, Amesterdão, Holanda; Brummelhuis e col., 1981) .
Isolamento de hepatócitos de humanos adultos
Foram isolados hepatócitos de humanos a partir de tecido de figado humano obtido de dadores falecidos por meio de perfusão de colagenase a dois passos da forma descrita previamente (Rijntjes e col., 1986; Moshage e col., 1988). A viabilidade das células isoladas era de 90% tal como determinado por ensaio de exclusão de azul de triptano. As células foram cultivadas em placas de 24 furos (200.000 células/furo) contendo tiras de cobertura revestidas com matriz extracelular (ECM). As células foram cultivadas em meio definido hormonalmente suplementado com 1,5% de DMSO. Três dias após o isolamento, as células foram usadas para experiências de ligação. Antes dos ensaios de ligação as células foram incubadas com meio refrigerado com gelo contendo 1 mM de Ca2+ e 1 mM de Mg2+ e 1% de BSA para reduzir a ligação não especifica.
Sintese de péptidos
Todos os péptidos descritos foram sintetizados em Tentagel S-RAM (Rapp Polymere, Tubingen, Alemanha), um co-polímero enxertado de poliestrireno-polioxietileno 46
V 1__^ funcionalizado com o ligante ácido instável ácido p[5-alfa-1(9H-fluoren-9-il)metoxiformamido-2, 4-dimetoxibenzil]-fenoxiacético (Rink e col., 1987) para gerar amidos carboxi terminais de péptido aquando da clivagem. Foi utilizada uma protecção de cadeia lateral com base em tertio-butilo e uma protecção Fmoc-a-amino. As ligações foram realizadas utilizando ésteres O-pentafluorofenilo executados. Todas as sínteses foram realizadas num PepSynthesizer Milligen 9050 (Novato, Ca, EUA) utilizando procedimentos de fluxo contínuo. Após a clivagem com ácido trifluoroacético na presença de absorventes e extracção com éter dietílico, todos os péptidos foram analisados por cromatografia de fase invertida C18. EXEMPLO 1: Ligação de proteínas de membrana de plasma radiomarcadas a HBsAg principais e grandes recombinantes imobilizados (rHBsAg)
Foi utilizado HBsAg principal recombinante (McAleer e col., 1984) ou derivado do soro (Brum, 1981) para revestir pratos de ELISA de alta ligação (1 pg/poço) (Greiner) . Os pontos de ligação não específicos foram reduzidos por meio de incubação dos poços com solução de gelatina a 3% (Merck) em PBS durante 2 h à temperatura ambiente. Após lavagem com PBS-Tween 80 a 0,01%, foram adicionadas proteínas de membrana de plasma radiomarcadas (800.000 cpm) na presença de 1 mM de Ca2+ e 1 mM de Mg2+. Após incubação durante 1 h à temperatura ambiente, os poços foram lavados com PBS-Tween 80 a 0,01% - 1 mM de Ca2+ e 1 mM de Mg2+ até não se detectar radioactividade nas soluções de lavagem. Posteriormente, foi adicionada aos poços 40 μΐ de uma solução contendo 9 M de Urea (Janssen) e 1% de Triton X-100 (Bio-Rad). Após incubação durante a noite a 4°C, os eluatos dos poços foram combinados e guardados a -80°C até posterior utilização. A pureza da proteína eluída foi determinada por meio de SDS-PAGE e por meio de IEF/SDS-PAGE bidimensional. Como se pode ver na Fig. 1, foi observada uma banda de proteína com um 47 de SDS-PAGE, bidimensional Γ peso molecular aparente de 34 kD por meio enquanto que uma análise de IEF/SDS-PAGE indicava que apenas um proteína isolada (34 kD, plasmídio 4,1) estava ligada por HBsAg principal (Figura 2B) .
Nas experiências de controlo utilizando placas de microtitulação revestidas com BSA, ou em experiências de controlo efectuadas na presença de um excesso de proteína de membrana de plasma não marcada (Figura 1) ou HBsAg principal (não mostrado), não estavam ligadas proteínas radiomarcadas aos pratos de ELISA. Além disso, quando foram utilizadas proteínas de membrana de plasma obtidas de fígado de rato, foi obtido um resultado negativo.
Foi efectuada uma experiência de ligação semelhante, em que foi utilizado 1 pg de HBsAg principal recombinante (McAleer) para revestir placas de microtitulação da forma acima descrita. A adição de proteínas de membrana de plasma radiomarcadas nas condições acima descritas resultou na detecção de uma proteína de membrana de plasma radiomarcada ligada a HBsAg principal recombinante, bem como grande recombinante. É, contudo, importante notar que a HBsAg grande parece ligar-se mais eficazmente a proteínas radiomarcadas do que acontece com a HBsAg principal. EXEMPLO 2: Isolamento e gelectroforese bidimensional de
proteínas de 34 kD
Isolamento fracção de 34 kD que liga a HBsAg principal
Foi efectuado da forma a seguir descrita o isolamento a grande escala da fracção de proteína de 34 kD a partir de proteínas extraídas com CHAPS de membranas de plasma de fígado humano (ver Figura 1 e "Materials and Methods").
Foi isolada uma fracção de proteína com um peso molecular aparente de 34 kD quer a partir de géis de gradiente de SDS- 48
V
'J ^ PAGE pré-vazado horizontal (ExcelGel; Pharmacia) ou de géis verticais de 1 mm de Tricina a 10% (Janssen) (Scha) do sistema Model 491 Prep Cell (Bio-Rad). Nos primeiros casos, a proteina foi electrocutada a partir de uma banda de 34 kD excisada em SDS a 0,1%- 192 mM de glicina por meio de utilização de S&S Biotrap (Schlei). No último caso, as proteínas de 34 kD foram recuperadas num tampão de eluição (SDS a 0,1%- 192 mM de glicina) e foram combinadas as fracções adequadas. As fracções eluídas foram congeladas rapidamente em azoto líquido e guardadas a -80°C até utilização.
Antes da electroforese de gel bidimensional, a fracção de proteína de 34 kD foi concentrada de 10 vezes por meio de centrifugação em vazio num dispositivo de Savant Speedvac ou por filtração em Centriprep (corte a 10 kD; Amico), precipitou-se durante a noite (4°C) com TCA (concentração final de 20% p/d) e lavou-se com TCA a 20%, acetona e acetona contendo trietilamina a 1% (v/v). A amostra foi seca a pressão reduzida e dissolvida em não mais do que 200 μΐ de tampão de lise (Ureia a 9,5 M, 2-mercaptoetanol a 5%, CHAPS a 2% e Resolyte a 5% pH 3,5-10 (Hoefer).
Electroforese de gel bidimensional de uma fracção de 34 kD A focagem isoel.éctrica (IEF)/SDS-PAGE foi baseada no
sistema de 0'Farrel e col., (1977) com as seguintes modificações tal como descrito por Meheus e col. (1987). A primeira dimensão foi efectuada em géis de poliacrilamida com ultratina (0,5 mM) revestidos com película de ligação a PAG-Gel (FMC) e com um gradiente de pH obtido por meio de uma mistura (3:1) de Phormalyte a pH 2,5-5 (Pharmacia) e de Resolyte a pH 4-8 (Hoefer). O gel IEF foi pré-usado (500 V durante 1 h) antes da aplicação da amostra e foi usado a 6259 Vh (500 durante 0,5 h, 1000 V durante 2 h, e 2000 V durante 2 h). Após a electroforese na primeira dimensão, os géis foram fixados em 49 Γ TCA a 10% (p/v) durante 30 mm, lavado durante a noite com metanol a 40% e revelado em Azul Brilhante de Coomassie R-250 (Merck) a 0,1% (p/v) e ácido acético a 10% (v/v) - metanol a 50% (v/v).
Para a electroforese na segunda dimensão, as filas apropriadas foram cortadas, lavadas com água destilada (10 min), Tris-HCl a 50 mM a pH 6,8 (10 min) e equilibradas contra SDS a 4% - DTT a 100 mM - Tris-HCl a 50 mM a pH 6,8 (30 min). A electroforese na segunda dimensão foi efectuada em gel de Tricina a 10% (Scha) e revelou-se com Azul Brilhante de Coomassie R-250.
Embora a fracção de proteína obtida acima revelasse uma banda de proteína única de 34 kD numa electroforese de gel de uma dimensão, foram observadas várias proteínas com aproximadamente o mesmo peso molecular numa electroforese de gel de duas dimensões (Figura 2A) . A mancha de interesse na electroforese de gel de duas dimensões foi identificada por meio de análise de uma mistura de proteína de ligação a HBsAg principal radiomarcada, obtida a partir de ensaios de ligação (Exemplo 1) , a fracção de 34 kD não marcada após revelação e auto-radiografia. A co-migração de material marcado e não marcado resultou numa mancha revelável de Coomassie, coincidindo com uma única mancha de proteína radioactiva com um peso molecular de 34 kD e um valor de pH de 4,1. (Figuras 2A (seta) e 2B).
EXEMPLO 3: Sequenciação da proteína de ligação a HBsAg principal de 34 kD
As manchas de proteínas de interesse foram cortadas do géis bidimensionais, concentradas numa mancha utilizando o método descrito por Rasmussen e col. (1991) e reveladas com Poinceau S a 0,1% em metanol/ácido acético/água (50:10:50). 50 r L·
Foi recolhida uma quantidade sequenciável desta proteína de 34 kD (aproximadamente 4 pg) de 56 géis bidimensionais de IEF-SDS/Tricina. A mancha concentrada foi clivada em péptidos de acordo com o método de Vanfieteren e col. (1992) . De uma maneira resumida, após dissociação do corante, a proteína foi hidrolisada na matriz de gel em ácido fórmico a 3% a 112°C durante 4 h.
Os péptidos eluídos foram separados por meio de HPLC de fase inversa numa coluna Vydac C-4 (2,1 x 250 mm, Hesperia, CA, EUA) utilizando um Sistema de Libertação de Solvente 140B (Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA) e eluído com um gradiente linearmente crescente de acetonitrilo em ácido trifluoroacético a 0,1%. A coluna foi directamente ligada a uma célula de fluxo de 8 μΐ de um detector de rede de tipo díodo 1000 S (Applied Biosystems). Foram registados os picos de péptidos num registrador de gráficos e estes foram recolhidos manualmente. O padrão de eluição de HPLC destes, péptidos é mostrado na Figura 3. Finalmente, os péptidos resultantes forma sequenciados utilizando um dispositivo Sequenator 477A de modelo líquido pulsado (Applied Biosystems) equipado com um analisador em linha 120 de feniltiohidantoína. A sequência de amino ácidos dos diferentes péptidos é apresentada no Quadro 2. QUADRO 2
Sequência de amino ácidos obtidos por sequência-ção dos picos indicados (setas) na Figura 3 pico AH5 AETLRKMGGL pico AH21 YKKALLLL (Q) GE pico AH24a AQALFQAGEL* pico AH24b YKKALLLL*GED pico AH24c TSGDYKKALLLL*GED pico AH25 * * * * FQAGEL (K)*G Pico AH42 AYELK (Q) ALKGAGTNEK 51 I’w ^^
Entre parêntesis estão indicados os amino ácidos que não deram um sinal claro. Os asteriscos indicam que não foi obtido sinal para este resíduo. EXEMPLO 4: Identificação da endonexina II humana como proteína de ligação a HBsAg principal
As sequências de amino ácidos obtidas da análise foram escrutinadas contra o banco de dados Suíço (Departamento de Bioquímica Médica da Universidade de Genebra e das bibliotecas de dados do EMBL) o que resultou na identificação da endonexina II humana como a proteína de ligação a HBsAg principal. A comparação com a sequência de endonexina II como referido por Kaplan e col. (1988) revela que o pico AH5 corresponde aos amino ácidos 21 a 31, o pico AH21 aos amino ácidos 308 a 318, o pico AH24a aos amino ácidos 176 a 186, o pico AH24b aos amino ácidos 308 a 319, o pico AH24c aos amino ácidos 304 a 319, o pico AH25 aos amino ácidos 180 a 188, e o pico AH42 aos amino ácidos 93 a 108.
Com base na informação das sequências de amino ácidos dos péptidos AH5, AH21, AH24, A25, AH42" (Figura 3 e Quadro 2) e a pesquisa do banco de dados de sequências (banco de dados Suíço de sequências) , foi verificado que a proteína de 34 kD da invenção pertencia sem margem para dúvidas à família da anexina e podia ser identificada como endonexina II ou anexina humana (Kaplan e col., 1988; Walker e col., 1992). EXEMPLO 5: Ligação de endonexina II humana e de rato a HBsAg principal 0 isolamento da endonexina II humana e de rato dos respectivos tecidos de fígado foi de agora em diante feita de acordo com o método de Haigler e col. (1987) com algumas pequenas modificações. Em resumo, foram descongelados 50 pg de tecido de fígado a 4°C num tampão de homogeneização (tampão Η), o qual continha 20 mM de Hepes (pH de 7,4), 150 mM de KC1, 52 L-^ ^ 2 mM de MgCl2, 1 mM de benzamidina e 1 mM de fluoreto de fenilmetanossulfonilo (PMSF). 0 tecido descongelado foi homogeneizado num dispositivo de Waring-Blendor e o homogeneizado foi centrifugado a 800 g (4°C) durante 15 min. A pastilha obtida foi re-suspensa no tampão H e foi de novo centrifugada. Foram combinados os dois líquidos sobrenadantes e foram filtrados através de filtro de "nylon" de 100 malhas. Foi adicionado CaCl2 ao filtrado até uma concentração final de 1 mM e a solução foi deixada em repouso durante 30 min. Na presença de Ca2+, todas as proteínas de ligação de fosfolípidos dependentes do cálcio se ligam à membrana de plasma (Haigler e col., 1987). Após 30 min, a solução foi centrifugada a 100.000 g (4°C) durante 20 min e o sobrenadante foi desprezado. A pastilha foi re-suspensa no tampão H, suplementada com CaCl2 por meio de homogeneização de Dounce e foi centrifugada a 100.000 g. Este passo foi repetido por três vezes. Após os passos de lavagem, a pastilha foi re- suspensa durante 15 min e centrifugada a 100.000 g (4°C) durante 20 min. Todas as proteínas de membrana de plasma dependentes de cálcio são libertadas da membrana. O sobrenadante foi separado e concentrado para 15 ml por meio de filtração sob pressão através de uma membrana de YM-10 (Amicon, Conn. Beverly, MA, EUA). O eluato de EGTA concentrado foi fraccionado numa coluna de Sephadex G-100 (2,5 x 90 cm) (Pharmacia, Upsala, Suécia) equilibrada com acetato de amónio (0,06 M, pH 8,3). O caudal era de 0,5 ml/min e foram recolhidas fracções de 5 ml. Foram concentradas fracções de interesse, investigadas em SDS-PAGE a 12% e ajustadas para acetato de amónio 5 mM (pH 8,65). Esta amostra foi aplicada a uma coluna (1x4 cm) de celulose DE-52 (Whatman, Maidstone, Inglaterra), equilibrada com tampão de acetato de amónio (5 mM, pH 8,65) e eluída com o seguinte gradiente de acetato de amonio (5 mM, pH 8,65): 160 ml de 5-30 mM, 60 ml de 30-75 mM e 125 ml de 75-350 mM. A taxa de fluxo foi de 0,5 ml/minuto e foram recolhidas fracções de 5 ml. O pico eluído a ± 300 mM de acetato de amónio foi concentrado e vigiado em SDS-PAGE a 12% e em electroforese de gel de duas 53 Γ
dimensões utilizando ο dispositivo de tiragem seca de imobilina (Pharmacia) na primeira dimensão e gel Excel (Pharmacia) na segunda dimensão. Por fim, 10 μg da proteina purificada foram sujeitos a hidrólise ácida limitada e sequenciadas tal como acima descritos.
Foram realizados estudos de ligação com endonexina II de figado humano e de ratazana marcada como 125I sob as condições experimentais tal como descrito para as proteínas de membrana de plasma marcadas (ver exemplo 1) . Neste tipo de estudo de ligação, contudo, a ligação foi realizada adicionando 15 ng de endonexina II humana ou de ratazana marcada como 125I a 1 μg de HBsAg principal revestida nos furos do prato ELISA.
Tal como mostrado na Figura 4 (linha 1) isto resultou na ligação da endonexina II de fígado humano à HBsAg principal recombinante. A especificidade da ligação foi demonstrada pela capacidade de um excesso de endonexina II de fígado humano não marcada (2 μg) ou de HBsAg principal (2 μg) ou de proteínas de membrana de plasma humanas (20 μg) em completarem a ligação à HBsAg principal (Figura 4, linhas 2-4). A pré incubação de endonexina II de fígado humano marcada com IgG anti-endonexina II de fígado humano de coelho (purificado tal como ilustrado em Materiais e Métodos) inibe a ligação da endonexina II de fígado humano à HBsAg principal (Figura 4, linhas 5-6). A ligação não foi inibida por IgG pré-imune do mesmo coelho. A Figura 5 representa os resultados de pré incubação de endonexina II de fígado humano radiomarcada com concentrações variadas de anti-endonexina II para ligação à HBsAg principal. As experiências de ligação com quantidades iguais de endonexina II de fígado humano e de ratazana radiomarcada (10 ng) demonstrou que a endonexina II de fígado de ratazana em comparação com a endonexina II de fígado humano foi mais difícil de se ligar à HBsAg principal (Figura 6). 54 r~ U, ^ EXEMPLO 6: Inibição da ligação da HBsAg principal aos hepatócitos humanos intactos pela endonexina II de figado humano
Para investigar se a endonexina II de figado humano é susceptivel de inibir a ligação da HBsAg principal radiomarcada a hepatócitos intactos foram pré-incubados HBsAg principal radiomarcada e excesso de endonexina II de figado humano não marcada durante 30 minutos a 4°C antes da adição às células cultivadas.
Foram incubadas aproximadamente 200.000 células durante 1 hora a 4°C com 1 ml de meio de ligação (meio de cultura suplementado com 1 mM de Ca2+, 1 mM de Mg2+ e 1% de BSA. A HBsAg principal radiomarcada, na ausência ou presença de um excesso de HBsAg não marcada (para determinar a ligação de base especifica) incubada com endonexina II de figado humano ou proteína de controlo, foi adicionada e as células foram incubadas a 4°C durante 2 horas. Subsequentemente, as células foram lavadas com meio de ligação frio até não ser encontrada mais radioactividade nas soluções de lavagem, analisadas com SDS de 0,2 N NaOH/0,5% para permitir a determinação da radioactividade ligada.
Tal como mostrado na Figura 7, a ligação da HBsAg principal radiomarcada a hepatócitos humanos cultivados foi inibida pela endonexina II de fígado humano. EXEMPLO 7: ligação cruzada da HBsAg principal à endonexina II humana A ligação cruzada foi realizada pela adição de uma solução de 50 mM de DSS (suberato de dissuccinimidilo) (Pierce, Rockford, IL, EUA) em DMSO a uma concentração final de 1 mM para a HBsAg principal revestida em furos contendo endonexina II marcada como 125I. A reacção foi deixada continuar durante 30 minutos a 4°C e a reacção foi 55 ^ tumm'
interrompida pela adição de 1 M de glicina para uma concentração final de 100 mM. Por fim, os furos foram lavados tal como acima descrito e as proteínas ligadas foram eluídas e examinadas por SDS-PAGE a 12%.
Quando se adicionou 1 mM de DSS nas experiências de ligação (tal como descrito no exemplo 1) de endonexina II marcada como 125I para HBsAg principal imobilizada recombinante ou derivada de soro, foi vista uma banda adicional com um peso molecular aparente de 90 kD na SDS-PAGE (Figura 8).
Este complexo de proteína pode ser o resultado de: 1) interacção entre uma molécula de endonexina II (MW 34 kDa) e duas moléculas de HBsAg principal (MW 27 kDa) ou de 2) interacção entre duas moléculas de endonexina II e uma molécula de HBsAg principal.
Foram obtidos resultados semelhantes quando foi adicionada DSS a uma mistura de endonexina II marcada como 125I e HBsAg principal em solução, enquanto que não foi encontrado esse complexo de proteína quando foi adicionado DSS a uma mistura de endonexina II marcada como 125I e BSA, asialofetuin (ASF) ou endonexina II não marcada (Figura 2).
Tal complexo de proteína também não foi verificado quando a endonexina II de fígado de ratazana radiomarcada e a HBsAg principal foram sujeitas a ligação cruzada. A especificidade da ligação cruzada foi adicionalmente demonstrada pela ausência de um complexo ± 90 kD se forem utilizados ligadores cruzados químicos diferentes de DSS (DMA ou dimetiladipimidato, DMP ou dimetilpimelimidato, DTBP ou ditiobispropionimidato, DTP ou ditiopropionimidato). Com base nestas descobertas a interacção entre a HBsAg principal e a endonexina II de fígado humano pode ser considerada especifica 56 e a distância de interacção entre a endonexina II e a HBsAg pode ser estimada em 11,4 A (comprimento da cadeia do DSS).
Exemplo 8: Ligação da endonexina II de figado humano marcada como 12SI aos hepatócitos humanos e de ratazana
Para investigar se a endonexina II era susceptivel de prevenir a ligação da HBsAg principal a hepatócitos intactos era necessário determinar se a endonexina II de figado humano era ela própria capaz de se ligar a estas células. Assim, os hepatócitos humanos e de ratazana foram encubados com endonexina II de figado humano marcada como 125I.
Foi adicionado aproximadamente (15 ng) de endonexina II de figado humano marcada como 125I na presença de excesso não marcado (2 μg) de endonexina II de figado humano, excesso não marcado (2 μg) de HBsAg ou excesso não marcado (2 μg) de BSA.
Tal como mostrado na Figura 9, foi obtida ligação entre os hepatócitos humanos e a endonexina II, enquanto que não foi observado um padrão de ligação semelhante utilizando hepatócitos de ratazana. Além disso, excesso de HBsAg foi susceptivel de prevenir a ligação da endonexina II de figado humano marcada como 125I a células intactas (de ratazana e humanas), indicando que existe uma interacção entre a HBsAg e a endonexina II de fígado humano o que origina uma concorrência de ligação entre os hepatócitos e a endonexina II de fígado humano. Como um controlo, foi adicionada BSA na presença de endonexina II de fígado humano marcada como 125I. Neste caso, não foi demonstrada inibição da ligação da endonexina II de fígado humano marcada como 125I.
Para investigar a diferença na ligação da endonexina II de fígado humano marcada como 125I aos hepatócitos humanos e de ratazana foram efectuados estudos de ligação nos hepatócitos humanos e de ratazana (50.000 células) utilizando quantidades variáveis de excesso não marcado de endonexina II. Tal como 57
V \ i Vi
U mostrado na Figura 10 existe uma diferença marcada entre os hepatócitos humanos e de ratazana para a ligação da endonexina II de fígado humano marcada como 125I. No primeiro caso, a adição de pequenas quantidades de endonexina II de fígado humano resultou numa ligação acrescida da endonexina II de fígado humano marcada como 125I, enquanto que a inibição da ligação ocorre quando pelo menos 7 μg (concentração final 7 μg/ml) de endonexina II de fígado humano não marcada foi adicionada à mistura reaccional. Contudo, no último caso (hepatócitos de ratazana) a inibição da ligação da endonexina II de fígado humano marcada como 125I foi observada após adição de 1 μg de endonexina II de fígado humano não marcada (concentração final 1 μg/ml). Não foi observado aumento de ligação quando foram adicionadas quantidades mais pequenas de endonexina II de fígado humano não marcada.
Para investigar se a endonexina II de fígado humano é susceptível de inibir a ligação da HBsAg principal marcada como 125I às células intactas, deve estar presente no meio uma certa concentração de endonexina II livre. Tal como acima mencionado, são necessários pelo menos 7 μg/ml de endonexina II de fígado humano para prevenir a ligação da endonexina II de fígado humano marcada como 125I adicional aos 50.000 hepatócitos humanos. Para hepatócitos de ratazana esta corresponde a pelo menos 1 μg/ml de endonexina II de fígado humano.
Para determinar o efeito da endonexina II de fígado humano na ligação da HBsAg aos hepatócitos, foram utilizados vários protocolos experimentais. Em primeiro lugar, foi incubou-se HBsAg principal marcada como endonexina II de fígado humano marcada como 125I com hepatócitos intactos (humanos e de ratazana) durante 3o minutos a 4°C antes de se adicionar excesso não marcado (7 ou 1 μg) respectivamente de endonexina II de figado humano. Em segundo lugar, misturou-se HBsAg principal marcada como 125I e excesso não marcado de endonexina II de fígado humano durante 30 minutos a 4°C antes da adição à suspensão da célula. Em terceiro lugar, incubou-se 58 (Γ ^—. excesso não marcado de endonexina II de fígado humano com hepatócitos intactos durante 30 minutos a 4°C antes de se adicionar HBsAg principal marcada como 125I. Em todos estes três casos, tal como mostrado na Figura 11, a adição de endonexina II de fígado humano inibe a ligação da HBsAg principal marcada como 125I aos hepatócitos humanos. Pelo contrário, utilizando hepatócitos de ratazana, foi observada uma ligação acrescida da HBsAg marcada como 125I (comparada com a baixa ligação da HBsAg radiomarcada na ausência de concorrentes) quando foram adicionados aos hepatócitos um excesso da endonexina II de fígado humano e HBsAg marcada como 125I, ou HBsAg marcada como 125I e subsequentemente excesso da endonexina II de fígado humano. Contudo, quando as células pré-incubadas com excesso não marcado da endonexina II de fígado humano, não foi observada ligação acrescida da HBsAg principal. EXEMPLO 9: Isolamento de clones da endonexina II de figado humano e expressão de endonexina II de fígado humano recombinante em leveduras.
Isolamento dos clones ADNc da endonexina II
Construiu-se uma biblioteca de ADNc de fígado humano no local EcoRI do vector Lambeda Zap (Stratagene, La Jolla, Califórnia, EUA) e utilizada para infectar as células XL1 azul (Stratagene). Foram espalhadas placas de aproximadamente 6,5 x 105 da livraria em pratos NZY e incubados durante toda a noite a 37°C antes de serem efectuadas réplicas duplicadas em filtros de nitrocelulose (Schleicher e Schuell, Dassel, Alemanha). Subsequentemente, estas réplicas foram escrutinadas para clones positivos da endonexina II, utilizando um protocolo de hibridização padrão e uma prova de oligonucleótico 36-mer sintético (5' TTTTTCATTTGTTCCAG CTCCCT-TCAAGGCAGTT-3') . A sequência da prova foi derivada dos dados da sequência de aminoácido (e ácido nucleico correlativo) obtidos de análises prévias de proteína de ligação HBsAg 59 Γ u principal isolada (Quadro 2) . Foi utilizado um sistema de marcação de ADN 5'-fim (Promega, Madison, WI, EUA) para marcar 100 ng (10 pmoles) de prova.
Os filtros foram autoradiografados durante 48 horas utilizando escrutínios de intensificação. As placas que emitiram sinais de hibridização positiva em ambos os filtros foram considerados positivas e utilizadas para escrutínio adicional. Por fim, 10 clones positivos da endonexina II foram identificados e purificados por replacagem a baixa densidade e placas de re-escrutínio com a prova no oligonucleótido.
Foram utilizados fagos de armazenagem de clones positivos para infectar células xll azul na presença do fago auxiliar R 408 (Stratagene). Por meio de eventos de recombinação, obteve-se como resultado a construção de um plasmídio de pBluescript. As colónias de células que surgiam nas placas de LB/ampicilina continham o plasmídio de pBluescript com a inserção de ADN no ponto EcoRl. Para confirmar a identidade dos clones positivos à endonexina II, o ADN de plasmídio foi isolado de células azuis XL1 por meio de um método de miniprep de lise alcalina. Este ADN foi digerido com EcoRl (Boeh) na presença de ARNse A (Boehringer). Com base no padrão de digestão, foram escolhidos cinco clones com uma inserção de 1,6 kb e um clone com uma inserção de 2,2 kb, análogos ao comprimento total do ADNc da placenta humana, e foram passados num gel de agarose a 0,8%, e transferidos para membranas de nylon Hybond (Amersham) e foram hibridizados com a sonda de oligonucleótidos de 36 meros. Dos cinco clones, quatro revelaram-se de novo positivos. A sequenciação de ADN destes clones utilizando o sistema de sequenciação de TaqTrack (Promega) revelou códãos de início e de paragem em todos os clones de 1,6 kb. A sequenciação completa de todos os clones não revelou diferenças entre a proteína de fígado humano de 34 kD e o já referido ADNc da endonexina II de placenta humana (Kaplan e col., 1988). 60 r
t
Expressão da endonexina II de figado humano adulto em S.cerevisiae A sequência de codificação da endonexina II de figado humano foi isolada como um fragmento de NcoI/Ecll36II de 981 pb de clone 5.3.1 de endonexina II de pBSK(-)h e posteriormente inserido no vector pYlGl aberto com NcoI/EcoRV. este vector, que é um derivado de pTZ18U (Mead e col., 1986), contém um promotor de S.cerivisiae (tal como o promotor de PGK (fosfoglicerato quinase), JAP (gliceraldeido-3-fosfato desidrogenase ou MFla (factor coerente a)) e um terminador de S.cerivisiae (tais como os terminadores TRP1, GAP ou MF1) . 0 vector resultante foi designado por pYIGlhEXNII.
Num segundo passo foi transferido o módulo de sequência de codificação/terminador de endonexina II promotora/humana para o vector de transferência pSYl de E.coli/S.cerivisiae. este vector contém todo o plasmidio de 2 μ de circulo de S.cerivisiae, as sequências pBR322 de E.coli e um marcador auxotrófico de S.cerivisiae tal como URA3, HIS3 ou LEU2. Esta transferência foi feita por meio de isolamento do módulo como o fragmento BamHI de a ± 2600 pb do vector pYIGlhEXNII e inserindo-o no vector pSYl aberto com BamHI. Os vectores forma isolados quando o módulo foi inserido na direcção do sentido e do sentido inverso. Estas construções foram designadas por pSYlhEXNIIs e pSYlhEXNIIas. O ADN do plasmidio de pSYlhEXNIIs e pSYlhEXNIIas foi transformado por meio de método de formação de esferoplastos (Klebe e col., 1983) na estirpe AVB100 de S.cerivisiae. Foram cultivadas várias colónias em meio YPD suplementado com glicose a 3% e a 28°C. Foram tomadas amostras por fraccionamento das células de leveduras a vários intervalos de tempo e elas foram analisadas por meio de SDS-PAGE e por revelação de "western". 61
V
u
Era visível uma banda induzida revelável por meio de Azul Brilhante de Coomassie (P.M. de 34-35 Kd) em SDS-PAGE após cultura de 24 horas. Não se podia observar diminuição do nível de expressão após cultura de 120 horas (dados não apresentados). A identidade da proteína expressa podia ser confirmada por meio de revelação de "western" com um soro policlonal de anti-endonexina II de coelho. A endonexina II humana adulta está praticamente exclusivamente presente na fracção solúvel.
Purificação da Endonexina II recombinante.
Foram rompidas células de levedura cultivadas por meio de um homogeneizador de Brown num tampão de homogeneização (tampão H), contendo 20 mM de HEPES (pH 7,4) (Boehringer), 150 mM de KC1, 2 mM de MgCl2, 1 mM de Benzamidina (Sigma, S. Luis, EUA), 1 mM de fluoreto de fenilmetanossulfonilo (PMSF) (Sigma) e 0,1 mM de Pefabloc SC (Boehringer), e foram centrifugadas a 100 000 g (4°C) durante 30 minutos para remover os resíduos das células. Os sobrenadantes (Sup I) foram guardados a -80°C até serem utilizados. As pastilhas foram homogeneizadas em tampão H, suplementado com 1 mM de Ca2+ e guardadas a 4°C durante 15 minutos. Após centrifugação a 100 000 g (4°C) durante 20 minutos, a pastilha foi homogeneizada em tampão H, contendo 2 mM de EGTA, deixada em repouso 15 minutos e recentrifugada a 100 000 g. O sobrenadante final (Sup II) foi também guardado a -80°C até ser utilizado.
Os Sup I e II foram ainda fraccionados numa coluna de Sephadex G-100 (Pharmacia) , seguido de uma coluna de celulose DE-52 (Watman, Maidstone, Inglaterra) da forma descrita por Haigler e col., (1987). A concentração de proteínas de endonexina II purificada foi determinada de acordo com Bradford (1976), utilizando o ensaio de proteínas de Bio-Rad. 62
V L-Cj ^^
Caracterização química da endonexina II de figado humano recombinante. tal como se mostra nas figuras 12 a 14, verificou-se que o peso molecular, o ponto iso-eléctrico e as propriedade de reconhecimento de anticorpos anti-endonexina II da endonexina II recombinante eram idênticos aos da endonexina II de figado humano nativa.
Caracterização das propriedades de ligação a HBsAg de endonexina II de figado humano recombinante.
Para confirmar a actividade funcional da proteína recombinante, foi efectuada a ligação de endonexina II recombinante radiomarcada a HBsAg principal da forma acima descrita para endonexina principal II de fígado humano nativa.
Tal como se mostra na figura 15, ambas as proteínas se ligam a HBsAg principal mas não a BSA. A especificidade é demonstrada por meio de competição de ligação por adição de HBsAg principal não marca em excesso, ou endonexina II de fígado humano nativa não marcada em excesso. Quando a endonexina II recombinante radiomarcada é pré-incubada com anticorpos anti-endonexina II policlonais, dirigidos a endonexina II de fígado humano nativa, a ligação a HBsAg é completamente inibida. Isto não acontece quando a endonexina II é pré-incubada com soro pré-imune do mesmo coelho. Pode ser verificado que a ligação de endonexina II recombinante a HBsAg não difere de modo algum da ligação revelada pela proteína de fígado humano nativa. É obtida confirmação adicional da actividade de ligação a HBsAg a partir de experiências de reticulação entre HBsAg principal e endonexina II recombinante radiomarcada. 0 complexo específico, com um peso molecular aparente de 90 kD, que é obtido por meio de reticulação de HBsAg principal e de endonexina II foi obtido em experiências efectuadas com endonexina II recombinante bem como em experiências efectuadas com endonexina II de fígado humano 63
V t Γ nativa (fig. 16) . Em experiências de controlo efectuadas com BSA ou com HBsAg não marcada, ou experiências efectuadas sem reticulação, não pode ser obtido o complexo de elevado peso molecular. Este facto confirma que a interacção entre a HBsAg e a endonexina II é especifica e é estabilizada por meio de adição de um reticulador químico. EXEMPLO 10: Anticorpos anti-idiotipicos para endonexina II de fígado humano
Análise de imunoabsorvente ligado a enzima (ELISA) de anti-soro de coelho
Para investigar se a imunização de coelhos com a endonexina II de fígado humano recombinante podia levar ao desenvolvimento de anticorpos anti-idiotipicos, reagindo com o seu ligante de receptores específicos, foram sangrados coelhos imunizados com endonexina II de fígado humano nativa ou recombinante (ver Materiais e Métodos) a intervalos e foi feito o exame por meio de ELISA para determinar a possível presença de actividade anti-HBs. tal como se mostra na figura 17, foi demonstrada no soro actividade anti-HBs e anti-endonexina II. Todos os quatro coelhos (dois imunizados com endonexina II de fígado humano nativa, dois imunizados com endonexina II de fígado humano recombinante) revelaram uma actividade anti-HBs comparável. Esta actividade era específica, dado que o soro pré-imune não reagia com a HBsAg principal e a actividade anti-HBs (tal como determinada por meio de ELISA) podia ser eliminada por meio de pré-incubação do anti-soro com HBsAg principal em excesso (figura 18). Pelo contrário, os coelhos imunizados com as mesmas quantidades de endonexina II de fígado de rato, que não têm as mesmas propriedades de ligação a HBsAg apesar de uma homologia de 90% das sequências quando comparada com a endonexina II de fígado humano não desenvolviam anticorpos anti-HBs, mas desenvolviam uma resposta anti-E-II no mesmo momento (Figura 17, Painel B). 64
Separação de anticorpos idiotípicos e anti-idiotipicos
Para excluir a possibilidade de reactividade cruzada de anti-endonexina II a epitopos de HBsAg, foram separadas as actividades anti-HBs e anti-endonexina II, presentes no soro do coelho por meio de cromatografia de afinidade utilizando endonexina II recombinante acoplada a Sepharose activada com CNBr (ver Materiais e Métodos) . As fracções que passaram (1-12) bem como as fracções eluidas (13-18) da coluna de afinidade foram recolhidas e examinadas para determinar a sua reactividade com HBsAg principal e com endonexina II (ELISA). Tal como se demonstra na figura 19, a actividade anti-HBs era sobretudo encontrada nas fracções que passaram (1-6), enquanto que a reactividade anti-endonexina II era exclusivamente encontrada nas fracções eluidas (14-17), indicando que a reactividade anti-HBs nos anticorpos anti-endonexina II de coelho é dirigida para os epitopos de HBsAg principal.
Análise de imuno-revelação de manchas.
Para verificar os resultados acima mencionados tal como determinados por meio de ELISA, forma reveladas HBsAg principal e endonexina II em filtros de nitrocelulose e incubou-se com diferentes anti-soros. A figura 20 mostra que o anti-soro de coelho é reactivo quer à E-II de figado humano quer à HBsAg principal enquanto que a fracção de passagem de caudal da cromatografia de coluna da proteína H e da endonexina II (= anticorpos anti-HBs purificado) é apenas reactiva a HBsAg principal.
Imuno-precipitação de HBsAg principal radiomarcada
De modo a investigar se os anticorpos, separados da forma acima mencionada, também eram reactivos a antigénios em solução, forma efectuadas experiências utilizando endonexina II de fígado humano radiomarcada e HBsAg principal respectivamente. Tal como se mostra na figura 21, ambas as 65
V L-Cj proteínas radiomarcadas podiam ser precipitadas pelo soro de coelhos imunizados com endonexina II de fígado humano, enquanto que as experiências de controlo com soros pré-imunes mostraram a ausência de precipitação destas proteínas radiomarcadas. A HBsAg principal radiomarcada foi incubada numa diluição de 1:100 de vários anticorpos anti-HBs (ou soros de controlo) e forma deixadas em repouso durante a noite a 4°C. Em seguida, a mistura foi incubada com proteína A-Sepharose (Pharmacia) durante 3 horas a 4°C. Após lavagem intensa, a proteína A-Sepharose foi pastilhada e transferida para tubos de contagem. A precipitação de proteínas marcadas foi reduzida por meio de adição de um excesso não marcado das proteínas respectivas.
Experiências de ligação competitiva.
Para examinar se o anticorpo anti-HBs produzido era um anticorpo idiotípico (Ab2) que reagia com epitopo(s) específico(s) em HBsAg principal que se liga a endonexina II de fígado humano, foram efectuados estudos de ligação competitiva usando Ab2 imobilizado em pratos de ELISA de lata ligação. Para estas experiências, os pratos de ELISA de lata ligação forma revestidos com 500 ng de Proteína A e anticorpos anti-idiotípicos purificados por meio de cromatografia de
coluna de endonexina II, sem reactividade de endonexina II (ver Figura 15) , seguida de incubação com PBS/Gelatina a 3% (Merck, Darmstadt, Alemanha)para bloquear os pontos de ligação não específica e lavagem com PBS/Tween 20 a 0,05%. Os poços foram em seguida incubados com misturas de ligação durante 1 hora à temperatura ambiente. Após incubação, os poços forma lavados intensamente com PBS/Tween 20 a 0,05%, foi libertada HBsAg radiomarcada ligada em tampão de amostra de SDS-PAGE e foi transferida para tubos de contagem.
Tal como se mostra na figura 22, a endonexina II de fígado humano compete com sucesso com o anticorpo anti-HBs para ligação a HBsAg principal na presença de Ca2+ e de Mg2+. 66
Pode assim ser concluído que o anticorpo anti-HBs simula uma região de endonexina II que interactua com HBsAg principal.
Exemplo 11: Péptidos derivados de endonexina II mostrando propriedades de ligação a HBsAg
Hidrólise ácida limitada de endonexina II
Foi tratada endonexina II purificada de acordo com o método descrito no exemplo 3. (Hidrólise em ácido fórmico a 3% a 112°C durante 4 horas). Após tratamento com ácido fórmico, a digestão de proteínas foi separada por meio de HPLC de fase inversa numa coluna Vydac C-4 (2,1 x 250 mm, Hesperia, CA, EUA) da forma descrita no exemplo 3. Foram registados os picos de péptidos num registador de gráficos e estes foram manualmente recolhidos. Foram efectuadas múltiplas digestões e separações e os padrões de eluição (comparáveis ao representado na figura 3) foram cuidadosamente comparados para identificar fracções de pico idênticas para experiências de ligação e sequenciação.
Ligação de endonexina II humana radiomarcada a HBsAg principal recombinante (rHBsAg) na presença de fracções de péptidos de endonexina II
Foram efectuadas experiências de ligação de acordo com o método descrito nos exemplos 1 e 5. Contudo, a ligação de endonexina II radiomarcada a HBsAg principal imobilizada foi efectuada na presença de fracções de pico individuais de endonexina II de fígado humano digerida não marcada (ver acima). A experiência foi efectuada em triplicado. Com base nestes resultados, foram encontrados quatro fracções de péptidos (picos F, Q, Q, R, S) para inibir a ligação de endonexina II radiomarcada a HBsAg principal significativamente mais do que as outras (figura 23a) . Portanto, este péptido foi considerado como um dos epitopos de ligação a HBsAg principal principal na endonexina II. Por meio de sequenciação de uma fracção de pico idêntica efectuada numa experiência paralela, foram determinados como aminoácidos 266 a 280 os péptidos correspondentes aos picos F e S (pico F, DHTLIRVMVSRSEID) e aminoácidos 92 a 138 (pico S) : DAYELKHALKGAGTNEKVLTEIIASRTPEELRAIKQVYEEEYGSSLE) de endonexina II humana(numeração de acordo com Kaplan e col., 1988). Também os picos L e N, que revelaram uma capacidade de inibição de ligação ligeiramente inferior forma analisados e foi verificado que correspondiam à região que englobava os aminoácidos 190 a 225 da endonexina II humana (DEEKFITIFGTRSVSHLRKVFDDKYMTISGFQIEETI).
Em seguida, foi usado um péptido sintético com base na sequência de péptidos F TLIRVMVSSEIDLF para imunizar coelhos. Foi verificado que os coelhos imunizados com este péptido F sintético produziam uma forte resposta anti-péptidos. A endonexina II intacta não era reactiva com estes anticorpos. Contudo, uma maior concentração de anticorpos anti-HBs (Ab2 = anticorpos anti-idiotipicos) foi de novo verificada no anti-soro de coelho, sugerindo que um ou mais epitopos dentro deste péptido podia de facto estar envolvido na ligação de HBsAg principal.
Isolamento do fragmento F(Ab')2 de anticorpos anti-endonexina II
Após purificação por afinidade de anticorpos usando endonexina II e posterior cromatografia de coluna de proteína A, a preparação de IgG foi digerida com pepsina de acordo com os procedimentos convencionais (Gorevic e col., 1985). Após digestão, a preparação foi fraccionada por meio de cromatografia de coluna da proteína A. As fracções de passagem, contendo o fragmento F(Ab')2 foram usadas para imunizar galinhas.
Imunização de galinhas com o fragmento F(Ab')2 68
V
L· t
Foram imunizadas galinhas de acordo com procedimentos convencionais de imunização. Foram isoladas IgY pré-imunes de ovos (gema) antes da primeira injecção. Os ovos foram recolhidos e usados para isolamento de IgY da forma descrita por Jensenius e col., (1981). 0 escrutínio dos anticorpos produzidos foi efectuado por meio de ELISA da forma acima descrita. Os resultados obtidos nestes ensaios de ELISA (figura 23B) demonstrava claramente a produção de anticorpos (anti-idiotípicos), após injecção de fragmentos de F(Ab')2 anti-endonexina II (idiotípicos). Esta verificação suporta ainda o conceito de gue a endonexina II e a HBsAg principal possuem uma relação única de receptor-ligante.
Experiências de ligação competitiva entre anticorpos anti-idiotípicos .
Para investigar se os anticorpos anti-HBs. produzidos por endonexina II de fígado humano intacta (Ab2/E-II), péptido F sintético (Ab2/F) ou o fragmento F(Ab')2 (Ab2/Fab), reconheciam epitopos idênticos na HBsAg principal, foi efectuado um ensaio de ligação competitiva (ver figura 23 C). com este objectivo, foi radiomarcada a (E-II refere-se a endonexina II de fígado humano) e foi adicionada a HBsAg principal, imobilizada em patos de ELISA de alta ligação, na presença de ou na ausência de Ab2/E-II, Ab2/F, Ab2/Fab, IgG como proteína de controlo em HBsAg principal. Tal como se
mostra na figura 23D a ligação de Ab2/E-II radiomarcada pode ser inibida por meio de adição de HBsAg principal não marcada ou Ab2/E-II, Ab2/F, Ab2/Fab numa maneira dependente da dose, enquanto que a IgG não inibia a ligação de Ab2/E-II
radiomarcada a HBsAg principal. Portanto, pode concluir-se que os anticorpos anti-HBs, criados por imunização de coelhos com endonexina II de fígado humano intacta ou com o péptido F sintético e por galinhas imunizadas com o fragmento anti-E-II F(Ab')2, reconheciam regiões idênticas em HBsAg principal. Dado que os ensaios prévios também demonstram que o Ab2/E-II compete com a endonexina II de fígado humano para a ligação a 69 L-Cj ^^ HBsAg principal, pode concluir-se que o péptido F está envolvido na ligação de HBsAg principal a endonexina II de fígado humano.
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Lisboa, 7 de Junho de 2000
0 AGENTE OFICIAL DA PROPRIEDADE INDUSTRIAL p Lc, ^^ 78

Claims (12)

  1. L-Cj t V Γ REIVINDICAÇÕES Processo para a determinação in vitro da ligação entre a endonexina II humana e a HBsAg grande e/ou principal compreendendo a utilização de: o receptor da HBsAg grande e/ou principal, contendo o receptor ou sendo constituído por • endonexina II humana; • ou uma muteína derivada da endonexina II humana, sendo a referida muteína de forma a ser susceptível de se ligar à HBsAg grande e/ou principal; • ou um fragmento da endonexina II humana, * sendo o referido fragmento de forma a ser susceptível de se ligar à HBsAg grande e/ou principal, * ou sendo o referido fragmento de forma a poder ser reconhecido por anticorpos criados contra a endonexina II humana e susceptível de neutralizar a infecção HBV, * ou sendo o referido fragmento de forma a ser susceptível de gerar anticorpos susceptíveis de reconhecerem a endonexina II humana acima referida, ou de reconhecerem um polipéptido variante que corresponda ao receptor acima referido, compreendendo mutações localizadas de forma a que o polipéptido variante não perca a sua propriedade de ser um receptor da HBsAg grande e/ou principal, * ou os péptidos da endonexina II: DHTLIRVMVSRSEID, DAYELKHALKGAGTNEKVLTEIIASRTPEELRAIKQVYEEEYGSSL E e DEEKFITIFGTRSVSHLRKVFDKYMTISGFQIEETI 1 V
    L·, t ou um ligante receptor ou um péptido anti-sentido em relação ao receptor acima mencionado, contendo o referido receptor ou sendo constituído por endonexina II humana ou suas muteinas, ou seus fragmentos, correspondendo o referido ligante a um ligante específico, ou parte de um ligante tendo a propriedade de ligação à endonexina II humana, ou anticorpos policlonais ou monoclonais direccionados contra a endonexina II humana, ou contra as muteinas acima definidas, ou contra os fragmentos acima definidos, ou anticorpos policlonais ou monoclonais contra o ligante ou péptidos anti-sentido acima definidos, ou anticorpos anti-idiotipo criados contra a endonexina II humana, ou contra as muteinas acima definidas, ou contra os fragmentos acima definidos, ou anticorpos anti-anti-idiotipo criados contra a endonexina II humana, ou contra as muteinas acima definidas, ou contra os fragmentos acima definidos, ou anticorpos anti-idiotipo criados contra o ligante ou péptido anti-sentido acima definidos, ou anticorpos anti-anti-idiotipo criados contra o ligante ou péptidos anti-sentido acima definidos, ou medicamentos que se possam comportar como um ligante em relação a qualquer dos receptores da HBsAg grande e/ou principal tal como acima definidos e estando os referidos receptores presentes nas superfícies das células, que são transferidos pelos genes ou fragmentos de gene que codificam para pelo menos um dos receptores da HBsAg tal como acima definidos, ou que codificam para pelo menos uma das muteinas ou um dos fragmentos acima definidos. Utilização de pelo menos uma das seguintes substâncias activas:
  2. 2 V Γ u o receptor da HBsAg grande e/ou principal, contendo o receptor ou sendo constituído por: • uma muteína derivada da endonexina II humana, sendo a referida muteína de forma a ser susceptivel de se ligar à HBsAg grande e/ou principal • ou um fragmento da endonexina II humana, * sendo o referido fragmento de forma a ser susceptivel de se ligar à HBsAg grande e/ou principal * ou sendo os referidos fragmentos de forma a poder ser reconhecido por anticorpos criados contra a endonexina II, susceptíveis de neutralizar a infecção por HBV, * ou sendo o referido fragmento de forma a ser 9 susceptivel de gerar anticorpos susceptíveis de reconhecerem a endonexina II humana acima referida, ou um polipéptido variante que corresponda ao receptor acima definido, compreendendo mutações localizadas de forma a que o polipéptido não perca a sua propriedade de ser um receptor da HBsAg grande e/ou principal, mais particularmente com os péptidos da endonexina: DHTLIRVMVSRSEID, DAYELKHALKGAGTNEKVLTEIIASRTPEELRAIKQVYEEEYGSSLE e DEEKFITIFGTRSVSHLRKVFDKYMTISGFQIEETI, ou um ligante ou péptido anti-sentido em relação ao receptor acima definido na reivindicação 1, sendo o referido ligante tal como definido na reivindicação 1, ou anticorpos policlonais ou monoclonais, de preferência anticorpos monoclonais humanos, contra o ligante ou péptidos anti-sentido acima definidos na reivindicação 1, 3
    contra a ou anticorpos anti-idiotipo criados endonexina II humana, ou contra as muteínas acima definidas na reivindicação 1, ou contra os fragmentos acima definidos na reivindicação 1, ou anticorpos anti-anti-idiotipo criados contra a endonexina II humana, ou contra as muteinas acima definidas na reivindicação 1, ou contra os fragmentos acima definidos na reivindicação 1, ou anticorpos anti-idiotipo criados contra o ligante acima definido na reivindicação 1, ou péptido anti-sentido, ou anticorpos anti-anti-idiotipo criados contra os ligantes acima definidos na reivindicação 1, ou péptidos anti-sentido acima definidos na reivindicação 1, ou medicamentos que se possam comportar como um ligante em relação a qualquer um receptor de HBV tal como definido na reivindicação 1, e estando os referidos receptores presentes na superfície das células, que são transfectados pelos genes ou fragmentos de gene que codificam para pelo menos um dos polipéptidos tendo uma propriedade de serem receptores da HBsAg grande e/ou principal, ou que codificam para pelo menos uma das muteínas acima definidas na reivindicação 1 ou um dos fragmentos acima definidos na reivindicação 1, para a preparação de um medicamento para o tratamento da hepatite, mas excluindo a utilização da HBsAg.
  3. Composição de vacina contendo, como substância activa: * ligantes ou péptidos anti-sentido tal como definidos na reivindicação 1, que se referem explicitamente à interacção HBV-endonexina II, * ou anticorpos anti-idiotipo criados contra os ligantes ou péptidos anti-sentido tal como definidos na reivindicação 1, * muteínas ou fragmentos da endonexina tal como definidos na reivindicação 1, e desde que a referida composição não consista de HBsAg. 4
    Processo para a detecção da capacidade de uma molécula em se comportar como um ligante em relação a qualquer dos polipéptidos receptores mencionados na reivindicação 1 ou a qualquer um dos péptidos da endonexina II mencionados na reivindicação 1, e para o desenvolvimento de um processo de escrutínio para novos medicamentos anti-hepatite, caracterizado por: colocar-se em contacto a molécula com um hospedeiro celular que tenha sido previamente transformado por um vector ele próprio modificado por uma inserção que codifica para qualquer um dos polipéptidos ou péptidos acima referidos, contendo o hospedeiro na sua superfície um ou mais locais específicos para este polipéptido, se necessário após contactar-se a expressão da referida inserção, sendo o referido contacto efectuado sob condições que permitam a formação de uma ligação entre pelo menos um dos locais específicos acima referidos e a referida molécula, se esta última apresentar uma afinidade em relação ao referido polipéptido, detectar-se o complexo possivelmente formado do tipo ligante-polipéptido.
  4. Processo para a detecção da afinidade dos polipéptidos receptores tal como definidos na reivindicação 1 ou dos péptidos da endonexina II mencionados na reivindicação 1 para um ou mais ligantes, caracterizado por: transformar-se uma célula hospedeiro adequada com um vector, em particular um plasmídio ou um fago, em que foi previamente inserida uma sequência de nucleótidos que codifica para qualquer um dos polipéptidos ou péptidos acima definidos (inserção) sob o controlo de elementos reguladores, particularmente um promotor reconhecido pela polimerase da célula hospedeiro e permitindo a expressão da referida sequência de nucleótidos na referida célula hospedeiro,
  5. 5 (Ρ ^ ^-t cultivar-se a célula hospedeiro transformada sob condições que permitam a expressão da referida inserção e o transporte das referidas sequências de polipéptido ou péptido que foram expressas em direcção à membrana de modo que as sequências necessárias para interacção com um ligante sejam expostas à superfície da célula hospedeiro transformada, contactar-se esta célula hospedeiro com ligantes determinados, detectar-se uma reacção de afinidade entre a referida célula hospedeiro transformada e os referidos ligantes determinados.
  6. Processo para a detecção in vitro de HBV ou da HBsAg grande e/ou principal compreendendo: contactar-se uma amostra biológica susceptível de conter HBV com uma quantidade fixa de (i) endonexina II humana, ou suas muteínas, ou um seu fragmento tal como definido na reivindicação 1 e mais particularmente os péptidos da endonexina: DHTLIRVMVSRSEID, DAYELKHALKGAGTNEKVLTEIIASRTPEELRAIKQVYEEEYGSSLE e DEEKFITIFGTRSVSHLRKVFDKYMTISGFQIEETI e uma quantidade fixa de (ii) um dos ligantes, ou péptido anti-sentido tal como definidos na reivindicação 1 e actuando como um concorrente da HBsAg, sob condições que permitam a formação de um complexo entre (i) endonexina II humana ou a sua contraparte funcional tal como definida na reivindicação 6 e (ii) um ligante ou péptido anti-sentido tal como acima definidos na reivindicação 6 e entre a endonexina II humana e a HBsAg grande e/ou principal, e cada componente (i) ou (ii) transportando uma marca detectável e sendo cada componente possivelmente imobilizado, detecção da quantidade de complexo possivelmente formado entre (i) endonexina II humana ou a sua 6
    contraparte funcional e (ii) o ligante, ou péptidos anti-sentido e o complexo formado entre (i) endonexina II humana ou a sua contraparte funcional e (ii) HBsAg grande e/ou principal, deduzir-se a quantidade de HBV que está presente na referida amostra à medida que diminui a formação de complexo em relação a uma amostra de controlo conhecida como sendo isenta de HBV. Processo para a determinação in vitro do dano hepato-celular de uma amostra biológica tomada a partir de plasma ou soro compreendendo: contactar-se uma amostra biológica susceptivel de conter endonexina II humana de hepatócitos danificados, * quer com uma placa revestida com ligantes ou péptidos anti-sentido tal como definidos na reivindicação 1, * ou com uma placa revestida com anticorpos policlonais e/ou monoclonais, de preferência monoclonais humanos ou versões humanizadas de monoclonais de rato, dirigidos contra a endonexina II humana, ou contra as muteinas da endonexina II humana tal como definidas na reivindicação 1, ou contra os fragmentos derivados da endonexina II humana tal como definidos na reivindicação . 1, * ou com uma placa revestida com anticorpos anti-anti-idiotipo criados contra a endonexina II, ou contra as muteinas da endonexina II humana tal como definidas na reivindicação 1, ou contra os fragmentos derivados da endonexina II humana tal como definidos na reivindicação 1, * ou com uma placa revestida com anticorpos anti-idiotipo criados contra o ligante ou péptidos anti-sentido tal como definidos na reivindicação 1, 7 detectar-se o complexo formado quer entre a endonexina II humana e o ligante receptor ou péptidos anti-sentido, quer entre a endonexina II humana e os anticorpos monoclonais ou policlonais, quer entre a endonexina II humana e os anticorpos anti-anti-idiotipo acima definidos quer entre a endonexina II humana e os anticorpos anti-idiotipo acima definidos.
  7. Dispositivo de diagnóstico para a determinação in vitro de HBV contendo: pelo menos uma microplaca para deposição na mesma de um produto compreendendo: * endonexina II humana ou as suas muteinas tal como definidas na reivindicação 1, ou fragmentos derivados da endonexina II humana tal como definidos na reivindicação 1, * ou anticorpos policlonais ou monoclonais, de preferência monoclonais humanos, dirigidos contra os ligantes ou péptidos anti-sentido tal como definidos na reivindicação 1, * ou anticorpos anti-idiotipo criados contra a endonexina II humana, ou contra as suas muteinas tal como definidas na reivindicação 1, ou contra os fragmentos derivados da endonexina II humana tal como definidos na reivindicação 1, * ou anticorpos anti-anti-idiotipo criados contra os ligantes ou péptidos anti-sentido tal como definidos na reivindicação 1, uma preparação contendo a amostra a ser diagnosticada e susceptível de conter a HBsAg, juntamente com um concorrente da HBsAg, tal como: * anticorpos monoclonais ou policlonais, de preferência monoclonais humanos ou versões humanizadas 8
    de monoclonais de rato, contra a endonexina II humana, ou contra as muteínas da endonexina II humana tal como definidas na reivindicação 1, ou contra os fragmentos derivados da endonexina II humana tal como definidos na reivindicação 1, * ou anticorpos anti-anti-idiotipo criados contra a endonexina II humana, * ou anticorpos anti-idiotipo criados contra o ligante receptor ou péptidos anti-sentido tal como definidos na reivindicação 1, soluções tampão adequadas para efectuar a reacção entre a HBsAg e o produto depositado na placa, e marcadores adequados para a determinação do complexo formado ente a HBsAg e o produto depositado na placa.
  8. Dispositivo de diagnóstico para a determinação in vitro da endonexina II humana contendo: pelo menos uma microplaca para deposição na mesma de um produto contendo: * ligantes ou péptidos anti-sentido tal como definidos na reivindicação 1 ou, * anticorpos policlonais ou monoclonais, de preferência monoclonais humanos ou versões humanizadas de monoclonais de rato, dirigidos contra a endonexina II humana, ou contra as muteínas da endonexina II humana tal como definidas na reivindicação 1, ou contra os fragmentos derivados da endonexina II humana tal como definidos na reivindicação 1, ou * anticorpos anti-anti-idiotipo criados contra a endonexina II humana, ou contra as muteínas da endonexina II humana tal como definidas na reivindicação 1, ou contra os fragmentos derivados da endonexina II humana tal como definidos na reivindicação 1,
  9. 9 Η— i \ί * anticorpos anti-idiotipo criados contra os ligantes ou péptidos anti-sentido tal como definidos na reivindicação 1, uma preparação contendo a amostra a ser diagnosticada, possivelmente em conjunto com um concorrente da endonexina II humana, tal como: * anticorpos policlonais ou monoclonais, de preferência anticorpos monoclonais humanos, criados contra os ligantes ou péptidos anti-sentido tal como definidos na reivindicação 1, * ou anticorpos anti-idiotipo criados contra a endonexina II humana, ou contra as muteinas da endonexina II humana tal como definidas na reivindicação 1, ou contra os fragmentos derivados da endonexina II humana tal como definidos na reivindicação 1, * ou anticorpos anti-anti-idiotipo criados contra os ligantes ou péptidos anti-sentido tal como definidos na reivindicação 1, solução tampão adequada para efectuar as reacções imunológicas entre a endonexina II humana e o produto depositado na placa, e marcador adequado para detectar a formação de um complexo entre a endonexina II humana e o produto depositado na placa.
  10. 10. Utilização de: • um polipéptido receptor tal como definido na reivindicação 1, • ou um ligante ou péptido anti-sentido tal como definidos na reivindicação 1, sendo o referido ligante diferente de HBsAg integral, • ou de anticorpos policlonais ou monoclonais, de preferência versões humanizadas de anticorpos 10 V V
    u monoclonais de rato ou anticorpos monoclonais humanos, criados contra a endonexina II humana tal como definida na reivindicação 1, ou contra as suas muteinas tal como definidas na reivindicação 1, ou contra os seus fragmentos tal como definidos na reivindicação 1, • ou de anticorpos anti-idiotipo contra a endonexina II humana tal como definidos na reivindicação 1, ou contra as suas muteinas tal como definidas na reivindicação 1, ou contra os seus fragmentos tal como definidos na reivindicação 1, • ou anticorpos anti-anti-idiotipo contra a endonexina II humana tal como definidos na reivindicação 1, ou contra as suas muteinas tal como definidas na reivindicação 1, ou contra os seus fragmentos tal como definidos na reivindicação 1, • ou anticorpos anti-idiotipo criados contra os péptidos anti-sentido tal como definidos na reivindicação 1, • ou anticorpos anti-anti-idiotipo contra o ligante ou péptidos anti-sentido tal como definidos na reivindicação 1, • ou os medicamentos tal como definidos na reivindicação 1, para a preparação de um medicamento útil para o tratamento da hepatite B.
  11. 11. Utilização de: um polipéptido receptor tal como definido na reivindicação 1, ou um ligante ou péptido anti-sentido tal como definidos na reivindicação 1, sendo o referido ligante diferente de HBsAg integral, ou de anticorpos policlonais ou monoclonais, de preferência versões humanizadas de anticorpos monoclonais de rato ou anticorpos monoclonais 11 f—' ^^ li humanos, contra a endonexina II humana tal como definidos na reivindicação 1, ou contra as suas muteinas tal como definidas na reivindicação 1, ou contra os seus fragmentos tal como definidos na reivindicação 1, • ou de anticorpos anti-idiotipo contra a endonexina II humana tal como definidos na reivindicação 1, ou contra as suas muteinas tal como definidas na reivindicação 1, ou contra os seus fragmentos tal como definidos na reivindicação 1, • ou anticorpos anti-anti-idiotipo contra a endonexina II humana tal como definida na reivindicação 1, ou contra as suas muteinas tal como definidas na reivindicação 1, ou contra os seus fragmentos tal como definidos na reivindicação 1, • ou anticorpos anti-idiotipo criados contra os péptidos anti-sentido tal como definidos na reivindicação 1, • ou anticorpos anti-anti-idiotipo contra o ligante ou péptidos anti-sentido tal como definidos na reivindicação 1, • ou os medicamentos tal como definidos na reivindicação 1, para a preparação de uma vacina contra a infecção da hepatite B.
  12. 12. Utilização de: • um polipéptido receptor tal como definido' na reivindicação 1, • ou um ligante ou péptido anti-sentido tal como definidos na reivindicação 1, • ou de anticorpos policlonais ou monoclonais, de preferência versões humanizadas de anticorpos monoclonais de rato ou anticorpos monoclonais humanos, contra a endonexina II humana tal como definidos na reivindicação 1, ou contra as suas 12 muteínas tal como definidas na reivindicação 1, ou contra os seus fragmentos tal como definidos na reivindicação 1, • ou de anticorpos anti-idiotipo contra a endonexina II humana tal como definidos na reivindicação 1, ou contra as suas muteínas tal como definidas na reivindicação 1, ou contra os seus fragmentos tal como definidos na reivindicação 1, • ou anticorpos anti-anti-idiotipo contra a endonexina II humana tal como definida na reivindicação 1, ou contra as suas muteinas tal como definidas na reivindicação 1, ou contra os seus fragmentos tal como definidos na reivindicação 1, • ou anticorpos anti-idiotipo criados contra os péptidos anti-sentido tal como definidos na reivindicação 1, • ou anticorpos anti-anti-idiotipo contra o ligante ou péptidos anti-sentido tal como definidos na reivindicação 1, • ou os medicamentos tal como definidos na reivindicação 1, para a preparação de meios de diagnóstico da infecção do vírus da hepatite B. Lisboa, 7 de Junho de 2000 ó agente oficial da propriedade industrial r Vi ' 13
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