PT689381E

PT689381E - Flora de exclusao competitiva da mucosa

Info

Publication number: PT689381E
Application number: PT94911615T
Authority: PT
Inventors: Norman J Stern; Nelson A Cox; Joseph S Bailey; Leroy C Blankenship
Original assignee: Us Agriculture
Priority date: 1993-03-16
Filing date: 1994-03-16
Publication date: 2000-06-30
Also published as: ATE188342T1; BR9405999A; JPH08512285A; US5451400A; AU6409494A; DK0689381T3; JP3147903B2; EP0689381A1; CA2156486C; DE69422501D1; AU679733B2; CN1119406A; NZ263411A; DE69422501T2; WO1994021127A1; CN1076586C; EP0689381A4; CA2156486A1; EP0689381B1

Description

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DESCRICÃO "Flora de exclusão competitiva da mucosa"

Antecedentes do invento Campo do invento 0 consumo de produtos de aves domésticas impropriamente preparados, tem resultado em numerosos casos de doenças intestinais humanas. Foi há muito reconhecido que as Salmonella spp. são agentes causadores de tais doenças, e mais recentemente a Campylobacter spp., especialmente a Campylobacter jejuni, tem sido também implicada. Ambos os microorganismos podem colonizar os tractos gastrointestinais das aves domésticas, sem qualquer efeito deletério nas aves, e, embora algumas doenças de aves possam ser detectadas, portadores assintomáticos podem espalhar livremente os microorganismos durante a produção e o processamento, resultando numa contaminação adicional das aves vivas e das carcaças.

Descricão da arte relacionada São necessárias melhores medidas de controlo para minimizar a disseminação destas e outras bactérias enteropatogénicas humanas, e a mais promissora abordagem para alcançar este fim tem sido decrescer a incidência e o nível da colonização de microorganismos nos tractos gastrointestinais das aves domésticas.

Um meio eficaz para decrescer a colonização dos frangos por Salmonella foi descrito por Nurmi e Rantala (1973) e é conhecida como exclusão competitiva (EC). A flora intestinal indígena dos frangos desempenha um papel significativo na protecção destes contra a colonização por Salmonella, e verificou-se que preparações de conteúdos intestinais subcultivados de frangos adultos e saudáveis conferem protecção a pintos jovens cuja microflora não tinha ainda sido estabelecida. A administração de preparações de EC indefenidas a pintos acelera a maturação da flora intestinal nas aves recém eclodidas e também proporciona um substituto para o processo natural de transmissão da microflora da fêmea adulta à sua descendência. A instalações limpas e desinfectadas dos aviários contemporâneos não proporcionam a microflora de ocorrência natural que tem sido proporcionada pelas reprodutoras no passado. 83 985 ΕΡ Ο 689 381 /ΡΤ 2

Snoeyendos et al.(1982) desenvolveram uma técnica concebida para reduzir Salmonellae em aves domésticas onde a fonte de microflora de EC foi excrementos fecais liofilizados os quais foram propagados por cultura anaeróbica. Mikkola et al. (1987) usaram conteúdos fecais intestinais e cecais como fonte de microflora EC. O tratamento com as suas culturas requereu meios para ser anaeróbico e com pH equilibrado. Nenhum destes tratamentos EC é dirigido a Campylobacter jejuni.

Desde que EC foi conhecida como sendo eficaz contra Salmonella, um método similar para o controlo de Campylobacter foi investigado por Stern et al.(1988). Verificou-se, no entanto, que o tratamento com preparações de EC, tal como descrito por Nurmi e Rantala (1973), Snoeyenbos et al. (1982) e Mikkola et al.(1987), não afectou a colonização de Campylobacter. Depois dos tratamentos com cinco culturas diferentes de EC, a colonização foi observada após o desafio com Campylobacter em 81 de 84 pintos, e 45 de 46 pintos controlo. Shanker et al.(1990) confirmaram estas observações (Shanker et al. 1990. Epidemiol. Infect.. vol. 104, pp. 101-110).

Numa investigação subsequente, composições de misturas de Salomonella e Campylobacter foram administrados a pintos do dia. Acreditava-se que os dois microorganismos podiam competir entre si ou de alguma forma antagonizarem-se mutuamente, reduzindo assim ambas as populações (Stern et. al., 1991). No entanto, nenhuma competição ou efeito antagonístico foi observado.

Sumário

Uma modificação do método de EC foi agora estabelecida a qual provou ser eficaz para o controlo tanto de Salmonella como de Campylobacter. Esta modificação, exclusão competitiva da mucosa (ECM), utiliza culturas de flora associada à mucosa obtida a partir do ceco de frangos adultos os quais estão isentos de Salmonella e outros patogénicos das aves domésticas. Uma subcultura a partir de ECM administrada a pintos recém chocados ou no choco tem demonstrado proporcionar protecção substancial contra ambos os microorganismos. Quando apropriadamente aplicado, o tratamento de ECM resulta na presença diminuída de Salmonella e Campylobacter na produção de aves domésticas. Com a diminuição da carga intestinal nos frangos, deverá 83 985 ΕΡ Ο 689 381 /ΡΤ

3 haver uma redução subsequente no risco para a saúde humana.

De acordo com esta verificação, é um objecto do invento proporcionar um método novo de preparação de uma composição de exclusão competitiva da mucosa (ECM) eficaz para a protecção das aves domésticas contra infecção por bactérias enteropatogénicas humanas capazes de colonização de aves domésticas incluindo Salmonella e Campylobacter. É também um objecto do invento proporcionar um novo método de tratamento de aves domésticas para prevenir a infecção e o crescimento de tais bactérias nas aves tratadas.

Outros objectos e vantagens do invento tornam-se prontamente aparentes a partir da seguinte descrição.

Descricão detalhada do invento A nova preparação de ECM é uma composição indefenida e é preparada de acordo com o seguinte método: (1) Remover o ceco de aves isentos de Salmonella e cuidadosamente remover qualquer material interno por lavagem com o meio; (2) Assepticamente e num ambiente anaeróbico, (a) obter raspagens a partir da camada de mucina do ceco lavado, ou (b) cortar uma porção do ceco lavado; (3) Suspender as raspagens ou cortes cecais em meio anaeróbico; e (4) Incubar em ambiente anaeróbico durante um tempo suficiente para permitir a ocorrência de proliferação. O meio resultante contendo flora pode então ser subcultivado e expandido como necessário para proporcionar quantidades suficientes da preparação necessária para os procedimentos de tratamento.

Preferivelmente, no passo (1) uma ave isenta de Salmonella é morta, o ceco é removido assepticamente e colocado numa placa de Petri estéril num ambiente isento de oxigénio. O ceco é invertido num frasco cilíndrico estéril, e a maior parte do material cecal é cuidadosamente removido sob condições 83 985 ΕΡ Ο 689 381/ΡΤ 4

estéreis e eliminado. Ο conteúdo cecal restante é removido por lavagem com um meio apropriado. O passo de lavagem pode utilizar qualquer meio eficaz para o próposito referido, incluindo água. Um meio preferido é um meio anaeróbico, sendo particularmente preferido se for meio anaeróbico pré-reduzido (MAPR).

No passo (2), pode ser usado um bisturi estéril tanto para (a) raspar a camada de mucina do ceco lavado como (b) cortar uma porção de aproximadamente 1mm do ceco lavado.

No passo (3), as raspagens da camada de mucina do passo 2(a) podem ser suspensas em cerca de 1ml de MAPR, seguindo-se a inoculação da suspensão em cerca de 5ml de MAPR fresco. Alternativamente, a porção de ceco cortado no passo 2(b) pode ser colocada directamente em cerca de 5ml de MAPR.

No passo (4), as suspensões podem ser incubadas a cerca de 35°C até cerca de 37°C durante aproximadamente 48 horas.

Antes de subcultivar e usar, as culturas devem ser testadas para a presença de Salmonella. Pode ser utilizada qualquer técnica convencional de isolamento eficaz.

Para assegurar que não está presente Campylabacter nas preparações de ECM, as culturas podem ser subcultivadas por duas passagens adicionais em MAPR sob as condições anaeróbicas acima indicadas.

Para obter quantidades suficientes de ECM para tratar um grande número de aves, as culturas podem ser expandidas usando técnicas de cultura convencionais bem conhecidas pelos peritos na arte (ex. diluições de aproximadamente 1:1000 da preparação da solução-mãe seguidas de incubação durante cerca de 48 horas). A eficácia das culturas pode ser avaliada determinando a dose de colonização a 50% (DC500/o) ou o quociente de colonização (QC), como descrito por Stern et al., 1991. O número DC50% representa o número médio de 83 985 ΕΡ Ο 689 381 /ΡΤ

5 bactérias desafiantes requerido para colonizar o ceco em metade dos pintos num grupo particular (teste ou controlo), senão a amostragem feita uma semana após o desafio. 0 QC representa o log10 do número médio de colónias por grama de material cecal para todos os animais num grupo particular. Em adição, pode ser calculado um factor de protecção (FP) representando a razão entre QCcontr0|0 e QCteste. A DC50% depende da protecção proporcionada por ECM contra a colonização pelos microorganismos desafiantes e é independente do número de colónias. Portanto, quanto maior o número DC50%, maior a quantidade de protecção que foi conferida. Um QC, por outro lado, depende do número de colónias formadas pelo desafio dos microorganismos no tracto intestinal das aves. Portanto, um número mais baixo de QC é mais desejável. Uma vez que FP é a razão entre o número de controlo e número de teste, um número de FP mais elevado é uma indicação de melhor protecção. No caso da Salmonella, um FP de pelo menos 6 é indicativo de uma preparação de ECM eficaz. Para Campy/obacter, uma protecção de 100 vezes (ou QC=102 ) é o nível minímo aceitável. Quando se testa a eficácia de ECM, as doses desafiantes de Salmonella e Campyllobacter podem ser administradas separadamente ou em misturas. Uma vez que se sabe que os dois microorganismos actuam independentemente no intestino (Stern et al., 1991), os resultados obtidos a partir de desafios simultâneos com ambos os microorganismos são igualmente precisos, e o procedimento é significativamente mais conveniente.

As aves domésticas são tratadas administrando uma quantidade eficaz da preparação de ECM.Tratamento com culturas de ECM podem ser aplicados em duas etapas. Na primeira parte, uma quantidade eficaz da cultura é pulverizada nas aves quando estão 50-75% chocadas, seguindo-se a terminação do período de incubação. Em frangos, por exemplo, o tabuleiro de choco pode ser removido da chocadeira após os ovos terem sido incubados numa incubadora durante cerca de 18 dias e na chocadeira cerca de 2,5 dias, e cada tabuleiro é pulverizado de forma a que cada pinto chocado e/ou cada ovo não chocado recebe cerca 0,2 a cerca de 0,3ml de ECM. Os tabuleiros de choco são então devolvidos à chocadeira para completar a incubação.

Para a segunda parte do tratamento, uma quantidade eficaz de ECM é primeiro adicionada á primeira água de bebida das aves, e é aí deixada até que tenha sido toda consumida. Em frangos, por exemplo, uma diluição de

83 985 ΕΡ Ο 689 381/ΡΤ aproximadamente 1:10 de ECM em jarros de beber de 1 galão é colocada num aviário a uma razão de aproximadamente 1 jarro por 200 pintos. Os jarros são deixados no local até que toda a cultura seja consumida (aproximadamente 4 horas), resultando o consumo de aproximadamente lOml da solução diluida de ECM por pinto.

Alternativamente, a preparação pode ser eficazmente administrada adicionando preparações criodessecadas ou encapsuladas à alimentação, injectando in ovo, pulverizando directamente nos pintos depois de todos serem banhados, ou por administração através do sistema de água da instalação. A nova cultura de ECM e o novo método de tratamento são eficazes para todas as aves domésticas criadas para o propósito do consumo humano que podiam servir como portadores dos agentes patogénicos alvo. Aves domésticas incluem todas as aves domésticas criadas para produção de ovos ou carne, tais como frangos, perus, patos e gansos.

Os agentes patogénicos alvo incluem todas as bactérias enteropatogénicas humanas capazes de colonizar aves domésticas. De particular interesse são as espécies de Salmonella e Campy/obacter.

Os seguintes exemplos pretendem apenas ilustrar adicionalmente o invento e não pretendem limitar o âmbito do invento como definido pelas reivindicações.

Exemplol

Preparação da cultura de exclusão competitiva da mucosa

Um frango completamente adulto e isento de Salmonella foi morto e o ceco foi assepticamente removido. O espécime foi imediatamente colocado numa placa de Petri estéril numa câmara de azoto isenta de oxigénio. O ceco foi então invertido num cilindro de vidro estéril e a maior parte do material cecal foi removido com a ponta de uma pipeta estéril. O restante material foi lavado com MAPR expondo-o num fluxo através de uma agulha estéril a partir de uma seringa contendo MAPR. A camada de mucina foi então raspada a partir do material cecal lavado usando um bisturi estéril, e as raspagens foram suspensas

83 985 ΕΡ Ο 689 381/ΡΤ 7 em 1,Oml de MAPR. A suspensão foi deitada numa seringa estéril, e então inoculada num tubo contendo 5ml de MAPR fresco. A cultura foi então incubada a 37°C durante 48 horas. Todo o procedimento foi realizado num ambiente isento de oxigénio conseguido passando uma corrente de azoto constante através da câmara de preparação da cultura.

Exemplo 2

Teste para eficácia do ECM contra Campvlobacter A três a dez pintos do dia retidos em unidades de isolamento administram-se 0,2ml de preparação de ECM por sonda gástrica, e um número similar de pintos foram deixados sem tratamento como controlos. Vinte e quatro horas a trinta e seis horas após a administração, os pintos foram desafiados com Campylobacter com dosagens variando como se mostra na tabelai. Após sete dias os pintos foram sacrificados. Os cecos foram colhidos, os conteúdos foram plaqueados num meio selectivo para Campylobacter e incubados microaerobicamente ( 5%02, 10% C02, 85% N2 ) a 42°C durante 24 horas. O DC50o/o foi achado determinando a que dosagem metade dos cecos dos pintos foram colonizados. O QC foi achado determinando o número de colónias por grama de material cecal colhido de todos os pintos tratados a uma dosagem particular.

Os dados apresentados na tabelai mostram que em três testes separados a protecção fornecida pelo tratamento de ECM foi de pelo menos 100 vezes. Em adição, também se pode observar que pintos sacrificados nos dias 21 e 42 tinham conservado níveis similares de protecção. (Segue Tabela) 8 83 985 ΕΡ Ο 689 381/ΡΤ

Tabelai

Dose de colonização de Camovlobacter ieiuni para 50% de pintos desafiados

Ensaio Idade dos pintos(D) Tratamento Controlo ECM Expcl 7 102'0 104'° Expç2 7 <101'° O O Expc2 21 <1010 o O Expc3 21 103'0 105'0 Expc4 7 103,0 O 4* o Expc4 21 O N> Ò 105.° Expc4 42 1 o2,0 104'0

Os dados de QC apresentados na tabela2 indicam também a mesma capacidade protectora. Os valores de QC para pintos tratados com ECM são consistentemente mais baixos do que para os controlos.

Tabela2

Quociente de colonização do Camovlobacter ieiuni em pintos desafiados com cerca de 103 células aos 2 dias após eclosão

Ensaio Idade dos pintos(D) Tratamento Controlo ECM Expcl 7 103'2 10u'3 Expc2 7 102'0 0 Expc2 21 ~ 1 o3,0 102'2 Expc3 21 101'6 10o'5 Expc4 7 101'6 10o'5 Expc4 21 105.5 0 Expc4 42 00 eo O 0 9 83 985 ΕΡ Ο 689 381/ΡΤ

Exemplo3

Teste para eficácia do ECM contra Salmonella

Os pintos foram tratados essencialmente como descrito no exemplo2, Depois dos cecos serem colhidos, no entanto, os materiais cecais foram plaqueados num meio selectivo para Salmonella e incubados a 37°C por 24 horas. Os valores de QC foram determinados como descrito para Campylobacter e são apresentados na tabela 3 e 4 juntamente com os números de positivos por grupo de teste. Pode-se observar que o tratamento com ECM também confere protecção considerável contra colonização por Salmonella.

Tabela 3

Teste de eficácia contra Salmonella

Nivel do desafio #Positivos/#testados QC Controlo 104 9/9 102'b Controlo 106 6/9 103'3 ECM3 104 0/10 0 ECM3 106 0/10 0

Tabela 4

Teste de eficácia contra Salmonella

Nivel do desafio #Positivos/#testados QC

Controlo 103 0/15 0 Controlo 105 14/15 104'3 Controlo 107 12/15 103'5 ECM 103 0/15 0 ECM 105 4/15 o o ECM 107 3/15 O p Ca)

Lisboa,

29. KAR. ZQOO

Por THE UNITED STATES OF AMERICA representado por THE SECRETARY OF AGRICULTURE - O AGENTE OFICIAL -

O ADJUNTO

Ag. Q|. Pr. lri<L

Claims

83 985 ΕΡ Ο 689 381 /ΡΤ 1/1 Reivindicações 1. Método de preparação de uma composição de exclusão da mucosa competitiva eficaz para a protecção de aves domésticas contra infecção por Salmonella e Campylobacter, compreendendo o dito método: (a) remover pelo menos uma parte do ceco de aves isentas de Salmonella e remover materiais internos por lavagem cuidadosa com meio anaeróbico; (b) assepticamente e num ambiente anaeróbico, (i) a obter raspagens da camada de mucina do ceco lavado, e/ou (ii) cortar uma porção do dito ceco lavado; (c) suspender raspagens e/ou cortes cecais em meio anaeróbico para formar uma suspensão; e (d) incubar a dita suspensão num ambiente anaeróbico a de cerca de 35°C até cerca de 37°C durante aproximadamente 48 horas.
2. Método de acordo com a reivindicação 1, em que as ditas raspagens são raspagens da camada de mucina do dito material cecal lavado.
3. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, em que o dito meio anaeróbico é meio anaeróbico pré-reduzido.
4. Composição obtenível através de qualquer uma das reivindicações 1 a 3.
5. Utilização de uma composição de exclusão da mucosa para o fabrico de uma preparação para aves domésticas para prevenir infecção por Salmonella e por Campylobacter, compreendendo o dito uso a administração às ditas aves domésticas de uma quantidade eficaz da composição obtida de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3.
6. Aditivo alimentar compreendendo a composição obtida de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3. Lisboa, 29. MAR. ZU30 Por THE UNITED STATES OF AMERICA representado por THE SECRETARY OF AGRICULTURE - O AGENTE OFICIAL -

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