JPH05500656A - 家禽用細菌製剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 家禽用細菌製剤 本発明は家禽用細菌製剤、特に人間の病原性細菌類、特にカンピロバクタ一種に よる家禽腸管中での細菌繁殖を防止するために用いる細菌製剤に関する。

家禽はカンピロバクタ−及びサルモネラ菌によるヒトの疾病の最も重要な感染源 である。胃ＮＮｆ系疾患の共通の原因とによる文献″ザラボラトリー　リコグニ ションオブビプリオフィークスアンドアクロースリイ　リレイテッドビプリオア イソレーテッドフロムケーシスオブヒューマンビブロシス、アナルスオブザニュ ーヨーク　アカデミイオブサイエンス（”Ｔｈｅ　１ａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｔｅ ｃｏｇｎＮｉｏｎ　ｏｆ　Ｖ：ｂｒ’＋。

ｆｅｔｕｓ　ａｎｄ　ａ　ｃｌｏｓｅｌｙ　ｒｅｌａｔｅｄ　Ｖｉｂ＋ｉｏ　１ ｓｏｌａｔｅｄ　ｆｒｏｍ　ｅａｓｅｓｏｆｈｕ［１Ｉａｎ　ｖｉｂ＋ｏｓｉｓ ”、Ａｎｎａｌｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆＳ ｃｉｅｎｃｅｓ）９８巻、７００−７１１頁、１９６２年によればニワトリがヒ トの感染の主要源である。エム、ビー、スカロウ（Ｓｋｉｒｒｏｗ、Ｍ、Ｂ、） 、″カンピロバクターエンテリティス：ア″二ニー′ディジイーズ″、プリティ ッシュ　メディカルジャーナル（”Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｔ　ｅｎｌｅｒｉ ｌｉｓ：ａ　’ｎｅｗ’　ｄｉｓｅａｓｅ”、Ｂｒ１ｌ、　Ｍｅｄ、　Ｊ、）２ 巻、９−１１頁（１９７７年）によれば、ある例におけるヒトの疾患と、農場・ 畜肉業者・家庭の台所における病原菌を有するニワトリとの接触との間の関連性 が示されている。この関連性は後にいくつかの疫学的研究にまとめられた。例え ばエフ。ビイ−、ハリス、エフ。ニス、ヴアイスとシー、エム、ノラン、′ザロ ールオブプールトリーアンドミーツインジイエチイオロジイーオブカンピロバク タージエジュニコリ　エンテリティス”。

アメリカンジャーナルオブパブリックヘルス、（）ｌａｒｒｉｓ。

Ｎ、Ｙ、、Ｗｅｉｓｓ、Ｎ、Ｓ、　ａｎｄ　Ｎｏ１ａｎ、　Ｃ，Ｍ、、　Ｔｈｅ 　ｒｏｌｅ　ｏｆ　ｐｏｕｌｔｒｙ　ａｎｄ　ｍｅａｔｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｅｔ ｉｏＩｏｇ７　ｏｆ　Ｃａｍ　１ｏｂａｅ！ｅｒ　７　ｃｏｌｉｅｎｔｅｒｉｌ ｉｓ”、　Ａｍ、Ｊ、　ｏｆ　Ｐｕｂｌｉｃ　Ｈｅａｌｔｈ）７６巻、４０７− ４１１頁（１９８６年）を挙げることができる。また疫学的に関連していると考 えられ、疑われているカンピロバクタ−症の病原媒体が生、バーベキューまたは 充分加熱されていないニワトリ肉であるとするいくつかの突発的な発症例の報告 がある。ＷＨＯによるニューズレターＮｏ、２０（１９８９年４月）によると、 カンピロバクタ−による感染数は幾つかの先進工業国での過去何年かのサルモネ ラによる感染数を上まわっている。

フィンランドの国立獣医学研究所（ｔｈｅ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｖｅｌｅｒｉｎ ａｒｙ　１ｎｓｔｉｔｕｔｅ）で行われた研究において、ブロイラーがサルモネ ラ菌の腸管内繁殖（成長と付着）を受け易い理由が、おそらく正常な腸管内の細 菌叢（ｂａｃｔｅｒｉａ　ｆｌｏｒａ）の発達の遅れであろうということが確認 されている。この遅れは、ブロイラーの現代的な大量飼育法の結果である。この ような動物は体内に侵入する外来性細菌に対してその抵抗力が弱い。イー・ヌル ミとエム・ランタラ、ネーチャー（Ｅ、Ｎｕｔｍｉ　ａｎｄ　Ｍ、Ｒａｎｔａｌ ａ、Ｎａｔｕｒｅ）２４１巻、２］０−２１１頁（１９７３年）には、新たに評 化したヒナに正常な成鳥の腸内容物を与えるとサルモネラの繁殖に対する抵抗性 が増大することが報告されている。このパイオニア的研究に基づき、競争的排他 の理論（ｔｈｅ　ｔｈｅｏｒｙ　ｏｆ　ｃｏｍｐｅ＋Ｈｉｖｅ　ｅｘｃｌｕｓｉ ｏｎ）（以下ＣＥと略す）が形成された。そして、細菌製剤、特に家禽のサルモ ネラ感染予防用の細菌製剤が公開され提案されるに至った（例えばＥＰ　６６９ ５．ＥＰ　３３５８４及びＥＰ　１５４４７８）。ブロイラー用ヒナにおける競 争的排他によるサルモネラ感染予防の成功に刺激されて、世界のいくつかの研究 グループがカンピロバクタ一種の予防に同様の方法を適用することを試みた。七 −ルヤディーリエン、スノエエンボス及びワアイナク、工ヴイアンディジイーズ （Ｓｏｅ＋　１ａｄｉ−Ｌｉｅｎ。

５ｎｏｅｙｅｎｂｏｓ　ａｎｄ　Ｗｅｉｎａｃｋ、　Ａｖｉａｎ　Ｄｉｓｅａｓ ｅｓ）２６巻、５２０−５２４頁、（１９８２年）と２８巻、１３９−１４６頁 （１９８３年）は、最適な予防力を持つミクロフローラ（ｍｉｃｒｏｆｌｏｒａ ）を有している特定の病原菌のいない（ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｐａｔｈｏｇｅｎ　 ｆｒｅｅ：５ＰＦ）群からのフンの１０％懸濁液を若鶏に投与したところ、カン ピロバクタージェジュニに対する抵抗力の増大が見られたことを報告している。

更に、この研究チームは、投与されたミクロフローラのＣＥ効果がカンピロバク タ一種の投与量を増加させると減少していくことを報告している。カンピロバク タ一種のＣＥ効果についてのほかの報告によれば、フン及び盲腸排出物から生じ るＣＥ−フローラを用いた場合〔スターン、ベイソーとプランケンシップ、工ヴ イアンディジイーズ（Ｓｔｅｒｎ、　Ｂａ１ｌｅｙ　ａｎｄＢｌａｎｋｅｎｓｈ ｉｐ、　Ａｖｉａｎ　Ｄｉｓｅａｓｅｓ）３２巻、３３０−３３４頁（１９８８ 年〕又は新鮮な成鳥盲腸フローラから生じるＣＥ−フローラを用いた場合〔ジャ ンカ、リー及びソレル、エビデミオロジーアンドインフェクション（Ｓｈａｎｋ ｅｒ、　Ｌｅｅ　＆　５ｏｒｒｅｌ、　Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｉ ｎｆｅｃｔｉｏｎ）１００巻、２７−３４頁（１９８８年）〕のどちらも効果は 認められなかった。

本発明は、ヒトの病原性細菌が家禽に繁殖するのを予防するのに有用な、病原性 細菌類が生息する成鳥のミクロ生態学的部位（ｍｉｃｒｏｅｃｏｌｏｇｉｃａｌ 　ｎ１ｃｈｅ）に由来する細菌を含有してなる細菌製剤を提供するものである。

本発明の製剤は、特に成鳥の正常な盲腸フローラ、殊に盲腸粘膜層に由来する細 菌叢（ｂａｃｔｅｒｉａ　ｆｌｏｒａ）を含有してなり、ヒトの病原性細菌、特 にカンピロバクタ−の若鳥における繁殖を抑制するのに使用することができる。

ここに報告する結果は、ブロイラーヒナにおいてカンピロバクタージェジュニバ イオタイブ１の繁殖が抑制されることを示している。

本発明の細菌製剤はまた、他のカンピロバクタ一種及びおそらく他の病原性細菌 に対しても有効である。

本発明で使用されるフローラは、カンピロバクタ−がブロイラーニワトリの盲腸 において占有する傾向のあるミクロ生態学的部位から選択される。有効性の高い フローラは成鳥の盲腸壁の粘膜層からの細菌叢（ｂａｃｔｅｒｉａ　ｆｌｏ「ａ ）を嫌気的条件又は微好気的条件下、好ましくはムチン培地中にて培養すること で得られる。ムチン中で運動性の高い細菌を選択することも好ましい。

以下の実施例で用いるフローラは全て高齢の産卵期のメス鶏の盲腸からのもので ある。

盲腸全体をホモジナイズし、実験室規模では０．１％ペプトン水にて、農場規模 の実験では通常の飲料水にて希釈する。

サルモネラ°　１％ペプトン緩衝液（３７℃／２０時間）、ラバボードーパシリ アディス培地（Ｒａｐｐａｐｏｒ＋−Ｖａｓｓｉｌｉａｄｉｓ　ｂｔｏｔｈ）（ ４１，５℃７２０時間）とテトラチオネート培地（ｆｅｌｒａｌｈｉｏｎａ＋ｅ 　ｂｔｏｔｈ）（３７℃７２０時間）、オーネズ（Ｏｎｉｉｚ）とブリリアント 　グリーン寒天（３７℃７２０時間）カンピロバクタ−ピルビン酸塩、メタ重亜 硫酸塩と第一鉄塩（ＦＢＰ）で補足したプルセラ培地（Ｂ＋ｕｃｅｌｌａＢｒｏ ｔｈ）（微好気的条件下４１．５℃７２０時間）　ＣＣＤ寒天（微好気的雰囲気 下４１．５℃／４４時間） 盲腸ホモジネート培養物（フローラＢ）盲腸ホモジネート１ｍΩを、豚胃部ムチ ン（シグマＨｇで強化したプルセラ培地（ＢＢＬ）　Ｉ　Ｑ　ＯｒｎΩに接種し た。ムチンは少量ずつ沸騰水中に懸濁させ、残りの培地に加える前に中和した。

加圧滅菌後に七ホペラゾン（Ｃｃｌｏｐｅｒａｚｏｎｅ）　（Ｃｅｆｏｂｉｓ。

ファイザー）を最終濃度３２Ｂ／ｌになるように無菌的に加えた。インキュベー ションを微好気的条件下４１．５℃にて４８時間続けた。

盲腸粘膜層培養物の精製物（フローラＣ）フローラＢの非運動性の細菌の大部分 を次の組成を持つ半固体状１０％ムチン寒天により除去する。

半固体状１０％ムチン寒天・ ムチンは加圧滅菌前に沸騰水に溶解させる必要がある。ｐＨは０．］Ｎ　ＮａＯ Ｈで７．２に調整する。

半固体状１０％ムチン寒天３３ｍｕを含む１２ｃｍベトリ皿上に、フローラＢを 一直線上に移植する。

微好気的条件下（酸素５％、二酸化炭素１５％、窒素８０％）４１．５℃にて４ ８時間培養後、移植した直線から２ｃｍから４ｃＬ１１までの間の部分の寒天を 少量、１０％ムチン培地に移植した。この培地の組成はセホペラゾン（Ｃｔｌａ ｐｅｒａ！ｏｎｅ）と寒天を含まない点を除けば１０％ムチン寒天と同じである 。

この操作を非運動性の細菌類が培地中に観測されなくなるまで繰り返した。

細菌類の単離 フローラＣを微好気的雰囲気下４１．５℃にて４８〜９６時間プル七う寒天中で 培養した。運動性を有するスパイラル形の微生物を単離した。

フローラＢを半固体状１０％ムチン寒天３３ＩＩＩＱを含む１２ｃｍベトリ皿中 に一直線上に移植した。嫌気的条件下４１゜５℃にて４８時間の培養後、その移 植した直線から２ｃｍから４ｃ＋ｎまでの間の部分の寒天を少量、】０％ムチン 培地ＩＩに移植し、嫌気的条件下培養した。この操作をブロス中に非運動性の細 菌類が検出されなくなるまで繰り返した。３回の繰り返しの後、培地中にはＹと 命名した一種類の細菌のみが残った。

フローラの投与 実験室試験 実験室試験においては、６０〜７２羽の新たに評化したヒナを１２群に分目、２ ×４群に対して烏用餌の中にＣＥ−フローラを添加した。残りの４群は対照群と し、ＣＥ−フローラを与えなかった。翌日カンピロバクタ−ジェジュニバイオタ イプＩベナー（Ｐｅｎｎｅｄ）　１５またはベナー３／４３１５９の１０００〜 ３０００　ＣＦＵを４群の対照群の２群を除いて全ての群に同じ方法で投与した 。全鳥の半数を１週後に殺し、残りは２週後に殺した。カンピロバクタ−の定量 的測定を盲腸部に対して行った。

野外試験 野外試験においては、１６００〜１７００羽のヒナを１６群に分け、８群は試験 群、４群はカンピロバクタ−陽性対照群、４群は参照群とした。８群の試験群に 対しては、最初の飲用水中にＣＥ−フローラを混合し与えた。翌日１０ｇ＋ｏｃ ＦＵとして４．１６〜５．８０のカンピロバクタ−ジェジュニバイオタイプ］ベ ナー（Ｐｅｎｎｅｄ）　１５を、４群の参照群を除いて他の群のケージ内の３羽 の種ヒナに投与した。成長期間が終わるまで毎週各ケージの３から５羽の鳥を殺 し、盲腸におけるカンピロバクタ一種について定量的に測定した。

ＦＢＰ（硫酸第一鉄、メタ重亜硫酸ナトリウムとビリビン酸ナトリウム、各０． ５ｇ／Ｑ）とセホベラゾン（３２ｍｇ／Ｑ）を含んだプルセラ培地（Ｂｒｕｃｅ ｌｌａ　ｂｒｏｔｈ）、およびチアコールーセホベラゾンーデオキシクロエート （ＣＣＤ）寒天とを用いて、カンピロバクタ一種の定性及び定量的測定を行った 。微好気的雰囲気下４１．５℃にて上記培地は２０時間、寒天は４４時間培養し た。

糀！ 繁殖率（ｃｏｌｏｎｉｚａｔｉｏｎ　ｆａｃｔｏｒ）は各試験群あるいは対照群 の各々のニワトすの盲腸内容物のｇ当りのＣＦＵ数のｌｏｇｌｏ値の算術的平均 値である。

カンピロバクタ−陰性（定量的にも定性的測定いずれにおいても）の鳥は、計算 値で通常１０ｇ＋ｏ値が０．１である。

実験１ 実験室試験 表】はフローラＢの微好気的条件下での培養物がフローラＢの嫌気的培養物より もカンピロバクタ一種に対する競争的排除能力が高いことを示している。

２１　カンピロバクタージエジュニバイオタイブ■熱安定性血清型１５を１羽当 り攻撃量として８９５ＣＦＵの量を投与 繁殖率 １週目　２週目 対照群１　５，１３　７．７４ 対照群２　５．９６　８．３５ 微好気的培養フローラＢ 群１＜２．　Ｏｏ　＜２．　Ｏ。

群２　＜２．００　＜２．００ 群３　＜２．００　＜２．００ 群４　２．３４　＜２．００ 嫌気的培養フローラＢ 群１　＜２．００　３．２４ 群２　４．９１　＜２．００ 群３　３．８９　＜２．００ 群４３．７０　７．０４ 実験２ フローラＢを、運動性と培養雰囲気の違いに基づき上記したように微好気性フロ ーラＣと嫌気性細菌フローラＹとに精製した。嫌気性細菌ＹだけではＣＥ効果は 発現されなかった。

これら２つのフローラを１：１に組み合わせると表２の群３と群４に見られるよ うにＣＥ効果が回復した。

実験室試験 ８２　カンピロバクタージエジュニバイオタイプエ熱安定性血清型１５を１羽当 り攻撃量として２４５　ＣＦＵの量を投与 繁殖率 １週日　２週目 対照群１　７．７８　７．５８ 対照群２　８．３３　８．７４ フローラＹのみ 群１　１．９０　６．７０ 群２　６．５５　８．０６ フローラＹ＋フローラＣ（１：　１） 群３　１．８０　＜２．００ 群４　３．２２　＜２．００ 野外試験 １６Ｘ１００羽のブロイラーヒナを６週間通常の飼育条件で育てた。競争的排除 試験には８群を用いた。４群は負の対照群として用い、図に示していない。試験 群にはそれらの最初の飲用水中に２種類の特定された盲腸フローラを加えた。

フローラの希釈は３０倍を用いた。害鳥に約０．２５１１Ｉｎの溶液を施こした 。

４試験群にはムチンで適合化した嫌気性運動性細菌（フローラＹ）を与えた。残 りの４群には上記したようにムチンで適合化した微好気的フローラであるフロー ラＹとフローラＣとが１：１からなるものを与えた。

３６羽のブロイラーヒナに生後１日日にカンピロバクタージエジュニバイオタプ １、ペナー血清型１５を投与し感染させた。投与量はｌ０ｇ１ｏ４　、　１６　 ＣＦ　Ｕである。これらの種ヒナを３羽づつ各群に分配した。

各群からの３羽の盲腸内容物について、−週間毎にＣＣＤ寒天上でカンピロバク タ−の定量的測定を行った。各群のそれぞれのニワトリの盲腸内容物のｇ当りの ＣＦＵのＩＯｇ＋ｏ値の算術平均値として繁殖率を計算した。負の対照群は、殺 されるまでカンピロバクタ一種に対して定性的に負のままであった。

結果を図１に示す。ムチンで適合化した嫌気性運動性細菌（フローラＹ）は、盲 腸内でのカンピロバクタ一種の数が若干低下（ｆｏｇ１ｏ単位として１以下だけ ）しているもののカンピロバクタ一種の盲腸での繁殖を防止できなかった。フロ ーラＹとフローラＣとの１：１組成物はカンピロバクタ一種の繁殖の発生を２週 間遅らせた。感染３週間後カンピロバクタ一種の数は対照群よりもｌｏｇｘｏ単 位で４単位低い水準に留まった。

実験３ 盲腸のホモジネート（フローラＡ）希釈物のＣＥ効果を嫌気的条件下で生育した 特定されていない盲腸内フローラのＣＥ効果と比較した。試験に供したニワトリ の数、試験群の数及び−羽当りのＣＥ−フローラの投与量は前の試験と同じであ る。４試験群にフローラＡを４群に嫌気的条件下で生育した未特定の盲腸内フロ ーラを与えた。この未特定のフローラを４２７／Ｃと命名した。１８羽のブロイ ラーヒナに１８日後方ンピロバクタージェジュニバイオタイプ１、ペナー血清型 １５を投与した。投与量はＩａｇ＋ｏ５　、８０　ＣＦ　Ｕであった。これらの 種ヒナを３羽づつ各群に分配した。

図２から、フローラＡ（盲腸のホモジネート希釈物）が最も有効なＣＥ効果を示 すことが分る。

フローラＡは明らかにニワトリの盲腸部に繁殖し、２つの群においてカンピロバ クタ−ジェジュニの繁殖を防止しており、他の２群においては繁殖の速度をｌ０ Ｌｏ単位として４の割合で遅らせている。フローラ４２７／Ｃは感染の発現を１ 〜２週間遅らせるが、多分２週後にはニワトリの盲腸部のカンピロバクタ−の数 は対照群の盲腸（カンピロバクタ一種が充分繁殖している）内におけるのと同じ 水準になっていたであろう。

２種類のフローラを用いて のカンピロバクテリア の競争的排除 Ｇ−−０４１ＣＩＩｆｆ７ａ−？Ｙ Δ−−−シ　４　試験群　フローラＹ＋フローラＣ（１：　１＋図　１ ２種類のフローラを用いて のカンピロバクテリア の競争的排除 国際調査報告 １、、ｌｐｍ＋＋３．、＋＊Ｉ　ＡＷｕｌｌｃａｌｌａｎ　Ｎ。　ｐＣ丁／Ｆｌ 　９０１００１７１国際調査報告 ＰＣＴ／ＦＩ　９０１００１７１

Claims (8)

【特許請求の範囲】
1. １．病原性細菌類が通常生育する傾向のある成鳥のミクロ生態学的部位に由来す る細菌類を含有してなる家禽類の腸管細菌感染の予防に有効な細菌製剤。
2. ２．カンピロバクタ一種の予防に有効な請求項１に記載の細菌製剤。
3. ３．成鳥の盲腸に由来する細菌類を含有してなる請求項２に記載の細菌製剤。
4. ４．成鳥の盲腸粘膜層に由来する細菌類を含有してなる請求項３に記載の細菌製 剤。
5. ５．成鳥の盲腸ホモジネート物に由来する細菌類を含有してなる請求項１〜４の いずれか１つに記載の細菌製剤。
6. ６．上記の由来する細菌類を微好気的条件下または嫌気的条件下培養して生成さ れてなる請求項１〜５のいずれか１つに記載の細菌製剤。
7. ７．上記細菌類をムチン培地にて培養して生成されてなる請求項１〜６のいずれ か１つに記載の細菌製剤。
8. ８．スパイラル形の運動性細菌を含有してなる請求項１〜７のいずれか１つに記 載の細菌製剤。