JPS6037980A - 非毒素産生性ビブリオ・コレラ変異株 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の分野 本発明は、例えば、コレラおよび他の症状に対する免疫
学的防護のために有用なビブリオ・コレラ（Ｖ　１ｂｒ
ｉｏ　ｃｈｏｌｅｒａｅ）の修飾株ならびにかかる株の
調製に用いるプラスミドおよび方法に関する。

発明の背景 コレラはグラム陰性１ａ菌であるごブリＡ・コレラによ
って起る下痢症である。経口的に取り込まれるど、ビブ
リオ・コレラはヒトの上部腸管で増りハし、該病気で観
察される下痢の原因となる可溶性蛋白、コレラ・トキシ
ンを産生ずる。このトキシンは△Ｊ５よびＢの２つのタ
イプのサブユニツ１−で）１°４成され、無傷の１〜ギ
シンの活性はその起源がＡサブユニットの蛋白分解性フ
ラグメン１へ、Ａ１ペプチド中に見出される。これは標
的ｌ胞のアゾニレ−１−・ザイクラーゼ系を活性化する
酵素である［Ｇ１１ｌ　（１９７５）　、　Ｐｒｏｃ、
Ｎａｔ’　１．Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、ＵＳＡ、７２　：　２０６４−２０６８　コ　
。　その結果、腸管細胞における環状ＡＭＰか増加し、
該病気に見られる下痢を生じさせる。Ｂサブユニッ１〜
は非ｍ性ではあるが、標的細胞に結合し、その細胞膜を
通じる△１ペプチドの輸送を容易にする［Ｃｕａｔｒｅ
ｃａｓｅｓ、　Ｂ　ｉｏｃｂｅｍ、、１２　：　３５７
７−３５８１　（１９７３）］。Ｂサブユニツｊ・にλ
・１１する抗体は、１〜キシンの細胞表面への結合を遮
断りることにより、［・キシンを効率よく不活化づる［
前記参照］。

コレラ・トキシンは腸管の病気のため、市販の死菌およ
びトキソイドワクチンは非経口投句した場合の免疫誘発
において比較的効果がない。症状自体が免疫を誘発する
ので、分泌１（ＩＡによって伝達される局所腸管免疫が
、多分、コレラに対りる獲得免疫のもつども重要な朗様
ど結論しな【）ればならない。腸管における局所免疫を
刺）２にりるには、該細菌抗原は胃の酸および蛋白分解
性障壁を通して与えなければならない。この７．−めに
、軒１１コレラ生ワクチンが提案されている。

全くトキシンを産生じないか、１〜キシンの１３　（Ｊ
プユニットのみを産生するピブリＡ・コレラの変異株が
単離されている［　Ｆ　１ｎｋｌｅｓｔｅｉｎ　ｅｌ　
ａｌ、。

＜１９７４＞、Ｊ、Ｉｎｆｅｃｔ、［）ｉｓ、、１２９
　：１１７〜１２３：Ｈｏｎｄａｅｔａ１．．（１９７
９）。

ｐ　ｒｏｅ、Ｎａｔ’　１．Δｃａｄ、ｓｃｉ、　ＵＳ
Ａ、　７６　：　２０５２−２０５６　：Ｍｅｋａｌａ
ｎｏｓ　ｅｔ　ａｌ、、（１’９８２）、　ｌ：）ｒｏ
ｃ、Ｎａｔ’　１．Ａｃａｄ、ｓｃｉ、　ＬＩＳＡ、　
７９　：１５１−１５５］ｏしかしながら、抗コレラ生
ワクチン用の株として至適な株どなるには、変異株は＜
１）Ｊ：＜特徴づ（プられ、ｊｍ伝的に安定であること
（ずなわら、トキシン産生性の野生型に復帰しないこと
）、（２）胆管内でよくコロニー化すること、Ｊ５よび
−（３）長命の酵素な免疫を与えることが必要である。

これまでに１ｑられた変異株、例えば、化学的変異誘発
処理で得られた変菫株または至適コロニー化および免疫
産生能を有することの知られていない親株から１ｒ、１
られた変異株は、たとえ、ヒト有志における予備テスト
でそれらが比較的無毒で、有意な免疫を誘光るすことが
示されても、前記３つの範躊のうちの１つに問題を起り
ことかある「Ｗｏｏｄｗａｒｄ　ｅｔ　ａｌ、、（１９
７５）　。

Ｐｒｏｃ、１１ｔｌ］Ｊｔ、Ｃｏｎｆ、ｏｎ　Ｃｔ＋ｏ
ｌｅｒａ　ＮＩＨ。

ｐ３３０；　ト１ｏ１ｍｅ　ｅｔ　ａｌ、、Ａ（ｊＪｔ
ｅ　Ｅｎｔｅｒ；ｃｌ　ｎｆｅｃｊｉｏｎｓ　ｉｎ　Ｃ
ｈｉｌｄｒｅｎ　、Ｎ　ｅｗ　Ｐｒｏｓｌ＋ｅｃｔｓｆ
ｏｒ　Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ　ａｎｄ　Ｐｒｅｖｅｎｔｉ
ｏ＋＋　（１９８１）。

［：　１ｓｅｖｉｅｒ　／　Ｎ　ｏｒ口ｌ−１−１ｏ１
１ａｎ（Ｉ　Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｐｒｅｓｓ、Ｃｈ、
２６．ｐｌ＋４４３　ｅｔｃ、（ｌ　ｅｖｉ＋＋ｅ　ｅ
ｌａｌ、）　コ　。

発明の概要 本発明は、その１つの態様にｄ３いて、ＡＩベノ′チド
ーコード（＝Ｊけ遺伝子（ｅｔｘＡ）の両方のコピーに
欠失変異を有し、そのため、毒４ＱＡ＋ベア１−ドを表
現するのに必要なｉｌｌｌｌ配子配列つｌこじプリΔ・
コレラ・オガワ３９５株の）真伝的に安定な、非に素度
生形を提供するものである。

好まｌノい具体例においては、ｃｔｘＡ項伝子配列の各
コピーは、少なくとも、△１ザブコーニツトのアミノ酸
４１〜１０１（もっとも好ましくは、）アミノ酸１０〜
１６４）をコートイリ（プする）口伝了配列部分がなく
、ＣＬＸＢｉＭ伝子配列が伝動配列該欠失変異が有効Ｂ
−ザブユニットを表現するために必要なり一すブユニッ
１〜・コード（＝Ｊけ３ｎ伝子部分も包含している。該
ビブリＡ・コレラ細胞系り、Ｌ　、ｉ’メリカン・タイ
プ・カルヂ１？−・コレクシコンに寄託されているＡＴ
ＣＣＮｏ、３９３４６またはＡＴＣＣＮｏ、３９３４７
の同定特性を有する。

他の態様において、本発明は毒性Ａ１ペプチドを表現で
きないビブリオ・コレラの遺伝的に安定な形の製法およ
びその方法で用いるプラスミドを１；？供Ｊる。

好ましい具体例において、該方法は、ｃｔｘＡおよびｃ
ｔｘＢ３ｕ伝子およびこれらの遺伝子の両側を囲Ｇ　（
ｂｒａｃｋｅｔ　）　Ｄ　Ｎ　Ａセグメントを含有覆る
第１のプラスミドを単口１し、第１のプラスミドから、
Ａ１ペプチド−コード付は遺伝子中の毒素産生性Ａ１ペ
プチドの表現のために必要な配列が欠失した第２のプラ
スミドを作り、該囲まれた范仏子しグメントを含む第２
のプラスミドのセグメン１〜を、腸管でコロニー化し、
免疫原性であることが公知のビブリオ・コレラの染色体
に組換えて、該染色イホ−ＶのｃｔｘＡ遺伝子の１つの
コピーを欠失変放で置換し、得られた微生物を数世代増
殖させて、ｃｔｘＡｉｍ伝子のもう一方のコピーへ該変
異を自然に伝達させる工程を包含する。また、この方法
の好ましい具体例においては、第２のプラスミドが該組
換工程を確認するための遺伝的標識形ｖ１を含み、該組
換工程に用いる株がオガワ３９５株Ｉ、前記のような欠
失が包含される、１ 該プラスミドは、ビブリオ・コレラの株のｃｔｘＡ−員
ｘＢｉ伝子を囲む染色体セグメントに相当づる［）ＮＡ
配列からなり、該プラスミド１よ、少なくとも、毒性Ａ
１ペプチドを表現Ｊるのに必ｔ２４「ｃｔｘＡｍ伝子の
セグメン１〜を欠く。

本発明の他の特徴および利点を以１・、さらに訂しく説
明する。

１Ｆましい具体例 まず、好ましい具体例を図面の簡単な説明りる。。

図面中、第１図は、ビブリオ・コレラの染色体に絹換え
るべきプラスミドを作るｌｊ法の１稈を示す図面である
。

第２図ＡおよびＢは、第１図で得られた一ｆシラスドを
ビブリオ・コレラの染色体上に絹換える／ｊめの工程を
示り図面である。

第３図はサザン・ブロワｌ−（３０ＬＩ［ＩＩＧＩＭｌ
旧ａｔ）分析の結果を示す図面代用９衰である。

第１図および第２図においてはつぎの略号を用いている
。

遺伝子配列 ユｔｘｐ　＝　トキシン・プロモーターＡ＋　＝Ａ＋ザ
ブユニツ１〜配列 Ａ２　＝Ａ２サブユニット配列 Ｂ＝Ｂ配列 耐性標識 Ｑｍ−ゲントマイシン Ｔｃ−テトラサイタリン Ｋｍ−カナマイシン Ｒｅｐ＝プラスミド複製の原点 表示した制限酵素でのプラスミドの消化条件はその販売
省（Ｎ　ｅｗ　Ｅ　ｎｇｌａｎｄ　［３１ｏｌａｂｓ。

３　ｅｖｅｒｌｙ、、　ｆｖｌ　Ａ　、　）によって指
示されているものである。同号子に、丁４ＤＮＡポリメ
ラーゼヌクレアーゼ　Ｂａｔ−３ｉ、フレナラ（１＜　
ｌｅｎｏｗ　）フラグメン１〜およびＤＮｉ＼Ｎｉ−ゼ
もその製造者（８８口１ｅｓｄａ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　
Ｌ　ａｌａｓ、［＋＋ｃ、、３　ｅｔｈｅｓｄａ。

ＭＤ、）の指示に従って用いた。Ｘ’ｂａ　ｌ：および
ＥＣ０ＲＩリンカ−は前記のＮ　（！Ｗ　Ｅ　ｎｇ　Ｉ
ａ＋＋＋ＪＢ　１ｏｌａｂｓから購入した。Ａ１、Ａ２
および巳と表示した囲はｃｔｘ　ＡおよびｃｔｘＢ；Ｍ
仏子の対応部１ｒｔを示す。太い実線は該トキシン遺伝
−ｒに隔接りるビブリΔ・コレラＤＮＡを示１゜ ■、親株の選択 生ワクチン用の変異株製造に用いるビフリΔ・コレラの
親株は長期持続性の、広範囲の画論を誘発する必要があ
り、と１〜の腸管でよくコロニー化しなりればならない
。Ａガラ３９５株【、１他の株の感染に対して一般的に
有効な、３年間持続する免疫を誘発することが証明され
ている［　ｃａｓｌ＋　ｅｔａｌ、、（’１９７４）Ｊ
、　ＩＩ汀ｅａｔ　、　ｌ）　ｉｓ、、　二１：ｌ＋鼾
−−：４５−５２］。また、該株は腸管でよ（」ＩＬＩ
”−化する。

１丁、プラスミドの製造 概略、ピアソンおよびメカラノスの方法［ｐ　（３ａｒ
ＳＯｎおよび１ｖｌｅｋａｌａｎｏｓ、（１９８２）Ｐ
ｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　７９　：　２
９７　Ｇ　−２９８０］に従って、ビプリＡ・コレラの
野生型イナバ５６９Ｂ株のＤＮＡから調製されたプラス
ミド（ｐＪＭ１７）がＡトキシン・サブユニットについ
ての遺伝子（ＣｊＸＡ）おＪ：びＢトキシン・ザブユニ
ットについての遺伝子（ｃｔｘＢ）ならびにテトラザイ
クリン耐性に関する遺伝子（ＴｃＲ）を含有−４る。

第１図に示ずごとく、ｐＪＭ１７プラスミドをＸｂａＩ
で線形化し、ついでＢａ１３１でエキソ核酸分解的に消
化°りる。Ｘｂａｉ部位がｃｔｘＡ辿伝子内にあるので
、この操作でｃｔｘ　Ａ配列の欠失が生じる。Ｂａ１３
１消化物のＸｌ＋ａＩ　Ｉ）ＮＡリンカ−の存在下にお
ける結紮により、プラスミドＤＪＩＶ１１７．２３が止
し、単離される。ｌ）ＪＭ１７およびｌ）ＪＭ１７．２
３のＰ　ｓｔＩ　−Ｘ　ｂａＩフラグメン１〜の再集合
により　ｐＪ　Ｍ　２３が生じる。このプラス４ｌ’　
にｌ：　ＣＩＸ　Ａ中に内部４．５０塩基対欠失を含む
。

ｃｔｘＡｉＨ伝子内のこの欠失の位置はＡ１ペプチドの
産生に必要な配列の８０％以上が欠失したことを示すＤ
ＮＡ配列によって確認された。特に、ｐＪＭ２３によっ
て担持されるＣｔＸ　Ａ欠失はＤＮＡコードイ」けアミ
ノ酸残ＪＪ１０〜１Ｇ／Ｉを除く。酵素的に活性なＡ１
ペプチドは１９２のアミノ酸残基からなる長さを有する
ので、この欠失はＡ１についての必要な情報の８０％以
上を除く。

ｃｔｘ　Ａ欠失のＤＮＡ配列を双手に承り。

目　詫 目　蝿 矩　錠 ６　閏 践　賎邑 目　尾 目　足 Ｆ期 目間 砦咥出 に　円部 ＜　Ｈ− 西　衣 １悶 禅裟 騎頗 Ａ１ペプチドの分子！１２５００ダルｌ−ン・フラグメ
ントがＭＥＴ−４１〜Ｍ　Ｅ　Ｔ　−１０１の部位を含
有し、完全なＡ１ペプチドの酵素活１！Ｉの３５％を保
持していることが報告されている［１ａｉｅｔ　ａｌ、
、（１９７９）ＡＩ＋５ｔｒａｃｔｓ　ｏｆ　ｔｌ＋ｅ
　１１１１＋Ｉｎｔｅｒ＋＋ａｔｉｏｎａｌ　Ｃｏｎｇ
ｒｅｓｓ　ｏ、ｒ　３ｉｏｃｔ＋ｅｍｉｓｔｒｙ。

Ｔｏｒｎｔｏ、Ｃａｎａｄａ、ｐ２０７．Ａｂｓｔｒａ
ｃｊ　０３−４５１７３］。しＩこがって、ＡＩベブヂ
ドの；重性サイトはこの１２５００ダル１−ン・ノラグ
メント上に位置し、たとえ、該ザイ［・がＭ　Ｅ　Ｔ−
／ｌ　’１〜ＭＥＴ−１０１間の６６００ダル１〜ン部
位内にないとしても、ＭＥＴ−１０’１を越えた、約５
４アミノ酸（５９００ダル１−ン）以上にはない。かく
して、活性部位はプラスミドｌ）ＪＭ２３のｃｔｘＡ欠
失内に存在する。アミノ酸４１〜１０１間（または、よ
り好ましくは、毒素産生性の完全な不存在を保証づるた
めに、アミノ１Ｉｕｌｏ〜１６／１の間）のアミノ酸の
欠失がＡｄｉｔ素産生性のないことを保証する。

プラスミドｐＪ　Ｍ　２３が、イー・コリ（「。

ｃｏｌｉ）　＃よびビブリオ・コレラの両方においてＢ
サブユニットの産生をコード付けすること、ずなわち、
ｃｔｘ　Ａにおける欠失変異がｃｔｘ　Ｂの表現にほと
んど影響を及ぼさないことが証明された。つぎの第１表
の結果は１８ＨｒＣＹＥ培養における総Ｂサブユニット
産生を酵素結合免疫吸着剤検定法により分析して得られ
たものである。Ｂサブユニットの０．００５μｇ／戴以
下ｔよ検知できなかった。ＮＤは寅験が禁止されている
ために測定しなかったことを意味する。

（以下余白） 第１表 相模体プラスミドによるＢサブユニツ１−のｉ−！ｔ５
１Ｘｍ、染色イホの組換え 第１図に示ずように、２つのプラスミドｐＪｔｖ１２３
．２およびｐＪＭ２３．２１１がＩ）Ｊ　Ｍ　２３から
作られる。ついで、これらのプラスミドのフラグメント
を、第２図に示し、以下に説明する標識交換において使
用づるために、もう１つ別のプラスミド（ＲＫ２９０）
　［Ｒｕｎｋｅｎ　ｅｔ　ａｌ、。

（１９８１）　Ｎａｔｕｒｅ　（１−ｏｎｄｏｎ　）　
、　２８９　：８５−８８］ヘクローンする。

Ａ、プラスミド　ｐＪ　Ｍ　２３からの０３９５−Ｎ１
株 第１図に示づように、ｎＪＭ２３を、ＰｓｔＩＪ＞よひ
Ｔ４ポリメラーゼで消化し、ついで、ＥＣＯＲ■ＣＯＲ
−の存在下で結紮してＨＱ体プラスミド１）ＪＭ２３．
２に変える。ｐＪｆｖ１２３．２はｐＪＭ　２３と同じ
であるか、ＰｓｔＴυイトがＥｃｏＲＩ（）゛イ１〜と
置換している。ＤＪ　Ｍ　２３．２から当初ρＪ　Ｍ　
２３上に存在するｃｔｘ△−ｃｔ、ｘＢ欠失の接合点付
近に挿入されノζカナマイシン耐性をツー１−イ＜Ｊ’
　＋−ｊη゛るＤＮＡフングメンＩ−（Ｋｍ　Ｒ）でプ
ラスミドＬＩＪＭ２３．２１１を作る。

これは、ＸｂａＩ／Ｈｉｎｃ　ｎサイ１へが側面に位ｉ
ｊ′ｊするに１１１Ｒを担持Ｊ′るプラスミドＩ）ＪＩ
ＶＩ２２のＸｂａＩ生成物の存在下、ＸｂａＪで＋＋Ｊ
Ｍ２３．２を消化することにより行なわれる。１Ｆ？ら
れたノ″ラスミドＩ］ＪＭ２３．’２１をＨ目Ｉｃ　ｆ
ｌて消化し、結紮してＩ］ＪＭ２３．２１１を作る。こ
れ（、Ｌ、）′ミノ酸１０から開始し、ｃｔｘ　［３を
通って王の１ｌｉｎｃ１■ザイ１〜まで延長づるｃｔｘ
　Ａ欠失をイｊ３する。

Ｋ　ｍ　１１頂伝子は両方のそれらに固有のｃｔｘ△）
可仏子が、＋＋Ｊｆｖ１２３．２１１の担持りる欠失変
異で置換された０３９５組換体を得る！こめの選択標識
を与える。

ついで、Ｉ７ｉ識交換操作を用い、つさ゛のようにして
染色体へ組換えを行なう。まず、ストレゾ１−マイシン
１００μ ０３９５株を平板１ｇ養して約１０１０個の細胞を得る
ことにより、０３９５株の自然ス１ヘレブ１ーンイシン
削性（Ｓｍ”）誘導体を作る。この誘々（本を後の全て
の実験に用いる。プラスミドＲ　Ｋ　２　０１　３　［
Ｒｕｖｋｉｎ　ｅｔ　ａｌ．、（　１　９８　１　）　
Ｎａｔｕｒｅ＜Ｌｏｎｄｏｎ　）、２８９：８５−８８
］を移動剤（ｍｏｂｉｌｉｚｅｒ　）として用いる接合
により、プラスミドｌｌＪＭ２９０．２ゴ１　ヲ０　３
　９　ｂ　Ｓ　ｍ　ｎへに’Ｊ入さゼる。＋）ＪＭ２９
０．２　１　１を担持づ゛る０３９　５　Ｓ　ｍ　”細
胞はＳｌｌｌＲＴ０１１Ｋｍｌ＋である。これらを、Ｇ
１１ｌＲであるもう１つ別のプスミドＩ）ｌ−１１す １１［ｐｌ−１１１ペー＃−リンガ−ら（　Ｂ　ｅｒ　
ｌ　１１１ｇ０ｒへ ｅｔ　ａｌ．、（　１　９　７８）Ｎａｔｕｒｅ　２　
７６　：　６３３−６３４）が報告しているｌ］Ｈ１Ｉ
Ｊ１と同じであるコて重感染ざｌ！，　Ｇｍ　ＲＫｍ　
”コロニーを選択する。ｔｌ＋−１　１　１　Ｊ５よび
ｐＪｆｖ１２９０．２　１　１は不適合障壁のために、
同し細胞内で安定に共存覆ることができない。したがっ
て、細胞にに■ＩＲを残存ざυるには、この耐性をコー
ドイ４けするＤＮＡを０３９５染色体上に組換えな（プ
ればならない。

第２　１盟ＡはＣｔＸ逍伝子の染色体コピーと、プラス
ミド　ｐＪＭ２９０．２１　１に担持される欠失誘導イ
ホの間の交差結果を示づ一０ｊ弱当なな１換体を不適Ｋ
ｎＩＲの選択により回１１ゾする。かかる組換体、０　
３　９　５　−　Ｎ　Ｔの構造を示−！Ｉ　ｏ　Ｋ　ｍ
　’ｌ　／）Ｎ柊＜＋　（−）３９５染色体上のサイト
４．ＬＫ　ｍ　”フラグメンｌ−　／ＪＩ側面に位置す
るＤＮＡ配列によって決定される。この配列は、該染色
体上のみ索遺伝子が側面に１１７　ｉＱｉブるＤＮＡか
ら誘導されるので、第２０Δに承り結果となり、固有の
遺伝子がｌ（ｍＲイン１ノー１−を担持する変異株遺伝
子によって置換される。ｃ　ｔ　ＸＡおよびｃｔｘ　Ｂ
遺伝子サイ１へを囲み、野〈１ニ型染色体ＤＮＡ配列に
対応刃るｐＪＭ２３．２１　１　＋のＤＮＡの大ぎさは
、ｐＪＭ２３．２１上の△范１云子フラグメン１〜中の
ＥＣ０ＲＩリ−イ１〜どＸｌ＋ａＪリイ１〜の間の距離
（２．７キロベース）およびＢ　’＋’Ｊ　（入子中の
ｉｆ　ｉｎｃ　ＩＩザイ１〜どＴ　Ｃ　”　遺伝子にｌ
：＾接りるＥＣ０ＲＩザイ１〜の間の距１ｉｉｆｌ（１
．／Ｉキロベース）で表わＪことができる。かくして、
該欠失変異か染色体上に組換えられ、ｃｔｘｉＥ）伝了
Ｐｉモの１つの１１常なコピーと置換する。

０３９５は該１−ギシン遺伝子座２つの」ビーを右して
いるので、該２９０．２１１欠失変異をこれらの両方と
組換える必要がある。驚くべきことに、１つの標識交換
コピーを担持する株を数世代増殖さゼ、この間に組換え
により、該変異をもう一万のコピーへ自然に伝）ヱさせ
ることにより、これが面単に行なえる。ついで、両方の
コピーに欠失変異を有する０３９５誘導体を、該欠失変
異にお【プる１ＤＮＡ不存在と特異的に雑種形成をづる
プローブ゛（ｌｌｖ１１７の０．９５Ｋｂ　ＸｂａＩ／
Ｈｉｎｃｌ［フラグメン１〜）を用いるコ［コニ−雑種
形成にＪ、り確認ηる。このプローブと反応しないコロ
ニーをザザン（Ｓｏｕ目１ａｒｒ＋　）雑種形成てヂｌ
ツクし、欠失により除去された配列の欠損を確Ｒ”ｌ−
る。ハン１〜の移入に−こり、Ａｎ仏子の所望の人きざ
の欠失か０３９５の２つの固イｊの員ｘ蓮伝子コピーの
各々に導入され、０３９５−ＭＴ株か１ｑられたことが
確認される。

ｃｔｘΔ−ｃｔｘ　Ｂ欠失から予想されるとｄ３す、こ
れら両方の遍伝子部分かｐＪＭ２９０．２１１上で欠失
されたので、０３９５−Ｎ　Ｔ株はΔリブユニッｌ−も
Ｂザブユニツ１〜も産生じない。つぎの第２表の結果は
１８８ｒＣＹＥ１８ｍで産生され、酵素結合免疫吸着剤
検定により分析された槍１３リノユニット抗原を示す。

０．００５μｇ／πβ以−トの（３サブ１ニツトは検出
できなかった。＜＝＋−１シシ活性は１ＩＩＪ／′か精
製コレラ・１−キシン−（表わし１こ。

同様に、Ｂザブユニツ１−につい−（、同しＩａ　Ｍ上
沼液を分析した。毒性の検定はプランｌ〜ら［Ｇｕｅｒ
ｒａｎｔ　ｅｔ　ａｔ、、（１９７４）　Ｉ　＋＋ｆ（
！ｃｔ、　Ｉ　ｍｍ１，１止：３２０−３２７１の記載
に従−）でＣＩＩ　Ｏ−細胞分析によって行なった。

（以下余白） 第２表 上ゾリＡ・コレラ誘導体ににっ−Ｃ産牛された［３ザブ
ユニツトｔＨよひトキシン活性 ８．０３９５−Ｎ１株 １）Ｊ　Ｍ　２３．２上に存在する４１４造を修ｆ’＋
１ｉ標識交換操作により染色体へ交差さける。ｌ）Ｊ　
Ｍ　２３　。

２からの４，６キロベース対ラグメントをＲＫ　２９０
へ移入させてプラスミドＩ）ＪＩＶ１２９０．２を形成
する。ついで、プラスミドｌ＋ＪＭ２９０．２を、Ｋ　
（Ｈｎで標識付すしたその２つのｃｔｘコピーの各々を
有する０３９５−ＮＴ株へ移入さける。

ｃｍ　（７）　１１、へのｐＪｌｖ１２９０．２の導入
は交差を７１じさせ、ついで、Ｋ　Ｂ　Ｉｔ標識コピー
のｌｉ　Ｊ　ｆｖｌ　２９０２上の構造による置換を生
じさける。これぼろの引換体コロニーはそのＫｍに対Ｊ
る完成によっで１ｌｉｒ認できる。

さらに詳しくは、第２図Ｂに示りごどく、０３９５−Ｎ
Ｔ株をｐＨ１１で処理し、つい（、該４′Ａ、にｐＪＭ
２９０．２を移入覆る。約５０　ｌｌ！代増催１さぜた
後、平板反復法により、自然Ｋ１１ｌ”組換体を単離す
る。これらの１つを１ｌＪｆｖ１２９０．２’ｃ処理し
たものが第２図Ｂに示す構１４を右４るｂの（０３９５
−Ｎ１）である。これらの１つの横ｊ６を確認し、０３
９５−Ｎ１株を得るために、サザン雑秤形成をつぎのと
おり行なった。

ＤＮＡを０３９５および０３９５−Ｎ１株から調製する
。このＤＮＡを）（ｂａＩで消化し、Ａ１プローブ［Ｅ
ＷＤ２９９　（Ｄａｌｌａｓ、（１９７９）。

Ｊ、Ｂａｃｔ、１３９　：　８５０−８５８＞の５８０
塩基対Ｘ　ｂａＩ　−Ｈｉｎｄ　Ｉｆｆフラグメント］
またはＢプローブ（ＥＷＤ２９９の５９０塩基対［ｃｏ
ＲＩ−１−１ｉｎｄ　■〜フラグメント）を用い、ザザ
ンの方法［Ｓ　ｏ　ｕＬＩ＋ｅｒｎ　、　（１９７５ン
　、Ｊ　、Ｍｏ１ｅｃ　。

Ｂｉｏｌ、、　９８　：　５０３−５１７］で分析する
。０３９５の２つの員×座は２つのバンドとして見え、
両方のプローブと反応する。しかし、０３９５−Ｎ１株
はＢプローブとのみ反応し、反応するバンドはｌ）Ｊ　
Ｍ　２３上にはじめに存在したｃｔｘ　Ａ欠失により、
大ぎさがＪ：り小さくなる。第３図はかかるザザン雑種
形成にお（プるブロワ１〜の図面代用写真で、０３９５
−Ｎ１はＡ１部位から由来するプローブと相同の配列を
欠き、プラスミド−ｐＪＭ２３の　ｃｔＸＡ＋欠失の大
きさく４５０塩基対）によってより小さくなった制限フ
ラクション上に位置するＢザブユニットについての配列
を保持しＣいることを示している。この結果と一致しＣ
１０３９５親株と比較した場合、０３９５〜Ｎ　１４２
、はＢサブユニットの正常なｍを産生づるが、Ｃ１−１
０１１Ａ胞中で何らｍ性を示さない（前記り１２表〉。

かくして、０３９５−１〜１株は、はじめに　１八」Ｍ
２Ｓ上に存在したｃｔｘ　Ａ欠失を除い゛Ｃ１親株で市
）る０３９５株と同じである。

得られた菌株およびプラスミドはつぎの寄託ｍ号でアメ
リカン・タイプ・カルテ１ｒ−・コレクション＜ＡＴＣ
Ｃ）に寄託され“Ｃいる。

０３９５−　Ｎ　１株　Ａ　１−　ＣＣ３９：１４Ｇ０
３９５−Ｎ　Ｔ株　ＡＴＣＣ３≦）３４７ブラスミドＩ
）ＪＭ　２９０．２　△−ｒ　ＣＣ３９３４８プラスミ
ドＩＩＪＭ　２９０．２１１　ＡＴＣＣ３≦１３４！１
かかるＡＴＣＣ寄託ザ寄託シンブルの公告により、また
、本願に対応する米国特許の発（ｊ、ヨーロッパ特許の
公告により、あるいは、本願ｌご灼応する特許出願をな
したいずれもの国の法ｔｌｉｌ＋に（１１つて自由に一
人手することができる。

ＩＶ　、使用 ０３９５−Ｎ１株おにび０３９５−Ｎ２株共にコレラ感
染に対する免疫学、的防護源として有用である。これら
は生ワクチンおよび死菌ワクチンの両方に有用である。

０３９５−Ｎ１株は膓管内テ、Ｊ：　＜−１０ニー化し
、強い免疫反応を誘発することが知られている公知の株
から産生される。この変異株は毒素産生性Ａ＋　トキシ
ン・サブユニットの表現を防ぐ欠失疫異を有する場合に
のみ、遺伝的に改造されることが証明された。この株は
、とりわけ、ホルムら［１−１ｏｌｍｅ　ｅｔ　ａｌ、
、　”　Ａ　ｃｕｔｅ　Ｅ　ｎｔｅ四Ｃ１ｎｆｅｃｔｉ
ｏｎｓ　ｉｎ　Ｃｈｉｌｄｒｅｎ、Ｎｅｗ　ｐｒｏｓｐ
ｅｃｔｓｆｏｒ　Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ　ａｎｄ　Ｐｒｅ
ｖｅｎｔｉｏｎ、”（１９８１）Ｅｌｓｅｖｉｅｒ／Ｎ
ｏｒｔｂ−Ｈｏｌｌａｎｄ　ＢｉｏｍｅｄｉｃａｌＰｒ
ｅｓｓ、　Ｃｂ、２６．１）１１．４４３　ｅｔ　ｓｅ
ｑ。

（Ｌ　ｅｖｉｎｅ　ｅｔ　ａｌ　、　）コの記載の容量
および条件で製造および投与されるワクチンとして有用
であ毒素産生性ビブリオ・コレラ・Ａ万ワ３９５に感染
した各人が有為な量の熱傷の細胞をＩＪＩ　；＋Ｉ！ｔ
ノ＜ｔいという事実は抗トキシン防護に加えて、細胞標
的免疫防護が含まれることを示している。０３９５−Ｎ
Ｔ＄ｌｌｉは、該トキシンのＢサブユニット産牛のため
の遺伝情報を欠いているが、該Ａガラ３３９５株の他の
免疫原的特徴を有しており、前記のにうに製造、投与さ
れるワクチンどしく＋４用Ｃｉｌ＋＋る。

本明細書に記載したプラスミドおよび方法（ま０３９５
−　Ｎ−ｒおよび０３９５−Ｎ１株の製造（、：有用で
あり、また、ある種の他の抗原と共に１３リブユニツ１
〜を表現する株を製造するのに用いることらできる。か
かる株は、ついで、抗原を該Ｉ３リブユニットに付着さ
ｕ、１なわち、該Ｂ　４）′７７　、：＋ニットを細胞
認識およびイ」着ビヒクルとじで用いることにより実現
される改良された免疫卯性を利用するワクチンに使用で
きる。

【図面の簡単な説明】

第１図はビブリオ・コレラの染色体に組ＩＬ＃えるべき
プラスミドを作る工程を示覆工程図、第２図のＡおよび
Ｂは第１図で得られたプラスミドのピブリＡ・コレラ染
色体上への組換工程を示す工程図、第３図はサザン・プ
ロット分析結果を示す図面に代る写真である。 特許出願人　プレジデント・アンド・フエローズ・オブ
・バーバード・ノコレッジ・′ 代　理　人　弁理士　青白　葆　ばか２名Ｆｉｇ、３ 昭和５９年７月３日 特許庁長官　殿 ■事件の表示 昭和５９年特許願第　０８７６　］、　９　号２、発明
の名称 非毒素産生性ビブリオ・コレラ変異株 ３補正をする者 事件との関係　特許出願人 ４、代理人 手続補正書口式） 特許庁長官　殿 １事件の表示 昭和５９年特許願第　０８７６１９　号２発明の名称 非毒素産生性ビブリオ・コレラ変異株 ３補正をする者 事件との関係　特許出願人 ４、代理人 住所　大阪府大阪市東区本町２−１．０　本町ビル内氏
名　弁理士（６２］、４．）青　山　葆　はか　２名７
、補正の自答 （１）明細書第３１頁３〜４イ）°、「第３図は・・・
（中１略〕・・・写真である。」とあるを、「第３図は
Ｎ１株および０３９５親株のザザン・プロット分析にお
けるプロット・パターンの図面に代る写真である。」と
補正する。 以」−

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）Ａ＋ペプチド・コード付は遺伝子（ｃｔｘＡ＋）
   の両方のコピーに欠失変異を有し、その結果、毒性Ａ１
   ペプチドの表現に必要な遺伝子配列を欠いている、ビブ
   リオ・コレラ（Ｖ　１ｂｒｉ。 ｃｈｏｌｅｒａｅ）・オガワ３９５の非毒素産生性の遺
   伝的に安定な株。 （２）ＣｔＸＡ＋遺伝子の各コピーが少４【りとも、ア
   ミノ酸残基４１〜１０１をコード付けする遺伝子配列部
   分を欠いている前記第（１）項の株。 （３）ｃｔｘＡ１遍仏子の各コピーが、少なくとも、ア
   ミノ酸残基１０〜１６４をコード付【プする遺伝子配列
   部分を欠いている前記第（１）項の株。 （４）　ｃｔｘ　Ａ＋　’Ａ伝子の各コピーがＡ１ペプ
   チドの表現に必要な配列の少なくとも８０％を欠く前記
   第（１）項の株。 （５）　ｃｔｘ　Ｂ１１１伝子配列が無傷である前記第
   （１）項の株。 （６）該野生型遺伝的配列が、該欠失変異を除いて他は
   無傷である前記第（１）項の株。 （７）該欠失変異が、有効Ｂサブユニツ１−の表現に必
   要な、Ｂサブユニット・コード４４１１３ｍ仏子（ｃｔ
   ｘＢ）の一部を包含する前記第（１）項の株。 （８）ＡＴＣＣＮｏ、３９３４６　ま　／ｊ　は　ＡＴ
   ＣＣＮ０．３９３４７の特性を有する細胞系。 （９）染色体上にｃｔｘＡ＋３ｉ伝子の少なくとも２つ
   のコピーを有する、腸管内でコロニー化し、免疫原作で
   あることが公知のごブリΔ・二」レラ（Ｖ　１ｂｒｉｏ
   　ｃｂｏｌｅｒａｅ）の野生型株を用怠し、涛ＭＡ＋ペ
   プチドの表現に必要な、該株のＤＮＡ配列の　ｃｔｘＡ
   １伝子の１つのコピー上に欠失変異を生じさせ、得られ
   た改造ビブリＡ・コレラを数１１１代増殖させて、該改
   造を該染色体のｃｌｘＡ迫伝子の第２のコピーに自然に
   伝達させることを’４４ｒ　徴とづる毒性Ａ１ペプチド
   の表現りることのできない、ビブリオ・コレラの遺伝的
   に安定な形の製法。 （１０）該欠失工程が、ビブリＡ・コレラの野生型性か
   らＤＮＡを用意し、該株からｃｔｘ　ＡおよびｃｔｘＢ
   遺伝子と、該株のこれらの遺伝子を両側を囲むＤ　Ｎ　
   Ａ　ｔグメントを含有り゛る第１のプラスミドを単離し
   、該第１のプラスミドから、少なくとも、毒性△１ペプ
   チドの表現に必要なｃｔｘＡｉＭ伝子のセグメントが欠
   失するように改造された第２の１ラスミドを製造し、該
   両側を囲むｌ）　Ｎ　Ａセラメン１〜を含む第２のプラ
   スミドのレグメン１−を、腸管内でコロニー１ヒし、免
   役原性であることの公知のビブリオ・コレラ株の染色体
   への組換え、該染色体上のｃｔｘＡｉＭ仏子の１つのコ
   ピーを置換づることからなるｎｕ記第（９）項の製法。 （１１）該第２のプラスミドが該絹換工程確認のための
   ｍ識を含む前記第（１０）項の製法。 （１２）該第２のプラスミドとのＭＪ換えに用いる株か
   オカツ３９５である前記第（１０）項の製法。 （１３）該ｃｔｘ△遺伝子から欠失されるレグメン１−
   か、少なくとも、アミノ酸残塁４１〜１０１をコード付
   けする該遺伝子配列部分からなる前記第（１０）項の製
   法。 （１４）該ＣｔｘＡ３ｉ伝子から欠失されるレグメント
   が、少なくとも、アミノ酸残基１０・〜１　ｆｉ　／’
   Ｉをコード付けする該遺伝子配列部分からなる前記第（
   １０）項の製法。 （１５）該ｃｔｘ△遺伝子から欠失されるレグメシトが
   Ａ１ペプチドの表現に必要な配列の少１．Ｋ　＜ども８
   ０％からなる前記第（１０）項の製法。 く］Ｇ６ビブリオ−ｍｌ］レラ（ｙ　！　ｌ）　ｒｔ　
   ＯＣＩＩ　＋ｌ　ｌ　Ｄ　ｌ”　ｉｌ　Ｑ　＞株のｃｔ
   ｘ△−ＣｔＸ　ｌ’３遺伝子を囲む染色体レグメン１〜
   に対応するＤ　Ｎ　Ａ　レグメン１〜から４「す、少４
   １りとも、１毒性Ａ１ペプチドを表現するのに必％　／
   、’Ｋｃｔｘ八遺伝子へグメン１〜を欠いているシラス
   ミド。 （１７）ＡＴＣＣＮｏ、３９３４８Ｊ５よひへ丁ＣＧ　
   Ｎｏ、３９３４９からなるＢＹから選ばれるノ゛ンスミ
   ドの特１！Ｉを有する前記第（１６）項のプラスミド。