PT85849B

PT85849B - Processo para a preparacao de novos peptideos relacionados com linfocina

Info

Publication number: PT85849B
Application number: PT85849A
Authority: PT
Inventors: Clemens Sorg; Karel Gerrit Odink; Josef Brugen; Walter Wiesendanger; Nico Cerletti; Lajos Tarcsay; Roger Clerc
Original assignee: Ciba Geigy Ag
Priority date: 1986-10-03
Filing date: 1987-10-01
Publication date: 1990-07-31
Also published as: DK517787D0; IE872645L; DE3789413D1; US5350687A; US5702920A; IE61773B1; EP0263072B1; PT85849A; FI874287A0; FI874287A7; EP0263072A2; DE3789413T2; EP0263072A3; NO874159L; AU7930987A; JPH09188698A; ES2052602T3; NO874159D0; DK517787A; FI874287L

Description

Resumo

O invento diz respeito a um processo para a preparação de polipeptídeos relacionados com o factor inibidor da migração de macrófagos humano, em particular de polipeptídeos designados por MRP-8 e MRP-14. 0 presente invento diz também respeito a mRNAs, DNAs e vectores híbridos que codificam os referidos polipeptídeos, a hospedeiros transformados com tais vectores híbridos, a anticorpos monoclonais e policlonais para tais polipeptídeos e a

CIBA-GEIGY AG.

PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE NOVOS PEPTIDEOS RELACIONADOS COM LINFOCINA métodos de diagnóstico para condições inflamatórias e de fi-

brose cística.

processo de preparação dos referidos polipeptídeos consiste em se purificar uma solução contendo os compostos desejados, por métodos cromatográficos, se isolarem os compostos, e se se desejar, se prepararem os seus fragmentos ou derivados a partir deles.

invente diz respeito a polipeptídeos relacionados com o factor de inibição de migração de macrófagos humanos, processos para a sua preparação, ARNm, ADN e a vectores híbridos que codificam tais polipeptídeos, a hospedeiros transformados com um tal vector híbrido, a anti-corpos monoclonais ou policlonais para os referidos polipeptídeos e a métodos de diagnóstico para condições inflamatórias e fibrose cística.

Base do invento factor de inibição de migração de macrófagos humanos (MIF) pertence ao grupo das chamadas linfocinas que compreendem polipeptídeos solúveis biologicamente activos que são segragados por linfócitos e monócitos ou macrófagos quando estes são estimulados por antigénes, mitogenus ou semelhantes. Outros exemplos de linfocinas são interferão imune (interferou- γ) interleucina 1 e 2 e factor de activação de macrófagos (MAF). Estas linfocinas controlam a diferenciação, activação e proliferação de vários tipos de células do sistema imunológico.

De acordo com o estado conhecido do domínio, o MIF humano consta de um grupo de polipeptídeos que inibe a capacidade de migração de macrófagos. 0 MIF humano é segregado não apenas por linfócitos activados, células-T e -B, mas também por células não-linfoides, por exemplo por crescimento de fibroblastos e certas células de tumores. O MIF pode ser claramente diferenciado a partir de interferão y , MAF e de outras linfocinas.

MIF humano desempenha um papel decisivo na fase inicial de uma reacção de inflamação (reacção de hipersensibilidade do tipo retardada). Induz a diferên-4-

ciação de monocitos e tecidos inactivo de macrófagos para macrófagos inflamatórios maduros. 0 MIF humano e as proteínas relacionadas são portanto importantes marcadores para condições inflamatórias e podem ser úteis na terapêutica de doenças de ordem imunológica e doenças inflamatórias crónicas .

A separação e purificação de uma proteína MIF de peso molecular 8 kD de células mononucleares humanas estimuladas com concanavalina A são descritas no Pedido de Patente Europeia EP 162.812. Esta proteína é caracterizada por uma sequência N-terminal de aminoácidos (61 aminoácidos) e a sua actividade inibidora de migração de macrófagos e também pela sua imuno-reactividade em relação a anticorpos monoclonais seleccionados. São descritos outras proteínas de MIF de 14 kD, 28kD e 45 kD, mas fracamente caracterizados. A proteína de MIF de 14 kD foi descoberto ter a mesma sequência N-terminal de aminoácidos (aminoácidos 2 a 19) como a proteína de MIF de 8 kD.

De acordo com a EP 162.812, o MIF humano e as suas proteínas são obtidos a partir de sobrenadantes de cultura de células ou filtrados de células humanas estimuladas. Este método limita a eficácia do MIF humanas devido a problemas inerentes à cultura de células humanas adequadas, a eficácia limitada de células produtoras de MIF humano fresco e separação inconveniente de uma proteína simples.

progresso rápido na tecnologia de ADN recombinante nos recentes anos fornece os métodos gerais para a preparação de polipeptídeos em grandes quantidades independentes das fontes naturais primárias de tais compostos. A identificação de um ARNm ou um ADN codificador do polípeptideo desejado é crucial para o sucesso deste método. Se a informação da sequência de aminoácidos (parcial) está

disponível, uma sonda de ácido nucleico sintetizado quimicamente pode conduzir à separação de ARNm ou ADN codificador a partir de uma mistura de ARNm derivado de células que produzem os polipeptídeos desejados ou a partir de um ADN biblioteca, respectivamente. Apesar de muitos exemplos para a separação de um ARNm ou ADN codificador de um polipeptídeo desejado se terem tornado até agora conhecidos e o processo geral ter sido descrito em principio, cada problema novo específico requer adaptação da técnica ao caso particular.

Uma vez que um ADN genómico ou complementar codificador do polipeptídeo desejado está à mão, a preparação de vectores de expressão adequados, a transformação de hospedeiros com estes vectores, fermentação de hospedeiros transformados e separação dos polipeptídeos expressos segue os processos vulgares. Aqui novamente, estes processos devem ser adaptados ao problema particular com o fim de tornar estável a incorporação do ADN e a expressão suficientemente alta do polipeptídeo desejado num organismo hospedeiro escolhido e rendimentos aceitáveis da proteína isolada pura, biologicamente activa.

Além disso, a tecnologia de ADN recombinante permite produzir variantes de polipeptídeo por mutação ou de outro modo alteração do ADN codificador incorporado num organismo hospedeiro, aumentando por isso as aplicações potenciais de um principio activo encontrado numa única estrutura de natureza polipeptídica.

Uma recente publicação sobre antigênio de fibrose cística (antigênio CF) isolado a partir de células de leucemia mielóide crónica (J.R. Dorin et al. , Nature 1987, 326, 614) sugere que este antigênio CF é idêntico ou pelo menos muito mais relacionado com a proteína MRP-8 relacionada-MIF deste invento. No entanto, o presente invento fornece evidência que a MRP-8 não é indicativo para a fibrose

cística. Ao mesmo tempo um método de diagnose seguro de fibrose cística é descrito por este invento com base na determinação imunológica de outra proteína relacionada, MRP-14.

Objectivo do invento ,

I

Um objectivo do presente invento é fornecer polipeptídeos relacionados com o factor de inibição I de migração de macrófagos humanos (MIF) com pureza elevada ) e quantidade suficiente e processos para a sua preparação .

O problema da síntese industrial de polipeptídeos pode ser resolvido pelos métodos de tecnologia de ADN recombinante. Um outro objectivo do presente invento é portanto fornecer hibridização de ADN com ARNm e ADN de fontes naturais codificadoras de peptídeos relacionados com MIF, ADNs e vectores I híbridos codificadores de polipeptídeos relacionados com i

MIF, e hospedeiros transformados com um tal vector. Outros objectivos são métodos de produção dos referidos vectores híbridos, hospedeiros transformados, moléculas de ARN e ADN, também preparações farmacêuticas contendo quantidades efectivas de polipeptídeos relacionados com MIF e métodos de sua preparação e o uso de tais polipeptídeos.

Um objectivo adicional do presente invento é fornecer anticorpos monoclonais e policlonais dirigidos a polipeptídeos relacionados com MIF, linhas celulaI res de hibridoma produtoras tais anticorpos monoclonais, métodos de produção de tais anticorpos e linhas celulares de hibridoma e o uso de tais anticorpos. Um objectivo particular é um método de diagnose seguro de condições inflamatórias e fibrose cística. Estes objectivos foram atingidos pelo presente invento.

Descrição do invento invento refere-se a peptídeos relacionados com o factor de inibição de migração de macrófago humanos (MRP) de peso molecular semelhante de cerca de kD ou cerca de 14 kD, e seus mutantes, fragmentos e deri vados.

Em particular o invento diz respeito . MRP-8 da fórmula o

Zi-Leu-Thr-Glu-Leu-Glu-Lys-Ala-Leu-Asn-Ser-Ile-Ile-Asp-Val-Tyr2 03 0

Hís-Lys-Tyr-Ser-Leu-Ile-Lys-Gly-Asn-Phe-His-Ala-Val-Tyr-Arg-AspI» 0

Asp-Leu-Lys-Lys-Leu-Leu-Glu-Thr-Glu-Cys-Pro-Gln-Tyr-Ile-Arg-Lys5060

Lys-Gly-Ala-Asp-Val-Trp-Phe-Lys-Glu-Leu-Asp-Ile-Asn-Thr-Asp-Gly7080

Ala-Val-Asn-Phe-Gln-Glu-Phe-Leu-Ile-Leu-Val-Ile-Lys-Met-Gly-Val9 09 3

Ala-Ala-His-Lys-Lys-Ser-His-Glu-Glu-Ser-His-Lys-Glu (D, em que Z^ é hidrogénio, acilo ou o resíduo do aminoácido me tionina, e seus mutantes, fragmentos e derivados, e MRP-14 da fórmula

-8\ -V

1⁰ .

Z2-Ser-Gln-Leu-Glu-Arg-Asn-Ile-Glu-Thr-Ile-Ile-Asn-Thr-Phe-His-Gln30

Tyr-Ser-Val-Lys-Leu-Gly-His-Pro-Asp-Thr-Leu-Asn-Gln-Gly-Glu-Phe-Lyso 5 0

Glu-Leu-Val-Arg-Lys-Asp-Leu-Gln-Asn-Phe-Leu-Lys-Lys-Glu-Asn-Lys-Asn60 70

Glu-Lys-Val-Ile-Glu-His-Ile-Met-Glu-Asp-Leu-Asp-Thr-Asn-Ala-Asp-Lys80

Gln-Leu-Ser-Phe-Glu-Glu-Phe-Ile-Met-Leu-Met-Ala-Arg-Leu-Thr-Trp-Ala9 0 ¹ θ θ

Ser-His-Glu-Lys-Met-His-Glu-Gly-Asp-Glu-Gly-Pro-Gly-His-His-His-Lys110 1 1 *<

Pro-Gly-Leu-Gly-Glu-Gly-Thr-Pro (II), em que Zg é hidrogénio, acilo ou um resíduo peptídeo acilado facultativamente de 1 a 5 aminoácidos, e seus mutantes, fragmentos e derivados.

Acilo ou Zg é o resíduo acilo de um ácido orgânico ou inorgânico ocorrendo naturalmente, por exemplo de ácido fórmico, ácido alcanocarboxílico por exemplo ácido acético propiónico, palmítico ou mirístico, ou ácido fosfórico ou súlfúrico, de preferência ácido acético.

Um resíduo peptídeo Zg é composto de um, dois, três, quatro ou cinco aminoácidos que ocorrem naturalmente e é, por exemplo, Met-Tre-Cis-Lis-Met- ou Met-Tre-Cis-Lis-Met-, Um tal resíduo peptídico pode ser acilado no grupo amino N-terminal por um resíduo acilo como definido sob acilo ou Zg, por exemplo acetilo e é, por exemplo acetil-Tre-Cis-Lis-Met-.

Os mutantes do invento são polipeptídeos, em que um ou mais, em especial um, dois, ou três, aminoácidos simples de um composto da fórmula I ou II são substituídos por um aminoácido diferente ou por uma ligação. Estes mutantes podem ser formados por mutação espontâneas ou induzidas quimicamente no nível ADN ou por substituição de aminoácidos pro síntese química. Os fragmentos do invento são fragmentos de um composto da fórmula I ou II compreendendo pelo menos 20 aminoácidos consecutivos. Os fragmentos do invento podem ser formados por mutações espontâneas ou induzidas-quimicamente no nível ADN, pelo que um tripleto codificador dum aminoácido é mudado para um codão stop ou ao nível do peptídeo por clivagem de ligações de peptídeo quimicamente ou enzimáticamente.

Os derivados de um polipeptídeo de fórmula I ou II, seus mutantes ou fragmento são aqueles em que os grupos funcionais, por exemplo, amino, hidroxi, mercapto ou carboxi, são derivados, por exemplo glicosilados, acilados, amidados ou esterifiçados. Em derivados glicosilados um resíduo de hidrato de carbono ou um oligosacarídeo é ligado a asparagina, serina e/ou treonina. Os derivados acilados são substituidos pelo grupo acilo de um ácido orgânico ou inorgânico que ocorre naturalmente, por exemplo, ácido acético, ácido fosfórico ou ácido sulfúrico, em grupos em especial no grupo amino N-terminal, ou em grupos hidroxi, especialmente de tirosina ou serina. Os ésteres são os de álcoois que ocorrem naturalmente, por exemplo de metanol ou etanol.

Os derivados do invento são também dímeros de um composto da fórmula I ou de um composto da fórmula II, seus mutantes ou fragmentos em que o grupo mercapto de um resíduo cisteína está na forma oxidada i.e. na forma de dissulfureto dando origem a pontes intermoleculares

S-S _t e dímeros mistos de um composto da fórmula I, de um

-ΙΟ-

seu mutante ou fragmento com um composto da fórmula II, um seu mutante ou fragmento ligado via o grupo mercapto oxidado de um resíduo de cisteína.

Também os derivados são sais, em especial sais farmacêuticamente aceitáveis, por exemplo sais de metal, tais como sais de metal alcalino e sais de metal alcalino-terrosos, por exemplo sais de sódio, potássio, magnésio, cálcio ou zinco, ou sais de amónio formados com amónia ou com uma amina orgânica adequada tal como uma alquilamina inferior, por exemplo trietilamina, hidroxi-alquilamina inferior, por exemplo 2-hidroxietilamina e semelhantes.

É preferido o composto MRP-8 de fórmula I, em que Z^ é Met, i.e. o resíduo aminoácido metionina. 0 peso molecular efectivo deste polipeptídeo é 10,8 kD, mas em dodecil sulfato de sódio-electroforese de gel de poliacrilamida (SDS-PAGE), este peptídeo migra como um peptídeo de 8 kD quando comparado com proteínas marcadoras padrão.

Também preferido é o composto MRP-14 de fórmula II, em que Z^ é Tre-Cis-Lis-Met- ou hidrogénio. Este último composto é também chamado MRP-14d. O peso molecular efectivo destes polipeptídeos é 13,1 kD e 12,6 kD, respectivamente, mas em SDG-PAGE, estes peptídeos migram como peptídeos de 14 kD quando comparados com marcadores padrão de proteínas.

Os derivados preferidos são dímeros de MRP-8 de fórmula I, em que Z^ é Met, dímeros de MRP-14 de fórmula II, em que Z£ é Tre-Cis-Lis-Met- e os dímeros mistos de MRP-8 de fórmula I em que Z^ é Met, com MRP-14 de fórmula II, em que Z^ é Tr-Cis-Lis-Met, todos ligados via o grupo mercapto oxidado de um resíduo cisteína.

O invento refere-se também a um processo para a preparação de peptídeos relacionados com o factor

de inibição de migração de macrófagos humanos, seus mutantes, fragmentos e derivados, caracterizado pelo facto de uma solução contendo os compostos desejados, por exemplo um extracto pré-purificado célula sobrenadante ou filtrado de cultura de leucócitos humanos normais estimuladores ou de microorganismos criados por engenharia genética ou linhas celulares permanentes de mamíferos, ser purificada por métodos cromatográficos e os compostos isolados e, se se desejar, os fragmentos ou derivados deles preparados.

Os extractos pré-purifiçados, células sobrenadantes e filtrados de cultura de leucócitos humanos normais estimulados contendo um composto da fórmula II ou seus derivados são preparados como descrito em EP 162.812. Em particular, as células mononucleares normais são estimuladas para produzir o factor de inibição de migração de macrófagos (MIF) e outras linfocinas por adjuvantes adequados, por exemplo concanavalina A ou fito-hemaglutinina e são cultivados de acordo com os métodos usuais. Os extractos, células sobrenadantes ou filtrados de culturas são depois pré-purificados por cromatografia de imuno-afinidade numa coluna carregada com anticorpos específicos para o MIF humano, por exemplo, com anticorpos monoclonais 1C5.

Os extractos, células sobrenadantes e filtrados de culturas de microorganismos criados por engenharia genética ou linhas celulares permanentes de mamíferos contendo peptídeos relacionados com o factor de inibição de macrófagos humanos são obtidos ou pre-purifiçados como será aqui discutido posteriormente.

Os métodos cromatográficos contemplados para a preparação dos compostos desejados são cromatografia de permuta iónica, cromatografia líguida de alta resolução de fase reversa, filtração por gel, cromatografia de afinidade, cromatografia sobre hidroxilapatite, cromatografia

por interacção hidrofóbica e semelhantes.

Um material veículo adequado para cromatografia de permuta iónica pode ser de origem orgânica ou inorgânica por exemplo agarose de ligação cruzada, dextrano, poliacrilamida, co-polímero de estireno/divinilbenzeno, celulose ou semelhante. Este material veículo contém grupos funcionais básicos, por exemplo funções amino terciárias, grupos amónio quaternário ou grupos funcionais de ácidos, por exemplo resíduos de ácido carboxílico ou sulfónico. Exem‘ pios para permutadores iónicos preferidos são os grupos fun| cionais que contêm dietilaminoetilo (DEAE) ou dietil-2-hidroxipropil-aminoetilo e os grupos funcionais contendo sulfopropilo (SP) ou carboximetilo (CM) quer ligados a veículos adequados para cromatografia líquida vulgar, cromatografia líquida de proteínas rápida (FPLC) ou cromatografia líquida de alta resolução (HPLC). As separações e purificações com cromatografia de permuta iónica são realizadas seguindo processos estabelecidos, por exemplo em soluções tampão aquosas de pH 5 a pH 9 contendo quantidades aumentadas de sal, por exemplo cloreto de sódio.

veículo material adequado para cromatografia por filtração em gel ou exclusão de dimensões inclui dextrano de ligação cruzada, agarose, poliacrilamida modificada adequadamente ou sílica, e semelhantes. Facultativamente estes veículos são modificados com substituintes contendo funções hidroxi, por exemplo com os grupos 1-hidro| xi- ou 1,2-di-hidroxi-alquilo inferior. 0 material cromatográfico é escolhido de modo a revelar óptima separação de peptídeos na gama de um peso molecular de 5.000 a 20.000 Dalton (5 kD ou 20 kD). Tal cromatografia por filtração de gel ou exclusão de dimensão pode ser realizada numa coluna adequada para cromatografia líquida normal, FPLC ou HPLC, usando soluções tampão aquosas quase neutras contendo quantidades variáveis de sal, por exemplo cloreto de sódio.

A cromatografia de fase reversa é realizada num material veículo com base em sílica contendo grupos hidrofóbicos, por exemplo grupos alquilo de 1 a 20 átomos de carbono, de preferência 4, 8, 12 ou 18 átomos de carbono ou misturas de grupos alquilo de 1 a 8 ou 2 a 18 átomos de carbono, respectivamente, ou grupos fenilo. Relacionados com este método encontra-se a cromatografia de interacção hidrofóbica, em que é usado agarose ou um material relacionado revestidos com grupos alquilo até 12 átomos de carbono e/ou grupos fenilo. Estas técnicas cromatográficas são aplicadas usando FPLC ou HPLC. Os solventes para o processamento dos polipeptídeos do invento em material de fase reversa com base em sílcia são ácidos aquosos por exemplo ácido trifluoroacético aquoso, contendo quantidades crescentes de um solvente aogânico polar míscivel em água, por exemplo acetonitrilo, álcoois inferiores, por exemplo metanol, etanol ou propanol, tetra-hidrofurano e semelhantes, de preferência acetonitrilo.

A cromatografia por afinidade é também contemplada para a purificação dos peptídeos do invento asando um material veículo adequado, por exemplo agarose de ligação cruzada, dextrano ou poliacrilamida contendo moléculas com afinidade elevada para um composto de fórmula I, seus mutantes fragmentos e derivados por exemplo anticorpos em particular anticorpos policlonais e monoclonais específicos para os peptídeos do invento como aqui descrito posteriormente.

Os métodos cromatográficos preferidos são cromatografia de permuta iónica com veículos contendo grupos sulfopropilo e cromatografia líquida de alta resolução de fase reversa (HPLC).

Os compsotos do invento são isolados pelas técnicas usuais por exemplo filtração ou ultrafiltra-

ção, diálise, dissolução e re-precipitação em soluções adequadas de sal e/ou tampão e misturas de solventes, evaporação do solvente liofilização e semelhantes.

Os fragmentos de um peptídeo relacionado com MIF são preparados por exemplo por tratamento com uma protease. Por exemplo, pode ser adicionado papaína, tripsina, χ-cimotripsina, termolisina, pepsina, subtilisina, endoproteinase Lis-C a partir de Lysobacter enzimogenes, V8 protease a partir de Staphylococcus aureus ou proteases relacionadas a uma solução de um composto de fórmula I ou II, e a mistura resultante de fragmentos separados pro métodos cromatográficos, por exemplo por filtração em gel e/eú HPLC de fase reversa.

Os dímeros de compostos de fórmula I ou II contendo um resíduo Cis são obtidos pro oxidação suave, por exemplo com ar, oxigénio, iodo, dimetilsulfóxido e HC1, ou HBr, ou outros oxidantes químicos. Conjugados de compsotos de fórmula I com compostos de fórmula II são preparados do mesmo modo por oxidação de uma mistura adequada.

Em particular, os compostos da fórmula I ou II, seus mutantes, fragmentos e derivados podem ser preparados por técnicas de ADN recombinante compreendendo por exemplo a cultura de um hospedeiro transformado que expressa um peptídeo da fórmula I ou II, um seu mutante ou derivado sob condições que permitem a expressão do polipeptídeo heterólogo e separação do composto desejado. Mais específicamente, os compostos desejados são preparados por a) isolamento de um ADN codificador dum composto de fórmula I ou II ou um seu fragmento a partir de um ADNc ou uma biblioteca de ADN genómico de células humanas e facultativamente sua mutação, ou síntese química de um tal ADN,

b) incorporação do ADN num vector de expressão apropriado,

c) transferência do vector híbrido obtido por um recipiente hospedeiro.

d) selecção do hospedeiro transformado a partir de hospedeiros não transformados, por exemplo por cultura sob condições em que apenas sobrevive o hospedeiro transformado, e cultura do hospedeiro transformado sob condições que permitem a expressão do polipeptídeo heterólogo, e

f) isolamento do composto de fórmula I ou II, seu mutante, fragmento ou derivado, e, se necessário, a derivação do composto obtido de fórmula I ou II, seu mutante ou fragmento,

Os passos envolvidos na preparação destes peptídeos por técnica de ADN recombinante serão discutidos com mais detalhe aqui posteriormente.

É também possível sintetizar um composto de fórmula I ou II, seus mutantes e em particular seus fragmentos por métodos químicos, por exemplo por reacções de condensação como descrito em M. Bodanszky, Principies of Peptide Synthesis, Springer-Verlag, 1984. Os fragmentos são sintetizados, por exemplo por um método de fase sólida em que um aminoácido N-protegido é acoplado a uma resina adequada, o grupo de protecção é removido, um segundo aminoácido N-protegido é condensado com o grupo amino do primeiro aminoácido, o ciclo de desprotecção/condensação com aminoácidos N-protegido seguinte é repetido até o resíduo peptídeo da composição desejada estar completo e finalmente este resíduo peptídeo ser clivado a partir da resina e desprotegido. As resinas adequadas, os grupos de protecção, os reagentes de condensação e as condições da reacção são bem conhecidas nesta técnica.

invento refere-se também a ADNs codificadores dum composto de fórmula I ou II, a seus mutantes,

por exemplo ADNs em que um ou mais, em especial um, dois, três ou quatro nucleotídeos são mutados e a fragmentos de um tal ADN compreendendo pelo menos 15 nucleotídeos. É de compreender que tais ADNs são de cadeia simples ou de cadeia dupla.

Em particular, o invento refere-se a um DNA codificador para MRP-8 da fórmula

MLTELEKA v^L_ v^N v^S v^I-Y^I-Y^D-Y^V-Y^Y-Y^H-Y^K-Y^Y··

Yi-Y -Y -Y -Y -Y Y ~y ^-Y y y -i .S L I _yK _yG__yN _YF__YH__YA__YV__YY__YR__yD__YD__YL__YK__YK__yL__yL__YE_ T E C _yP _yQ _yY__yY_y^R_y^K-y^K-y^G-Y^A-Y^D-Y^V-Y^W-Y^F-Y^K-Y^E-Y^L~Y^D·' γΙ_γΝ_γΤ_γΟ_γΰ_γ^Α_γ^ν_γΝ_γΡ_γΡ_γΕ_γΓ-Υ^Ε-Υ^Ι-Υ^Ε-Υ^ν-Υ^Ι-^γΚ-^γΜ-^γΟν__γΑ__γΑ__γΗ__γΚ__γΚ__γ8__γΗ__γΕ__γΕ__γ5__γΗ__γΚ__γΕ_-γ*__γ3 (III), e um ADN codificador de MRP-14 da fórmula

Y J __Yc _γΜ_γ5_γΡ_γΕ_γΕ_γΚ_γΝ_γ^Ι_γΕ_γ^Τ_γ^Ι_γ^Ι_γΝ_γ^τ_γΕ_γ^Η_γΡ_γ^γ_γ5_ γν_γΚ yL yG yH YP_YD_yI_YL_YN_yQ_YG_YE_YF_YK_YE_YL_YV_yR_YK_YD_ yL γΡ_γΝ_γΡ_γΕ_γΚ_γΚ_γΕ_γΝ_γΚ_γΝ_γΕ_γΚ_γν_γΙ_γΕ_γΗ_γΙ_γΜ_γΕ_γΟ_ yL_YD_YT_YN_YA_YD_yK_YQ_YL_yS_yF_yE_YE_yF_YI_YM_YL_YM_YA_YR_yL_ γΤ_γν_γΑ_γ5_γΗ_γΕ_γΚ_γΜ_γΗ_γΕ_γΟ_γΠ_γΕ_γΟ_γΡ_γΟ_γΗ_γΗ_γΗ_γΚ-γΡ_ γ^Ο_γΕ_γ^Ο-γΕ_γ^β_γ^Τ_γ^Ρ_γ*_γ3 (IV),

em que é um resíduo ADN lateral de 12 nucleotídeos ou mais contendo uma sequência promotora.

Y₂ e Y -Y —Y —Y ou esta ausente

^Y3	é um resíduo flanqueador de ADN	de um	OU	mais	nucleotí-
deos ou está ausente,
_γΑ	codifica	alanina (A ou Ala) e	e	GCT,	GCC	, GCA	ou	GCG,
Y^C	codifica	císteina (C ou Cis) <	3 e	TGT	ou	TGC,
Y^D	codifica	o ácido aspártico (D	ou	Asp)	e	é GAT	ou	GAC,
Y^E	codifica	o ácido glutâmico (E	ou	Glu)	e	é GAA	ou	GAG,
Y^F	codifica	para fenilalanina (F	ou	Fen)	e	é TTT	ou	TTC,
Y^G	codifica	glicina (G ou Gli) e	z e	GGT,	GGC	, GGA	ou	GGG,
Y^H	codifica	histidina (H ou His)	e	é CAT	ou	CAC,

Y*· codifica isoleucina (I ou Ile) e é ATT, ATC ou ATA,

Y codifica lisina (K ou Lis) e é AAA ou AAG,

Y^L codifica leucina (L ou Leu) e é TTA, TTG, CTT, CTC,CTA ou CTG,

Y codifica metionina (M ou Met) e é ATG,

Y^N codifica asparagina (N ou Asn) e é AAT ou AAC,

Y^P codifica prolina (P ou Pro) eé CCT, CCC, CCA ou CCG,

Y^G codifica glutamina (Q ou Gin) e é CAA ou CAG,

Y^R codifica arginina (R ou Arg) e é CGT, CGC, CGA, CGG,AGA ou AGG,

Y^S codifica serina (S ou Ser) e é TCT, TCC, TCA, TCG, AGT ou AGC

Y^T codifica treonina (T ou Tre) eé ACT, ACC, ACA ou ACG, Y^V codifica valina (V ou Vai) e é GTT, GTC, GTA ou GTG, w

Y codifica triptofano (W ou Trp) e e TGG,

Y^Y codifica tirosina (Y ou Tir) e é TAT ou TAC, e

Y* é um codão stop TAA, TAG ou TGA, um ADN de cadeia dupla consistindo de um ADN de fórmula II ou IV e de um ADN complementar, em que a adenina (A) se combina com timina (T) e vice versa, e a guanina (G) se combi-18na com citosina (C) e vice versa, o próprio ADN complementar, ADN genómico, em que um ou mais, em especial um ou dois intrões interrompem o ADN de fórmula III ou IV, um mutante de tais ADNs, em que um ou mais, em especial um, dois, três ou quatro nucleotídeos são mutados e fragmentos de tais ADNs compreendendo pelo menos 15 nucleotídeos.

Em especial, o invento refere-se a um ADN codificador de MRP-8 da fórmula o

MLTELEKALNSIIDVYHKY

Y1-ATGTTGACCGAGCTGGAGAAAGCCTTGAACTCTATCATCGACGTCTACCACAAGTAC 10 20 30 4050

0 3 0

SLIKGNFHAVYRDDLKKLLE ICCCTGATAAAGGGGAATTTCCATGCCGTCTACAGGGATGACCTGAAGAAATTGCTAGAG 60 70 80 90 100110 *»o50

TECPQYIRKKGADVWFKELD ACCGAGTGTCCTCAGIATATCAGGAAAAAGGGTGCAGACGTCTGGTTCAAAGAGTTGGAT 120 130 140 150 160170

07 0

INTDGAVNFQEFLILVIKMG ATCAACACTGATGGTGCAGTTAACTTCCAGGAGTTCCTCATTCTGGTGATAAAGATGGGC 180 190 200 210 220230

09 0

VAAHKKSHEESHKE* GTGGCAGCCCACAAAAAAAGCCATGAAGAAAGCCACAAAGAGTAG-Y₃240 250 260 270280 (V), e a um ADN codificador de MRP-14 da fórmula

-19e a um ADN codificador de MRP-14 da fórmula

10 20

MSQLERNIETIINTFHQY

Y1-Y2-ATGTCGCAGCTGGAACGCAACATAGAGACCATCATCAACACCTTCCACCAATAC

20 30 4050

3040

SVKLGHPDTLNQGEFKELVR

TCTGTGAAGCTGGGGCACCCAGACACCCTGAACCAGGGGGAATTCAAAGAGCTGGTGCGA 60 70 80 90 100110

5060

KDLQNFLKKENKNEKVIEHI AAAGATCTGCAAAATTTTCTCAAGAAGGAGAATAAGAATGAAAAGGTCATAGAACACATC 120 130 140 150 160170

08 0

MEDLDTNADKQLSFEEFIML AIGGAGGACCTGGACACAAAIGCAGACAAGCAGCTGAGCTTCGAGGAGTTCATCATGCTG 180 190 200 210 220230

90100

MARLTWASHEKMHEGDEGPG ATGGCGAGGCTAACCTGGGCCTCCCACGAGAAGATGCACGAGGGTGACGAGGGCCCTGGC 240 250 260270

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CACCACCAIAAGCCAGGCCICGGGGAGGGCACCCCCTAA

300 ³¹⁰

110

-Y3 (VI), em que Y^ é um resíduo flanqueador de ADN de 12 nucleotídeos ou mais contendo uma sequência promotora, Yg é ATGACTTGCAAA ou está ausente e Yg é um resíduo lateral ADN de um ou mais nucleotídeos ou está ausente, um ADN de cadeia dupla consistindo de um ADN de fórmula V ou VI e de um seu ADN comple mentar, ADN genómico, em que um ou mais, em especial um ou dois, intrões interrompem o ADN de fórmula V ou VI, um mutante de tais ADNs, em que um ou mais em especial um, dois, três ou quatro nucleotídeos são mutados, e fragmentos de taisADNs compreendendo pelo menos 15 nucleotídeos.

invento refere-se também a um DNA que hibridiza com um ADN de fórmula V ou VI ou com um ADN com-20-

plementar para o ADN de fórmula V ou VI.

Um exemplo de um ADN do invento da fórmula V codificadora de MRP-8 é por ecemlpo o ADNc que é derivado a partir de ARNm de um leucócito mononuclear humano, da fórmula

AACTTGGAACAGCCCITCTACATACACTCCATCTICTCTATCTTAGITACAAGTITTTTT

20 30 40 5060

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80 90 100 110120 ι o

MLTELEKALNSIIDVYHKY ATCATGTTGACCGAGCTGGAGAAAGCCTTGAACTCTATCATCGACGTCTACCACAAGTAC 130 140 150 160 170180

03 0

SLIKGNFHAVYRDDLKKLLE TCCCTGATAAAGGGGAATTTCCATGCCGTCTACAGGGATGACCTGAAGAAATTGCTAGAG 190 200 210 220 230240

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TECPQYIRKKGADVWFKELD ACCGAGTGTCCTCAGTATATCAGGAAAAAGGGTGCAGACGTCTGGTTCAAAGAGTTGGAT 250 260 270 280 290300

310 320 330-íhu

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AAGTCTGTGGGCATC-, ATGICTCTTGTCAGCTGTCTITCAGAAGACCTGGTGGGGCAAGTTCCGIGGGCATC-, TTGTCTCTTGTCAGCIGTCTTTCAG

AAGACCTGAAGGTTCTGTTTTTCAGGTGGGGCAAGTTCCGTGGGCATC(VII).

Outros ADNsc particulares derivados a partir de ARNsm de leucócitos mononucleares humanos diferem no significado de (nucleotídeos 1 a 123 na fórmula VII)

Y1 é por exemplo

ou uma sequência compreendendo os nucleotídeos 108 a 123 ou 86 a 123 de fórmula VII com uma inserção de um T entre os nucleotídeos 112 e 113.

Um outro exemplo de um ADN da fórmula V codificador para MRP-8 é por exemplo o ADN genómico que é isolado a partir de placenta humana e que contem um intrão de 150 nucleotídeos entre os aminoácidos 47 e 48 (nucleotídeos 141 e 142 de fórmula V), da fórmula

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Um exemplo de um ADN do invento da fórmula VI codificador de MRP-14 é por exemplo o ADNc que é derivado a partir de ARNm de um leucocito mononuclear humano, da fórmula

Μ T C K M S

AAAACACTCTGTGTGGCTCCTCGGCTTTGACAGAGTGCAAGACGATGACTTGCAAAATGTCG 10 20 30 40 5060

20 QLERNIETIINTFHQYSVKL CAGCTGGAACGCAACATAGAGACCATCATCAACACCTTCCACCAATACTCTGTGAAGCTG

80 90 100 110120

0U 0

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130 140 150 160 170180

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NFLKKENKNEKVIEHIMEDL AATTTTCTCAAGAAGGAGAATAAGAATGAAAAGGTCATAGAACACATCATGGAGGACCTG

190 200 210 220 230240

7080

DTNADKQLSFEEFIMLMARL GACACAAATGCAGACAAGCAGCIGAGCTTCGAGGAGTTCATCATGCTGATGGCGAGGCTA 250 260 270 280 290300

90100

TWASHEKMHEGDEGPGHHHK ACCTGGGCCTCCCACGAGAAGATGCACGAGGGTGACGAGGGCCCTGGCCACCACCATAAG

310 320 330 340 350360

1 0

PGLGEGTP*

CCAGGCCTCGGGGAGGGCACCCCCTAAGACCACAGTGGCCAAGATCACAGTGGCCACGGC

370 380 390 400 410420

CACGGCCACAGTCATGGTGGCCACGGCCACAGCCACCCAT

430 440 450460

Um outro exemplo de um ADN da fórmula VI codificador de MRP-14 é por exemplo o ADN genómico que é isolado a partir de placenta humana ou células de fígado fetal e que contém um intrão entre os aminoácidos 50 e 51 (nucleotídeos 138 e 139 de fórmula VI) da fórmula o o o o vO t'-

ATCACTGTGGAGTAGGGGAAGGGCACTCCTGGGGTGGCAAGGTGGGAGGTGGGCCCTGTGTTCCCACAGTGGGCAGGGAGGTAGTGAAAGGGAAGCTGGC -901

CGGACAGGAAGGGCCATTCCAAGAGGGCTTTGTGCGCAGGGCTAAGCCAAGCTTTCTCCATAGGCAATGGGGAGCAACTGGAGGTTCGTAGCAGGAGAAG -801

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Além disso, o invento refere-se também a ARNs codificadores de um composto de fórmula I ou II, a seus mutantes, por exemplo ARN em que um ou mais nucleotídeos são mutados e a fragmentos de um tal ARN, em particular a um ARN da fórmula V ou VI, em que os Y têm os significados aqui dados anteriormente excepto que os resíduos ARN substituem os resíduos ADN e portanto a uridina (U) substitui a desoxi-timidina (T), em particular a um ARN de fórmula VII ou IX, em que U substitui T.

Os ADNs codificadores de um composto de fórmula I ou II ou de um seu mutante e fragmentos detais ADNs ou mutantes podem ser preparados por exemplo por cultura de um hospedeiro transformado e isolamento do ADN desejado, ou por síntese química através da condensação de nucleotídeos.

Em particular, tais ADNs podem ser preparados por

a) isolamento de um ARNm a partir de leucócitos mononucleares humanos, selecção do ARNm desejado, por exemplo por hibridização com uma sonda de ADN preparação de um ADN complementar de cadeia simples em ARNm, depois ADN de cadeia dupla (ADNc ds), ou

b) isolamento do ADN genómico a partir de células humanas, por exemplo placenta ou células de fígado fetal, e selecção do ADN desejado usando uma solução de ADN, e

c) incorporação do ADNc ds do passo a) ou do ADN ds do passo b) num vector de expressão apropriado,

d) transformação de um hospedeiro apropriado com o vector híbrido obtido,

e) selecção do hospedeiro transformado que contém um ADN codificador de um composto de fórmula I ou II, um seu mutante ou fragmento a partir de hospedeiros que não contêm ADN codificador, e

f) isolamento do ADN desejado.

O ARN mensageiro poliadenilado é isolado a partir de leucócitos mononucleares humanos por métodos conhecidos. Os leucócitos podem ser derivados a partir de sangue humano fresco, por exemplo a partir de coágulos brancos consistindo de corpúsculos brancos de sangue, ou a partir de leucócitos de uma linha celular contínua estabelecida que podem ser propagados em cultura. Os métodos de separação envolvem, por exemplo a homogeneização de leucócitos estimulados na presença de um detergente e um inibidor ribonuclease, por exemplo, heparina, isotiocianato de guanídínio e mercaptoetanol, extracção do ARNm com misturas adequadas de clorofórmio-fenol, facultativamente na presença de sal e soluções tampão, detergentes e/ou agentes quelantes de catiões, e precipitação do ARNm a partir da restante fase aquosa contendo sal com etanol, isopropanol ou semelhantes. O ARNm isolado também pode ser purificado por centrifugação num gradiente de cloreto de césio seguido por precipitação em etanol e/ou por métodos cromatográficos, por exemplo por cromatografia de afinidade, por exemplo cromatografia em oligo (dT) celulose ou em oligo (U) sefarose. De preferência, tal ARNm total purificado é fraccionado de acordo com o tamanho por centrifugação de gradiente, por exemplo num gradiente linear de sacarose , ou cromatografia sobre colunas de fraccionação de tamanho adequados, por exemplo em geles de agarose.

O ARNm desejado é seleccionado por protecção com uma sonda ADN ou por tradução em células adequadas ou sistemas isentos de células e rastreio dos polipep-31-

tídeos obtidos.

O ARNm fraccionado pode ser traduzido em células por exemplo, em oócitos de rãs, ou em sistemas isentos de células, por exemplo em lisados de reticulocitos extractos de germe de trigo. Os polipeptídeos obtidos são protegidos por actividade inibidora de migração de macrófagos ou por reacção com anticorpos aumentados em relação ao factor de inibição de migração de macrófagos naturais (MIF), por exemplo num ensaio de imunidade, por exemplo radio imunoensaio, imunoensaio de enzimas ou imunoensaio com marcadores fluorescentes. Estes imunoensaios e a preparação de anticorpos monoclonais e policlonais são bem conhecidos no domínio e são aplicados de acordo. Os anticorpos monoclonais para MIF e os imunoensaios que os usam são descritos, por exemplo no Pedido de Patente Europeia EP 162.812.

A selecção do ARNm desejado é alcançada de preferência usando uma sonda de hibridização de ADN, evitando-se portanto o passo adicional de tradução. Esta sonda de hibridização pode ser um ADN totalmente sintético consistindo de pelo menos 17 nucleotídeos ou um ADN ou fragmento de ADN isolado a partir de uma fonte natural ou a partir de um microorganismo criado por engenharia genética .

Uma sonda de ADN sintético pode ser construída na base de uma sequência de aminoácidos parcial de uma proteína de MIF humano isolado a partir de uma fonte natural, por exemplo o MIF humano de 8 kD descrito em EP 162.812 ou uma proteína relacionada com MIF humano com pso molecular aproximado de -14 kD. De preferência,as misturas de oligonucleotídeos compreendendo 17 ou mais nucleotídeos são preparadas, em que cada membro da mistura é complementar a um fragmento definido por 6 ou por mais codões tripleto consecutivos Y de fórmula III ou IV. Tais sondas de

I

ADN são também compreendidos pelo presente invento.

Exemplos de sondas de ADN do invento são os 17-mer oligonucleotídeos complementares aos fragmentos de ADN de fórmula Y^D-Y^U-Y^Y-Y^H-Y^K-TA correspondente a aminoácidos 14-19 de MRP-8 de fórmula I e de fórmula | Y^D-Y^V-Y^W-Y^F-Y^K-GA correspondente a aminoácidos 52-57 de

MRP-8 de fórmula I e a mistura nucleotídeos de 26 meros complementar ao fragmento de ADN de fórmula γΤ-Υ^-Υ^-γΝ-γΤ-Υ^-γΗ-Υ^-ΤΑ correspondente a aminoácidos 14-22 de MRP-14 de fórmula II, fórmulas em que o significado de ^! „D .,F „H „1 ,.K ,.N _WQ _VT _WV _VW _WY . , ..

Ύ,Ύ,Ύ,Υ,Ύ,Ύ, Y , Y , Y , Y e Y e como definido na fórmula IV. Os oligonucleotídeos de 26 meros contêm três resíduos de inosina em vez de um nucleotídeo complementar a um nucleotídeo de um tripleto Y, reduzindo assim o número de /nteracções nucleotídeos complementar-nucleotídeo para 23.

A síntese destes oligonucleotídeos é realizada de acordo com métodos conhecidos como aqui detalhado posteriormente, de preferência por condensação passo a passo usando o método da fase sólida de fosfotriéster, fosfito triéster ou o método de fosforamidite, por exemplo | a condensação de unidades de ligação de dinucleotídeos pelo método de fosfotriéster. Estes métodos são adaptados à síntese de misturas dos oligonucleotídeos desejados usando misturas de dois, três ouquatro nucleotídeos dA, dC, dG e/ou dT na forma protegida ou as unidades de acoplamento de dinucleotídeos correspondentes no passo de condensação aproI priado como descrito por Y.Ike et al♦, (Nucleic Acid. Research, 1983, 11, 477).

As sondas de ADN têm de conter um marcador de modo que a hibridização com o ARNm desejado pode ser detectada e o ARNm identificado e separado a partir de outro ARNm não codificador de um polipeptídeo dg presente invento. Os marcadores radioactivos adequados sao por exem-33-

plo P no fosfato terminal 5' do oligonucleotídeo, marcadores fluorescentes ou um marcador contendo biotina que pode ser detectado com avidina marcada adequadamente, por exemplo avidina contendo um marcador fluorescente ou conjugado com um enzima tal como peroxidase de rábano.

| A hibridização do ARNm fraccionado em dimensão com as sondas de ADN contendo um marcador é realizada de acordo com os processos conhecidos, isto é em soluções tampão e soluções de sal contendo adjuvantes, por exemplo agentes de quelação do cálcio, compsotos reguladores da viscosidade, proteínas, ADN irrelevante e semelhantes, a temperaturas favorecendo a hibridização selectiva, por exemplo entre 0° e 70°C, por exemplo entre 25° e 40°C para os oligonucleotídeos de 17 meros e entre 30° e 50°C para os oligonucleotídeos de 26 meros, de preferência à volta de 20°C maisbaixo do que a temperatura de fusão do ADNds híbrido .

A preparação de um ADN complementar de cadeia simples a partir do ARNm seleccionado é bem conhecido no domínio, como é a preparação de um ADN de cadeia dupla a partir de um ADN de cadeia simples. O padrão ARNm é I incubado com uma mistura de trifosfatos de desoxinucleosídeo, facultativamente um trisulfato de desoxinucleosídeos marcados radioactivamente (com o fim de ser capaz de seleccionar o resultado da reacção), uma sequência iniciadora tal como um resíduo de hibridização oligo-dT com a cauda poli(a) do mensageiro ARN e um enzima adequado, por exemplo uma transcriptase inversa. Depois da degradação do padrão ARN, o ADN complementar (ADNC) é incubado com uma mistura de trisulfatos de desoxinucleotídeos e um enzima adequado como anteriormente referido para dar um ADN de cadeia dupla. Os enzimas adequados são uma transcriptase inversa, o fragmento Klenow de E. coli ADN polimerase I ou ADN polimerase. Facultativamente, o ADN de cadeia dupla é primeiro au-34-

mentado com uma cauda de desoxinucleotídeos semelhantes para permitir o uso de uma sequência iniciadora de desoxinucleotídeos semelhantes complementares, mas a formação de ADNds começa geralmente por formação espontânea de ganchos. Este ADNds obtido como um resultado de formação de ganchos é também processado com nuclease S1 que corta o gancho.

Como uma alternativa à preparação de ADNc a partir de ARNm, o ADN genómico pode ser isolado e seleccionado a partir do ADN codificador desejado polipeptídeo.

ADN genómico é isolado a partir de tecido humano adequado de preferência a partir de placenta humana ou células de fígado fetal humano de acordo com os métodos conhecidos nesta técnica. Uma biblioteca de ADN genómico é preparado daqui por digestão com endonucleases de restrição adequada, por exemplo Alui e HaelII e incorporação em fago charon JL , por exemplo charon 4A, seguindo os processos estabelecidos. 0 ADN genómico biblioteca replicado em membranas de nitrocelulose é seleccionado com uma sonda de ADN, por exemplo uma sonda de ADN sintético de pelo menos 17 nucleotídeos ou um ADNc derivado a partir de ARNm codificador do polipeptídeo desejado, como aqui descrito anteriormente. Quando se rastreia com um ADNc propagado num microorganismo hospedeiro adequado, este ADNc é marcado por exemplo pela técnica bem conhecida de tradução de fragmentos depois hibridizado com a biblioteca de ADN genómico em soluções contendo sais e tampões e outros adjuvantes como aqui anteriormente descrito, de preferência a temperaturas entre 40 e 80°C, por exemplo cerca de 65°C.

A incorporação de ADNds preparado a partir de ARNm ou de origem genómica num vector apropriado é bem conhecida nesta técnica. Por exemplo, um vector adequado é cortado e provido com caudas de desoxinucleotídeos

I análogos. 0 ADNds a ser condensado tem então de conter caudas de desoxinucleotídeos análogos complementares, que é realizado por incubação na presença do trisulfato de desoxinucleotídeo e uma enzima tal como desoxinucleotidil transferase terminal. Por outro lado, o ADNds pode ser incorporado no vector com a ajuda de oligodesoxinucleotídeos ligantes ou doutro modo por ligação terminal embotada.

A transformação de um hospedeiro apropriado com o vector híbrido obtido é bem conhecido nesta técnica. Por exemplo, E. coli são condicionados por transformação em meio de incubação contendo cloreto de cálcio, depois tratados com o vector híbrido. Os hospedeiros transformados são seleccionados por um marcador adequado, por exemplo marcador de resistência a antibióticos, por exemplo resistência à tetraciclina ou à ampicilina.

A preparação de um ADN do invento também pode ser realizada por meio de síntese química. Os métodos adequados para a síntese de ADN foram apresentados de forma resumida pro S.A.Narang, Tetrahedron, 1983, 39,3. As técnicas de síntese conhecidas permitem a preparação de polinucleotídeos para 40 bases de comprimento, com bom rendimento, pureza elevada e num tempo relativamente curto. Os nucleotídeos protegidos adequadamente são ligados com um outro pelo método de fosfodiéster /^-K.L. Agarwal et al., Angew. Chem. 1972, 84, 489 7 pelo método fosfotriéster mais eficiente /~C.B. Reese, Tetrahedron 1972 , 34, 3143_7, pelo método de fosfito triéster /^-R.L. Letsinger et al., J. Am. Chem. Soc. 1976, 98 , 3655 7 ou pelo método de fosforamidite / S.L. Beaucage e M.H. Caruthers, Tetrahedron Letters 1981, 22 , 1859_7- A simplificação da síntese dos oligonucleotídeos e polinucleotídeos é possível pelo método da fase sólida, em que as cadeias do nucleotídeos são ligadas a um polímero adequado. H. Rink et al. /Nucleic Acids Research 1984, 12, 6369_/ usam trinucleotídeos em vez de nucleotí-36-

deos individuais e ligam-nos pelo método de fosfotriéster na síntese de fase sólida. Um polinucleotídeo com 67 bases pode pois ser preparado num curto espaço de tempo e com bons rendimentos. 0 actual ADN de cadeia dupla é construído enzimáticamente a partir de oligonucleotídeos de sobreposição preparados quimicamente a partir de ambas as cadeias de ADN, que sao unidas juntamente no arranjo correcto por emparelhamento de bases e são depois ligados quimicamente pela enzima ADN ligase. Outra possibilidade compreende a incubação de oligonucleotídeos simples de sobreposição a partir das duas cadeias de ADN na presença dos quatro trifosfatos de desoxinucleotídeos, necessários com uma ADN polimerase, por exemplo ADN polimerase I, o fragmento Klenow de polimerase I ou ADN polimerase ou com AMV (avian myeloblastosis virus) transcriptase inversa. Os dois oligonucleotídeos são por isso unidos juntamente no arranjo correcto pro emparelhamento de bases e são suplementados com os nucleotídeos necessários pela enzima para dar um ADN completo de cadeia dupla /~S.A. Narang et al., Anal. Biochem. 1982, 121, 356_7.

invento refere-se também a vectores híbridos compreendendo um ADN codificador de um composto de fórmula I ou II, seus mutantes e fragmentos de um tal ADN ligado operativamente a uma sequência controlo de expressão, e a processos para a sua preparação.

vector é seleccionado dependendo das células hospedeira consideradas para a transformação. Exemplos de hospedeiros adequados são microorganismos, que são isentos ou pobres em enzimas de restrição ou enzimas de modificação, tais como leveduras, por exemplo Saccharomyces cerevisiae, por exemplo cerevisiae GRF18, e estirpes de bactérias, em particular estirpes de Escherichia coli, por exemplo EM coli X1776, EX coli HB101, E. coli W3110, E.coli HB10J/LM1035, E. coli JA221 ou EX coli K12 estirpe 294, Ba cilus subtilis, Bacillus stearothermophilus, Pseudomonas, Haemophilus, Streptococcus e outros, e além disso células de organismos superiores, em particular linhas celulares de animais ou humanas estabelecidas, por exemplo fibroplastos de pulmão embrioníco humano L-132, células Bowes de melanoma maligno humanas, células Hela, SV-40 vírus células de rins transformados de macacos verdes de África COS-7 ou células de ovário de hamster chinês (CHO). As estirpes anteriores de E. coli, por exemplo E. coli HB101, IS. coli K12 e E. coli W3110 e de Saccharomyces cerevisiae, por exemplo S_. cerevisiae GRF18, são preferidas como hospedeiros, para elém da linha celular do fibroplasto de pulmão embriónico humano L-132.

Em princípio, todos os vectores que replicam e expressam o gene polipeptídico desejado de acordo com o invento no hospedeiro escolhido são adequados. Exemplos de vectores que são adequados para a expressão dos compostos de fórmula I ou II numa estirpe E. coli são bacteriofagos por exemplo derivados de bacteriofagos jL , ou plasmídeos tal como, emparticular, o plasmídeo ColEl e seus derivados, por exemplo pMB9, psF2124, pBR317 ou pBR322. Os vectores preferidos do presente invento são derivados do plasmídeo pBR322. Os vectores adequados contêm um replicão completo e um gene marcador, que permite seleccionar e identificar os hospedeiros transformados com os plasmídeos expressão na base de uma acção fenotípica, e facultativamente sequências e aumentos de sinal. Os genes marcadores adequados conferem ao hospedeiro, por exemplo, resistência em relação a metais pesados, antibióticos e análogos. Além disso, os vectores preferidos do presente invento contêm, fora das regiões do replicão e do gene marcador, reconhecimento de sequências para endonucleases de restrição, de modo que o ADN estrangeiro e, se apropriado, a sequência de controlo de expressão pode ser inserido nestes pontos. 0 vector preferido, o plasmídeo pBR322 e os plasmídeos derivados, por exemplo

-38pUC9 , pUC-KO, pHRil48 e pPLC24, contêm um replicão intacto, genes marcadores, que conferem resistência, por exemplo em

R R relação a tetraciclina e ampicilina (tet ; e amp ), e um número de pontos de reconhecimento único para endonucleases de restrição.

Podem ser usadas várias sequências de controlo de expressão para regularização da expressão genética. Em particular são usadas as sequências de controlo de expressão de genes expresses de forma elevada do hospedeiro a ser transformado. No caso de pBR322 como o vector híbrido e E. coli como o microorganismo hospedeiro, por exemplo as sequências de controlo de expressão (que contêm, inter alia, o promotor e o local de ligação ribossómica) do operão lactose, operão triptofano, operão arabinose e análogos, o gene p>-lactamase, as sequências correspondentes do fago J- N gene, em especial os que contêm o promotor P ou o fago do

Li gene proteína fd-revestido e outros são adequados. Enquanto o plasmídeo pBR322 já contém o promotor do gene p>-lactamase ( Ç> -lac gene) as outras sequências de controlo de expressão devem ser introduzidas no plasmídeo.

levedura e um marcador genético selectivo para Os vectores híbridos que contêm um início de relevedura, por exemplo segmento de replicação são retidos extracromossómicaOs vectores que são adequados para a replicação e expressão na levedura contêm um início de re plicação de a levedura, plicação de autónoma cromossómica (ars), mente dentro da célula de levedura depois da transformação e são replicados autonomamente. Além disso, os vectores híbridos que contêm sequências homólogas para a levedura 2ji plasmídeo ADN podem ser usados. Estes vectores híbridos irão ser integrados por recombinação em plasmídeos 2ji existindo já dentro da célula ou de replicação autónoma. As sequências 2jx são particularmente adequadas para os plasmídeos com uma frequência de elevada transformação e permite números eleva-39-

dos de cópias. 0 vector de levedura preferido do presente invento é o plasmídeo pJDB207.

Os genes marcadores adequados para leveduras são, em particular, os que conferem resistência ao antibiótico para o hospedeiro ou no caso de mutantes de levedura auxotrófica, genes que complementam lesões do hospedeiro. Os genes correspondentes conferem, por exemplo, resistência em relação ao antibiótico de ciclo-heximida ou fornecem protrofia num mutante de levedura auxotrófico, por exemplo o gene URA3, LEU2, HIS3 ou, em particular, o gene TRP1. Os vectores híbridos da levedura contêm além disso de preferência um começo de replicação e um gene marcador para um hospedeiro bacteriano, em particular E. coli, de modo que a construção e clonagem dos vectores híbridos e seus intermediários possam ter lugar num hospedeiro bacteriano.

As sequências de controlo de expressão que são adequadas para a expressão em levedura são, por exemplo os genes de levedura altamente expressos. Assim, os promotores do gene TRP1, o gene ADHI ou ADHII, gene do ácido fosfatase (PHO3 ou PHO5), gene isocitocrómico ou um promotor envolvido com o processo glicolítico, tal como o promotor dos genes da enolase, gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (GAPDH), 3-fosfogliceratoquinase (PGK), hexoquinase, piruvato descarboxilase, fosfofructoquinase, glucose-6-fosfato isomerase, 3-fosfoglicerato mutase, piruvatoquinase, triosefosfato isomerase, fosfoglucose isomerase e glucoquinase podem ser usados .

Os vectores preferidos do presente invento contêm promotores com controlo de transcrição, por exemplo os promotores dos genes PHO5, ADHII e GAPDH que podem ser desprezados ou diminuídos por variação das condições de crescimento. Por exemplo, o promotor PHO5 pode ser re primido ou não apenas por aumento ou diminuição da concen

tração de fosfato inorgânico no meio.

Os vectores adequados para replicação e expressão em células de mamíferos são providenciadas de preferência com ADN de origem virai, por exemplo de simian virus 40 (SV40), Rous sarcoma virus (RSV), adenovirus 2, papiloma virus bovino (BPV), papovavirus BK mutante (BKV) ou citomegalovirus humano ou de ratinho (CMV). De preferência, estes vectores contêm uma origem de replicação e um gene resistente a antibióticos por propagação em E. coli juntãmente com uma sequência reguladora de transcrição eucariótica. Em particular, tais vectores vai-vem assim chamados podem ser construídos a partir de um plasmídeo pBR322 E. coli e SV40 e/ou CMV de regiões promotoras ou de aumento. Por exemplo, o plasmídeo pode conter a unidade de aumento do gene imediato-precoce principal citomegalo virus humano ou de ratinho, aumento do SV40 combinado com o promotor í\-globina humana, e/ou em promotores induzíveis de adição, tal como os derivados a partir de genes metallotioneína ou choque pelo aquecimento. Também é possível utilizar as sequências promotoras ou de controlo que estão geralmente associadas com a sequência de gene desejado. Uma origem de replicação pode ser providênciada quer por construção do vector para incluir uma origem exógena tal como derivado a partir de SV40, outra fonte virai ou providênciada pelo mecanismo de replicação cromossómico dacélula hospedeira. Se o vector é integrado no cromossoma da célula hospedeira, o último método é muitas vezes mais eficiente.

Num exemplo preferido, o presente invento refere-se a vectores híbridos capazes de replicação e selecção fenotípica numa estirpe hospedeira compreendendo um promotor e um ADN codificador de um composto de fórmula I ou II, um seu mutante ou um fragmento, sendo o referido ADN situado juntamente com os sinais de iniciação e terminação de transcrição assim como os sinais de iniciação e ter-41-

minação de tradução no referido vector híbrido sob o controlo do referido promotor como num hospedeiro transformado é expresso para produzir o polipeptídeo.

invento refere-se também a um processo para a preparação de um hospedeiro transformado, que compreende a transformação ou transfecção de um hospedeiro com um vector de expressão contendo um ADN do invento regulado por uma sequência de controlo de expressão, e aos próprios hospedeiros transformados ou transfectados.

Exemplos de hospedeiros adequados são os microorganismos atrás referidos, tais como as estirpes de Saccharomyces cerevisiae, Bacillus subtilis e Escherichia coli. A transformação com os plasmídeos de expressão de acordo com o invento é efectuada, por exemplo, como descrito na literatura, para S_. cerevisiae /^-A. Hinnen, J.B. Hicks e

G.R. Fink, Proc. Natl. Acad. Sei. US A1978, 75 , 1929_7, B. subtilis /~Anagnostopoulos et al., J. Bacteriol. 1961, 81, 741 7 θ E. coli /~M. Mandei et al., J. Mol. Biol. 1970, 53, 159_7.

De acordo, o processo de transformação , , 2+ das células E. coli inclui o pre-tratamento com Ca das células de modo a permitir a absorção de ADN e incubação com o vector híbrido. As células são transferidas para um meio de crescimento selectivo que permite a separação das células transformadas a partir das células progenitoras. As células que não contêm o vector não irão sobreviver num tal meio. A transformação da levedura compreende, por exemplo, os passos de (1) remoção enzimática da parede da célula de levedura por meio de glucosidases, (2) tratamento dos esferoplastos obtidos com o vector na presença de polietileno glicol e de iões de Ca³⁺ e (3) regeneração da parede da célula embutindo os esferoplastos em agar. De preferência, a regeneração em agar é preparada num meio para permitir a

regeneração e selecção das células transformadas ao mesmo tempo.

Outros exemplos de hospedeiros adequados são as células de mamíferos atrás referidas, por exemplo, células COS-7, células Bowes de melanoma, células de ovário de hamster chinês (CHO) ou de preferência células de pulmão embriónico L-132. Os vectores são introduzidos em células de mamíferos por transfecção na presença de compostos auxiliares, por exemplo dietilaminoetildextrano, dimetil-sulfóxido, glicerol, polietileno glicol ou semelhantes, ou como co-precipitados de vector ADN e fosfato de cálcio. Outros métodos adequados incluem a microinjecção directa do vector ADN no núcleo da célula e electroporação, i.e., introdução de ADN por ondas eléctricas curtas aumentando a permeabilidade de membranas da célula. A selecção subsequente de células transfectadas pode ser feita usando um marcador de selecção que é integrado de forma covalente no vector de expressão ou adicionado como uma entidade separada. Os marcadores de selecção incluem genes que conferem resistência aos antibióticos, por exemplo G-418 (neomicina) ou higromicina, ou genes que complementam uma lesão genética da célula hospedeira tal como a ausência de timidina quinase ou hipoxantina fosforibosie transferase.

Um sistema de selecção preferido faz uso de células sem di-hidrofolato reductase (DHFR^-), por exemplo células de CHO, que requerem absolutamente timidina, glicina e purinas para crescimento a não ser que seja fornecido um gene DHFR exógeno. Por introdução de um vector contendo um gene DHFR ligado ao gene codificador dum polipeptídeo do invento em células DHFR^- adequadas, por exemplo células CHO, as células transformadas são seleccionadas por aumento da concentração do composto anti-folato metetrexato no meio. Este tratamento amplifica além disso a produção do polipeptídeo desejado através da amplificação do gene DHFR

-43-Μ juntamente com as regiões cromóssomicas flanqueantes substanciais contendo o gene codificador do polipeptídeo desejado .

Particularmente preferido é um método de selecção em que as células de mamíferos adequadas por exemplo as células L-132 de pulmão embrionário humano, são tratadas com co-precipitadõs de vector de ADN contendo o gene codificador dum composto de fórmula I ou II, um plasmídeo ADN contendo um gene codificador da resistência a antibióticos, por exemplo resistência ao G-418 e fosfato de cálcio. As células transformadas são rastreadas por cultura na presença do antibiótico correspondente, por exemplo G-418,e por rastreio para expressão do polipeptídeo desejado.

As células de hospedeiro transformadas são cultivadas por métodos conhecidos nesta técnica num meio líquido contendo fontes assimiláveis de carbono, azoto e sais inorgânicos.

Podem ser usadas várias fontes de carbono para a cultura dos hospedeiros transformados de acordo com o invento. Exemplos de fontes preferidas de carbono são hidretos de carbono assimiláveis, tais como glucose, maltose, manitol ou lactose ou um acetato, que podem ser usados na sua própria forma ou em misturas adequadas. Exemplos de fontes adequadas de azoto são aminoácidos tais como casaminoácidos, peptídeos e proteínas e seus produtos de degradação tais como triptona, peptona ou extractos de carne, extractos de levedura, extracto de malte e também sais de amónio, por exemplo cloreto de amónio sulfato ou nitrato, que podem ser usados eles próprios ou em misturas adequadas. Os sais inorgânicos que também podem ser usados são por exemplo, sulfatos, cloretos, fosfatos e carbonatos de sódio, potássio, magnésio e cálcio.

meio contém além disso, por exemplo, substâncias promotoras de crescimento, tais como elementos vestigiais, por exemplo ferro, zinco, manganésio e análogos, e de preferência substâncias que exercem uma pressão selectiva e preventiva do crescimento das células que perderam a expressão de plasminogénio. Assim, por exemplo, é adicionado ampicilina ao meio se a expressão plasmldeo contém um gene amp . Uma tal adição de substâncias antibióticas também tem o efeito de ser destruída a contaminação de microorganismos sensíveis ao antibiótico. Se é usado uma estirpe de levedura que é auxotrófica, por exemplo, num aminoácido essencial como o microorganismo hospedeiro, o plasmídeo contém de preferência um gene codificador dum enzima que complementa a omissão de hospedeiro. A cultura da estirpe de levedura é realizada num meio minimamente deficiente no referido aminoácido.

As células de vertebrado são desenvolvidas sob condições de cultura de tecido usando meios disponíveis comercialmente suplementandos facultativamente com substâncias promotoras de crescimento e/ou soros de mamíferos . As células são desenvolvidas ligadas a um suporte sólido, por exemplo um microveículo ou fibras de vidro poroso ou flutuante-livre em recipientes de cultura apropriados.

A cultura é efectuada por processos que são conhecidos no domínio. As condições de cultura, tais como temperatura, valor de pH do meio e tempo de fermentação são escolhidos de modo que seja obtido um título máximo do polipeptídeo do invento. Assim, uma estirpe E. coli ou de levedura é cultivada, de preferência, sob condições aeróbicas por cultura submersa com sacudidela ou agitação a uma temperatura de cerca de 20 a 40°C, de preferência cerca de 30°C, e um valor de pH de 4 a 8, de preferência a um pH de cerca de 7, durante cerca de 4 a 30 horas, de preferência até ser alcançado um redimento máximo do polipeptídeo do invento.

Quando a densidade de células alcançar um valor suficiente, a cultura é interrompida e o polipeptídeo é isolado. Se o polipeptídeo é fundido com uma sequência peptídeo de sinal adequado, é excretado pela célula directamente na camada sobrenadante. Por outro lado, as células têm de ser destruídas , por exemplo por tratamento com | um detergente, tal como SDS, NP-40, Triton® ou ácido desoxicólico, ou lisado com lisozima, um enzima de acção análoga ou com ultra-som. Se é usado levedura como um microorganismo hospedeiro, a parede da célula pode ser removida por digestão enzimática com uma glucosidase. Alternativamente ou em adição, as forças mecânicas, tais como forças de corte (por exemplo prensa X, prensa Francesa, moinho Dyno) ou de sacudir com contas de vidro ou de óxido de alumínio,ou em alternativa congelação, por exemplo em azoto líquido e derreter, por exemplo entre 30°C e 40°C, assim como podem ser usados ultra-sons para cindir as células.

sobrenadante celular ou a solução obtida após centrifugação da mistura obtida por fractura das células, que contêm proteínas, ácidos nucleicos e outros constituintes da célula, é enriquecida em proteínas, incluindo os polipeptídeos do invento, de uma forma que é conheci) da per se. Assim, por exemplo, a maior parte dos constituintes não-proteínas são removidos por tratamento com polietilenoimina e as proteínas incluindo os polipeptídeos do invento são precipitadas, por exemplo, por saturação da solução com sulfato de amónio ou com outros sais. Por outro lado, o sobrenadante ou lisado celular é pré-purifiçado directamen te usando métodos cromatográficos.

Os polipeptídeos preparados por microorganismos criados genéticamente são purificados por uma combinação deseparações cromatográficas, de preferência por uma combinação de cromatografia de permuta iónica com grupos funcionais básicos e ácidos ecromatografia líquida de alta resolução de fase reversa como aqui discutido anteriormente.

Outros métodos de separação podem ser incluindos no protocolo de purificação, por exemplo filtração ou ultra-filtração com membranas cortadas de peso molecular, filtração em gel, cromatografia por afinidade, cromatografia por interacção hidrofóbica, cromatografia por hidroxilapatite, cromatofocagem, e métodos de diálise, dissolução e re-precipitação em soluções adequadas de sal e/ou tampão e misturas solvente.

Preferido é um esquema de purificação em que o sobrenadante lisado celular bruto é cromatográfado em sequência numa coluna de permuta iónica contendo funções amino terciárias, numa coluna de permuta iónica contendo resíduos de ácido sulfónico e numa coluna de cromatografia líquida de fase reversa. Outros esquemas preferidos são aque les em que a cromatografia de permuta iónica é realizada apenas num veículo contendo resíduos de ácido sulfónico, e/ou em que a filtração, isto é a cromatografia por exclusão de dimensões, é incluida no protocolo de purificação.

invento refere-se além disso aos compostos de fórmula I ou II, seus mutantes, fragmentos e derivados, sempre que preparados de acordo com os métodos do presente invento.

O invento refere-se em especial ao ADN, aos vectores híbridos, a células de hospedeiro transformadas, compostos de fórmula I e II e a processos para a sua preparação como descrito nos Exemplos.

As propriedades imuno-reguladoras de um peptídeo relacionado com o factor de inibição de migração de macrófagos humano, um seu mutante, fragmento ou derivado pode ser útil para a terapêutica das doenças imune-reguladoras e doenças inflamatórias crónicas e para a protecção contra as infecções, de preferência na forma de preΛ

-ΙΊparações farmacêuticas que contêm uma quantidade terapêuticamente efectiva do ingrediente activo facultativamente junto ou em mistura com veículos inorgânicos ou orgânicos, sólidos ou líquidos, farmaceuticamente aceitáveis.

As preparações farmacêuticas de acor| do com o invento são as preparações para administração enteral, por exemplo rectal ou oral, e de preferência para aministração parenteral, por exemplo intranasal, intramuscular, subcutânea ou intravenosa, a animais de sangue quente, por exemplo ao homem. Dependendo do método de administração | pretendido, as preparações farmacêuticas podem estar na forma de dose unitária, por exemplo em ampolas, frasquinhos, supositórios, drageias, comprimidos, cápsulas ou spray nasal na forma líquida ou sólida.

A quantidade dos compostos terapêuticamente efectiva a ser administrada depende da condição do animal de sangue quente, por exemplo o homem, tal como o peso do corpo, a natureza e gravidade da doença e a condição geral e também do modo de administração, e é efectuado de acordo com a avaliação do médico que dá o tratamento. A dose efectiva de um composto de fórmula I ou II, de um seu í mutante ou fragmento está na ordem de magnitude de 0,001 a jig por kg de peso do corpo, por dia.

As preparações farmacêuticas de acordo com o invento contêm os veículos vulgares inorgânicos ou orgânicos, sólidos ou líquidos farmaceuticamente aceitáveis, * facultativamente junto com outros compostos terapêuticamen te efectivos e/ou adjunetõs. São usadas de preferência soluções ou suspensões do ingrediente activo, em especial soluções aquosas isotónicas ou suspensões, ou também preparações liofilizadas que são dissolvidas em pouca água antes do uso. As preparações farmacêuticas podem ser esterilizadas e/ou contêm preservativos, estabilizadores, agentes molhantes, emulsificadores, solubilizadores, substâncias de

-48aumento de viscosidade, sais para regularizar a pressão osmótica e/ou tampões, etambém outras proteínas por exemplo preparações de albumina de soro humano e plasma sanguíneo do homem.

As preparações farmacêuticas preferi) das são na forma de liposomas em dispersão aquosa contendo uma quantidade terapeuticamente efectiva de um peptídeo relacionado com FIM, um seu mutante, fragmento ou derivado.

São adequados, em particular, os liposomas que têm uma população de um tamanho tão homógeneo quanto possível e umdiâmetro aproximado de 2,0x10” a 5,0x10 consistindo de uma ou mais cadeias duplas de componentes lípidos, por exemplo lípidos antipáticos, por exemplo fosfolípidos, tais como lecitina, cefalina ou ácido fosfatídico, e facultativamente lípidos neutros, por exemplo colesterol, incluindo uma solução aquosa contendo um peptídeo relacionado com o FIM de acordo com o invento. Os liposomas preferidos consistem de uma mistura de fosfatidilserina e fosfatidilcolina sintéticas .

O invento refere-se também a anticorpos policlonais e monoclonais específicos para um peptídeo • relacionado com o factor de inibição de migração de macrófagos humano, em particular para o MRP-8 de fórmula I e para MRP-14 de fórmula II, e seus derivados.

Os anticorpos policlonais em relação a peptídeos relacionados com MIF são de origem mamíferapor ¹ exemplo ratinhos, ratazanas, coelhos, cabras, carneiros, cavalos, porcos, chimpazés ou de origem humana. Os anticorpos preferidos são de ratinho, ratazanas, coelhos, cabras, ou carneiros, em particular os anticorpos de coelhos. Estes anticorpos policlonais podem conter outros anticorpos que não são anticorpos em relação a compostos de fórmula I e compostos de fórmula II, respectivamente. Em particular, os anticorpos policlonais são uma colecção de anticorpos com dife-49-

rente afinidade e selectividade em relação a peptídeos relacionados com o FIM. Os anticorpos policlonais preferidos são específicos para MRP-8 e específicos para MRP-14, respectivamente.

Os anticorpos preferidos do invento são anticorpos monoclonais em relação a peptídeos relacionados com MIF. Os anticorpos monoclonais são também de origem mamífera, por exemplo, ratinhos, ratazanas ou de origem humana, de preferência anticorpos de ratinhos.

São particularmente preferidos os anticorpos monoclonais em relação a MRP-8 com a designação 8-5C2 e 8-10D7 e os anticorpos monoclonais contra MRP-14 com a designação 14-6B2 e 14-19C9, e seus derivados. Estes anticorpos monoclonais são- segregados pelas correspondentes linhas celulares de hibridoma com a designação 8-5C2, 8-10D7, 14-6B2 e 14-19C9, respectivamente.

Os derivados de anticorpos deste invento são por exemplo fragmentos de anticorpos, anticorpos marcados ^radioactivamente, e conjugados dos anticorpos, por exemplo com enzimas, compostos com propriedades ligantes excepcionais, por exemplo avidina ou biotina, marcadores fluorescentes, marcadores quimioluminescentes ou partículas para magnéticas.

Os fragmentos de anticorpos deste invento são por exemplo Fab,Fab' ou os fragmentos F(ab')2, que retêm a sua especificidade fora os determiantes antigénicos i.e., que retêm a característica ligante padrão do anticorpo progenitor para as proteínas relacionadas com MIF.

Os anticorpos marcados radioactivameni 2 3 i 25 131 14 te contêm por exemplo iodo ( I, I, I), carbono ( C), enxofre ( S), trítio ( H) radioactivos ou análogos. São preferidos os anticorpos marcados com iodo radioactivo, por

exemplo anticorpos monoclonais marcados com I.

Os conjugados de anticorpos do invento são por exemplo conjugados com enzimas tais como peroxidase de rábano, alcalina fosfatase, (S -D-galactosidase, glucose-oxidase, glucoamilase, carboanidrase, acetil colinesterase, lisozima, malato desidrogenase ou glucose-6-fosfato desidrogenase, conjugados com biotina ou avidina ou conjugados com marcadores fluorescentes, por exemplo com fluoresceína ou rodamina B, conjugados com marcadores quimioluminescentes, por exemplo ésteres de acridinio, ou conjugados com partículas paramagnéticas sólidas. Nestes conjugados o anticorpo é ligado ao par de conjungação directamente ou por meio de um grupo espaçador ou de ligação. São preferidos os conjugados de anticorpos monoclonais com os enzimas peroxidase de rábano ou fosfatase alcalina e os conjugados de anticorpos policlonais e monoclonais com biotina.

A selectividade de um anticorpo em relação a uma proteína relacionada com MIF pode ser detectada qualitativamente num imunoensaio de enzima em que as cavidades de uma placa de microtitulação são revestidas com a proteína, depois tratadas com o anticorpo a ser testado, e o anticorpo ligado é detectado com anti-soro marcado dirigido contra o anticorpo. Por exemplo, a selectividade de um anticorpo monoclonal de ratinho do invento é determinada num imuno-ensaio-enzima tipo sandwich em que as cavidades de uma placa de microtitulação são cobertos com um anticorpo policlonal de coelho para uma proteína relacionada com o MIF seguido pela própria proteína, depois tratado com o anticorpo a ser testado e o anticorpo monoclonal ligado é detectado com anti-soro marcado dirigido contra a parte constante de anticorpos em ratinhos.

Os anticorpos monoclonais também podem ser analisados em relação à sua classe e subclasse de imu-51-

noglobulina, por exemplo pelo método Ouchterlony de imuno-difusão usando segunda classe-específica de anticorpos.

Os anticorpos do invento e seus derivados são obtidos por processos conhecidos per se. Os anticorpos policlonais do invento e seus derivados são obtidos por um processo, em que um mamífero adequado é imunizado por duas ou mais injecções de um composto de fórmula I ou II na presença de um amplificador de resposta imunológica, o soro sanguíneo do mamífero imunizado é recolhido e os anticorpos isolados e purificados e, se se desejar, os anticorpos obtidos são transformados nos seus derivados.

Os mamíferos adequados para a preparação de anticorpos policlonal são, por exemplo ratinhos, ratazanas, coelhos, cabras, carneiros, porcos ou cavalos. São usados de preferência ratinhos ou coelhos. São imunizados por duas, três, quatro ou mais injecções do composto de fórmula I ou II, intradermicamente, subcutâneamente, intravenosamente ou intraperitonealmente em intervalos reguladores ou irregulares de alguns dias, por exemplo três a sete dias, até vários meses, por exemplo quatro semanas. O amplificador de resposta imunológica é um adjuvante que estimula a produção de linfócitos, por exemplo adjuvantes de Freund completos ou incompletos.

A resposta imunológica do mamífero é controlada de preferência por um ensaio de anticorpos adequado, por exemplo um imuno-ensaio-enzima como aqui descrito anteriormente. 0 sangue do mamífero é recolhido alguns dias, por exemplo dóis a cinco, após a última dose de imunização. Os anticorpos são isolados por métodos conhecidos, por exemplo por precipitação, centrifugação e/ou processos cromatográficos. Pode ser obtido uma fracção de imunoglobulina impura a partir do soro por precipitação com sulfato de amónio ou análogos. Uma tal fracção de imunoglobulina pode ser também purificada por filtração em gel ou cromatografia por crivos moleculares cromatografia de permuta iónica, cromatografia em celulose DEAE ou cromatografia por afinidade imunológica, por exemplo por material veículo contendo Staphylococcus proteína A ou, de preferência a correspondente proteína relacionada com o FIM.

Os fragmentos de anticorpos, por exemplo Fab, Fab' ou F(ab')2 que retêm a sua especificidade em relação a determinantes antigénicos, podem ser obtidos por métodos conhecidos per se, por exemplo por digestão dos anticorpos com enzimas tais como pepsina ou papaína e/ou clivagem de ligações de dissulfureto por redução química.

Os anticorpos marcados com iodo radioactivo são preparados com sódio radioactivo ou iodeto de potássio e um oxidante químico tal como hipoclorito de sódio, cloramina T ou análogos, ou um oxidante enzimático tal como lactoperoxidase ou glucose oxidase e glucose.

Os conjugados dos anticorpos do invento são preparados por métodos conhecidos nesta técnica,por exemplo por reacção de um anticorpo ou de um seu fragmento preparado como aqui descrito anteriormente com o enzima na presença de um agente de ligação, por exemplo glutaraldeído, periodato, N,N‘-o-fenilenodimaleímida, N-(m-maleimidobenzoíloxi)-succinimida, N-(3-/”2¹-piridiltio_7-propionoxi)succinimida, N-etil-N'-(3-dimetilaminopropil)-carbodiimida ou análogos. Os conjugados com avidina são preparados do mesmo modo. Os conjugados com biotina são preparados por exemplo por reacção de anticorpos com um éster activado de biotina tal como o éster de N-hidroxisuccinimida biotina.

Os conjugados com marcadores fluorescentes ou quimioluminiscentes são preparados na presença de um agente ligante, por exemplo os listados anteriormente, ou por reacção com um isotiocianato, de preferência fluoresceína-isotiocianto. Os conjugados com partículas paramagnéticas são obtidas com

partículas pré-activadas ou por ligação na presença de por exemplo glutaraldeído ou periodato.

Os anticorpos monoclonais do invento e seus derivados são obtidos por processos conhecidos per se, caracterizados pelo facto das células hibridoma que segregam tais anticorpos monoclonais

a) serem cultivadas in vitro e os anticorpos monoclonais isolados a partir do sobrenadante de cultura, ou

b) serem propagados in vivo num mamífero adequado e ós anticorpos monoclonais recolhidos a partir dos fluidos corporais dos referidos mamíferos, e, se se desejar os anticorpos monoclonais obtidos serem convertidos num seu derivado.

Os meios de cultura adequados para a cultura in vitro de acordo com o processo a) são meios de cultura padrão tais como o meio Eagle modificado por Dulbecco ou meio RPMI1640, facultativamente completado por um soro de mamífero, por exemplo soro de vitela fetal, ou outros suplementos mantendo o crescimento, por exemplo 2-aminoetanol, insulina, transferrina, lipoproteína de baixa densidade, ácido oleico e análogos, e elementos traço. A separação dos anticorpos monoclonais é realizada por precipitação da proteína contida nas camadas sobrenadantes da cultura por sulfato de amónio ou análogos, seguido por purificação de imunoglobulina por métodos cromatográficos padrão, tais como filtração em gel, cromatografia de permuta iónica, cromatografia em celulose DEAE ou cromatografia por afinidade imunológica.

A produção in vitro permite aumentar a escala para dar grandes quantidades dos anticorpos desejados. As técnicas para a cultura de hibridoma em grande escala são conhecidas no domínio e incluem uma cultura de suspensão homogénea por exemplo num reactor de elevação de ar ou num reactor de agitação contínua ou cultura de célula

I

imobilizada ou presa, por exemplo em fibras ocas, microcápsulas, em micro-esferas de agarose ou cartuchos cerâmicos.

Também podem ser obtidos grandes quantidades dos desejados anticorpos monoclonais pela propagação de células de hibridoma de acordo com o processo b). Os clones celulares são injectados em mamíferos singeneicos o que causa o crescimento de tumores que produzem anticorpos. Depois de uma a três semanas os anticorpos monoclonais desejados são recolhidos a partir dos fluídos corporais do referido mamífero. Como exemplo as células de hibridoma derivadas de ratinho Balb/c são injectadas intraperitonealmente em ratinhos Balb/c pré-tratados facultativamente com um hidrócarboneto tal como pristano, e depois de uma a duas semanas, é recolhido o fluído ascites destes ratinhos. Os anticorpos monoclonais desejados são isolados a partir de corpos fluidos por métodos conhecidos per se,por exemplo por precipitação das proteínas com sulfato de amónio ou análogos seguido por purificação das imunoglobulinas por métodos cromatográficos padrão, tais como filtração em gel, cromatografia de permuta iónica, cromatografia em celulose DEAE ou cromatografia por afinidade imunológica.

Os fragmentos, derivados marcados radioactivamente e conjugados de anticorpos monoclonais são preparados como aqui descrito anteriormente. Os anticorpos monoclonais marcados radioactivamente também podem ser preparados por adição de nutrientes marcados radioactivamente ao meio de cultura do cultivo in vitro do passo a). Estes nutrientes marcados contêm por exemplo carbono radioactivo (¹⁴C) .

invento refere-se também a linhas celulares de hibridoma, caracterizadas por segregarem anticorpos monoclonais dirigidos contra peptídeos relacionados com MIF, em particular contra MRP-8 de fórmula I e contra MRP-14 de fórmula II.

I

Em particular o invento refere-se a linhas celulares que são híbridas de células de mieloma e linfócitos B de um mamífero imunizado com compostos de fórmula I ou II. De preferência estas linhas celulares são híbridos de células de mieloma de ratinho e linfócitos B de um ratinho singeneico imunizado com compostos purificados | de fórmula I ou II.

São preferidas as linhas celulares de hibridoma com a designação 8-5C2, 8-10D7, 14-6B2 e 14-19C9. Estas linhas celulares de hibridoma são híbridas da linha celular de mieloma de ratinho P 3x63-Ag8.653 e de linfócitos de baço de ratinho Balb/c imunizados com MRP-8 e MRP-14, respectivamente. São linhas celulares estáveis, segregam os anticorpos monoclonais com a designação correspondente e podem ser mantidos em culturas muito congeladas e reactivados por degelo e re-clonagem facultativa.

As linhas celulares de hibridoma preferidas foram depositadas em 9 de Setembro de 1987, na Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, Institut Pasteur, Paris, sob os regulamentos do Tratado de Budapeste. Os números de depósito atribuídos foram: 1-687 para a linha

I celular 14-19C9, 1-688 para a linha celular 14-682, 1-689 para alinha celular 8-10D7 e 1-690 para a linha celular 8-5C2.

invento refere-se também a um processo para a produção de linhas celulares de hibridoma que segregam anticorpos monoclonais que se ligam a compostos de fórmula I ou II, caracterizado por um mamífero adequado ser imunizado com um composto de fórmula I ou II, células produtoras de anticorpos deste mamífero são fundidas com células de mieloma, as células híbridas obtidas na fusão são clonadas, e os clones da célula que segrega os anticorpos desejados são seleccionados.

Os antigenes adequados para a imunização de mamíferos no processo do invento são os compostos preferidos de fórmula I e II, MRP-8 e MRP-14, respectivamente, aqui descrito anteriormente. Os mamíferos preferidos para a imunização são os ratinhos em particular ratinhos Balb/c. As imunizações são realizadas por exemplo, como aqui descrito anteriormente para a preparação de anticorpos policlonais .

As células produtoras de anticorpos dos mamíferos imunizados, de preferência células do baço, tomadas dois a cinco dias após a injecção da dose final são fundidas com células de mieloma de uma linha celular adequada na presença de um promotor de fusão. São conhecidas nesta técnica várias linhas celulares de mieloma. São preferidas as linhas de células de mieloma sem o enzima hipoxantina guanina fosforibosil transferase (HGPRT), ou o enzima timidina quinase (TK), que portanto não sobrevivem num meio de cultura selectivo contendo hipoxantina, aminopterina e timidina (meio HAT). Particularmente preferidos são as células de mieloma e as linhas celulares derivadas que não sobrevivem em meio HAT e não segregam imunoglobulinas ou seus fragmentos, tais como as linhas celulares P3x63-Ag8.653 ou Sp2/O-Agl4. Os promotores de fusão considerados são por exemplo Seudai virus ou outras viroses paramyxo facultativamente na forma inactivada-UV, iões de cálcio, lipidos tensio-activos tais como lisolecitina ou polietileno glicol. De preferência, as células de mieloma são fundidas com um excesso de três a vinte vezes de células de baço a partir de mamíferos imunizados numa solução contendo cerca de 30% até cerca de 60% de polietileno glicol de um peso molecular entre 1000 e 4000 e cerca de 10% até cerca de 20% de dimetilsulfóxido.

Depois da fusão, as células são re-suspensas e cultivadas em meio HAT selectivo.. Assim, ape-57f

nas irão sobreviver as células hibridoma porque combinam a capacidade de crescer e replicar in vitro herdada das células de mieloma e o HGPRT ausante ou os genes TK essenciais para a sobrevivência no meio HAT herdado das células do baço produtoras de anticorpos dos mamíferos imunizados.

Os meios de cultura adequados para a expansão de células de hibridoma são os meios de cultura padrão, tais como o meio Eagle modificado por Dulbecco, meio essêncial mínimo, meio RPMI1640 e análogo facultativamente abastecido por soro, por exemplo 10 a 15% de soro de vitela fetal. Facultativamente são adicionados células de alimentação no inicio do crescimento da célula, por exemplo células de exudado peritoneal de ratinho normais, células de baço, macrófagos da medula óssea, ou semelhantes. Os meios de cultura são suplementados com meio HAT selectivo, emposteriores estádios com meio hipoxantina/timidina (HT), com o fim de evitar o crescimento excessivo das células normais de mieloma face às células de hibridoma.

Os sobrenadantes da cultura de células de hibridoma são rastreados para os desejados anticorpos monoclonal, de preferência um imunoensaio de enzimas ou um radio-imunoensaio. As células de hibridoma positivas são clonadas, por exemplo, por diluição limitadora. As linhas celulares clonadas podem ser congeladas de uma forma convencional .

Os anticorpos policlonal e monoclonal do invento e/ou seus derivados são úteis para a determinação qualitativa e quantitativa de proteínas relacionadas com o MIF em particular de compostos de fórmula I ou II.

Por exemplo, os anticorpos ou seus derivados, tais como conjugados de enzima ou derivados radioactivos, podem ser usados em qualquer dos imunoensaios con hecidos, que contam com as interacção de ligação entre o determinante antigénico das proteínas relacionadas com o MIF e os anticorpos. Exemplos destes ensaios são os radioimunoensaios (RIA), enzima-imunoensaios, por exemplo ensaio imunoadsorvente ligado a enzima (ELISA), imunofluorescência, imunoprecipitação, aglutinação de latex e hemaglutinação. Estes ensaios são úteis por exemplo na determinação qualitativa e quantitativa das proteínas relacionadas com o MIF em fluidos biológicos ou tecidos, por exemplo de doentes com condições inflamatórias e de doente ou seres humanos saudáveis com pré-disposição genética de fibrose cística.

Os anticorpos de acordo com o invento podem ser usados como tal na forma de derivados marcados radioactivamente num ensaio radio-imunológico (RIA). Pode ser usado gualguer das modificações conhecidas de um RIA, por exemplo RIA na fase homogénea, RIA na fase sólida ou RIA na fase heterogénea, RIA simples, ou RIA duplo (Sandwich) com determinação (competitiva) directa ou indirecta da proteína do invento. É preferido um RIA sandwich em que um veículo adequado, por exemplo a superfície de plástico de uma placa de microtitulação ou de um tubo de teste, por exemplo de poliestireno, polipropileno ou cloreto de polivinilo, esferas de vidro ou plástico, papel de filtro ou dextrano, folhas de celulose acetato ou de nitrocelulose ou análogos é coberto com um anticorpo monoclonal ou policlonal do invento por adsorção simples ou facultativamente após activação do veículo, por exemplo com glutaraldeído ou brometo de cianogénio e incubado com a solução teste e uma solução de um anticorpo monoclonal marcado radioactivamen125 te com I, o anticorpo monoclonal dissolvido reconhecendo outro epítopo das proteínas do invento que não o anticorpo monoclonal ligado ao veículo, se tal é usado, e a quantidade das proteínas do invento é determinada por medida da radioactividade ligada ao veículo.

Particularmente preferido é um radio-imunoensaio sandwich como aqui atrás descrito, em que um anticorpo monoclonal do invento é ligado a uma pérola, por exemplo uma pérola de poliestireno, esta pérola revestida é incubada numa solução teste ou solução padrão contendo proteínas relacionadas com o MIP e é finalmente desenvolvido com um anticorpo monoclonal radiomarcado reconhecendo um epítopo diferente.

Os anticorpos de acordo com o invento podem ser usados como tal ou na forma de derivados enzima-conjugado ou biotina-conjugado num imunoensaio em enzima (EIA). Estes ensaios imunológicos incluem os processos teste, em que os derivados de anticorpos monoclonais marcados com enzima de acordo com o invento, anticorpos marcados com enzima conhecidos per se que reconhecem e ligam um epítopo dos anticorpos de acordo com o invento, ou são usados conjugados de avidina-enzima. Qualquer das modificações conhecidas de um EIA pode ser usada, por exemplo EIA em fase homogénea, EIA em fase sólida ou EIA na fase heterógenea,EIA simples ou EIA duplo (sandwich) com determinação (competitiva) directa ou indirecta das proteínas relacionadas com o MIF.

É preferido um ELISA (ensaio imunoadsorvente ligado a enzima) em que um veículo como atrás descrito para um RIA é revestido com um anticorpo policlonal ou monoclonal de acordo com o invento, incubado com uma solução teste contendo uma proteína relacionada com o MIF e depois com um anticorpo policlonal ou monoclonal diferente conjugado com biotina, e, finalmente, o conjugado anticorpo ligado à biotina é desenvolvido por um conjugado de avidina-enzima e a quantidade da proteína ligada é determinada por uma reacção de substrato de enzima.

É também preferido um ELISA em que um

veículo revestido com um anticorpo policlonal ou monoclonal de acordo com o invento é incubado com uma solução teste e com uma solução de um anticorpo monoclonal que é conjugado com um enzima, o anticorpo monoclonal dissolvido reconhecendo um epítopo diferente da proteína relacionada com o MIF do que faz o anticorpo monoclonal ligado com o veículo, se tal é usado. Por uma reacção de substracto de enzima que resulta, por exemplo numa alteraçõa de côr e pode ser observado à vista desarmada ou com aparelhos ópticos de medida, a quantidade de enzima ligado, que é proporcional à quantidade da proteína na solução teste, é determinada.

È também preferido um ELISA em que um veículo revestido com um anticorpo policlonal ou monoclonal de acordo com o invento é incubado com uma solução teste, com uma solução de um anticorpo monoclonal ou policlonal de uma espécie diferente do que o anticorpo ligado ao veículo e depois com um segundo anticorpo marcado com um enzima que reconhece e liga a parte específica do anticorpo dissolvido. A quantidade de enzima ligado é proporcional à quantidade da proteína na solução teste e pode ser determinada por uma reacção de substracto de enzima.

Os anticorpos monoclonais de acordo com o invento podem ser usados como tal ou na forma de derivados conjugados com marcadores fluorescentes em testes de imunofluorescência. Estes testes de imunofluorescência incluem os processos em que são usados os derivados de anticorpos monoclonais de acordo com o invento, por exemplo derivados conjugados com fluoresceína ou anticorpos marcados com marcadores fluorescentes conhecidos per se que reconhecem e ligam um epítopo dos anticorpos monoclonais de acordo com o invento.

É preferido um teste de fluorescência imunológica em que um veículo como atrás descrito para um RIA

é revestido de acordo com os métodos padrão com células a ser testadas relativamente à presença de uma proteína do invento, as células são fixas e permeabilizadas para permitir a interacção de material proteico dentro da célula com soluções aplicadas, depois incubadas com uma solução de um derivado anticorpo policlonal ou monoclonal de acordo com o invento conjugado com um marcador fluorescente, ou incubado com uma solução de um anticorpo policlonal ou monoclonal do invento seguido por uma solução de um segundo anticorpo marcado com um marcador fluorescente que reconhece e liga o anticorpo do invento, por exemplo uma imunoglobulina anti-ratinho de coelho marcada com fluoresceína. A presença de uma proteína do invento é depois detectada e a proteína localizada por microscopia de fluorescência padrão ou citometria de fluxo.

Também é preferido o teste imuno-histológico do enzima correspondente em que as células fixas são incubadas com um anticorpo policlonal ou monoclonal do invento seguido por uma solução de um segundo anticorpo marcado com enzima que reconhece e liga o anticorpo do invento, por exemplo um anti-soro anti-coelho ou anti-rato marcado com peroxidase. A presença de uma proteína do invento é depois detectada e a proteína localizada por uma reacção de substracto de enzima.

uso de acordo com o invento de anticorpos monoclonais e seus derivados como atrás descrito para a determinação qualitativa e quantitativa das proteínas relacionadas com o MIF inclui também outros imunoensaios conhecidos per se, por exemplo análise imunodot, testes de precipitação imunológica com anticorpos marcados com radioactividade ou proteínas relacionadas com o MIF marcados com isótopos radioactivos, aglutinação de latex com partículas de latex revestidas com anticorpos ou revestidas com antigénios hemaglutinação com corpúscupos de sangue vermelho revestidos com anticorpos ou revestidos com antigénios

-62ou análogos.

invento refere-se também a conjuntos de testes para a determinação qualitativa e quantitativa de proteínas relacionadas com o MIF, em particular de compostos de fórmula I ou II, contendo anticorpos policlonais e/ou monoclonais do invento e/ou seus derivados e, facultativamente, outros anticorpos monoclonais ou policlonais e/ou adjuvantes .

conjunto de testes de acordo com o invento para um ensaio radioimunológico contém, por exemplo, um veículo adequado, não revestido ou revestido com um anticorpo policlonal ou monoclonal do invento, facultativamente seco por congelação ou soluções concentradas de um anticorpo monoclonal ou policlonal para um composto de fórmula I ou II e/ou um seu derivado marcado radioactivamente, soluções padrão do correspondente composto de fórmula I ou II, soluções tampão e, facultativamente, polipeptídeos e detergentes para a prevenção de adsorção não-específica e formação de agregados, pipetas, vasos reaccionais, curvas de calibração, manuais de instrução e análogos.

conjunto de testes de acordo com o invento para um ensaio imunológico com enzima contém, por exemplo um veículo adequado, por exemplo pratos de microtitulação ou folhas de nitrocelulose, facultativamente seco por congelação ou soluções concentradas de um anticorpo policlonal ou monoclonal para um composto da fórmula I ou II e de um anticorpo monoclonal ou policlonal marcado com enzima ou marcado com biotina para esta proteína, soluções de um conjugado de avidina com enzima, se é usado um anticorpo marcado com biotina, substractos de enzima na forma sólida ou forma dissolvida, soluções padrão de uma proteína do invento, soluções tampão e, facultativamente, polipeptídeos e detergentes, pipetas, vasos reaccionais, curvas de calibra-63-

ção, tabelas de escala de côr, manuais de instrução e análogos .

Os anticorpos monoclonais e derivados anticorpos do invento são usados para a determinação qualitativa e quantitativa das proteínas relacionadas com o MIF, em particular de compostos de fórmula I ou II, por exemplo MRP-8 e MRP-14, respectivamente, de preferência em ensaios imunológicos com enzima. A determinação de confiança da quantidade de MRP-8 e MRP-14 em fluidos biológicos, secções de tecido e células permite uma simples detecção de condições inflamatórias e/ou pré-disposição genética para fibrose cística. Além disso, os anticorpos monoclonal e derivados anticorpos podem ser usados na separação e purificação das proteínas relacionadas com o MIF do invento a partir de fontes naturais ou de células hospedeiro recombinante por cromatografia de afinidade imunológica.

Os peptídeos MRP-8 e MRP-14 relacionados com o MIF deste invento ocorrem em quantidades variáveis de granulócitos normais e monocitos dependendo dos doadores. Após cultura de granulocito e monocitos, o número de células positivas de MRP-8 e MRP-14 aumenta até ao 32 dia de cultura e depois diminui aproximando-se dos níveis zero a partir do décimo dia. MRP-8 e MRP-14 parecem não estar presentes em tecido humano normal excepto em monocitos intravasculares por exemplo em fígado, MRP-14 também em monocitos no pulmão e em placenta.

No entanto, em lesões inflamatórias crónicas são detectadas macrófagos positivos MRP-8. No caso de sarcoidose dérmica também as células endoteliais contêm MRP-8. Os macrófagos MRP-14-positivos são vistos em número substancial em tecido de artritereumatóide MRP-8 e MRP-14 são expressos por subconjuntos de tecido de macrófagos em poliartrite crónica primária e outras inflamações crónicas

num padrão diferente de inflamação aguda tal como gengivite.

invento refere-se portanto a um método de diagnose de condições inflamatórias crónicas caracterizadas pelo facto dos anticorpos para MRP-8 e para MRP-14 aqui descritos anteriormente serem usados para determinar a quantidade e padrão de expressão de MRP-8 e MRP-14 em tecido .

A fibrose cística (FC) é uma doença recessiva autossómica cuja etiologia não é ainda conhecido. Há necessidade de um método simples que permite a determinação rápida e de confiança se um indivíduo é normal, FC heterozigótico ou FC homozigótica. Os heterozigotos de FC não são clinicamente afectados mas podem transmitir a doença à geração seguinte.

Um programa de rastreio de amostras de plasma de dadores saudáveis, heterozigotos de FC, hoozigotos de FC e doentes com diferentes condições inflamatórias e alérgicas e outras doenças revela a utilidade de MRP-14 como um marcador para fibrose cística (Tabela).

Tabela: Determinação de MRP-14 em amostras de plasma

Tipo de Amostra	Amostras Testadas	MRP-14 média	c) gama
Dadores saudáveis	39	0,043	0,003-0,132
homozigotos de FC	11	1,076	0,204-5,78
heterozigotos de
FC	7	0,611	0,161-1,020
poliartrite
reumatoide	13	0,618	0,093-1,48
Asma	2	0,595	0,357-0,476
linfoma de
células T	2	1,32	0,240-2,04
Neurodermite	1	1,840	-
Psoríase	6	0,027	0,014-0,036
... _{Ί Λ} b) Miscelânea	7	-	< 0,030

a) ELISA tipo sandwich do Exemplo 42, duas experiências independentes por amostra (desvio padrão dentro de 10%)

b) Micose fungoide, sarcoidose, lepra, dermatite por contacto

c) valor mais alto e mais baixo observado.

A quantidade média de MRP-14 encontrada em dadores saudáveis é 0,043 jig/ml com um valor máximo de 0,132 ^u.g/ml. Os doentes que sofrem de FC mostram uma concentração de plasma entre 0,204 e 5,78 jig/ml com um valor médio de 1,076 ^ig/ml. Os heterozigotos de FC, i.e., os dadores de plasma que são progenitores de doentes de FC, mas não afectados clínicamente, mostram concentrações médias de MRP-14 de 0,611 jxg/ml com um valor mínimo de 0,161 pg/ml. Tendo em conta a reprodutibilidade do ensaio padrão de

+ 10%, será possível portanto julgar com um grau de confiança se um indivíduo é heterozigótico em FC ou não com um limite de cerca de 0,15 pg/ml.

Os doentes que sofrem de poliartrite reumatóide, asma, linfoma com células T e neurodermite mos) tram também níveis elevados de MRP-14, enquanto que os doentes com várias outras doenças incluindo psoríase têm concentrações de MRP-14 na gama normal.

A quantidade de MRP-8 encontrada em amostras de plasma de dadores saudáveis, homozigotos de FC e heterozigotos de FC é geralmente menor do que 0,01 pg/ml e não indicativa de fibrose cística.

O invento refere-se também a um método de diagnose de confiança de fibrose cística, caracterizado por os anticorpos para MRP-14 atrás descritos serem usados para determinar a quantidade de MRP-14 em amostras de plasma de indivíduos saudáveis de outro modo supostos ser homozigóticos ou heterozigóticos em fibrose cística.

A Figura 1 mostra geles de poliacrilai mida de SDS-PAGE sob condições de redução (A) e não-redução (B) como descrito no Exemplo 1.2. Linha 1 e 2: marcadores de peso molecular. Linha 3: proteína total na forma eluída da coluna 1C5 de imuno-afinidade do Exemplo 1.1 Linhas 4 a 10: fracções I a VIII de HPLC.

A Figura 2 dá uma representação esquemática do ADNC de MRP-8 de fórmula VII isolado a partir dc clone 3. Na parte A, a região de codificação é apresentada. Os números dentro de um círculo referem-se a posições de base à qual o ADNc isolado de outros clones difere do ADNc do clone 3 e outros factos especiais discutidos no Exemplo 10. A Linha B mostra as posições dos pontos de restrição

usados para a sequência. A parte C resume a sequência de estratégia mostrando o inicio (linha vertical) e o fim (ponta da seta) da sequência no local de restrição, fim de sequência pura (ponto) e fim de ADN do clone respectivo (cruz). Os números referem-se a diferentes números de clones, as letras a método de sequênciação (S:Sauger, MG:Maxam e Gilbert).

A Figura 3 dá uma representação esquemática do ADNc de MRP-14 de fórmula IX com a região de codificação (linha A), posição dos locais de restrição usados para a sequênciação (linha B) e estratégia sequencial (linha C) aplicado ao clone MRP-14-10, ao clone MRP-14-16 e clones MRP-14-15, 18 e 19 (Exemplo 11). A figura mostra o início (linha vertical) e final (ponta da seta) da sequênciação e fim da sequência pura (ponto).

A Figura 4 dá uma representação esquemática do ADN genómico de fórmula VIII (MRP-8). A linha inferior mostra as posições dos pontos de restrição usados para a sequência, as posições do exão 1, 2 e 3 (barras) e a sequência de codificação entre os tripletos ATG e TAG (barras a preto). A linha superior resuma a estratégia de sequência melhorando o inicio da sequência nos locais de restrição e final de sequência legível ou fim da sequência nos locais de restrição. 0 método de sequênciação foi de acordo com o Sanger e Coulson.

A Figura 5 dá uma representação esquemática do ADN genómico de fórmula X (MRP-14). As posições de pontos de restrição, de exões 1, 2 e 3 (barras) e da sequência de codificação entre os tripletos ATG e TAA (barras a preto) são apresentados. A estratégia de sequência pode ser deduzida a partir de setas: A sequência foi lida a partir de um local de restrição (início da seta) até ao local de restrição seguinte ou fim de sequência legível. Foi usado o método de sequênciação de Sanger e Coulson.

i

A Figura 6 representa um mapa de restrição de plasmídeo pCMVe/MRP-8 com as posições relativas R de origem Ori, o gene de resistência ampicilina Amp , o amplificador CMV humano e os três exões do gene codificador para MRP-8.

A Figura 7 mostra um mapa de restrição do plasmídeo pCMVe/MRP-14 com a posição relativa da Origem

R

Ori, o gene de resistência à ampicilina Amp , o amplificador CMV humano, a região do promotor de MRP-14 e os três exões codificadores de MRP-14.

A Figura8 mostra a concentração doplasma de dadores saudáveis normais (A) e um total de 18 doentes de fibrose cística (FC) em que os círculos abertos representam homozigóticos e os pontos cheios a preto representam heterozigóticos (B). A representação é numa escala logarítmica em ng/ml MRP-14. As amostras de plasma tomadas com heparina são feitas até fluoreto de fenil metanossulfonilo 1 mM e testadas em duplicado pelo ELISA tipo sandwich do Exemplo 42 usando oanticorpo policlonal para MRP-14 do Exemplo 35.

Os exemplos que se seguem servem para ilustrar o presente invento mas não devem ser considerados como uma sua limitação.

As abreviaturas usadas nos Exemplos

têm os seguintes significados:
ATP	adenosina trifosfato
bp	pares de bases
BSA	albumina de soro bovino
ADNc	ADN complementar
cpm	ciclos por minutos (decainvento radioactivo) \|
dA	2-desoxiadenosina

dATP	2¹-desoxiadenosina trifosfato
dC	2¹-desoxicitidina
dCTP	2'-desoxicitidina trifosfato
DEAE	dietilaminoetilo
dG	2¹-desoxiguanos ina
dGTP	2'-desoxiguanosina trifosfato
DMEM	Meio de Eagle modificado por Dulbecco
DMSO	dimetilsulfóxido
ADN	ácido desoxiribonucleico
dNTP	mistura de dATP, dCTP, dGTP, e dTTP
dpm	desintegrações por minuto (decadência radioactiva)
ADNds	ADN de cadeia dupla
dT	(2'-desoxi)timidina
DTT	1,4-ditiotreitol
dTTP	timidina trifosfato
EDTA	ácido etilenodiamino-tetraacético
FAB-MS	espectroscopia de massa por bombardeamento átomos rápidos	de
FCS	soro de vitela fetal
FPLC	cromatografia líquida rápida de proteínas, peptídeos e polinucleotídeos	poli-
HAT	hipoxantina/aminopterina/timidina
HBS	soro fisiológico tamponado com Hepes.
Hepes	ácido N-2-hidroxietilpiperazina-N'-2-etanosulfónico
HPLC	cromatografia líquida de alta resolução
igG	imunoglobulina G
Kb	quilobase
KD	quilo-Dalton(peso molecular)
MEM	meio de Eagle essencial mínimo
MIF	factor de inibição de migração de macrófagos
ARNm	Arn mensageiro
MRP	peptídeo relacionado com o MIF
DO	densidade óptica
PAGE	electroforese com gel de poliacrilamida
PBS	soro fisiológico tamponado com fosfato
PMSF	fluoreto de fenilmetilsulfonilo

-70I

RNA	ácido ribonucleico
rpm	rotações por minuto
SDS	dodecil-sulfato de sódio
TFA	ácido trifluoroacético
Tris	Tris(hidroximetil)aminometano
ARN	ARN de transferência

	São usados as soluções tampão e meios
seguintes:
solução de Denhardt	0,1% polivinilpirrolidona (PVP-360, Sigma), 0,1% Ficoll 400 (Farmácia), 0,1% BSA.
tampão de eluição	2 0 Π’Μ Tris-HCl, pH=7,5, 1 mM EDTA, 0,2% SDS.
tampão GuSCN	4M guanidinio isotiocianato, 50 mM Tris-HCl, pH=7,5, 10 mM EDTA, 2% sódio N-lauroilsarcosinato (sarkosil), 140 mM β -mercaptoetanol.
Meio LB (meio L)	1% Bacto^triptona (Difco), 0,5% BAC- TC^ extracto de levedura (Difco), 170 mM NaCl, ajustado para pH=7,5 com HaOH.
PBS	136 mM NaCl, 2 mM KC1, 8 mM Na₂HPO₄, 1,4 mM KH₂PO₄.
RVT tampão	200 mM Tris-HCl, pH=8,3 a 42°C, 20 mM MgClg, 280 mM KC1, 20 mM DTT.
meio SOC	2% triptona (Gibco), 0,5% extracto de levedura (Gibco), 10 mM NaCl, 2,5 mM KC1 , 10 mM MgCl₂,5 mM MgSO₄, 20 mM glucose.
SSC tampão	15 mM citrato de sódio, 150 mM NaCl, ajustado para pFt=7,0 como NaOH.
TBE tampão	89 mM Tris (TRIZMA^ base), 89 mM ácido bófcico 1 mM EDTA.

I

-7110 mM Tris-HCl, pH=8,0, 1 mM

EDTA, 0,1 M NaCl.

TNE tampão

tampão de lavagem mM Tris-HCl, pH=7,5, 1 mM EDTA, 0,5 M NaCl, 0,2% SDS.

Exemplo 1: Separação e purificação de peptídeos relacionados com o MIF naturais

1.1. HPLC de fase reversa

Células mononucleares humanas são esti muladas e cultivadas e os sobrenadantes de cultura das células resultantes são concentrados e purificados por uma coluna de cromatografia por imuno-afinidade transportando anticorpos monoclonais 1C5 como descrito no Pedido da Patente Europeia 162.812. As fracções contendo as proteínas são preparadas em TFA a 1% e separadas em porções de 1,1 ml numa coluna HPLC de fase reversa Vydac® 214TP5415 (The Separations Group, Hesparia CA, USA) usando equipamento Waters Inc. HPLC. A coluna é equilibrada numa mistura de 65% de TFA 0,1% em água e 35% de TFA 0,07% em acetonitrilo e o produto foi eluido com um gradiente linear durante 30 minutos finalizando com uma mistura de45% de TFA a 0,1% em água e 55% de TFA a 0,07% em acetonitrilo com um caudal de 1 ml/min. O eluato é controlado para absorvância a 220 nm com um detector Kratos Spectroflow 773 HPLC UV. São recolhidos manualmente sete picos individuais com tempos de retenção de 11,8 minutos (I), 12,6 minutos (II), 13,4 minutos (III), 14,4 minutos (IV), 15,2 minutos (V), 16,0 minutos (VI) e 16,6 minutos (VII) de acordo com a absorvância em UV.

ι

1.2. Análise por PAGE-SDS

São analisadas partes aliquotas das fracções I a VII por PAGE-SDS sob condições de redução e não-redução /^-U.K. Laemmli, Nature 1970, 22 7) 680 7 e manchado com Coomassie Blue R-250 (Figura 1). As partes alíquotas (1-5%) das fracções de HPLC sãosecas in vacuo, dissolvidas em 20 p.1 de tampão de dissociação com ou sem (redutor) DTT (1%), aquecidas durante 2 minutos a 96°C e aplicadas a gel de poliacrilamida a 15%.

A proteína da fracção I é idêntica a proteína MIF humano de peso molecular aparente de 8 KD descrito na Patente Europeia 162.812. A fracção II contém a proteína MIF dimérica aparecendo como uma banda dupla a 16,5 KD sob condições de não-redução e como uma banda forte a 8KD com uma banda de movimento ligeiramente mais rápido, fraca sob condições de redução. A proteína da fracção III aparece a 14KD sob condições de redução e não-redução e é chamada MRP-14. A proteína da fracção IV exibe uma banda dupla a 13 KD e é chamada MRP-14. A proteína da fracção V com peso molecular aparente de 20 KD consiste no heterodímero ligado por dissulfureto da proteína MIF de 8 KD e MRP-14 como apresentado sob condições de redução. A proteína da fracção VI de 17,5 KD é também heterodímero ligado por dissulfureto de uma proteína de 8 KD e a proteína de fracção VII que aparece a 23,5 KD é o dímero de MRP-14 ligado por dissulfureto.

I

1.3. Método alternativo de separação de peptídeos relacionados com o MIF naturais

Ê feita a diálise de 770 ml do sobrenadante concentrado de células mononucleares humanas cultivadas do Pedido de Patente Europeia 162.812 extensivamente contra tampão acetato de sódio (NaOAc) 50 mM, pH=4 e bombeado sobre uma coluna (2,6x10 cm) de permuta iónica SP Trisa-73-

cry (LKB). A coluna é lavada até se atingir a absorção no UV de 254 nm no nível da linha de base. As proteínas ligadas à coluna são eluídas usando um gradiente linear de NaCl em NaOAc 50 mM, pH= 4,0, na gama de 0,0 M a 1,0 M de NaCl (300 ml) com um caudal de 1,8 ml/min. As fracções individuais de 18 ml são recolhidas e analisadas por PAGE-SDS.

MRP-8, MRP-14 e MRP-14¹ são eluidas juntamente nas mesmas fracções entre 250 ml e 280 ml do volume de gradiente total correspondente aproximadamente até NaCl 0,8 M-0,9 M. 0 conjunto das fracções contendo MRP é concentrado por ultra filtração numa membrana YM-1 d® (Amicon) e tornado 1% em TFA. A separação de MRP-8 puro, MRP-14 e MRP-14', respectivamente é atingida numa coluna de HPLC de fase inversa Vydac® 214 TP 510 (The Separations Groups, USA). A coluna é equilibrada numa mistura de 75% de TFA a 0,1% em água e 25% de TFA a 0,07% em acetonitrilo, e as proteínas são eluídas por um gradiente linear durante 45 minutos terminando com uma mistura de 45% TFA a 0,1% em água e 55% TFA a 0,07% em acetonitrilo com um caudal de 3 ml/minuto. O eluato é controlado para absorvância a 235 nm. São recolhidos manualmente picos individuais de acordo com a absorção lida. MRP-8, MRP-14 e MRP-14¹ são identificados por comparação com os peptídeos isolados de acordo com o Exemplo 1.1.

Exemplo 2: Clivagem enzimática de MRP-14

São incubados 25 pg da proteína de fracção III (Exemplo 1) chamada MRP-14 durante 6 horas à temperatura ambiente com 0,5 pg de Staphylococcus aureus V8 protease (Cooper Biomedical) em 100 pl 50 mM de NH^HCO^. O progresso de digestão é controlado por análise de pequenas partes alíquotas (2%) da mistura de incubação nome coluna de HPLC de fase reversa Vydac®214 TP 5415 (The Separations

Group). As separações preparativas dos fragmentos de peptídeos são conseguidas na mesma coluna com um gradiente linear de 50 minutos a partir de 100% de TFA a 0,1% em água até 100% de TFA a 0,07% em acetonitrilo com um caudal de 1 ml/minuto . São recolhidas manualmente três fracções de acordo com a absorvância em UV a 220 nm para tempos de retenção de 20,7 minutos (A), 22,7 minutos (B) e 24,8 minutos (C).

Exemplo 3: Análise de sequência de aminoácidos de Staphylococcusaureus V8 protease fragmentos de MRP-14

As fracções A, B e C (Exemplo 2) são evaporadas in vacuo, dissolvidas cada uma em 25 μΐ 0,1% de TFA aquoso e sujeitas a uma determinação de sequência de aminoácidos num modelo 470 sequencial de proteínas em fase gasosa de Biosistemas Aplicados.

As sequências de aminoácidos N-terminais encontradas são:

1 0

Thr-Ile-Ile-Asn-Thr-Phe-His-Gln-Tyr-Ser-Val-Lys-Leu-Gly(A)

(B)

(C)

em que X_n representa um aminoácido não determinado na posição a partir do terminal N.

Exemplo 4: Separação de ARN mensageiro de leucócitos de sangue mononucleares humanos

São isolados Ι,δχΙΟ^θ de leucócitos de sangue mononucleares humanos a partir de coágulos brancos e tratadas com concanavalina A durante 2 horas como descrito no Pedido de Patente Europeia 162.812. Depois de 16 horas de incubação a 37°C em meio RPMI1640 (5% de COg) em culturas giratórias, as células são recolhidas por centrifugação durante 15 minutos a 350 x g. A pastilha celular macia de aproximadamente 10 ml é dissolvida em 50 ml de GUSCN tampão e homogenizada num omnimisturador Sorvall (100 ml) à velocidade máxima durante 90 segundos. Subsequentemente, a solução é misturada completamente com 60 ml de fenol anteriormente equilibrada com uma solução contendo 10 mM tris-HCl, pH=7,5, 100 mM NaCl e 1 mM EDTA. A separação de fases é atin gida por adição de 60 ml de clorofórmio, por mistura e centrifugação a 3000 rpm numa centrifugadõra. A fase aquosa incluindo alguma interfase não viscosa é recolhidae são adicionados em sequência 60 ml de fenol em equilíbrio com clorofórmio. A mistura é centrifugada e a fase aquosa é a interfase não viscosa são recuperados. Estes passos são repetidos 3-4 vezes até toda a interfase ter desaparecido virtualmente. Os ácidos nucleicos são precipitados a -20°C por adição de 2 volumes de etanol (100 ml). O ARN é depois purificado a partir de ADN contaminador como se segue: os ácidos nucleicos são dissolvidos em 6 ml de HgO.1,5 ml de EDTA 0,5 M, pH= 7,5 depois uma mistura de 7,5 g de CsCl e 215 jul de HC1 IN são adicionados . A solução é separada em camadas sobre duas almofadas de 2 ml de 5,7M CsCl em 0,lM EDTA, pH=7,5 (final) em dois tubos TST41 (Kontron). Os tubos são cheios com HgQ _e centrifugados num rotor TST41 durante 16

horas a 20°C. No fim da experiência a maior parte da camada sobrenadante é removida e o tubo é drenado por rápida inversão. A pastilha de ARN vítrea é dissolvida em 4 ml de eluição tampão por vortex e aquecimento ocasional (2 minutos) a 37°C. O ARN é precipitado por adição de 10 ml de etanol e centrifugação num rotor HB4 (Sorvall) durante 10 minutos. O ARN (9,5 mg) é seco brevemente e dissolvido em 0,4 ml de tampão de eluição. Depois de aquecimento durante 2 minutos a 68°C e arrefecimento em gelo, são adicionados 0,44 ml de NaCl, 5M e a solução é aplicada a uma coluna contendo 0,5 g oligo-dT celulose (tipo 7, Pharmacia) equilibrado em tampao de lavagem. Depois de três aplicações subsequentes da amostra, a coluna é lavada com 15 ml de tampão de lavagem, e o ARN ligado eluido com 4 ml de tampão de eluição. O material eluído é aquecido durante 2 minutos a 68°C, arrefecido e são adicionados 0,44 ml de NaCl 5M. A solução é aplicada à coluna de oligo-dT celulose re-equilibrada (três vezes). Após lavagem com 15 ml de tampão de lavagem, o ARN ligado é eluido com 4 ml de tampão de eluição. O ARN é precipitado durante a noite a -20°C por adição de 0,25 ml de NaOAc 3M, pH=5,5 e 10 ml de etanol. O precipitado (110 jig) é recolhido por centrifugação (15 minutos a 16.000 x g), dissolvido em 0,4 ml de f^O e re-precipitado por adição de 25 jil de NaOAc 3M e 1 ml de etanol . Depois de arrefecimento em neve carbónica durante 10 minutos o ARN é recolhido por centrifugação durante 5 minutos numa centrífuga Eppendorf. A pastilha é seca ao ar e dissolvida em 110 ^11 de HgO.

Exemplo 5: Fraccionamento de dimensão de ARN poliadenilado

p.g de ARN poliadenilado (Exemplo 4) são desnaturados a 80°C durante 2 minutos em 200 pl de 50% de DMSO, 10 mM de Tris-HCl, pH=7,5, 1 mM EDTA e 0,5% de SDS.

Depois de arrefecimento e adição de 300 pl de HgO, a solução é posta em camadas sobre 11,5 ml de um gradiente linear de

sacarose de 5-15% peso/volume em 100 mM de NaCl, 10 mM de Tris-HCl, pH=7,5, EDTA 1 mM e 0,5% de SDS num rotor TST41 (Kontron). Depois de centrifugação a 41000 rpm durante 4horas e meia a 25°C, são recolhidos 30 fracções. de 0,4 ml e registados espectros de UV individuais. O ARN das fracções individuais é precipitado por adição de 15 jil de NaOAc 0,3M, pH=5,5 e 1 ml de etanol. Depois de incubação durante a noite a -20°C, o ARN é recolhido por centrifugação dissolvido e re-precipitado como anteriormente. Finalmente o ARN é dissolvido em 20 jil de HgO.

Exemplo 6: Localização de MRP-ARNm entre o ARN fraccionado em dimensões

Os oligodesoxinucleotídeos mistos são sintetizados na base da sequência de aminoácidos parcial conhecida de MRP-8. A mistura 1 de oligodesoxinucleotídeos tem a composição 5¹-TAYTTRTGRTANACRTC-3¹, em que A, T, Ge C representam adenosina, timidina, guanosina e citosina,respectivamente, Y e R pirimidinas (T, c) e purinas (A, G), respectivamente, e N para qualquer dos quatro desoxinucleotídeos. A mistura 2 de oligodesoxinucleotídeos é composta de 5¹-TCYTTRAACCANACRTC-3¹, em que os códigos têm o mesmo significado qua anteriormente. Estas duas misturas de 64 e 32 meros, 17 diferentes representam as possíveis cadeias de ADN complementares dos aminoácidos 14-19 e 52-57, respectivamente, de MRP-8. Os oligodesoxinucleotídeos são sintetizados seguindo o processo de Y. Ike et al. ,Nucleic Acid Research 1983, 11, 477. Os extremos 5' dos oligodesoxinucleo- tídeos são tornados radioactivos (1-2x10 dpm/ug) usando y - P-dATP (5000 Ci/mmol) e polinucleotídeo quinase (Pharmacia) usando processos padrão (T. Maniatis, E.F. Fritsch e

J. Sambrook, Molecular Cloning, a Laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982 ). 2x2 jil do ARN fraccionado em dimensão do Exemplo 5 são colocados em filtros de réplica (Pall-Biodyne ) e aquecidos a 80 C durante 2 horas num

-78forno de vácuo. Os filtros são pré-hibridizados durante 3 horas a 32°C em 50 ml de uma solução de Denhart contendo NaCl 0,9M, 180 mM de Tris-HCl, pH=8,0, 6 mM EDTA, 0,5% de SDS e 50 pg/ml de ADN de cadeia simples do timo de vitela. Depois da remoção da solução de pre-hibridização, um filtro é hibridizado durante 36 horas a 29°C em 1,5 ml de solução de pre-hibridização contendo em adição 5x10 dpm de mistura 1 de oligodesoxinucleotídeos. O segundo filtro é hibridizado a 32°C na mesma solução contendo 5x10 dpm da mistura 2 de oligodesoxinucleotídeos. No fim da hibridização os filtros são lavados a 25°C (filtro 1) e 29°C (filtro 2) 15 minutos com 250 ml de 0,6M NaCl, 0,12M Tris-HCl pH=8,0, 4 mM EDTA e 0,2% de SDS e quatro vezes 15 minutos com 250 ml de 0,3 m NaCl, 0,06M Tris-HCl, pH=8,0, 2 mM de EDTA e 0,2% de SDS. Depois de secagem os filtros são expostos durante 3 dias a -80°C em filme de raios-X usando um Ilford Fast Tungstate Screen®. Por comparação das réplicas, a fracção 23 (9 S) é estimada para conter a maioria de MRP-8 ARNm.

Exemplo 7: Localização de MRP-14 ARNm entre o ARN fraccionado em dimensão

É sintetizado uma mistura 3 de oligodesoxinucleotídeos da composição 5 '-TAYTGRTGRAAIGTRTTIATIATNGT-;!', em que I representa inosina, por exemplo uma mistura de 64 meros 26 representando a possível cadeia de ADN complementar de um ARNm codificador de aminoácidos 1-9 do fragmento de _z 9 peptideo A do Exemplo 3, e tornado radioactivo (1-2x10 dpm/ /|ig) como descrito no Exemplo 6.

O ARN fraccionado em dimensão é preparado como descrito no Exemplo 5 excepto que são recolhidas fracções de 0,3 ml e o arn precipitado é dissolvido em μΐ de H₂O.

2x2 ul deste ARN são em filtros réplica e aquecidos até 80°C. Os filtros são pré-hibridizados, depois hibridizados na presença de 5x10 dpm da anterior mistura 3 de oligodesoxinucleotídeos e lavados como descrito no Exemplo 6, excepto que a temperatura de hibridização é de 37°C. Por comparação das réplicas em filme de Raios-X as fracções 12 e 13 são estimadas para conter a maioria de MRP-14 ARNm.

Exemplo 8: Clonagem ADNc de MRP-8

8.1. Preparação do ADNc ds

São incubados 3 pg de 9S ARNm codificador de MRP-8 da fracção 23 (ver Exemplo 6) durante 90 minutos a 42°C numa mistura reaccional de 50 pl contendo 100 mM de Tris-HCl (pH=8,3 medido a 42°C), 10 mM de MGC1₂, 140 mM de KC1, 10 mM de DTT, 1 mM de cada dNTP, 100 pg/ml de oligo-dT_{12 18} (Pharmacia), 90 unidades R Nasin (Genofit), 40 unidades AMV transcriptase inversa (Genofit) e 30 pCi de - P-dCTP (3000 Ci/mmol). A reacção é interrompida por adição de 2 pl de 0,5M EDTA, pH=7,5. O ARN é degradado por incubação com 25 pl de 0,15N NaOH durante 1 hora a 65°C.A solução é neutralizada por adição de 25 pl de Tris-HCl, pH=8,0 e 6 pl de HC1 1N. Depois de adição de SDS até 0,5%, a solução é extraída com 100 pl de fenol-clorofórmio (1:1) equilibrado com tampão TNE. A fase aquosa é passada por 2 ml de uma coluna contendo Sephadex^ G-50 (Pharmacia) em tampão TNE. São recuperados 2x10^ dpm ^²ρ (1,6 pg) de ADNc de cadeia simples a partir da fracção de 0,4 ml e precipitados por adição de 1 ml de etanol. O precipitado é recolhido por centrifugação e transformado em cadeia dupla numa mistura reaccional de 50 pl contendo 100 mM de Hepes, pH=6,9, 10 mM de MgCl₂, 2,5 mM de DTT, 70 mM de KC1, 0,5 mM de cada dNTP e 40 unidades de ADN polimerase fragmento grande (Boehrin-80-

ger) durante a noite a 15°C. Para digestão com SI nuclease, a reacção é diluída com 3 0 pl de H₂O, ²θ J^{* 1}-*- ^e uma solução contendo 1M de NaCl, 250 mM de NaoAc, pH=4,5, 5 mM de ZnSO^ e 2,5% de glicerol, e 1 pl de 1N HCl. Depois da adição de 2 unidades de SI nuclease (Pharmacia) a mistura é incubada durante 30 minutos a 30°C. A reacção é interrompida pela adição de 5 pl de 0,5M EDTA, pH=7,5, 5 pl de 1M Tris-HC1, pH=8,3 e 5 pl de 20% de SDS, extraído com fenol-cloR rofórmio e cromatografado em Sephadex G-50 como anteriormente. São recuperados 2 pg de ADNc de cadeia dupla e precipitados com etanol.

8.2. Biblioteca de ADNc em E. coli

O ADNc ds do Exemplo 8.1 é aumentado com caudas-dC homopoliméricas numa mistura reaccional de 200 pl contendo 200 mM de cacodilato de potássio, pH=6,9, mM de CoCl₂, 1 mM de DTT e 0,75 pm de dCTP. Depois de pré-aquecimento durante 10 minutos a 30°C, são adicionados 120 unidades de desoxinucleotídil-transferase (Pharmacia) e a mistura é incubada durante 15 minutos a 30°C. São adicionados 4 pl de 0,5M EDTA, pH=7,5 e 2 pl 20% de SDS, e o ADN é extraído, cromatografado e precipitado como anteriormente. São misturados 40 ng (20 pl) deste ADNc com caudas-dC com: 8 pl (100 ng) de oligo-dG^g ₂θ cauda pUC9 ADN (Pharmacia) e 172 pl de tampão TNE e seguidamente incubado a 65°C durante 10 minutos, a 46°C durante 1 hora, a 37°C durante 1 hora e à temperatura ambiente durante 1 hora. O ADN do plasmídeo ADNc recozido é usado para transformar as competentes células E. coli HB101 (estirpe LM 1035), que foram preparadas por transformação como descrito por D. Hanahan, J. Mol. Biol. 1983, 166, 557. É adicionado 1 pl de ADN recozido a 200 pl de células competentes e deixou-se em gelo durante 30 minutos . Este processo é realizado 60 vezes. Depois de um choque por aquecimento de 90 segundos e arrefecimento em gelo duraste 2 minutos, são adicionados 0,8 ml de meio SOC por tubo

que é depois incubado durante 60 minutos a 37°C. Depois da incubação todos os tubos são combinados e colocados em placas de agar (12 cm) 3 McConkey contendo 25 ^ug/ml de ampicilina. As latas são incubadas durante a noite a 37°C. Os 2500 recombinantes resultantes por placa são erguidos sobre membranas de nylon (Pall-Biodyne ) e são feita duas réplicas são processadas apenas para hibridização de colónias como descrito no manual de Maniatis.

8.3. Pré-rastreio:

Os filtros réplica do Exemplo 8.2 são pré-hibridizados durante 2 horas a 32°C em 100 ml de 2x solução de Denhart contendo NaCl 0,9M, Tris-Hcl 0,18M pH=8,0, EDTA 6 mH, 0,2% ds SDS e 50 jig/rnl de ADN do timo de vitela desnaturado. A hibridização é realizada durante 36 horas em 7 ml da mesma solução contendo 2x10 dpm de mistura 2 de oliaonucleotídeos (Exemplo 6) num saco de plástico selado. Depois da hibridização os filtros são lavados e expostos num filme de raios-X durante a noite. Aparecem positivos nos dois filtros réplica. As seis colónias positivas são desenvolvidas e os seus plasmídeos de ADNs são isolados por análise derestrição.

O ADNc mais comprido inserido fora destas 6 clones (aproximadamente 500 pares de bases, clone 3) é escolhido para rastreio da mesma biblioteca ADNc e uma segunda biblioteca de ADBc, que é gerada para se obter clones de ADNc de comprimento total.

8.4. Segunda biblioteca de ADNc

São incubados 10 jil (1 mg/ml) de ARNm

9S codificador de MRP-8 (fracção 23, Exemplo 6) numa solução contendo 24 p.1 de tampão RVT, 2,5 jil de mistura de dNTP 20 mM, jil de 1 mg/ml de oligo-dT]_2-18 (Pharmacia), 1 plde <-32ρ_ \

TM ,

-dCTP (10 pCi, 3000 Ci/mmol), 3 pl RNasin (60 unidades,

Biotec), 3 pl de AMV transcriptase inversa (66 unidades,Genofit) e 2 pl de ^H2°* ^A mistura é incubada durante 1 hora a 42°C, depois a reacção é interrompida por adição de 2 pl de EDTA 0,5M, pfi= 7,5 . O ARN é degradado e o ADNc é recolhido como no Exemplo 8.1. O ADNc é aumentado com caudas oligo-dC numa mistura reaccional contendo 32 pl de ADNc (2,8 pg),pl de cacodilato de potássio 1M, pft=7,0, 5 pl de CoC^ de 10 mM, filizado). Depois de pré-incubação durante 5 minutos a 37°C, são adicionados 3 ul de desoxinucleotídil-transferase termi nal (81 unidades, Pharmacia) e a incubação é deixada prosseguir durante 10 minutos. São adicionados 50 pl de tampão TNE e a solução é extraída com 0,1 ml de mistura fenol-clorofórmio. O ADNc é precipitado por adição de 0,2 ml de etanol e arrefecimento em gelo-seco. Depois da centrifugação da pastilha é lavada com 70% de etanol, seco ao ar e dissolvida em pl de H2O.

Uma solução do anterior ADNc em 13 pl de f^O, ^{33 RVT} tampão, 2,5 pl de mistura de dNTP 20 mM, pl de 0,2 mg/ml de oligo-dG^ (Pharmacia), 3 pl de 0/ -32p_cjcTP (10 mCi/ml, 3000 Ci/mmol) e 3 pl de transcriptase inversa (66 unidades, Genofit) é incubada a 42°C durante 1 hora e meia. A reacção é interrompida por adição de 2 pl de EDTA 0,5M, pfi=7,5 e 50 pl de tampão TNE, e a mistura é extraída com 0,15 ml de mistura de fenol-clorofórmio. A fase aquosa é aplicada sobre uma coluna G-50 Sephadex (2,5 ml em TNE tampão) e a fracção solvente (0,4 ml) contendo 1,3 pg de ADNc é recolhida. O ADN é precipitado por adição de 1 ml de etanol e arrefecendo em neve carbónica. A pastilha resultante é dissolvida em 32 pl de e o ADN aumentado com caudas de oligo-dC como atrás descrito para ADNc de cadeia simples. A reacção é interrompida por adição de 1 pl de EDTA

0,5M, pH=7,5 e a amostra é carregada horizontalmente sobre gel de agarose a 1% em tampão TBE usando fendas com uma es«

-83pessura de 0,5 cm. Depois de electroforese durante 1 hora a 5V/cm, a região contendo ADNc com um tamanho aproximado entre 0,35 e 0,7 kb é excisado e colocado em dois micro-recipientes de colóides (bartorius) e préviamente ensopados em HgO. São adicionados 0,3 ml de HgO e os recipientes são colocados num*aparelho de electroforese contendo tampão TBE semi-concentrado. 0 ADN é electroeluído a uma distância de electrodos de 5V/cm durante 20 minutos e recuperado do recipiente por pipetagem vigorosa. Depois de extracção com 0,6 ml de mistura de fenol-clorofórmio, são adicionados 40 jal de NaOAc 3M, pH=5,5 e 1,2 ml de etanol e a solução arrefeci) da em neve carbónica durante 10 minutos. Depois de centrifugação (5 minutos, centrífuga Eppendorf) são recuperados 164 ng de ADNc ds e dissolvidos em 18 ul de Tris-HCl 10 mM, pH= =8,0 e EDTA 1 mM.

μΐ (27 ng) do anterior ADNc são recozidos com 8 pl (100 ng) de oligo-dG^Q_gQ de cauda ADN pUC9 (Pharmacia) e o ADN resultante usado para transformar as competentes células HB101 de E. coli (estirpe LM1035) como atrás descrito (Exemplo 8.1). Os 2600 recombinantes resultantes por placa são colocados sobre membranas de nylon

TM (Pall-Biodyne ) e são feitas duas réplicas. O filtro principal é guardado a 4°C numa placa de agar e as réplicas são processadas para hibridização das colónias como descrito no manual de Maniatis.

8.5. Rastreio

I

ADNc inserido a partir de 1 pg de plasmídeo do clone 3 (Exemplo 8.3.) é removido por digestão com HindIII e EcoRI endonuclease de restrição e isolado por electroforese de agarose gel e eluição por gel. O ADNc puro inserido (100 ng) é tornado radioactivo usando um equipamento de tradução de fragmentos de Amersham (N.5000) seguindo as instruções dadas pelo fornecedor. A sonda radioactiva de

ADNc tem uma actividade específica de 5x10

Os filtros de réplica do Exemplo 8.4 são j pré-hibridizados durante 2 horas em 100 ml de 2x solução de Denhart contendo NaCl 0,9M, Tris-HCl 0,18M, pH=8,0, EDTA 6 mM 0,2% de SDS e 50 pg/ml de ADN timo de vitela desnaturado. A hibridização é realizada durante a noite em 1 ml da mesma solução contendo a sonda de ADNc desnaturada pelo calor traθ duzida pela técnica de fragmentos (60x10 dpm) num saco de plástico selado. Após hibridização, os filtros são lavados em 200 ml de NaCl 0,9M, Tris-HCl 0,18M, pH=8,0, EDTA 6 mM e 0,2% de SDS, duas vezes a 65°C, seguido por duas lavagens a 65°C com 200 ml de NaCl 0,45M, Tris-HCl 0,09M, pH=8,0, EDTA 3 mM e 0,2% de SDS e duas lavagens com 200 ml de NaCl 0,15M, Tris-HCl 0,03, pH=8,0, EDTA 1 mM e 0,2% de SDS. Os filtros são expostos durante a noite num filme de raios-X e os positivos aparecem nos dois filtros réplica.

i

Exemplo 9: Clonagem de ADNc de MRP-14

9.1. Preparação de ADNc ds

São incubados 20 pl (0,12 mg/ml) de cada

ARNm codificador de MRP-14 a partir das fracções 12 e 13 (Exemplo 7) durante 60 minutos a 42°C numa solução contendo pl de tampão RVT, 7 pl de mistura de dNTP 20 mM, 10 pl de TM mg/ml de oligo-dT^ jg (Pharmacia), 3 pl RNasin (60 unidades, Biotec), 2 pl de transcriptase inversa AMV (66 unidades, Genofit) e 7 pl de o< -³^p_dCTP (1 pCi, 3000 Ci/mmol).

A reacção é interrompida por adição de 6 pl de EDTA 0,5M, pH=7,5. O ARN é degradado por incubação com 3,75 pl de NaOH 1N durante 1 hora a 65°C. A solução é neutralizada por adi ção de 25 pl de Tris-HCl, pH=8,0 e 6 pl de HC1 1N. Depois da adição de SDS a 0,5%, a solução é extraída com 100 pl de uma mistura (1:1) de fenol-clorofórmio equilibrada tampão

TNE. A fase aquosa e passada sobre uma coluna de 2 ml contendo Sephadex^ G-50 (Pharmacia) em TNE tampão. São recupe5 32 rados 2x10 dpm P (1,0 jig) de ADNc de cadeia simples a partir da fracção saliente (0,4 ml) e precipitados por adição de 1 ml de etanol. O precipitado é recolhido por centrifugação .

O ADNc é aumentado com caudas oligo-dc como descrito para MRP-8 ADNc no Exemplo 8.4, tratado depois com mistura de dNTP oligo-dG^g jg ~ P-dCTP e 3 pl de transcriptase inversa em RVT tampão a 37°C durante 60 minu tos. Depois da extracção com fenol-clorofórmio, a fase aquosa é aplicada sobre uma coluna de Sephadej^ G-50 (2,5 ml em tampão TNE) e a fracção saliente (0,4 ml) contendo 0,53 pg de ADNc ds é recolhido. O ADN é aumentado com caudas oligo

-dC, depois colocados horizontalmente sobre gel de agarose a 1% em tampão TBE usando fendas com uma espessura de 0,5 cm. Depois da electroforese durante 1 hora a 5V/cm, a região contendo ADNc com um tamanho aproximado entre 0,5 e 0,75 kb é cortada e electroeluída como descrito no Exemplo 8.4. São recuperados 100 ng de ADNc ds e dissolvidas em 200 pl de Tris-HCl 10 mM, pH=8,0 e EDTA 1 mM.

9.2. Biblioteca de ADNc em E. coli

São misturados 20 ng (20 pil) de ADNc ds de caudas dc do Exemplo 9.1. com 30 pil (60 ng) de oligo-dG

10-20 de cauda pUC-KO ADN e 20 pil dez vezes concentrado de tampão TNE e de seguida incubado a 65°C durante 10 minutos, a 46°C durante 1 hora, a 37°C durante 1 hora e à temperatura ambien te durante 1 hora. O plasmídeo pUC-KO é um derivado de pUC9 (obtido a partir de Pharmacia) em que a região promotor/operador do gene lacZ é apagado entre o local de restrição

HaelI apenas fora da sequência promotora e do local de restrição HindIII dentro do poliligante deixando as outras sequências do plasmídeo não alteradas. O plasmídeo ADN de ADNc

recozido é usado para transformar células competentes HB101 E. coli (estirpe LM1035) como descrito no Exemplo 8.2. para MRP-8 de ADNc. A partir de 6 placas de agar McConkey contendo cada um 2500 recombinantes são feitas duas réplicas. Os filtros principais em membranas de nylon são guardadas a 4°C num prato de agar e as réplicas são processadas para hibridização de colónias.

9.3. Rastreio

Os filtros réplica do Exemplo 9.2. são hibridizados a 37°C numa solução contendo 2x10 dpm da mistura 3 de oligodesoxinucleotídeos do Exemplo 7 num saco de plástico selado como descrito sob rastreio prévio do Exemplo 8.3. As colónias positivas são desenvolvidas e os seus plasmídeos de ADNs são isolados por análise de restrição.

Um plasmídeo recombinante designado por pMRP-14-10 contendo uma inserção de 500 nucleotídeos aproximadamente é escolhido para rastrear a mesma biblioteca ADNc. O ADNc inserido a partir de 1 pç; de plasmídeo deste clone pMRP-14-10 é removido por digestão com endonuclease de restrição HindIII e EcoRI e tornado radioactivo (actividade esg pecífica de 5x10 dpm/pg) usando um equipamento de tradução de fragmentos. Esta sonda é usada para rastrear uma vez mais os filtros réplica do Exemplo 9.2 como descrito no Exemplo

8.5. Os positivos aparecem nos dois filtros, réplica.

Exemplo 10: Sequência de ADN codificadora de MRP-8

A inserção de ADNc do clone 3 (Exemplo

8.3. ) e um número de inserções de ADNc a partir de clones positivos do Exemplo 8.5 são escolhidos para a determinação da sequência de nucleotídeos usando os métodos bem conhecidos de Sanger e de Maxam e Gilbert. A sequência da região codi-87-

ficadora é determinado em ambas as cadeias e locais de restrição usadas na estratégia de sequênciação determinada também por sobreposição de fragmentos. A estratégia é resumida na Figura 2 (Parte C), e oslocais de restrição dados (Parte B). A sequência de ADNc codificadora do clone 3 ( e a sequência de aminoácidos que elecodifica) é dada na fórmula VII. A Parte A da Figura 2 representa esquematicamente toda a sequência deste ADNc. As características especiais e discrepâncias entre este ADNc do clone 3 e outros clones são indicados pelos números e são listados em seguida:

1. Posição 1: fim do clone 3, a sequência até'à posição 68 está presente apenas no clone 3 e não é encontrada no gene.

2. Posição 69: extremos de clones 8 e 15; um A em clones 3 e 8 e um T no clone 15.

3. Posição 72: variação de 6 bases de GGCAAA no clone 3 até TCTCTT nos clones 8 e 15.

4.	Posição	86:	fim do clone 7.
5.	Posição	102:	inserção das 17 bases de	AAGGTTCTGTTTTTCAG
no	clone 15	¹ ·
6.	Posição	108:	fim do clone 14.
7.	Posição	109:	fim dos clones 2 e 110.
8 .	Posição	113:	inserção de um T nos clones 7, 8, 14	e	15.
9.	Posição	115:	variação de bases até um	T em clones	2	e 110.

10. Posição 124: início da região codificadora.

11. Posição 378: inserção de AA no clone 2 não encontrada no gene.

12: Posição 403: fim da região codificadora.

13. Posição 475: início da cauda poli-A.

—88—

Exemplo 11: Sequência de ADN codificadora de MRP-14

A inserção de ADNc de dois clones (Exemplo 9.3, pMRP-14-10 e pMRP-14-16) são escolhidos para a determinação de toda a sequência de nucleotídeos. A estratégia é resumida na Figura 3. A sequência de ADNc codificadora destes clones ( e a sequência de aminoácidos que ele codifica) é idêntica e é dada na fórmula IX.

São analisados mais três clones (pMRP-14-15, 18 e 19) na extremidade 3'. Todos revelam sequências idênticas como representado na fórmula IX, portanto na ausência do extremo 3' do ARNm.

Exemplo 12: Expressão de MRP-8 em E. coli sob controlo do promotor de trp

É preparado um vector expressão E. coli contendo um promotor de trp e uma inserção de ADN codificador de MRP-8 essêncialmente como descrito para o correspondente vector de expressão EglinC no Pedido de Patente Europeia EP 146.785.

12.1. Preparação do vector

São digeridos 20 pg de plasmídeo pHRi 148 (EP 146.785) até completar usando BamHT. Os extremos são desfosforilados usando 3 unidades de fosfatase alcalina intestinal de vitela. O ADN é extraído com uma mistura de fenol-clorofórmio, depois digeridos até completar usando EcoRI. O vector ADN é isolado por electroforese de gel de agarose e electroeluição como atrás descrito para o ADNc do Exemplo

8.4. O vector de ADN é dissolvido em f^O até uma concentração de 0,5 ^ug/ml.

12.2 Preparação de ligante: Oligo desoxinucleotídeos

5’-AATTCATGCTGACTGAGC-3' e

5¹-TCAGTCAGCATG-3' são sintetizados usando processos padrão (H. Rink et al. , Nucleic Acid Research, 1984, 12 , 6369).

jiq do nucleotídeo mais curto são fosforilados usando ATP e polinucleotídeo-quinase e ligados a 2 pg do oligodesoxinucleotídeo mais comprido não fosforilado com ADN ligase. Seguindo a ligação o ADN ds é digerido até completar com Alui. 0 ADN é extraído com uma mistura de fenol-clorofórmio, precipitado com etanol e dissolvido em 10 pl de HgO.

12.3 Preparação da inserção de ADN pg de clone 3 de ADNc (Exemplo 8.3) é digerido até completar com BamHI e PvuII, e o ADNc inserido de aproximadamente 480 bp isolado por electroforese de gel de agarose e eluição por gel. 3 pg deste fragmento do ADN são cozidos parcialmente com Alui, e um fragmento de aproximadamente430 bp isolado como anteriormente. 70 ng deste ADN são ligados a 8 jal do ligante ADN em solução, do Exemplo 12.2 em 8 pl de HgO. O ADN resultante é digerido até completar com EcoRI e BamHI, e o fragmento resultante de aproximadamente 440 bp isolado por PAGE e electroeluição.

12.4. Ligação de vector e inserção

0,5 ptg do vector do Exemplo 12.1 e 50 ng do ADN ligante-inserção do Exemplo 12.3 são ligados. O ADN resultante é usado para transformar as competentes células HB101 E. coli (estirpe LM 1035) como atrás descrito (Exem pio 8.2). Um recombinante de pMRP-8-trp apresentando o padrão enzima de restrição esperado e a sequência de ADN de inserção é escolhida para a expressão de MRP-8 .

12.5. Fermentação pMRP-8-trp contendo E. coli (Exemplo 12.4) é desenvolvido durante a noite a 37°C em 200 ml de meio contendo 7 g de Na₂HPO^, 3 g de ΚΗ,^ΡΟ^, 0,5 g de NaCl, 1 g de NH^Cl, 5 g de glucose, 0,02 g de CaCl₂, 0,25 g de MgSO₄, 25 g de casamino-ácidos, 0,1 g de tiamina e 50 mg de ampicilina por litro. A cultura é diluída com 800 ml do mesmo meio aquecido préviamente, suplementado com 12,5 jig/ml de ácido -indole-acrílico. Depois de 4 horas e meia, a densidade óptica de atinge o valor de 1,3. As células ) são recolhidas por centrifugação. As culturas de controlo usando E. coli:contendo pHRil48 são processadas da mesma forma .

12.6. Extracto de lisozima

A pastilha bacteriana é re-suspensa em ml de Tris-HCl 50 mM, pH=8,0, NaCl 30 mM e 1 mg/ml de lisozima branca de ovo de galinha. A suspensão é mantida durante 1 hora em gelo. São adicionados 0,1 mM de PMSF e as células são partidas por três ciclos de congelação em azoto líquido e descongelação a 37°C. O lisado é limpo por centriI fugação durante 30 minutos a 1700 rpm num rotor SS34 (So vali) a 4°C.

12.7 Extracto submetido a ultrasons de ureia

22,5 ml de uma suspensão de células (ODggg=20) em Hepes 50 mM, pH=8,0, NaCl 30 mm e 0,1% de etanolamina preparado a partir de uma pastilha bacteriana do Exemplo 12.5 são misturados com 18 g de ureia. A suspensão é submetida a ultrasons 3x30 segundos com intervalos de 30 segundos com um MSE Soniprep® 150 usando uma sonda de 9,5 mm e amplitude de 24 mícronn. O cisado é limpo por centrifugação a 17000 rpm num rotor Sorvall SS34 durante 30 minutos a

20°C. 0 sobrenadante é feito de 0,1 mM em CaCl₂, MgCl₂, CoCl₂, ZnCl₂, MnCl₂, CuSo^ e FeSO₄ e feita a diálise contra três variações de Hepes, 10 mM, pH=7,5, NaCl 130 mM e 0,1 mM dos mesmos sais que anteriormente. O dialisato é limpo por centrifugação como no Exemplo 12.6.

Exemplo 13: Expressão de MRP-14 em E. coli sob controlo do promotor de trp

Um vector de expressão de EL coli contendo um promotor de trp e uma inserção de ADN codificadora de MRP-14 é preparado essêncialmente como descrito no Exemplo 12.

13.1. Preparação do ligante

Os oligodesoxinucleotídeos seguintes são sintetizados usando processos vulgares (H. Rink et al., Nucleic Acid Research 1984, 12.# 6369):

(1) 5'-AATTCATGACTTGCAAAATGTCGCAG-3¹, (2) 5'-CTGCGACATTTTGCAAGTCATG-3', (3) 5'-AATTCATGTCGCAG-3 ¹ e (4) 5¹-CTGCGACATG-3'. Os oligodesoxinucleotídeos 1 e 3 são fosforilados usando ATP e polinucleotídeos quinase de acordo com os processos vulgares são preparados misturas equimolares de oligonucleotídeos 1 fosforilados e oligodesoxinucleotídeos 2 não fosforilados tal como oligodesoxinucleotídeos 3 fosforilados e oligodesoxinucleotídeos 4 não, fosforilados. A mistura 1-2 é usada para a construção de plasmideos expressando MRP-14 e a mistura 3-4 é usada para a construção de plasmideos expressando MRP-14d, que não tem os primeiros quatro aminoácidos de MRP-14.

13.2. Preparação do vector

Cada 1 pg de vector de ADN de plasmídeo pHRil48 preparado como no Exemplo 12.1 é ligado a 50 pmol das misturas ligantes 1-2 e 3-4, respectivamente, do Exemplo 13.1. O vector de ADN é separado a partir dos ligantes livres por electroforese de gel de agarose e eluição por gel. 10 pg do clone pMRP-14-10 de ADNc (Exemplo 9.3) é digerido até completar com BamHI e PvuII, e a inserção de ADNc de 430 pb aproximadamente isolada por electroforese de gel de agarose e eluição por gel. 25 ng de cada uma dastas inserções de ADNc; são ligadas a 0,2 pg do vector-ligante 1-2 (para MRP-14) e 0,2 pg do vector-ligante 3-4 (para MRP-14d), respectiamente. Os ADNs resultantes são usados para transformar as células competentes HB101 E. coli (estirpe LM 1035) como atrás descrito. Os recombinantes de pMRP-14-trp e pMRP-14d-trp mostrando o padrão enzima de restrição esperado e a sequência da inserção de ADN esperada são escolhidos para a expressão de MRP-14 e MRP-14d, respectivamente.

13.3 Fermentação de E. coli transformado e extracção de MRP-14

E. coli contendo pMRP-14-trp ou pMRP-14d-trp (Exemplo 13.2) são desenvolvidos e processados como descrito no Exemplo 12.3.

As células são tratadas com lisozima ou partidas por ultrasons em solução de ureia e o lisado processado como descrito nos Exemplos 12.6 e 12.7.

Exemplo 14: Expressão de MRP-8 em E. coli sob controlo do promotor pL do fago

14.1. Construção do vector

O plasmideo pPLc24 (E. Remaut, P. Stanssens e W. Fiers, Gene 1981, 15, 81) é digerido com EcoRI,

depois é tratado com mistura de Klenow polimerase e de dNTP com o fim de tornar as ligações terminais embotadas. O ADN é digerido com BamHI, eo vector de ADN resultante é isolado por electroforese de gel de agarose e electroeluição. 0 ADN pMRP-8-trp (Exemplo 12.4) é digerido até completar com BamHI e digerido parcialmente com Hpal. 0 fragmento de 440 bp aproximadamente é isolado por electroforese de gel de agarose e electroeluição. O fragmento é ligado ao vector ADN derivado de pPLc24 e o ADN resultante usado para transformar _E. coli K12 tipo selvagem. Os transformantes são colocados em pratos-L contendo 40 pg de ampicilina. A análise de sequência padrão de recombinantes é realizada para assegurar a correcção das construções. O ADN de uma construção correcta é usado para transformar as estirpes E. coli W3110 e HB101, ambas na vizinhança de Λ CI857 (Remaut et al., loc. cit). Os transformantes são colocados em placas L contendo 40 pg/ml de canamicina e ampicilina. Os recombinantes resultantes pMRP-8-P_L são usados para a fermentação.

14.2 Fermentação

Os recombinantes de pMRP-8-P^ são desenvolvidos a 30°C durante a noite em meio LB contendo 40 yg/ml de ampicilina e canamicina. As culturas são diluídas (1:5) com o mesmo meio e incubadas a 42°C durante 2 horas e meia. As células são lisadas como descrito nos Exemplos

12.6 ou 12.7.

Exemplo 15: Expressão de MRP-14 e MRP-14d em E. coli sob controlo do promotor p_L de fago^

Os vectores são construídos a partir de pMRP-14-trp e pMRP-14d-trp ADN (Exemplo 13.2), respectiva mente, e plasmídeo pPLc24 e usados para transformar E. coli K12, W3110 e HB101 como descrito no Exemplo 14.1. Os recom-94-

binantes resultantes pMRP-14-P e pMRP-14d-P são desenvolLi Li vidos emmeio LB e lisados como descrito no Exemplo 14.2.

Exemplo 16: Construção de um plasmídeo para a expressão

MRP-8 em S. cerevisiae

I -------------------------------------------------------------------------

16.1. Separação do fragmento do vector pJDB207 pg de plasmídeo pJDB207R/PHQ5-TPA12-2 (Pedido de Patente Europeia EP 143081) são digeridos até ) completar com endonuclease BamHI de restrição. Os fragmentos de ADN resultantes de 6,8 kb e 2,4 kb de tamanho são precipitados por etanol e re-suspensos em 400 pl de Tris-HC1, 50 mM, pH=8,0. São adicionados 4,5 unidades de fosfatase alcalina de intestino de vitela (Boehringer, Mannheim). A mistura é incubada durante 1 hora a 37°C. Subsequentemente, a fosfatase é inactivada por incubação a 65°C durante 1 hora e meia. A solução é ajustada para NaCl 150 mM. A solução de ADN é aplicada a uma câmara de 100 pl de DE52 (Whatman) de permuta iónica equilibrada com Tris-HCl 10 mM, pH=7,5 contendo NaCl 150 mM e EDTA 1 mM. Depois de lavagem com o mesmo tampão, o ADN é eluído com 400 pl de NaCl 1,5M, Tris-HCl 10 mM, pH=7,5 e EDTA 1 mM e precipitado por etanol. O fragmento grande de 6,85 kb BamHI é separado do pequeno fragmento pequeno num gel agarose a 1% em tampão TBE. O fragmento ADN é electroeluído a partir do gel, purificado por cromatografia de permuta iónica DE52 (ver atrás), precipitaI do com etanol e re-suspenso em H₂O para uma concentração de 0,1 pmol/pl.

16.2. Separação de um fragmento promotor de 534 bp PHO5 pg de plasmídeo p31/R (Pedido da Patente Europeia EP 100.561) são digeridas com EcoRI e BamHI. Os 3 fragmentos resultantes são separados em 1,2% de gel de

agarose em tampão TBE. Os fragmentos de 534 bp BamHI-EcoRI compreendem o promotor PHO5. 0 fragmento de ADN é electroeluído do gel, purificado por cromatografia DE52, precipitação em etanol e re-suspenso em HgO a uma concentração de 0,1 pmol/pl.

16.3. Isolamento de um fragmento de DNA de 0,4 kb codificador de MRP-8:

jig de plasmídeo pMRP-8-trp (Exemplo

12.4) são digeridos com BamHl e EcoRI. Os dois fragmentos de DNA resultantes são separados sobre um gel de agarose a 1,2%. O fragmento de 0,4 kb é isolado como anteriormente referido e re-suspenso emHgO numa concentração de 0,1 pmol/

16.4. Ligação dos fragmentos de ADN

São ligados 0,1 pmol (0,45 pg) do fragmento do vector 6,8 kb BamHl, 0,2 pmol (70 pg) do fragmento promotor 534 bp BamHI-EcoRI PHO5 e 0,2 pmol (52 ng) do fragmento 0,4 kb EcoRI-BamHI de pMRP-8 em 15 pl de Tris-HCl 60 mM, pH=7,5, MgCl₂ 10 mM, DTT 10 mM, ATP 1 mM com 600 unidades de ADN ligase (Biolabs) a 15°C durante 6 horas. É adicionado 1 pl de parte alíquota da mistura ligação a 100 pl de cálcio tratado, transformação competente de células E. coli HB101.

São desenvolvidas individualmente 12 colónias resistentes à ampicilina, transformadas, em meio LB contendo 100 ^ig/ml de ampicilina. O plasmídeo ADN é preparado de acordo com o método de Holmes et al., (Anal. Biochem. 1981, 114, 193) e analisado por digestão de BamHI e HindIII/EcoRI. O aparecimento de um fragmento de 780 bp EcoRI-HindIII indica a correcta orientação do promotor PHO5-MRP-8 ADN inserção. Um tal clone é isolado e referido como pJDB207R/PHO5-MRP-8.

Exemplo 17: Construção de plasmídeos para expressão de MRP-14 e MRP-14d em S. cerevisiae

Os plasmídeos para expressão de MRP-14 e MRP-14d em Saccharomyces cerevisiae são preparados a partir de plasmídeo pJDB207R/PHQ5-TPA12-2 e fragmentos 0,4 kb EcoRI-BamHI de pMRP-14-trp e pMRP-14d-trp (Exemplo 13.2) respectivamente como descrito no Exemplo 16.

As células de colónias E. coli HB101 resistentes à ampicilina, transformadas, são desenvolvidas individualmente em meio LB contendo 100 ^ug/ml de ampicilina. O plasmídeo ADN é preparado e analisado por digestão de BamHI e HindIII/EcoRI. O aparecimento de um fragmento de 780 pb EcoRI-HindIII indica a correcta orientação do promotor PHO5-MRP-14 ou MRP-14d ADN inserção. Tais clones são isolados e referidos como pJDB207R/ PHO5-MRP-14 e pJDB207R/PHo5-MRP-14d, respectivamente.

Exemplo 18: Transformação de Saccharomyces cerevisiae GRF18

Os plasmídeos pJDB207R/PHQ5-MRP-8, pJDB207R/PHQ5-MRP-14 e pJDB207R/PHQ5-MRP-14d são introduzidos na estirpe Saccharomyces cerevisiae GRF18 ( o< , his 3-11,

his3-15, leu 2-3, leu 2-112, Karr-J usando o protocolo de transformação descrito por Hinnen et al (Proc. Natl. Acad. Sei. USA 1978, 75, 1929 ). As células de levedura transformadas são seleccionadas sobre placas de meio mínimo de levedura deficientes em leucina. As colónias de levedura transformadas simples são isoladas e referidas como Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207R/PHQ5-MRP-8,GRE18/pJDB207R/PHQ5-MRP-14 e GRF18/pJDB207R/PHO5-MRP-14d.

Exemplo 19: Fermentação de estirpes de levedura transformadas

As células das anteriores estirpes de levedura transformada Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207R/ /PHO5-MRP-8, GRF18/pJDB207R/PHO5-MRP-14 e GRF18/pJDB207R/ /PHO5-MRP-14d são desenvolvidas em 50 ml de meio mínimo de levedura (Difco yeast Nitrogen Base sem aminoácidos ao qual são adicionados 2% de glucose e 20 mg/1 de L-histidina) com agitação a 30°C durante 25 h até uma densidade de 3x1o⁷ células /ml. As células são lavadas em NaCl a 0,9% e usadas para inocular 100 ml de meio mínimo P\ baixo preparado de acordo com a receita do meio Difco yeast Nitrogen Base (sem aminoácidos) com 0,03 g/1 de KH^PO^, 1 g/1 de KC1, 10 g/1 de L-asparagina em vez de (NH^^SO^, 2% de glucose e 1 g/1 de L-histidina. O meio é inoculado para um inicio de Οϋθθθ de 0,25. As células são desenvolvidas a 30°C durante 24 horas ecolhidas até um θϋςθθ de

As células de 35 ml de meio baixo P.

são recolhidas por centrifugação e re-suspensas num volume total de 4 ml de tampão de fosfato de sódio 66 mM, pH=7,4 e 0,1% (v/v) Triton® X-100. A suspensão celular é transferida para um tubo Corex de 30 ml, são adicionadas 8 g de pérolas de vidro (de diâmetro de 0,4 mm) e a suspensão é misturada num Mixer Vortex (Scientific Instruments Inc., USA) à velocidade maxima durante 4 minutos e depois arrefecida num ban-98-

ho de gelo. Mais do que 90% das células são partidas por este processo. Os fragmentos de células e pérolas de vidro são sedimentadas por centrifugação durante 10 minutos a 8.000 rpm a 4°C num rotor Sorvai HB-4. A camada sobrenadante é transferida para tubos de Eppendorf, congelada em azoto líquido e guardada a -60°C.

Exemplo 20: Separação ~e purificação de MRP-8

20.1. Cromatografia de permuta iónica DEAE

Ê feita a diálise de 72 ml de lisado impuro do Exemplo 12.6 (Spectrapor*^ membrana N2. 3, 3,5 kD decepada, Spectrum Medicai Industries) contra Tris-HCl 20 mM, DTT a 0,01%, pH=8,5. A solução dialisada é bombeada soZ (ÍT bre uma coluna (2,6x10 cm) de permuta iónica DEAE TrisacrypMM (LKB) equilibrada com o tampão de diálise. Depois de en cher a coluna com a amostra, esta é lavada com o tampão de diálise (80ml) até se atingir o nível de linha de base de (Uvicorc^ S, absorção UV254 um

LKB). As proteínas ligadas à coluna são eluídas usando um gradiente linear de NaCl em tampão de diálise da gama de 0,0M a 0,2M de NaCl, depois tampão diálise/0,2M NaCl (80 ml) e tampão diálise/NaCl l,0M (200 ml) a uma velocidade de fluxo de 1,8 ml/min. (bomba peristáltica P-I, Pharmacia). As fracções individuais de 9 ml (recolhidas com um Ultrorac^wII, LKB) são analisadas por SDS-PAGE /U.K. Laemmli, Nature 1970, 227, 680_7 em gelo de placas de poliacrilamida a 15% e combinadas de acordo com o seu conteúdo de MRP-8. O conjunto das fracções eluindo entre 180-380 jj.s (controlador de condutividade de Bio Rad) é concentrado por ultrafiltração (membrana YM-10, Amicon) até um volume de 5,5 ml.

São processadas da mesma forma amostras de lisado impuro do Exemplo 12.7, 14.2 e 19 contendo MRP-8.

20.2. Cromatografia por exclusão de dimensões

A mistura concentrada do Exemplo 20.1 é separada com uma coluna de filtração gel de alta resolução TSK G 3000 SWG (LKB) equilibrada em NaOAc 30 mM e NaCl 150 mM, pH=6,5 num sistema HPLC consistindo de uma bomba 2150 de HPLC, um registador de 2 canais 2210 de LKB e um detector de UV HPLC Spectroflow^ 757 de Kratos. O volume máximo da amostra aplicado é de 2 ml, o caudal é de 3 ml/min, e as fracções são recolhidas automáticamente em todos os minutos, (colector de fracção Superrac® 2211, LKB). Com base na análise por SDS-PAGE, as fracções eluindo entre um volume de eluição de 163 ml e 182 ml são combinadas e concentradas até um volume de 6 ml por ultrafiltração como anteriormente.

20.3. Cromatografia de permuta iónica de alta resolução numa (R) coluna Mono

0,8 ml da mistura concentrada do Exemplo 20.2 é diluida com 3 ml de água e o pH é ajustado para 8,5 com amónia diluída. Esta solução é aplicada a uma coluna Mono Q® HR 5/5 (FPLC, Sistema de Cromatografia Líquida Rápida de Proteínas Polipeptídeos e Polinucleotídeos, Pharmacia) equilibrada em 20 mM de dietànolamina-HCl, pH=8,5. A coluna é lavada com 12 ml de tampão de dietanolamina e as proteínas eluídas com um gradiente linear de NaCl no mesmo tampão da gama de NaCl 0,0M a NaCl 0,125M durante 21 minutos com um caudal de 1,5 ml/minuto. As fracções dos picos individuais são recolhidas manualmente de acordo com o padrão de eluição de UV 280 nm.

20.4. Cromatografia de permuta iónica em sulfopropilo

Como uma alternativa para a purificação com a cromatografia de exclusão de dimensões e cromatografia de permuta iónica Mono ζ^) (Exemplos 20.2 e 20.3) a mistura

-100-

concentrada do Exemplo 20.1 (52 ml contendo aproximadamente 250 mg de proteínas) é dialisada com NaOAc 50 mM/DTT a 0,01%, pH=5,5 (tampão inicial) e bombeada sobre uma coluna (2,5 x 10 cm) de permuta iónica (LKB) SP Trisacryl^M equilibrada no mesmo tampão. A coluna é lavada com mais tampão até a absorção UV 254 nm atingir o nível da linha de base. As proteínas ligadas à coluna são eluidas usando um gradiente linear de NaCl em tampão inicial da gama de 0,0M a 0,5M de NaCl (300 ml), depois com tampão inicial/NaCl 0,5M (100 ml) e tampão inicial/NaCl l,0M (100 ml) a um caudal de 2,0 ml/minuto. MRP-8 é eluída entre NaCl 0,25 a 0,35M. A pureza, como julgado por SDS-PAGE é maior do que 9% neste estádio.

20.5. HPLC de fase reversa

A fracção de proteínas do Exemplo 20.3 ou 20.4 é também purificada numa de HPLC de fase reversa Vydac® 218 TP 5415 (The Separations Group, Hesparia, CA, USA) usando um cromatografo líquido Varion 5000. A coluna é equilibrada numa mistura de 65% de TFA 0,1% em água e 35% de TFA 0,07% em acetonitrilo 5 minutos depois da injecção da amostra, um gradiente linear de 12 minutos é iniciado acabando com 45% de TFA 0,1% em água e 55% de TFA 0,07% em acetonitrilo a um caudal de 1 ml/minuto. O eluído é controlado para absorvância de UV a 215 nm.

MRP-8 é eluido em 2 picos separados com tempos de retenção de 14,5 minutos e 15,8 minutos, respectivamente. Como mostrado por SDS-PAGE sob condições de redução e não-redução, o material de eluição mais rápido representa a forma monomérica de MRP-8 (peso molecular aparente de 8 KD), enquanto queo segundo pico consta do derivado dimérico de MRP-8 ligado por dissulfureto (peso molecular aparente de 16 KD).

-101-

Exemplo 21: Caracterização do MRP-8

21.1. Análise de sequência de aminoácidos

O MRP-8 purificado do Exemplo 20 é submetido a análise de sequência de aminoácidos N-terminal usan do um modelo de sequências de proteínas de fase-gasosa 470 (Biosistemas Aplicados) de acordo com o método de M. W. Hunkapillar e L.E. Hood, Methods in Enzimology 1983, 91, 399. Os derivados anilino-tiazolinona são rearranjados para feniltiohidantoína (PTH) aminoácidos por tratamento com 25% de TFA aquoso a 50°C. Os PTH aminoácidos são analisados numa coluna (de pont 200x4,6 mm) de HPLC Zorbax CP^ /~R. Knecht e colab., Anal. Biochem. 1983, 130, 65 7. E encontrada a seguinte sequência de aminoácidos N-terminal:

¹⁰

Met-Leu-Ihr-Glu-Leu-Glu-Lys-Ala-Leu-Asn-Ser-Ile-Ile-Asp-Val-Tyr-Xi?20

Lys-Tyr-Ser-Leu-Ile-Lys-Glv-Asn-Phe-X27-Ala-Val-Tyr-X3i~Asp-Asp-Leu40 ⁵⁰

Lys-Lys-Leu-Leu-Glu-Thr-Glu-Xuz-Pro-Gln-Tyr-Ile-X^-Lys-Lys-Gly Ala

Asp-Val-Trp-Phe-Lys-.

^X17' ^X27’ ^X31' ^X42 ^{e X}47 ^reP^resentam aminoácidos não determinados. Esta sequência está de acordo com a sequência de fórmulas I ou VII determinada por análise de ADNc (Exemplo 10) .

-102-

21.2. HPLC de fase reversa

A HPLC analítica de fase reversa é realizada numa coluna (4,0x120 mm) Vydac® 218-TP-B5-5p com MIF humano de 8 KD da Patente Europeia 162.812, MRP-8 do Exemplo 20 e uma sua mistura usando um gradiente linear de 30 minutos de 65% de TFA 0,1% em água e 35% de TFA 0,08% em acetonitrilo até 45% de TFA 0,1% em água e 55% de TFA 0,08% em acetonitrilo a um caudal de 1 ml/minuto. O MIF humano de 8KD e MRP-8 são indistinguíveis sob estas condições e eluem-se com um tempo de retenção de 11,2 minutos (absorvência no UV a 250 nm).

21.3 Cromatografia por Exclusão de dimensões

O MRP-8 e o derivado dimérico de MRP-8 ligado por dissulfureto do Exemplo 20 são cromatografados numa coluna de cromatografia (Shimadzu, 7,9x500 mm) por exclusão de dimensões de alta resolução Shimpack^ Dior 150em Tris-HCl 30 mM e NaCl 150 mM, pH=7,0 a um caudal de 1 ml/minuto. A absorção no UV émedida a 215 nm. MRP-8 monomérico é eluído após 16,4 minutos com um peso molecular aparente de 30 KD e o derivado de MRP-8 dimérico após 15,1 minutos com um peso molecular aparente de 42 KD quando comparado com os marcadores de peso molecular padrão citocromo e (12 KD), mioglobina.(17 KD), anidrase carbónica (30 KD, ovalbumina (45 KD) e BSA (66,2 KD).

21.4. Espectroscopia de massa

O peso molecular de MRP-8 é determinado com o método de bombardeamento de Átomos Rápidos (FAB-MS) de acordo com M. Barber et al. (Nature 1981, 293, 270) num espectrómetro ZAB-SE (VG Analytical Ltd., Manchester, GB) a

KV. A ionização é atingida com um canhão de césio a 35 KV.

É usado tioglicerol contendo 0,1% de TFA como uma matriz.

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M (Calculado): 10'832.53

Μ (encontrado): 10'833.6+ 2,1 (média de 4 medidas).

Partes alíuotas de MRP-8 são digeridas com 1/10 da quantidade de tripsina, cimotripsina ou proteína V8 a partir de Staphylococcus aureus em NH^HCOg 50 mM. Os fragmentos de V8 são convertidos em ésteres de metilo com HC1 1,25N em metanol 1 hora à temperatura ambiente. Os fragmentos de tripsina (50 jag) são oxidados com 50 ul de ácido perfórmico (1 parte de HgOg a 30% e 19 partes de HCOOH) durante 2 horas à temperatura ambiente. O FAB-MS de fragmentos não derivados, esterifiçados e oxidados permite a identificação inequívoca dos fragmentos de MRP-8 compreendendo aminoácidos 1 a 16, 19 a 41, 57 a 70 e 72 a 77, respectivamente.

Exemplo 22: Separação e purificação de MRP-14 recombinante

22.1. Cromatografia de permuta iónica DEAE ml de lisado impuro do Exemplo 13.3 de E. coli contendo pMRP-14-trp é dialisado e purificado numa coluna (5x10 cm) de permuta iónica DEAE Trisacril^M (LKB) como descrito no Exemplo 20.1. MRP-14 elui-se a uma concentração de 0,12 a 0,15M de NaCl em Tris-HCl 20 mM, 0,01% de DTT, pH=8,5 (tampão de diálise). As amostras de lisado impuro do Exemplo 15 e 19 contendo MRP-14 são processadas do mesmo modo.

22.2. Cromatografia de permuta iónica em sulfopropilo

A mistura de MRP-14 recombinante contendo as fracções do Exemplo 22.1 (68 ml) é acidificada para pH=5,5 com ácido acético a 10% e bombeada sobre uma coluna (2,5x10 cm) de permuta iónica SP Trisacryl(§) M (LKB) equili-104-

brada com 50 mM de NaOAc/0,01% DTT, pH=5,5 (tampão inicial). A coluna é lavada com tampão inicial até a absorção UV 254 nm atingir o nível de linha de base. As proteínas ligadas à coluna são eluídas usando um gradiente linear de NaCl em tampão inicial da gama de 0,0M a 0,5M de NaCl, depois tampão inicial/NaCl 0,5M (80 ml) e tampão inicial/NaCl l,0M (200 ml) a um caudal de 1,7 ml/minuto. São recolhidas fracções individuais de 17 ml e analisadas por SDS-PAGE. O MRP-14 recombinante das fracções misturadas pensa-se ter mais do que 90% de pureza neste estádio de acordo com o SDS-PAGE.

22.3. HPLC de fase reversa

O MRP-14 recombinante do Exemplo 22.2 é também purificado numa coluna de HPLC (0,4x12 cm) cheia com 218 TP-B5-5u (The Separations Groups). 0 equipamento e as condições do Exemplo 1.1. são usados. Assim, para um gradiente linear de 30 minutos de 65 a 45% de TFA 0,1% em água e 35 a 55% de TFA 0,07%-em^zacetonitrilo e a um caudal de 1 ml/min., o MRP-14 é eluído após 13,8 minutos. O MRP-14 dimérico ligado por dissulfureto, elui-se após 16,2 minutos. Este dímero pode ser convertido em MRP-14 monomérico por tratamento com 0,2% de DTT durante 15 minutos à temperatura ambiente.

22.4. Análise de sequência de aminoácidos

O MRP-14 purificado do Exemplo 22.3 é submetido a análise de sequência de aminoácidos N-terminal como descrito no Exemplo 21.1. Foi encontrada a seguinte sequência de aminoácidos N-terminal:

T^-Xz-Lys-Met-Ser-Cln-Leu-clu-X.-Xio-ne-Glu-Tbr-He.

He-Asn-Thr-Phe-His-Xs ₀-Tyr-X_{2 2}-v_al-Lys-Leu-Gly-Xo₇-p_ro30

Asp-X₃ Q-Leu-Asn-.

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Χ₂, X_g , Χ^θ, X₂q' ^Χ22' ^Χ2 7 ^{e Χ}30 ^reP^resentam amino-ácidos não determinados. O aminoácido de metionina esperado no MRP-14 N-terminal tinha sido partido obviamente pelo hospedeiro E. coli alojado em pMRP-14-trp.

22.5 Espectroscopia de massa

Foi realizado FAB-MS como descrito no Exemplo 21.4:

M (calculado, primeiro aminoácido Tre): 13'110.94

M (calculado): 13'112.8 (Sinal acumulado de 3 análises individuais ) .

FAB-MS de tripsina, cimotripsina e V8 cozidos permite a identificação inequívoca dos fragmentos de MRP-14 que compreendem os aminoácidos 10 a 19, 23 a 52, 58 a 77 e 79 a 93.

Exemplo 23: Separação e purificação de MRP-14d Recombinante

23.1. Cromatografia por permuta iónica DEAE β feita a diálise de 320 ml de lisado impuro do Exemplo 13.3 de E. coli contendo pMRP-14d-trp e carregado numa coluna (2,6x10 cm) de permuta iónica DEAE Trisacryl^M como descrito no Exemplo 20.1. A coluna é lavada com 80 ml de tampão diálise, depois eluída usando um gradiente linear de NaCl em tampão diálise da gama de 0,0M a 0,2M NaCl. MRP-14d é eluido entre 0,08 e 0,19M NaCl.

23.2. Cromatografia de permuta iónica em sulfopropilo

As fracções combinadas contendo MRP-14d recombinante do Exemplo 23.1. (70 ml) são acidificadas para pH=5,5 e carregadas numa coluna de permuta iónica SPTrisa106-

cryT*^ como descrito no Exemplo 22.2. MRP-14d é eluido usando um gradiente linear de 0,0M a 0,5M, depois 0,5M e l,0M NaCl em tampão inicial como anteriormente e pensa-se ter mais do que 95% de pureza de acordo com SDS-PAGE.

²³ *³ · Análise de sequência de aminoácidos

O MRP-14d purificado do Exemplo 23.2 é submetido a análise de sequência de aminoácidos N-terminal como descrito no Exemplo 21.1. É encontrada a seguinte sequência de aminoácidos N-terminal:

510

Ser-Gln-Leu-Glu-Ars-Asn-Ile-Glu-Ihr-Ile-Ile-Asn-Tta-Phe· ²⁰²⁵

His-Gln-Tyr-Ser-Val-Lys-Leu-Gly-His-Pro-Asp-Thr-Leu-Asn·

Gln-Gly-Glu-Phe-Lys-Glu-Leu-Val-.

O aminoácido de metionina esperado em N-terminal de MRP-14d não está presente.

Exemplo 24: ADN genómico humano codificador de MRP-8

24.1. Separação de ADN genómico de placenta humana

Uma placenta humana é picada até se transformar em pó por congelação de fatias de tecido em azoto líquido e esmagamento num almofariz. O ADN é isolado por várias partes alíquotas lisadas suavemente de 2 ml de pó fino de tecido em 30 ml de EDTA 0,1M, Tris-HCl O,1M, PH=7,5,,

Sarkosil a 1%, S -mercaptoetanol 0,3M e 100 jig/ml de pro-107-

teína K a 50°C durante 2 horas num disco rotativo. Com o fim de evitar a formação de aglomerações, o pó é passado através de um crivo antes da adição ao tampão de lise. São adicionados 28 g de CsCl e 10 mg de brometo de etídio e o ADN ligado por centrifugação em equilíbrio num rotor VT50 Beckman a 49.000 rpm durante 36 horas. As bandas são separadas e o brometo de etídio extraído três vezes com álcool isoamílico. O ADN é dialisado extensivamente contra 1000 volumes de Tris-HCl 10 mM, pH=7,5 e EDTA 0,5 mM a 4°C durante dois dias .

24.2. Digestão por restrição a 15 pg de ADN de placenta humana (Exemplo 24.1) são limitadas até completar de acordo com os protocolos de manufactura com endonuclease de restrição BamHI, HindIII, EcoRI ou PstI (Boehringer) durante 2 horas a 37°C. As digestões de restrição são carregadas em fendas separadas (10 pg por fenda) em gel de agarose a 0,6% em Tris-acetato 50 mM, pH=8,0 e EDTA 1 mM e realizam-se a 4°C a 100V durante 6 horas neste tampão. Depois de electroforese o gel é manchado com brometo de etídio (5 pg/ml de H₂O) durante 10 minutos e fotografado com a ajuda de um transiluminador de UV 260 nm.

24.3 Souther blot

O gel com mancha do Exemplo 24.2. é exposto a irradiação a UV 260 nm durante 5 minutos para permitir a transferência eficiente de moléculas de ADN de elevado peso molecular. O gel é depois incubado durante 30 minutos em NaOH 0,4N e NaCl 0,6M para desnaturação e durante 30 minutos em Tris-HCl, 0,5M, pH=7,5 e NaCl 1,5M para neutralização. O gel é colocado num prato de vidro cheio com papel Watman 3 MM e imerso em 20xtampão SSC (NaCl 3M e citrato de sódio 0,3M). Uma membrana Gene Sereen plus^ (New England

108-

Nuclear) pré-humedecida com 2xSSC e umapilha de 5 cm de papel Whatman 3 MM são dispostos em camada no gel para permitir a transferência de fluido de ácidos nucleicos em 20xSSC durante 18 horas à temperatura ambiente.

24.4. Hibridização com uma sonda de ADNc de MRP-8

As digestões de restrição HindIII e

PstI de ADN de placenta humana total (Exemplo 24.2) são examinados para fragmentos que contêm sequências homólogas e relacionadas parcialmente ao ADNc de MRP-8 humano (clone 3 do Exemplo 8.3). Os fragmentos de ADN de placenta em GeneScreen plus^ são hibridizados a baixa e elevada estringên32 7 cia com uma sonda marcada com P de MRP-8 ADNc (1,2x10 cpm/jig). Esta sonda é preparada para formar o plasmídeo do clone 3 (Exemplo 8.3) por digestão com PvuII/Pstl, que cliva um fragmento de 369 bp, e submetido a indusão de fragmentos como descrito no Exemplo 8.5. A membrana com os fragmentos de ADN é hibridizada a 65°C em tampão 6xSSC, 5x solução de Denhart, SDS a 0,1% e 100 pg/ml de timo de vitela sonificado veículo de ADN submetido a ultra-sons durante 12 horas com 5-10x10° cpm/ml de sonda de ADNc de MRP-8. A membrana é lavada a 65°C em 6xSSc, 4xSSC, 2xSSC, lxSSC e 0,lxSSC tampão contendo 0,1% de SDS sucessivamente, seca e exposta para auto-radiografia. A hibridização de baixa estringência é realizada do mesmo modo excepto relativamente à lavagem a 65°C em 6xSSC contendo apenas 0,1% de SDS. Apenas os fragmentos de ADN fortemente hibridizantes são observados para estringência baixa e elevada. A digestão de BamHI dá um fragmento 18 kb hibridizante, um fragmento HindIII 22 kb, EcoRI 21 kb, e um fragmento PstI 5 kb. Este resultado sugere fortemente que o gene MRP-8 está presente como uma cópia simples no genoma humano. Para testar se o ADN genómico está na verdade digerido até completar, um controlo southern blot é hibridizado com uma sonda de ADNc activador de tecido plasminogénio humano (S. Friezner-Degen, B. Rajput e E.

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Reich, J. Biol. Chem. 1986, 261, 6972 ). O padrão de bandas publicado com os fragmentos BamHI, EcoRI, HindIII e PstI é confirmada.

24.5. Separação de clones genómicos contendo o gene MRP-8

Uma biblioteca genómica de Charon Λ4A humano é construída a partir de ADN de fígado fetal humano por digestão limitada com endonucleases de restrição HaelII e Alui (R.M. Lawn, E.F. Fritsch, R.C. Parker, G. Blake e T. Maniatis, Cel 1978, 15, 1157-1174). Esta biblioteca é rastreada com a sonda ADNc de MRP-8 como descrito no Exemplo 24.4. São transferidas 600.000 placas de fagos independentes para membranas de nylon (Pall-Biodyne )

32 e hibridizadas em duplicado com 8x10 cpm de sonda de ADN por membrana de acordo com os protocolos vulgares (Maniatis handbook). As placas principais são mantidas a 4°C durante vários meses. São recolhidas seis placas positivas purificadas e o ADN isolado para análise posterior. A análise por southern blut do ADN mostrou que todos os seis fagos recombinantes contêm o gene completo inserido no fago humano de ADN. Um fragmento de ADN longo Hpall 5 kb contendo a região codificadora de MRP-8 completo é sub-clonado a partir do clone 3 do fago β para um tipo selvagem de vector pBR322 linear com Ciai aumentando para o plasmídeo pBRMRP-8/ /3A-HpaII.

Exemplo 25: Análise da sequência de plasmídeo pBRMRP-8/3A-Hpall

A estratégia seguida é descrita na Figura 4 e as áreas seguidas representadas por linhas e círculos a preto apontando na direcção de sequência de ADN. A sequência de ADN é realizada em bacteriofagos M13 templatos de cadeia simples de acordo com o protocolo (Amersham) de

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!

[ manufactura. A sequência de ADN completo do gene MRP-8 é li- I da nas duas cadeias. | i

gene MRP-8 contém dois intrões (intrão 1 e 2) e três exões (exão 1-3). Intrão 1 interrompe os nucleotídeos 5' não traduzidos da região 23 a montante do codão de iniciação de ATG, enquanto o intrão 2, que é 150 bp de tamanho, interrompe a região codificadora na posição 47 de aminoácidos. O exão não-codificador é de 33 bp de comprimento. O exão é 164 bp de comprimento e codifica para a proteína de MRP-8 a partir dos aminoácidos 1 a 47 enquanto o exão 3 é de 211 bp de comprimento e codifica a partir dos aminoácidos 48 a 93 (C-terminal). A sequência lider do ARNm de 56 bp de comprimento é interrompida em 33 bp a jusante do local CAP pêlo intrão 1 de 484 bp de comprimento. O arrastador de ARNm acima do ponto de adição poli (A) é de 70 nucleotídeos de comprimento. O ponto de adição poli(A) é deduzido da sequência de ADN de sinal 3' do ADNc de MRP-8 de comprimento total (Exemplo 10). Assim o comprimento de ARNm de MRP-8 é de 408 nucleotídeos.

A sequência de ADN completa do gene codificador de MRP-8 assim como as regiões reguladoras de ADN lateràis são apresentadas na fórmula VIII. No extremo 5' do gene é encontrado um elemento promotor 5'-TATAAAA-3¹, 26 bp a montante do ponto principal CAP de ARNm de MRP-8. No extremo 3' é encontrado um sinal de adição de poli(A) 5'-AATAAA-3', 53bp a jusante do codão âmbar. Além dos locais de enlaçamento conservados que estão de acordo com a regra GT/AG estabelecida (R. Breathnack et al.,Proc. Nat. Acad. Sei. USA 1978, 75, 4853-4857), os intrões contêm uma extensão de polipirimidina e uma sequência de ADN consensual para a formação de estrutura laço.

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Exemplo 26: ADN genómico humano codificador para MRP-14

26.1. Hibridização de ADN genómico de placenta humana com uma sonda de ADNc de MRP-14

As digestões de restrição BamHI, EcoRI, HindIII, e PstI de ADN de placenta humana total do Exemplo 24.2 são examinados para fragmentos contendo sequências homólogas e parcialmente relacionadas com o ADNc de MRP-14 humano (clone pMRP-14-10 do Exemplo 9.3.). Os fragmentos de ADN de placenta em GeneScreen plus® são hibridizados a baixa e elevada estringência com uma sonda marcada com P de ADNc de MRP-14 (1,2x10 cpm/jug). Esta sonda é preparada a partir do plasmídeo do clone de pMRP-14-10 (Exemplo 9.3), por digestão com DralII/Aval, gue parte um fragmento de 364 bp e tradução de fragmento como descrito no Exemplo 9.3. A membrana com os fragmentos de ADN é hibridizada a 65°C em tampão 6xSSC, 5x solução de Denhart, SDS a 0,1% e 100 jig/ml de timo de vitela veículo ADN submetido a ultra-sons durante 12 horas com 5-10xl0⁸ cpm/ml do sensor de ADNc de MRP-14. A membrana é lavada a 65°C em tampão 6xSSC, 4xSSC, 2xSSC, lxSSC e 0,2xSSC contendo SDS a 0,1% sucessivamente, seco e exposto para autoradiografia. A hibridização a baixa estringência é realizada do mesmo modo excepto relativamente à lavagem a 65°C em 4xSSC contendo apenas SDS a 0,1%.

São observados fragmentos de ADN apenas fortemente hibridizantes a alta e baixa estringência. A digestão de BamHI dáum fragmento 11,6 kb hibridizante e um fragmento PstI 6 kb. A digestão HindIII e EcoRI dão os dois fragmentos i.e., para HindIII 5,7 e 3,6 kb, para EcoRI 5,4 e 2,7 kb. Este resultado sugere fortemente que o gene MRP-14 está presente como uma cópia simples no genoma humano.

26.2. Separação de clones genómicos contendo o gene MRP-14

Uma biblioteca genómica de charon,Á4A

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humano é construída a partir de ADN de fígado fetal humano e rastreada com osensor de ADNc de MRP-14 como descrito no Exemplo 24.5. São transferidas 600'00 placas de fagos β independentes para 20 membranas de nylon e hibridizadas de Ϊ acordo com os protocolos vulgares. São recolhidos quatro placas positivas, purificadas e o ADN isolado para análii se posterior. A analise southern blot do ADN mostrou que todos os quatro fagos recombinantes contêm o gene completo inserido no fago humano de ADN. Um fragmento de ADN longo PstI 6 kb contendo a região codificadora MRP-14 completaé sub-clonada a partir do clone 2 do fago num vector pUC9 tipo selvagem linear com PstI aumentando para o plasmídeo pUCMRP-14/Pst6 .

Exemplo 27: Análise de sequência de plasmídeo pUCMRP-14/Pst6

A estratégia seguida é descrita na Figura 5 e as áreas de sequência apresentadas por linhas e círculos a preto apontadas na direcção da sequência do ADN. A sequência de ADN é realizada com o método de terminação de cadeia didesoxi em bacteriofagos M13 de templatos de cadeia simples e em templatos de ADN super-enrolados de cadeia dupla de acordo com o manual de Maniatis. A região codificadora do gene de MRP-14 é interrompida por dois intrões, intrão 1 e intrão 2. 0 intrão 1 é de 387 bp de comprimento e interrompe a região não traduzida 5', 15 bp a montante do codão de iniciação de ATG. O intrão 2 é de cerca de 2227 bp de comprimento e interrompe a região codificadora na posição de aminoácidos. O exão 1 não-codificador é de 28 bp de comprimento. O exão 2 é de 165 bp de comprimento e codifica a proteína MRP-14 desde o aminoácido 1 até 50 enquanto que o exão 3' é de 389 bp de comprimento e codifica os aminoácidos a 114 (terminus COOH).

A sequência de ADN do gene codificador de MRP-14 tal como as regiões reguladoras de ADN flanqueante

-113são apresentadas na fórmula X. Entre as posições 1737 e 2098, a sequência não é conhecida. As sequências de ADN reguladoras tal como as ligações intrão-exão são apresentadas na fórmula X. No extremo 5' do gene é encontrado um elemento promotor 5'-TATAAA-3* 29 bp a montante do ponto CAP ARNm de MRP-14. No extremo 3' é encontrado um sinal de adição poli(A) 5'-AAATAAA-3¹ 164 bp a jusante do codão ocre. Além dos pontos de enlaçamento conservados que estão de acordo com a regra GT/AG estabelecida (R. Breathnach et al., Proc. Nat. Acad. Sei. USA 1978, 75, 4853-4857), os intrões contêm uma extensão de polipirimidina e uma sequência de ADN consensual para a formação de estrutura laço.

Exemplo 28; Construção de um vector para a expressão de

MRP-8 em células de mamíferos

È construído um vector expressão pCMVe/ /MRP-8 por manipulação de ADN padrão e é apresentado na Figura 6. O plasmídeo tem a origem pBR322 de replicação e o gene de resistência à ampicilina para a propagação em E.coli Contém o fragmento de ADN BamHI/EcoRI 4320 bp de comprimento. Este amplificador de citomegalovirus humano (HCMV) da região promotora do gene principal IE1 (M. Boshart, F. Weber, G. Janh, K. Dorsch-Hãsler, B. Fleckenstein e W. Schaffner, Cell 1985, 41, 521-530) é derivado do plasmídeo pBR322AccI por manipulação de ADN padrão (manual de Maniatis). O plasmídeo pBR322AccI é preparado por ligação do fragmento de ADN 2144 bp de comprimento AccI/HindIII de pBR322 (J. G. Sutcliffe, Proc. Nat. Acad. Sei. USA 1978, 75 , 3737-3741) usando ligantes Xbal (Biolabs Inc.) com o amplificador HCMV de 300 bp contendo o fragmento de ADN isolado cortando p pSV40-HCMV (recombinante ) conraNcoI. O fragmento de ADN amplificador de Ncol de 300 bp cobre a região a montante do ponto de partida entre os nucleotídeos 262 e 524 no promotor do gene princiapl IE1 HCMV.

Exemplo 29: Construção de um vector para a expressão de MRP-14 em células de mamíferos

É construído um vector expressão pCMVe/MRP-14 por manipulação de ADN padrão e é apresentado na Figura 7. 0 plasmídeo é idêntico ao plasmídeo pCMVe/MRP-8 do Exemplo 28 excepto que contém o fragmento de ADN PstI de 6ooo bp de comprimento derivado do plasmídeo pUCMRP-14-Pst 6 do Exemplo 26.2, que realiza a região codificadora de MRP-14 assim como os elementos reguladores de ADN 5' e 3'.

Exemplo 30: Transferência de genes e expressão transiente dos plasmídeos pCMVe/MRP-8 e pCMVe/MRP-14 em células de mamíferos

O gene de MRP-8 e o gene de MRP-14 são transfectados em células de mamíferos com uma técnica modificada de DEAE-Dextrano (J. H. Cutchan e J. Pagano, J. Natl. Câncer Inst. 1968, 41, 351-357; J. Baneiji, L. Olson e W. Schaffner, Cell 1983, 33, 729-740).

30.1. Expressão de pCMVe/MRP-8

O plasmídeo de ADN do Exemplo 28 é purificado duas vezes sucessivamente em gradientes de densidade de Cscl/brometo de etídio e re-suspenso em Tris-HCl 10 mM e EDTA 1 mM, pH=7,5,depois misturado com DEAE-dextrano (0,5 mg/ml, Pharmacia , peso molecular de 5x10 ) em DMEM (Gibco) contendo Hepes 10 mM (Gibco) até uma concentração final de 1 |jg/ml de plasmídeo de ADN. A solução é incubada à temperatura ambiente durante 10 minutos. Um pseudo-controlo contendo o plasmídeo sem o gene é tratado de forma idêntica.

Células COS-7 (ATCC CRL 1651, vírus SV-40 transformados de células de rins de macacos verdes de África, Y. Gluzman, Cell 1981, 23 , 175-182), células de

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Bowes (RPMI 7272, melanoma maligno humano, D.C. Rijken e D. Collen, J. Biol Chem. 1981, 256, 7035-7041) e células L-132 (ATCC CCL 5, fibroblastos de pulmão embriónico humano, C. Davis et al., Fed. Proc. 1960, /9, 386) são postas em placas com MEM contendo 5% a 10% de FCS (Gibco) em placas de microtitulaçõ de 96 cavidades ou discos de Petri de 10 cm (Falcon). A densidade das células atinge 60%-80% de confluência após 24 horas. A monocamada celular é arrefecida duas vezes com DMEM. O plasmídeo ADN mistura DEAE-dextrano é adicionado (50 pl por placa de microtitulação e 1,2 ml por disco de Petri de 10 cm). As células são incubadas durante 30 minutos a 37°C/5% de CO₂, depois durante 90 minutos a 120 minutos a 37°C/7,5% de CC>₂ dependendo do tipo de célula. As células também são incubadas com DMSO (Merck) a 15% (v/v) em DMEM durante 90 segundos, arrefecido duas vezes com DMEM, depois incubado em 100 pl (por placa de microtitulação) ou 10,0 ml (por disco de Petri) de MEM contendo 5,0% (v/v) de FCS e butirato de sódio 5 mM (Sigma) durante 12 horas a 37°C/5% de CO₂. O meio é alterado para MEM contendo 5% (v/v) de FCS. As células transfectadas são testadas para expressão de MRP-8 após 48 a 72 horas.

30.2. Expressão de pCMVe/MRP-14

O plasmídeo ADN do Exemplo 29 é purificado, misturado com DEAE-dextrano e adicionado a células L-132 como anteriormente (Exemplo 30.1). As células L-132 são incubadas durante 30 minutos a 37°C/7,5% de CC>₂ e depois processadas como anteriormente. As células transfectadas são testadas para expressão de MRP-14 após 48 a 72 horas.

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Exemplo 31: Caracterização de MRP-8 expresso em células de mamífero

31.1. Separação de ARN de células L-132 transfectadas com pCMVe/MRP-8

Uma pastilha contendo 7x10 células L-132 é re-suspensa em 500 pl de tampão GuSCN 48 horas depois da transfecção (Exemplo 30.1). São homogeneizadas fazendo passar a solução de GuSCN várias vezes através de 1 pipeta de 1 ml esterilizada. As células lisadas são tratadas com fenol, e os ácidos nucleicos são precipitados de acordo com um processo padrão (manual de Maniatis). Os ácidos nucleicos são centrifugados, re-dissolvidos em 7,5 ml de Tris-HCl 10 mM, pH=7,0 e EDTA 1 mM e adicionados a 7,5 g de CsCl (Merck). A solução de CsCl é carregada numa almofada de solução de CsCl 5,7M, 2 ml, num tubo polialómero ultracentrifugador TST41 (15 ml). As moléculas de ARN são postas em pastilhas após 16 horas a 2900 rpm a 20°C num rotor Kontron TST 41. O ADN restaíite no cimo da almofada de CsCl é removido. A pastilha de ARN é re-dissolvida em 2 ml de tampão de eluição, precipitada com etanol, re-suspensa em 100 pl de SDS a 0,1% e usada para a experiência de extensão iniciadora. A concentração é determinada espectro fotometricamente para quantidades até 30-50 pg de ARN por 10θ células.

31.2. Preparação de uma sequência iniciadora radioactiva

Uma sequência iniciadora radioactivo é preparada por digestão a 60°C 500 ng de um oligómero de ADN sintético 5-GGCTCGACCTCTTTCGGAAC-3' complementar à posição 131 a 150 de ADNc de MRP-8 de fórmula VII para 1 pg de um templato de cadeia simples M13 contendo a sequência completa de ADNc de MRP-8 (Exemplo 10) durante 60 minutos). O oligómero é clonado por incubação em 50 pl de uma solução contendo 5 unidades de ADN polimerase de Klenow (Boehringer) e 60 uCi dos quatro dNTP- qç - ^ZP radiomarcados à temperatura

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ambiente durante 30 minutos. A reacção é varrida com 5 jil de mistura varrimento de dNTP (0,2 mM) durante 15 minutos e interrompida a 65°C durante 5 minutos. O ADN recentemente sintetizado é restringido com PvuII e a mistura reaccional separada por desnaturação de ureia 8M 8% PAGE. O produto de elongação, um fragmento de ADN de 68 nucleotídeos de comprimento é cortado e eluido a partir do gel de poliacrilamida. A actividade específica da sequência iniciadora sintetizada é 0,5x10 cpm/pg.

31.3. Mapa do extremo 5' de ARNm-MRP-8 pg de ARN total de células L-132 humanas transfectadas (Exemplo 31.1) são co-precipitadas com ΙχΙΟθ cpm da sequência iniciadora sintético do Exemplo 31.2 com etanol. Os ácidos nucleicos são re-suspensos em 27 pl de HgO esterilizada e 3 pl de KC1 2,5M por agitação durante 30 ' minutos. ARN e a sequência iniciadora são desnaturados a 99°C durante 3 minutos e cozidos a 60°C durante 1 hora. 30 pl de tampão transcriptase inversa triplamente concentrada (Tris-HC1 60 mM, pH= 8,8 , MgCl„ 30 mM, DTT 30 mM) são adicionados | ^z I e a mistura reaccional ajustada para mistura de dNTP 30 mM | em 90 pl de 10 unidades de transcriptase inversa (BRL) são adicionados e a mistura reaccional incubada durante 30 minutos a 37°C, depois interrompida com 4 μΐ de EDTA 0,5M, pH=7,5. O ARN é hidrolizado por tratamento alcalino com NaOH 50 mM durante 1 hora a 65°C. Os ácidos nucleicos são neutralizados, depois precipitados com etanol na presença de veículo de

ARNt. Os ácidos nucleicos são re-suspensos em tampão amostra de formamida (80% de formamida, NaOH 10 mM, EDTA 1 mM, 0,1% de xileno cianol, bromofenol azul a 0,1%) e a sequência iniciadora alongada visualizado numa sequência de ADN ureia 8M PAGE a 8% em tampão TBE. 90% das moléculas de ARN elongado co-migran com uma desoxiadenosina localizada 30 bp a jusante do elemento regulador 5¹-TATAAAA-3¹. São obtidos os mesmos resultados quando o ARN poli(A) isolado a partir de células

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mononucleares de sangue humano são ensaiados com a mesma sequência iniciadora como atrás descrito. Não é detectado o produto elongado das pequenas moléculas de ARN de células transfectadas quando as últimas são ensaiadas sob condições idênticas como para as células transfectadas de pCMVe/MRP-8.

31.4. Detecção imuno-histológica de MRP-8 in situ

Células transfectadas com pCMVe/MRP-8 do Exemplo 30.1 são fixadas com glutaraldeído usando protocolos estabelecidos (J. Bruggen et al.,Câncer Immunol, Immunother. 1983, 15, 200-205 ). A monocamada celular é lavada duas vezes com PBS e incubada com 0,05% (v/v) de glutaraldeído (Fluka) em PBS durante 5 minutos à temperatura ambiente seguido por lavagem duas vezes com PBS.

As células fixas são testadas para a expressão de MRP-8 usando uma versão modificada de uma técnica imunoperoxidase (J. Bruggen et al., 1983, loc. cit; Suter et al., Câncer Immunol. Immunother. 1983, 16, 53-58) da seguinte forma: Depois de bloquear a ligação não específica com soro de suino normal a 10% (v/v) (Gibco), as células são incubadas com IgG anti-coelho suino conjugado com peroxidase de rábano (DAKO) durante 30 minutos a 37°C. Faz-se reagir a ligação de peroxidase com (Merck) a 0,10% (v/v) e 3-amino-9-etilcarbazole a 0,26% (p/v) (AEC, Sigma) em tampão de acetato 0,lM, pH=5,2 durante 7 minutos à temperatura ambiente. A avaliação é feita em 500 células microscopicamente; As células de MRP-8 positivas mostram um precipitado de côr vermelha. A tabela 1 mostra a percentagem de expressão nas células testadas MRP-8 é expresso com uma percentagem elevada em células L-132 de pulmão embriónico humano. A expressão é muito mais baixa em células COS-7 de rins de macacos transformados SV-40 e em células de melanoma maligno humano (Bowes). Os controlos pseudo-tratados e soros de controlo negativo são negativos.

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Tabela 1: Expressão de MRP-8 em células de mamíferos transfectadas

Linha celular	espécie	origem de tecido	células com resultado positivas
COS-7	macaco	rins	1%
Bowes	homem	melanoma maligno	1%
L-132	homem	pulmão embriónico	65%

31.5. Western blot de MRP-8 expresso em células de mamíferos

Células de pulmão embriónico L-132 são transfectadas com o gene MRP-8 como descrito no Exemplo 30.1. São destacadas com tripsina a 0,05% (p/v) e EDTA a 0,02% (p/v) (Gibco) tirada a pele a 80 xg e lisadas com NP-40 a 0,5% (v/v) ou SDS a 0,1% (p/v) em tampão contendo Tris-HCl 20 mM, NaCl 120 mM, KC1 5 mM, Mg(OAc)₂ 1,4 mM, CaCl₂ 3,6 mM -mercaptoetanol 6,0 mM e PMSF 1 mM (todos os reagentes da Biorad) em gelo durante 15 minutos. O lisado celular é centrifugado a 48'000 xg durante 60 minutos e a camada sobrenadante processada por um SDS-PAGE (15% (p/v); U.K. Lãmmli, Nature 1970, 227, 680-685). A quantidade de proteína introduzida por fenda corresponde a um equivalente celular de 5x10^ células. A proteína separada é electrotransferida sobre nitrocelulose (Millipore; Towbin et al., Proc. Nat. Acad. Sei. USA 1979, 76, 4350). As proteínas transferidas sobre a folha de nitrocelulose são manchadas com amido black (Merck) a 0,1% (p/v) em metanol a 45% (v/v) e ácido acético a 10% (v/v). Uma folha não tratada de nitrocelulose é revelada com soro anti-coelho de porco (Exemplo 34.1.) durante 14 horas a 4°C seguido por IgG anti-coelho de porco conjugado com peroxidase de rábano (DAKO). A peroxidase ligada é tornada visível por H₂q_{2 a 0},l% e cloronaftol a 0,3%

Λ

(ρ/ν) (Merck) diluido em PBS durante 7 minutos. 0 soro anti-coelho de MRP-8 reconhece uma banda de proteína dentro dos lisados celulares que apresentam um peso molecular de 8 kg/ /mol e mostram as mesmas características que a proteína MRP-8 recombinante expressa em E. coli ou levedura (Exemplo 21) .

Exemplo 32: Caracterização de MRP-14 expressa em células de mamíferos

32.1. Detecção imuno-histológica de MRP-14 in situ em célu- las L-132 transfectadas com pCMVe/MRP-14

Células L-132 transfectadas do Exemplo

30.2. são fixas com glutaraldeído e testadas relativamente à de MRP-14 usando o método do Exemplo 31.4. As células são incubadas com o soro monoespecífico de coelho anti MRP-14 do Exemplo 35.1. A avaliação é feita em 500 células microscopicamente ; as células positivas de MRP-14 mostram um precipitado de cor vermelha. MRP-14 é expresso em 75% das células L-132 depulmão embriónico humano transfectadas. Os controlos pseudo-tratados e os soros de controlo negativos são negativos.

³² ·² · Western blot de MRP-14 expresso em células L-132

Células L-132 de pulmão embriónico transfectadas com pCMVe/MRP-14 como descrito no Exemplo 30.2. são lisadas e o lisado processado por um SDS-PAGE como descrito no Exemplo 31.5. As proteínas separadas são electrotransferidas sobre nitrocelulose e reveladas com soro de coelho anti MRP-14 (Exemplo 35.1.) durante 14 horas a 4°C seguido por IgG anti-coelho de porco conjugado com peroxidase de rábano (DAKO) O soro de coelho anti-MRP-14 reconhece uma banda de proteína dentro dos lisados celulares que apresentam um peso mole-121-

cular de 14 kg/mol e mostram as mesmas características que a proteína MRP-14 recombinante expressa em E. coli ou levedura (Exemplo 22).

Exemplo 33: Separação de linhas celulares humanas estáveis que exprimem MRP-8 ou MRP-14

Com o fim de alcançar a separação de linhas celulares humanas permanentes produtoras de MRP-8 ou MRP-14 recombinante, um plasmídeo contendo o marcador de selecção dominante Tn5 neomicina conferindo resistência a G-418 é co-precipitado com o plasmídeo contendo o gene MRP-8 ou o plasmídeo contendo o gene MRP-14 em células L-132 de pulmão embriónico humano usando a técnica de fosfato de cálcio (F.L. Graham e A.J. Van der Eb, Virology 1973, 52., 456-467; D. Picard e W. Schaffner, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 1983, 80, 417-421) .

Os plasmídeos pSV₂ neo (P. Southern e P. Berg, J. Mol. Appl. Genet 1982, 1^, 327-341) e pCMVe/MRP-8 (Exemplo 28) ou pCMVe/MRP-14 (Exemplo 29) são misturados numa razão de 1:5 em Tris-HCl 10 mM/EDTA 1 mM, pH=7,5. Um volume igual de CaCl₂ 0,5M contendo Hepes O,1M (Gibco) pH=7,05 é adicionado e a mistura é incubada durante 5 minutos a 22°C. É adicionado duas vezes o volume de 2xHBS (Hepes 0,05M, NaCl 0,28M, Na₂HPO₄ 0,75 mM e NaH₂PO₄ 0,75 mM) para dar uma concentração final de 4 ug/ml pSV2 neo e 20 pg/ml de pCMVe/MRP-8 ou pCMVe/MRP-14, e a mistura deixada em gelo durante 30 minutos. São adicionados quantidades de 10 pl desta mistura a células L-132 subconfluentes (Exemplo 30) d senvolvidas em 100 ul em placas de microtitulação de 96 cavidades. As células são incubadas durante 16 horas a 37°C/5% de C0₂, reabastecidas com MEM e incubadas durante 24 horas a 37°C/5% de CC>₂. O agente de selecção G-418 (Gibco) é adicionado para uma concentração final de 1 mg/ml. As células são postas em cultura durante 5 dias, tripsinisadas, divididas em MEM/5% de FCS numa razão de 1:5 em placas de microtitulação de 96 cavidades e incubadas a 37°C/5% de C0₂ com G-418. Depois de 10 dias os clones de células simples são isolados e propagados até culturas de massas celulares de acordo com os processos padrão. As células são examinadas para a expressão de MRP-8 ou MRP-14 como descrito no Exemplo 31 e 32, e os clones positivos são seleccionados.

Exemplo 34: Anticorpos policlonais para MRP-8

34.1. Soro anti-MRP-8 de coelho

O soro anti-MRP-8 de coelho é gerado por imunização de um coelho com MRP-8 recombinante de E.coli (Exemplo 12) purificado por cromatografia de exclusão de dimensões (Exemplo 20.2). 0,5 mg de proteína de adjuvantes de Freund completo (Gibco) são injectadas seguido por uma injecção estimulante de 0,5 mg de proteína em adjuvantes de Freund imcompleto após 20 dias. 0 título do soro de coelho é controlado por um ensaio imuno absorvente ligado a enzima (ELISA) em placas de microtitulação revestidos com MRP-8 recombinante segundo os protocolos estabelecidos. A observação de Western blots revela que, após absorção exaustiva com lisados de E. coli não transfectado, a única reactividade deixada no anti-soro é dirigida em relação a MRP-8.

34.2. Separação de anticorpos de cromatografia de imuno-afinidade

É preparada uma coluna imuno adsorvente MRP-8-Affi-Gel^ 10 usando o processo de manufactura (Bio-Rad, Richmond, Califórnia). A imunoglobulina G (IgG) do soro anti-MRP-8 de coelho não específica (Exemplo 34.1.) é precipitada por sulfato de amónio a 50% de saturação O precipi-123-

tado é dissolvido em PBS e feita a diálise em relação a PBS. Ê bombeado 15 ml da solução dialisada contendo aproximadamente 100 mg de IgG através de coluna de imuno-afinidade a um caudal de 10-12 ml/hora. 0 material ligado não específicamente é removido por lavagem da coluna com PBS/cloreto de sódio 0,4M. A IgG ligada específicamente é eluida com hidrocloreto de glicina O,1M, pH=2,5. As fracções contendo os anticorpos são misturadas, neutralizadas por adição de Tris 1M e dialisadas com PBS. São obtidos aproximadamente 4 mg de IgG específica para MRP-8.

Exemplo 35: Anticorpos policlonais para MRP-14

35.1. Soro anti-MRP-14 de coelho

O soro anti-MRP-14 de coelho é gerado por imunização de um coelho com MRP-14 recombinante purificado de E. coli (Exemplo 22). São injectadas 0,5 mg de proteína em adjuvantes de Freund Completo (Gibco) seguido por uma injecção estimulante de 0,5 mg de proteína em adjuvantes de Freund incompleto após 20 dias. O título do soro do coelho é controlodo por um ensaio imuno absorvente ligado a enzima (ELISA) em pratos de microtitulação revestidos com MRP-14 recombinante seguindo os protocolos estabelecidos. A observação de western blots revela que, após absorção exaustiva com lisados de E. coli não transfectado, a única reactividade deixada no anti-soro é dirigida em relação a MRP-14.

35.2. Separação de anticorpos de coelho específicos para

MRP-14 por cromatografia de afinidade imunológica

Analogamente à forma descrita no Exemplo 34.2, é preparada uma coluna imunoadsorvente de MRP-14-Affi-Gel 10 recombinante e usada para a separação de IgG anti-MRP-14 de coelho de soro anti-MRP-14 de coelho monoespe-124-

cífico. São obtidas aproximadamente 3,2 mg de IgG específica para MRP-14.

Exemplo 36: Células de hibridoma produtoras de anticorpos monoclonais para MRP-8

36.1. Protocolo de imunização

São injectados em 3 ratinhos Balb/C fêmeas intraperitonealmente com 0,1 mg de MRP-8 recombinante (Exemplo 12, purificado como no Exemplo 20.2) em adjuvantes de Freund completo seguido por duas injecções estimulantes de 0,05 mg de MRP-8 em adjuvantes de Freund incompleto com 14 dias de intervalo. Depois de 6 semanas é injectado 0,05 mg de MRP-8 em soro fisiológico e os ratinhos são sacrificados 4 dias mais tarde.

36.2. Fusão celular e separação de hibridomas

Todas as experiências de fusão são realizadas segundo os protocolos estabelecidos (G. Kohler e C. Milstein, Nature 1976, 256, 495) usando alinha de mieloma não secretora P3x63-Ag8.653 (ATCC NS CRL 1580). São fundidas

7 células de baço com 10 células de mieloma na presença de 35% de polietileno glicol (p/v) PEG 4000, Merck) e de dimetilsulfóxido a 15% (Merck). A mistura de fusão é distribuída em meio de selecção HAT padrão (FCS a 20%, Gibco) em 1200 placas de microtitulação (Falcon) contendo células de exsudato peritoneal de ratinho como células de alimentação. Depois de 10-14 dias as camadas sobrenadantes de crescimento de hibridomas são testadas para a ligação de MRP-8 com um ELISA tipo sanduíche (Exemplo 40.2). De 633 camadas sobrenadantes de hibridomas testadas 48 dividiram-se em fortemente positivas.

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Exemplo 37: Separação e caracterização de anticorpos monoclonais de MRP-8

37.1. Separação e purificação

Ratinhos Balb/C de 8 a 10 semanas de idade dão tratados préviamente por via intraperitoneal (i.p.) com 0,3 ml de pristano (Aldrich). 2 a 3 semanas mais tarde, θ

5-10x10 células de hibridomaclonados e 0,2 ml de pristano são injectados i.p.. Depois de 8-10 dias é recolhido o fluído de ascites, centrifugado a 800 xg e guardado a -80°C.

Alternativamente os hibridomas são propagados in vitro a uma grande escala usando meio de hibridoma (Gibco). A camada sobrenadante é centrifugada a 800 xg, filtrada com um filtro 0,45 jim Nalgene^ e guardada a -80°C.

A imunoglobulina impura é precipitada por adição gota a gota de 0,9 volumes equivalentes de sulfato de amónio concentrado a 0°C, depois dissolvida em Tris-HC1 20 mM, NaCl 50 mM, pH=7,9. Uma fracção de IgG é obtida por uso do processo Affigel^ Protein A MAPS Kit de Bio-Rad. A fracção de IgG eluida é precipitada outra vez com sulfato de amónio e dissolvida em PBS com uma concentração de 10 mg/ml e dialisada para o mesmo tampão.

37.2. Caracterização

Os anticorpos produzidos pelos hibridomas seleccionados 8-5C2 e 8-10D7 são testados para a sua especificidade no ELISA tipo sanduiche usando anti-MRP-8 de coelho e anti-MRP-14 de coelho (Exemplo 40 e 42), no Western blot para MRP-8 e MRP-14 Exemplos 31.5 e 32.2) e no ensaio de células simples para MRP-8 e MRP-14 (Exemplos 31.4 e 32.1). Os anticorpos monoclonais 8-5C2 e 8-10D7 reconhecem selectivamente o FIM 8 KD de EP 162.812 e o MRP-8 recombinan-126-

te como expresso em E. coli (Exemplo 12), levedura (Exemplo 19) e células L-132 de pulmão embriónico transfectadas (Exemplo 30), mas não reagem com sobreposições com MRP-14 recombinante ou natural ou com outras proteínas. 0 epítopo identificado é estável em SDS.

A subclasse dos anticorpos monoclonal é determinada segundo os protocolos vulgares (J. Briiggen et al., Câncer Immunol. Immunolher. 1983, 15, 200) e encontrou-se ser IgG^ para os dois 8-5C2 e 8-10D7.

Exemplo 38: Células de hibridoma produtoras de anticorpos monoclonais contra MRP-14

Ratinhos Balb/c são imunizados com 0,1 mg de MRP-14 recombinante de E. coli (Exemplo 13, purificado de acordo com o Exemplo 22) em adjuvantes de Freud completo seguido por duas injecções estimulantes de 0,05 mg de MRP-14 em adjuvantes de Freund incompleto em 14 dias de intervalo. Depois de 6 semanas são injectadas 0,05 mg de MRP-14 em solução salina fisiológica. Quatro dias mais tarde as células de baço dos ratinhos imunizados são recolhidos e fundidos com células de mieloma em ratos P3x63-Ag8.653 (ATCC NS CRL1580), e as células de hibridoma resultantes rastreadas como descrito no Exemplo 36. De 420 camadas sobrenadantes de hibridoma testadas, 27 eram positivas no ELISA tipo-sanduiche do Exemplo 42. Os hibridomas adequados são re-clonados por diluição limitativa pelo menos duas vezes.

Exemplo 39: Separação e caracterização de anticorpos monoclonais para MRP-14

Células de hibridoma seleccionadas do

Exemplo 38 saõ propagadas in vivo ou cultivadas in vitro como

127-

descrito no Exemplo 37.1. A fracção de IgG precipitada é purificada usando Affingel® Proteín A MAPS Kit, precipitada outra ves com sulfato de amónio, dissolvido em PBS com uma concentração de 10 mg/ml, dialisada contra PPS e guardada a -80°C.

Os anticorpos produzidos pelos hibridomas seleccionados 14-6B2 e 14-19C9 são testados pela sua especificidade no ELISA tipo sanduíche, Western blot e o ensaio de células simples como descrito no Exemplo 37.2. Os anticorpos monoclonais 14-6B2 e 14-19C9 reconhecem selectivamente MRP-14 natural, MRP-14', MRP-14 recombinante e MRP-14d, mas não reagem com sobreposição com MRP-8 ou outras proteínas. A subclasse dos anticorpos monoclonais 14-6B2 e 14-19C9 é determinada ser IgG^.

Exemplo 40: Detecção de MRP-8 com um imunoensaio de enzima (ELISA)

40.1. Biotinilação de anticorpos policlonais e monoclonais para MRP-8

Faz-se reagir 1 mg de anticorpo anti—MRP-8 de coelho policlonal (Exemplo 34) ou anticorpo monoclonal 8-5C₂ (Exemplo 37) e 0,1 mg de Biotin-X-NHS^R (Calbiochem) em 1,0 ml de tampão Hepes 0,lM, pH=8,0, durante 4 horas a 4°C de acordo com uma versão modificada do método de Lerner e Colab. (J. Exp. Med. 1980, 152, 1085).Os anticorpos biotinilados são dialisados a 4°C contra PBS e guardados a -80°C.

40.2. ELISA tipo-sanduiche usando anticorpos policlonais anti-MRP-8 de coelho e anti-MRP-8 de coelho biotinilado

Placas de microtitulação (NUNCFI) são

-128-

revestidos com anticorpos anti-MRP-8 de coelho purificado por afinidade (5 ^ig/ml) do Exemplo 32.2 em tampão de carbonato 0,05M, pH=9,6 e 50 ul/cavidadee incubado durante a noite a 4°C. As placas revestidas podem ser guardadas durante 2 semanas. Depois do bloqueamento dos locais não específicos com PBS contendo o,2% de gelatina e BSA a 1% (Serva) durante 1 hora a 37°C, 50 j^l/cavidade de uma série de diluição de MRP-8 (Exemplo 20 .2 , 0,1-50 ng/ml) e 50 ^il/cavidade de uma série de diluição de amostras teste em PBS contendo 0,2% de gelatina 1% de BSA e 0,05% de Tween 20 (Bio-Rad) são adicionados e incubados durante a noite a 4°C. Depois de lavagem com PBS contendo 0,05% de Tween 20 o anti-MRP-8 de coelho biotinilado (1 ^il/ml) do Exemplo 40.1 em PBS, 0,2% de gelatina e 0,05% de Tween 20 é incubado durante 1 hora a 37°C seguido por estreptavidina-peroxidase (BRL) durante 30 minutos a 37°C. Depois de lavagem com PBS e 0,05% Tween 20 a peroxidase ligada é revelada usando ^a (v/v) (Merck) e ácido 2,2¹-azimo-bis-(3-etilbenzotiazolina sulfónico) (ABTS, 0,54 mg/ml (w/v), Bohringer Mannheim) dissolvido em tampão citrato 0,05M, pH=4,0. Depois de 30 minutos a 37°C a densidade óptica é medida a 415 nm usando um fotómetro de oito canais (FLOW).

Os ensaios detectam MRP-8 baixa para 50 pg/ml em lisados celulares de monocitos humanos, em células L-132 de pulmão embriónico transfectadas em MRP-8 (Exemplo 31) e em amostras de plasma de doentes humanos e indivíduos normais.

Os anti-MRP-8 de coelho biotinilado podem ser substituídos pelos anticorpos 8-5C2 monoclonais de ratinhos biotinilados (1 ug/ml).

-129-

40.3. ELISA tipo sanduíche usando os anticorpos monoclonais 8-10D7 e os anticorpos 8-5C2 biotinilados processo do ensaio é como no Exemplo

40.2, excepto que as placas de microtitulação são revestidos primeiro com os anticorpos monoclonais 8-10D7 (10 pg/ /ml). Depois do bloqueamento de locais não específicos as amostras teste e as soluções padrão de MRP-8 são adicionadas e depois fazem-se reagir com os anticorpos 8-5C2 biotinilados (1 pig/ml) . O restante processo é como descrito.

O anticorpo 8-5C2 monoclonal biotinilado pode ser substituido por anti-MRP-8 de coelho biotinilado.

40.4. ELISA tipo-sanduiche usando os anticorpos monoclonais 8-10D7 ou 8-5C2 e anti-MRP-8 de coelho

O processo do ensaio é como descrito no Exemplo 40.2. Como anticorpo 8-10D7 captura (ou 8-5C2) é revestido (10 pg/ml) na placa de microtitulação. Depois do bloqueamento do local não específico, as amostras teste e as soluções padrão contendo o MRP-8 são adicionadas e depois fazem-se reagir com o anti-MRP-8 de coelho. Os anticorpos de coelho são detectados com espécies específicas de conjugados de Ig anti-coelho de cabra-peroxidase (DIANOVA) e processados também como no Exemplo 40.2.

Um ensaio equivalente usa anti-MRP-8 de coelho policlonal para revestimento seguido pelas amostras teste e depois os anticorpos monoclonais de ratinhos 8-5C2 ou 8-10D7. Fazem-se reagir as ligações dos anticorpos de ratinhos com espécies específicas de conjugados de Ig anti-ratinho de cabra-peroxidase (DIANOVA).

-130-

Exemplo 41: Equipamento de teste para ELISA tipo-sanduiche para MRP-8

Um equipamento de teste para o ELISA tipo-sanduiche do Exemplo 40.2. contém

1) Placas de microtitulação (NUNC FI)

2) 10 ml de anticorpos policlonais anti-MRP-8 de coelho purificados (5 jig/ml, EXemplo 34.2) em tampão carbonato 0,05M, pH=9,6

3) 1,0 ml de solução (1 mg/ml) padrão de MRP-8 recombinante em PBS contendo 0,05% de Tween 20.

4a) 10 ml de anti-MRP-8 de coelho biotinilado (1 ^ig/ml, Exemplo 40.1) em PBS, pH=7,4, 0,2% de gelatina, BSA a 1%, 0,05% de Tween 20 ou

4b) 10 ml de anticorpos 8-5C2 monoclonais biotinilado (1 jig/ /ml) em PBS, pH=7,4, 0,2% de gelatina, 1% de BSA, 0,05% de Tween 20.

5) 10 ml de estreptavidina - peroxidase (BRL) 1:2000 em PBS, pH=7,4, 2% de gelatina, 1% de BSA, 0,05% de Tween 20.

6) 200 ml de PBS, 0,05% de Tween 20.

7) 200 ml de PBS, pH=7,4, 0,2% de gelatina, 1% de BSA, 0,05% de Tween 20.

8) 40 ml de ABTS (0,54 mg/ml) e 0,064% de ^2°2 ^{em tam}P^aocitrato 0,05M, pH=4,0.

9) curva de calibração.

10) manual de instruções.

Um equipamento de teste para ELISA tipo-sanduiche do Exemplo 40.3. contém os mesmos componentes que anteriormente excepto relativamente às seguintes substituições :

2) 10 ml de anticorpo monoclonal 8-10D7 (10 ipg/ml) 4a) 10 ml de anticorpo monoclonal 8-5C2 biotinilado (1 |ig/ml) ou

4b) 10 ml de anticorpo policlonal biotinilado anti-MRP-8 de

131coelho (1 ^ig/ml)

Um equipamento de teste para o ELISA tipo-sanduiche do Exemplo 40.4. contêm os mesmos componentes que anteriormente excepto relativamente às seguintes substituições :

2a) 10 ml de anticorpo monoclonal 8-10D7 ou 8-5C2 (10 jug/ml) ou

2b) 10 ml de anticorpo policlonal anti-MRP-8 de coelho (5 jig/ /ml) purificado por afinidade

4a) 10 ml de anticorpo policlonal anti-MRP-8 de coelho (1 pg/ /ml) e

5a) 10 ml de conjugado de Ig anti-coelho de cabra-peroxidase ou

4b) 10 ml de anticorpo monoclonal 8-5C2 (1 ^ig/ml) e

5b) 10 ml de conjugado de Ig anti-coelho de cabra-peroxidase 1:5000.

Exemplo 42: Detecção de MRP-14 com um imunoensaio de enzima ELISA

O anticorpo policlonal anti-MRP-14 de coelho (Exemplo 35) ou anticorpo monoclonal 14-6B2 ou 14-19C9 (Exemplo 39) são biotinilados como descrito no Exemplo 40.1.

Um ELISA tipo-sanduiche é apresentado para a detecção de MRP-14 como descrito nos Exemplos 40.2 ou 40.4 substituindo o anticorpo policlonal anti-MRP-8 por anti-MRP-14 e anticorpo monoclonal 8-10D7 ou 8-5C2 por 14-6B2 ou 14-19C9. São feitas referências às soluções padrão de MRP-14 do Exemplo 22 (0,1-100 ng/ml).

Para a determinação de MRP-14 em plasma

-132-

sanguíneo, as amostras de plasma tomadas com heparina são feitas para fluoreto de fenilmetanosulfonilo 1 mM (PMSF, Fluka) e guardadas a -80°C. As amostras para análise são diluídas a partir de 1:5 a 1:10'000 e testadas no ensaio tipo-sanduiche atrás descrito .

Exemplo 43: Equipamento de teste para ELISA tipo-sanduiche para MRP-14

Um equipamento de teste para o ELISA tipo-sanduiche do Exemplo 42 usando anticorpo policlonal anti-MRP-14 e anti-MRP-14 biotinilado ou anticorpo 14-6B2 monoclonal biotinilado contêm

1) Placas de microtitulação (NUNC FI)

2) 10 ml de anticorpo policlonal anti-MRP-14 de coelho purificado por afinidade (5 pg/ml, Exemplo 35.2) em tampão carbonato 0,05M, pH=9,6.

3) 1,0 ml de solução padrão (1 mg/ml) de MRP-14 recombinante em PBS contendo 0,05% de Tween 20.

4a) 10 ml de anti-MRP-14 de coelho biotinilado (1 ^uig/ml) em PBS, pH= 7,4 , 0,2% de gelatina, 1% de BSA, 0,05% de Tween 20 ou

4b) 10 ml de anticorpo 14-6B2 (1 ^ig/ml) monoclonal biotinilado em PBS, pH=7,4, 0,2% de gelatina, 1% de BSA 0,05% de Tween 20

5) 10 ml de estreptavidina-peroxidase (BRL) 1:2000 em PBS, pH=7,4, 2% de gelatina, 1% de BSA, 0,05% de Tween 20.

6) 200 ml de PBS, 0,05% de Tween 20.

7) 200 ml de PBS, pH=7,4, 0,2% de gelatina, 1% de BSA, 0,05% de Tween 20.

8) 40 ml de ABTS (0,54 mg/ml) e a 0,064% em tampão ci- trato 0,05M, pH=4,0.

9) curva de calibração

10) manual de instruções

-133-

Os anticorpos policlonais ou monoclonais biotinilado e o conjugado estreptavidina-peroxidase (4 e 5) podem ser substituidos pelos próprios anticorpos policlonais ou monoclonais e por um conjugado de soro anti-Ig de uma espécie específica e peroxidase como no Exemplo

Exemplo 44: Preparação farmacêutica para aplicação parentérica jig de MRP-8 do Exemplo 20.5 ou MRP-14 do Exemplo 22.3 são dissolvidos em 3 ml de albumina de soro humano 5N. A solução resultante é passada através de um filtro bacteriológico e a solução filtrada é súb-dividida sob condições assépticas em 10 frasquinhos. Estes frasquinhos são guardados de preferência no frio, por exemplo a -20°C.

-134-

L Ί

Claims

REIVINDICAÇÕES

1θ. - Processo para a preparação de um peptídeo relacionado com o factor inibidor da migração de macrófagos humano (MRP) de peso molecular aparente de cerca de 8KD ou cerca de 14 KD, ou de um seu mutante, fragmento ou derivado, caracterizado por se purificar uma solução contendo os compostos desejados por métodos cromatográficos e se isolarem os compostos e, se se desejar se prepararem os fragmentos ou derivados a partir deles.
2â. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a solução contendo os compostos desejados ser um extracto pre-purifiçado, sobrenadante celular ou filtrado de cultura de leucócitos humanos normais estimulados ou de microorganismos modificados por engenharia genética ou linhas celulares permanentes, de mamíferos.
3â. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o método de purificação cromatográfico ser seleccionado a partir de cromatografia de permuta iónica, cromatografia líquida de alta resolução de fase reversa, filtração com gel, cromatografia de afinidade, cromatograf ia sobre hidroxilapatite, cromatografia de interacção hidrofóbica ou uma sua combinação.
4â. - Processo de acordo com a reivindicação 1, 2 ou 3, caracterizado por se preparar um peptídeo relacionado com o factor inibidor da migração de macrófagos humano MRP-8 da fórmula

-135-

Z -Leu-Tre-Glu-Leu-Glu-Lis-Ala-Leu-AÍfl-Ser-lle-Ile-Asp-Val-Tir¹ 20 . ³⁰

Η i s—L is—Ti r—Ser—Leu—Ile-Lis-Gli-iAsn-Fen-His-Ala-Val-Tir-Arg-Asp⁴⁰

Asp-Leu-Lis-Lis-Leu-Leu-Glii-Tre-Glu-Cis-Pro-Gln-Tir-Ile-Arg-Lis50 θθ

Lis-Gli-Ala-Asp-Val-Trp-Fen-Lis-Glu-Leu-Asp-Ile-Asn-Tre-Asp-Gli70 ⁸⁰

Ala-Val-Asn-Fen-Gln-Glu-Fen-Leu-Ile-Leu-Val-Ile-Lis-Met-Gli-Val90 93

Ala-Ala-His-Lis-Lis-Ser-His-Glu-Glu-Ser-His-Lis-Glu (I) em que é hidrogénio, acilo ou o resíduo do aminoácido metionina, ou um seu mutante, fragmento ou derivado.
5â. - Processo de acordo com a reivindicação 1, 2 ou 3, caracterizado por se preparar um peptídeo relacionado com factor inibidor de migração de macrófagos humano MRP-14 da fórmula
6 10 20 Z₂-Ser-Gln-Leu-GiD-Arg-Asn-Ile-Glu-Tre-Ile-Ue-Asn-Tre-Fen-His-GlnrTir-Ser-Val-Lis-Leu-Gli-His-Pro-Asp-Tre-Leii-Asn-Gln-Gli-Glu-Fen-Lis⁴⁰50

Glu-Leu-Val-Arg-Lis-Asp-Leu-Gln-Asn-Fen-Leu-Lis-Lis-Glu-Asn-Lis-Asn⁸⁸70

Glu-Lis-Val-Ile-Giu-His-Ile-Met-GIu-Asp-Leu-Asp-Tre-Asn-Ala-Asp-Lis80 «In-Leu-Ser-Fen-Glu-GIu-Fen-Ile-Met-Leu-Met-Ala-Arg-Leu-Tre-Trp-Ala⁹θ . 100

Ser-His-Glu-Lis-Met-His-Glu-Gli-Asp-Glu-Gli-Pro-Gli-His-His-Iflis-Lis. ¹¹⁰ 114

Pro-Gli-Leu-Gli-Glu-Gli-Tre-Pro (II),

-136- em que

Zg é hidrogénio, acilo ou um resíduo peptídico, acilado facultativamente, de 1 a 5 aminoácidos, ou um seu mutante, fragmento ou derivado.

6ã. - Processo de acordo com a reivindicação 4 ou 5, caracterizado por a solução contendo o composto desejado ser obtida por cultura de um hospedeiro transformado que expressa um peptídeo da fórmula I ou II, um seu mutante ou derivado sob condições que permitem a expressão do polipeptídeo heterólogo.
7â. - Processo de acordo com a reivindicação 6, caracterizado por compreender os passos de

a) isolamento de um DNA que codifica um composto de fórmula I ou II ou um seu fragmento de uma biblioteca de cDNA ou de DNA genómico de células humanas e sua mutação facultativamente, ou a síntese quimica de tal DNA.

b) incorporação do DNA num vector de expressão apropriado .

c) transferência'do vector híbrido obtido num hospedeiro receptor.

d) selecção do hospedeiro transformado a partir de hospedeiros não transformados por cultura e sob condições em que apenas sobreviva o hospedeiro transformado.

e) cultura do hospedeiro transformado sob condições que permitem a expressão do polipeptídeo heterólogo, e

f) isolamento do composto de fórmula I ou II, seu mutante, fragmento ou derivado.

e, se se desejar, derivação do composto obtido de fórmula I ou II, seu mutante ou fragmento.

-137-
8â. - Processo de acordo com a reivindicação 6, caracterizado por se preparar o MRP-8 da fórmula I, em que Ζ_χ é hidrogénio, acetilo ou o resíduo do aminoáci do metionina (Met).
9§. - Processo de acordo com a reivindicação 6, caracterizado por se preparar o MRP-8 da fórmula I, em que Ζ_χ é Met.
10a. - Processo de acordo com a reivin dicação 1 ou 6, caracterizado por se preparar o MRP-14 da fórmula II, em que Z₂ é hidrogénio, acetilo, Met-Tre-Cis-Lis-Met, Met-Tre-Cis-Lis-Met- ou acetil-Tre-Cis-Lis-Met.

llâ. - Processo de acordo com a reivin dicação 1 ou 6, caracterizado por se preparar o MRP-14 da fórmula II, em que Z₂ é hidrogénio ou Tre-Cis-Lis-Met.

12â. - Processo de acordo com a reivin dicação 6, caracterizado por se prepararem os mutantes de MRP-8 da fórmula I, em que um, dois ou três aminoácidos sim· pies do composto da fórmula I são substituídos por um amino· ácido diferente ou por uma ligação.

13â. - Processo de acordo com a reivindicação 6, caracterizado por se prepararem os fragmentos de MRP-8 da fórmula I compreendendo pelo menos 20 aminoácidos consecutivos.

14a. - Processo de acordo com a reivin

-138- dicação 6, caracterizado por se prepararem os derivados de MRP-8 da fórmula I, em que as funções amino e/ou hidroxilo são glicosiladas.

15â. - Processo de acordo com a reivindicação 6, caracterizado por se preparar um dímero de MRP-8 da fórmula I, em que Z^ é Met e o grupo mercapto do resíduo cisteína está na forma oxidada dando origem a uma ponte S-S intermolecular.

16ã. - Processo de acordo com a reivindicação 1 ou 6, caracterizado por se prepararem os mutantes de MRP-14 de fórmula II, em que um, dois ou três aminoácidos simples do composto da fórmula II são substituidos por um aminoácido diferente ou por uma ligação.

17ê. - Processo de acordo com a reivindicação 1 ou 6, caracterizado por se prepararem os fragmentos de MRP-14 de fórmula II compreendendo pelo menos 20 aminoácidos consecutivos.

18^. _ Processo de acordo com a reivindicação 1 ou 6, caracterizado por se prepararem os derivados de MRP-14 de fórmula II, em que as funções amino e/ou hidroxilo são glicosiladas.

19ê. - Processo de acordo com a reivindicação 1 ou 6, caracterizado por se preparar um dímero de

MRP-14 de fórmula II, em que ® Tre-Cis-Lis-Met- e em que o grupo mercapto do resíduo cisteína está na forma oxidada dando origem a uma ponte intermolecular.

-139-

20ã. - Processo de acordo com a reivindicação 1 ou 6, caracterizado por se preparar um dímero misto de MRP-8 de fórmula I, em que é Met, com MRP-14 de fórmula II, em que Z₂ é Tre-Cis-Lis-Met- e em que o qrupo mercapto do resíduo cisteína está na forma oxidada dando origem a uma ponte S-S intermolecular.

21a. - Processo para a preparação de um DNA que codifica um composto de fórmula I ou II, um seu mutante ou fragmento compreendendo pelo menos 15 nucleotídeos, caracterizado por compreender a cultura de um hospedeiro transformado e o isolamento do DNA desejado ou a sua síntese por condensação de nucleotídeos.

22a. „ Processo de acordo com a reivindicação 21, caracterizado por compreender os passos de

a) isolamento de mRNA a partir de leucócitos mononucleares humanos, selecção do mRNA desejado, preparação do DNA de cadeia simples complementar do referido mRNA, depois do DNA de cadeia-dupla (cd cDNA), a partir dele, ou

b) isolamento de DNA genómico a partir de células humanas e selecção do DNA desejado usando uma sonda DNA, e

c) incorporação de cd cDNA do passo a) ou do cd DNA do passo b) num vector de expressão apropriado.

d) transformação de um microorganismo hospedeiro apropriado com o vector híbrido obtido.

e) selecção do hospedeiro transformado que contêm o DNA que codifica um composto de fórmula I ou II, um seu mutante ou fragmento a partir de hospedeiros que não contêm DNA codificador, e

f) isolamento do DNA desejado.

23^. _ Processo de acordo com a reivin-140- dicação 21 ou 22, caracterizado por se preparar um DNA que codifica MRP-8 da fórmula yⁱ_yⁿ_y^t_y^d_y^g_y^a_y^v-yⁿ_y^f_yQ-y^e_y^f-y^l_yⁱ-y^l_y^v-yⁱ_y^k-y^m-y^g. _vV ,Λ _VH _VK _VK _VS MI _VE _VE _VS _VH _VK _VE * _v

Y -Y -i -Y -Y -Y -Y -Y -Y -Y -Y -Y -Y -Y -Y -Y3 (III), em que

Y₁ é um resíduo de DNA flanqueador de 12 nucleotídeos oumais contendo uma sequência promotora,

Y₂ e Y -Y -Y -Y , ou esta ausente,

Y^ é um resíduo de DNA flanqueador de um ou mais nucleotídeos ou está ausente,

Y^A codifica alanina (A ou Ala) e é GCT, GCC, GCA ou GCG, c

Y codifica cisteína (C ou Cis) e é TGT ou TGC,

Y^D codifica ácido aspártico (D ou Asp) e é GAT ou GAC,

Y codifica ácido glutâmico (E ou Glu) e é GAA ou GAG,

Y^F codifica fenilalanina (F ou Fen) e é TTT ou TTC,

Y^G codifica glicina (G ou Gli) e é GGT, GGC, GGA ou GGG, Y^E codifica histidina (H ou His) e é CAT ou CAC, Y¹ codifica isoleucina (I ou Ile) e é ATT, ATC ou ATA,

Y codifica lísina (K ou Lis) e é AAA, ou AAG,

Y^E codifica leucina (L ou Leu) e é TTA, TTG, CTT, CTC, CTA ou CTG,

M

Y codifica metionina (M ou Met) e é ATG,

Y^N codifica asparagina )N ou Asn) e é AAT ou AAG, p

Y codifica prolina (P ou Pro) e é CCT, CCC, CCA ou CCG, YQ codifica glutamina (Q ou Gin) e é CAA ou Cag, codifica arginina (R ou Arg) eé CGT, CGA, CGG, AGA ou AGG, Y³ codifica serina (S ou Ser) e é TCT, TCC, TCA, TCG, AGT ou AGC, γΤ codifica treonina (T ou Tre) e é ACT, ACC, ouACA ou ACG,

Y^V codifica valina (V ou Vai) e é GTT, CTC, GTA ou GTG,

Y^W codifica triptofano (W ou Trp) e é TGG,

Y^Y codifica tirosina (Y ou Tir) e é TAT ou TAC, e

Y* é TAA codão stop, TAG ou TGA, um DNA de cadeia dupla consistindo em um DNA de fórmula III e um DNA que lhe é complementar, o próprio DNA complementar, DNA genómico em que um ou dois intrões interrompem o DNA de fórmula III, um mutante de tais DNAs, em que um, dois, três ou quatro nucleotídeos foram sujeitos a mutação, ou um fragmento de tais DNAs compreendendo pelo menos 15 nucleotídeos.

24a. - Processo de acordo com a reivindicação 21 ou 22, caracterizado por se preparar um DNA que codifica MRP-14 de fórmula

Υ₁-Υ₂-γΜ-γ^-γ^<λ-γ^_γΕ_γΚ_γΝ_γΙ_γΕ_γΤ_γΙ_γΙ_γΝ_γ’Γ_γΡ_γΗ_γ9 γΥ

I Y^V-Y^K-γ^Ε-γθ—γ^-γ^_γ^_γΤ_γΤ_γ^_γύ_γθ_γΤ_γΙ γΚ γΕ yL yV yR γΚ

Υ^-Υ^-Υ^-Υ^-Υ^-Υ^Χ-Υ^-Υ^-Υ^-γ^-γ^_γ^_γ^_γ^_γί_γΕ γΗ γΐ γΜ yE_yD y^l-y^d-y^t-yⁿ-y^a-y^d-y^k-y^-y^l-y^s-y^f-y^e-y^e-y^f-yⁱ-y^m_y^l_y^m_y^a_y^r_y^l. γΤ-Υ^-γΑ-γ5_γΗ_γ£_γΚ_γΜ_γΗ_γΕ_γΟ_γϋ_γΕ_γΟ_γΡ_γβ yH γΗ_γΗ_γΚ yP (IV), em que

Yj_ é um resíduo de DNA flanqueador de 12 nucleotídeos ou mais contendo uma sequência promotora;

Μ T C K

Y2 é Y -Y -Y -Y , ou estaausente,

-142- __ ..Μ _,T -,C _Χ-Κ , ζ ,

Υ₂ e Υ -Υ -Υ -Υ , ou esta ausente,

Yg é um resíduo de DNA flanqueador de um ou mais nucleotídeos ou ausente,

Y^A codifica alanina (A ou Ala) e é GCT, GCC, GCA ou GCG,

Y codifica cisteína (C ou Cis) e é TGT ou TGC,

Y^D codifica ácido aspártico (D ou Asp) e é GAT ou GAC,

Y codifica ácido glutâmico (E ou Glu) e é GAA ou GAG,

Y^ codifica fenilalanina (F ou Fen) e é TTT ou TTC,

Y^G codifica glicina (G ou Gli) e é GGT, GGC, ou GGG, Y^H codifica histidina (H ou His) e é CAT ou CAC, Y¹ codifica isoleucina (I ou Ile) e é ATT, ATC, ou ATA,

Y codifica lisina (K ou Lis) e é AAA ou AAG,

Y^L codifica leucina (L ou Leu) e é TTA, TTG, CTT, CTC, CTA ou CTG,

M

Y codifica metionina (M ou Met) e é ATG, γΝ codifica asparagina (N ou Asn)) e é AAT, ou AAC,

Y^P codifica Prolina (P ou Pro) e é CCT, CCC, CCA ou CCG,

Y^ codifica glutamina (Q ou Gin) e é CAA ou CAG,

Y^R codifica arginina (R ou Arg) e é CGT, CGC, CGA, CGC, AGA ou AGG,

Y^G codifica serina (S ou Ser) e é TCT, TCC, TCA, TCG, AGT ou AGC,

T

Y codifica treonina (T ou Tre) e é ACT, ACC, ACA, ou ACG,

Y^V codifica valina (V ou Vai) e é GTT, GTC, GTA ou GTG, w

Y codifica triptofano (W ou Trp) e e TGG_r

Y codifica tirosina (Y ou Tir) e é TAT ou TAC e

Y* um codão stop TAA, TAG, ou TGA, um DNA de cadeia-dupla consistindo em um DNA de fórmula IV e um DNA que lhe é, complementar, o próprio DNA complementar, DNA genómico, em que um ou dois intrões interrompem o DNA de fórmula IV, um mutante de tais DNAs, em que um, dois, três ou quatro nucleotídeos foram sujeitos a mutação, ou um fragmento de tais DNAs compreendendo pelo menos 15 nucleotídeos .

14325^. - Processo de dicação 21 ou 22, caracterizado por se codifica MRP-8 da fórmula acordo com a reivinpreparar um DNA que i o

MLTELEKALNSIIDVYHKY

Yi-ATGTTGACCGAGCTGGAGAAAGCCTTGAACTCTATCATCGACGTCTACCACAAGTAC

10 20 30 4050

2 03 0

SLIKGNFHAVYRDDLKKLLE

TCCCTGATAAAGGGGAATTTCCATGCCGTCTACAGGGATGACCTGAAGAAATTGCTAGAG

60 70 80 90 100110

U050

TECPQYIRKKGADVWFKELD ACCGAGTGTCCTCAGTATATCAGGAAAAAGGGTGCAGACGTCTGGTTCAAAGAGTTGGAI 120 130 140 150 160170

6070

INTDGAVNFQEFLILVIKMG ATCAACACTGATGGTGCAGTIAACTTCCAGGAGTTCCICATTCTGGTGATAAAGATGGGC 180 190 200 210 220230

8090

VAAHKKSHEESHKE* GTGGCAGCCCACAAAAAAAGCCATGAAGAAAGCCACAAAGAGTAG-Y3 240 250 260 270280 (V), em que é um resíduo de DNA flanqueador de 12 nucleotídeos ou mais contendo uma sequência promotora e Yg é um resíduo de DNA flanqueador de um ou mais nucleotídeos ou está ausente, um DNA de cadeia-dupla consistindo em um DNA de fórmula V e um DNA que lhe é complementar, o próprio DNA complementar, DNA genómico, em que um ou dois intrões interrompem o DNA de fórmula V, um mutante de tais DNAs, em que um, dois, três ou quatro nucleotídeos foram sujeitos a mutação e fragmentos de tais DNAs gue compreendem pelo menos 15 nucleotídeos.

144-

26â. - Processo de acordo com a reivindicação 21 ou 22, caracterizado por se preparar um DNA que codifica MRP-14 da fórmula

5 10 20 M S Q L E R N I E TIINTFHQY ATGTCGCAGCTGGAACGCAACATAGAGACCATCATCAACACCTTCCACCAAIAC 10 20 30 40 50 30 M0 K L G H P D T L N QGEFKELVR

TCIGTGAAGCTGGGGCACCCAGACACCCTGAACCAGGGGGAATTCAAAGAGCTGGTGCGA

60 70 80 90 100 110

50 60 KDLQNFLKKENKNEKV I E Η I

AAAGATCIGCAAAATTTTCTCAAGAAGGAGAATAAGAATGAAAAGGTCATAGAACACATC

120 130 140 150 160 170

70 80 MEDLDTNADKQLSFEE F I M L

ATGGAGGACCTGGACACAAATGCAGACAAGCAGCTGAGCTTCGAGGAGTTCATCATGCTG

180 190 200 210 220 230

90 100 MARLTWASHEKMHEGD E G P G

ATGGCGAGGCTAACCTGGGCCTCCCACGAGAAGATGCACGAGpGTGACGAGGGCCCTGGC

240 250 260 270 280 290

110

HHHKPGLGEGTP*

CACCACCATAAGCCAGGCCTCGGGGAGGGCACCCCCTAA-Y3 300 310 320 330 (VI), em que

Y é um resíduo de DNA flanqueador de 12 nucleotídeos ou mais contendo uma sequência promotora, Yg é ATGACTTGCAAA ou está ausente e Yg é um resíduo de DNA flanqueador de um ou mais nucleotídeos ou está ausente, um DNA de cadeia-dupla de um

DNA de fórmula VI e um DNA que lhe é complementar, o próprio

-145-

DNA complementar, DNA genómico em que um ou dois intrões interrompem o DNA de fórmula VI, um mutante de tais DNAs, em que um, dois, três ou quatro nucleotídeos foram sujeitos a notação, e os fragmentos de tais DNAs que compreendem pelo menos 15 nucleotídeos.

27â. - Processo de acordo com a reivindicação 21 ou 22, caracterizado por se preparar um DNA que codifica MRP-8 da fórmula

AACTTGGAACAGCCCTTCTACATACACTCCATCTTCTCTATCTTAGTTACAAGTTTTTTT

10 20 30 40 5060

AATAAGAAATGGGCAAAGTCAGCTGTCTTTCAGAAGACCTGGTGGGGCAAGTCCGTGGGC

70 80 90 100 110120

MLTELEKALNSIIDVYHKY ATCATGTTGACCGAGCTGGAGAAAGCCTTGAACTCTATCATCGACGTCTACCACAAGTAC 130 140 150 160 170180

2 0 3 0

SLIKGNFHAVYRDDLKKLLE TCCCIGATAAAGGGGAATTTCCATGCCGTCTACAGGGATGACCTGAAGAAAITGCTAGAG

190 200 210 220 230 240 90 50 T E C P Q Y I R K K G A D V W F K E L D ACCGAGTGTCCTCAGTATATCAGGAAAAAGGGTGCAGACGTCTGGTTCAAAGAGTTGGAT 250 260 270 280 290 300 60 70 I N T D G A V N F Q E F L I L V I K M G

ATCAACACIGATGGTGCAGTTAACTICCAGGAGTTCCTCATTCTGGTGATAAAGATGGGC

310 320 330 340 350 360

8090

VAAHKKSHEESHKE*

GTGGCAGCCCACAAAAAAAGCCATGAAGAAAGCCACAAAGAGIAGQTGAGIIACTGGGCC

370 380 390 400 410420

CAGAGGCTGGGCCCCTGGACATGTACCTGCAGAATAATAAAGTCATCAATACCTCAAAAA

430 440 450 460 470480

AAAAA (VII)

-146dicação 21 ou 22, caracterizado por se

281. - Processo de acordo com a reivinpreparar um DNA que codifica MRP-14 da fórmula VIII.

291. - Processo de acordo com a reivindicação 21 ou 22, caracterizado por se preparar um DNA que codifica MRP-14 da fórmula

Μ I C K M S

AAAACACTCTGTGTGGCTCCTCGGCTTTGACAGAGTGCAAGACGATGACTTGCAAAATGTCG

10 20 30 40 5060

10 20

QLERNIEIIINTFHQYSVKL CAGCTGGAACGCAACATAGAGACCATCATCAACACCTTCCACCAATACTCTGTGAAGCTG

70 80 90 100 110120

3040

GHPDTLNQGEFKELVRKDLQ GGGCACCCAGACACCCTGAACCAGGGGGAATTCAAAGAGCTGGTGCGAAAAGATCTGCAA

130 140 150 160 170180

5060

NFLKKENKNEKVIEHIMEDL

AATTTTCTCAAGAAGGAGAATAAGAATGAAAAGGTCATAGAACACATCATGGAGGACCTG

190 200 210 220 230240

708θ

DTNADKQLSFEEFIMLMARL GACACAAATGCAGACAAGCAGCTGAGCTTCGAGGAGTTCAICATGCTGATGGCGAGGCTA 250 260 270 280 290300

TWA⁹SHEKMHEGDEGPGHHHK ACCTGGGCCTCGCACGAGAAGATGCACGAGGGTGACGAGGGCCCTGGCCACCACCATAAG 310 320 330 340 350360
11 0

PGLGEGTP*

CCAGGCCTCGGGGAGGGCACCCCCTAAGACCACAGIGGCCAAGATCACAGTGGCCACGGC

370 380 390 400 410420

CACGGCCACAGTCATGGTGGCCACGGCCACAGCCACCCAT

430 440 450460 (IX)

-147-

30α. - Processo de acordo com a reivindicação 21 ou 22, caracterizado por se preparar um DNA que codifica MRP-14 da fórmula X.

31â. - Processo de acordo com a reivindicação 21 ou 22, caracterizado por se preparar um DNA, que hibridiza com um DNA de fórmula V ou VI ou com um DNA complementar do DNA de fórmula V ou VI.

32â. - Processo para a preparação de um vector híbrido compreendendo um DNA que codifica um composto de fórmula I ou II, um seu mutante ou um fragmento de um tal DNA operativamente ligado a uma sequência de controlo de expressão caracterizado por se cortar um vector adequado e se prover de caudas de desoxinucleotídeos semelhantes e fundidos com o referido DNA codificador que transporta as caudas dos desoxinucleotídeos complementares semelhantes ou se ligar o vector de corte e o DNA codificador com aajuda de oligodesoxinucleotídeos ligantes ou por ligação terminal embotada .

33§. - Processo de acordo com a reivindicação 32, caracterizado por se preparar um vector híbrido derivado de um plasmideo pBR322.

34â. - Processo de acordo com a reivindicação 32, caracterizado por se preparar um vector híbrido contendo o promotor trp.

35â. - Processo de acordo com a reivin dicação 32, caracterizado por se preparar um vector híbrido contendo o promotor P do fago L·

36^. - Processo deacordo com a reivindicação 32, caracterizado por se preparar um vector híbrido contendo o segmento de replicação autónoma de cromossomas da levedura (ars) e o promotor PHO5.

37a. - Processo de acordo com a reivindicação 32, caracterizado por se preparar um vector híbrido pJDB207R/PHQ5-MRP-8, pJDB207R/PHQ5-MRP-14 ou pJDB207R/PHQ5-MRP-14d.

38â. - Processo de acordocom a reivindicação 32, caracterizado por se preparar um vector híbrido contendo a unidade de aumento do gene imediato-precoce principal citomegalovirus humano.

39â. - Processo de acordo com a reivin dicação 32, caracterizado por se preparar um vector híbrido, pCMVe/MRP-8 ou pCMVe/MRP-14.

40â. - Célula hospedeira caracterizada por ter sido transformada com um vector híbrido contendo um DNA que codifica um composto de fórmula I ou II, um seu mutante ou um fragmento de tal ADN ligado operativamente a uma sequência de controlo de expressão.

41â. - célula hospedeira de acordo com a reivindicação 40, caracterizado por ser do género Escherichia coli.

-149-

42^. - Célula hospedeira de acordo com a reivindicação 41, caracterizado por ser de estirpe E. coli HB101/LM 1035, K12 ou W3110.

43â. - Célula hospedeira de acordo com a reivindicação 40, caracterizado por ser do género Saccharomyces cerevisiae.

44â. - Célula hospedeira de acordo com a reivindicação 43, caracterizado por ser da estirpe Í5. cerevisiae .

45â. - Célula hospedeira de acordo com a reivindicação 40, caracterizado por ser uma célula de pulmão embriónica L-132 .

46ê. - Célula hospedeira de acordo com a reivindicação 45, caracterizado por ser uma célula de pulmão embriónica L-132 transformada estávelmente com pCMVe/MRP-8 ou pCMVe/MRP-14 e neo pSV^.

47§. - Processo para a preparação de um hospedeiro transformado que expressa um composto de fórmula I ou II, um seu mutante fragmento ou derivado, caracterizado por se transformar ou transfectar um hospedeiro adequado com um vector de expressão contendo um DNA que codifica um composto de fórmula I ou II, um seu mutante ou um fragmento de tal DNA ligado operativamente a uma sequência de controlo de expressão.

150-

48â. - Processo para a preparação de uma composição farmacêutica caracterizada por um peptídeo relacionado com o factor inibidor da migração de macrófagos humano um seu mutante, fragmento ou derivado ser misturado com um veículo farmaceuticamente aceitável.

49â. - Processo para a preparação de anticorpos policlonais para um peptídeo relacionado com o factor inibidor da migração de macrófagos humano e seus derivados, caracterizado por se imunizar um mamífero adequado por duas ou mais injecções de um composto de fórmula I ou II na presença deum agente de aumento da resposta imune, se recolher o soro sanguíneo do mamífero imunizado e se isolarem e purificarem os anticorpos e, se se desejar, se transformarem os anticorpos obtidos em seus derivados.

50â. - Processo de acordo com a reivindicação 49, caracterizado por se prepararem anticorpos policlonais específicos para MRP-8 e seus derivados.

50ã. - Processo de acordo com a reivindicação 49, caracterizado por se prepararem anticorpos policlonais específicos para MRP-8 e seus derivados.

51a. - Processo de acordo com a reivindicação 49, caracterizado por se prepararem anticorpos policlonais específicos para MRP-14 e seus derivados.

52â. - Processo de acordo com a reivindicação 49, caracterizado por se prepararem conjugados de anticorpos policlonais com biotina.

531. _ Processo para a preparação de anticorpos monoclonais específicos para um peptídeo relacionado com o factor inibidor da migração de macrófagos humano e seus derivados, caracterizado por células de hibridoma de secreção dos referidos anticorpos monoclonais.

a) serem cultivados in vitro e os anticorpos monoclonais isolados a partir da cultura sobrenadante, ou

b) serem propagadas in vivo num mamífero adequado e os anticorpos monoclonais recuperados a partir dos fluidos do corpo do referido mamífero e se se desejar, os anticorpos monoclonais obtidos serem convertidos num seu derivado.

541. - Processo de acordo com a reivindicação 53, caracterizado por se prepararem anticorpos monoclonais específicos para MRP-8 e seus derivados.

551. - Processo de acordo com a reivindicação 53, caracterizado por se prepararem anticorpos monoclonais específicos para MRP-14, e seus derivados.

561. - Processo de acordo com a revindicação 53, caracterizado por se prepararem os anticorpos poclonais com a designação 8-5C2., 8-10D7, 14-682 e 14-19C9, e seus derivados.

571. - Processo de acordo com a reivindicação 53, caracterizado por se prepararem conjugados de anti-corpos monoclonais com biotina.

581. - Linhas celulares de hibridoma caracterizado por originarem secreção de anticorpos monoclonais

-152específicos para um peptídeo relacionado com um factor inibidor da migração de macrófagos humano.

59â. - Linhas celulares de hibridoma de acordo com a reivindicação 58, caracterizado por terem a designação 8-5C2, 8-10D7, 14-6B2 e 14-19C9 .

60ã. - Processo para a preparação de linhas celulares de hibridoma de acordo com a reivindicação 58, caracterizado por se imunizar um mamífero adequado com um composto de fórmula I ou II, se fundirem as células produtoras de anticorpos deste mamífero com células de mieloma,se clonarem as células híbridas obtidas na fusão e se seleccionarem as células que segregam os anticorpos desejados.

61â. - Método de determinação imunológica de um peptídeo relacionado com o factor inibidor da migração de macrófagos humano caracterizado por se revestir I um veículo sólido com um anticorpo policlonal ou monoclonal específico para um peptídeo relacionado com o factor inibidor da migração de macrófagos humano, se incubar com uma

-153solução contendo o peptídeo a ser determinado, se incubar depois com uma solução contendo um anticorpo policlonal ou monoclonal diferente ou um seu derivado com especificidade para o mesmo peptídeo, e se determinar a quantidade do segundo anticorpo referido ligada ao veículo por uma reacção de substracto enzimático.

Lisboa, 1 de Outubro de 1987

J. PEREIRA DA CRUZ Ageris Gíiciil da Propriedade Industrial RUA VlCTvi·. CORDON, 10-A, 1.· 1200 LISBOA (A)

FOLHA 1 (8 FOLHAS)

FOLHA 2 (8 FOLHAS)

FOLHA 3 (8 FOLHAS)

CODING REGION ¢=:

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