PT78478B

PT78478B - Non-toxinogenic vibrio cholerae mutants

Info

Publication number: PT78478B
Application number: PT78478A
Authority: PT
Original assignee: Harvard College
Priority date: 1983-04-29
Filing date: 1984-04-24
Publication date: 1986-05-27
Also published as: DK213784A; US4882278A; ZA843142B; IE57266B1; EG17879A; ZW6884A1; ZM2884A1; CA1326218C; PH25301A; IE841043L; IL71652A; DE3472114D1; IL71652A0; AU585481B2; EP0125228A1; ES531986A0; DZ634A1; DK213784D0; ES8600649A1; GR81986B

Description

Descrição das Aplicações Preferidas

Descreverei primeiro os desenhos das aplicações escolhidas.

A Fig. 1 é um diagrama que representa os passos da técnica de

construção de um plasmídeo para ser recombinado com 0 cromossoma de V, cholera.

As Fig, 2A e B são diagramas que representam os passos para a re combinação do plasmídeos da Fig.l com 0 cromossoma de V.cholera.

A Fig. 5 ó uma cópia de uma fotografia de uma análise pela técnica de Southern,

As seguintes abreviaturas aplicam-se às Fig 1 β 2,

Sequências Genéticas

ctx p - promotor da toxina

Al	jB	sequência da	subunidade Aq
A2	»	II II	” a₂
B		" de	B Marcas de Resistência
Gm	=	gentamicina
Tc	a:	tetraciclina
Km	BI	kanamicina

Rep » origem de replicação do plasmídeo.

As condições usadas para a digestão dos plasmídeos com os enzimes de restrição indicadas foram as sugeridas pelo fornecedor, New England Biolabs, Beverly, MA. Do mesmo modo, a polimerase T4 do DNA, a Nuclease Bal-51. 0 fragmento de Klenow e a ligase do DNA foram usadas tal como sugerido pelo seu produto, Bethesda Research Labs, Inc., Bethesda, MD. Os "linkers” Xba Γ e Eco Rl foram adquiridos de New England Biolabs.

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Os rectângulos vazios marcados Aj, A2 e B representam as regiões correspondentes dos genes ctx A e ctx B. Os traços grossos representam DNA de V.cholera adjacente aos genes da toxina.

I* Seleoção da estirpe original

A estirpe original de V.cholera utilizada para construir um mutante para vacinas vivas deve induzir protecção duradoura e total e deve colonisar bem 0 intestino humano. A Ogawa 595 tem demonstrado uma capaci dade de induzir uma imunidade que dura três anos, geralmente eficaz contra a infecção por outras estirpes /""Cash et al (1974), J. Infect, Dis„ 129:45-52_7. Também colonisa bem 0 intestino.

II. Construção do plasmideo

Em linhas gerais, um plasmideo (pJM17) preparado a partir de DNA da estirpe selvagem de V.oholera Inaba 5&9B segundo 0 método de Pearson e líekalanos (1982, Proc. Natl. Acad, Sei. USA 79: 2976-2980, contém genes de subunidade A da toxina (ctx A) e da subunidade B da toxina (ctx B), assim como da resistência ã tetraciclina (Tc ).

Tal como se descreve na Pig. 1, 0 plasmideo pJM17 foi linearizado com Xba I e, em seguida, digerido exonucleoliticamente com Bal51. Uma vez que 0 local de ataque da Xbalestá dentro do gene ctx A, este método resul ta na delecção de sequências de 0txA. A ligação dos produtos de digestão de Bal-51 na presença de um "linker” Xba I resultou na construção e isola mento do plasmideo pJM17.25. A reunião dos fragmentos Pstl^Xbal de pJM17 e pJM17.25 resultou na construção de pJM25. Este plasmídeo contém uma delecção interna de 45θ pares de bases em ctxA. A posição desta delecção dentro do gene ctx A foiconfirmada pela determinação da sequência do DNA, que demonstrou que mais de 80% da sequência necessária à produção do peptfdeo Aj, tinha sofrido delecção. Especificamente, a delecção de otx A transportada por pJM25 remove 0 DNA que codifica para os resíduos aminoácidos 10 a I64. Uma vez que 0 peptídeo Αχ enzimaticamente active tem o comprimento de 192 resíduos aminoácidos esta delecção remove 80% da informação necessária para Αχ. A sequência de DNA da delecção de ctxA é apresentado abaixo:

AGT

AAC

TTA

GAT

ATT

GCT

CCA

GOA

GCA

GAT

GGT

TAT

GGA

TTG

GCA

GGT

TTC

CCT

CCG

GAG

CAT

AGA

GCT

TGG

SER

ASN

LEU

ASP

ILE

ALA

PRO

ALA

ASP

GLY

TYR

GLY

LEU

ALA

GLY

PHE

PRO

GLU

HIS

ARG

ALA

TRP

continua para 0 residuo # 10

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Foi descrito que um fragmento do peptídeo Αχ de 12500 dalton de peso molecular que contém a região de MET-41 a MET-101, retém 35$ cLa actividade enzimática de um peptídeo Αχ eompleto ^"bai et al. (1979),Abs tracts of the llth International Congress of Bioohemistry, Toronto, Canada, p. 207, Abstract 03-45173^7. 0 local activo do peptídeo Α_χ, fica, portanto, nesse fragmento de 12,500 dalton e, mesmo se não está dentro da regiSo de 6600 dalton entre MET-41 β MET-101, não pode ficar mais de cer ca de 54 amino ácidos (5900 dalton )para lá de MET-101.0 local activo está portanto bem dentro da delecção de ctxA do plasmídeo pJM 23. A delecçSo dos aminoácidos entre o aminoácido 41 o 101 (ou, de preferência, para assegurar a total ausência de toxinogenicidade, entre os aminoácidos 10 β I64) assegura a perda da toxinogenicidade de A^,

Bemonetra-ee que 0 plasmídeo pJM23 codifica para a produção da subunidade B tanto em E. coli como em V. cholera, demonstrando-se assim que as mutações de delecção em otxA tem pouco efeito na expressão de ctxB. Os resultados seguintes (Quadro i) foram obtidos testando a subuni dade B total produzida em 18 cultnras Hr CYE por teste imunoabsorvente de ligação enzimática (ELISA). Menos de 0,005^g/ml de subunidade B não puderam ser detectados. NB significa "não determinado" porque a experiência foi proibida.

Quadro 1

Produção de subunidade B por plasmídeos recombinantes

Plasmídeo Em E< coli MS371 Em V, cholera M7922

pJM17 0,3 /ig/ml ND

pJM23 0,2 /<g/ml 9,0 ^g/ul

pJM290.2 0,05 yug/ml 1,5 yfcg/ul

pJM23.211 0,005^(g/ml < 0,005 /tg/ml

pJM290.211 4 0,005/(g/ml < 0,005y*g/ml

III. Recombinação oom 0 cromossema

Ainda com referência à Fig. 1, dois plasmídas, pJlí 23»2e pJM23211, foram construidas a partir de pJM 23. Fragmentos desses plasmídeos foram então cionados noutro plasmídeo (RK290) /~Runken et al (1981), Nature (Lon don) 289:85-88 / para utilização nas substituições de marcas representadas na Fig. 2 e descritas abaixo.

A, Estirpe 0395-N1 do Plasmídeo pJM23

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Como se mostra na Fig. 1, pJM 23 & convertido num plasmídeo derivado pJM 23.2 por digestão com Pst I e polimerase T4, seguida por ligação na presença de "linker’' Eco RI. pJM 23.2 ó idêntico a pJM23, excepto no facto do local Pst I ter sido substituido por um local Eco RI.

A partir de pJM 23.2, constmói-se um plasmídeo (pJM 23.211) com um frag mento de UNA que codifica para a resistência à Kanamycina (Km ) inserido aproximadamente na junção da delecção otxA e ctxB originalmente em T>JM23.

Isto Ó realizado por meio da digestão de pJM 23.2 com Xbal na pre sença de produtos de Xbal do plasmídeo pJM22 que transporta Km ladeada por locais Xbal/Hinc II. 0 plasmídes resultante pJM 23.21 é digerido por Hlnc II e ligado para criar pJM 23,211, o qual tem uma delecção de ctxA começando no amiroácido 10 e extendendo-se através de ctxB atê ao local Hlnc II.

R

0 gene Km" fornece uma marca selectiva com a qual se podem obter os recombinantes de 0395 que substituíram ambos os seus genes ctxA residentes pela mutação de delecção transportado por pJM23.211,

Utiliza-se então uma técnica de substituição de marcas para efectuar a recombinação com 0 cromossoma, tal como se segue: primeiro é feito um derivado espontâneo de 0395 resistente à estreptomicina (Sm ) plaqueando cerca de ΙΟ^θ células Ogawa 0395 em meio contendo 100yW-1 de estreptomicina, Este derivado é utilizado em todas as experiências subsquentes. 0 plasmídeo pJM290.211 é transferido para 0395 Sm por conjugação, utilizando · plasmídeo RK2013 /"Ruvkin et al.(1981) Nature (London) 289: 85-88 7 como mobilizador. As células 0395 Sm^ transportando pJM290.2]l sSo Sm Tc Km , SSo superinfectadas com outro plasmídeo pttCl £ pHIl § o mesmo que o plasmídeo pHIlJl descrito por Berlinger et al. (ΐ97θ) Nature 276:633-634J, 0 q4al e Gm e são seleccionadas as colónias Gm Km „ pHIl e pJM290.211 não podem coexistir estavelmente na mesma célula por

•ausa de uma barreira de incompatibilidade. Assim, para que a célula per

R

aaneça Km , precisa de se recombinar com 0 DNA que codifica para esta resistência nm cromossoma 0395·

A Fig. 2A representa a ligação cruzaâá entre a cópia cromossómica dos genes otx e a delecção derivada transportada pelo plasmídeo pJM290.

211. Os recombinantes adequados foram recuperados por superinfecção com o

r RR

plasmídeo incompatível e selecção de Gm e Km . A estrutura de tal recombi^ nante, 0395-HT, ê mostrada. 0 local do cromossoma 0395 em que Km vai ficar e determinado pelas sequências de DNA que ladeiam 0 fragmento Km .Uma vez que estas são derivadas do DNA que ladeia os genes da toxina no oro-

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mossoma, dá-se o resultado apresentado na Fig. 2A e os genes residentes sâo substituídos pelos genes mutantes transportando o fragmento inserido Km^R. A extensão do DNA de pJM 25.211 que ladeia os loci otx A e ctx B e que corresponde à sequência de DNA cromossómico selvagem pode ser expressa como a distância entre o local Eco BI e o local Xba I no fragmento do gene A em pJM 25.21 (2,7 kb) e a distância entre o local Hino

R

II no gene B e o local Eco RI adjacente ao gene Tc (l,4 kb). Assim, a mutação de delecção recombina-se com o cromossoma e substitui uma cópia normal do locus ctx.

Uma vex que 0595 possui duas cópias do locus da toxina, á neces: sário recombinar a mutação de delecção 290,211 em ambas. Surpreendentemente, isto é conseguido simplesmente fazendo crescer as estirpes que transportam uma marca substituída durante várias gerações em que as recombinações resultaram na transferência espontânea da mutação noutra cÓ pia. Os derivados 0595 transportando as mutações de delecção em ambas as cópias são então reconhecidas por hibridização de colónias utilizando uma sonda (o fragmento Xbal/5inc II de 0,95 kb de pJM17) que hibridiza especificamente com o DNA ausente na mutação de delecção. As que não rea gem a esta sonda são em seguida verificadas por hibridização de Southern para confirmar a perda da sequência removida pela delecção. A migração das bandas confirma que as delecções da dimensão esperada do gene A são introduzidos em ambas as cópias dos dois genes ctx residentes de 0595 pa ra dar origem à estirpe 0595-NT.

Como se esperava para a delecção ctx A-ctx B, a estirpe 0395-NT não produz nem a subunidade A nem a subunidade B, uma vez que as porções de ambas estes genes sofreram delecção em pJlí290.211. Os resultados abai, xo (Quadro 2) apresentam o antigénio da subunidade B total produzida em 18 culturas Hr CYE e testadas por ELISA. Menos de 0,005ytg/ml da subunidade B não puderam ser detectados. A actividade da toxina total é expressa em termos deyUg/ml de toxina colérica. 0 mesmo fluido sobrenadante da cultura foi testado como referido acima para a subunidade B. 0 teste de toxicidade foi o teste de célula-CHO realizado como foi descrito por Guer rant et al (1974) Infect. Immunol 10j 320-327»

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Quadro 2

Subunidade B e Actividade Toxinica Produzidas por Derivados de V. cholera

Estirpe Antigénio de Subunidade B Actividade Toxinica

0395 °.5 /g/ml 0.3 /g/ml

0395-NT < 0.005 /g/ml < 0.001 /g/ml

0395-Nl 0.3 /g/ml 0.001 /g/ml

B. Estirpe 0395-Nl

A construção presente em pJM23.2 e recombinada com 0 cromossoma por meio de uma técnica de snbstituição de marcas. 0 plasmideo pJM290.2 é formado por transferência de um fragmento de 4,6 kb de pJM23.2 em RK 29O, 0 plasmideo pJM290.2 é entSo transferido para a estirpe 0395-NT que tem cada uma das suas duas cópias de ctx ligadas a uma Km . Á introdução de pJM290,2 nesta estirpe permite então que as recombinaçães subsquentes substituem as cópias ligadas a Km com a construção em pJM290.2. Estas colónias recombinantes são reconhecidas pela sua sensibilidade a KM_e

Especificamente, tal como^é apresentado na Pig.2B, a estirpe

foi curada de pHIl e pJM290.2 foi então transferido para a estirpe. Após R

cerca de 50 geraçUes de crescimento, os recombinantes Km espontâneos foram isolados por meio de réplicas. Um destes foi curado de pJM290,2 β tem a estrutura que se apresenta (0395-Nl). A hibridização de Southern para oonfirmar a estrutura de um destes que dão origem à estirpe 0395-Nl é feita éòmo se segue.

É preparado DNA a partir das estirpes 0395 θ 0395-Nl» θ DNA é digerido com Xbal e analisado pelo método de Southern (1975), J.Mol.Biol.

98i 503-517 que com a sonda Al (0 fragmento Xbal-Hind III fragmento de 560 pares de bases de EWD299 /"*Dallas (1979) J.Bact.l39i 850-858 /,quer com a sonda B (0 fragmento Eco RI-Hind III de 590 pares de bases de EDW 299)» 0s dois leci ctx de 0395 são vistos como duas bandas que reagem com ambas as sondas. A estirpe 0395-Nl, todavia, reage unicamente com a sonda B e as bandas que reagem são de tamanho mais pequeno devido à dele£ ção de ctxA originalmente presente em pJM23. A Fig. 3 é uma cópia de uma fotografia de hibridizaçães de Southern mostrando que 0395-Nl perdem a sequência homóloga a uma sonda derivada da região A^, mas retém a sequência da subunidade B, a qual reside em fragmentes de restrição que são mais pequenos do que a delecção de ctx A^, noplasmídeo pJM 23 (45θ pares

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-10de bases). Consistente com este resultado, O395-N1 produzia quantidades normais de subunidade B quando comparada com a estirpe de origem 0395, mas não apresentava toxicidade em células-CHO. Beste modo, O395-N1 é idêntica à estirpe de origem 0395 excepto na delecção de ctxA originalmen te presente em pJM23·

As estirpes e plasmídeos resultantes foram depositados na American Type Culture Collection e têm os seguintes números de depósitos

Estirpe O395-U1 39346 Estirpe 0395-NT 39547 Plasmídeo pJM290.2 39348 Plasmídeo pJM290.211 39349

As amostras dos depósitos da - --- ATCC estarão disponíveis após

o registo desta patente nos Estados Unidos, publicação de um requerimento de patente europeia ou japonesa ou de acordo com as leis de qualquer país em que é feito um requerimento da patente.

IV. Utilização

Tanto a estirpe O395-N1 como a estirpe 0395-NT são úteis como fontes de protecção imunológica contra a infecção de cólera. São utilizáveis como vacinas mortas ou vivas.

A estirpe O395-U1 ó produzido a partir de uma estirpe original que se sabe colonisar bem o intestino e provocar uma forte reacção imunitária. Demonstrou-se que a estirpe mutante estava alterada unicamente no facto de ter uma mutação de delecção que impede a expressão de uma subunidade A^ toxinogÓnica. A estirpe é útil, por exemplo, como vacina preparada e administrada nas doses e condições descritas em Holme et al. Acute Enteric Infections in Children, New Prospects for Treatment and Prevention (Ι9θΐ), Elsevier/North-Holland Biomedical Press, Cap. 26, pp. 443 et seq. (Levine et al).

0 facto de os indivíduos infectados com ο V. cholera Ogawa 395 toxinogenico não excretarem quantidades significativas de células intactas indica que está envolvida uma defesa imunitária dirigida às células, além das defesas anti-toxina. A estirpe 0395-UT, embora não possua a informação genética necessária para produzir a subunidade B da toxina, possui, no en tanto, outras caracteristicas imunogénicas da Ogawa 395 e é útil como vacina preparada e administrada como dito acima.

Os plasmídeos e métodos descritos aqui são úteis para construir

as estirpes 0395-NT e O395-N1 e podem também ser usados para construir

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e stirpes que expressem a subunidade B com qualquer outro antigénio. Tais estirpes poderiam então ser utilizados numa vacina para aproveitar a maior imunogenicidade que se obtem ligando um antigénio à subunidade B e utilizando assim a subunidade B como veículo de reconhecimento e ligação à célula.

-

Claims

REIVINDICAÇÕES-

1. Processo de construção de uma estirpe geneticamente estável de Vibrio cholera Ogawa 395 que tem uma mutação de delecção em ambas as cépias do gene que codifica para o peptídeo A^ (otxA^). resultando na perda de uma sequência genética necessária â expressão de um peptídeo té

xico Ap
2. Processo de construção da estirpe da reivindicação 1 em que

ambas as cépias do gene ctxA^ estão ausentes, pelo menos a porção de sequência genética que codifica para os resíduos aminoácidos de 41 até 101.
3. Processo de construção da estirpe da reivindicação 1 em que

ambas as cépias do gene ctxA^ estão ausentes, pelo menos a porção da sequência genética que codifica para os resíduos aminoácidos de 10 até 101.
4. Processo de construção da estirpe da reivindicação 1 em que

ambas as cépias do referido gene ctxA^ não possuem pelo menos 80% da sequência necessária à expressão do peptídeo Ap
5. Processo de construção da estirpe da reivindicação 1 em que a sequência do gene otxB está intacta.
6. Processo de construção da estirpe da reivindicação 1 em que a sequência genética selvagem está em tudo 0 resto intacta, excepto no que diz respeito à referida mntação de delecção.
7. Processo de construção da estirpe da reivindicação 1 em que

a referida mutação de delecção inclui uma porção do gene que codifica para a subunidade 3 (otx B) necessária à expressão de uma subunidade B eficaz.
8. Processo de construção de uma forma geneticamente estável de Vibrio cholera que é incapaz de expressar um peptídeo téxico incluindo

fornecer uma estirpe selvagem de Vibrio cholera com, pelo menos,

duas cépias do gene ctxA^ no seu cromossoma e que se sabe colonisar 0 intestino e ser imunogénica; provocar uma mutação de delecção em uma das cé

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pias do gene ctxA de uma sequência genética da referida estirpe necessá ria à expressão de um peptídeo tóxico A^; e fazer crescer o resultante Vibrio cholera alterado durante várias gerações para permitir a transferência espontânea da alteração para a segunda cópia do gene ctxA do re. ferido cromossoma·
9. Processo da reivindicação 8 em que o referido passo de delecção inclui as seguintes etapas

fornecer DNA de uma estirpe selvagem de Vibrio cholera; isolar a partir dessa estirpe um primeiro plasmideo que contem os genes ctxA e ctxB e segmentos de DNA que ladeiam ambos os lados desses genes na referida estirpe; construir um segundo plasmídeo a partir do primeiro, sendo o segundo plasmídeo alterado, pelo facto de pelo menos um segmento do gene otxA necessário à expressão de um peptídeo tóxico A^ ter sofrido delecção; e recombinar um segmento do segundo plasmídeo que inclui os referidos segmentos que ladeiam os referidos genes no cromossoma de uma e.s tirpe de Vibrio cholera que se sabe colonisar o intestino e ser imunogénico, substituindo deste modo uma cópia do gene ctxA do referido cromossoíâa.
10. Processo da reivindicação 9 θ® que o segundo plasmídio possui uma marca para verificar o referido passo de recombinação,
11. Processo da reivindicação 9 sm que a referida estirpe usada para recombinação com o segundo plasmídeo é Ogawa 395·
12. Processo da reivindicação 9 ^em que o segmento delectado do re ferido gene ctxA inclui pelo menos a porção da sequência genética que cg difica para os residuos aminoácidos de 41 atá 101.
13. Processo da reivindicação 9 cm que o segmento delectado dm referido gene ctxA inclui pele mehos a porção da sequência genética que codifica para os resíduos aminoácidos 10 a I64.
14. Processo da reivindicação 9 sm que 0 segmento delectado do referido gene ctxA inclui pelo menos 80$ da sequência necessária à expressão do peptídeo A^.
15. Processo de construção de um plasmídeo que inclui uma sequência de DNA que correspopde a um segmento do cromossoma que ladeia 0 gene ctxA - ctxB de uma estirpe de Vibrio cholera em que o referido plasmídeo não possui pelo menos um segmento do gene ctxA necessário ã expressão de um plasmídeo tóxico A_lo

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