PT672162E - Producao melhorada de taxol e taxanos por cultura de celulas de especies de taxus - Google Patents

Description

"Produção melhorada de taxol e taxanos, por cultura de células de espécies de

Taxus"

ANTECEDENTES DO INVENTO

A. CAMPO DO INVENTO O presente invento refere-se a métodos para a produção e recuperação melhoradas de taxol e taxanos, por cultura de células de espécies de Taxus.

B. ARTE RELACIONADA O problema de fornecimento do taxol e soluções possíveis O taxol é um alcaloide diterpenóide, originalmente isolado da casca do teixo dò Pacífico, o Taxus brevifolia (Wani et a/., 1971). O interesse pelo taxol teve início quando o National Câncer Institute (NCI), num programa de pesquisa em grande escala, verificou que os extractos brutos de casca apresentavam actividade antitumoral. Desde então, os ensaios clínicos confirmaram que o taxol é extremamente eficaz contra cancros refractários do ovário e contra o cancro da marria e outros cancros. 0 taxol tem sido considerado como um avanço à quimioterapia, devido ao seu mecanismo de citotoxicidade, fundamentalmente diferente, i.e. por inibição da despolimerização de microtúbulos (veja-se Rowinsky et ai, 1990). A variável mais preocupante no equacionamento do taxol é, até agora, o seu fornecimento. São necessários três a seis teixos do Pacífico com 100 anos de idade, para tratar um paciente, pois os rendimentos médios de taxol são baixos - ca. 0,01% de casca seca e agulhas (Witherup et ai, 1990). Para produzir a quantidade de taxol necessária para o tratamento e testes seria necessário destruir dezenas de milhar de teixos. Até agora, todo o fornecimento mundial tem resultado da colheita destas coníferas atarracadas, de crescimento lento, que populam as florestas antigas do Noroeste do Pacífico. Infelizmente, o teixo está quase extinto, devido à procura para lenha. Os conservadores têm-se oposto, com sucesso, a qualquer sacrifício em grande escala da árvore, que cresce em florestas antigas e que são o refúgio do mocho malhado do Norte, em risco de extinção, e outra vida selvagem. À medida que o número de teixos do Pacífico diminui, a pesquisa médica tem dirigido as suas esperanças para um ú 'íiit t -i

85 681

EP 0 672 162/PT 2 novo taxol, proveniente de fontes de fornecimento alternativas. Três das fontes que têm sido consideradas são a síntese química, semi-síntese e cultura de células vegetais. O taxol é uma molécula química grande, estruturalmente complexa, que até agora não tem sido possível sintetizar na totalidade quimicamente. Assim, a síntese em grande escala a partir de químicos simples disponíveis não parece ser uma opção viável para os próximos anos.

Uma opção possível para a produção em grande escala é a semi-síntese, i.e.,. a ligação química de uma cadeia lateral ao precursor do taxol produzido a nível agrícola, a bacatina. Tem sido feito um progresso significativo na síntese da cadeia lateral (Denis et a!., 1991). Também se têm desenvolvido métodos para acoplar a cadeia lateral à bacatina (Denis et a!., 1990, Patente U.S. 4,924,011; Holton 1991, Patente U.S. 5,015,744). No entanto, o fornecimento agrícola de bacatina a partir de agulhas de plantações de Taxus não é, de todo, trivial; e está actualmente a ser reavaliado, tendo em conta o facto de os registos anteriores serem mais optimistas em relação ao teor de bacatina (Denis et a!., 1988, 0,1% em peso), do que os mais recentes (Witherup et a!., 1990, 0,03% peso seco). Em resumo, a capacidade da síntese química e semi-síntese fornecerem o taxol para uma utilização quimioterapêutica a nível mundial, não está ainda assegurada. Há fortes razões para explorar e desenvolver meios de produção alternativos. O presente invento refere-se ao desenvolvimento de um processo à base da cultura de células vegetais, para o fornecimento de taxol e outros taxanos.

Culturas de tecidos como fonte de químicos derivados de plantas A capacidade das células vegetais se dividirem, crescerem e produzirem metabolitos secundários numa variedade de regimes de cultura diferentes tem sido amplamente demonstrada por vários grupos. Actualmente existem dois compostos, a chiconina (um corante vermelho e anti-inflamatório) e o ginsengósido (um tónico na medicina oriental), que são produzidos por processos de cultura de tecidos no Japão. Há referência de muitos outros processos em vias de comercialização, incluindo a vanilina, berberina e ácido rosmarínico (veja-se Payne et a!., 1991).

85 681 ΕΡ Ο 672 162/ΡΤ 3

As vantagens de um processo de cultura de células vegetais para o taxol são imensas: (i)uma cultura de células assegura um fornecimento uniforme, contínuo, ilimitado de produto e não está sujeita a pestes, desastres e flutuações sazonais, (ii) as culturas de células podem ser cultivadas em biorreactores grandes e podem ser induzidas a superproduzir o taxol por manipulação das condições ambientais, (iii) as culturas de células produzem um espectro mais simples de compostos, comparado com a casca ou agulhas, simplificando consideravelmente a separação e a purificação, (iv) um processo de cultura de células pode ser mais rapidamente adaptado a alterações rápidas de procura, do que os processos baseados na agricultura, (v) além de fornecer taxol, um processo de cultura de células pode também produzir precursores de taxano, como a bacatina, que podem ser convertidos semi-sinteticamente em taxol e outros derivados activos.

Uma vez que o cultivo asséptico, em grande escala, de células vegetais é inerentemente dispendioso, um processo de cultura de células torna-se comercialmente relevante, apenas quando estes custos são contrabalançados por um crescimento celular rápido e uma produtividade de metabolitos elevada. Cada espécie de planta e metabolito alvo é diferente e são necessárias diferentes abordagens para cada sistema particular. O presente invento centra-se em abordagens inovadoras e hábeis para obter culturas de células vegetais, com um crescimento rápido e produtividade elevada, para a produção de taxol e taxano.

Problemas com culturas de tecidos de plantas lenhosas e coníferas

Uma retrospectiva histórica da literatura sugere que enquanto as plantas herbáceas têm sido manipuladas de forma relativamente fácil em cultura, as culturas de plantas lenhosas e coníferas apenas tem sido conseguida com dificuldade. 0 crescimento de culturas de gimnospérmicas e coníferas que produzem metabolitos secundários tem sido geralmente baixo. Por exemplo, Berlin e Witte (1988), verificaram que as culturas de Thuja occidentalis aumentaram a sua biomassa em apenas ca. de 30%, em 18 dias. Van Uden et ai (1990) referem um aumento de biomassa de 20-50% em 21 dias, para suspensões de Callitrís drummondii. Westgate et al. (1991) referem um tempo de duplicação de cerca de 10 dias, para suspensões da gimnospérmica Cephalotaxus harríngtonia. Tal

85 681 ΕΡ Ο 672 162/ΡΤ como resumido por Bornman (1983), tem-se dirigido um enorme esforço para o desenvolvimento de um meio para suspensões de abeto vermelho (Picea abies). Este trabalho colectivo demonstra que as suspensões de gimnospérmicas são de facto capazes de um crescimento rápido, mas que não se podem aplicar generalidades, e que as formulações dos meios para diferentes linhas celulares deverão ser optimizadas independentemente.

Uma retrospectiva da produtividade de metabolitos secundários entre as culturas de gimnospérmicas também aponta para a dificuldade de induzir uma biossíntese rápida, comparada com as espécies herbáceas. Por exemplo, as culturas de Cephalotaxus harringtonia produziram alcaloides de terpeno a um nível de apenas 1% a 3% do verificado na planta progenitora (Delfel e Rothfus 1977). Mesmo com um estímulo de sucesso, Heinstein (1985) apenas foi capaz de se aproximar dos níveis produzidos na planta progenitora (ca. de 0,04% do peso seco total de alcaloides). Van Uden et aí. (1990) foram capazes de induzir culturas em suspensão da conífera Calfitris drummondii a produzir podofilotoxina, mas apenas a níveis de um décimo dos produzidos pelas agulhas. A capacidade da Thuja occidentalis para produzir níveis significativos de monoterpenos (10-20 mg/l) e do diterpenóide desidroferruginol (2-8 mg/l) foi demonstrada, de forma convincente, por Berlin et al. (1988). No entanto, estes resultados foram obtidos com uma cultura de crescimento lento (aumento de biomassa de 30% em 18 dias) e baixa densidade celular (5 a 7 gramas de peso seco por litro).

Cultura de células para a produção de taxol: Esforços anteriores

As dificuldades em atingir um crescimento rápido e uma produtividade elevada encontradas em suspensões de gimnospérmicas são patentes nos três relatórios, existentes até à data, relativos à produção de taxol. Jaziri et al. (1991) iniciaram recentemente culturas de calo de Taxus baccata, mas não foram capazes de detectar qualquer taxol utilizando o seu ensaio imunossorvente. Wickremesinhe e Arteca (1991) referem a presença de 0,009%, em peso seco, de taxol em culturas de calo de Taxus media (cv. Hicksii), mas nãó estão indicados os pormenores acerca dos tempos de duplicação, densidades celulares e escala de tempo em que o referido taxol foi produzido.

85 681 ΕΡ Ο 672 162/ΡΤ 5 A patente U.S. Νο. 5,019,504 (Christen et al. 1991) descreve a produção e recuperação de taxano e compostos do tipo taxano por culturas de células de Taxus brevifolia. Estes investigadores referem a produção de taxol a um nível de 1 a 3 mg/ml, num intervalo de duas a quatro semanas. Referem também um aumento de massa celular de "5-10 vezes em 3-4 semanas", que corresponde a tempos de duplicação de ca. de 7 a 1 2 dias. São claramente necessários aumentos nas taxas de crescimento, nas taxas de biossíntese de taxol e nas produtividades volumétricas, antes que um processo de cultura de tecidos para a produção de taxol possa fornecer a procura anual prevista, de dezenas a centenas de quilogramas de taxol por ano.

SUMÁRIO DO INVENTO

Os inventores verificaram que o taxol e os compostos do tipo taxol, ou taxanos, podem ser produzidos com um rendimento muito elevado a partir de todas as espécies de Taxus conhecidas, i.e. brevifolia, canadensis, cuspidata, baccata, gfobosa, fioridana, waiiichiana, media e chinensis. Em particular, os inventores verificaram que a espécie Taxus chinensis é capaz de um crescimento rápido e de produzir níveis extremamente elevados de taxol e taxanos, num período de tempo curto.

Constituindo uma melhoria em relação ao invento descrito por Christen et ai. (1991), os inventores verificaram que as culturas de células de diferentes espécies de Taxus podem ser rápida e eficientemente iniciadas e crescidas com sucesso em meios nutrientes artificias e que se produzem na cultura de células os mesmos alcaloides de taxano quimioterapeuticamente activos, que os produzidos pela planta intacta.

Além disso, pelos métodos do presente invento é possível obter o taxol num intervalo de tempo muito menor do que o anteriormente referido. Com a espécie Taxus chinensis, os inventores foram capazes de manipular células de modo a obter taxol em quantidades muito superiores às quantidades obtidas a partir de culturas de tecidos de outras espécies de Taxus. Além disso, a taxa de crescimento das culturas de células de Taxus chinensis é significativamente maior, de 3 a 6 vezes, do que para o Taxus brevifolia, descrita por Christen et ai. (1991).

85 681 ΕΡ Ο 672 1 62/ΡΤ 6

Os objectos do presente invento incluem a iniciação rápida e eficiente de culturas de células de várias espécies de Taxus.

Os objectos do presente invento incluem a formulação de condições ambientais especiais para assegurar um crescimento rápido, densidades celulares elevadas e viabilidades celulares elevadas. As características de crescimento reportadas neste estudo ultrapassam resultados anteriores, por um factor significativo. 0 presente invento proporciona um processo para a recuperação de taxol e outros taxanos, com rendimentos elevados, a partir de culturas de células de uma espécie de Taxus, que compreende: fazer a cultura, numa cultura em suspensão, num ou mais meios nutrientes, sob condições de crescimento e formação de produto, de células de uma espécie de Taxus derivada de calo e/ou fazer culturas em suspensão e recuperar o referido taxol e outros taxanos a partir das referidas células e/ou do referido meio, da referida cultura de células, em que as referidas condições compreendem um ou mais de entre: iluminação contínua ou intermitente, com luz de banda larga ou banda estreita; ou meios nutrientes que têm composição do meio alterada para as fases de crescimento e produção da cultura.

Os objectos do presente invento incluem a capacidade de induzir taxas elevadas e prolongadas de biossíntese e secreção de taxol e taxano por (a) manipulação cuidadosa das concentrações de nutriente ("formulação do meio de produção", (b) utilização de luz, (c) utilização de protocolos de troca periódica de meio , (d) utilização de potenciadores.

Os objectos do presente invento incluem a capacidade de manipular o perfil de taxanos produzidos, por alteração das formulações dos meios e das condições ambientais. Em particular, as células foram induzidas a produzir taxol como produto de taxano predominante. Além disso, a produção do produto secundário cefalomanina foi suprimida, proporcionando assim uma solução biológica elegante para os problemas de separação e purificação subsequentes, dispendiosos e importantes.

Os objectos do presente invento incluem a capacidade de produzir vários taxanos, para além do taxol, que podem eles próprios ter actividade

85 681 ΕΡ Ο 672 162/ΡΤ 7 farmacológica, ou podem ser modificados e convertidos em compostos com actividade farmacológica.

Os objectos do presente invento incluem a capacidade de induzir culturas de células de Taxus chinensis a produzir taxol (0,32% de peso seco) a níveis que excedem largamente os produzidos pelas plantas selvagens (0,003 a 0,03%, em peso seco, Xu e Liu 1991).

DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

Figura 1. Aumento de biomassa numa cultura em suspensão de Taxus chinensis linha K-1, durante um ciclo de crescimento em descontínuo típico em Meio A. As barras de erro representam o desvio padrão medido a partir de balões em duplicado.

Figura 2. Efeito da troca de meio aos dias 9 e 12 na produtividade de taxol (A) e taxano total (B), numa experiência de 15 dias. Os números em cada caixa representam o intervalo de tempo (dias) ao longo do qual o produto foi produzido. A porção escurecida das caixas intracelulares representa o taxol ou taxanos totais que estavam presentes no inoculo celular, no início da experiência. Todos os tratamentos foram realizados em duplicado. A suspensão de Taxus chinensis linha K-1 foi utilizada com Meio A, como elaborado na Tabela 2.

Figura 3. Características espectrais de uma lâmpada Gro-Lux convencional (GTE Silvania, Danvers, MA) utilizada no exemplo 7.3

Figura 4. Produção de taxano em suspensão de células K-1 de Taxus chinensis. Apresenta-se a porção do cromatograma dos 10 aos 40 minutos. Os varrimentos por agrupamento de díodos de picos de taxano seleccionados, mostram um espectro de absorção de UV característico do taxano, com um pico aos 227 nm.

Figura 5. Produção de taxol e taxano após cultura prolongada em Meio C por Taxus chinensis, linha celular K-1. 0 painel superior mostra os dados para taxanos conhecidos e desconhecidos, enquanto que o painel inferior mostra o aumento da produção de taxol e taxano, no período de tempo de 25 a 42 dias.

85 681 ΕΡ Ο 672 1 62/ΡΤ 8

Figura 6. Confirmação por ΕΜ/ΕΜ de taxoi no sobrenadante da cultura de células. O painel A mostra o espectro de massa APCI de pulverização iónica, do taxoi autêntico e o painel B mostra o espectro iónico filho do pico progenitor (m/z 871 = taxoi + NH4+). O painel C representa o espectro APCI de pulverização iónica de um extracto bruto de cultura de células e mostra m/z 854 e 871, característico do taxoi. O painel D mostra o espectro filho correspondente de m/z 871 e proporciona uma evidência inequívoca da presença do taxoi no sobrenadante da cultura de células.

DESCRICÃO PORMENORIZADA DO INVENTO

As plantas têm desde há muito proporcionado fontes importantes de fármacos e em especial de químicos. Estes produtos têm sido tipicamente obtidos através da extracção dos materiais das plantas colhidas, ou por síntese química. O taxoi tornou-se um dos agentes anti-cancro potenciais mais importantes, que emergiu recentemente da pesquisa de produtos naturais.

Tal como aqui utilizados, os termos taxoi e compostos do tipo taxoi, ou taxanos, são utilizados indiferentemente para descrever um composto com um anel de taxano. Estes compostos podem possuir eles próprios actividade antineoplásica, ou podem ser modificados para se obterem compostos bioactivos.

Tal como aqui utilizado, o termo "calo" é utilizado para descrever uma massa das células vegetais em cultura, que é estruturalmente indiferenciada e é cultivada em meio solidificado. Tal como aqui utilizado, o termo "cultura em suspensão" é utilizado para descrever células estruturalmente indiferenciadas, que estão dispersas num meio nutriente líquido. Deve entender-se que as culturas em suspensão compreendem células em várias fases de agregação. Observa-se uma gama de tamanhos dê agregados nas suspensões descritas no presente invento, com tamanhos que variam entre dezenas de micra de diâmetro (células únicas ou poucas células agregadas) a agregados de muitos milímetros de diâmetro, consistindo em muitos milhares de células. O material da planta útil no presente invento foi obtido a partir de todas as espécies conhecidas de Taxus, i.e. brevifolia, canadensis, cuspidata, baccata, globosa, floridana, wallichiana, media e chinensis. Em particular, os

85 681 ΕΡ Ο 672 162/ΡΤ 9 inventores identificaram que a espécie Taxus chinensis é capaz de produzir quantidades significativas de taxol e taxanos, num período de tempo de cultura curto, sendo os compostos desejados segregados continuamente para o meio.

Os inventores verificaram que o teor específico de taxol varia com a espécie de planta e, dentro da espécie de planta, com a fonte de tecido e com as árvores específicas. A selecção de uma fonte com rendimento elevado para a produção de taxol é um primeiro passo importante para proporcionar quantidades suficientes de taxol para utilização terapêutica.

Início de linhas celulares de Taxus O material da planta Taxus pode ser recolhido em toda a América do Norte, bem como noutros continentes. A cultura é iniciada seleccionando o tecido de Taxus adequado para o crescimento. Pode-se seleccionar tecido de qualquer parte da planta, incluindo a casca, o câmbio, agulhas, caules, sementes, pinhas e raízes para a indução de calo. No entanto, para a obtenção de um rendimento óptimo em taxol, preferem-se as agulhas e regiões meristemáticas de partes da planta. São particularmente preferidas as agulhas recentes (e.g. com um a três meses de idade), que podem ser geralmente identificadas pela sua cor verde mais clara. O termo "recente" pretende incluir a produção de agulhas da planta durante a estação de crescimento desse ano. A fim de evitar a contaminação da cultura, o tecido deverá ser esterilizado à superfície antes de o introduzir no meio de cultura. Qualquer técnica de esterilização convencional, tal como tratamento com CLOROX (marca registada, da companhia CLOROX para lixívia) será eficaz. Além disso, agentes microbianos, como a cefoxitina, benlato, cloxacilina, ampicilina, sulfato de gentamicina e fosfomicina, podem ser utilizados para esterilização de superfície de material vegetal.

Crescimento de calo

As culturas exibirão tipicamente uma variabilidade na morfologia de crescimento, produtividade, perfis de produtos e outras características. Uma vez que as linhas celulares individuais variam nas suas preferências em relação aos constituintes do meio de crescimento, podem-se utilizar muitos meios de crescimento diferentes para a indução e proliferação do calo.

85 681 ΕΡ Ο 672 162/ΡΤ 10 A composição do meio adequada varia com a espécie em cultura. Os meios preferidos para as diferentes espécies estão listados na Tabela 3. Por exemplo, embora se possam utilizar outros, os dois meios nutrientes de crescimento preferidos para Taxus chinensis são A & D. Estes meios contêm preferencialmente os ingredientes listados na Tabela 2. Por exemplo, quando se utiliza o Meio A, as hormonas ou reguladores de crescimento são incorporados no meio numa quantidade entre 1 ppb a 10 ppm e de preferência de 2 ppb a 1 ppm. Quando se utiliza o Meio D, as hormonas de crescimento ou reguladores são incorporados a níveis que variam entre 1 ppb a 10 ppm e preferencialmente de 2 ppb a 2 ppm. Podem-se incorporar outros ingredientes do meio em quantidades desde 1/10 da concentração, a três vezes as concentrações indicadas na Tabela 2, mas são de preferência incorporados nos níveis apresentados na Tabela 2.

Crescimento em suspensão

As culturas em suspensão de Taxus são capazes de atingir taxas de crescimento rápidas e densidades celulares elevadas, tal como outras culturas de células vegetais. No entanto, as condições óptimas variam de uma linha celular para outra e, deste modo, devem considerar-se métodos que conduzam à optimização rápida para cada linha celular em particular.

As culturas iniciais de várias espécies de Taxus são sub-cultivadas por transferência para os meios listados na Tabela 3, contendo macro- e micronutrientes, sais orgânicos e hormonas de crescimento. As quantidades são geralmente nas seguintes gamas: começando com 1/10 da concentração, até três vezes a concentração de cada ingrediente do meio apresentado na Tabela 2. Os níveis preferidos são os listados na Tabela 2.

As culturas líquidas são expostas ao ar e de preferência agitadas, ou de algum outro modo movimentadas cuidadosamente, para introduzir ar no meio, ou o ar pode ser introduzido através de tubos introduzidos nos recipientes de cultura. As culturas são mantidas sob condições de crescimento adequadas a uma temperatura entre 20 a 26°C. 0 pH pode ser desde cerca de 3 a 7 e de preferência entre 4 e 6. A cultura pode ser crescida sob condições de luz que variam desde a escuridão total, à luz total (banda estreita e/ou espectro largo) para vários períodos de tempo. Uma vez que a produção total de taxol é mais elevada em culturas expostas à luz, esta é preferida. As condições de

85 681 ΕΡ Ο 672 162/ΡΤ 11 intensidade de luz típicas variam entre cerca de 100 e cerca de 3000 footcandie.

As culturas em suspensão são mantidas durante 1 a 8 semanas, desde o tempo de sub-cultura, após o ocorre um decréscimo no crescimento da cultura. As culturas são recolhidas por remoção do meio de crescimento, tal como por filtração. A cultura recolhida é pesada e seca, tal como por liofilização, moída num pó fino e o taxol pode ser extraído por utilização de técnicas convencionais de extracção com solventes.

Os tempos de duplicação foram medidos por monitorização do aumento de biomassa em função do tempo, bem como por monitorização simples do índice de crescimento, durante a sub-cultura de rotina. Obtiveram-se densidades máximas, em peso seco, de 15-24 gramas por litro. As características de crescimento de várias suspensões de espécies de Taxus são apresentadas no Exemplo 4. Métodos analíticos

Os métodos para a extracção e recuperação de taxol e taxanos a partir de células e do meio são de acordo com as técnicas convencionais, que estão descritos em pormenor no Exemplo 5. A técnica de imunoensaio (ELISA) seguiu, essencialmente, os protocolos fornecidos pela Hawaii Biotechnology no estojo comercialmente disponível. Os métodos de cromatografia líquida de alta eficiência foram ligeiramente modificados em relação aos protocolos existentes, elaborados como no Exemplo 5. Nas condições utilizadas no presente invento, obteve-se uma boa resolução dos picos de taxanos, resultando numa detecção e quantificação precisas. Devido à possibilidade de co-eluição de componentes que não taxanos, a pureza espectral de cada pico de taxano putativo foi verificada por um agrupamento de díodos, antes da integração da área dos picos. Os tempos de retenção dos padrões de taxano estão listados no exemplo 5 e inclui-se um cromatograma amostra na Figura 4.

Condições do meio de produção

Tal como aqui utilizada, a expressão "meio nutriente" é utilizado para descrever um meio que é adequado para a cultura de calo de células vegetais e culturas em suspensão. A expressão "meio nutriente" é genérica e inclui, quer o "meio de crescimento", quer o "meio de produção". A expressão "meio de 12 85 681 ΕΡ Ο 672 162/ΡΤ crescimento" é utilizada para descrever um meio nutriente que favorece o crescimento rápido das células em cultura. A expressão "meio de produção" refere-se a um meio nutriente que favorece a biossíntese de taxol e taxano em células em cultura. Deve entender-se que o crescimento pode ocorrer num meio de produção e que a produção pode ocorrer num meio de crescimento e que ambos, crescimento e produção óptimos, podem ocorrer num único meio nutriente.

Algumas classes de aditivos no meio nutriente são referidas por nomes especiais no presente invento e são aqui definidas. Tal como aqui utilizada, a expressão "agentes anti-aparecimento de cor castanha" referem-se a componentes que são adicionados ao meio nutriente para prevenir a formação de pigmentos durante a cultura de células. Estes pigmentos incluem compostos fenólicos e compostos relacionados, que se verifica terem geralmente um efeito prejudicial no crescimento e na viabilidade celulares, e na formação de produtos. Tal como. aqui utilizada, a expressão "precursores biossintéticos" é utilizada para descrever compostos adicionados ao meio nutriente que são metabolizados e incorporados pelas células em taxol e taxano. Tal como aqui utilizada, a expressão "iníbidores metabólicos" é utilizada para descrever compostos adicionados ao meio nutriente que interferem com vias biossintéticas específicas. Por exemplo, pode-se utilizar um inibidor metabólico para melhorar a biossíntese de taxol, por bloqueio de uma via diferente que compete com o taxol para um precursor biossintético precoce. Tal como aqui utilizado, o termo estimulador ou activador é utilizado para descrever compostos adicionados ao meio nutriente que estimulam ou activam vias biossintéticas específicas, por exemplo, as que conduzem à biossíntese do taxol. Deve entender-se que o mecanismo de acção dos aditivos aqui descrito poderá não ser completamente compreendido.

Se a formação de metabolitos secundários numa cultura em suspensão ocorre ao mesmo tempo que o crescimento, o metabolito é designado como associado ao crescimento e poderá ser suficiente uma única formulação de meio para se obter um bom crescimento e um nível elevado de produção. Em muitos outros sistemas, verificou-se que o crescimento rápido e a formação de produto elevada não ocorrem ao mesmo tempo. Nestes casos, as fases de crescimento e produção são separadas e desenvolve-se independentemente um meio para cada fase (revisto em Payne et al. 1991). No caso da produção de taxol e

85 681 ΕΡ Ο 672 162/ΡΤ 13 taxano em Taxus chinensis, o crescimento e a formação rápida de produto foram separados e desenvoiveram-se meios independentes para cada um. No entanto, deve entender-se que se pode formular um único meio de crescimento/produção para esta cultura. Os meios de produção aqui desenvolvidos não só aumentam a formação total de taxol e de taxano, mas também dirigem a biossíntese celular directa no sentido da produção de taxol. Além disso, a produção de subprodutos que interferem, como a cefalomanina, é mínima, comparada com o tecido da casca. Os meios de produção aqui desenvolvidos também promovem uma viabilidade celular e biossíntese prolongadas e, além disso, originam níveis significativos de produto segregado para o meio extracelular. Estas características são extremamente importantes na operação de um processo à escala comercial, eficaz para a produção de taxol.

Embora se possam utilizar outros, os meios de produção preferidos para as várias espécies estão listados na Tabela 5. Por exemplo, embora se possam utilizar outros, os meios de produção preferidos para Taxus chinensis são B & C. Estes meios contêm preferencialmente os ingredientes listados na Tabela 2. Estes meios contêm preferencialmente sais inorgânicos maiores e menores, orgânicos e hormonas de crescimento ou reguladores de crescimento. As quantidades são geralmente nas seguintes gamas, começando com 1/10 até três vezes a concentração de cada ingrediente do meio indicado na Tabela 2. No entanto, os níveis preferidos são os listados na Tabela 2.

Quando se utiliza o Meio B, os reguladores de crescimento são incorporados no meio numa quantidade entre 0,1 ppm e 20 ppm e de preferência entre 1 ppm e 10 ppm. Quando se utiliza o Meio C, os reguladores de crescimento são incorporados de preferência a níveis que variam de 0,1 ppm a 5 ppm.

Deve entender-se que é possível efectuar modificações neste meio, tais como substituição de outras composições de sais convencionais (como orgânicos, vitaminas, aminoácidos, precursores, activadores e inibidores), adição ou deleção de vários componentes, reguladores de crescimento, ou alterações das proporções. 14 85 681 ΕΡ Ο 672 1 62/ΡΤ

Além dos nutrientes dissolvidos não voláteis, os componentes gasosos, essencialmente oxigénio, dióxido de carbono e etileno (uma hormona vegetal), desempenham papéis críticos no crescimento e formação de produtos. Há dois parâmetros que são importantes. As concentrações de gases dissolvidos que favorecem o crescimento e a formação de taxol, são obviamente importantes, uma vez que ditam as condições de operação do reactor. Além disso, é necessário incorporar as taxas de consumo ou produção na concepção do reactor, de modo a que se possam manter as concentrações óptimas especificadas.

Além da sua importância na respiração, o oxigénio também pode afectar drasticamente a taxa de biossíntese secundária. Uma constante de saturação elevada para um passo que requer oxigénio, numa via biossintética secundária poderá necessitar que as células sejam submetidas a níveis elevados de oxigénio, no reactor. Está documentada a importância da suplementação de C02 na manutenção de taxas de crescimento elevadas. O etileno, uma hormona vegetal, desempenha papéis pleiotrópicos em todos os aspectos do crescimento e desenvolvimento da planta, incluindo o metabolismo secundário (e.g., veja-se Payne et ai., 1991)

Potenciadores

De modo a melhorar o rendimento de taxol e outros taxanos relacionados em culturas de células, os inventores fizeram várias abordagens. Uma das abordagens que tem sido utilizada para melhorar a produtividade é a utilização dos designados potenciadores. Tal como aqui utilizado, o termo potenciador é utilizado para compostos de origem biológica e não biológica que originam um aumento na produção de metabolitos secundários, quando aplicados a plantas ou culturas de células vegetais (Eilert 1987; Ebel 1984; e Darvill et ai 1984). Há muitos compostos diferentes que podem actuar como potenciadores, dependendo da natureza da sua origem e do seu modo de acção com o metabolismo celular. Nestes estudos, os inventores utilizaram dois tipos principais de potenciadores: 1) potenciadores bióticos que compreendem normalmente extractos de parede celular, ou filtrados de um grupo seleccionado de fungos, bactérias e leveduras, e também as suas fracções purificadas. 2) potenciadores abióticos que incluem agentes de stress químico, bem como compostos de origem biológica (vejam-se os potenciadores na Tabela 1).

85 681 ΕΡ Ο 672 162/ΡΤ 15

Christen et al. (1991) referem a utilização de potenciadores fúngicos e compostos seleccionados para a produção de taxol por suspensões de Taxus brevifotia; no entanto, não foi especificado o aumento no nível de acumulação de taxol devido aos tratamentos com o potenciador.

Em geral, ambos os tipos de potenciadores foram eficazes, embora a extensão a que a potenciação ocorreu (acumulação de taxano nas culturas de células, bem como a sua secreção para o meio) tenha sido diferente de potenciador para potenciador e de espécie para espécie. O maior aumento de produção foi obtido com glutamato de quitosano, liquenano, ácido ferúlico e ácido benzóico. O quitosano e o liquenano são polissacáridos complexos derivados de paredes celulares microbianas. O quitosano quando utilizado sozinho é insolúvel no meio e é tóxico, e origina danos celulares permanentes. O glutamato de quitosano, por outro lado, é facilmente solúvel no meio e não afecta a viabilidade celular. Os ácidos ferúlico e benzóico são químicos sintetizados de origem biológica e são geralmente utilizados como antioxidantes em sistemas biológicos.

Os potenciadores interagem com gases dissolvidos de muitos modos. As . necessidades de oxigénio podem ser alteradas com a potenciação. Observam-se vulgarmente aumentos nas taxas de respiração como resposta a uma ferida, em culturas de células vegetais. De salientar que os potenciadores podem mediar a sua acção através do etileno. Nestes casos, poderá ser desejável substituir uma preparação de um potenciador microbiano por etileno e talvez evitar a toxicidade associada a outros componentes microbianos na preparação do potenciador.

Os potenciadores e agentes de stress metabólico podem ser utilizados de acordo com o presente invento para maximizar a produção e a secreção de taxol em cultura de tecidos, determinando a especificidade e a concentração de potenciador, momentos e duração, como uma função da idade da cultura e da composição do meio.

Troca rápida de meio para melhorar a produtividade

Tal como documentado no exemplo 7.3, a remoção de meio esgotado e novo fornecimento de meio fresco a cada 3 dias contribuíram para uma

85 681 ΕΡ Ο 672 162/ΡΤ 16 melhoria significativa da produção de taxol e taxano total, bem como para um aumento nas quantidades de produto extracelular.

Os efeitos estimuladores da troca de meio podem ser devidos à remoção de produto in situ, que pode evitar a rectro-inibição e a degradação de produto. Estes efeitos positivos de remoção de produto in situ sobre a produção de metabolitos secundários e a secreção em culturas em suspensão foi documentado por, entre outros, Robins e Rhodes (1986) e Asada e Shuler (1989). A remoção periódica de meio esgotado incorpora as vantagens acima e pode servir, adicionalmente, para desreprimir a biossíntese secundária, por remoção de outros componentes inibitórios, que não o taxano (tais como compostos fenólicos), do meio. O fornecimento de meio fresco às células que sofrem biossíntese activa pode também aumentar a produção, proporcionando os nutrientes essenciais que foram esgotados. Por exemplo, Miyasaka et aí. (1986) conseguiram estimular células em fase estacionária de Sa/via miltiorhiza para produzir metabolitos de diterpeno, criptotanchinona e ferruginol, simplesmente adicionando sacarose ao meio. Presumivelmente, a biossíntese cessou devido a limitações de carbono na fase estacionária. O protocolo de troca periódica de meio utilizado no presente trabalho poderá ter sido benéfico, como resultado de qualquer dos factores acima mencionado.

Deve entender-se que a quantidade de meio trocado, a frequência das trocas e a composição do meio a ser fornecido podem variar. A capacidade de estimular a biossíntese e a secreção por troca periódica do meio, tem implicações importantes para a concepção e operação de um processo comercial eficiente no modo contínuo, semi-contínuo ou descontínuo com alimentação.

Luz

Para as plantas superiores, a luz é um factor potente no metabolismo secundário, tanto em plantas íntactas como em culturas de células. Tanto a intensidade como o comprimento de onda da luz são importantes (Seibert e Kadkade 1980). Por exemplo, a biossíntese de flavanóides e antocianina é normalmente favorecida por luz contínua de intensidade elevada, enquanto que

85 681 ΕΡ Ο 672 162/ΡΤ 17 as culturas cultivadas no escuro poderão ser preferíveis para outros metabolitos. O aumento da cor verde ou da capacidade fotossintética das células cultivadas, também pode aumentar a formação de produtos ou o espectro de produtos. Os estudos dos inventores envolveram a utilização de fontes de luz de banda larga, bem como fontes de luz de banda estreita, específicas. Como se pode ver no Exemplo 7.3, a exposição à luz pode resultar numa acumulação aumentada de taxol, bem como na secreção para o meio. O efeito estimulador da luz na produção de taxol sugere a existência de mecanismos de controlo únicos para a biossíntese de taxanos. A natureza do fotorreceptor e as características bioquímicas do estímulo induzido por luz não são ainda claras.

Modos de operação do processo 0 modo de operação para um processo de cultura de células vegetais refere-se ao modo como os nutrientes, as células e os produtos são adicionados ou removidos, ao longo do tempo (Payne et a!., 1991). Quando todos os nutrientes são fornecidos inicialmente e o conteúdo da cultura que compreende as células e o produto, é recolhido no final do período de cultura, o modo de operação é designado por "processo descontínuo numa fase". Quando um processo descontínuo é dividido em duas fases sequenciais, uma fase de crescimento e uma fase de produção, sendo o meio trocado entre as duas fases, o modo de operação é designado por "processo descontínuo em duas fases".

Numa operação "descontínua com alimentação", os aditivos e nutrientes particulares do meio são fornecidos quer periódica, quer continuamente no decorrer de uma cultura descontínua de uma fase, ou de duas fases.

Quando se recolhe uma porção substancial, mas não total, do conteúdo de uma cultura descontínua, com adição de meio fresco para o crescimento celular e produção contínuos, o processo assemelha-se a uma operação de "recolha e fornecimento repetidos" e é designada por processo semi-contínuo.

Quando se fornece meio fresco continuamente e se remove continuamente o meio efluente, o processo é designado por "contínuo". Se as células são retidas no reactor, o processo é designado por "modo de perfusão".

85 681 ΕΡ Ο 672 162/ΡΤ 18

Se as células são continuamente removidas com o meio efluente, o processo contínuo é designado por "quimióstato".

Deve entender-se que estes vários modos de operação são compatíveis com o sistema de produção de taxol aqui descrito.

EXEMPLOS

Os exemplos seguintes descrevem ainda os Materiais e Métodos utilizados na prática do invento. Os exemplos pretendem ser ilustrativos e não limitam o invento de nenhum modo.

Exemplo 1:

Iniciação de calo

Recolheram-se amostras de material de planta Taxus a partir de várias plantas selvagens e cultivadas. As amostras foram processadas à chegada ao laboratório, ou armazenadas a 4°C até poderem ser utilizadas. O material foi primeiro lavado com solução de sabão diluída, enxaguado com água e a superfície foi esterilizada numa solução CLOROX (1% de hipoclorito, pH 7), durante 10 minutos. Sob condições estéreis, o material foi então enxaguado 3 vezes com água estéril. Cortaram-se então as agulhas numa solução de polivinilpirrolidona (PVP) a 1%, com 100 mg/l de ácido ascórbico. As agulhas foram colocadas com a extremidade cortada em Meio E (veja-se Tabela 2). Fez-se a cultura de trinta a quarenta explantes por placa de meio. As placas que continham os explantes foram incubadas a 24^1 °C no escuro. As placas foram monitorizadas diariamente quanto ao aparecimento de microorganismos contaminantes e quando estes estavam presentes, removeram-se as agulhas não contaminadas e colocaram-se numa placa com Meio E fresco. Observou-se uma formação substancial de calo e os calo foram separados do explante aos 20 dias e colocados em vários meios de proliferação de calo, listados na Tabela 3. Por exemplo, os calos de Taxus chinensis foram transferidos para Meio D (veja-se Tabela 2). O processo de iniciação foi muito eficiente, resultando numa baixa taxa de contaminação e frequência elevada de indução de calo, em mais de 90% dos explantes de início. Utilizou-se, com sucesso, o mesmo processo para iniciar culturas de Taxus brevifolia, Taxus

85 681 ΕΡ Ο 672 162/ΡΤ 19 canadensis, Taxus cuspidata, Taxus baccata, Taxus globosa, Taxus f/oridana, Taxus wallichiana, Taxus media e Taxus chinensis.

Exemplo 2 Proliferação de calo

Uma vez removidos os calos do explante, estes são cultivados a 24jM°C no escuro. As partes saudáveis do calo foram transferidas para meio fresco a cada 10 dias e verificou-se que esta frequência de transferências era extremamente importante para a prevenção do aparecimento da cor castanha e para a manutenção prolongada do calo. Os meios de crescimento e manutenção preferidos para calos de várias espécies, estão resumidos na Tabela 3.

Exemplo 3:

Início da suspensão

Inoculou-se, de forma asséptica 1 g, em peso fresco, de material de calo num balão Erlenmeyer de 125 ml, contendo 25 ml de meio líquido adequado para cada espécie (veja-se Tabela 3). Por exemplo, utilizou-se o Meio D para Taxus chinensis. O balão foi coberto com uma capa de espuma de silicone (Bellco, NJ) e colocado num agitador giratório a 1 20 rpm a 24+ 1°C, no escuro. Formaram-se culturas em suspensão, em aproximadamente 3 a 10 dias. Inicialmente, o meio foi trocado filtrando por sucção o conteúdo do balão através de um funil de Buchner 'contendo um filtro Miracloth (Calbiochem) e ressuspendendo toda a biomassa em meio fresco. Após o crescimento celular, transferiram-se 1-2 g (peso fresco) de células para um novo balão de 125 ml contendo 25 ml de meio fresco e em seguida estas foram sub-cultivadas semanalmente.

Exemplo 4:

Crescimento de células suspensas

As taxas de crescimento e densidades celulares típicas obtidas em culturas em suspensão das espécies representativas, estão listadas na Tabela 4.

Como exemplo pormenorizado, apresenta-se na Figura 1 o aumento de biomassa (peso fresco e peso seco) ao longo do tempo para o Taxus chinensis linha K-1. A taxa máxima de crescimento foi medida calculando o declive tomado nos pontos de aumento mais rápido de biomassa nas curvas de crescimento. As culturas de células de Taxus chinensis cresceram com um 20 85 681 ΕΡ Ο 672 162/ΡΤ tempo de duplicação máximo de 2,5 dias. Esta taxa de crescimento é significativamente mais elevada do que a referida anteriormente para as culturas em suspensão de espécies de Taxus. Por exemplo, Christen et al. (1991) referem um aumento de 5 a 10 vezes na biomassa após 3 a 4 semanas de cultura, o que se traduz num tempo de duplicação médio de 7 a 12 dias, para suspensões de Taxus brevifolia. A capacidade de cultivar células a uma densidade elevada é importante para maximizar a produtividade volumétrica de um processo de cultura de células. Enquanto que as culturas de Taxus brevifolia atingiram uma densidade celular inferior a 1 g, em peso seco, por litro (calculada a partir dos dados apresentados em Christen et al. (1991)), as suspensões de Taxus chinensis conseguiram atingir densidades de até 8 a 20 g, em peso seco, por litro, após 18 dias de crescimento. A viabilidade das células foi determinada corando as células com uma solução de diacetato de fluoresceína a 0,05% em acetona (Widholm, 1972) e por contagem do número de células verdes fluorescentes após excitação com luz azul, num microscópio de fluorescência invertido (Olympus IMT-2, Japão). A viabilidade celular era maior do que 90% ao longo da fase de crescimento. A capacidade de cultivar células sob condições de crescimento rápido até densidades celulares elevadas, mantendo ao mesmo tempo uma viabilidade elevada é um pré-requisito importante para a operação económica de um processo de cultura de células vegetais, para produzir taxol e compostos do tipo taxol.

Exemplo 5

Análise de taxol e taxanos 5.1 Métodos ELISA A análise ELISA para o taxol (Hawaii Biotech) foi utilizada para a pesquisa em grande escala de linhas celulares. Este método proporciona uma sensibilidade elevada (0,1 ng/ml), mas uma vez que se utiliza um anticorpo monocional, observa-se uma reacção cruzada com outros taxanos. A HPLC preparativa (escala analítica) com recolha de fracções mostrou uma reactividade cruzada com 10-desacetiltaxol, 7-xilosil-1O-desacetiltaxol, cefalomanina, 10-desacetil-7-epitaxol, 7-epitaxol, bem como outros taxanos não identificados. 21 85 681 ΕΡ Ο 672 162/ΡΤ

Apesar desta reactividade cruzada, verificou-se que este método é extremamente útil para a detecção da produção de taxano e permitiu a pesquisa rápida de um grande número de linhas celulares. Os extractos celulares que apresentam uma produção significativa de taxanos foram então analisados em pormenor utilizando o processo de HPLC acima descrito. 5.2. Extracção de taxol e taxanos relacionados A extracção de taxanos a partir dos sobrenadantes fòi realizada por dois métodos, dependendo das concentrações presentes nos meios. Quando estavam presentes nos meios líquidos quantidades suficientes de taxanos, as amostras foram preparadas de forma muito rápida e eficiente. Os meios (2 ml) foram completamente secos (in vacuo) e adicionou-se uma quantidade medida de metanol (0,5-2,0 ml). Esta mistura foi agitada por aplicação de ultra-sons até à dissolução ou dispersão completa da amostra. Removeram-se os sólidos por centrifugação, antes da análise por HPLC. As recuperações quantitativas foram obtidas a níveis de 1 mg/l, com níveis de detecção muito abaixo dos 0,1 mg/l.

Quando a concentração de taxanos nos sobrenadantes da cultura era baixa, o meio foi extractado três vezes com um volume igual de uma mistura de cloreto de metileno e álcool isopropílico (IPA) (9:1 em vol.). A camada orgânica foi reduzida até à secura e reconstituída num volume de metanol medido (50-250 ml). A extracção múltipla recuperou tipicamente 90-95% do taxol, cefalomanina e bacatina III a níveis de 0,6 mg/l.

Os materiais celulares foram extraídos congelando células colhidas de fresco (-5°C), seguindo-se secagem por vácuo e extracção "Soxhlet" com metanol, durante 50 ciclos. Recuperaram-se geralmente 70 a 80% de taxanos com uma decomposição mensurável de 10-15%. A extracção de meios sólidos e calo foi realizada de forma idêntica à das células, no entanto, realizou-se sempre a partição em cloreto de metileno/IPA vs. água, do extracto metanólico final. 5.3. Métodos de cromatografia líquida de alta eficiência

A cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) foi realizada numa coluna de bifenilo altamente carregada com carbono (Supelco, 5 mM, 4,6 mm x 25 cm) com um sistema de mistura de alta pressão com gradiente binário LDC

85 681 ΕΡ Ο 672 162/ΡΤ 22

Analítico, que consiste de bombas CM3500/CM3200, um amostrador automático de volume variável CM4100 e um detector por agrupamento de fotodíodos SM5000, em interface com um computador pessoal Total Peripherals 486. A temperatura da coluna foi regulada a 35°C, com um forno de colunas Eldex CH150. A análise de HPLC quantitativa de taxanos foi realizada utilizando um esquema de eluição com um gradiente binário, como se segue:

Tempo % de Eluente A % de Eluente B Caudal 0 75 25 1 ml/min 40 35 65 11 42 25 75 II 47 25 75 »r 50 75 25 t»

Eluente A = KH2PO4 0,015 mM acertado para pH 3,5 com ácido trifluoroacético Eluente B = acetonitrilo

Os métodos cromatográficos utilizados assemelham-se a diversos métodos publicados (Witherup et al. 1989) com as excepções de que se utilizaram um tampão fosfato que contém ácido trifluoroacético e um gradiente maior. Estas diferenças melhoram significativamente a resolução do taxol e outros taxanos a partir da mistura. Os tempos de retenção relativos observados para os taxanos são apresentados a seguir. 0 taxol elui entre 31 e 33 minutos, dependendo da coluna e do hardware utilizados.

Composto Tempo de retenção relativo 10-desacetilbacatina III 0,38 bacatina III 0,56 7-xilosil-10-desacetiltaxol C 0,80 10-desacetiltaxol C 0,87 cefalomanina 0,94 10-desacetil-7-epitaxol C 0,98 taxol C 1,00 7-epitaxol 1,12

Os tempos de retenção do taxol, cefalomanina e bacatina III foram determinados utilizando amostras autênticas obtidas no National Câncer Institute. Os tempos de retenção dos outros taxanos acima listados foram

85 681 ΕΡ Ο 672 162/ΡΤ 23 comparados com os padrões analíticos fornecidos pela Hauser Chemical (Boulder CO). A identificação de taxanos conhecidos baseou-se em comparações do tempo de retenção e espectros de ultravioleta. A quantificação do taxol, da cefalomanina e da bacatina III baseou-se em factores de resposta determinados a partir de materiais autênticos. A quantificação da 10-desacetilbacatina III foi realizada utilizando o factor de resposta determinado para a bacatina III. A quantificação dos derivados de taxol remanescentes baseou-se de forma conservativa, no factor de resposta medido para o taxol.

Cada um dos padrões (10 ml) foi tipicamente injectado (inicialmente e após 3 ou 4 amostras) e as áreas para cada um destes três componentes foram integradas. Os factores de resposta para cada um dos componentes foram obtidos por análise linear dos mínimos quadrados, dos dados. Injectaram-se 10 ml de cada amostra e a quantidade por injecção foi calculada com base na regressão dos dados padrão. Estes resultados foram convertidos em quantidade por litro, ou percentagem em peso seco. A figura 4 ilustra um cromatograma típico de uma amostra de sobrenadante. 5.4 Confirmação por EM/EM de taxol A identidade do taxol no sobrenadante da cultura de células foi confirmada utilizando um método EM/EM (como apresentado na Figura 6) que junta a injecção de fluxo com a ionização química à pressão atmosférica, por pulverização iónica. Os pormenores dos processos utilizados para adquirir os dados apresentados na Figura 6 foram como se segue: Espectrómetro de massa: Sciex API 3 triplo quadrupolo com uma fonte de ionização à pressão atmosférica. Utilizou-se azoto como gás cortina e árgon como gás de colisão para os espectros CID. Interface: Interface de pulverização de iões que produz iões por Ionização por Evaporação Iónica (Electropulverização). Utilizou-se ar zero como gás nebulizador. Bomba LC: ABI 140B bomba de seringa dupla operando a 5 μΙ/minuto. Solventes: acetonitrilo/H20 50/50, NH40Ac 2 mM + ácido fórmico a 0,1%. Volume de inieccão: 5 μΙ, todos os espectros foram tomados por análise de injecção de fluxo. Este método proporciona uma confirmação inequívoca da presença de taxol em amostras de cultura de células e proporciona também uma quantificação com uma excelente concordância com os resultados de HPLC.

85 681 ΕΡ Ο 672 162/ΡΤ 24

Exemplo 6

Produção de taxol por várias espécies O taxol produzido por culturas de células de várias espécies de Taxus está resumido na Tabela 5. Cultiva-se calo durante 20 dias no escuro, no meio solidificado indicado para cada espécie. As células e o meio foram secos e extraídas em conjunto com metanol e testadas, quer por ELISA quer por HPLC, como indicado. Os resultados obtidos com as culturas de Taxus chinensis são pormenorizados mais à frente nos exemplos 7 e 8.

Exemplo 7 7.1. Produção em meio de crescimento A produção de taxol e taxanos relacionados teve início nos primeiros 2 dias de transferência para Meio A de crescimento. O taxol máximo observado ocorreu ao dia 15, a 8,81 pg/balão, o que corresponde a 0,44 mg/litro de taxol. Destes, 46,1% estavam presentes no meio extracelular. No dia 15, a concentração total de taxano era de 72,87 pg/balão ou 3,6 mg/litro, dos quais 58,6% estavam presentes no meio extracelular. A viabilidade das células era sempre maior do que 90%, medidos por coloração por fluorescência (Exemplo 4), sugerindo que a presença de taxol e taxanos extracelulares era devida à . secreção e não a lise celular. A capacidade das células segregarem taxol e taxanos será um aspecto importante na operação em contínuo. 7.2. Troca de meio para melhoria da produtividade

Obtiveram-se melhorias significativas na produtividade de taxol e taxanos totais por sucção asséptica de Meio A de crescimento no dia 9, substituindo-o por meio fresco e repetindo o processo no dia 12. A experiência foi concluída no dia 15 e os resultados são apresentados na Figura 2. Os importantes aumentos na produtividade devido à troca de meio estão resumidos na Tabela 6. As quantidades totais de taxol e taxanos produzidos eram ca. 4-6 vezes maiores com a troca de meio, em comparação com controlos sem tratamento. De salientar que se recuperaram ca. 4,9 vezes mais taxol e ca. de 5,9 vezes ’ mais taxanos totais no meio extracelular, em comparação com controlos sem tratamento de troca de meio. A capacidade de aumentar de forma acentuada as produtividades de taxol e taxanos totais e, além disso, originar uma acumulação de produto extracelular

85 681 ΕΡ Ο 672 162/ΡΤ 25 é importante para a operação de um processo eficiente, contínuo, com reutilização de biomassa e purificação subsequente simplificada. 7.3. Efeito da luz na produção de taxano no meio de crescimento

Sabe-se que a luz desempenha um papel importante não só na fotossíntese, mas também em vários aspectos do metabolismo secundário em cultura de células vegetais (Seibert e Kadkade 1980). As experiências descritas nos exemplos 4, 7.1 e 7.2 foram realizadas no escuro, descrevendo-se aqui a resposta das culturas de Taxus chinensis à luz.

Inoculou-se um grama, em peso fresco, de células de Taxus chinensis linha K-1, de 7 dias de idade, em 25 ml de Meio A de crescimento (veja-se Tabela 2) em balões Erlenmeyer de 125 ml e incubou-se a 24 +1 °C num agitador giratório a 120 rpm. Colocaram-se balões em duplicado no escuro e sob uma lâmpada GroLux Standard, a uma distância de 3 pés. As características espectrais da lâmpada são apresentadas na Figura 3. Os resultados são apresentados na Tabela 7. A exposição de culturas à luz não afectou os níveis de taxano total, nem a extensão da acumulação extracelular. No entanto, os perfis de taxano foram significativamente alterados nos dois tratamentos. Por exemplo, as células cultivadas à luz produziram 2,8 vezes mais taxol do que as células no escuro. A proporção de taxol extracelular também era significativamente maior do que no tratamento no escuro (76% vs 56%). A utilização de tratamento de luz, especialmente de qualidade espectral específica, seria assim extremamente útil num processo de cultura de células para a produção de taxol.

Exemplo 8 Potenciadores O termo potenciadores é utilizado para compostos de origem biológica (ou bióticos) e não biológicos (ou abióticos) que originam um aumento no metabolismo secundário quando adicionados a culturas de células vegetais.

Apesar de se ter verificado que vários potenciadores são úteis, descreve-se aqui em pormenor um exemplo ilustrativo e representativo, nomeadamente, a utilização de glutamato de quitosano. Apesar de o quitosano ter sido anteriormente testado como potenciador nalguns sistemas de cultura de células

85 681 ΕΡ Ο 672 162/ΡΤ 26 vegetais, as reacções tóxicas paralelas, como o aparecimento de cor castanha e a perda de viabilidade, tornaram o seu uso impraticável (Beaumont e Knorr 1987). De facto, estas reacções laterais tóxicas são um revés comum a muitos dos potenciadores descritos na literatura. A utilização de quitosanos quimicamente modificados, como o glutamato de quitosano, para induzir especificamente a biossíntese de taxol e taxano, ultrapassando ao mesmo tempo os efeitos laterais tóxicos é uma abordagem inovadora.

Filtraram-se por sucção, de forma asséptica, suspensões de Taxus chinensis, linha K-1, crescidas em Meio D, durante 7 a 8 dias, utilizando um funil de Buchner estéril equipado com um filtro Miracloth (Calbiochem). Transferiram-se, de forma asséptica, 2 g, em peso fresco, de células para 25 ml de Meio C (veja-se Tabela 2) num balão Erlenmeyer de 125 ml. Preparou-se de fresco uma solução a 0,05% de glutamato de quitosano e esterilizou-se por filtração através de um filtro de cartucho de 0,22 micra. Adicionaram-se 825 μΙ desta solução ao balão no início da experiência, correspondendo a um nível de 1 65 mg de potenciador por grama, em peso seco, de células. Os balões foram incubados a 24_+_1°C num agitador giratório a 1 10 rpm no escuro. Os balões foram amostrados, de forma destrutiva, no dia 15 e registaram-se as observações relativas ao crescimento, cor das células e meio e viabilidade celular. As amostras liofilizadas foram extraídas com metanol para se obter taxol e taxanos, como descrito no Exemplo 5 que foram analisados por HPLC. Os resultados desta experiência são apresentados na Tabela 8. 0 tratamento com potenciador resultou numa melhoria modesta na produção de taxano total por célula (0,53% vs 0,42%, em peso seco, de taxanos) em relação a controlos não tratados. A natureza não tóxica do potenciador era evidente pelas viabilidades elevadas (75-80%), observadas em ambos os tratamentos. De facto, observou-se, de forma reprodutível um maior peso seco no tratamento com potenciador, em comparação com controlos (14,2 g/l vs 10,1 g/l em peso seco). As maiores densidades celulares resultaram num título 1,8 vezes maior em taxanos totais no tratamento com potenciador, i.e. 75,8 mg/l versus 42,4 mg/l para o controlo. O tratamento com potenciador resultou numa biossíntese de taxol aumentada, tanto em termos comparativos por célula (0,098% vs 0,054%, em peso seco, de taxol, um aumento de 1,8 vezes) como em título (13,9 mg/l

85 681 ΕΡ Ο 672 162/ΡΤ 27 versus 5,4 mg/l, um aumento de 2,6 vezes). A extensão da secreção era maior para o tratamento com potenciador, em comparação com o controlo (85% versus 72% de produto extracelular). 0 tratamento com potenciador aqui descrito resulta numa produção de taxol aumentada, num perfil de produto mais favorável, numa secreção de produto aumentada e retenção de uma viabilidade celular elevada. Estas cáracterísticas de produção representam uma melhoria significativa para um processo de cultura de células, para a produção de taxol.

Exemplo 9

Desenvolvimento do meio de produção

Numa tentativa de aumentar as produtividades de taxol, em relação aos níveis descritos no exemplo 6, manipularam-se os níveis de nutriente para formular 'meios de produção' especiais. Filtraram-se por sucção, de forma asséptica, suspensões de Taxus chinensis, linha K-1, de 7 a 8 dias de idade, crescidas em Meio D, utilizando um filtro de Buchner estéril equipado com um filtro Miracloth (Calbiochem). Transferiram-se de forma asséptica 500 mg, em peso fresco, de células para 5 ml de Meio B e C de produção (veja-se Tabela 2). Os vasos foram incubados durante períodos de tempo variáveis de 1 8, 25 e 42 dias a 24 +1 °C num agitador giratório a 110 rpm, no escuro. Os tratamentos foram amostrados, de forma destrutiva e registaram-se as observações relativas a crescimento, cor das células e do meio e viabilidade celular. As amostras liofilizadas foram extraídas com metanol para se obter taxol e taxanos, como descrito no Exemplo 5, e foram analisadas por HPLC. i 9.1 Resultados de cultura de 18 dias

As culturas de células de Taxus chinensis responderam às composições alteradas de meio, produzindo níveis significativos de taxanos e taxol. Estes dados estão resumidos na Tabela 9 e apresenta-se uma amostra de um cromatograma na Figura 4. No Meio B, produziram-se 99,8 mg/litro de taxanos totais, com 24,1 mg/l de taxol puro. No Meio C, produziram-se 110 mg/litro de taxanos totais, com 21,3 mg/litro de taxol. Numa base de peso seco, as células produziram 0,18%, em peso seco, de taxol em Meio B e 0,065%, em peso seco, de taxol em Meio C.

85 681 ΕΡ Ο 672 162/ΡΤ 28 9.2. Cultura prolongada A produção de taxol e taxano após cultura prolongada de Taxus chinensis (linha K-1) durante 25 e 42 dias foi estudada em Meio C, sendo os resultados apresentados na Figura 5. Podem-se resumir as seguintes observações significativas: (i) As culturas em suspensão de Taxus são capazes de produzir níveis significativos de taxol e outros taxanos. A maior acumulação ocorreu aos 42 dias, com 0,32%, em peso seco, de taxol, 0,62%, em peso seco, de taxanos totais; correspondendo a títulos de 153 mg/l de taxol e de 295 mg/l de taxanos totais, com base no volume final de Meio. A análise desta amostra por espectrometria de massa em série confirmou a presença de taxol, como apresentado na Figura 6. A quantificação por EM/EM mostrou uma concordância excelente com a HPLC. (ii) A taxa de biossíntese de taxol entre os dias 25 e 42 era de ca. de 7,6 mg de taxol por litro por dia, assumindo uma produção linear no período de 17 dias. Esta taxa é significativamente mais elevada do que a taxa de produção nos i primeiros 25 dias. A taxa de biossíntese total de taxano entre nos dias 25 e 42 era de 1 2,3 mg por litro, por dia. (iii) Ás formulações de meios de produção podem induzir aumentos de até 45 vezes no teor específico de taxol, em comparação com condições de crescimento rápido, como as descritas no Exemplo 7. (iv) 0 espectro do produto pode ser manipulado de modo a canalizar a biossíntese para o produto final de taxol desejado, minimizando ao mesmo tempo a produção de taxanos indesejáveis. Por exemplo, no dia 25, o taxol constituía 28% dos taxanos totais e no dia 42, o taxol constituía 52% dos taxanos totais em contraste com o meio de crescimento (veja-se o Exemplo 7.1), em que o taxol constituía apenas 12,2% dos taxanos totais. Esta capacidade de manipular os perfis dos produtos terá repercussões importantes para a purificação subsequente e para questões de regulação relacionadas com a pureza do produto. Por exemplo, a capacidade de suprimir a produção do produto secundário de taxano, a cefalomanina, poderia simplificar significativamente a purificação subsequente, em comparação com a purificação do taxol a partir do tecido da casca.

85 681 ΕΡ Ο 672 162/ΡΤ 29 (ν) As culturas de células de Taxus foram induzidas a segregar quantidades significativas de taxol (87% no dia 42) e outros taxanos. O facto de a presença de taxol e taxanos extracelulares ser devida à secreção e não à lise celular é corroborado por várias observações independentes: (a) ocorreu uma biossíntese continuada entre os dias 25 e 42, sugerindo que as células eram viáveis e activas. Observações independentes mostraram que se observou uma viabilidade >70% após 18 dias no meio de produção, (b) foram segregadas diferentes percentagens de taxanos diferentes. Se as células estivessem lisadas, seria de esperar que a percentagem no meio fosse semelhante para os diferentes taxanos. (vi) A capacidade desta linha celular de Taxus prosperar e produzir taxol a taxas elevadas, num ambiente extracelular tão rico em produto é particularmente notável. (vii) A linha celular de Taxus com que se obtiveram estes resultados é também capaz de um crescimento rápido até densidades celulares elevadas e expressou as produtividades referidas após 20 gerações, sob condições de crescimento rápido, atestando a sua estabilidade e potencial comercial.

Os níveis de taxol e taxanos produzidos pelas linhas celulares de Taxus chinensis nas condições aqui descritas são maís elevados do que os anteriormente referidos, por um factor de 35 a 150 vezes. Por exemplo, Christen et al. (1991) referem a produção de 1 a 3 mg/litro de taxol por culturas em suspensão de Taxus brevifolia após 2 a 4 semanas de cultura. Wickeramesinhe e Arteca (1991) referem a produção de taxol a 0,009% de peso seco em culturas de células de Taxus media.

Em resumo, os nossos dados mostram que com cuidadosas iniciação e selecção de culturas de Taxus chinensis, e com condições de meios de crescimento especialmente formuladas, as células podem ser induzidas a crescer rapidamente até densidades celulares elevadas. Quando estas células são transferidas para condições de meio de produção, as células são capazes de biossintetizar e segregar níveis significativos de taxol e outros taxanos durante períodos prolongados, mantendo ao mesmo tempo viabilidades elevadas. A incorporação da troca de meio periódica, luz e potenciadores com meio de produção resulta em novas melhorias de produtividade sinergísticas. Estas

85 681 ΕΡ Ο 672 162/ΡΤ 31

REFERÊNCIAS Μ. Asada e M.L. Shuler, 1989. Stimulation of Ajmalicine Production and Excretion from Catharanthus roseus: Effects of adsorption in situ, Elicitors and Alginate Immobilization. Appl. Microbiol. Biotechnol., 30, 475-481. M. D. Beaumont e D. Knorr, 1987. Effects of immobilizing agents and Procedures on Viability of Cultured Celery (Apium graveolens) Cells. Biotechnol. Lett. 9, 377-382. J. Berlin e L. Witte, 1988. Formation of Mono and Diterpenoids by Cultured Cells of Thuja Occidentalis. Phytochemistry. 27, 127-132 C.H. Bornman, 1983. Possibilities and Constraints in the Regeneration of Trees from Cotyledonary needles of Picea abies in vitro. Physiol. Plant. 57, 5-16. A.A. Christen, D.M. Gibson e J. Bland. 1991. Production of Taxol or Taxol-Like Compounds in Cell Culture. Patente U.S. 5019504. A.G. Darvill and P. Albersheim. 1984. Phytoalexins and their Elicitors-A Defense Against Microbial Infection in Plants. Ann. fíev. Plant Physiol. 35, 243-275 N. E. Delfel e J.A. Rothfus. 1977. Antitumor Alkaloids in Callus cultures of Cepha/otaxus harringtonia. Phytochemistry. 76,1595-1598 J.N. Denis, A. Corrêa e A.E. Greene. 1991. Direct Highly Efficient Synthesis from S-Dextro Phenylglycine of the Taxol and Taxotere Side Chains. J. Org. Chem. 56, 6939-6942. J. Denis, A.E. Greene, D. Guenard e F. Guerrite-Voegelein. 1990. Process for Preparing Taxol. Patente U.S. 4924011. J.N. Denis, A.E. Greene, D. Guenard, F. Guerrite-Voegelein, L. Mangatal e P. Potier. 1988. Highly Efficient Praticai Approach to Natural Taxol. J. Am. Chem Soc., 110, 5917-5919

85 681 ΕΡ Ο 672 162/ΡΤ 32 J. Ebel. 1984. Induction of Phytoalexin Synthesis in Plants Following Microbial Infection or Treatment with Elicitors. Bioregulators: Chemistry and Uses. 257-271. U. Eliert. 1987. Elicitation: Methodology and Aspects of Application. In "Cell culture and Somatic Genetics of Plants" Vol. 4, F. Constabel e I.K. Vasil (eds) Academic Press, Nova Iorque, pp. 153-196. P.F. Heinstein. 1985. Future Approaches to the Formation of Secondary Natural Products in Plant Cell Suspension Cultures. Journal of Natural Products 48, 1-9 R. A. Holton 1991. Method for Preparation of Taxol Using an Oxazinone. Patente U.S. 5015744. M. Jaziri B.m., Diallo, M.H. Vanhaelen, R.J. Vanhaelen-Fastre, A. Zhiri, A.G. Becu e J. Homes. 1991. Enzyme-linked Immunosorbent Assay for the detection and the Semi-Quantitative Determination of Taxane Diterpenoids Related to Taxol in Taxus sp. and Tissue Cultures. J. Pharm. Belg. 46, 93-99. H. Miyasaka, M. Nasu, T. Yamamoto, Y. Endo e K. Yoneda. 1986. Regulation of Ferruglnol and Cryptotanshinone Biosynthesis in Cell Suspension Cultures of Salvia Miltiorrhiza. Phytochemistry 25, 637-640. G.F. Payne, V. Bringi, C. Prince e M.L. Shu/er. 1991. Plant Cell and Tissue Culture in Liquid Systems, Hanser Publishers, Munique. R.J. Robins e M.J.C. Rhodes. 1986. The Stimulation of Anthraquinone Production by Cinchona ledgeriana Cultures with Polymeric Adsorbents. Appl. Microbiol. Biotechnol., 24, 35-41. E.K. Rowinsky, L.A. Cazenave e R.C. Donehower. 1990. Taxol: A Nove! Investigational Antimicrotubule Agent. J. Natl. Câncer Inst., 82, 1247-1259. M. Seibert e P.G. Kadkade. 1980. Light in "Plant Tissue Culture as a Source of Biochemicals". E.J. Staba (ed) CRC Press, Boca Raton, Florida, pp. 123-141.

85 681 ΕΡ Ο 672 162/ΡΤ 33 W. van Uden, Ν. Pras e Τ.Μ. Malingre. 1990. The Accumulation of Podophyllotoxin-B-D-glycoside by Cell Suspension Cultures Derived from the Conifer Callitris drummondii. Plant Cell Reports 9, 257-260. M.C. Wani, H.L. Taylor, M.E. Wall, P. Coggort e M.T. McPhail, 1971. Plant Antitumor Agents. VI. Isolation and Structure of Taxoi, a Nove! Antileukemic and Antitumor Agent from Taxus brevifolia. J. Am. Chem. Soc. 93, 2325-2327. P.J. Westgate, A.H. Emery, P.M. Hasegawa e P.F. Heinstein. 1991. Growth of Cephalotaxus harringtonia Plant Cell Cultures. Appl. Microbial Biotechnol. 34, 798-803. E.R.M. Wickeramesinhe e R.N. Arteca. 1991. Habitua ted Callus Cultures of Taxus media cultivar Hicksii as a Source of Taxo! (Abstract). Plant Physiol., 96 (Supplement) p. 97. J. M. Widho/m. 1972. The Use of Fluorescein Diacetate and Phenosafranine for Determining Viability of Cultured Plant Cells. Stain Technoi., 47, 189-194. K. M. Witherup, S.A. Look, M.W. Stasko, T.G. McCIoud, H.J. Issaq e G.M. Muschik 1989. HPLC Separation of Taxoi and Related Compounds from Taxus brevifolia. J. Liq. Chrom. 12, 2117-2132. K. M. Witherup, S.A. Look, M.W. Stasko, T.J. Ghiorzi, G.M. Muschik. 1990. Taxus spp. Needfes Contain Amounts of Taxoi Comparab/e to the Bark of Taxus brevifolia: Analysis and Isolation. Journal of Natural Products 53, 1249-1255 L. X. Xu e A.R. Liu. 1991. Determination of Taxoi in Taxus chinensis by HPLC Method. Acta Pharmaceutica Sinica, 26, 537-540.

85 681 ΕΡ Ο 672 162/ΡΤ 34

Tabela 1.a. Lista de potenciadores utilizados na potenciação de Culturas de células de Taxus spp. I. Potenciadores bióticos (microorganismos) • Botrytis cinerea • Phytophthora meqasperma • Pinellas stripticum • Oliqosporus sp, • Pvthium mamillatum » Pythium svlvaticum • Verticiílium dahliae • Verticiílium sp. • Penicillium minioluteum • Phvtophtora lateralis • Cvtospora cincta • Cvtospora leucostoma • Alternaria brassicicola • Alternaria solani • ALternaria cucumerina • Botrvtis sguamosa • Cochliobolus heterostrophus • Colletotrichum trifolii • Colletotrichum orbiculare • Colletotrichum qraminicola • Colletotrichum qloeosporioides • Cviindrocladium floridanum • Fusarium crookwellense • Fusarium heterosporium • Fusarium oxvsporum f. sp. conglutinans • Fusarium oxvsporum f. sp. lycopersici • Fusarium oxvsporum f. sp. pisi • Gibberella zeae • Gaeumannomvces qraminis var. tritici • Geotrichum sp. • Leotosphaeria korroae

• Nectria haematococca MPVI • Mvcosphaerella pinodes • Qphiostoma ulmi 35 85 681 ΕΡ Ο 672 162/ΡΤ • Phoma linqam • Phoma pinodella • Phvtophthora infestans • Pvthium aristosporum • Pvthium graminicola • Pvthium ultimum • Rhizoctonia solani • Sclerotinia sp. • S. nodorum D-45 • Trametes versicolor • Ustillaqo mavdis • Venturia inaequalis II. Potenciadores bióticos (fracções ou produtos microbianos) • Quitosano • Celulisina • Liquenano • Multifect XL • Glucomanano • Multifect CL • Pleurano • Resinase • Glucano • Pulpxyme • Carboximetilglucano • SP431 • Hidroximetilglucano • Pectinol • Sulfoetilglucano • Rapidase • Manano • Klerzyme • Xilano • Quitinase • Manobiose • Manotriose • Manopentose • Manotetraose III. Potenciadores abióticos (Agentes de stress agentes bioquímicos que ocorrem naturalmente) • Ácido araquidónico • sulfato de vanadilo • Ácido elaídico • Uniconazol • AMP cíclico • Paclobutrazol • AMP Dibutiril cíclico • Espermina • Jasmonato de metilo • Espermidina • Cis-Jasmona • Putrescina • Fenpropemorfo • Procloraz • Naptifine

• EDU

• HTA

• MPTA 36 85 681 ΕΡ Ο 672 162/ΡΤ • Miconazol • Ácido Ferúlico • ΑΜΟ-1618 • Triton Χ-100 • Ácido Benzóico • Ácido salícílico • Gaiato de propilo • Sesamol • Cloreto de clorocolina • 3,4-diclorofenoxitrietii (amina) • Ácido cloroetilfosfónico • Ácido dietilditiocarbâmico • Ácido Nordi-hidroguaiarético • dítiotreitol • Metabissulfito de sódio • Metabissulfito de potássio • d-amino-DL-fenilalanina • Cadavarina • Sulfato de Protamina • SKF-7997 • MER 29 • Ancimidol • Triadimefon • Phosphon D • Tioureia • Sulfato de dextrano • Hidroquinona • Glutamato de quitosano • Glutationa • EGTA • Giberelinas • Ácido Absísico • 1,3-difenilureia •Diazolidinilureia • Floroglucinol •Alginato de sódio • Carragenano 37 85 681 ΕΡ Ο 672 162/ΡΤ

Tabela 1.b. Lista de precursores, inibidores e estimulantes ou activadores utilizados na regulação da biossíntese de Taxol & Taxanos em culturas de células de T, spp.

Precursores

Fenilalanina

Lisina

Tirosina

Triptofano

Metionina

Tiramína

Acetato de sódio

Acetato de potássio

Acetato de amónio Ácido Mevalónico

Acetato de Famesilo

Acetato de Geranilo

Acetato de geranil geraniol

Triptamina

Mentol a-Pineno Ácido trans-cinâmico

Cambreno A

Verticileno

Verticilol Cânfora

Quercetina Ácido levulínico Ácido abiético

Borneol

Inibidores

Cloreto de clorocolina

Uniconazol

Paclobutrazol SKF-7997 MER 29

Ancimidol

Triadimefon

Phospon D

Fenpropemorfo

Procloraz

Naptifina

Miconazoi

Nitrato de prata

Norbornadieno AMO 1618

Alar Ácido 4-amino-5-hexinóico

Feniletanolamina

Fenetilamina

Glifosfato

Di-hidrocicloeucalenol Sulfóxido de metionina β-hidroxifeniletilamina 5-metil-DL-triptofano a-fluorofenilalanina

Estimulantes ou activadores AMP cíclico AMP dibutirilcíclico Jasmonato de metilo cis-Jasmona Ácido cloroetilfosfónico Espermina Espermidina Putrescina Cadavarina MPTA DCPTA Dl PT A ACC HTA

Brassinosteróides

BHA

BHT

OTA cloridrato de 5-2 aminoetil-L-cisteína / x 85 681 EP 0 672 162/PT 38

Λ O <o 00 co

io co ™ r-' O CO

r- « o ” N CO (N CM *- CM in CM d

— — CM

CM O to Ò líí ° ll C| O (N O ^ fs, CO o n . ·· tT> — (O -- σ> Λ Λ O CM CM 00 00 -J O q O rC SS o Ο Ο Γ0 , CM — o Λ d

LO d ro o

o d o o o d o o to in

Λ IO ^ cg O r- o <o co 00 IO co q rC O 00

LO CM O o © § o o 00 «- r-' r-'

CO

O to d i io

Tabela 2: componentes (mg/l) de meios catalíticos "Phyton" utilizados para cultura de culturas de Taxus

IO LO CM CM in — r- CO - q to irí

LO O

LO CM

q o q — LO O

(O IO σ>

r*» cm O cm — —

O lo o g q q lo O . O CM CM —

CO cm' σ> CM

to lo' — to (O lo to ro O O O cm co q co* d q q q CO O CM LO . O O <J}

o L) D σ UJ Q LU QC o CM to o d CM co fO ^ Λ Λ cm r*·' cm io d — d d co'

— T CM

o d IO

o d o LO co io' o d IO cm' o o d ΟΛΟ λ q ó to o oo

o S 8 ° «— CM (O o d o 3- q d λ o-

o o d d CO CM . O o v. o o o q o o — IO CM — «- co id m Λ Λ Ο CM CM co ca N- O q q r»' r»' cm d O O co i CM >— ·— O o s 5 .2 O u u .2 o £ LO d co

— — CM o d o o o o co o q q ο Ο Ο Λ to td ο d •ο ο ο

JJJ (J) 3J O o — — c

Ο I- 1L 3 CJ -2 .2 tí .2 D «3 _ _ - — — o C0*<UOZOC02C0WC0(0í— ·< υ -= ca .•ο δ C Ό .2 | < ο ο Ο <

£ X © X ο. esterilizado por filtração para meio autoclavado

85 681 ΕΡ Ο 672 162/ΡΤ 39

Tabela 3. Condições preferidas para a proliferação de calo para várias espécies de Taxus. Os ingredientes no meio basal estão enumerados na Tabela 2

Reguladores de crescimento*

Espécie Meio basal Auxina Citoquinina (Tabela 2) tipo Conc(M) Tipo Conc(M) T. b revi folia F P 5 x 106 2iP IO7 D P 5 x 10'6 BA 1CT8 T. canadensis H P 5 x 10'6 K 10'7 D P 5 x 10'6 BA ίο8 T. chinensis D P 5 x 10'6 BA 10-8 A N 5 x 106 BA 10-8 T. globosa D P 5x10® BA ίο8 T. floridana D P 5 x 106 BA 10·β T. baccata D P 5 x 10'6 BA ΙΟ’8 T. cuspidata D P 5 x 10'6 BA 10 a T. media D P 5 x 10'6 BA ΙΟ'8 T. wailichiana D P 5 x 106 BA 10-8 “Abreviaturas: Picloram (P), ácido naftalenoacético (N), Benziladenina (BA), dimetilalilaminopurina (2iP), Cinetina (K)

Tabela 4. Características de crescimento típicas de culturas em suspensão de Taxus sp.

Espécie Peso seco Tempo de duplicação Peso fresco Temoo de duolicacão Peso seco Densidade Peso fresco Densidade T. brevifolia 2,0 dias 3,5 dias 20 g/l 400g/l T. baccata 2,0 6,0 15 220 T. chinensis 2,5 4,5 20 285 T. canadensis nd* 8,5 13 260 * ainda não determinado

85 681 ΕΡ Ο 672 162/ΡΤ 40

Tabela 5: Produção de taxol em várias espécies de Taxus

Espécie Teor de taxol (% em peso seco) Meio (veja-se Tabelas 2&3) Análise T. brevifolia 0,006 F ELISA T. canadensis 0,004 H ELISA T. baccata 0,0014 D HPLC T. giobosa 0,0003 G ELISA T. cuspidata 0,0025 G HPLC T. floridana 0,001 G ELISA T. media 0,02 F ELISA T. chinensis 0,18 B HPLC

Tabela 6: Melhorias na produtividade devido ao tratamento de troca de meio. Os números são expressos como X vezes de melhoria em relação aos níveis atingidos num intervalo descontínuo de 1 5 dias. Fez-se a cultura da linha celular K-1 de Taxus chinensis em Meio A, no escuro. Níveis totais* Níveis extracelulares

Taxol 4,6 4,89

Taxanos totais 4,55 5,94 * Níveis totais nas células e meio combinados

Tabela 7. Efeito do tratamento de luz GroLux Standard no teor de taxol e taxano em culturas de Taxus chinensis linha K-1, de 10 dias de idade, cultivadas em Meio A. As quantidades apresentadas são expressas em μς extraídos a partir de 20 ml de suspensão. O crescimento celular foi idêntico em ambos os tratamentos (164 mg, em peso seco, por balão)

Luz Escuro Taxol total: células e meio: 8,8 μg 3,13 μg Taxol extracelular: 76,40% 56,20% Taxanos totais: células e meio: Taxanos extracelulares: 61,55 μg 62,17 μg 89% 84% 41 85 681 ΕΡ Ο 672 162/ΡΤ

Tabela 8. Comparação de suspensões de Taxus chinensis linha K-1 tratadas com glutamato de quitosano em relação a não potenciadas, após 1 5 dias de cultura em Meio C. Os níveis de taxano descritos são de células e meio combinados. A % extra refere-se à percentagem de produto extracelular. CONTROLO POTENCIADOR Densidade celular 10,1 g/l Densidade celular 14,2 g/l Viabilidade celular 70-80% viáveis Viabilidade celular 75-80% viáveis Taxanos % peso seco mg/l % Extra % peso seco mg/l .% Extra Taxol 0,054 5,4 72,0 0,098 13,9 85,0 Baccatina III 0,057 5,8 69,9 0,055 7,8 76,6 7-Xilosil-10-desacetiltaxol 0,040 4,0 63,0 0,048 6,9 77,0 10-desacetiltaxol 0,004 0,4 71,1 0,0 1,0 75,3 Cefalomanina 10-desacetilbaccatina III 10-desacetil-7-epitaxol 0,054 5,4 74,2 0,076 10,8 85,7 7-epitaxol 0,009 0,9 74,6 0,009 1,3 86,2 Taxanos desconhecidos 0,203 20,5 79,7 0,240 34,1 90,2 Taxanos totais: 0,421 42,4 j 0,533 75,8

Tabela 9. Manipulação de meio nutriente para a biossíntese melhorada de taxano e taxol, em suspensão de Taxus chinensis linha K-1. Inocularam-se 500 mg, em peso fresco, de células, por 5 ml de meio e incubaram-se no escuro durante 18 dias. São referidos os taxanos totais produzidos (nas células e meio combinados). Os ingredientes nos Meios B & C estão enumerados na Tabela 2 Nível de Taxano Meio B (mg/l) Meio C (mg/l) Baccatina III 4,3 3,9 7-xilosii-10-desacetiltaxol 8,3 12,9 Cefalomanina 1,1 vestígios 10-desacetil-7-epitaxol 4,6 5,4 taxol 24,1 21,3 7-epitaxol 1,3 2,8 outros taxanos não identificados* 56,1 63,7 f, Taxanos totais 99,8 mg/l 110 mg/l

Lisboa, -2. KOV. 20UU

Por PHYTON, INC. O AGENTE OFICIAL

ANTÓNIO JOÃO —— *BA CUNHA FERREJRA Ag. Of. Pr. Ind. Ruo dos Flores, 74 - 4.® 16Θ0 LISBOA

Claims (9)

1. 1. Processo para a recuperação do taxol e outros taxanos com rendimentos elevados, a partir de culturas de células de uma espécie de Taxus, compreendendo: fazer a cultura em suspensão, num ou mais meios nutrientes, sob condições de crescimento e formação de produto, de células de uma espécie de Taxus, derivadas de calo e/ou de culturas em suspensão, e recuperar o referido taxol e outros taxanos a partir das referidas células e/ou do referido meio, da referida cultura de células, em que as referidas condições compreendem um ou mais de entre: iluminação contínua ou intermitente, com luz de banda larga ou banda estreita; ou meios nutrientes que têm uma composição de meio alterada para as fases da cultura de crescimento e de produção.
2. 2. Processo de acordo com a reivindicação 1, em que a espécie de Taxus é T. canadensis, T. chinensis, T. cuspidata, T. baccata, T. globosa, T. floridana, T. wallichiana ou T. media.
3. 3. Processo de acordo com a reivindicação 1 ou a reivindicação 2, em que os referidos meios nutrientes incluem picloram.
4. 4. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, em que o glutamato de quitosano está presente na fase de produção da cultura como potenciador.
5. 5. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, em que os referidos meios nutrientes incluem um estimulante.
6. 6. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, em que a fenilalanina está presente na fase de produção da cultura, como precursor.
7. 7. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, que compreende ainda a troca periódica do meio nutriente.
8. 8. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, que compreende ainda a remoção periódica de taxol e outros taxanos. 85 681 ΕΡ Ο 672 162/ΡΤ 2/2
9. 9. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, em que o crescimento e formação de produto são obtidos utilizando um processo descontínuo de uma fase ou de duas fases, ou um processo descontínuo com alimentação, ou um processo semi-contínuo ou suas variações. Lisboa, .52K0V. 2000 Por PHYTON, INC. 0ASMfõL

   EB36.e ÂMTÓWÍO ΜΦ ÊA CUNHA FERREIRA Ag. O/. Pr. Ind.