PT802913E

PT802913E - Imidazo¬4,5|quinolinaminas

Info

Publication number: PT802913E
Application number: PT95942556T
Authority: PT
Inventors: Kyle J Lindstrom
Original assignee: Minnesota Mining & Mfg
Priority date: 1995-01-12
Filing date: 1995-12-06
Publication date: 2000-09-29
Also published as: NO308538B1; NO3198A; ATE192153T1; DE69516540D1; ZA96101B; CA2209487C; CZ220497A3; AU692033B2; HUT77667A; GR3033869T3; DE69516540T2; IL116566A0; US5482936A; WO1996021663A1; EP0802913A1; SK282145B6; SK87297A3; JPH10512256A; FI113866B; NO972801D0

Description

$02^1 õ

DESCRIÇÃO ”IMIDAZO[4,5-c]QUINOLINAMINAS”

Esta invenção refere-se a compostos de imidazo[4,5-c]quinolinami-nas. Noutro aspecto esta invenção relaciona-se com compostos imunomodula-dores. Noutros aspectos esta invenção relaciona-se com composições farmacêuticas contendo tais compostos e métodos farmacológicos de utilização de tais compostos.

Algumas lH-imidazo[4,5-c]quinolin-4-aminas são conhecidas como agentes antivirais e/ou imunomoduladores. Tais compostos são revelados, e.g., nas Patentes dos U.S. Nos. 4,698,338, 4,929,624, 5,037,986, 5,266,575, 5,268,376, 5,346,905, Pedido de Patente Europeia N°s. 0,385,630 A2 e W092/15582 (todas para Gerster et al.). O pedido de patente copendente cedido em conjunto com o presente pedido de patente 08/092,002 (Lindstrom et al.) revela imidazopiridinaminas imunomoduladoras de fórmula

-r2 em que Ri é seleccionado do grupo que consiste em hidrogénio; CHRxRy em que Rx é hidrogénio e Ry é seleccionado do grupo que consiste em alquilo de cadeia -2- linear, ramificada ou cíclico contendo de um a cerca de dez átomos de carbono, alcenilo de cadeia linear ou ramificada contendo de dois a cerca de dez átomos de carbono, hidroxialquilo de cadeia linear ou ramificada contendo de um a cerca de seis átomos de carbono, alcoxialquilo em que a entidade alcoxi contém um a cerca de quatro átomos de carbono e a entidade alquilo contém de um a cerca de seis átomos de carbono, e feniletilo; e -CH=CRZRZ em que cada Rz é independentemente, alquilo de cadeia linear, ramificada ou cíclico com um a cerca de seis átomos de carbono. A Patente dos U.S. N°. 5,352,784 (Nickolaides et al.) revela cicloalquilimidazopiridinaminas condensadas na posição 6,7 como imunomodu-ladores.

As lH-imidazo[4,5-c]quinolin-4-aminas são compostos de formula estrutural geral I, tendo o sistema de numeração mostrado:

N 3 * N1 I H 2 I

Esta invenção proporciona compostos e sais farmaceuticamente aceitáveis deles derivados por ligação das posições 1 e 2 de lH-imidazo[4,5-c]quinolin-4-aminas. Em particular esta invenção proporciona compostos de Fórmula II -3-

em que R, Z e q são como definido em detalhe abaixo, ou um seu sal farmaceuticamente aceitável.

Esta invenção também proporciona uma formulação farmacêutica compreendendo: (i) um composto de Fórmula II numa quantidade eficaz para induzir a biossíntese de interferão num animal, e (ii) um veículo farmaceuticamente aceitável. Esta invenção proporciona ainda a utilização de um composto de Formula II numa quantidade eficaz para a preparação de uma composição farmacêutica para induzir a biossíntese de interferão num animal.

Esta invenção proporciona compostos de Formula II em que Z é seleccionado do grupo que consiste em: -(CH2)n- em que n é 1 a 4, -(CH2)a-C(RiR2)(CH2)b-, em que a e b são inteiros e a+b é 0 a 3, Ri é hidrogénio ou alquilo com 1 a 4 átomos de carbono, e R2 é seleccionado do grupo que consiste em alquilo com 1 a 4 átomos de carbono, hidroxi, -OR3, em que R3 é alquilo com 1 a 4 átomos de carbono, e -NR4R4 em que R4 e R'4 são independentemente hidrogénio ou alquilo com 1 a 4 átomos de carbono, -(CH2)a-(Y)-(CH2)b-, em que a e b são inteiros e a+b é o a 3, e Y é O, S ou -NR5- em que R5 é hidrogénio ou alquilo com 1 a 4 átomos de carbono, e em que qéOouleRé seleccionado do grupo que consiste em -4- alquilo com 1 a 4 átomos de carbono, alcoxi com 1 a 4 átomos de carbono e halogénio, e sais farmaceuticamente aceitáveis dele derivados.

Quando Z é -(CH2)„- como definido acima, é preferencialmente um alquileno possuindo 1, 2 ou 3 átomos de carbono. Quando Z é -(CH2)a-C(RiR2)(CH2)b- como definido acima Ri é preferencialmente hidrogénio e R2 é preferencialmente alquilo com 1 a 4 átomos de carbono, mais preferencialmente metilo. Quando Z é -(CH2)a-(Y)-(CH2)b-, como definido acima, Y é preferencialmente O, e quando Y é O, a+b é preferencialmente 1.

Os compostos preferidos da invenção incluem: 8,9,10,11 -tetra-hidropirido[ 1 ',2': 1,2]imidazo[4,5-c]quinolin-6-amina, i.e.,

10-metil-8,9,10,11 -tetra-hidropirido[ 1 ',2': 1,2]imidazo[4,5-c]quinolin-6-amina, i.e.,

-5- 8H-9,10,11,12-tetra-hidrohexametileno-imino[ 1 ',2': 1,2]imidazo[4,5-c]quinolin-6-amina, i.e., -5-

-6- Ο Esquema Reaccional I ilustra a preparação dos compostos da invenção. O composto não substituído de Fórmula XI é um composto conhecido disponível comercialmente e outros compostos de Fórmula XI podem ser preparados por métodos conhecidos pelos técnicos na matéria e revelados, e.g., em Chem. Ber. 1927, 60, 1108 (Kohler) e J. Heterocvclic Chem. 1988, 25, 857 (Kappe).

No passo (i) um 3-nitroquinolino-2,3-dissulfonato é primeiro preparado por reacção de um 2,4-dihidroxi-3-nitroquinolino com um haleto de sulfo-nilo ou preferencialmente um anidrido sulfónico. Haletos de sulfonilo adequados incluem haletos de alquilsulfonilo tais como cloreto de metanossulfonilo e cloreto de trifluorometanossulfonilo, e haletos de arilsulfonilo tais como cloreto de benzenossulfonilo, cloreto de p-bromobenzenossul fonilo e cloreto de p-toluenos-sulfonilo. Anidridos sulfónicos adequados incluem aqueles que correspondem, aos acima mencionados haletos de sulfonilo. Um anidrido sulfónico particularmente preferido é o anidrido trifluorometanossulfónico.

Preferencialmente, as condições da reacção envolvem primeiro a combinação de um composto de Fórmula XI com uma base, preferencialmente um excesso de uma base amina terciária (e.g., uma base trialquilamina tal como a trietilamina) e preferencialmente num solvente apropriado como o diclorometano adicionando-se então o haleto de sulfonilo ou o anidrido sulfónico. A adição é preferencialmente efectuada de uma forma controlada (e.g., gota a gota) e a uma temperatura reduzida (e.g., a cerca de 0°C). -7-

ESQUEMA REACCIONAL I

II -8-

Faz-se então reagir o dissulfonato com a íerc-butilamina, preferencialmente em presença de um excesso de base amina terciária num solvente como o diclorometano para dar um composto de Fórmula XII. A reacção pode ser efectuada por adição da base amina terciária à mistura reaccional resultante da primeira porção do passo (i), arrefecendo-a até uma temperatura reduzida (e.g., 0°C), e adicionando a terc-butilamina de uma forma controlada (e.g., gota a gota). A reacção também pode ser efectuada por adição da terc-butilamina a uma solução do dissulfonato e uma base amina terciária num solvente como o diclorometano. A reacção pode decorrer a temperaturas relativamente baixas, e.g., cerca de 0°C, de modo a diminuir a quantidade de produtos secundários 2- r aminados e 2,4-aminados indesejados. E por vezes necessário ou desejável aquecer a mistura reaccional após a adição de modo a completar-se a reacção.

No passo (ii) faz-se reagir o composto de Fórmula XII com dibenzilamida. A reacção pode ser efectuada colocando o material de partida e a dibenzilamida num solvente inerte tal como benzeno, tolueno ou xileno, e aquecendo-os a uma temperatura e durante o tempo suficiente para causar a deslocação dos grupos sulfonados pela dibenzilamida, sendo a temperatura e duração facilmente seleccionados pelos técnicos na matéria. O grupo terc-butilo é então removido por aquecimento num solvente polar tal como o metanol em presença de um ácido tal como o ácido clorídrico. O grupo nitro é então reduzido a um grupo amino. Os métodos para tal redução são bem conhecidos pelos técnicos da matéria. Um método preferido envolve a geração in situ de Ni2B a partir de borohidreto de sódio e NiCl2 em metanol para dar uma solução de agente redutor. O composto nitro é adicionado à solução de agente redutor para se efectuar a redução do grupo nitro. O produto é um composto de Fórmula XIII.

No passo (iii) faz-se reagir um composto de Fórmula XIII com ácido acético ou um seu equivalente para dar o composto cíclico de Fórmula -9- XIV. Equivalentes adequados do ácido acético incluem os correspondentes hale-tos de acetilo e ortoésteres. Quando se utiliza ácido acético ou um ortoéster equivalente, a reacção pode ser efectuada na ausência de solvente ou num solvente inerte tal como xileno ou tolueno com aquecimento suficiente (e.g., 80-150°C dependendo do solvente, se algum) para remover qualquer álcool ou água formados como produtos secundários da reacção. Quando se utiliza um haleto de acetilo a reacção é preferencialmente efectuada em ácido acético com aquecimento.

No passo (iv) o composto cíclico de Fórmula XIV é primeiro substituído na posição 1 com um grupo alcoximetilo (-CH2OR' em que R' é alquilo tal como etilo) de modo a proteger o azoto 1. A substituição pode ser efectuada por tratamento do composto de Fórmula XIV com hidreto de sódio e um éter halometilalquílico tal como o éter clorometiletílico. O composto protegido em 1 resultante é então substituído no grupo metilo 2 com uma entidade de fórmula -ZC1 para dar um composto de Fórmula XV. Isto pode ser conseguido metalando o grupo metilo 2 do composto protegido em 1, e.g., tratando com «-butil-lítio em tetra-hidrofurano, adicionando depois um agente alquilante de fórmula X'-ZC1 em que X' é um grupo mais fácilmente substituível do que o cloro (e.g., X' pode ser bromo). Outro método adequado de substituir no grupo metilo 2 envolve metalação, reacção com um epóxido tal como o óxido de etileno, e conversão do composto 2-(hidroxialquilo) resultante para o haleto correspondente com um agente clorante tal como o cloreto de tionilo num solvente inerte.

No passo (v) a posição 1 do composto de Fórmula XV é desprotegida, e.g., por aquecimento em presença de HC1 num solvente como o metanol. O composto resultante com hidrogénio em 1 é então ciclizado por deslocamento formal do grupo cloro pelo azoto em 1. O tratamento com iodeto de sódio num solvente polar como a acetona em presença de uma base neutralizante (e.g., carbonato de potássio) é um meio adequado para efectuar a ciclização. Resulta num composto de Fórmula XVI. -10-

No passo (vi) o composto de Fórmula XVI é hidrogenado para dar o correspondente composto 4-amina de Fórmula II. As condições convencionais e bem conhecidas para hidrogenação catalítica são adequadas. As condições preferidas envolvem aquecimento em ácido fórmico em presença de Pd(OH2)/C. O Esquema Reaccional II mostra uma via para certos compostos da invenção não preparáveis via Esquema Reaccional I.

ESQUEMA REACCIONAL II

OH

XXIV -11 -

No passo (i) um composto de Fórmula XIII é ciclizado utilizando ácido fórmico ou um seu equivalente tal como um ortoformato (e.g., ortoformato de trietilo) para dar um composto de Fórmula XXI (ver, e.g., passo (iii) do Esquema Reaccional I). No passo (ii) o composto de Fórmula XXI é protegido na posição 1 como descrito acima em ligação com o passo (iv) do Esquema Reaccional 1. O produto protegido é então formilado na posição 2 primeiro metalando num solvente polar tal como tetra-hidrofurano, e.g., reagindo com n-butil-lítio, e depois tratando com formaldeído. O passo (iii) envolve a homologação do substituínte 2 do composto de Fórmula XXII, e.g., por reacção com l-bromo-2-(trifenilmetoxi)etano. O produto de fórmula XXIII pode ser transformado num composto de Fórmula II por hidrólise catalisada por ácido dos grupos protectores para dar um composto de Fórmula XXIV, conversão do grupo hidroxilo no substituínte 2 num grupo de saída apropriado, ciclização (e.g., como descrito acima em conecção com o passo (v) do Esquema Reaccional I), e clivagem redutiva como descrito acima em ligação com o passo (vi) do Esquema Reaccional I.

Os compostos de Fórmula II não susceptíveis de serem preparados pelas vias ilustradas nos Esquemas Reaccionais I ou II, ou de outro modo aqui descrito, podem ser preparados utilizando variações dos esquemas ilustrativos envolvendo alternativas sintéticas bem conhecidas, alteração da ordem dos passos, e outras semelhantes. O produto composto de fórmula II pode ser isolado pelos meios convencionais revelados na Pat. dos U.S. N°. 4,689,338 (Gerster), tal como, por exemplo, remoção do solvente e recristalização a partir de um solvente apropriado (e.g., Ν,Ν-dimetilformamida) ou de uma mistura de solventes, ou por dissolução num solvente apropriado (tal como metanol) e reprecipitação por adição de um segundo solvente no qual o composto seja insolúvel. - 12- O composto de fórmula II pode ser ele próprio utilizado como um antiviral ou pode ser utilizado na forma de um sal farmaceuticamente aceitável tal como cloridrato, diidrogenosulfato, trihidrogenosulfato, nitrato de hidrogénio, metanossulfonato ou um sal de outro ácido farmaceuticamente aceitável. Um sal farmaceuticamente aceitável de um composto de Fórmula II pode ser facilmente preparado, geralmente por reacção do composto com uma quantidade equimolar de um ácido relativamente forte, preferencialmente um ácido inorgânico tal como o ácido clorídrico, sulfurico ou fosfórico, ou um ácido orgânico tal como o ácido metanossulfónico, num solvente polar. O isolamento do sal é facilitado pela adição de um solvente, tal como éter dietílico, em que o sal é insolúvel.

Um composto da invenção pode ser formulado para as diversas vias de administração (e.g., administração oral por comprimido, cápsula, suspensão oral, ou outros semelhantes, tópica, transdérmica ou parenteral) combinando uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto de Fórmula II com um veículo farmaceuticamente aceitável apropriado incluindo quaisquer adjuvantes e excipientes adequados para a forma de dosagem seleccionada. Formulações adequadas incluem soluções parenterais, cremes tópicos, geles, pomadas, e comprimidos e cápsulas orais. Os métodos de manufactura de tais composições farmacêuticas são bem conhecidos dos técnicos na matéria e revelados, e.g., em Remington's Pharmaceutical Sciences, 18a. Edição, 1990, Mack Publishing Company, A. R. Gennaro, Editor. Consequentemente, formulações particulares adequadas para uma via seleccionada podem ser facilmente identificadas e preparadas pelos técnicos na matéria. Uma forma de dosagem sólida, por exemplo, contém um composto de Fórmula II, e um ou mais diluentes (e.g., fosfato dicálcico, sulfato de cálcio, lactose, manitol, celulose, caulino, cloreto de sódio, amido, sacarose, inositol, sorbitol), ligantes (e.g., amido, gelatina, sacarose, glucose, dextrose, melaço, lactose, gomas naturais e sintéticas), lubrificantes (e.g., talco, estearato de magnésio, estearato de cálcio, ácido esteárico, óleos vegetais hidrogenados, polietileno glicóis), desintegrantes (e.g., amido de milho, amido de batata, argilas, celulose, alginatos), agentes corantes e agentes aromatizantes. Uma solução parenteral contém um composto de Fórmula II e um veículo aquoso farmaceuticamente aceitável incluindo excipientes adequados, tais como ácidos (ácido clorídrico, ácido láctico, ácido acético, ácido aspártico ou misturas deles) ou bases (hidróxido de sódio) suficientes para se conseguir um pH de 2 a cerca de 6 e ajustadores da tonicidade (e.g., sorbitol ou glicerina) de modo que a formulação seja isotónica com o soro. As formulações tópicas ou transdérmicas contêm um composto de Fórmula II num creme, pomada ou numa composição adesiva sensível à pressão. Um creme pode conter emolientes (e.g., álcool cetílico, álcool estearílico, vaselina, óleo mineral leve, lanolina acetilada), emulsionantes (e.g., surfactantes não iónicos tais como o polisorbato 60, monoestearato de sorbitano), espessantes (e.g., argilas de montmorilonite ou alcoóis de cadeia longa tais como álcool cetearílico, álcool cetílico e álcool estearílico) em quantidades fácilmente seleccionáveis pelos técnicos na matéria. Uma pomada contém uma base de pomada (e.g., polietileno glicol, vaselina) e emolientes e espessantes. A quantidade de composto de Fórmula II que constitui uma quantidade terapeuticamente eficaz variará de acordo com o composto particular utilizado, o efeito terapêutico desejado, o estado a ser tratado, o regime de dose e a via de administração. Geralmente, um composto de Fórmula II estará presente numa formulação parenteral numa quantidade de cerca de 0,1 até cerca de 10 por cento em peso baseado no peso total da formulação. Similarmente, um comprimido ou cápsula oral conterá geralmente desde cerca de 0,5 até cerca de 50 por cento em peso; e uma formulação tópica ou transdérmica conterá desde cerca de 0,1 até cerca de 10 por cento em peso. Formulações particulares serão facilmente seleccionadas pelos técnicos na matéria. - 14-

Um número de compostos de Fórmula II foram testados e verificou-se que induziram a biossíntese de interferão em células humanas e em ratinho. Estes resultados sugerem que os compostos da invenção podem ser úteisno tratamento de doenças virais (e.g., hepatite, herpes, verrugas) e doenças como a artrite reumatóide, eczema, psoriase, esclerose múltipla, trombocitémia essencial, cancro tal como carcinoma das células basais e outras doenças neoplásicas.

Os exemplos abaixo tentam ilustrar a invenção. As estruturas foram confirmadas por espectroscopia de ressonância magnética nuclear.

Exemplo 1

8.9.10.11 -T etra-hidropiridor 1 '.2': 1.21imidazor 4.5-clquinolin-6-amina Parte A

Adicionou-se trietilamina (84 mL, 0,6 mol) a uma suspensão de 3-nitro-2,4-quinolinodiol (40 g, 0,194 mol) em cloreto de metileno (1200 mL). A solução resultante foi arrefecida num banho de gelo e adicionou-se anidrido trifluorometanossulfónico (67,2 mL, 0,40 mol). Depois de se ter completado a adição, a mistura reaccional foi aquecida num banho de vapor durante 10 minutos e novamente arrefecida num banho de gelo. Adicionou-se terc-butilamina (42 mL, 0,4 mol) e a mistura reaccional foi aquecida num banho de vapor durante 15 minutos. A mistura reaccional foi lavada com bicarbonato de sódio aquoso (500 mL), seca sobre sulfato de magnésio e depois concentrada sob vácuo. O concentrado foi passado por uma camada de sílica gel e a sílica gel foi eluída com cloreto de metileno. A solução de cloreto de metileno foi evaporada sob vácuo para dar 54 g de [4-(l,l-dimetiletil)amino-3-quinolino-2-il]trifluorometanossul-fonato. - 15-

Parte B

Adicionou-se trietilamina (19,2 mL, 0,137 mol) a uma solução de [4-(l,l-dimetiletil)amino-3-quinolino-2-il]trifluorometanossulfonato (54 g, 0,137 mol) em tolueno (cerca de 1 L). Adicionou-se dibenzilamida (27 mL, 0,137 mol) e a mistura reaccional foi aquecida em refluxo durante cerca de 2 horas. A mistura reaccional foi concentrada sob vácuo. O resíduo foi diluído com metanol (900 mL). Adicionou-se ácido clorídrico (100 mL a 6N) e a mistura reaccional foi aquecida em refluxo durante 1 hora. A mistura reaccional foi agitada à temperatura ambiente de um dia para o outro. O precipitado resultante foi isolado por filtração, lavado com metanol e seco para dar 42,1 g de cloridrato de N ,N -bis(fenilmetil)-3-nitroquinolino-2,4-diamina como um sólido amarelo.

Parte C

Adicionou-se cuidadosamente borohidreto de sódio (5,5 g, 0,147 mmol) a uma solução contendo cloreto de níquel (II) hidratado (11,9 g, 0,05 mol) em metanol (1200 mL). O cloridrato de N2,N2-bis(fenilmetil)-3-nitroquinolino-2,4-diamina (42,1 g, 0,1 mol) foi retomado numa mistura de cloreto de metileno (400 mL) e metanol (200 mL) e adicionado ao reagente de borato de níquel. Adicionou-se cuidadosamente borohidreto de sódio até descoloração da espuma gerada. A mistura reaccional foi filtrada através de uma camada de agente de filtração Celite™. O filtrado foi concentrado sob vácuo. O resíduo foi partilhado entre cloreto de metileno e água. A camada de cloreto de metileno foi seca sobre sulfato de magnésio e concentrada sob vácuo. O resíduo foi retomado em éter dietílico (cerca de 1200 mL). Fez-se borbulhar gás clorídrico através da solução de éter durante 5 minutos. O precipitado resultante foi recolhido e seco para dar 32 g de cloridrato de N2,N2-bis(fenilmetil)quinolino-2,3,4-triamina. -16-

Parte D

Adicionou-se trietilamina (3,6 mL, 25,6 mol) a uma suspensão de cloridrato de N2,N2-bis(fenilmetil)quinolino-2,3,4-triamina (5 g, 12,8 mmol) em ácido acético (120 mL). Adicionou-se cloreto de acetilo (0,19 mL, 12,8 mmol) e a mistura reaccional foi aquecida em refluxo durante 5 a 6 horas e depois concentrada sob vácuo. O resíduo foi repartido entre éter dietílico e solução aquosa saturada de bicarbonato de sódio. A camada de éter foi seca e depois concentrada sob vácuo. O resíduo foi purificado por cromatografia em coluna (sílica gel eluindo com cloreto de metileno contendo 1-5% (v/v) de acetato de etilo) para dar cerca de 2,4 g de N.N-bis(fenilmetil)-2-metil-lH-imidazo[4,5-c] quinolino-4-amina.

Parte E

Arrefeceu-se uma suspensão de hidreto de sódio (0,064 g, 2 mmol) em tetra-hidrofurano (15 mL) num banho de gelo. Adicionou-se N,N-bis(fenil-metil)-2-metil-lH-imidazo[4,5-c]quinolmo-4-amina (0,5 g, 1,32 mmol) e deixou-se a mistura reaccional aquecer até à temperatura ambiente durante 20 minutos. Adicionou-se éter clorometiletílico e a mistura reaccional foi agitada durante 30 minutos. A mistura reaccional foi diluída com éter dietílico, lavada duas vezes com água, seca sobre sulfato de magnésio e concentrada sob vácuo. O resíduo foi purificado por cromatografia em coluna (sílica gel eluindo com cloreto de metileno) para dar 0,43 g de N.N-bis(fenilmetil)-l-etoximetil-2-metil-lH-imidazo[4,5-c]quinolino-4-amina.

Parte F

Uma solução de N.N-bis(fenilmetil)-l-etoximetil-2-metil-lH-imi-dazo[4,5-c]quinolino-4-amina (1,12 g, 2,56 mmol) em tetra-hidrofurano (20 mL) -17- foi arrefecida a -78°C sob atmosfera de azoto. Adicionou-se butil-lítio (1,03 mL de 2,5 M em hexanos, 2,56 mmol) e a mistura reaccional foi agitada durante 5 minutos. Adicionou-se l-bromo-3-cloropropano (2,7 mL, 25 mmol) e deixou-se a mistura reaccional aquecer até à temperatura ambiente. Quando a reacção se completou, como indicado por cromatografia em camada fina (sílica gel, 30% de acetato de etilo em hexanos (v/v)), a mistura reaccional foi diluída com éter dietílico e água. A camada de éter foi separada, seca sobre sulfato de magnésio e concentrada sob vácuo. O resíduo resultante foi purificado por cromatografia em coluna (sílica gel eluíndo com 10-20% de acetato de etilo em hexanos (v/v)) para dar 0,76 g de N.N-bis(fenilmetil)-2-(4-clorobutil)-l-etoximetil-lH-imidazo[4,5-c]quinolino-4-amina.

Parte G

Adicionou-se metanol (vários mL) a uma suspensão de N.N-bis(fenilmetil)-2-(4-clorobutil)-1 -etoximetil-1 H-imidazo[4,5-c]quinolino-4-amina (0,76 g, 1,5 mmol) em ácido clorídrico 3N (20 mL). A mistura reaccional foi aquecida num banho de vapor durante 4 horas e depois partilhada entre cloreto de metileno e solução aquosa saturada de bicarbonato de sódio. A camada de cloreto de metileno foi separada, seca sobre sulfato de magnésio e concentrada sob vácuo para dar 0,64 g de N.N-bis(fenilmetil)-2-(4-clorobutil)-lH-imidazo[4,5-c]quinolino-4-amina

Parte H

Adicionaram-se iodeto de sódio (1 g, 6 mmol) e carbonato de potássio (0,8 g, 6 mmol) a uma solução de N.N-bis(fenilmetil)-2-(4-clorobutil)-lH-imidazo[4,5-c]quinolino-4-amina (0,55 g, 1,2 mmol) em acetona. A mistura reaccional foi aquecida em refluxo durante 4 horas, filtrada e concentrada sob vácuo. O resíduo foi purificado por cromatografia “flash” (sílica gel eluindo com 10-15% de acetato de etilo em hexanos (v/v). A espectroscopia de ressonância magnética nuclear indicou a possível presença de iodo intermédio; assim o resíduo foi retomado em acetona, combinado com iodeto de sódio e carbonato de potássio e aquecido em refluxo de um dia para o outro. A reacção foi processada para dar 0,38 g de N.N-bis(fenilmetil)-8,8,10,ll tetra-hidropirido[r,2':l,2]imida-zo[4,5-c]quinolin-6-amina.

Parte I

Adicionou-se hidróxido de paládio em carbono (0,35 g) a uma solução de N.N-bis(fenilmetil)-8,9,10,ll tetra-hidropirido[l\2':l,2]imidazo[4,5-c]quinolin-6-amina em ácido fórmico (cerca de 15 mL). A mistura reaccional foi aquecida em refluxo durante 3 dias e depois diluída com cloreto de metileno e tomada básica (pH a cerca de 9) com hidróxido de sódio a 10%. A camada de cloreto de metileno foi separada, seca sobre sulfato de magnésio e concentrada sob vácuo para dar um sólido branco. O material foi purificado por cromatografia em coluna (sílica gel eluindo com 4-10% de metanol em cloreto de metileno (v/v)), para dar um sólido. O sólido foi suspenso em cloreto de metileno (20 mL) isolado por filtração e seco para dar 70 mg de 8,9,10,11 tetra-hidropirido-[l',2':l,2]imidazo[4,5-c]quinolin-6-amina como um sólido, p.f. 275-278°C. Calculada para Ci4H14N4 + 0,2 CH2C12: %C, 66,81; %H, 5,69; %N, 21,95; Encontrada: %C, 67,06; %H, 5,60; %N, 22,18.

Exemplo 2

10 Metil-8.9.10.11 tetra-hidropirido|~ Γ.2': 1.21imidazor4.5-clquinolin-6-amina Parte A

Uma solução de N,N-bis(fenilmetil)-l-etoximetil-2-metil-lH-imi-dazo[4,5-c]quinolino-4-amina (1,8 g, 4,12 mmol, Exemplo 1 Parte E) em tetra- - 19- hidrofurano (40 mL) foi arrefecida a -78°C. Adicionou-se butil-lítio (1,7 mL de 2,5 M em hexanos, 4,3 mmol) e a mistura reaccional foi agitada durante 20 minutos. Adicionou-se l-bromo-3-cloro-2-metilpropano (4,8 mL, 42 mmol) e deixou-se que a mistura reaccional aquecesse até à temperatura ambiente durante um período de 1 hora. A mistura reaccional foi diluída com éter dietílico e água. A camada de éter foi separada, seca sobre sulfato de magnésio e depois concentrada sob vácuo. O resíduo resultante foi purificado por cromatografia “flash” (sílica gel eluindo com 5-20% de acetato de etilo em hexanos (v/v)) para dar 0,65 g de N,N-bis(fenilmetil)-2-(4-cloro-3-metilbutil)-l-etoximetil-lH-imidazo[4,5-c]quinolino-4-amina.

Parte B

Adicionou-se ácido clorídrico (80 mL de 6N) a uma suspensão de N,N-bis(fenilmetil)-2-(4-cloro-3-metilbutil)-l-etoximetil-lH-imidazo[4,5-c]qui-nolino-4-amina (0,64 g, 1,2 mmol) em metanol (40 mL). A mistura reaccional foi aquecida em refluxo durante 2 horas (todo o metanol foi removido durante este período), diluída com cloreto de metileno e tomada básica com hidróxido de sódio a 10%. A camada de cloreto de metileno foi separada, seca sobre sulfato de magnésio e concentrada para dar cerca 0,5 g de N,N-bis(fenilmetil)-2-(4-cloro-3-metilbutil)-lH-imidazo[4,5-c]quinolino-4-amina.

Parte C

Um grande excesso (cerca de 10 vezes) tanto de iodeto de sódio como de carbonato de potássio foram adicionados a uma solução de N,N-bis(fenilmetil)-2-(4-cloro-3-metilbutil)-lH-imidazo[4,5-c]quinolino-4-amina (cerca de 0,5 g) em acetona (cerca de 75 mL). A mistura reaccional foi aquecida em refluxo de um dia para o outro, diluída com acetona adicional, filtrada e concentrada sob vácuo. O resíduo foi lavado com cloreto de metileno para recuperar o produto a partir dos sais e purificado por cromatografia em coluna (sílica gel eluíndo com 3% de acetato de etilo em cloreto de metileno (v/v)) para dar 0,35 g de N,N-bis(fenihnetil)-8,9,10,ll-tetra-hidro-10-metilpirido[r,2':l,2]-imidazo[4,5-c]quinolin-6-amina.

Parte D

Adicionou-se hidróxido de paládio sobre carbono (0,35 g) a uma solução de N,N-bis(fenilmetil)-8,9,10,11-tetra-hidro-10-metilpirido[ 1 ',2': 1,2]imi-dazo[4,5-c]quinolin-6-amina (0,35 g, 0,809 mmol) em ácido fórmico (cerca de 15 mL). A mistura reaccional foi aquecida em refluxo durante 3 dias, diluída com uma mistura de metanol e água e filtrada através de agente de filtração Celite™. O filtrado foi concentrado sob vácuo e tomado básico com hidróxido de sódio a 10%. O precipitado resultante foi isolado por filtração e purificado por cromatografia em coluna (sílica gel eluindo com 2-5% de metanol em cloreto de metileno (v/v)) para dar 0,1 g de 10-metil-8,9,10,ll-tetra-hidropirido[r,2':l,2]-imidazo[4,5-c]quinolin-6-amina como um sólido, p.f. 279-281°C. Calculada para C]5H]6N4: %C, 71,40; %H, 6,39; %N, 22,20; Encontrada: %C, 71,10; %H, 6,46; %N, 22,25.

Exemplo 3

Hidrato de 8H-9.10.11.12-tetra-hidrohexametileno-iminor 1 '.2': 1.21imidazor4.5-clquinolin-6-amina

Parte A

Uma solução de N,N-bis(fenilmetil)-l-etoximetil-2-metil-lH-imi-dazo[4,5-c]quinolino-4-amina (1,5 g, 3,43 mmol, Exemplo 1 Parte E) em tetra-hidrofurano (30 mL) foi arrefecida a -78°C. Adicionou-se gota a gota butil-lítio (1,4 mL de 2,5 M em hexanos, 3,5 mmol) seguido pela adição de l-bromo-4-clorobutano (4 mL, 34 mmol). Deixou-se que a mistura reaccional aquecesse até à temperatura ambiente e foi parada com éter dietílico e água. A camada de éter foi separada, seca sobre sulfato de magnésio e depois concentrada sob vácuo. O resíduo resultante foi purificado por cromatografia em coluna (sílica gel eluíndo com 10% de acetato de etilo em hexanos (v/v)) para dar 1,5 g de N,N-bis(fe-nilmetil)-2-(5-cloropentil)-1 -etoximetil- lH-imidazo[4,5-c]quinolino-4-amina.

Parte B

Uma suspensão de N,N-bis(fenilmetil)-2-(5-cloropentil)-l-etoximetil-lH-imidazo[4,5-c]quinolino-4-amina (1,5 g, 3 mmol) em ácido clorídrico 6N (100 mL) foi aquecida em refluxo durante 1 hora. A mistura reaccional foi arrefecida, diluída com cloreto de metileno, tomada básica com hidróxido de sódio a 10% e depois extraída com cloreto de metileno (400 mL no total). Os extractos de cloreto de metileno foram combinados, secos sobre sulfato de magnésio e concentrados sob vácuo para dar cerca 1,3 g de N,N-bis(fenilmetil)-2-(5-cloropentil)-1 H-imidazo [4,5-c] quinolino-4-amina.

Parte C

Utilizando o método do Exemplo 2 Parte C , a N,N-bis(fenilmetil)-2-(5-cloropentil)-lH-imidazo[4,5-c]quinolinc>-4-ainina (1,3 g, 3 mmol) foi cicli-zada para dar 1,1 g N,N-bis(fenihnetil)-8H-9,10,11,12-tetra-hidrohexametileno-imino[r,2':l,2]imidazo[4,5-c]quinolin-6-amina como um sólido branco.

Parte D

Adicionou-se hidróxido de paládio em carbono (1 g) a uma solução de N,N-bis(fenilmetil)-8H-9,10,11,12-tetra-hidrohexametileno-imino[ Γ,2': 1,2]- imidazo[4,5-c]quinolin-6-amina (1 g, 2,3 mmol) em ácido fórmico (cerca de 30 mL). A mistura reaccional foi aquecida em refluxo durante 4 dias, filtrada, lavada com metanol/cloreto de metileno e depois concentrada sob vácuo. O resíduo foi partilhado entre cloreto de metileno e hidróxido de sódio a 10%. A camada de cloreto de metileno foi separada, seca sobre sulfato de magnésio e concentrada sob vácuo. O resíduo foi purificado por cromatografia em coluna (sílica gel eluíndo com 3-10% de metanol em cloreto de metileno (v/v)) para dar 0,4 g de hidrato de 8H-9,10,11,12-tetra-hidrohexametileno-imino[ 1 ',2': 1,2]imidazo[4,5-c]quinolin-6-amina com um sólido branco , p.f. 237-240°C. Calculada para C15H16N4 + 1/3 H20: %C, 69,74; %H, 6,50; %N, 21,69; Encontrada: %C, 69,74; %H, 6,27; %N, 21,37.

Exemplo 4

Hidrato de 9,10-dihidro-8H-pirrolor 1 '.2': 1.21imidazor4.5-clquinolin-6-amina Parte A

Uma solução de N,N-bis(fenilmetil)-l-etoximetil-2-metil-lH-imi-dazo[4,5-c]quinolino-4-amina (1,7 g, 3,9 mmol, Exemplo 1 Parte E) em tetra-hidrofurano (50 mL) foi arrefecida a -78°C. Adicionou-se butil-lítio (1,6 mL de 2,5 M em hexanos, 4,1 mmol) gota a gota e a mistura reaccional foi agitada durante 5 minutos. Fez-se correr óxido de etileno sobre a superfície da mistura reaccional. Após 10 minutos deixou-se a mistura reaccional aquecer até à temperatura ambiente. A adição de óxido de etileno foi parada quando a temperatura da reacção atingiu os 0°C. A mistura reaccional foi parada com éter dietílico e água. A camada de éter foi separada, seca sobre sulfato de magnésio e depois concentrada sob vácuo. O resíduo resultante foi purificado por cromatografia em coluna (sílica gel eluindo com 5-10% de acetato de etilo em cloreto de metileno (v/v)) para dar 1,4 g de N,N-bis(fenilmetil)-2-(3-hidroxipropil)-l-etoximetil-lH-imidazo[4,5-c]quinolino-4-amina.

Parte B

Adicionou-se cloreto de tionilo (5 mL, 68 mmol) a N,N-bis(fenilmetil)-2-(3-hidroxipropil)-1 -etoximetil- lH-imidazo[4,5-c]quinolino-4-amina (1 g, 2,1 mmol) e a mistura reaccional foi agitada rapidamente até a cromatografia em camada fina (sílica gel, 10% de acetato de etilo em cloreto de metileno (v/v)) indicar que a reacção estava completa. A mistura reaccional foi diluída com cloreto de metileno e depois neutralizada com hidróxido de sódio a 10% e bicarbonato de sódio. A camada de cloreto de metileno foi separada, seca sobre sulfato de magnésio e depois concentrada sob vácuo. O resíduo foi purificado por cromatografia em coluna (sílica gel eluindo com 10-30% de acetato de etilo em hexanos (v/v) para dar 1 g de N,N-bis(fenilmetil)-2-(3-cloropropil)-1 -etoximetil-1 H-imidazo[4,5-c]quinolino-4-amina.

Parte C

Uma suspensão de N,N-bis(fenilmetil)-2-(3-cloropropil)-l-etoxi-metil-lH-imidazo[4,5-c]quinolino-4-amina (1 g, 2,0 mmol) em ácido clorídrico 6N (80 mL) foi aquecida em refluxo durante 2 horas e depois agitada à temperatura ambiente de um dia para o outro. A mistura reaccional foi neutralizada com hidróxido de sódio a 10% e depois extraída com cloreto de metileno. O extracto foi seco sobre sulfato de magnésio e depois concentrado sob vácuo para dar 0,8 g de N,N-bis(fenilmetil)-2-(3-cloropropil)-lH-imidazo[4,5-c]quinolino-4-amina. -24-

Parte D

Adicionou-se carbonato de potássio (excesso de 10X) e iodeto de sódio (excesso de 5X) a uma solução de N,N-bis(fenilmetil)-2-(3-cloropropil)-lH-imidazo[4,5-c]quinolino-4-amina (0,8 g, 1,8 mmol) em acetona. A mistura reaccional foi aquecida em refluxo durante 2 horas, filtrada e concentrada sob vácuo. O resíduo foi repartido entre cloreto de metileno e água. A camada de cloreto de metileno foi separada, seca sobre sulfato de magnésio e concentrada sob vácuo. O resíduo foi purificado por cromatografia em coluna (sílica gel eluindo com 10-30% de acetato de etilo em hexanos (v/v)) para dar 0,25 g de N,N-bis(fenilmetil)-9,10-dihidro-8H-pirrolo[ Γ,2': 1,2]imidazo[4,5-c]quinolin-6-amina.

Parte E

Adicionou-se hidróxido de paládio em carbono (0,5 g) a uma solução de N,N-bis(fenilmetil)-9,10-dihidro-8H-pirrolo[ 1 ',2': 1,2]imidazo[4,5-c]quinolin-6-amina (0,25 g, 0,62 mmol) em ácido fórmico (75 mL). A mistura reaccional foi aquecida em refluxo durante 4 dias, diluída com metanol e filtrada. O filtrado foi concentrado sob vácuo depois misturado com água e bicarbonato de sódio. Um precipitado cinzento foi isolado por filtração. O filtrado foi concentrado, o resíduo resultante foi suspenso com uma mistura de metanol e cloreto de metileno e depois filtrado. O filtrado foi combinado com o precipitado cinzento isolado préviamente e purificado por cromatografia em coluna (sílica gel eluindo com 3-5% de metanol em cloreto de metileno (v/v) para dar 80 mg de N,N-bis(fenilmetil)-9,10-dihidro-8H-pirrolo[ Γ,2': 1,2]imidazo[4,5-c]quinolin-6-amina como um sólido branco, p.f. 275-277°C. Análise: Calculada para C13H12N4 + 1/3 H20: %C, 67,81; %H, 5,54; %N, 24,33; Encontrada: %C, 68,80; %H, 5,26; %N, 24,28.

Exemplo 5 10,1 l-Dihidro-8H-Γ1.41-oxazinoΓ4^3,: 1.21imidazor4.5-clquinolin-6-amina

Parte A Λ Λ

Uma suspensão de cloridrato de N ,N -bis(fenilmetil)quinolino-2,3,4-triamina (10 g, 25,6 mmol, Exemplo 1 Parte C) em ortoformato de trietilo (40 mL) foi aquecida a cerca de 120°C durante 30 minutos, arrefecida até à temperatura ambiente e diluída com éter dietílico. O precipitado resultante foi isolado por filtração e partilhado entre hidróxido de amónio e cloreto de metileno. A camada de cloreto de metileno foi separada, lavada duas vezes com água, seca sobre sulfato de magnésio e depois concentrada sob vácuo para dar 8,6 g de N,N-bis(fenilmetil)-lH-imidazo[4,5-c]quinolino-4-amina como um sólido castanho escuro.

Parte B

Adicionou-se uma suspensão de N,N-bis(fenihnetil)-lH-imidazo-[4,5-c]quinolino-4-amina (2 g, 5,49 mmol) em tetra-hidrofurano (10 mL) a uma suspensão de hidreto de sódio (0,21 g, 6,58 mmol) em tetra-hidroíurano (25 mL). Após 30 minutos adicionou-se éter clorometil etilico (0,61 mL, 6,58 mmol) e a mistura reaccional foi agitada durante 2 horas. A mistura reaccional foi diluída com éter dietílico, lavada com água, seca sobre sulfato de magnésio e depois concentrada sob vácuo para dar o produto crú como um óleo castanho. O óleo foi purificado por cromatografia em coluna (sílica gel eluíndo com 20-30% de acetato de etilo em hexanos (v/v)) para dar 1,77 g de N,N-bis(fenilmetil)-l-etoximetil-lH-imidazo[4,5-c]quinolino-4-amina como um sólido branco/acas-tanhado. -26-

Parte C

Adicionou-se butil-lítio (1,6 mL de 2,5 M em hexanos, 4 mmol) a uma solução arrefecida (gelo seco/acetona) de N,N-bis(fenilmetil)-l-etoximetil-lH-imidazo[4,5-c]quinolino-4-amina (1,7 g, 4 mmol) em tetra-hidrofurano. Não se observou mudança de cor. A mistura reaccional foi aquecida até -20°C (gelo seco/tetracloreto de carbono) e a mistura reaccional tomou-se vermelha. Adicionou-se formaldeído gasoso arrastado por uma corrente de azoto à mistura reaccional. Após vários minutos a mistura reaccional tomou-se numa massa sólida e o banho de gelo foi removido. Deixou-se a mistura reaccional aquecer até à temperatura ambiente e a cor da mistura reaccional mudou de vermelho para amarelo. A mistura reaccional foi diluída com éter dietílico e água. A camada de éter foi separada, seca sobre sulfato de magnésio e concentrada sob vácuo. O resíduo foi purificado por cromatografia em coluna (sílica gel eluíndo com 10-20% de acetato de etilo em hexanos (v/v) para dar 1 g de 4-bis(fenilmetil)amino-1 -etoximetil-1 H-imidazo[4,5-c]quinolino-2-metanol.

Parte D

Adicionou-se hidreto de sódio (0,11 g, 3,3 mmol) a uma solução de 4-bis(fenilmetil)amino-l-etoximetil-lH-imidazo[4,5-c]quinolino-2-metanol (1 g, 2,21 mmol) em N,N-dimetilformamida (15 mL) e a mistura resultante foi agitada durante 10 minutos. Adicionou-se l-bromo-2-(tritiloxi)etano e continuou-se a agitação à temperatura ambiente durante 3-4 horas. A reacção foi parada com éter dietílico e água. A camada de éter foi separada, lavada várias vezes com água, seca sobre sulfato de magnésio e concentrada sob vácuo. O resíduo foi purificado por cromatografia em coluna (sílica gel eluíndo com 10-30% de hexanos (v/v)) para dar 1,1 g de N,N-bis(fenilmetil)-l-etoximetil-2-[(2-trifenilmetoxi)etoxi]me-til-1 H-imidazo[4,5-c]quinolino-4-amina. -27-

Parte E

Uma suspensão de N,N-bis(fenilmetil)-l-etoximetil-2-[(2-trifenil-metoxi)etoxi]metil-lH-imidazo[4,5-c]quinolino-4-amina (1,1 g, 1,5 mmol) em ácido clorídrico 6N (25 mL) foi aquecido num banho de vapor durante 1,5 horas. A mistura reaccional foi neutralizada até pH 7 e extraída com cloreto de metileno. O extracto foi seco e concentrado sob vácuo. O resíduo foi purificado por cromatografia em coluna (sílica gel eluíndo com 10-50% de acetato de etilo em hexanos (v/v)) para dar 0,5 g de N,N-bis(fenilmetil)-l-etoximetil-2-(2-hidroxietoxi)metil-lH-imidazo[4,5-c]quinolino-4-amina.

Parte F

Adicionou-se trietilamina (0,17 mL, 1,25 mmol) a uma solução de N,N-bis(fenilmetil)-1 -etoximetil-2-(2-hidroxietoxi)metil- lH-imidazo[4,5-c]qui-nolino-4-amina (0,5 g, 1,14 mmol) em cloreto de metileno (20 mL). Adicionou-se cloreto de metanossulfonilo (0,09 mL, 1,14 mmol) e a mistura reaccional foi agitada à temperatura ambiente durante 1 hora. A mistura reaccional foi diluída com cloreto de metileno, lavada com água, seca sobre sulfato de magnésio e concentrada sob vácuo para dar 0,6 g de N,N-bis(fenilmetil)-2-(2-metilsulfonil-oxietoxi)metil-lH-imidazo[4,5-c]quinolino-4-amina.

Parte G

Adicionaram-se carbonato de potássio e iodeto de sódio em excesso a uma solução de N,N-bis(fenilmetil)-2-(2-metilsulfoniloxietoxi)metil-lH-imida-zo[4,5-c]quinolino-4-amina (0,6 g, 1,14 mmol) em acetona (200 mL). A mistura reaccional foi aquecida em refluxo de um dia para o outro e depois concentrada sob vácuo. O resíduo foi partilhado entre cloreto de metileno (150 mL) e água (50 mL). A camada de cloreto de metileno foi separada, seca sobre sulfato de magnésio e concentrada sob vácuo. O resíduo foi purificado por cromatografia em coluna (sílica gel eluíndo com cloreto de metileno:acetato de etilo: hexanos (v/v/v)) para dar 0,42 g de N,N-bis(fenilmetil)-10,ll-dihidro-8H-[l,4]oxazino-[4',3':l,2]imidazo[4,5-c]quinolin-6-amina como um sólido branco.

Parte H

Adicionou-se hidróxido de paládio em carbono (0,5 g) a uma solução de N,N-bis(fenilmetil)-10,11 -dihidro-8H-[ 1,4]oxazino[4',3': 1,2]-imida-zo[4,5-c]quinolin-6-amina (0,4 g, 0,95 mmol) em ácido fórmico (cerca de 40 mL). A mistura reaccional foi aquecida em refluxo durante 6 dias, diluída com metanol e filtrada através de uma camada de agente de filtração Celite™. O filtrado foi tomado básico com hidróxido de amónio e concentrado sob vácuo. O resíduo foi retomado numa mistura de metanol e cloreto de metileno. Adicionou-se sílica gel e a mistura resultante foi. concentrada sob vácuo. O sólido foi colocado numa coluna e eluído com 2-5% de metanol em cloreto de metileno para dar um sólido branco. O espectro de ressonância magnética nuclear foi consistente com o sal formato do produto desejado. O sal foi retomado em ácido clorídrico a 5% e aquecido num banho de vapor durante 30 minutos. Tomou-se a mistura básica com hidróxido de sódio a 10%. O precipitado resultante foi isolado por filtração, lavado com água e seco sob vácuo para dar 75 mg de 10,11-dihidro-8H-[l ,4]oxazino[4',3': 1,2]imidazo[4,5-c]quinolin-6-amina como um sólido, p.f. 258-259°C. Análise: Calculada para C13H12N4O: %C, 64,99; %H, 5,03; %N, 23,32; Encontrada: %C, 64,61; %H, 4,88; %N, 23,18.

INDUÇÃO DE INTERFERÃO EM CÉLULAS HUMANAS

Foi utilizado um sistema de células de sangue humano in vitro para avaliar a indução de interferão pelos compostos da invenção. A actividade é baseada na medida do interferão secretado para o meio de cultura. O interferão é medido por bioensaio.

Preparação de Células Sanguíneas para Cultura O sangue total é recolhido por venipunctura para tubos de vácuo com EDTA. As células mononucleares do sangue periférico (PMB) são separadas do sangue total utilizando tanto LeucoPREP™ Brand Cell Separation Tubes (disponíveis em Becton Dickinson) como a solução Ficoll-Paque® (disponível em Pharmacia LKB Biotechnology Inc., Piscataway, NJ). As PMB são suspensas a 1 x 106/mL em meio RPMI 1640 (disponível em GIBCO, Grand Island, NY) contendo 25 mM de HEPES (ácido N-2-hidroxietilpiperazina-N'-2-etanos-sulfónico) e L-glutamina (adicionado com solução de penicilina-estreptomicina a 1%) adicionado com 10% de soro autólogo inativado pelo calor (56°C durante 30 minutos). Porções de 200 mL de suspensão PBS são colocadas em placas estéreis de cultura de tecidos MicroTest III (fundo plano) de 96 poços.

Preparação do Composto

Os compostos são solubilizados em etanol, sulfóxido de dimetilo ou água para cultura de tecidos e depois diluídos com água para cultura de tecidos, hidróxido de sódio 0,01N ou ácido clorídrico 0,01N (a escolha do solvente dependerá das características químicas do composto a ser testado). A concentração de etanol ou DMSO não deverá exceder uma concentração final de 1% para adição aos poços de cultura. Os compostos são testados inicialmente numa gama de concentrações variando desde cerca 0,1 pg/mL até cerca de 5 pg/mL. Os compostos que mostrem indução a uma concentração de 0,5 pg/mL são então testados numa maior gama de concentrações. -30-

Incubacão

Um volume (menor ou igual a 50 pL) de solução do composto teste é adicionado aos poços contendo 200 pL de sangue total diluído ou PBM em meio. O solvente e/ou o meio são adicionados aos poços de controlo (poços sem composto teste) na quantidade necessária para ajustar o volume final em cada poço a 250 pL. As placas são cobertas com tampas de plástico, cuidadosamente agitadas em redemoinho e depois incubadas durante 48 horas a 37°C numa atmosfera com 5% de dióxido de carbono.

Separação

Após a incubação, as placas são cobertas com “parafilm” e centriíugadas a 1000 rpm durante 10 a 15 minutos a 4°C numa centrífuga Damon IEC modelo CRU-5000. É removido o meio de 4 a 8 poços e junto em frascos estéreis de congelação de 2 mL. As amostras são mantidas a -70°C até à análise.

Análise do Interferão/Cálculo O interferão é determinado por bioensaio utilizando células de carcinoma de pulmão humano A549 confrontadas com encefalomiocardite. Os detalhes do método de bioensaio foram descritos por G. L. Brennan e L. H. Kronenberg em “Automated Bioassay of Interferons in Micro-test Plaques”, Biotechniques, Junho/Julho, 78, 1983, incorporado aqui por referência. Em resumo, o método é como se segue: as diluições de interferão e as células A549 são incubadas a 37°C durante 12 a 24 horas. As células incubadas são infectadas com um inoculo de vírus da encefalomiocardite. As células infectadas são incubadas a 37°C durante um período adicional antes de se quantificar o efeito citopático virai. O efeito citopático virai é quantificado por coloração seguida por medidas espectrofotométricas de absorvância. Os resultados são expressos em -31- unidades de referência alfa/mL baseados no valor obtido para o padrão NIH HU IF-L. O interferão foi identificado como essencialmente todo interferão alfa testando por ensaio de neutralização cruzada contra interferão anti-humano de coelho (beta) e interferão anti-humano de cabra (alfa) utilizando monocamadas de células A549 confrontadas com vírus da encefalomiocardite. Os resultados são mostrados na tabela abaixo em que a ausência de entrada indica que o composto não foi testado nessa concentração de dose particular.

Indução de Interferão (a) em Células Humanas Composto do Exemplo Unidades de Referência a/mL Concentração de Dose (mg/mL) 0.01 0,05 0,10 0,50 1,0 5,0 1 2 5 320 1000 370 46 2 __ 4 500 66 7 3 __ __ 4 100 130 32 4 5 510 1200 160 190 380 5 1 1 510 310 170 210

INDUÇÃO DE INTERFERÃO EM RATINHOS

Este método de teste foi utilizado para avaliar a capacidade dos compostos da invenção para induzir a biossíntese de interferão em ratinhos.

Para cada nível de dosagem testado, três grupos (três ratinhos por grupo) de ratinhos macho (não alimentados) são doseados oralmente com composto. Uma hora mais tarde é recolhido sangue do plexo retrobulbar e reunido. O sangue é centrifugado e o soro recolhido e retiradas aliquotas. As amostras de soro são armazenadas congeladas a -70°C até à análise. Este -32- procedimento é repetido 2 horas após a dose com o segundo grupo de ratinhos e quatro horas depois da dose com o terceiro grupo de ratinhos.

As amostras são ensaiadas como descrito acima em ligação com a análise de indução de interferão em células humanas. Os resultados são expressos na tabela abaixo como unidades de referência α/β/mL baseados no valor obtido para o rato padrão UM-l-IF. Os resultados são mostrados na tabela abaixo em que os resultados designados “<”número indicam que o interferão não era detectável em quantidades acima do nível de sensibilidade mínima do ensaio.

Indução de Interferão em Ratinhos Composto do Dose Unidades de Referência/mL Exemplo (mg/Kg) lh 2 h 4 h 1 0,3 <250 <250 <250 1 1,0 480 480 <250 1 3,0 480 1300 330 1 10,0 1600 4300 480 3 0,3 <380 <380 <380 3 1,0 <380 <380 <380 3 3,0 1100 820 <380 3 10,0 1500 290 660 4 0,3 <520 520 <520 4 1,0 1100 1100 <520 4 3,0 2700 3500 <520 4 10,0 4700 11000 <520 5 0,3 <310 <310 <310 5 1,0 310 <310 <310 5 3,0 1100 1200 310 5 10,0 1700 2100 630

ACTIVIDADE ANTIVIRALINDIRECTA IN VITRO O método de teste descrito abaixo demonstra a capacidade de compostos da invenção para inibir o progresso de infecção virai. O sangue total é recolhido por venipunctura para tubos de vácuo com EDTA. As células mononucleadas do sangue periférico (PMB) são isoladas utilizando solução Ficoll-Paque® (disponível em Pharmacia LKB Biotechnology Inc., Piscataway, NJ). As PMB são lavadas com solução salina tamponada com fosfato e depois diluídas com meio RPMI 1640 (Disponível em Gibco, Grand Island, Nova iorque) e 10% de soro fetal bovino para obter uma concentração final de 2,5 x 106 células/mL. Porções de um mL de PBM em meio são colocadas em tubos de polipropileno de 15 mL. O composto de teste é dissolvido em sulfóxido de dimetilo e depois diluído com meio RPMI 1640. A solução do composto de teste é adicionada aos tubos contendo as PBM para dar concentrações finais variando desde 0,05 μg/nlL até 1,0 pg/mL. Os tubos de controlo não recebem nenhum composto de teste. Os tubos são então incubados durante 24 horas a 37°C em atmosfera com 5% de dióxido de carbono. Após a incubação os tubos são centrifugados a 400 x g durante 5 minutos. O sobrenadante é removido. As PMB são colocadas em 100 pL de meio RPMI 1640 e infectadas com 100 pL de solução contendo 105 doses de cultura de tecido 50% infectado com virus da estomatite vesicular (VSV). Os tubos são incubados durante 30 minutos a 37°C para permitir a absorção do vírus. Adiciona-se 1 mL de meio RPMI 1640 a cada tubo e os tubos são incubados durante 48 horas a 37°C. Os tubos são congelados e depois descongelados para lisar as células. Os tubos são centrifugados a 400 x g durante 5 minutos para remover os resíduos celulares e o sobrenadante é ensaiado em diluições em série de 10 vezes em células Vero em placas para microtitulação de 96 poços. As células infectadas são incubadas durante 24 horas a 37°C antes -34- da quantificação do efeito citopático virai. O efeito citopático virai é quantificado por coloração com cristal violeta a 0,05%. Os resultados são apresentados como inibição de VSV, definido como logio (rendimento do VSV de controlo/rendimento do VSV experimental). Os resultados são mostrados na tabela abaixo em que a ausência de entrada indica que o composto não foi testado nessa concentração particular. Os tubos de controlo têm um valor 0.

Actividade Antiviral In vitro Composto do Exemplo Rendimento da Inibição de VSV Concentração da Dose (pg/mL) 0,05 0,1 0,5 1,0 1 8,0 8,0 8,0 __ 2 — 2,0 4,0 5,0

Lisboa, 3 de Julho de 2000 V.

JORGE CRUZ

Agente Oficial da Propriedade Industrial RUA VICTOR CORDON, 14 1200 LISBOA

Claims

REIVINDICAÇÕES 1. Composto de fórmula II nh2

( Γ )-0¾. π em que Z é seleccionado do grupo que consiste em: -(CH2)n- em que n é 1 a 4, -(CH2)a-C(RiR2)(CH2)b-, em que a e b são inteiros e a+b é 0 a 3, Ri é hidrogénio ou alquilo com 1 a 4 átomos de carbono, e R2 é seleccionado do grupo que consiste em alquilo com 1 a 4 átomos de carbono, hidroxilo, -0R3, em que R3 é alquilo com 1 a 4 átomos de carbono, e -NR4R4 em que R4 e R'4 são independentemente hidrogénio ou alquilo com 1 a 4 átomos de carbono, -(CH2)a-(Y)-(CH2)b-, em que a e b são inteiros e a+b é 0 a 3, e Y é O, S ou -NR5- em que R5 é hidrogénio ou alquilo com 1 a 4 átomos de carbono; e em que q é 0 ou 1 e R é seleccionado do grupo que consiste em alquilo com 1 a 4 átomos de carbono, alcoxi com 1 a 4 átomos de carbono e halogénio, ou um seu sal farmaceuticamente aceitável.
2. Composto de acordo com a Reivindicação 1, em que Z é -(CH2)„- e n é de 1 a 3, ou um seu sal farmaceuticamente aceitável.
3. Composto de acordo com a Reivindicação 1 em que Z é -(CH2)a-C(RiR2)(CH2)b- em que a e b são inteiros e a+b é de 0 a 3, R| é hidrogénio ou alquilo com 1 a 4 átomos de carbono, e R2 é seleccionado do grupo que consiste em alquilo com 1 a 4 átomos de carbono, hidroxilo, -OR3 em que R3 é alquilo com 1 a 4 átomos de carbono, e NR4R4 em que R4 e R'4 são independentemente hidrogénio ou alquilo com 1 a 4 átomos de carbono, ou um seu sal farmaceuticamente aceitável.
4. Composto de acordo com a Reivindicação 3, em que Rj é hidrogénio e R2 é alquilo com 1 a 4 átomos de carbono, ou um seu sal farmaceuticamente aceitável.
5. Composto de acordo com a Reivindicação 1, em que Z é -(CH2)a-(Y)-(CH2)b- em que a e b são inteiros e a+b é de 0 a 3, e Y é O, S ou -NR5- em que R5 é hidrogénio ou alquilo com 1 a 4 átomos de carbono, ou um seu sal farmaceuticamente aceitável.
6. Composto de acordo com a Reivindicação 5, em que Y é O, ou um seu sal farmaceuticamente aceitável.
7. Composto de acordo com a Reivindicação 6, em que a+b é 1, ou um seu sal farmaceuticamente aceitável.
8. Composto de acordo com a reivindicação 1, seleccionado do grupo que consiste em : 8,9,10,11-tetra-hidropirido[ Γ,2': 1,2]imidazo[4,5-c]quinolin-6-amina, 10-metil-8,9,10,l l-tetra-hidropirido[r,2': l,2]imidazo[4,5-c]qui-nolin-6-amina, -3- 8Η-9,10,11,12-tetra-hidrohexametileno-imino[ 1 ',2': 1,2]imidazo [4,5-c]quinolin-6-amina, 9,10-dihidro-8H-pirrolo[ 1 ',2': 1 J2]imidazo[4,5-c]quinolin-6-ainina, 10,11 -dihidro-8H- [ 1,4]-oxazino[4',3': 1,2]imidazo[4,5-c]quinolin-6- amina, ou um seu sal farmaceuticamente aceitável.
9, Formulação farmacêutica compreendendo: (i) um composto de acordo com a Reivindicação 1 numa quantidade eficaz para induzir a biossíntese de interferão num animal, e (ii) um veículo farmaceuticamente aceitável.
10. Utilização de um composto de acordo com a Reivindicação 1 numa quantidade eficaz para a preparação de uma composição farmacêutica para induzir a biossíntese de interferão num animal. Lisboa, 3 de Julho de 2000

JORGE CRUZ Agente Oficial da Propriedade Industrial RUA VICTOR CORDON, 14 1200 LISBOA