PT79894B - Process for preparing tumor specific monoclonal antibodies - Google Patents

Description

Descrição de Trabalhos Anteriores

As tentativas anteriores para obtenção de anticorpos monoclonais específicos de cancros humanos seguiram duas vias em relação âs células B.

1) Foram extraídas células Ba partir de baços de ratinhos imunizados contra tumores humanos, Patente U.S. 4.172 124; e

2) foram extraídas células B humanas quer do sangue periférico quer dos modulos linfáticos a jusante de tumores em pacientes com cancro. Nenhuma das abordagens deu resultados satisfatórios.

Ratinhos imunizados contra tumores humanos posseum também uma larga reactividade. Ou seja, grande parte dos anticorpos monoclonais de ratinho produzidos reagem com antigênios humanos presentes tanto em tecido normal como em tecido de tumores·. Um anticorpo que reaja apenas com células de tumor é muito dificil de selec cionar entre a grande variedade de anticorpos produzidos. Por exemplo, 20.000 hibridomas derivados de ratinhos imunizados com carcinoma das pequenas células de pulmão humanas foram testados quanto â reactividade com células turno rais (Science, 1982, 216:283). Ao contrário da frequência muito baixa ( 0,4%) observada por este grupo de investigação, o presente invento resulta até 16% de hibridomas derivados de colon de pacientes imunizados produtores de anticorpos que reagem especificamente com células tumorais Em adição, anticorpos monoclonais derivados de células B de ratinho têm um limitado potencial para aplicação em terapia de cancro. Após administração repetida eles tendem a estimular o sistema imunitário humano para produzir anticorpos "anti-ratinho" os quais, em ensaios clínicos, se verificar neutralizarem a actividade dos anticorpos monoclonais de ratinho. A utilização de anticorpos monoclonais humanos pode ultrapassar estas dificuldades.

Uma outra diferença aparente entre os anticorpos monoclonais humanos e de ratinho respeita aos seus padrões de marcação. Estudos anteriores com anti corpos de ratinho demonstraram que há por vezes uma marcação heterogénea das células em secções de tumores. Este padrão de reactividade foi atribuído por alguns autores a heterogeneidade antigénica das células tumorais (Hand

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et al., Câncer Research, 43: 728-735, 1983). Ao contrário, os anticorpos monoclonais humanos obtidos segundo a nossa estratégia mostraram-se homogéneos no que respeita à sua reactividade para tumores com os quais reagem. Uma explicação plausível para a coloração dos anticorpos monoclonais de ratinho ê que seja um reflexo do reconhecimento imune murino de antigénios de diferenciação específicos de fase ou ciclo celular abundantes nas células tumorais, em vez de antigénios putativos associados ao tumor. E razoável esperar que quando se imuniza ratinhos com células tumorais humanas, haja uma grande competição antigénica resultando numa competição com êxito dos antigénios do tipo de tecido e de diferenciação mais abundantes e mais predominantes com os antigénios associados a tumores presentes em menor quantidade para a resposta imunitária do hospedeiro. Assim, a imunização autóloga do homem pode resultar numa indução de anticorpos contra o grupo de antigénios normalmente pouco imunogénicos em ratinhos. Esta evidência sugere que os seres humanos e ratinhos podem responder a diferentes antigénios tumorais. Concordante com esta hipótese ê o facto de termos verificado que nenhum dos 36 anticorpos monoclonais humanos que produzimos parecer reagir com o antigénio carcino-embrionico (CEA), um antigénio frequentemente reconhecido pelos anticorpos monoclonais murinos feitos contra células humanas de tumor.

A maioria das tentativas feitas para produzir anticorpos monoclonais humanos fizeram uso de células B extraídas quer do sangue periférico quer dos módulos linfáticos de pacientes possuidores de tumores. Pensou-se que a presença de tumor antigénio causaria uma resposta imune num indivíduo possuindo de tumor contra o seu próprio tumor e produzir células B especificamente imunes. Assim, colheram-se células B de nódulos linfáticos a jusante de tumores em pacientes com cancro ou de linfócitos circulantes encontrados no sangue periférico. No entanto, antes

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do presente invento, houve um sucesso relativamente limitado na criação de anticorpos monoclonais específicos de tumores.

0 principal problema na obtenção de anticorpos monoclonais específicos para antigênios de tumores humanos foi a incapacidade para encontrar uma fonte de células B especificamente imunes. (Science, 1982. , 216, 285). Nos seres humanos os focos iniciais de células cancerosas tendem a crescer ao longo de grandes períodos de tempo, desde 1% a 10% da vida de um ser humano, antes de haver qualquer evidência clinica palpável da doença. Por esta altura os pacientes são imunológicamente hipo-respondentes aos seus tumores, ou possivelmente imunológicamente tolerantes. Assim, antes do presente invento não se conseguiu obter com reproducibi1 idade anticorpos monoclonais humanos reactivos com células tumorais. Ainda, do pequeno número de anticorpos monoclonais humanos obtidos de pacientes com cancro, muito poucos reagiram com determinantes encontrados na superfície de células tumorais, mas antes com determinantes intracelulares (R.J.

Cote et al., PNAS, 1983) 80:2026). 0 presente invento permite a produção de anticorpos monoclonais reactivos com antigênios de superfície; uma actividade necessária à obtenção de imagens de tumores e terapia dos mesmos.

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-10Sumârio do Invento

Um objectivo do presente invento foi a criação de anti-corpos monoclonais reactivos com antigênios específicos de tumor que induzem uma resposta imune em pacientes tendo cancros particulares. Um teste in vivo válido para a imunogenicidade dos antigênios específicos de tumor em pacientes imunizados com tumor é por hipersensibilidade cutânea retardada. Tais anticorpos constituem um meio de detecção e diagnóstico de tumores. Um segundo objectivo deste invento era obter anticorpos monoclonais que fossem eficazes no tratamento de pacientes com tipos de cancro particulares.

Desenvolvemos uma abordagem nova e mais eficaz para a obtenção de anticorpos monoclonais usa£ do as células B do sangue periférico de pacientes imunizados com células dos seus próprios tumores. Esta abordagem foi escolhida com base na nossa teoria de que as células tumorais expressam antigênios específicos de tumor.

Estudos em modelos animais apoiam ó conceito de que os antigênios não encontrados em tecidos normais de adultos são ferquentemente encontrados em tumores e de que a imunogenicidade destas células tumorais pode ser expressa e mesmo aumentada, quer em hospedeiros normais quer em hospedeiros com tumores. Estes resultados experimentais validaram a hipótese racional de imunoterapia especifica activa na neoplasia humana.

Os seres humanos com uma resposta imunitária objectiva contra células tumorais verificou-se especificamente serem uma boa fonte de células B activadas. 0 sangue periférico de pacientes que tenham sido activamente imunizados contra os seus próprios tumores verificou-se em ensaios clínicos serem uma fonte abundante de tais células B activadas.

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Demonstrou-se em estudos clínicos que um a resposta imuneobjectiva ê originada pelo tratamento de pacientes tendo um cancro particular por testagem da pele, i.e., hipersensibi1 idade cutânea retardada (DCH).

Os pacientes imunizados mostraram hipersensibi1 idade cutânea retardada para os seus próprios cancros colo-rectais. Em adição os anticorpos monoclonais obtidos a partir de células B de pacientes imunizadas reagem com tumores do mesmo tipo histológico em outros pacientes. Estes resultados indicam que a resposta imune humoral do paciente, produção de anticorpos, é dirigida contra cancro colo-rectal em geral e não é única para o tumor do próprio paciente imunizado. Esta resposta geral é especialmente importante para o desenvolvimento de uma vacina estandardizada.

0 tratamento também provou ser altamente benéfico.Quarenta e dois meses após a imunização dos primeiros pacientes houve um melhoramento objectivo e significativo dos pacientes em relação â duração do periodo sem doença após cirurgia e os resultados de sobrevivência são encorajadores. Apenas 3 de 20 pacientes tratados teve recidivas e nenhum morreu. Em comparação 9 de 20 pacientes num grupo testemunha tiveram recidivas e quatro morreram.

A obtenção, de células B que produzam

anticorpos tendo reactividade especifica para antigénios de células tumorais, particularmente antigénios de superfície celular como é na maioria dos casos, é um resultado vantajoso que era especulativo, na melhor das hipóteses, quando os estudos de imunização começaram. Apenas o tratamento de imunização foi observado e medido durante os estudos animais em que os processos de imunização de seres humanos foram baseados, não a produção de anticorpos específicos de tumor.

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imune geral acompanhada paciente era indicativo s macrófagos e células T

antioênios de células

A resposta

de um melhoramento do estado do de uma resposta celular em que o ficaram activadas na presença de

tumorais destruindo as células tumorais. Apesar de ser previsível uma resposta por anticorpos desencadeada por imunização na parte maior das circunstâncias, o tempo de aparecimento da resposta por anticorpos e da resposta celu lar seria diferente na maior parte dos casos. Ainda, o facto de os pacientes terem sido imunizados com células tu morais autólogas e experiência de outros ingredientes de que pouca ou nenhuma produção de anticorpos é induzida por um tumor do proprio paciente fazem com que a nossa descoberta de que as células B que produzem anticorpos específicos de tumor são geradas após imunização seja um resultado benéfico inesperado.

Algumas respostas imunes celular e humoral podem ocorrer independentemente uma da outra.

Por exemplo, ê possível provocar uma resposta humoral na ausência de imunidade celular demonstrável. Por outro lado, pode surgir uma imunidade celular potente, particularmente hipersensibi1 idade cutânea retardada (DCH) apesar de uma resposta mínima por anticorpos. Foi surpreendentemente portanto que no caso dos indivíduos que apresenta, ram uma resposta positiva â imunoterapia activa constituírem excelentes fontes de células B produtoras de anticorpos específicos de tumor, particularmente anticorpos da superfície celular.

Um terceiro objectivo deste invento foi preparar uma vacina estandardizada a ser usada na detecção e tratamento de cancros específicos na população em geral que não necessitam da preparação habitual de um novo imunogênio adequado a cada paciente individual. Sem uma vacina estandardizada, apenas uma vacina preparada para cada paciente individual a partir do seu próprio

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tecido tumoral poderia ser usada em terapia e apenas cancros conhecidos poderiam ser tratados numa escala limitada em grandes instituições. Não seria possível fazer preparações individuais para o tratamento de aproximadamente 139 000 casos de cancro colo-rectal que são descobertos todos os anos nos Estados Unidos.

Este invento compreende a preparaçao de vacinas com êxito na imunização especificas activa, processos para a extracção de células B imunizadas, produção de células produtoras de anticorpo monoclonais e produção de anticorpos monoclonais. Os tumores malignos são digeridos usando preparações de enzimas. As células obtidas são tratadas de modo a obter-se uma preparação de células tumorais não tumorigêricas tendo a viabilidade celular necessária as quais são injectadas como uma vacina no indivíduo a partir do qual foi obtido o tumor. As células B do sangue periférico são obtidas do indivíduo inoculado após um intervalo pré-determinado e são usadas para preparar células produtoras de anticorpos monoclonais por fusão com células de mieloma, após o que as células obtidas pela fusão são testadas para a sintese de imunoglobulina.

As células que sintetizam imunoglobulina são testadas para a produção de anticorpos que reajam com antigênios caracteristicos do tecido maligno. As seleccionados são cultivadas para produção de anticorpo monoclonais que reajam com o tipo de tumor particular e do qual sofre o doente.

cidas em cultura investigação que como os problemas

foram

levou

com

Células de mieloma de ratinho cresusadas para preparar hibridomas na a este invento. No entanto,

a criação de linhas celulares de mie

CA

14loma humano fáceis de crescer que não produzam os seus pró prios anticorpos estão resolvidos, são preferidos os mielomas humanos para a preparação dos hibridomas deste invento.

Descrição Detalhada do Invento

Os aspectos chave deste invento são:

1) Critérios para vacinas eficazes para imunização especifica activa:

Células tumorais: , células totais enzimâticamente dissocia das do tecido, preservadas por congelação e irradiadas com raios X para a não tumorigenicidade.

Adjuvante , um imunomodulador que é capaz de induzir imunógenicidade â preparação de células tumorais:

Componentes e administração, incluindo proporção de adjuvante para células tumorais, doses óptimas de células tumorais e regime de vacinação.

Paciente, nódulos linfáticos regionais a jusante do local de vacinação devem estar presentes durante os primeiros 21 dias após a vacinação.

2) Processos e tempos para a extracção de células B imunizadas dos pacientes.

3) Processos para a produção de hibridomas e limfócitos transformados e produção de anticorpos monoclonais.

Digerimos com sucesso tumores humanos sólidos malignos várias preparações enzimáticas. As dissociações dos tumores foram avaliados relativamente â obtenção de células tumorais por grama de tecido, tipos

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celulares recuperados, viabilidade celular, tamanho das células e esterilidade.

Os critérios para vacinas satisfatórias para terapia especifica activa estão apresentados na Tabela 1.

0 tecido tumoral foi obtido de pacientes sofrendo do cancro sólido particular para o qual os anticorpos monoclonais são preparados. 0 tecido tumoral foi removido cirúrgicamente do paciente, separado de qualquer tecido não tumoral e cortado em pequenos pedaços. Verificamos ser satisfatórios cortar o tecido tumoral em fragmentos de 2-3 mm de diâmetro. Os fragmentos de tumor foram então digeridos para dar células tumorais individuais por incubação numa solução de enzimas.

Apôs digestão, as células livres foram reunidas e contadas e calculada a viabilidade celular. 0 teste de exclusão pelo azul tripano mostrou ser uma medida aceitável da viabilidade celular. As células de tumor foram então preservadas por congelação e guardadas em azoto liquido.

A vacina foi preparada por injecção por descongelação rápida das células congeladas, diluição das mesmas e lavagem com HBSS, ressuspensão, contagem e cálculo da viabilidade.

As células de tumor viáveis foram irradiadas para as tornar não tumorigénicas. Encontrámos que a irradiação com 4020 rads/min num total de 20 000 rads resultava em células viáveis mas não tumorigénicas.

0 volume da suspensão celular em HBSS foi ajustado de modo a ficarem no tubo 10? células viáveis. As células foram centrifugadas, o sobrenadante foi removido e 10⁷ BCG viáveis., foram adicionadas num volume de 0,1 ml. Adicio-

16nou-se solução Salina Equilibrada de Hank (HBSS) numa quantidade suficiente para um volume final de 0,2 ml. Uma terceira vacina foi prepararda de modo idêntico mas omitin do a BCG.

Imunização dos Pacientes

Os pacientes sofrendo de um cancro sólido particular para qual se produzam os anticorpos foram imunizados por inoculação intradêrmica com a vacina de células tumorais. 10⁷ células tumorais viáveis misturadas com BCG foram usadas para as primeiras duas vacinaçõs e 10⁷ células tumorais sózinhas usadas para a terceira vacinação. Espaçando cada vacinação de uma semana verificou-se ser um processo eficaz para a indução da produção de anticorpos pelos linfócitos do sangue periférico dos pacientes.

Colheita das Células B Imunizadas

Colheu-se sangue venoso dos pacientes imunizados uma semana após cada vacinação. Os linfócitos do sangue periférico (PBL) foram separados do sangue colhido para usar na produção de hibridomas.

A separação dos linfócitos a partir do sangue foi conseguida usando dois métodos diferentes.

0 primeiro compreendeu diluição com HBSS sem cálcio e sem magnésio, colocação dos linfócitos num meio de separação de linfócitos, centrifugação e remoção das células na interface. Estas células foram diluídas com HBSS e sedimentadas. Os linfócitos foram então ressuspensos em MEM de Dulbecco (DMEM)sem soro e tamponado com Hepes, contados e testados quanto â viabilidade (GIBCO Biologics, Grand Island, New York).

Um método alternativo que foi usado para recuperar linfócitos do sangue periférico (PBLs) enriquecidos em células B compreendeu a remoção dos linfócitos T pela formação de rosetas em eritrócitos de carneiro tratados com 2-aminoeti1isotio urónio brometo hidrobrometo (AET). Os eritrócitos tratados foram misturados com linfócitos do sangue periférico, sedimentados por centrifugação e o sedimento incubado em gelo. Após ressuspensão, aplicação em meio para separação de linfócitos (LSM, Litton Bionetics) e centrifugação das células em roseta, os PBLs sem células T foram colhidos na interface, lavados e sedimentados. Os PBLs enriquecidos em células B foram então fundidos para obtenção de hibridomas após contagem e determinação da viabilidade .

Preparação de Hibridomas Humanos para a Produção de Anticorpos Monoclonais Anti-Tumor.

Linfócitos do sangue periférico (PBLs) e células de mieloma em cultura foram misturados, sedimentados e ressuspensos em meio sem soro. Adicionou-se polietilenoglicol (PEG), as células foram sedimentadas e ressuspensas em meio HT (DMEM contendo 20% de soro bovino fetal, hipoxantina e timidina) e distribuídas por placas de microtitulação. Vinte e quatro horas mais tarde, adicionou-se a cada meio poço HAT(meio HT contendo aminopterina), sendo metade do meiò substituído de três em três dias. Apôs manutenção em meio HAT durante 14 dias as células foram mantidas em meio HT durante mais duas semanas, após o que as células cresceram em meio DMEM contendo 20% de soro boi no fetal.

Os hibridomas foram prê-testados para a síntese de imunoglobulina humana usando o teste imune enzimâtico estandarda. Os hibridomas que sintetizam imunoΙ⁶?^^Ο.°ξ]

[aSÊIh -18globulina humana em quantidades suficientes foram testados nos tecidos. Amostras de tecidos particulares foram incubadas com sobrenadantes de hibridomas. Os sobrenadantes de hibridomas. Os sobrenadantes que apresentaram rea£ tividade com tecidos tumorais particulares indicaram que as células de hibridoma nos poços de onde foram retirados os sobrenadantes particulares produziam anticorpos especificos de tumor. Se os mesmos sobrenadantes não apresentaram uma reacção com amostras de tecido normal após extensivos testes então os hibridomas nesse poço particular foram considerados especificos de tumor. Estes sobrenadantes especificos de tumor foram posteriormente testados contra o antigênio carcinoembrionico (CEA) para asegurar a sua especificidade restrita.

Além das células de hibridomas produtoras de anticorpos especificos de tumor, também foram preparadas por estes processos células B humanas transformadas (células diplóides) as quais produziam também anticorpos especificos de tumor. As células B transformadas foram detectadas de modo idêntico aos hibridomas produ tores de anticorpos especificos de tumor. Assim, os sobre nadantes que se revelam positivos nas reacções'com tecido de tumor e negativos nas reacções com tecido normal e com CEA contendo tanto hibridomas com células B transformadas. Os dois tipos de células foram diferenciados por observação de que as células B transformadas possuíam 46 cromossomas humanas enquanto que os hibridomas continham muito mais cromossomas nem todos eles sendo do tipo humano.

0 mecanismo pelo qual as células B ficam transformadas durante os processos acima descritos não precisamente determinado.

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Descrição Breve das Figuras

Figura 1A

Preparação de cromossomas de uma célula com características de crescimento típicas de hibridomas ( x1600). LiCO 21B27 foram incubados com colcemida (0,05 jug/ml) durante duas horas e tratadas com KC 1 hipertónico (0,075M) durante três minutos. As células foram fixadas com metanol-ácido acético (3:1), colocadas em lâminas de microscópio, secas ao ar e coradas com Giemsa., Estaõ presentes tanto cromossomas humanos como de ratinho.

Figura 1B

Fotomicrografia em fase de um aglome rado de uma linha celular productora (hilo 18-15) de anticorpos monoclonais ( χ270). Note -se a agregação e a forma irregular das células.

Figura 1C

Preparação de cromossomas com bandas postas em evidência com Gienesa da linha celular mostrada na Figura 1D (x1360). Note-se a ausência de cromossomas de ratinho. As células foram incubadas com colcemida (0,0 1 jig/ ml) durante a noite. As preparações foram preparadas como descrito atrás. A lâmina não corada permaneceu assim durante 10 dias.’ Os cromossomas foram tratados com tripsina (0,19% durante 30 segundos â temperatura ambiente), desidratados com etanol e corados com Giemsa.

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Figura 1D

Uma secção de carcinoma do colôn fixado com formalina (10%) e embebido em parafina reagiu com LiCO 16-88(4 pg/ml IgM χ 380). Observam marcações aparentemente da superfície e citoplásmicas. A secção desparafinizada foi bloqueada (20 min. â temperatura ambiente) com tampão fosfato salino (PBS) (pH 7,3) contendo L-lisina 0,75M e 1% de albumina de soro bovino e em seguida incubada com LiCO 16-88 durante a noite a 4°C. Apôs a lavagem com PBS a secção foi incubada (60 min. a 37°C) com anticorpos de cabra marcados com peroxidase e purificados por afinidade (IgG + IgA + IgM), lavada e depois posta a reagir (15 min. à temperatura ambiente) com diaminobenzidina (0,5 mg/ml) em PBS (pH 7,6) contendo 0,1% de H^. Apôs contrastação com hematoxilina a secção foi desidratada clarifidade e montada com Permount.

Figura 1E

Tumor do colôn como na Fig. 1D, reagiu com IgM de ser humano normal (4 pg/ml) ( χ380). Não se observou qualquer coloração.

Figura 1F

Secção de criostato de um tumor do colôn corada com LiCo 16-88(χ640). Note-se a marcação interna da periferia das células tumorais (setas). A secção foi seca ao ar e guardada a -3o°C. Esta secção foi pós-fi. xadas (20 min. a 4°C) com PLP em PBS e processada como descrito na figura 1D, exceptuando o ter-se usado anticorpos de cabra marcados com peroxidade especificas das cadeias μ humanas.

Figura 16

Secções de criostato de tumor do colon mostradas na Figura 1F reagiram com imunoglobulina humana normal (x640). Não se observa marcação das células tumorais.

Figura 1H

Preparação de Cytospin de células SW 1463 não fixadas secas ao ar coradas com LiCo 16-88 (4 pg/ ml) (χ280). A linha celular de tumor de colo foi removido com ácido etilenodiaminatetraacêtico (EDTA) (0,02%), lavado e ressuspensa em meio contendo 1% de albumina de soro bovina.

As células (2 χ 10⁴ em 0,1 ml) foram sedimentadas nas lâminas de vidro numa citocèntrifuga, secas ao ar e guardadas a -30°C. As células foram incubdas com anticorpos monoclonais (1hr. à temperatura ambiente e em seguida durante a noite a 4°C) lavadas e depois processadas como descrito atrás.

Figura 2

Distribuição dos antigênios em secções de parafina de tumores colo-rectais. A área sombreada indica coloração indirecta positiva com imunoperoxidase de 15 tumores por 10 anticorpos monoclonais humanos

-22Figura 3

Dois anticorpos monoclonais reagem com a maior parte dos tumores colo-rectais, São comparadas as reactividades de dois anticorpos monoclonais com secções de parafinas de 15 tumores colo-rectais e preparações de Cytospin secas ao ar de tumores dissociados de 9 pacientes. A área sombreada indica coloração indirecta positiva com imunoperoxidase.

Figura 4

Evolução de todos os pacientes testemunha e imunizados em ensaios clinicos de imunoterapia activa especifica de acordo com o local e estado patológico.

Figura 5A

Estado de todos os pacientes sem doença.

Figura 5B

Estado de todos os pacientes que

sobreviveram.

Figura 6A

Estado dos pacientes sem doença com nódulos linfáticos regionais positivos (Astler-Coller C).

Exemplo I:Preparação de Células B Sensibilizadas

A. Selecção do Paciente.

Seleccionaram-se pacientes que iriam fazer ressecção cirúrgica de cancros do colon ou rectais para ensaios ao acaso de imunoterapia especifica activa. A escolha ao acaso foi feita com estratificação de ,acordo com o estado patológico e o tumor obtido de todos os pacientes que satisfaziam os critérios clínicos. Os candidatos para o estudo eram pacientes com cancro colo-rectal sem qualquer história prévia de cancro, que não receberam até então quimioterapia ou terapia por radiação e que esta, vam na condição médica adequada para colaborar com o protocolo de tratamento de doentes externos. Os pacientes escolhidos para o ensaio foram os que possuíram tumores estendendo-se ao longo da parede intestinal (Astler-Coller 2B), com nódulos linfáticos positivos (feses CpC₂) ou pacientes com doença com metâstases (fase D). Dentro destas classificações ou pacientes foram escolhidos ao acaso para participarem em grupos de tratamento e de não tratamento. Os cartões de escolha ao acaso foram obtidos por •computador e sequenciadamente retirados de cada categoria pós-operativamente.

B. Aquisição de Tumores

Após ressecção cirúrgica a amostra de intestino foi levada imediatamente para o departamento de patologia hospitalar e aberta em condições estéreis. 0 tecido tumoral foi retirado, colocado em tubos estéreis contendo solução Salina Equilibrada de Hank (HBSS) contendo 50 jjg de gentamicina por ml e levado imediatamente em gelo para o laboratorio para processo e congelação.

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C. Dissociação de Tumores Sólidos e Mucosa do Colo

Empregou-se o processo de dissociação de tecidos de Peters et al.(Câncer Research, 39: 1353-1360, 1979) usando técnicas estéreis efectuadas num fluxo laminar. 0 tecido tumoral foi lavado três vezes no tubo de centrífuga com HBSS e gentamicina e transferido para uma placa de petri em gelo. A dissecação com escalpelo permitiu remover os tecidos estranhos e o tumor foi picado em pedaços de aproximadamente 2 a 3 mm de diâmetro.

Os fragmentos de tacido foram colocados num frasco de 75 ml com 20-40 ml de 0,14% (200 unidades/ml) de Collagenase Tipo 1 (Sigma C-0130) e 0,1% (500 unidades Kunitz/ml) de deoxirribonuclease tipo 1 (Sigma D-0876) (Dnsase 1, Sigma D-0876) prê-aquecida atê 37°C. Os frascos foram colocados num banho de água a 37°C com agitadores magnéticos submersos a uma velocidade que causou turbulência mas não espuma. Apôs uma incubação de 30 minutos, as células livres foram decantadas através de três camadas de rede de nylon (166t: Martin Supply Co., Baltimore, Maryland) molhada em meio estéril para um tubo de centrífuga de 50 ml. As células foram oantrifugadas a 12oo rpm (250xg) numa centrífuga refrigerada durante 10 minutos. 0 sobrenadante foi decan tado e as células ressuspensas em 5-10 ml de DNAase (0,1% em HBSS) e mantidas a 37°C durante 5-10 minutos. 0 tubo foi cheio com HBSS as células lavadas por centrifugação, ressuspensas em 15 ml de HBSS e mantidas em gelo. 0 proce£ so foi repetido até se obterem células suficientes, normaj_ mente três vezes para células tumorais. As células das diferentes digestões foram então removidas, contadas e aviabilidade celular controlada pelo teste de exclusão com azul tripano. As células foram centrifugadas para uma lavagem final antes da criopreservação.

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D. Criopreservação

Uma criopreservação boa foi uma questão importante. Para preparação da vacina as células de tumor dissociado foram ajustadas a 5-8x10? /ml em HBSS e adicionadas num volume igual a meio de congelação 2x frio

contendo 15% de dimetilsulfóxido (DMSO) e 4% de albumina 7

de soro humano (HSA). A suspensão final de 2 a 4 x10 cêlulas/ml foi colocada em ampolas de congelação Nunc de 1,2 ml. Para testar células DCH o processo foi o mesmo exceptuando a não utilização de HSA. Em ambos os casos, na preparação para congelação as ampolas Nunc foram transferidas em gelo para um Cryo-Med Biological Freezer modelo 990 com Control ler modelo 700 e um Temperature Recorder modelo 500 para controlo da velocidade de congelação. Teve de se ter cuidado para que a temperatura das ampolas individuais, incluindo a ampola de controlo, fosse uniforme no inicio do processo de congelação. As ampolas foram arrefecidas a uma velocidade controlada de -1°C/min para uma temperatura final de -80°C. As amp.olas foram transformadas e transferidas em azoto liquido para serem guardadas também em azoto líquido.

E. Protocolo Clinico

Os pacientes com tumores nas fases patológicas adequadas foram escolhidos ao acaso para receberem ou a vacina constituída por células de tumor autólogo-BCG ou ficarem sem qualquer terapia . Os pacientes na fase D receberam todos quimioterapia com 5-fluorouracilo e todos os pacientes com lesões abaixo da elevação peritoneal (cancro rectal) receberam 5040rads de irradiação pélvica com raios X duas semanas após completada a imunoterapia. As vacinas iniciaram-se 4-5 semanas após resse£ ção do tumor para dar um tempo suficiente para recuperação da supressão imunológica induzida pela anestesia e cirúr-

-26gica. Ao fim de 3-4 semanas após ressecção os pacientes testemunha e os com tratamento foram testados na pele com antigénios de memória estandardizados assim como com doses graduais das suas células tumorais autólogas. Os antigénios de memória usados foram: Antigênio de teste na pele para a papeira, USP, Eli Lilly, Indianapolis, Indiana; Aplisol, PPD, (derivado proteico purificado de tuberculina), Parke-Davis, Detroit, Michigan; Trechophyton diluído a 1:30, Center Laboratories, Port Washington, New York, e Candida albicans diluída a 1:100, Center Laboratories Port Washington, New York, 0,1 ml de cada foi introduzido por via intradêrmica no antebraço e examinado relativamente a eritrema e a endurecimento âs 24 e 48 horas. Os pacientes seleccionados para o protocolo de tratamento receberam 3 injecções de vacina intradêrmica por semana consistindo em 10⁷ células tumorais autólogas irradiadas e 10⁷ BCG nas primeiras 2 vacinas com 10⁷ células do tumor apenas na final. BCG Tice recentemente congelado, fornecido pelo Dr. Ray Crispen, Centro Médico da Universidade de Illinois Chicago, Illinois, foi guardado a -70°C. A primeira vacina foi administrada na coxa anterior esquerda arca de 10 cm abaixo da prega da virilha, a segunda num local, comparável na coxa direita e a terceira na área deltóide direita.

F_. Preparação da Vacina

No dia das primeira e segunda vacinação, a ampola foi rápidamente descongelada num banho de água a 37°C, as células tumorais foram diluídas lentamente para 15 ml em HBSS, lavadas uma vez por centrifugação a 1200 rpm e ressuspensas para 15 ml de HBSS. As contagens das células e determinações da viabilidade foram feitas usando o teste de exclusão com o azul tripano. A viabilidade andava entre 70 e 90% com uma média de 80%. As células foram lavadas uma vez por centrifugação a 1200 rpm e ressuspensas para 15 ml de HBSS. A suspensão de células tumorais foi

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colocada em gelo e irradiada a 4020 rads/min. num total de 20 000 rads. 0 volume da suspensão celular foi ajustado de modo a ter-se 10⁷ células viáveis de tumor no tubo (1,3 x 10⁷ células viáveis contando com as perdas nos tubos e seringa e ainda com um erro de identificação de cerca de 20% das células linfóides). As células foram ceii trifugadas, o sobrenadante removido e 10⁷ BCG adicionado num volume de 0,1 ml. Adicionou-se HBSS numa quantidade suficiente para um \olume final de 0,2 ml. A terceira vacina foi preparada de modo idêntico, omitindo a BCG.

A suspensão de vacina foi sugada através de uma agulha de 20 gange para uma seringa de tuberculina de 0,1 ml. A agulha de 2o gange foi substituída por uma agulha de 27 gange para a injecção intradêrmica e a seringa foi colocada em gelo para ser transportada para a clínica.

Os pacientes foram estreitamente observados após cada vacina relativamente a eritrema e endurecimento no local das injecçôes, febre, finfadenopatia ou quaisquer reacções adversas. Os locais das duas primeiras vacinas ulceraram após 2-3 semanas mas cicatrizaram sempre dentro de 10 a 12 semanas.

G. fesultados de Imunização

Reactividade contra Antigénios Estandardes de Memória

Todos os pacientes se mostraram reac tivos inicialmente contra pelo menos um dos antigénios de memória estandardes. Dois dos 29 eram reactivos contra candida, 26 de 29 eram reactivos conta a papeira, 16 de 29 eram reactivos contra PPD e 3 de 29 reagiram com o Trichophyton. Não houve alteração significativa na reactividade no período que se seguiu excepto todos com excepção de

-28dois dos pacientes imunizados que se converteram em PPD positivos.

H. Hipersensibi1 idade Cutânea Retardada (DCH) contra células de Tumor

A reacção de hipersensibilidade cutâ

c

nea retardada contra 10 células de tumor autõlogo em 24 pacientes imunizados e 11 pacientes testemunha não imunizados está apresentada na Tabela 2. Uma medição de endurecimento às 48 horas superior a 5 mm foi considerada positiva. Quatro dos 24 pacientes (17%) tinham uma DCH po sitiva contra 10 células de tumor antes da imunização. Isto não foi significativamente diferente de um dos 11 pacientes (9%) com teste positivo no grupo testemunha não imunizado. De sublinhar (p 0,01) que todos' os 4 respondentes inicia mente positivos e 12 dos respondentes negativos no grupo de imunização aumentaram a reactividade de DCH após o período de imunoterapia (67% tornaram-se positivos). Sete destes pacientes foram testados um ano após mantendo três a resposta positiva. Apenas três dos 16 pacientes objecti_ vemante imunizados demonstraram uma resposta DCH positiva

5

a 10 células tumorais ao fim de seis semanas, com nenhum a apresentar uma resposta a 10⁴ células.

Exemplo II: Produção de Hibridomas para Anticorpos Monoclonais Humanos_

A. Remoção e Processamento das Células B imunizadas dos Pacientes.

Foi retirado sangue aos pacientes pela altura da segunda imunização uma semana após a primeira imunização, e quando da terceira vacinação, Uma semana após a segunda imunização. 0 sangue venoso foi colhido

β

C_

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assêpticamente na presença de heparina sem preservativo (0'Neill, Jones and Feldman, St. Louis, Missouri) numa coji centração final de 17 unidades/ml. 0 sangue foi mantido à temperatura ambiente e transportado expeditamente dentro de poucas horas após a colheita.

0 sangue diluído a 1:2 em HBSS sem cálcio e sem magnésio, foi colocado (4 ml) sobre 3 ml de meio para separação de linfócitos (LSM, Litton Bionetics) e centrifugado num tubo de centrífuga de 15 ml durante 3o minutos a 400 xg. As células na interface foram removidas, diluídas com três vezes o seu volume de HBSS e sedimentadas (1000 rpm durante 10 minutos). Os linfócitos do sangue periférico (PBL) foram ressuspensos em 10 ml de meio MEM de Dulbeco (DMEM) tamponado com Hepes e sem soro, contadas e determinada a viabilidade.

Um método alternativo foi também us^ do para recuperar células B imunizadas. 0 linfócitos T foram removidos por formação de rosetas com eritrócitos de carneiro tratados com AET. Os eritrócitos de carneiro (em solução de Alsever) foram lavados três vezes com so lução salina equilibrada (BSS) e incubados a 37°C durante 20 minutos com 4 vezes o volume de células sedimentadas com AET (Sigma) 0,14M. As células tratadas foram então lavadas três vezes com HBSS e ressuspensas de modo a obter-se uma suspensão a 10%. Os eritrócitos tratados foram colocados sobre LSM, centrifugados a 2500 rpm e colhido o sedimento Após três lavagens com HBSS os eritrócitos de carneiro foram ressuspensos para uma suspensão a 10% em soro bovino fetal não diluído e usados dentro de duas semanas. Os PBL (até 80 milhões de células) foram misturados com 1 ml de eri trócitos de carneiro tratados com AET e sedimentados a 1000 rpm durante 10 minutos a 4°C. 0 sedimento foi incubado em gelo durante 45 minutos, ressuspenso suavemente com uma pipeta de orifício largo e colocados sobre 3 ml de LSM

As células usadas na formação de rosetas foram centrifugadas a 400xg durante 40 minutos à temperatura ambiente.

Os PBLs sem células T foram colhidos na interface, lavados com três vezes o volume de HBSS e sedimentada. Após contagem e determinação da viabilidade celular as células B enriquecidas em PBLs foram então usadas na obtenção de hibridomas.

B_. Obtenção de Hibridomas Humanos

ft

Células de mieloma de ratinho (NS-1) foram cultivadas na presença de 8-azaguanina (20 ug/ml). três dias antes de fusão, as células foram sedimentadas e passadas em meio sem 8-azaguanina. As células foram passa_ das de novo no dia antes da fusão para as manter na fase log. As células de mieloma foram lavadas uma vez com meio sem soro, contadas e determinada a viabilidade. Os PBLs e as células de mieloma de tumor da imunização.

Isto não foi significativamente diferente de um dos 11 pacientes (9%) com teste positivo no grupo testemunha não imunizado. De sublinhar (p> 0,01) que todos os 4 respectivos respondentes inicialmente positivos e 12 dos respondentes negativos no grupo de imunização aumentaram a reactividade de DCH após o período de imunoterapia (67% tornaram-se positivos).

Sete destes pacientes foram testados um ano após mantendo três a resposta positiva. Apenas três dos 16 pacientes objectivamente imunizados demonstraram uma resposta DCH positiva a 10 células tumorais ao fim de seis semanas, com nenhum a apresentar uma resposta a 10⁴ células.

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CÍ

Exemplo II : Produção de Hibridomas para Anticorpos Monoclo nais Humanos.

A. Remoção e Processamento das Células B Imunizadas dos Pacientes.

Foi retirado sangue aos pacientes pe la altura da segunda imunização, uma semana após a primeira imunização, e quando da terceira vacinação, uma semana após a segunda imunização. 0 sangue venoso foi colhido assêpticamente na presença de heparina sem preservativo (O^lNeill, Jones and Feldman, St. Louis, Missouri) numa concentração final de 17 unidades/ml. 0 sangue foi mantido à temperatura ambiente e trnsportado expeditamente dentro de poucos horas após a colheita.

0 sangue, diluído a 1:2 em HBSS sem cálcio e sem magnésio, foi colocado (4 ml) sobre 3 ml de meio para separação de linfócitos (LSM, Litton Bionetics) e centrifugado num tubo de centrífuga de 15 ml durante 30 minutos a 400xg. As células na interface foram removidas, diluídas com três vezes o seu volume de HBSS e sedimentadas (1000 rpm durante 10 minutos). Os linfócitos do sangue periférico (PBL) foram ressuspensos em 10 ml de meio MEM de Dulbecco (DMEM) tamponado com Hepes e sem soro, contadas e determinado a viabilidade.

Um método alternativo foi também usado para recuperar células B imunizadas. 0 linfócitos T foram removidos por formação de rosetas com eritrócitos de carneiro tratados com AET . Os eritrocitos de carneiro (em solução de Alsever) foram lavados três vezes com solução salina equi1ibrada.(BSS) e incubados a 37°C durante 20 minutos com 4 vezes o volume de .células sedimentadas com AET(Sigma)O,14M. As células tratadas foram então lavadas três vezes com HBSS e ressuspensas de modo a obter-se uma suspensão a 10%. Os eritrócitos tratados foram colo-

cados sobre LSM, centrifugado a 2500 rpm e colhido o sedimento. Após três lavagens com HBSS os eritrócitos de carneiro foram ressuspensos para uma suspensão a 10% em soro bovino fetal não diluído e usados dentro de duas semanas.

Os PLB(atê 80 milhões de células) foram misturados com 1 ml de eritrocitos de carneiro tratados com AET e sedimentados a 1000 rpm durante 10 minutos a 4°C. 0 sedimento foi incubado em gelo durante 45 minutos, ressuspenso suavemente com uma pipeta de orificio larga e colocados sobre 3 ml de LSM. As células usadas na formação de rosetas foram centrifugadas a 400xg durante 40 minutos à temperatura ambiente. Os PBLs sem células T foram colhidos na interface, lavados com três vezes o volume de HBSS e sedimentadas. Após contagem e determinação da viabilidade celular as células B enriquecidas em PBLs foram então usadas na obtenção de hibridomas.

4. Obtenção de Hibridomas Humanos

Células de mieloma de ratinho (NS-1) foram cultivadas na presença de 8-azaguanina (20 ug/ml). Três dias antes da fusão as células foram sedimentadas e passadas em meio sem 8-azaguanina. As células foram pa£ sadas de novo no dia antes da fusão para as manter na fase log. As células de mieloma foram lavadas uma vez com meio sem soro, contadas e determinada a viabilidade. Os PBLs e as células de mieloma misturaram-se numa produção de 3:1 e sedimentaram-se em conjunto a 1000 rpm durante 10 minutos Todo o meio sobrenadante foi removido e o sedimento de células ressuspenso em menos de 100 ul de meio sem soro. Um ml de polietilenoglicol (50% p/v) prê-aquecido atê 37°C foi adicionado gota a gota ao sedimento de células ao longo de um minuto com agitação constante do tubo. Duas vezes o volume anterior do meio sem soro prê-aquecido foi adicionado â suspensão celular durante um minuto atê se encher o tubo de 50 ml. As células foram sedimentadas a

1

800 rpm durante 15 minutos. Ressuspendem-se suavemente as células em meio HT (DMEM contendo 20% de soro fetal de bovino, hipoxantina 13,6 pg/ml e timidina 3,9 pg/ml)numa concentração de 2,5x10⁵ cêlulas/ml (contagem antes da fusão) e colocou-se 100 pl de cada poço de microtitulação. Vinte e quatro horas mais tarde, adicionou-se a cada poço 100 pl de meio HAT (meio HT contendo 0,18 pg/ml de aminopterina).

De três em três dias substituiu-se metade do meio por meio HAT novo. Após manutenção em meio HAT durante 14 dias, as células foram mantidas em meio HT durante mais duas semanas, ao fim desse tempo as células foram cultivadas num meio DMEM contendo 20% de soro fetal .bovino.

Como alternativo pode-se usar para obtenção de células B diplóides transformadas, a co-cultura de células PBL com células de mieloma. As células PBL e de mieloma foram misturadas (numa proporção de 3:1), sedimentadas a 800 rpm e seleccionadas em meio HAT, como descrito atrás.

£. Detecção de Hibridomas

Os hibridomas foram primeiro quantificados e isotipados por um "imunoteste com enzima ligada" (ELISA) relativamente à síntese de imunoglobulina humana (IgA, IgG e IgM). 0 método estandardo Bio-EnzaBead foi utilizado, o qual ê sensível na gama de 10-300 ng/ml. 0 meio sobrenadante dos hibridomas foi diluído a 1:30 com uma gama de 0,3-9 pg/ml. Apenas os hibridomas que sintetizaram imunoglubolina humana numa concentração superior ou igual a 1 pg/ml foram testados por imunoperoxidase indirecta nos tecidos após determinado o isotipo do anticorpo (IgA, IgG, ou IgM).

Contas metálicas revestidas com policarbonato (BioEnzaBead Litton Bionetics) foram incu-

badas com anticorpos de cabra contra imunoglobulina humanas (IgG + IgA + IgM) durante a noite de 4°C e depois bloqueadas (30 min. â temperatura ambiente), com 2,5% de BSA para evitar ligações inespecificas. As contas foram então secas ao ar e guardadas a 4°C. A ELISA para detecção de imunoglobulina foi efectuada como se segue. Os sobrenadantes de uma placa de cultura de 96 poços foram diluídas, incubados com as contas com anticorpos adsorvidos durante 1 hora a 37°C, lavados e em seguida incubados durante 1hr a 37°C com anticorpos de cabra purificados por afinidade e marcado com peroxidase contra imunoglobulina humanas (IgG + IgA + IgM). As contas lavadas foram então incubadas (10 min. à temperatura ambiente) com 2,2¹-Azino-di-/~ácido 3-etilbenztiazolino-6-sulfónico7e a densidade Ôptica determinada a 405 nm. As concentrações de imunoglobulina foram interpoladas matemáticamente a partir de uma parte linear de uma curva padrão (30-1000 ng/ml) de gamaglobulina humana. Os sobrenadantes contendo 1 pg/ml foram então isotipados usando esta ELISA com anticorpos de cabra marcados com peroxidase contra as cadeias , cÇ e jj humanas.

Nos ensaios quantitativos subsequentes usou-se uma imonoglobulina padrão apropriada para o isotipo do anticorpo monoclonal. As imunoglobulinas de ratinho foram testadas com BIo-EnzaBeads Revestidas com IgG + IgM(H+L) de ca bras antiratinho e IgG+IgM(H+L) de cabra antiratinho., conjugado com peroxidase. Noutras experiências os sobrenadantes foram incubados com as contas com Ig anti-humano e IgG+IgM(H+L) de cabra anti-ratinho conjugado com peroxidase.

Secções de criostato de tecido normal de tumor guardadas a -30°C, foram posteriormente fixadas em PLP (0,5% de p-formaldeído L-Iisina 0,075M) periodato de sódio 0,01m) durante 20 minutos a 4°C. Em seguida lav_a ram-se as secções. As secções de pararfina de tecidos fixa dos em formalina a 10% foram desparafinizados imediatamente antes de usar. As secções criostáticas e de parafina

-35foram então incubadas â temperatura ambiente em 1% de albjj mina de soro bovina em PBS contendo o L-lisina 0,075M duran te 20 minutos. As secções foram incubadas durante a noite a 4°C com os sobrenadantes dos hibridomas. Após três lavagens com PBS, as secções foram então incubadas com a quantidade adequada de reagente anti-humano marcado com peroxidase durante 60 minutos a 37°C, lavadas e incubadas â temperatura ambiente durante 15 minutos com diaminobenzidina (0,5 mg/ml, pH 7,6) em PBS contendo 0,1% de peróxido de hidrogénio. As secções foram lavadas com PBS, coradas com hematoxi1ina, desidratadas e montadas em Permount.

Estes métodos permitiram detectar o espectro mais largo de anticorpos reactivos com os tecidos (i.e., dirigidos contra antigênios de superfície ou citoplásmáticos.').

Para isolar anticorpos reactivos contra uma gama longa de antigênios, os sobrenadantes foram testados contra um painel de secções de tumores. As linhas celulares produtoras de anticorpos monoclonais foram então clonados por diluição limite.

Foram feitas vinte e duas fusões com linfócitos do sangue periférico obtidos de dez pacientes e efectuadas duas fusões com linfócitos de pacientes antes de imunização. Os melhores resultados foram obtidos resultados foram com linfócitos removidos,uma semana após a segunda imunização (Tabela 8). A frequência de clones produtores de imunoglobulina isolados após a segunda imunização foi quase duas vezes obtida após a primeira imunização.

Sete dos 36 anticorpos monoclonais positivos contra tecidos reagiram com secções criostãticas mas não com tecidos embebidos em parafina, este resultado sublinha a necessidade de processos de detecção com maior espectro. Mais de dois terços dos clones produziam IgM, mais provável-βΟ'φΟΟ

mente uma consequência da fonte dos linfócitos (sangue periférico).

Um terço das linhas celulares tinha morfologia típica de hibridomas e cresceu como células dispersas. A análise de cariótipo de seis híbridos represen tados demonstrou que eles eram hetero-hibridomas homem-ratinho (Figura 1A). Ao contrário, a maioria das linhas celulares sintetizadores de anticorpos monoclonais (24 de 36) eram atípicas no que se respeita ao espectro (Figura 1B). Estas células eram predominantemente de forma irregular e cresciam em grandes agregados.Estas células formadoras de focos foram isoladas em sete fusões feitas com PBL.de sete de dez pacientes do colon. Portanto pareceram ser muito vulgares. Seis linhas celulares representando cinco fusões de quatro pacientes, foram cariotipadas e verificou-se terem 46 cromossomas. A coloração com Giemsa dasbandas dos cromossomas confirmou serem todos de origem humana (Figura 1C). Assim, baseado em critérios de morfologia celular, parece que a maioria das linhas celulares sintetisadoras de anticorpos monoclonais não são hibridomas mas antes células B humanas transformadas (células diplóides). 0 mecanismo desta transformação espontânea não ê conhecido mas pode estar relacionado com o processo de imunização.

Não existem diferenças entre estas tipos de células no que respeita ao isotipo de imunoglobulina secretada ou quanto ao tipo de tacido corado. As quantidades de imunoglobul ina (1-60 jjg/ml) secretadas por ambos os tipos celulares eram essencialmente comparáveis, com a maioria das células humanas produzindo 5-20 pg/ml. Como se poderia esperar as células diplóides parecem ser mais estáveis no que respeita à produção de imunoglobulinas. Estas células foram cultivadas em cultura contínua durante até 9 meses sem qualquer indicação de um limite de tempo para a produção de anticorpos. De facto, observaram-se aumentos na produção de anticorpos surante uma cultura a longo

-37prazo nalguns linhas diplóides. Os clones que subsequentemente se tornaram não produtores durante passagens celulares prolongadas tinham características de crescimento típicas de hibridomas. No entanto, a maioria dos híbridos tinha estabilidade suficiente para parmitir a produção de quantidades úteis de anticorpos. Por exemplo, o hetero-hibridoma homem-ratinho 7 a 2 foi passado durante mais de 20 gerações a partir de um "stock" de sementeira recenc

temente clonado de 5x10 células sem um decréscimo na pro

dução de anticorpos. Assim as células podiam teóricamente q

ser expandidas até 7 χ 10 células. Este hibrido produziu cerca de 30 pg/ml/10 células e portanto 7 χ 10 células poderiam teóricamente produzir cerca de 2 kg de anticorpo.

D. Produção de Anticorpos Monoclonais

As células produtoras de anticorpos monoclonais humanos foram cultivadas em meio RPMI 1640 (Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri) suplementado com 10% de soro fetal bovino, L-glutamina 3mM e 5 pg/ml de gentamicina. 0 meio foi nalguns casos suplementado ainda com 25% de D-glucose (concentração final de 0,25%). As células estiveram a 37°C (35-38°C) em atmosfera húmida com 7,5% de C0₂ em ar. 0 anticorpo foi colhido a partir de meio de cultura altamente metabolizado por sedimentação do meio sem células (e.g., por centrifugação a 500 rpm duran te 15 minutos.)

I»

Exemplos III: Reactividade de Anticorpos Monoclonais para tecidos Normais e de Tumores

A maior parte dos anticorpos apresen tava uma ligação muito reduzida â mucosa de colon normal.

Os anticorpos reactivos com secções de parafina foram também testados quanto à sua reactividade com mama, pulmão, vesicula biliar o figado e verificou-se serem negativos.

0 padrão de reactividade de 10 dos anticorpos monoclonais humanos (MCA) contra histológicas secções de adrenocarcinomas colo-rectais de 15 pacientes estâ apresentada na Figura 2. A matrix de reactividade dos anticorpos testados indica que os anticorpos individuais reagem contra entre 47 e 80% das especies de tumores testadas. Não se obteve anticorpos monoclonais que reagissem com todos os 15 tumores. Nãs secções de tecidos de pacientes individuais a gama de reactividade variou desde tecidos reactivos contra todos os 10 anticorpos atê tecidos reactivos contra apenas 1 ou 2 anticorpos. Todas as especies de tecidos usados para a determinação da reactividade de anticorpos monoclonais foram obtidos de pacientes que não foram os 10 dador de células B para as fusões iniciais.

Comparámos o estado patológico dos tumores testados com a percentagem de reactividade com o grupo de anticorpos monoclonais testado e encontrámos que os tumores com uma gama de reactividade mais longa eram adenocarcinomas desde moderadamente a bem diferenciados; o menos comum, adenocarcinomas muito pouco diferenciados eram normalmente não reactivos.

O anticorpo monoclonal LiCo 16-88 reagiu com um antigênio preservado em secções embebidas em parafina de carcinoma colo-rectal o igual não estava presente ou grandemente reduzido na mucosa de colon nor mal. Alfm da marcação citoplasmãtica as células de tumor

•39apresenta uma coloração que parece ser da superficie (Figu ra 1D). Esta ligação era especifica como se demonstrou pela ausência de coloração por imunoglobulina humana normal semelhante em concentração e isotipo ao anticorpo monoclonal. E também de salientar a observação de que este anticorpo reagiu quer com tumores primários quer com metastases. 0 anticorpo LiCo 16-88 reagiu com secções de criostato. Como se pode ver na Figura 1E, observou-se uma coloração intensa da periferia das células de tumor com LiCo 16-88 mas não com imunoglobulina humana normal (Figura 1F).

As principais vantagens de um anticorpo monoclonal humano, compreende comparado com um rati nho são para o diagnóstico in vivo (criação de imagens) e terapia. Menos de 1% dos anticorpos monoclonais humanos isolados de pacientes com tumores foram anteriormente divulgados por outros investigadores como reagindo com antigénios celulares de superficie (Cote et al., proc.

Nat. Acad. Sei. 80:2026-2030, 1983): Estes resultados sugeriram que os pacientes com cancro poderiam ser tolerante para os antigénios de superficie de células tumorais.

E significativo portanto, que se tenha encontrado que meta de dos anticorpos positivos para tecidos e isolados a partir de pacientes imunizados se liguem às superfícies de células tumorais (Tabelas 3, 4 e 8). Como se pode ver na Figura 1G., o anticorpo monoclonal 16-88 reage com a superficie das células SW-1463. A ausência de coloração de algumas das células poderá ser devido a variações clonais ou de ciclo celular na expressão do(s) antigênio(s). Assim a maior vantagem deste invento, que usa pacientes imunizadas como fonte de células B sensibilizadas, ê a frequência extremamente elevada de anticorpos reactivos com os antigénios da superficie celular produzidos. Os anticorpos produzidos de acordo com o invento têm o maior potencial para diagnóstico e tratamento de cancro.

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Preparam-se extractos de proteína (PBS e KC1 3,0M) e lípidos (clorofórmio-metanol) a partir de células HT-29 e SW 1463. Treze dos anticorpos verificou-se reagirem com estes extractos. 0 resultado mais-mar cante foi de que todos os anticorpos reagem com os extrac_ tos proteicos, o tratamento dos extractos com protease reduz significativamente a ligação. Estes resultados contrastam marcadamente com os obtidos com anticorpos monoclo nais de ratinhos os quais são muitas vezes dirigidos contra antigênios glicolipidicos dos tumores do colon (Morgan et al., Hybridoma, 3:3, página 233, 1984) e Lindholm et al., Int. Arch. Allergy Appl. Immuno. 71, 178-181 , 1983).

Para produção de anticorpos monoclonais contra antigénicos proteicos derivados de tumores do colón são necessários várias técnicas entre as quais a pre paração de extractos proteicos e a utilização de lectinas imunoadsorventes para a imunização de ratinhos. Assim, a imunização autóloga do homem induz anticorpos contra um grupo de antigênios normalmente pouco imunogênicos para ratinhos. E portanto possível que o homem e o ratinho possam responder o diferentes antigênios associados a tumores Está de acordo com esta hipótese o facto de nenhum dos 20 anticorpos monoclonais examinados reagirem com CEA purificado, um antigénio frequantemente detectado por anticorpos monoclonais de ratinho feitos contra células de tumor do colon (Koprowski et al., Somat. Cell .Genectic. 5; 957-972, 1979 e Morgan et al., supra). E interessante que três dos anticorpos monoclonais humanos também reconhecem antigênios extraídos por tratamento com clorofórmio metanol. Estes antigênios poderão representar proteínas não desnaturadas por este tratamento ou como alternativa glicolípidos que tenham um epito pó comum (i.e. a parte do açúcar) com uma gl icoproteína.

•41Reactívidade de Anticorpos Monoclonais Humanos contra Antigênios de Superfície Celular de 8 Linhas de Carcinoma do Colón

Trinta e seis anticorpos monoclonais humanos foram testados quanto â reactividade com antigênios de superficie de células tumorais contra um painel de 8 linhas celulares de cancro do colon humano preparadas como amostras de citocèntrifuga secas ao ar. Treze dos 36 anticorpos reconhecem antig-enios expressos na superficie de pelo menos 2 linhas de células de carcinoma do cólon humano (Figura 1H, Tabela 3). Todos os 13 anticorpos reactivos com os antigênios de superficie foram isotipados como IgM. Estes anticorpos monoclonais foram produzidos quer por hetero-hibridomas quer por linhas de células B diplóides.

Experiências usando anticorpos de ra. tinho contra antigênios citoplasmâticos estruturais, como seja a actina, confirmaram que as estruturas citoplasmâticas não podiam ser detectadas com preparações adequadameii te preparadas de células de Cytospin secas ao ar sem permeabilização prévia dos membranas celular. A localização dos antigênios na superficie reconhecida nas células preparadas na Cytospina para a maioria dos anticorpos foi confirmada por imunofluorescência indirecta de células vivas.

Não encontrámos correlação entre a reac tividade dos anticorpos monoclonais e a concentração de imunoglobulinas dos sobrenadantes das culturas celulares contendo anticorpos. Todos os sobrenadantes das células foram testados sem qualquer diluição e sem qualquer tentativa para os ajustar a uma concentração constante de imunoglobi luna. Para a maior parte, os .13 anticorpos reactivos com 2 ou mais linhas celulares apresentavam mais do que actividade de fundo;as excepções foram os anticorpos 12-42

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e 12-53 do isotipo IgG que reagiram fortemente contra apenas uma linha celular. Houve alguma variação na expressão de antigênios cognatos entre_as linhas celulares: LS-174¹³ ligou-se a 17 anticorpos monoclonais: SW-1463 e HT-29 ligaram-se a 12 e 10 anticorpos, respectivamente; as outras linhas celulares ligaram-se a entre 5 e 9 dos anticorpos e 7 a 2 e 16-52 reagiram com as 8 linhas celulares. Por outro lado o padrão de ligação dos monoclonais indicou uma quantidade de especificidades reconhecidas.

Reactividade de Anticorpos Monoclonais Humanos contra Anti gênios de Superfície Celulares de Células Tumorais Dissociados de Carcinoma do Cólon.

Confirmámos a reactividade da superfície celular observada com linhas celulares de colon em ensaios com preparações de Cytospin secas ao ar de células de tumor do colon enzimáticamente dissociadas obtidas de 9 pacientes (Tabela 4). Dezassete dos anticorpos monoclonais reagiram com pelo menos 2 das preparações de células de tumor. Houve algumas diferenças entre os resultados da linha celular e os resultados das células tumorais; 16-86, que reagiu com 4 das 8 linhas celulares, deu resultados positivos com apenas uma preparação de células tumorais. e 16-105 e 12-53, que reagiram com o de 8 e 1 de 8 das linhas celulares do colon, respectivamente, reagiram com 3 ou mais das preparações de células tumorais. Do que se obser vou nos ensaios de reactividade com linhas celulares, os padrões de ligação do anticorpo, que reflectem a presença e o grau de expressão antigénica pelas células tumorais, sugere que muitas especificidades diferentes são reconhecj_ das por estes anticorpos monoclonais.

Reactividade de Anticorpos Monoclonais Humanos com Seções de Parafina Emparelhadas de Tumor do Colon e Mucosa Normal

A especificidade de 25 dos anticorpos monoclonais humanos reactivos com secções de parafina foi testada por imuno-histoquímica indirecta contra secções dos pares de tumor do colon e mucosa de colon normal autóloga de 5 pacientes (Tabela 5). Onze dos 25(44%) não demons^ traram reactividade detectável com mucosa de colon normal nos 5 pacientes testados, mas os 11 reagiram com as amostras de tumor. Quatorze de 25 anticorpos, se bem que reactivos com as amostras de tumor, também reagiram com mucosa de colon normal. Quantitativamente, nestes casos a reactividade com amostras de colon normal era inferior à das amostras de tumor. Os anticorpos individuais reagiram com 1 a 4 das amostras de mucosa de colon normal testadas. Cinco de 14 destes anticorpos com reacção cruzada apenas reagiram com a mucosa de colon normal de 1 dos 5 pacientes.

A mucosa de colôn normal do paciente 8 reagiu com 13 dos 23 anticorpos que reagiram com o tumor desse paciente. Se a mucosa de colon normal deste paciente estava proximo ou distante de tumor não é conhecido. Se o paciente 8 fosse eliminado desta análise apenas 9 dos 24 anticorpos testados teriam reagido com 1-3 das amostras emparelhadas de mucosa de colôn normal. Em suma, na totalidade das amostras emparelhadas de mucosa de colôn normal e de tumor colo-rectal testadas, cerca de 30% apresentou reacção cruzada com mucosa de colôn normal, no entanto a reactividade quantitativa foi significantemente menor do que a observada coin tra a amostra de tumor emparelhar.

Ainda a ocorrência de um nível mais baixo mas detectável de reactividade com células normais pode ser atribuído aos determinantes de'reconhecimento associados a um desvio das condições normais que aparentemente não são cancerosas.

-44;

Reactividade de Anticorpos Monoclonais com Reparação de Cytospin Emparelhadas de Células de Tumor e Mucosa de Colon Humano por Ligação Directa de Anticorpos marcados com Biotina.

A especificidade dos anticorpos para as células de tumor versus células normais é dificil de avaliar por métodos de coloração indirecta em preparações de Cytospin e secções de criostato. Os anticorpos Ig anti-humano marcados com peroxidase usados para detectar os anticorpos humanos também reconhecem imunoglobulina humana endógena presente em todos os tecidos humanos. Os te eidos normais contêm maiores quantidades de imunoglobulina endógena do que os correspondentes tecidos tumorais, eonsequentemente o fundo é maior para tecido normal do que para tecido de tumor. A marcação directa dos anticorpos permite ultrapassar este problema e permite também a inclusão de um excesso de imunoglobulina humana irrelevante com os anticorpos monoclonais para bloquear ligação inespecifica de imunoglobulinas.

Cinco dos .anticorpos humanos reactivos com antigênios de superfície foram purificados a partir do meio de cultura e marcados com biotina. Os 5 foram escolhidos porque reagiram bem em ensaios anteriores e produziram níveis relativamente elevados de imunoglobulina humana. A Tabela 6 mostra os resultados com os 5 anticorpos marcados com biotina em ensaios directos de preparações de células Cytospin e secas ao ar de tumor de colon e células de mucosa adjacente de 7 pacientes. Os 5 anticorpos reagiram com as células tumorais confirmando a rea£ tividade observada nos ensaios indirectos. A reactividade com células de mucosa normal era fraca ou não se detectou.

Ligação Directa de Anticorpos Monoclonais com Biotina a sec ções de Tecido Congelado de Tumor do Colon e de Mucosa do Colon Normal.

Outra caracterização directa dos 5 anticorpos marcados com biotina relativamente, â sua especificidade para células de tumor versus células normais foi estabelecido com secções de tecido congelado de tumor do colon e de mucosa do colon normal adjacente (Tabela 7). Observou-se especificidade absoluta com 4 dos anticorpos como mostrado pelo facto de eles reagirem fortemente com pelo menos 2 de 5 tumores do colon e não reagirem com qualquer das 4 secções correspondentes de mucosa de colon normal 19b 2 reagiu fortemente com 4 das 5 secções de tumor e apresentou uma reacção fraca com 1 de 4 secções de mucosa de colon normal. 19b 2 também reagiu em certa medida com preparações de Cytospina de células de mucosa do colon normal (Tabela 6) e secções de parafina de mucosa do colon normal (Tabela 5).

Secções de tecido congelado de mama, estomago, rim, figado, musculo e pele normais (Tabela 7) não apresentaram coloração com anticorpos humanos marcados com biotina exceptuando com o anticorpo 19b 2 o qual mostrou um nível baixo de ligação de tecido normal de estomago. Observou-se uma coloração de fundo generalizada um componente de tecido conjuntivo. Este coloração de fundo era inespecifica e fòi observada por outros investigadores usando anticorpos monoclonais marcados com biotina.

Reactividade de Anticorpo Monoclonais com CEA e Antigénios de Eritrocitos e Leucócitos

Para estabelecer melhor a especificj_ dade para tumores dos anticorpos monoclonais, testamos a reactividade com CEA, antigénios de eritrocitos humanos e antigénios de linfócitos humanos para várias técnicas. Não encontrámos evidência de reactividade entre estes anticorpos e estes antigénios. A actividade anti-CEA foi testada por ELISA contra duas preparações de CEA. Os padrões de coloração dos anticorpos monoclonais humanos em secções de parafina de tumor do colon humano foram diferentes das observadas com um anticorpo anti-CEA. Nenhum dos 36 anticorpos humanos deu padrão de coloração luminal tipicamente observado com anticorpos anti CEA. A reactividade com anti génios de eritrócitos humanos foi medido por imunofluorescência indirecta e hemaglutinação contra um painel de eritrocitos representando todos os sistemas de grupos sanguíneos principais e a maior parte dos mesmos frequentes. Não se observou reactividade. ELISA, ensaios de cititoxicidade e coloração indirecta com imunoperoxidase de linfócitos humanos não mostrou qualquer evidência de reconhecimento de antigénios de linfócitos humanos por quaisquer dos anti corpos.

Acção dos Anticorpos Monoclonais Humanos contra Cancro Colorectal.

A especificidade ê uma consideração fundamental na determinação da utilidade destes anticorpos monoclonais reactivos contra tumores. A ausência de reactividade de alguns anticorpos monoclonais com uma certa percentagem de especies de tumores testadas ê outro factor que deve ser considerado. Portanto não parece provável, baseado nestes resultados, que quaisquer anticorpos monoclonais isolados tenham todos os factores que lhe estão asso-

-47·

ciados que o tornariam ideal para aplicação terapêutica a de diagnóstico. A estratégia da utilização de pacientes com cancro imunizados proporcionou um grande número de clones a partir dos quais se podem fazer certas selecções em relação â gama de reactividades, assim como â especificidade. Seleccionando apenas a dos anticorpos monoclonais que produzimos, os quais, baseado nas suas características num rastreio vasto in vitro, possuem a maior quantidade do rea£ tividade com tumores e a menor quantidade de reactividade com mucosa de colon normal, podemos propor a desenvolver misturas de anticorpos que em conjunto possuem maior efic_á cia. do que os anticorpos monoclonais individuais. Como se mostra na figura 3, 2 anticorpos monoclonais, 6 a 3-1

e 7 a 2, emparelhados pela sua gama de reactividade com secções de tecidos e células tumorais dissociadas e seleccionadas com base na ausência relativa de reactividade cruzada com mucosa de colón normal, constituem numa mistura de anticorpos que reage com 14 das 15 especies de tumores e com 9 das 9 espécies de células tumorais dissociadas. Outros misturas destes tipo podem ser criadas; no entanto ê claro que devemos ter uma larga gama de anticorpos monoclonais para seleccionar e um rastreio in vitro extenso para testar um grande número de especies numa variedade de estados de diferenciação para se utilizar anticorpos monoclonais huma nos com fins terapêuticos ou de diagnóstico.

0 invento além de fornecer anticorpos monoclonais reactivos com antigênios da superfície de células tumorais para o diagnóstico in vivo e imunoterapia do cancro também oferece anticorpos monoclonais que serão uteis como sondas para isolar e caracterizar os antigênios relevan tes para a imunidade do cancro humano. Estes antigênios poderão ainda mostrar-se úteis como vacina de tumor. Adicionalmente a obtenção de células diplóides produtoras de anticorpos adiciona uma dimensão de estabilidade genética â produção de anticorpos monoclonais humanos reactivos

-48contra antigênios da superfície de células de tumor.

A Tabela 3 mostra a reactividade com tecidos de anticorpos monoclonais produzidos pelas linhas celulares de anticorpos monoclonais preparadas segundo estes processo.

0 que se segue descreve a formação de novos anticorpos monoclonais específicos para certos tumores, hibridomas e métodos para a sua preparação. As téc nicas para preparação dos novos anticorpos monoclonais hibridomas, e células diplóides foi descrito com detalhe particularmente com referência a execuções especificas incluídas como exemplos. Compreender-se-â que os produtos e técnicas do presente invento são do maior significado no campo da detecção e tratamento de cancro. Eles incluem uma larga gama de anticorpos monoclonais, cada um especifico para determinantes que se encontram numa estirpe individual de cancro formador de tumores uma vez que a té£ nica aqui divulgada pode ser usada para obtenção de anticorpo para cada caso. Compreender-se-â ainda que muitas variações e modificações das técnicas aqui divulgadas sejam acessíveis aos ligados â matéria e que tais variações e modificações sejam consideradas dentro do âmbito deste invento.

As execuções fornecidas para ilustrar este invento relaciona-se com tumores de carcinomas, particularmente adenocarcinomas colo rectais bem diferenciados. E claro, no entanto, que o invento se estende a todos os carcinomas, como sejam os do pulmão, mama, e outras condições malignas em áreas que surjam do mesmo tipo de tecido embrionário.

Ainda os processos descritos podem ser ajustados, caso necessário, por alguém entendido na matéria para serem usados na aplicação deste invento a outros tipos de cancro.

Tabela 1

Critérios para vacinas eficazes em Imunoterapia Activa Especifica

Adj uvante

(a) BCG (Phipps, Tice, Connaught):1iofi1izada, congelada (dose-dependência 10® (10⁷-10θ)

(b) £. parvum (Wellcome Labs) (dose-dependência >7pg (70 pg- 700 pg)

Células de Tumor

(a) Dissociação enzimátiea

(1) Collagenase Tipo I (1,5-2,0 U/ml HBSS)

(2) DNAase (450 D.U./ml HBSS)

(3) 37°C com agitação

(b) Criopreservação

(1) Congelação com velocidade controlada (-1°C/min) (7,5% de DMSO, 5% de HSA, HBSS)

(2) Viabilidade 80%

(C) Irradiação com raios X

(1) Deixam de ser Tumorigénicas a 12 000 - 20000R

-50Componentes e AdministraçãS

(a) Proporção de adjuvante para células de tumor10:1 - 1:1 (óptimo).

(b) 10⁷ células de tumor (Óptimo)

(c) 2-3 vacinações i.d., com intervalos de uma semana. A terceira vacinação contem apenas células de tumor.

Λ

Quimioprofilaxia com isoniazida da infecção com BCG facuj. tativa

BCG - Bacillus Calmette Guerin

HBSS- Solução salina aquilibrada de Hank

DMSO- Dimetilsulfóxido

HSA- Albumina de soro humano R- Rads

PBS- Salino Tamponado com fosfato " EDTA- Acido etilenodiaminotetraacêtico

TABELA 2

Reacção DCH contra Células de Tumor Autólogo

	Fase	No. de Pacientes	Reactividade da Pré-imunização	Reactividade 6 semanas e/ ou 6 meses
Pacientes Imunizados:	B2	8	0	4
	Cl ,C2	9	’ 2	6
	D	7	2	6
Total (%)		24	4(17%)	16(67%)
Pacientes N/Imunizados	B2	4	1	0
	Cl ,C2	5	0	1
	D	2	0	0

Total (%)

11 1(9%) 1(9%)

As reacções foram consideradas positivas quando o endure cimento âs 48-hr.

(a média de 2 diâmetros) e na mais de 5mm

-52-⁺+ ¹ ' ¹ ! ^{1 1} + ⁺ ' ¹ ' ^{1 1 1} í v - ι .

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-53TABELA 3 (CONT)

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Intensidade da coloração com imunoperoxidase do anticorpo monoclonal testado comparada com a testemunha do mesmo isótipo e mesma concentração.

b

pg/ml

c "* " Designa a morfologia das culturas de hibridomas, as outras surgem como linhas de células B transformadas (diplóides).

Linhas Celulares

Linhas celulares humanas adenocarcinoma do colon HT-29, SW1463, SW948, SW480, SW403, LoVo e

WiDr foram obtidas da "American Type Cultura Collection"

(Rockville, Maryland)(As células foram cultivadas no meio

de cultura recomendado suplementado com 10% de sorofetal

bovino. A linha celular de adenocarcinoma do colon LS+

-174 obtida do Dr. Jeffery Schlom(National Câncer Institute, Bethesda, Maryland) foi cultivada em meio de Eagle modificado de Dulbecco. Todas as linhas celulares foram incubadas a 37°C em atmosfera de 5% de C0₂-

-55TABELA 4

Reactividade de Anticorpos Monoclonais Humanos com Antigênios da Superfície Celular de Células TurnoΟ ς

rais de Carcinoma do Colon:

Antibiótico mo noclonai s	Número de Paciente
Concen tração	ISÓ- ' tipo
16	17	18	19	•20	21	22	23	24
6*3* =	11	• IgM	+		—		24-	34·	4		—
- 7*2*	23	IgM	•4+	4+	4+	44-	4+	44-	4-	'4	44-
7*4*	18 -	IgM	2+	-	2+	24·		44-	ND
11B5	7	IgM ·	-	-	- -	-	-	+	-		ND
12-38*	144	IgG	-	-	-	-	-	-	-	4_.	ND
12-42*	74	- IgG .	-	-		-	-	-	-		ND
12-47*	25	IgC	-	- -	-		-	-	ND	ND	ND
12-53*	219	IgC	2+	-	3+	ND	-	-	-		24·
15-12	15- -	IgM	-	-	-	-	+	+
15-24 '	18	' IgC	-	. -	-	-	-		ND	. -	ND
15-33	11	IgM	-		-	-	+	2+	-	-	- .
15-39	3	IgG		-	-	-	-	-	-	-	ND
16-4	19	IgM	-	- ·	-	-	-	3+	-	-	ND
16-50	3	IgM	-	-		-	-	+	ND	-	ND
16-52	4	IgM	2+	2+	2+	2+	4	2+	4	+	-
16-58	14	IgM	3+	3+	3+.	24-	-	+	-	-	34-
' 16-66	7	IgM .	4+	4+	3+	-	4	-	-	-	-
16-72	5	IgM	-	-	-	-	-	24·	-	-	-
16-80	8	IgG	·	-	-	-	+	-	4	-
16-81	6	IgM	-	+	-	-	+	-	-	- . .	ND
16-86	9	• IgM	-	-	-	-	+	-	-	-
16-88	4	IgH-	+	+ '	* 4	3+	44· ·	-		+ ’	-
16-103	6	IgM	-	- .	-		-	• -	ND		ND
16-105	11	IgM	-	*	2+	+	+ -	+	ND	ND	ND
18-15	16	IgG - -	-	• 4	-	-	-	+	-	-	ND
1B-21-*	12 ·	IgM	+	+	+	+	-	+	-	-	-
18-22*	7	IgM	2+	+	2+ ·	24-	+	2+	-	+	-
19b2*	26	IgM	2+	2+.	2+	24-	- 34·	44·	4	24-	-
20A3	4	IgC	-	-	-		-	+	-	-	ND
20A6	9	IgC	-	-	-	-	-	-	-	-	ND
20B7	9	IgC .	-	+	-	-	-	-	-		ND
21E27*	19	IgM	•								ND
a A presença e	grau de	1igação	são	indicadas	como	foi	expl i

cado nas notas da Tabela 3.

^b ug/ml

^c * Designa a morfologia das culturas de hibridomas, as outras crescem como linhas de células B transformadas (diplóides).

TABELA 5

Reactividade de anticorpos monoclonais humanos em secções de parafina de tumores .Colorectais (T) e Mucosa de Colon

a

Normal Correspondente (N)

Número de Paciente

Anti corpos monoclonais	2	6	7	B	10
N	T	N	T	N	T	N	T	N
6*3	+	-	-	ND	2+	-	2+	-	2+	-
7*2	-	ND	3+	‘ -	-	ND	4+	-	-	ND
7*4	-	ND	-	ND	-	ND	4+	-	-	ND
11B5	+	-	3+	-	3+	-	4+	2+	3+	4
12-38	-	ND	-	-	2+		2+	-	3+	-
12-42	-	ND	-	ND	2+	-	3+	-	2+
12-47	+	-	-	ND	+		2+'	-	-	iv.
12-53	-	ND	’ 3+	- ,	-	ND	+	-	-
15-24-2		ND	3-¼	-	' 4+	2+	3+	4	-
lá-4	-	ND	2+	-	+	-	3+	+	v
.1Í-5S	-	ND	4+		4+	-	2+	4	-
	-	SD	4+	-. -	+	4·'	3+
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*. -.3		*·	2+	-	4.	-	XT
18-15		-	2+	-	+	-	2+	+	4
18-21	-	ND	3+	+	2+	+	3+	+	4	4
18-22	-	ND	-	ND	+	-	-	ND	+	-
19b2 .	-	ND	-	ND	2+	+	4+	2+	-	ND
20A3 ;		-	4+	+	+	-	• 2+	-	4	-
20A6	3+	-	2+	-	2+	-	2+	-	2+
20B7	3+	+	2+	-	+	-	3+	*	+	+
21B27	2+	+	2+	-	-	ND	3+	+	-	ND
23A4	-	ND	2+	-	• 2+	-	2+	+	3+	-
27B1	2+		4-«-	*	3+	-·	4+	2+	3+
28A32	-		4+	-	+	-	-\	HD. A·.	4	-

Presença e grau de ligação são indicados como expjicado nas notas da Tabela 3.

I

-⁵⁷TABELA 6

Reactividade de Anticorpos Monoclonais Marcados com Biotina com Preparações de Cytospin de células huma nas de Tumor do coíon (T) e de Mucosa Normal (N)^a

Anticorpos Monoclonais

6a3 7a2 7a4 18-22 19b2

Pari ρ n t p

Número TN TN TN TN TN

18	+ -	+	+	+	+	+	+	+	+
21	3+ -	+	+	2+	-	+	+	+	-
24	2+ -	+	+	4+	-	2+	-	3+	-
25	+ -	+	-	+	+	2+	2+	+	+
26		-	-	+	+	-	-	+	-
27	2+ -	-	-	2+	-	2+	+	2+	2+
28	+ +	+	—	+	+	+	—	2+	+

A presença e grau de ligação são indicadas como nas notas da Tabela 3.

explicado

-58TABELA 7

Reactividade de Anticorpos Monoclonais Marcados com Biotina com Secções Congeladas de Tecidos de

Tumores do Cólon	(T)	e Normais	(N)a
				Anticorpos	Monoclonais
Fonte	6a3	7a2	7a4	18-22		19b2
do
tecido	T	N	T	N	T N	T N	T	N
Colon	+	-	-	-	2+ -	+	2+	+
II	3+	-	2+	-	3+	+ "	2+	-
II	3+	-	+	-	3+	3+	3+	-
II	2+	-	+	-	-	-	-	-
Mama		-		-	-	-		-
II		-		-	-	-		-
II
Estomago		-		-	-	-		+
Rim		-		-	-	-		-
Fígado		-		-	-	-		-
Musculo		-		-	-	-		-
Pele		-		-	-	-		-
II

a

A presença e grau de ligação são indicados como explica do nas notas da Tabela 3.

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a.

a

PBL foram obtidos 7 dias após cada imunização.

b

Produção de >1 pg/ml de imunoglobulina humana medida por ELISA.

c

Marcação com imunoperoxidase de preparações não fixadas secas ao ar de SW1463, HT-29 ou células de tumor dissociadas enzimáticamente.

d

Os isótipos foram determinados por ELISA.

e

Células diplóides, crescimento celular em aglomerados Células de hibridomas, crescimento como células disper.

sas.

Claims (11)

1. REIVINDICAÇÕES

   1^â. - Processo para a preparação de anticorpos monoclonais humanos tendo especificidade para antigénios específicos de tumor de um tumor humano não autólo go do mesmo tipo histológico, o qual se caracteriza pela cultura de uma célula que produz um anticorpo humano tendo especificidade para antigénios específicos de tumor de um tumor humano não autólogo do mesmo tipo histológico e, caso se dese je, remoção do produto.
2. 2^â. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se preparar um anticorpo monoclonal específico de um tumor do tipo carcinoma.
3. 3^â. - Processo de acordo com a

   reivindicação 1 ou 2, caracterizado por se preparar um anti corpo monoclonal tendo especificidade para antigénios turno rais mas não reactivo com antigénios CEA ou antigénios encontrados nos correspondentes tecidos normais.
4. 4^â. - Processo de acordo com " qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado por se preparar um anticorpo monoclonal tendo especificidade para de terminantes antigénios encontrados num tumor adenocarcinoma bem diferenciado seleccionado de um grupo constituído por car cinomas do pulmão, da mama e colo-rectal.
5. 5s. - Processo de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por se preparar um anticorpo monoclonal tendo especificidade para antigénios de superfície de células tumorais.

   62. - Processo de acordo com

   qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado por a cê lula ser um hibridoma.
6. 7^â. - Processo de acordo com a reivindicação 6, caracterizado por o hibridoma ser preparado por fusão de linfócitos B humanos com células de mieloma, em que os linfócitos B são obtidos a partir do sangue periférico de um ser humano que tenha sido inoculado com uma vacina compreendendo células tumorais viáveis não tumorais.
7. 8â. - Processo de acordo com a

   reivindicação 7, caracterizado por o ser humano ser um pacien te com cancro que foi inoculado com células do seu próprio tjj mor.
8. 9ã. - Processo de acordo com a reivindicação 7 ou 8, caracterizado por o hibridoma produzir anticorpos monoclonais que são específicos para antigênios de superfície de células tumorais.
9. 10^â. - Processo de acordo com

   qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado por a célula ser um linfócito B humano transformado.

   113. _ processo de acordo com

   a reivindicação 10, caracterizado por o linfócito B humano transformado, ou uma sua mutação, ser usado para a produção in vitro de anticorpos monoclonais específicos de tumor.
10. 12^â. - Processo de acordo com

    a reivindicação 11, caracterizado por o linfócito B transfor. mado possuir 46 cromossomas humanos.

    133. _ Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 a 12, caracterizado por a célula, que produz um anticorpo monoclonal humano tendo espe cificidade para antigênios específicos de tumor de um tumor humano não autólogo do mesmo tipo histológico, ser preparado por exposição de linfócitos B humanos, em condições de tran^

    -63formação, a células tumorais humanas viáveis não tumorigénias e selecção de um linfócito B transformado.
11. 14^â. - Um anticorpo monoclonal sempre que preparado segundo um processo como o reivindicado em qualquer uma das reivindicações 1 a 13.