JPH08512285A - 粘膜競争的排除フローラ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 家禽へのヒト腸病原細菌の定着を減少させるのに有効な製剤が、成熟鳥の盲腸から得られた粘膜関連フローラの培養から調製され、粘膜競争的排除（ＭＣＥ）製剤と称される。この製剤は、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ及びＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｐ．にとりわけ有効である。この新規なＭＣＥ製剤を新たにふ化したひな鳥類かふ化中の鳥類に投与することにより、鳥類を上記微生物の両方に対して実質的に保護することができ、加工家禽製品中における上記両方の微生物の存在が減少する。

Description

【発明の詳細な説明】 粘膜競争的排除フローラ発明の背景 発明の分野 不適切に調製された家禽製品が消費されることにより、ヒト腸疾病患者が非常 に多く生み出された。Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｓｐｐ．がこのような疾病の病因 であることは長年認識されており、最近では、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｓ ｐｐ．、とりわけＣａｍｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉも、病因に含まれて いる。上記両方の微生物は、鳥類に何ら有害作用を及ぼすことなく家禽の胃腸管 に定着することがある。病気に患った鳥類を多少は検出することはできるが、無 症候キャリアは、生産及び加工中に上記微生物をまん延させ、その結果、生存鳥 類及び生肉がさらに汚染されることとなる。関連技術の説明 これら及び他のヒト腸病原細菌のまん延を最小限に抑えるためのよりよい対策 が必要とされており、このための最も有望な手法は、家禽の胃腸管における微生 物の発生及び定着レベルを減少させることであった。 Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａによるニワトリの定着を減少させる有効な手段がＮｕｒ ｉ及びＲａｎｔａｌａ（１９７３）により記載され、競争的排除（ｃｏｍｐｅｔ ｉｔｉｖｅ ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ、“ＣＥ”）として知られている。ニワトリ固 有の腸内フローラは、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ定着の防止に重要な役割を果たし、 成熟健康ニワトリから副次培養した腸内内容物の製剤は、微生物相（ｍｉｃｒｏ ｆｌｏｒａ）ががまだ確立されていない若ニワトリを保護できることが判明した 。未定義ＣＥ製剤をひよこに投与すると、新たにふ化した鳥類の腸内細菌叢の成 熟を加速し、また、これが、成雌鶏からその子孫への微生物相の伝播の自然プロ セスの代替ともなる。掃除且つ消毒を行った現代のブロイラー鶏舎の施設では、 過去に雌鶏により付与された天然微生物相は付与されない。Ｓｎｏｅｙｅｂｏｓ 等（１９８２）は、ＣＥ微生物相源が嫌気性培養により増 殖された凍結乾燥糞である、家禽においてＳａｌｍｏｎｅｌｌａを減少するよう に構成した方法を開発した。Ｍｉｋｋｏｌａ等（１９８７）は、ＣＥ微生物相源 として腸内糞及び盲腸分を使用した。これらの培養での処理には、嫌気性であり 且つｐＨのバランスをとった培地を必要とした。これらのＣＥ処理は、Ｃａｍｐ ｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉに触れていない。 ＣＥがＳａｌｍｏｎｅｌｌａに有効であることは公知であるので、Ｃａｍｐｙ ｌｏｂａｃｔｅｒの抑制について類似の方法が、Ｓｔｅｒｎ等（１９８８）によ り検討された。しかしながら、Ｎｕｒｍｉ及びＲａｎｔａｌａ（１９７３）、Ｓ ｎｏｅｙｅｎｂｏｓ等（１９８２）並びにＭｉｋｋｏｌａ等（１９８７）により 記載されているようなＣＥ製剤での処理は、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒの定着 には影響を及ぼさなかった。５種の異なるＣＥ培養での処理後、Ｃａｍｐｙｌｏ ｂａｃｔｅｒの投与によりひよこ８４羽のうちの８１羽及び対照ひよこ４６羽の うちの４５羽に定着が観察された。Ｓｈａｎｋｅｒ等（１９９０）は、これらの 観察結果を確認した（Ｓｈａｎｋｅｒ等、１９９０、「Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ．Ｉ ｎｆｅｃｔ．」、第１０４巻、第１０１−１１０頁）。 その後の研究において、ＳａｌｍｏｎｅｌｌａとＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ とを、初生ひなに投与した。これらの２種の微生物が互いに競争するか拮抗して 、両方の集団固体数を減少するように思われた（Ｓｔｅｒｎ等、１９９１）。し かしながら、競争作用も拮抗作用も観察されなかった。発明の要旨 今般、ＳａｌｍｏｎｅｌｌａとＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒとの両方の抑制に 有効である、ＣＥ法の改良法が見出された。改良法である粘膜競争的排除（ｍｕ ｃｏｓａ ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ、“ＭＣＥ”）では、 Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ及び他の家禽病原体のない成熟ニワトリの盲腸から得られ た粘膜関連フローラ（ｍｕｃｏｓａ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｆｌｏｒａ）の培 養を利用する。ＭＣＥからの副次培養を新たにふ化したひよこ又はふ化中のひよ こに投与すると、両方の微生物による感染が実質的に防止されることが明らかと なった。ＭＣＥ処理を適切に適用すると、家禽生産において、Ｓａｌｍｏｎｅｌ ｌａとＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒの両方の存在が減少する。 ニワトリにおける腸内での保菌が減少すると、次にヒトの健康上の危険が減少す はずである。 この知見により、本発明の目的は、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ及びＣａｍｐｙｌｏ ｂａｃｔｅｒを含む家禽に定着することのできるヒト腸病原細菌が家禽に感染す るのを防止するのに有効な粘膜競争的排除（ＭＣＥ）組成物の製造方法を提供す ることである。 また、本発明の目的は、家禽を処置して処置した鳥類における上記細菌の感染 及び成長を防止する新規な方法を提供することである。 本発明の他の目的及び利点は、以下の説明から容易に明らかとなろう。発明の詳細な説明 新規なＭＣＥ製剤は未定義組成物であり、以下の方法により調製される： （１）無Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ鳥類から盲腸を切り出し、培地で洗浄すること により内部物質を十分に除去し； （２）無菌的且つ嫌気性環境において、（ａ）洗浄した盲腸の粘膜層からスク レープ（ｓｃｒａｐｉｎｇｓ）を得るか、（ｂ）洗浄した盲腸から１片を切断し ； （３）スクレープ又は盲腸の切断片を嫌気性培地に懸濁し；そして （４）嫌気性環境において、増殖が生じるのに十分な時間インキュベーション する。 得られたフローラ含有培地を、次に副次培養し、必要程度増加させて、処置操 作に必要とするに十分な量の製剤を得る。 好ましくは、工程（１）では、無Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ鳥類を殺し、盲腸を無 菌的に切り出し、無酸素環境で無菌ペトリプレートに配置する。盲腸を、無菌ガ ラス棒で逆にし、盲腸の大部分を、無菌条件下で穏やかに除去し、捨てる。残り の盲腸内容物を、適当な培地で洗浄することにより除去する。洗浄工程には、水 をはじめとする上記目的に有効ないずれの培地も用いることができる。好まし培 地は嫌気性培地であり、特に好ましいものは、予備希釈した嫌気性培地（ｐｒｅ −ｒｅｄｕｃｅｄ ａｎａｅｒｏｂｉｃ ｍｅｄｉｕｍ、“ＰＲＡＭ”）である 。 工程（２）では、無菌小刀を使用して、（ａ）粘膜層を洗浄盲腸からスクレー プするか、（ｂ）洗浄盲腸から約１ｍｍ片を切断することができる。 工程（３）では、工程（２）（ａ）の粘膜層スクレープを、ＰＲＡＭ約１ｍｌ に懸濁後、懸濁液を新鮮なＰＲＡＭ約５ｍｌに接種する。また、工程（２）（ｂ ）で得られた盲腸の切断片を、ＰＲＡＭ約５ｍｌに直接入れてもよい。 工程（４）では、懸濁液を、約３５〜３７℃で約４８時間インキュベーション する。 副次培養及び使用の前に、培養を、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａが存在するかどうか をアッセイする必要がある。いずれかの効果的な通常の分離方法を利用すること ができる。 ＭＣＥ製剤にＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒが確実に存在しないようにするため に、培養を、上記嫌気性条件下、ＰＲＡＭ中でさらに２継代の副次培養してもよ い。 多数の鳥類を処置するのに十分な量のＭＣＥを得るために、培養を、当該技術 分野において周知の通常の培養法（例えば、保存製剤を約１：１０００に希釈し た後、約４８時間インキュベーション）を用いて増加できる。 上記培養の効力は、Ｓｔｅｒｎ等、１９９１（引用することにより本明細書の 開示の一部とされる）に記載されている定着供与量（ｃｏｌｏｎｉｚａｔｉｏｎ ｄｏｓｅ）―５０％（ＣＤ_50%）又は定着指数（ｃｏｌｏｎｉｚａｔｉｏｎ ｑｕｏｔｉｅｎｔ、“ＣＱ”）を求めることにより評価できる。ＣＤ_50%数は、 特定の群（試験又は対照）におけるひよこの半分の盲腸に定着するのに必要とす る平均供与細菌数（供与１週間後にサンプリング）を表す。ＣＱは、特定群にお ける全ての動物についての盲腸材料の１ｇ当たりの平均１ｏｇ₁₀コロニー数を表 す。さらに、対照ＣＱ：試験ＣＱ比を表す保護因子（ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ｆ ａｃｔｏｒ、“ＰＦ”）を、算出してもよい。ＣＤ_50%は、供与微生物による定 着に対するＭＣＥによる保護に依存し、コロニー数には無関係である。したがっ て、ＣＤ_50%数が大きいほど、付与される保護量が多い。一方、ＣＱは、鳥類の 腸管内で供与微生物により形成されたコロニー数に依存する。したがって、ＣＱ 数が低いほど望ましい。ＰＦは対照：試験数比である ので、ＰＦ数が大きいほど、保護がよりよいことを示す。Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ の場合、ＰＦが少なくとも６であることが、ＭＣＥ製剤が効果的であることの目 安である。Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒの場合、１００倍（又はＣＱ＝１０²） 保護が、最小許容レベルである。ＭＣＥの効力についての試験を行うとき、Ｓａ ｌｍｏｎｅｌｌａとＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒの供与は、別個に行っても、混 合物で行ってもよい。これら２種の微生物は、腸管（Ｓｔｅｒｎ等、１９９１） とは無関係に作用することが知られているので、両方を同時供与した時に得られ る結果は、等しく正確であり、この方法は有意により都合がよい。 ＭＣＥ製剤の効果的な量を投与することにより家禽を処置する。ＭＣＥ培養で の処置は、２段階で行ってもよい。第一段階では、効果的な量の培養を、鳥類に 、それらが５０〜７５％ふ化した時に噴霧した後、インキュベーション期間を完 了する。ニワトリでは、例えば、ふ化トレーを、ふ卵器中で１８日間及びふ化キ ャビネットで２．５日間ふ卵させた後に取り出し、各ふ化中ひな及び／又は未ふ 化卵がＭＣＥを約０．２〜約０．３ｍｌ受容するように各トレーに噴霧する。次 に、ふ化トレーを、ふ化キャビネットに戻し、ふ卵を完了させる。 処置の第二段階では、効果的な量のＭＣＥを鳥類の最初の飲料水へ添加し、全 て消費されるまで所定の位置に配置しておく。ニワトリでは、例えば、１ガロン のドリンカージャーでＭＣＥを１：１０希釈したものを、ブロイラー鶏舎にひよ こ２００羽当たり約１ジャーの割合で配置する。ジャーを、全ての培養が消費さ れて（約４時間）、ひよこ１羽当たり希釈ＭＣＥ溶液が約１０ｍｌ消費されるま で所定の位置に配置しておく。 また、製剤は、凍結乾燥又はカプセル化製剤を飼料に添加するか、インオ−ボ （ｉｎ ｏｖｏ）注入するか、ディップした後ひよこに直接噴霧することにより 投与するか、農場水系を介して投与することにより投与してもよい。 新規なＭＣＥ培養及び処置方法は、標的病原体のキャリアとしての役割を果た すことがあるヒトによる消費を目的として飼育している全ての家禽に効果的であ る。家禽には、ニワトリ、シチメンチョウ、アヒル及びガチョウ等の卵又は肉を 得るために飼育している全ての家畜が含まれる。 標的病原体には、家禽に定着できる全てのヒト腸病原細菌が含まれる。特に 重要なものは、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ及びＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ種である 。 以下の実施例は、本発明をさらに説明することのみを意図し、請求の範囲に記 載の本発明の範囲を限定することを意図するものではない。 実施例１ 粘膜競争的排除培養の調製 十分成熟した無Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａニワトリを殺し、盲腸を無菌的に切り出 した。検体を直ぐに、無酸素窒素チャンバー内の無菌ペトリプレートに入れた。 次に、盲腸を無菌ガラス棒で逆にして、盲腸材料の大部分を、無菌ピペットの先 端で除去した。残りの材料を、ＰＲＡＭをシリンジに入れ、そこから無菌針を介 して流れとして出すことによりＰＲＡＭで洗浄した。次に、粘膜層を無菌小刀を 用いて洗浄盲腸材料からスクレープし、スクレープをＰＲＡＭ１．０ｍｌに懸濁 した。懸濁液を、無菌シリンジに吸引して入れた後、新鮮なＰＲＡＭ５ｍｌを入 れた管に接種した。次に、培地を、３７℃で４８時間インキュベーションした。 操作全体を、窒素の一定流を培養調製チャンバーに通過させることにより得られ る無酸素環境中で実施した。 実施例２ Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒに対するＭＣＥの効力に関する試験 隔離ユニットに入れた日齢３〜１０日のひよこに、ＭＣＥ製剤０．２ｍｌを強 制飼養し、そして同様の数のひよこを対照として未処置のままとした。強制飼養 の２４〜３６時間後、ひよこに、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒを表１に示す供与 量範囲で供与した。７日目にひよこを殺した。盲腸を採取し、内容物をＣａｍｐ ｙｌｏｂａｃｔｅｒについて選択的な培地にプレーティングし、４２℃で２４時 間、微好気的（５％Ｏ₂、１０％ＣＯ₂、８５％Ｎ₂）にインキュベーションした 。ＣＤ_50%は、どの供与量でひよこの盲腸の半分に定着したかを測定することに より得た。ＣＱは、特定の供与量で処置した全てのひよこから採取した盲腸材料 １ｇ当たりのコロニー数を測定することにより得た。 表１に示したデータから、３つ別個の試験において、ＭＣＥ処置により付与さ れた保護は少なくとも１００倍であることが明らかである。さらに、２１日 及び４２日で殺したひよこは、同様の保護レベルを維持したことも分かる。 表２に示したＣＱデータも、同様の保護能を示している。ＭＣＥ処置ひよこの ＣＱ値は、対照のものよりも一貫して低い。 実施例３ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａに対するＭＣＥの効力に関する試験 ひよこを、実施例２と実質的に同様に処置した。ただし、盲腸を採取した後、 盲腸材料をＳａｌｍｏｎｅｌｌａに選択的な培地にプレーティングし、３７℃で ２４時間インキュベーションした。Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒに関して記載し たようにしてＣＱ値を測定した。結果を、試験群当たりの陽性数とともに、表３ 及び表４に示す。ＭＣＥ処置により、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａによる定着に対して も相当の保護効果が付与されることが分かる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:01） (72)発明者 ブランケンシップ，リロイ・シー アメリカ合衆国 ジョージア 30605、ア センズ、グレート・オーク・ドライヴ 165

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ及びＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒによる感染から家 禽を保護するのに有用な組成物の製造方法であって、 （ａ）無Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ鳥類から盲腸の少なくとも一部分を切り出し、 嫌気性培地で十分に洗浄する工程と； （ｂ）前記洗浄盲腸から無菌的且つ嫌気性環境において材料を得る工程と； （ｃ）前記材料を嫌気性培地に懸濁して懸濁液を形成する工程と； （ｄ）前記懸濁液を嫌気性環境において盲腸材料関連フローラが生じるに十分 な時間インキュベーションする工程、 からなる組成物の製造方法。 ２．前記材料が、切断片、スクレープ及びそれらの混合物からなる群から選択 されたものである請求の範囲第１項記載の方法。 ３．前記スクレープが、前記洗浄盲腸材料の粘性層のスクレープである請求の 範囲第２項記載の方法。 ４．前記ヒト腸病原細菌がＳａｌｍｏｎｅｌｌａ及びＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔ ｅｒからなる群から選択されたものである前記請求の範囲第１〜３項のいずれか 一項に記載の方法。 ５．前記嫌気性培地が、予備希釈された嫌気性培地である前記請求の範囲第１ 〜４項のいずれか一項に記載の方法。 ６．前記懸濁液を、約３５〜３７℃で約４８時間インキュベーションする請求 の範囲第１項記載の方法。 ７．請求の範囲第１〜６項のいずれか一項に記載の方法により得られる組成物 。 ８．家禽に対するＳａｌｍｏｎｅｌｌａ及びＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒによ る感染予防のための処置方法であって、請求の範囲第１〜６項のいずれか一項に 記載の方法で得られた組成物を有効量前記家禽に投与することからなる方法。 ９．請求の範囲第１〜６項のいずれか一項に記載の方法で得られた組成物を 含んでなる食品添加物。 １０．前記組成物が粘膜競争的排除組成物である請求の範囲第１〜６項のいずれ か一項に記載の方法。