PT85874B - Processo para a preparacao de oligo-peptidos com accao antibiotica - Google Patents

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Description

PROCESSO PARA A PREPARAÇAO DE OLIGO-PEPTIDOS COM ACÇAO
ANTIBIÓTICA
em que
X representa hidrogénio ou um radical de amino-ácido hidrófobo e Y representa um radical de amino-ácido básico, sendo que os átomos de carbono na posição 2 dos radicais de amino-acidos apresentam a configuração L_. e dos seus derivados e sais protegidos.
Os referidos compostos podem ser preparados a partir de meios de cultura de Bacillus subtilis ou por meio de processos de sintese quimica. Estes compostos possuem sobretudo uma acção fungicida.
primeiro processo referido consiste. por exemplo, em se cultivar a referida estirpe bacte riana. num meio nutriente, que contém, eventualmente um amino-ácido X ou Y ou um dipeptídeo Y-Y. e se isolar, a partir do meio de cultura, a desejada rizocticina ou mistura de rizocticinas.
ϊ
Ο presente invento refere-se a nq vos di- e tri-peptidos. a processos para a sua preparação, a extractos e concentrados de meios de culturas bacterianas que contem os referidos oligo-peptidos em forma concen trada. e se refere a utilização dos novos péptidos como fungicidas, nematicidas ou herbicidas e se refere ainda a preparados farmacêuticos, produtos fiossanitarios e prepara dos herbicidas contendo tais péptidos. Além disso, o invento refere-se a um processo para a preparação de um derivado da degradação destes péptidos. na forma opticamente pura, e se refere ainda ao proprio derivado dos péptidos, na forma opticamente pura.
Os novos di- e tri-peptidos designam-se por rizocticinas A. B. C. D. etc., e o produto deri vado tem a designação de acido L- 2-amino-5- fosfono-3-cis-pentenoico (L-APPA). As referidas rizocticinas exercem efeitos fungicidas, nematicidas e herbicidas.
As rizocticinas do presente invento podem obter-se a partir do bactérias, em especial da estirpe de Bacillus substilis. Extractos de acção anti-fungica. derivados de B. subti1 is. e que se designam por Rhizoctonia factor' e 'Aspergillus Factor!, tornaram-se conhecidos pelo cientista H. David Michener et al.,Arch. Biochem. 2j% 208-214 ( 1949). para além do conhecido polipeptido antibiótico Subtilin /jansen et al., Arcii. Biochem. 4- 297 (1944)7- Os dois factores atras indicados distinguem-se no seu espectro de acção. na medida em que o factor de Rhizoctonia praticamente não exerce qualquer acção sobre Aspergillus niger, Aspergillus oryzae. ou Fusarium Lycopersici. constrastando assim, com o factor de Aspergi 11 u >
Ao que parece, não se conseguiu ainda preparar, no estado puro, os compostos activos dos re feridos factores. nem esclarecer a sua resposta estrutura química. As rizocticinas puras do presente invento exercem uma acçao fungicida sobre Rhizoctonia solani que, em relaçao ao factor Rhizoctonia não-puro, é mais poderosa por 2 potências de 10.
Ebata et.al.. J. Antibiot. 22, 467-472 (1969) conseguiram isolar a partir de Baci1lus subti1 is PCI 219. que e idêntico a ATCC 6633, três metabolitos de acção anti-fúngica , do grupo da Baci1lomycis , que designaram por sub-esporinas. Nas suas propriedades essenciais, biológicas e fisicas. estes antibióticos correspondem ao factor Aspergi 1lus de modo que não pode haver duvidas quanto ã sua identidade.
No entanto Ebata el al., não deram pela existência do factor de Rhizoctonia de Bacilysin anterior à descoberta daquele factor. e que é, tal como o factor de Rhizoctonia. um agente antibiótico hidrofilo, de baixo peso molecular.
A bacilisina o di-peptido N-alanin-3-(2.3-epoxi-ciclohexanon-4-i1)-alanina (Walker et al. Biochem. J. 118 563-565. 1970). foi descrita pela primeira vez em 1946 (Forster et al. J. Bacteriol. 51 , 363-369), sem indicações quanto à sua estrutura química, sob o nome de Bacilina. em 1949 sob a designação de Bacilisina (Newton, Brit. J. Exptl. Pathol. 30. 306-319 (1949 ) e mais uma vez em 1973. sob o nome de Tetaina /Chmara et al. Biophys. Res. Commun. 52. 1382-1387 (1973)_7
Em dois casos, os agentes progenitores eram estirpes do genero Bacillus subtilis e uma vez Bacillus pumilus- De acordo com observações mais recentes Loeffler et al- J. Phytopathol. 115. 204-213 (1986), a bacilisina foi também produzida, em vários meios de cultura por Bacillus subtilis F-29-3. o agente progenitor de Fengmicina /“Vanittanakom et al . J. Antibiot. 2?.’ 888-901 (1986)7. bem como por todas as restantes estirpes selvagens examinadas da especie de B. subtilis e por respectivamente uma linhagem dos generos Baci1lus pumilus e Baci1lus 1 icheniformis. Esta substancia activa inibe o desenvolvimento de algumas bactérias, os blastomicetes Saccharomyces cerevisiae e Candida albicans. mas. contrariamente ao factor de Rhizoctonia. não mostra praticamente nenhuma acção sobre hifomicetes.
Existe uma certa semelhança entre Rizocticina B e as Plumbemicinas A e B /Boo Kil. Park et al Agr.Biol. Chem. 41_. 573-579 (1979)7, que no entanto, foram isoladas a partir de estreptomices (sem parentesco mai intimo com o bacilo productor das rizocticinas). A semelhança so existe no radical L-APPA do tri-peptido rizocticina B. ao passo que sao diferentes os amino-ácidos adjacentes ao L-APPA. Segundo as indicações de Park et al, as plumbemicinas A e B apresentariam as formulas L-Ala-L-Asp-D-APPA (A) e L-Ala-L-Asn-D-APPA (B); há razões para supor que seja errada a atribuiçào de D ao APPA. A diferença mais saliente consiste nos espectros de acção muito divergentes das rizoct icinas. por um lado., e da plumbemicinas, por outro lado. As plumbemicinas sõ actuam sobre bactérias enquanto as rizocticinas exercem a sua acção sobre fungos.
presente invento fundamenta-se no isolamento, síntese em estado puro, e esclarecimento estrutural das rizocticinas A. B e C e D. a partir de meios de culturas de bactérias- Partindo destas rizocticinas que ocorrem na Naturéxa podem obter-se compostos analogos, de maneira habitual, que possuem propriedades similares ou melhoradas.
presente invento refere-se‘ a rizocticinas de formula
O OH II Z -ch2-p - XOH
COOH
I
X-Y-NH-CH-C=C
I I Η H (I)/ em que
X representa hidrogénio ou um radical amino-ácido hidrófobo e Y representa um radical amino-básico. sendo que os átomos de C-2 nos radicais amino-ácidos apresentam a configuração L· e se refere aos seus sais e derivados protegidos .
As abreviaturas utilizadas corres pondem as regras de nomenclatura internacionalmente reconhecidas Na notaçao abreviada dos péptidos. o grupo amino encontra-se ao lado esquerdo e o grupo carboxi encontra-se do lado direito.
Radicais amino-ácidos hidrófobos
X sao derivados daqueles aminoácidos que apresentam um radical hidrofobo no átomo de C-2 e. em especial, são L-Val. L-Ile. L-Leu ou L-Ala. De preferencia. X representa hidrogénio ou L-Val.
Radicais amino-ácidos básicos Y sao derivados daqueles aminoacidos que apreesntam um radical básico no C-2. e. em especial, são L-Arg, L-Lis, L-Orn ou os seus homologos. por ex.. L-homo-Arg. De preferência Y representa L-Arg.
amino-ácido do lado direito da formula I tem a designação quimica de acido L-2-amino-5-fosfono-3-cis-pentenoico e. abreviadamente, representa por L-APPA.
Rizocticinas preferidas de formula I sao aquelas, em que X representa hidrogénio e Y representa L-Arg (rizocticina A: L-Arg-L-APPA) ou X representa L-Val e Y representa L-Arg (rizocticina B: L-Val-L-Arg-L-APPA). bem como os seus sais.
Outras rizocticinas preferidas de formula I são aquelas, em que X representa L-Ile e Y representa L-Arg (rizocticina C: L-Ile-L-Arg-L-APPA) ou X representa L-Leu e Y representa L-Arg (rizocticina D: L-Leu-L-Arg-L-APPA) e os seus sais.
Um outro grupo preferido de rizocticinas de formula I são L-Val-L-Lis-L-APPA,
L-Ala-L-Arg-L-APPA. L-HomoArg-L-APPA, L-Val-L-HomoArg-L-APPA. L-ILe-L-HomoArg-L-APPA. L-Leu-L-HomoArg-L-APPA, L-Ile-L-Lis-L-APPA. L-Leu-L-Lis-L-APPA. L-Ala-L-Lis-L-APPA L-Va 1-L-Orn-L-APPA. L-1 le-L-Orn-L-APPA. L-Leu-L-Orn-L-APPA e L-Ala-L-Orn-L-APPA. e os seus sais.
Derivados protegidos das rizocticinas de formula I são aqueles, em que cada um ou vários grupos funcionais estão presentes sob a forma protegida. Grupos protectores deste genero conhecem-se na Quimica dos Péptidos. e. tal como mais adiante irã ser especificado, eles podem ser utilizados na síntese quimica de péptidos para a protecçao dos grupos funcionais contra reacções indesejadas. Um genero especial destes grupos são grupos protectores que se podem separar em condições fisiológicas, que se podem introduzir também a seguir â síntese quimica e que podem ser eliminados em condições fisiológicas, isto e . in vi voSais são em primeiro lugar os sais internos das rizocticinas de formula I. mas também os sais de adiçao de ácidos ou sais com bases. Para uso farmaceuticamente consideram-se sobretudo sais, fisiologicamente aceitáveis, que no entanto, podem também ser empregados no âmbito da protecçao fitossanitaria ou sob a forma de herbicidas. Sais deste genero sáo sais de adição de ácidos com ácidos inorgânicos, em especial ácidos minerais, por ex.. acido cloriddco. ácido sulfurico ou acido fosfórico, ou sais com ácidos carboxi 1 icos . sulfonicos ou sulfo-ácidos, orgânicos, por ex-. acido acético, ácido propionico, ácido glicólico. ácido succínico. acido maleico, ácido hidroximalei co. ácido metilmaleico. acido fumárico. ácido málico, ácido tartarico. ácido cítrico, ácido benzoico, ácido cinâmico. ácido mandelico. ácido salicilico. ácido 4-aminossalici1ico acido 2-fenoxi-benzoico. ácido 2-acetoxibenzoico, ácido embónico. acido nicotinico ou acido isonicotínico, e também amino-ácidos bem como acido metanossulfonico. ácido etanossulfonico. ácido 2-hidroxi-etanossulfonico. ácido etano-1,2-dissulfonico. ácido benzenossulfonico. ácido 4-meti1-benzenossulfonico ou ácido naftaleno-2-sulfonico. ou com outros compostos orgânicos acidicos. tal como ácido ascórbico.
9As rizocticinas com grupo fosfono e/ou grupos carboxilo livres podem formar sais de metais ou sais de amonio. tais como sais de metais alcalinos e alcalino-terrosos. por ex.. sais de sodio. potássio, magnésio, potássio ou cálcio, bem como sais de amonio com amónia ou aminas organicas apropriadas, utilizando-se sobretudo mono- di- ou poli-aminas primarias, secundarias ou terciárias. alifaticas ciclo-alifaticas . ciclo-alifatico-alifaticas ou araiifaticos . bem como bases heterociclicas , para a formação dos respectivos sais, tais como alquilo inferior-aminas. por ex.. trietilamina . hidroxi-alquilo inferior-aminas. porex.. 2-hidroxietilamina. bis-(2-hidroxieti1)-amina,
2-hidroxi-eti1-dieti1-amina ou tris-(2-hidroxi-etil-)-amina. esteres alifáticos. básicos, de ácidos carboxi1icos, por ex.. ester 2-dietilaminoeti1ico de acido 4-aminobenzóico.alcileno inferior-aminas. por ex.. 1-etilpiperidina, cicloalquilaminas. por ex.. diciclohexilamina. ou benzilaminas por ex. . N.N'-dibenziletilenodiamina. e ainda bases do I tipo da piridina. por ex.. a própria piridina, colidina ouA quinolina.
Para fins de isolamento ou de purificação podem também usar-se sais, farmaceuticamente ou H tologicamente inaceitáveis.
presente invento refere-se também a um processo para a preparação das rizocticinas de formu la I. dos seus derivados e sais, caracterizado por,
a) se cultivar, num meio nuttriente. uma estirpe bateriana capaz de produzir rizocticinas. sendo que o referido meio de cultura conêm. eventualmente um amino-ácido X ou Y ou um dipeptido X-Y e. se isolar a partir do meio de cultura (caldo) a desejada rizocticina ou mistura de rizocticinas, ou
b) se combinar, numa sequencia qualquer, através de uma ligaçao peptidica. os amino-acidos, X. Y e ácido L-2-amino-5-fosfono-3-c22-pentenoico. ou os seus derivados protegidos, ou
c) para a preparação de uma rizocticina de formula I, em que X representa hidrogénio, se separar X de uma rizocticina de formula I. em que X representa um radical amino-acido hidrofobo. e se necessário, se separar o(s) grupo(s) protec tor (es) e se transformar num sal uma rizocticina obtida, de formula I. ou se transformar um sal obtido no composto livre -
Processo a)
Estirpes bacterianas capazes de produzirem rizocticinas sào em especial generos de Baci1lus como, nomeadamente Baci1lus subtil is. por ex..ATCC 6633 ou F-29-3. ou. eventualmente, também estirpes dos generos de Baci1lus atras referidos, tais como B.pumi1 is ou B.
iecheniformis.
Meios nutrientes para a produção de rizocticinas sao meios nutrientes aquosos e contem fortes fontes de carbono e de azoto, sais minerais e aditivos orgânicos específicos ou complexos. Meios nutrientes apropriados contêm, por ex.. um açúcar, tal como glucose ou manitol, glicerol. acido glutamico. farinha de soja, extracto de le11-
veduras. sulfato de amonio. cloreto de sodio, cloreto de potássio, hidrogenofosfato de potássio, carbonato de cálcio, sulfato de magnésio, ferro, cobre e de manganésio, e compostos similares. Com vantagem, em vez da glucose utiliza-se manitol. e adicionalmente, um amino-âcido em especial asparagina- ou também um dos dipéptidos ou amino-ácidos necessários para a síntese das rizocticinas e para a introdução/ incorporação nesses amino-ãcidos ou dipéptidos.
A cultivação da respectiva estirpe bacteriana realiza-se entre 15 e 33°C. de preferencia, a 27°C. em cubas de fermentaçào usuais, de tamanho crescente, sob condiçoes aerobicas. ate se ter formado a quantidade maxima de rizocticinas.
A elaboração do caldo de cultura efectua-se segundo métodos ja conhecidos, por ex. após acidificaçao a um pH de 7. de preferencia, a um pH de 2,5, pela adiçao de acido clorídrico, mediante separação das células bacteriainas por centrifugação ou filtração, concentração do meio de cultura isento de bactérias, por ex., por meio de evaporação, nova calrificação. por ex.. mediante cen trifugaçao. concentração até â secagem, dissolução do resi duo em etanol. por ex.. em etanol a 70%. nova precipitação por arrefecimento, por ex.. a cerca de 4°C, e concentração por evaporação, do material alcoólico que sobrenada. De preferencia, concentra-se o meio de cultura por meio de 1 iofi1izaçâo.
extracto alcoolico obtido contem as rizocticinas na forma concentrada.
A purificação ulterior realiza-se em fase aquosa, acidica. mediante resinas de adsorção, por ex.. Amberlite XAD-16. segundo o processo em ' batch' (num único lote) ou numa coluna e por meio de cromatografia de exclusão (selectiva) e cromatografia de permuta de iões por ex.. em colunas Sephadex CM-15 e Sephadex G-25, podendo servir de fase móvel, água desionizada. álcool etilico aquo so a 5%. e tampão de acetato de amonio. pH 4 a pH 5,5. Através de cromatografia de exclusão repetidas, por ex., em colunas de Sephadex G-20, com EtOH/I^O (15:85) como eluente. obtem-se na forma pura as rizocticinas A e B. Uma etapa de purificação adicional constitui a cromatografia liquida de elevada pressão, por ex,, utilizando RP18 Nucleosi 1.
A partir das fracções previamente purificadas, contendo rizocticina B. podem obter-se as rizocticinas C e D por meio de cromatografia liquida de alta presao. em RP 18 Nucleosil.
Para a obtenção das restantes rizo cticinas abrangidas pela formula I. adicionam-se ao meio njj triente os outros amino-acidos hidrofobos e básicos H-X-OH ou H-Y-OH. correspondentes, ou os outros dipeptidos H-X-Y-OH correspondentes, efectuando-se a sua ulterior elaboração de maneira analoga.
presente invento refere-se também aos extractos e concentrados, obtidos a partir dos meios de cultura, e contendo as rizocticinas na forma concentrada .
Processo b)
A ligação de X. Y e L-APPA para a formaçao do desejado di- ou tri-peptido realiza-se mediante estabelecimento de uma ligação amídica entre dois fragmentos- ou seja, entre o grupo carboxi do fragmento do lado esquerdo e o grupo -alfa-amino do fragmento direito. Caso X significar também uma amíno-ácido. a referida ligação poderá efectuar-se numa sequencia diferente, combinando por formaçao de uma ligaçào amídica. primeiro o fragmento Y com o fragmento L-APPA e combinando o produto da reacção com X. ou combinando primeiro X com Y e ligando o fragmento dipeptidico obtido (X-Y) com L-APPA.
Os processos implicados nestas reacçòes sao os geralmente conhecidos na Quimica dos Peptidos De preferência, a reacção realiza-se por forma a fazer reagir um derivado de acido acrboxilico reactivo de um dos fragmentos com o fragmento complemeii tar. contendo um grupo alfa-amino livre; neste caso, a activaçao do grupo carboxilo do derivado de acido acrboxilico poderá realizar-se também in situ
Derivados de ácidos carboxilicos reactivos sao sobretudo esteres activados. reactivos, ou anj_ dridos reactivos e ainda aminas. cíclicas, reactivas; os derivados de ácidos reactivos podem também formar-se ίή situ.
i ι
Esteres de activos de ácidos são nomeadamente esteres insaturados no átomo de carbono de ligação do radical que se pretende esterificar, por ex., esteres do tipo do éster vinílico, tal como os esteres de vinilo propriamente ditos (que se podem obter, por ex., por trans-esterificação de um éster correspondente com acetato de vinilo; método do ester vinílico activado), esteres carbamoi1-vini1icos (que se podem obter, por ex., mediante o tratamento do acido correspondente com um reagente de isoxazólio método de 1.2-oxazolio ou método de Woodward) ou esteres 1-alcoxi inferior-viní1icos (que se podem obter, por ex.. mediante tratamento do acido correspondente com um alcoxi inferior-acetileno; método de etoxi-acetileno), ou ésteres do tipo de amidino-ésteres, tais como amidino-ésteres N.N-dissubstituidos (que se podem obter, por ex., mediante tratamento do acido correspondente com uma carbodj^ imida. N.N'idissubstituida. apropriada, por ex., Ν,Ν'-diciclohexilcarbodiimida; método de carbodiimida ), ou amidinoésteres N.N-dissubstituidos (que se podem obter, por ex., mediante tratamento do acido correspondente com uma cianamida N.N-dissubstituida ; método de cianamida). ésteres de arilos apropriados, em especial ésteres fenilicos substituídos de maneira conveniente por substituintes que atraem electrões (que se podem obter, por ex.. mediante tratamento do acido correspondente com um fenol substituido de forma apropriada. por ex.. 4-nitrofenol - 4-metilsulfoni1-fenol, 2.4.5-triclorofenol. 2.3.4.5.6-pentaclorofenol ou 4-fenildiazofenol. em presença de um agente de condensação, tal como
N.N’-diciclohexilcarbodiimida; método de esteres de arilos actívados). esteres cianometi1icos (que se podem obter por ex. . mediante tratamento do acido correspondente com cloroacetonitrilo. em presença de uma base; método de ésteres cianometi1icos). tioesteres . em especial fenilo-tio-esteres. eventualmente substituidos. por ex.. por nitro, (que se podem obter, por ex.. mediante tratamento do acido
correspondente com tiofenóis. eventualmente substituídos, por ex.. substituídos por nitro, por ex.. com o auxilio do método de anidridos ou de carbodiimidas; método de tiol-ésteres activados). amino- ou amido-ésteres (que se podem obter, por ex.. mediante tratamento do acido correspondente com um composto de N-hidroxi-amino ou N-hidroxi-amido, por ex.. N-hidroxi-succinimida. N-hidroxi-piperidina, N-hidroxi -ftalimida ou 1-hidroxi-benzotriazole, por ex., segundo o método de anidridos ou de carbodiimidas; método de N-hidroxi-ésteres activados) ou esteres de sililo (que se podem obter, por ex.. mediante tratamento do acido correspondente com um agente de sililação. por ex.. hexameti1-dissilazano , que reagem facilmente com grupos hidroxi. mas não com grupos amino).
Os anidridos de ácidos podem ser os anidridos simétricos ou. de preferencia, os anidridos mistos, dos referidos ácidos; assim, por ex.. podem ser anidridos com ácidos inorgânicos, tais como os haletos de ácidos, em especial, os cloretos de ácidos (que se podem obter, por ex.. mediante tratamento do acido correspon dente com cloreto de tionilo. pentacloreto de fosforo ou cloreto de oxalilo; método de cloretos de ácidos), azidas (que se podem obter, por ex.. a partir de um ester acidico correspondente através da hidrazina correspondente e tratamento desta com acido nitroso; método de azidas), anidridos com semi-derivados do acido carbónico, atl como com esteres correspondentes, por ex.. semi-ésteres de alquilo inferj_ or do acido carbónico (que se podem obter, por ex., mediante tratamento do acido correspondente com ésteres de alquilo inferior do acido halogeno-. em especial cloro-formíco ou com uma 1-alcoxi inferior-carbonilo-2-alcoxi inferior-1,2-dihidro-quinolina. por ex.. 1-alcoxi inferior-carboni1-2-etoxi-1 .2-diidroquinolina ; método de anidridos mistos do acido
O-alquilo-carbonico). ou anidridos com acido fosforico diha_ logenado. em especial diclorado (que se podem obter, porex., mediante tratamento do acido correspondente com oxicloreto de fosforo); método de oxicloreto de fosforo) ou anidridos com ácidos orgânicos, tais como anidridos mistos com ácidos carboxílicos orgânicos (que se podem obter, por ex., medj. ante tratamento do acido correspondente com um haleto de acido carboxílico de alcano inferior ou de fenilo-alcano, eventualmente substituido por ex.. cloreto de acido fenilacetico. cloreto de acido pivalico ou cloreto de acido trifluoroacetico; método de anidridos mistos de ácidos carboxilicos) ou com ácidos sulfonicos orgânicos (que se podem obter, por ex.. mediante tratamento de um sal. tal como um sal de um metal alcalino, do acido correspondente, com um haleto de acido sulfonico orgânico apropriado, tal como, um cloreto de acido alcano inferior- ou de acido arilo-sulfo nico por ex.. cloreto de acido metano- ou p-tolueno-sulfonico; método de anidridos mistos de ácidos sulfonicos). bem como anidridos simétricos (que se podem obter, por ex.. mediante condensação do acido correspondente, na preesnça de uma carbodiimida ou de 1-dietilaminopropino; método de anidridos simétricos).
Amidas cíclicas apropriadas são sobretudo amidas com compostos diaza-ciclicos pentagonais de caracter aromatico. tais como amidas com imidazoles, por ex.. imidazole (que se podem obter, por ex., mediante tratamento do acido correspondente com N.N:-carbonildiimi dazole; método de imidazolida). ou pirazoles. por ex., 3.5-dimeti1-pirazole (que se podem obter, por ex.. através da hidrazida de acido mediante tratamento com acetilacetona; método de pirazolida).
Tal como já se mencionou, os derivados de ácidos carboxilicos podem também formar-se in situ Assim, podem por ex.. podem formar-se in situ, amidino-esteres N.N -dissubstituídos. fazendo reagir a mistura do fragmento complementar com o grupo amino livre e do fragmento do peptido com o grupo carboxilo livre, na presença de uma carbodiimida . N .N-dissubstituida apropriada, por ex. N.N'-diciclohexi1carbodi imida .
Alem disso, podem formar-se aminoou amido-eesteres do acido na presença da amina que se pretende acilar. fazendo reagir a mistura dos correspondentes reagentes de partida de amino e de acido na presença de uma carbodiimida. N.N -dissubstituida. por ex.. N.N1-diciclohexi1-carbodiimida . e de uma N-hidroxi-amina ou N-hidroxi-amina. por ex.. N-hidroxi-succinimida. evetualmente na presença de uma base apropriada, por ex.. 4-mdimetilamino-piridina.
Segundo um processo alternativo a variante a) do processo poderá realizar-se pela reacção de um fragmento com um grupo carboxilo livre, com o fragmeii to complementar, onde o amino-acido se encontra na forma reactiva. 0 grupo amino pode ser activado. por ex., mediante reacção com um fosfito. por ex.. dieti1clorofosfito; 1 .1.-feni1ieno-clorofosfito. etildiclorofosfito , etilenocloro-fosfito ou tetraetilpirofosfito .
grupo amino. pode também ser activado através da sua ligação a halogenocarbonilo, por ex.. clorocarbonilo. ou sob a forma de um grupo isocianato.
Grupos funcionais livres nos frag mentos que. contanto que não façam parte na reacção, estão presentes, com vantagem, na forma protegida, são grupos carboxi e amino. bem como os grupos hidróxi do acido L-APPA que como grupos hidróxi de ácidos . podem estar protegidos -analogamente â protécção dos grupos carboxi.
Os grupos protectores, a sua introdução e remoçào. vêm descritos por ex., nas seguintes publicações Protective Grou.ps in Organic Chemistry, Plenum Press. London. New York. 1973 e in Methoden der Organischen Chemie. Houben-Weyl. 4th Edition, Vol. 15/1 Georg Thieme Verlag. Stuttgart. 1974. e também em Theodora W. Greene . Protective Groups in Organic Synthesis, John Wiley & Sons. New York. 1981. E uma caracteristica de gri£ pos protectores que podem ser separados facilmente, isto é, sem que a se dêem reacções secundarias indesejadas, por ex.. por meio de solvolise. redução, fotólise, ou também sob condições fisiológicas.
Geralmente, os grupos carboxi estão protegidos sob a forma de esteres, que podem ser facilmente separados, em condiçoes reaccionais suaves.
Grupos carboxili. protegidos desta forma, contêm como grupos de esterificação sobretudo grupos alquilo inferior, ramificados na posição 1, ou substituídos de maneira apropriada na posição 1 ou 2. Grupos carboxilo preferidos, presentes sob a forma de esteres, são, entre outros, terc.-alcóxi inferior-carbonilo. por ex., terc.-butiloxicarbonilo. arilmetoxicarbonilo com um ou dois radicais de arilo. que representam radicais fenilo, eventual mente mono- ou poli-substituídos. por ex., por alquilo inferior. tal como terc.-a 1quilo inferior., por ex., terc.-19-
-butilo alcoxi inferior, tal como métoxi, hidroxi, halogenio- por ex.. cloro e/ou nitro, tal como, benziloxicarbonilo eventualmente substituído, por ex.. tal como se indica acima por ex.. 4-metoxibenziloxicarbonilo. ou 4-nitrobenziloxicarbonilo. ou difenilmetoxicarbonilo. eventualmente substituído por ex.. da maneira atras referida, por ex., difenilmetoxicarbonilo ou di-(4-metoxifeni1)-metoxicarbonilo, 1-alcoxi inferior-alcoxi inferior-carbonilo. tal como metoximetoxicai? bonilo. 1-metoxietoxicarbonilo ou 1-etoximetoxicarbonilo,
1-alquiltio inferior-alcoxi inferior-carbonilo. tal como 1-metiltiometoxicarbonilo ou 1-etiltioetoxicarbonilo, aroílmetoxicarbonilo. em que o grupo aroílo representa benzoílo, eventualmente substituído, por ex.. por halogeneo, tal como bromo, por ex..fenaciloxicarbonilo. 2-halo-alcoxi inferior-carbonilo. por ex.. 2.2.2-tricloroetoxicarbonilo , 2-bromo-etoxicarbonilo ou 2-iodetoxicarbonilo. ou 2-(sililo trissubstituído)-etoxicarbonilo - em que os substituintes , independentemente um do outro, representam um radical hidrocarboneto alifatico. aralifatico. cicloalifatico ou aromático, eventualmente substituído, por ex.. substituído por alquilo inferior, alcoxi inferior, arilo. halogenio e/ou nitro, tal como alquilo inferior, feni lo-alquilo inferior, cicloalquilo ou fenilo. eventualmente substituídos, por ex., 2-trialquilo inferior-sililetoxicarbonilo, 2-trimetilsi1ile toxicarboni lo ou 2-(di-£-butilmetilsi1i1)-etoxicarbonilo, ou 2-triarilsililetoxicarbonilo. tal como 2-trifeni lsi liletoxicarbonilo.
Os radicais orgânicos de sililo ou estanilo. mencionados atras e que irão ser referidos mais adiante, contêm preferentemente alquilo inferior, em especial metilo. como substituintes dos átomos de estanho ou de silício. Grupos sililo ou estanilo correspondentes sao em primeiro lugar trialquilo inferior-si 1ilo, em especial trimetilsi1ilo. e ainda dimetil-terc.-butilsililo,
ou estanilo substituído de maneira correspondente, por ex., tri-n-buti1-estanilo.
Grupos carboxi protegidos, preferidos sao por ex.. terc.-alcoxi inferior-carbonilo, tal como terc.-butoxicarbonilo. e. emprimeiro lugar, benziloxicarbonilo. eventualmente substituído, por ex.. da maneira atras referida, tal como 4-nitrobenziloxicarbonilo , ou difenilmetoxicarbonilo. e sobretudo 2-(trimetilsi1i1)-etoxicarbonilo.
Um grupo amino protegido pode estar presente, por ex.. sob a froma de um grupo, facilmente separavel. por ex.. um grupo acilamino, arilmetilamino, mercaptoamino eterificado. 2-acilo-alc-1-enilo inferior-amino, sililamíno ou estanilamino. ou sob a forma de um grupo azido
Num grupo acilamino correspondente acilo representa- por ex.. o radical acilo de um acido carboxilico orgânico, por ex.. com um numero máximo de 18 átomos de carbono, em especial o radical acilo de um acido alcanocarboxilico. eventualmente substituído, porex.. por halogenio. ou por arilo. ou de um acido benzoico. eventualmente substituído, por ex.. por halogénio. alcoxi inferior ou nitro ou de um semi-ester do acido acrbonico.
Grupos acilo deste genero são, por ex.. alcanoilo inferior, tal como formilo. acetilo ou propio nilo. halo-alcanoilo inferior, tal como 2-haloacetilo, em especial. 2-cloro-. 2-bromo-. 2-iodo-. 2.2,2-trifluoroou 2.2.2-tricloroacetilo . benzoilo. eventualmente substituí do. por ex.. por halogénio. alcoxi inferior ou nitro, por ex,
-21benzoílo. 4-cloro-benzoilo. 4-metoxibenzoilo. ou 4-nitrobenzoilo. ou alcoxi inferior-carbonilo, ramificado na posição 1 do radical alquilo inferior, ou substituido da forma apropriada na posição 1 ou 2. em especial terc.-alcoxi inferior-carbonilo. por ex.. terc.-butiloxicarbonilo , arilmetoxicarbonilo com 1 ou 2 radicais arilo. que de preferencia, representam fenilo eventualmente mono- ou poli-substituido, por ex.. por alquilo inferior, em especial terc.-alquilo inferior tal como terc.-butilo. alcoxi inferior, tal como metoxi, hidroxi. halogénio. por ex.. cloro e/ou nitro, tal como benzi loxicarboni lo . eventualmente substituido. por ex., 4-nitro -benziloxicarbonilo . ou difeníImetoxicarbonílo substituído, por ex.. benzidriloxicarbonilo ou di-(4-metoxifenil)-metoxj_ carbonilo. ou 9-fluorofeniImetoxicarbonílo, aroilmetoxicarbo nilo. em que o grupo aroilo representa preferentemente benzoilo. eventualmente substituido. por ex.. por halogénio, tal como bromo- por ex.. fenaciloxicarbonilo . 2-halo-alcoxi inferior-carbonilo. por ex.. 2.2.2-tricloroetoxicarbonilo,
2-bromoetoxícarbonilo. ou 2-iodetoxicarbonilo . ou 2-(sililo trissubstituido)-etoxicarbonilo . que os substituintes, independentemente um do outro, representam um ardical hidrocarbo neto alifatico. aralifatico. cicloalifatico ou aromatico, contendo um numero máximo de 15 átomos de carbono, e eventua_I_ mente substituido. por ex.. por alquilo inferior, alcoxi inferior. arilo. ahlogenio ou nitro, tal como alquilo inferior. fenilo-alquilo inferior, cicloalquilo ou fenilo, eventualmente substituídos, por ex.. 2-trialquilo inferior-si1iletoxicarbonilo. tal como 2-trimetilsililetoxicarbonilo ou 2-(di-n-butilmetilsi1i1)-etoxicarbonilo, ou 2-triarilsili letoxicarbonilo. tal como 2-trifenilsi1iletoxicarbonilo.
Outros radicais acilo. que se podem empregar como grupos protectores de amino, são também correspondentes radicais de ácidos fosforicos, fosfónicos ou
ou fosfinicos. tal como dialquilo inferior-fosforilo, por ex . dimetiIfosforilo. dietilfosforilo . di-n-propilfosforilo ou diisopropilfosforilo. dicicloalquiIfosforilo. por ex., diciclohexilfosforilo. difeniIfosforilo. eventualmente substituído, por ex.. d ifeni Ifosfori lo . d i - (f en i 1 a 1 qu i 1 o in_ ferior)-fosf ori lo . eventualmente substituído, por ex., subst_i tuido por nitro, por ex.. dibenziIfosforilo ou di-(4-nitrobenzil )-fosforilo. feniloxi-fenilfosfonilo. eventualmente substituído, por ex.. feniloxifenilfosfonilo . dialquilo inferior-fosfinilo . por ex.. dietilfosfinilo . ou difenilfosfi nilo. eventualmente substituído, por ex._. difeni lfosf ini lo .
Num grupo arilmetilamino, que representa um grupo mono- di- ou em especial, tri-arilmeti1 amino. os radicais arilo são sobretudo radicais fenilo eventualmente substituídos.
Grupos deste genero são, por ex., benzilamino. difenilamino e emespecial. tritilamino.
Num radical 2-acilo-alc-1-en-1 ilo inferior, utilizável como grupo amino-protector, acilo representa, por ex.. o correspondente radical de um acido carboxilico de alcano inferior, o correspondente radical de um acido benzoico. eventualmente substituído, por ex., por alquilo inferior, tal como metilo ou terc.-butilo, alcoxi inferior, tal como metoxi. halogenio. tal como cloro e/ou nitro, ou. em especial, o correspondente radical de um semi-ester de alquilo inferior do acido carbónico.
Grupos protectores correspondentes sao em primeiro lugar 1-alcanoilo inferior-prop-1-en-2-ilo,
-23Μ
por ex.. 1-aceti1-prop-1-en-2-ilo. ou 1-alcoxi inferior-car bonil-prop-1-en-2-ilo. porex.. 1-etoxicarboni1-prop-1-en-2- ilo.
Um grupo amino poderá estar protegido sob a forma protonada; aniões correspondentes são sobre tudo os anioes inorgânicos fortes tais como os aniões de ácidos halidricos. por exemplo o anião cloreto ou brometo ou os ácidos sulfonicos orgânicos tal como do ácido p_-tolue nossulfonico.
Grupos amino-protectores preferidos sao radicais acilo de semi-ésteres do acido carbonico, em especial, terc.-butiloxicarbonilo, benziloxicarbonilo (BOC). eventualmente substituído, por ex., de maneira indicada. por ex.. 4-nitro-benziloxicarbonilo, ou difeni.lmetoxicarbonilo. ou 9-fluorenilmetoxicarbonilo (Fmoc), ou 2halo-alcoxi inferior-carbonilo . tal como 2 ,2 ,2-tricloroetoxj_ carbonilo. e ainda tritilo ou formilo.
Como grupo protector, tal como, nomeadamente um grupo protector de carboxilo, entende-se, no âmbito da presente memória descritiva, também um material de suporte polímero, que está ligado, de maneira facilmente separavel. ao grupo funcional a proteger, tal como, em especial. ao grupo carboxilo; um material de suporte deste genero está indicado, por ex.. para a sintese segundo Merrifield. Um material de suporte polímero deste género, apropriado é. por ex.. uma resina de poli-estireno, ligeiramente reticulada, por meio de copo 1imerização, com benzeno de divinilo. e que. para a ligação reversível dos radicais peptídeos- contem elementos de ponte’ apropriados.
A reacção poderá realizar-se de maneira usual; as condições da reacção dependem em primeiro lugar da maneira da activação do grupo carboxilo que participar na reacção (se houver lugar a activaçao) e, geraj_ mente decorre na preesnça de um solvente ou diluente apropriado. ou de uma mistura destes solventes ou diluentes, e. caso seja necessário, na presença de um agente de condeii saçao que. no caso do grupo carboxilo reagente estar preseii te sob a forma de anidrido. também poderá ser um agente neutra 1izador de ácidos, e sob arrefecimento ou aquecimento, por ex.. numa gama de temperaturas entre cerca de -30°C e cerca de + 150°C. num reactor fechado, e/ou numa atmosfera de um gás inerte, por ex.. azoto.
Agentes de condensação usuais sao. por ex.. carbodiimidas. por ex.. N,N’-dieti1 -, N,N'dipropil-. N.N1-diciclohexi1 - ou N-etil-N'-(3-dimetilaminOpropi1)-carbodiimida. compostos de carbonilo apropriados, por ex.. carboniI-diimidazole. ou compostos de 1,2-oxazólio por ex.. 3-sulfato de 2-eti1-5-feni1-1,2-oxazólico e percl£ rato de 2-terc.-buti1-5-meti1-isoxazólio, ou um composto de acilamino conveniente, por ex.. 2-etoxi-1-etoxicarboni1 -1 2-diidroquinolina.
Agentes de condensação neutralizadores de ácidos usuais, sao. por ex.. carbonatos de metais alcalinos ou hidrogenocarbonatos de metais alcalinos, por ex.. carbonato de sodio ou de potássio; ou hidrogenocarbo nato de sodio ou de potássio (geralmente conjuntamente com um sulfato), ou bases organicas tal como trialquilo inferior -aminas. geralmente impedidas estéricamente, por ex., N,Ndiisopropil-N-eti lamina.
Processo c)
Para a eliminação do radical amino -acido hidrofobo X a partir de uma rizocticina de formula X-Y-L-APPA podem empregar-se métodos usuais de separação amídica. A separação pode realizar-se num meio'acido, por ex.. com acido clorídrico, evitando-se uma eventual hidrólise excessiva do produto reaccional de formula Y-L-APPA através do ajustamento correcto do valor pH. da temperatura e do tempo reaccional.
De preferencia, a separação de X realiza-se mediante clivagem enzimatica, com uma protease, por ex.. termolisina ou. em especial, pronase, por ex., obtida de Streptomyces griseus.
A eliminação dos grupos protectores realiza-se de maneira geralmente conhecida, por ex., mediante solvolise. em especial, por meio de hidrólise, alcoolise ou acidolise. ou com o auxilio de processos redutores em especial hidrogenólise ou redução química, eventualmente em varias etapas ou simultaneamente podendo utilizar-se também métodos enzimaticos.
Assim, terc.-alcoxi inferior-carbo nilo ou alcoxi inferior-carbonilo. . eventualmente substituído na posição 2 por um grupo sililo orgânico ou substituí_ do na posição 1 por alcoxi inferior ou alquiltio inferior, ou difenílmetoxicarbonilo. eventualmente substituído, pode ser convertido em carboxilo livre, por ex.. mediante tratamento com um acido apropriado, tal como acido formico ou acido trifluoroacetico. eventualmente com adição de um composto nucleofilo. tal como fenol ou anisole. A libertação de benziloxicarbonilo. eventualmente substituído, pode efectuar-se. por ex.. mediante hidrogenolise, isto é, mediante tratamento com hidrogénio na presença de um catalisador de hidrogenação metálico, tal como paládio catalisante.
Alem disso, benziloxicarbonilo, substituído de maneira apropriada . tal como 4-nitrobenziloxicarbonilo. pode ser convertido em carboxilo livre também mediante redução química, por ex.. mediante tratamento com um diol-tionito de um metal alcalino, por ex., ditionito de sodio. ou com um metal redutor, por éx., zinco, ou com um sal de um metal, tal como um sal de cromo-(II), por ex., cloreto de cromo-(II). geralmente na presença de um composto capaz de ceder hidrogeniões. que. juntamente com o metal, possa gerar hidrogénio nascente, tal como um acido, em prime/ ro lugar, um acido carboxílico apropriado, tal como um acido carboxílico de alcano inferior, eventualmente substituído por ex.. por hidroxi. por ex.. acido acético, acido formico, acido glicolico. acido difenilglicólico, acido láctico, ácido mandelico. acido 4-cloro-mandelico. ou acido tartárico, ou na presença de um álcool ou tiól. de preferencia, com adiçao de água. Mediante tratamento com um metal ou sal de um metal redutor de maneira atras referida. 2-halo-alcoxi inferior-carbonilo(eventualmente. após transformação de um grupo 2-bromo-alcoxi inferior-carbonilo num correspondente grupo 2-iodo-alcoxi inferior-carbonilo) ou aroílmetoxicarbonilo pode ser transformado também em carboxilo livre, podendo separar-se aroilmetoxicarbonilo também mediante tratamento com um reagnete nucleófilo de preferencia, capaz de formar sais, tal como tiofenolato de sodio ou iodeto de sodio.
2-Si1iletoxicarbonilo substituído pode ser transformado também em carboxilo livre mediante tratamento com um sal do acido fluoridrico, que forneça o aniao fluoreto. tal como um fluoreto de um metal alcalino, por ex.. fluoreto de sodio ou de potássio, na presença de um poli-éter macrociclico ( crown ether!) ou com um fluoreto de uma base quaternaria. organica. tal como fluoreto de tetra-alquilo inferior-amonio ou fluoreto de trialquilo inferior-arilo-amonio. por ex.. fluoreto de tetraetilamonio ou fluoreto de tetrabutilamonio. em presença de um solvente polar, aproptico. tal como sulfoxido de dimetilo ou N,N-dimetilacetamida.
A libertação de um grupo amino pro tegido realiza-se de maneira conhecida, e. de acordo com o genero dos grupos protectores. de varias maneiras, de preferencia. por meio de solvolise ou redução.
A libertação de 2-halo-alcoxi inferior-carbonilamino (eventualmente após transformação de um grupo 2-bromo- alcoxi inferior-carbonilamino (eventualmen_ te. após transformaçao de um grupo 2-bromo-alcoxi inferior-carbonilamino num grupo 2-iodo-alcoxi inferior-carboni1 amino). aroilmetoxicarbonilamino ou 4-nitrobenziloxicarboni1 amino pode realizar-se. por ex.. mediante tratamento com um redutor químico apropriado, tal como zinco,.na presença de um acido carboxilico apropriado, tal como acido acético aquoso.
A separaçao'de aroilmetoxicarboniI amino pode também fazer-se mediante tratamento com um reagente nucleofilo. de preferencia capaz de formar sais, tal como tiofenolato de sodio e 4-nitro-benziloxicarbonilamino pode também ser clivado mediante tratamento com um ditionito
-28de um emtal alcalino, por ex,. ditionito de sodio.
A libertação de difenilmetoxicarbonilamino. eventualmente substituído terc.-alcoxi inferior-carbonilamino ou si 1iletoxicarbonilamino 2-trissubstituído pode realizar-se por meio de tratamento com um acido apropriado. por ex.. acido formico ou acido trifluoroacetico, e a libertação de benziloxicarbonilamino. eventualmente substituído, realiza-se. por ex.. mediante hidrogenolise, is_ to e. mediante tratamento com hidrogénio, na presença de um catalisador de hidrogenação apropriado, tal como um cata_ lísador de paladio. e triarilo-metilamino ou formilamino, eventualmente substituído, pode libertar-se. por ex., mediar^ te tratamento com um acido, tal como um acido mineral; por ex acido clorídrico, ou um acido orgânico, por ex., acido formico. acido acético ouacido trifluoroacético, eventualmente em presença de agua, um ou grupo amino protegido por um grupo sililo orgânico pode libertar-se. por ex.. mediante hidrólise ou alcoolise.
Um grupo amino protegido por 2haloacetilo. por ex. . 2-cloroacetilo. pode ser libertado mediante tratamento com tio-ureia, em presença de uma base, ou com um sal tiolato. tal como um tiolato de metal alcalino. da tio-ureia, e solvolise subsequente, tal como alcoólj_ se ou hidrólise, do produto de condensação formado. Um grupo 9-fluorenilmetoxicarbonilo pode ser libertado através de uma base, em especial, piperidina ou piperazina.
Um grupo amino protegido por si 1 iletoxicarbonilo 2-substituido pode também ser transformdo no grupo amino livre mediante tratamento com um sal do acido fluoridrico que cede aniões fluoreto. tal como se
refere acima em relação com a libertação de um grupo carboxilo. protegido de forma conveniente.
Amino protegido sob a forma de um grupo azido pode ser transformado em amino livre, por ex.. mediante redução, assim, por ex.. mediante hidrogenação catalítica com hidrogénio na presença de um catalisador de hidrogenaçao tal como oxido de platina, paladio ou niquel de Raney ou também por meio de tratamento com zinco, em presença de um acido, tal como acido acético.
A hidrogenação catalítica realizase. de preferencia, num solvente inerte, tal como um hidrocarboneto halogenado. por ex.. cloreto de metileno, ou também em água ou numa mistura de agua e um solvente orgânico tal como um álcool de/ou dioxano. a cerca de 20°C até 25°C ou também sob arrefecimento ou aquecimento.
Caso se desejar, e quando existirem vários grupos funcionais protegidos, escolher-se-ão aos grupos protectores de modo que seja possível separar simultaneamente mais de um desses grupos protectores, por ex.. mediante acidolise. tal como mediante tratamenti com ácido trifluoroacetico. ou acido formico.
ou mediante redução tal como mediante tratamento com ou com hidrogénio e um catalisador para a hidrogenação. tal como um catalisador de paladio-em-carvão.
A preparação de sais de rizocticj_ nas realiza-se segundo métodos usuais, por ex., mediante a reacçao. com o acido ou a base correspondente, num solvente apropriado, tal como agua ou etanol. e separação, por evapo-30-
ração, do solvente, ou num solvente não-polar, tal como eter ou tetrahidrofurano e/ou pentano e precipitação do sal desejado. Para a preparação dos sais e dos compostos livres que estejam presentes sob a forma de sais internos, podem também aplicar-se resinas permutadoras de iões, de maneira conhecida.
Conforme vai ser demonstrado nos seguintes ensaios.
as rizoctícinas de acordo com o presente invento exercem acçós fungicidas, nematicidas e herbicidas. Para os ensaios da caracterização biologica empregou-se um preparado de rizocticina com uma acção especifica de cerca de 35%.
Acção sobre nemátodes.
No âmbito do ensaio contra Caenorhabditis elegans . as rizoctidnas exercem uma ação letal em concentrações que vao até 10 ug/ml. dentro de 2 dias, em erlaçao a todos os nematodoes de ensaio.
Com concentrações de rizocticinas de 3.5 ug/ml. nota-se uma redução na movimentação dos nemátodes em comparaçao com a verificada nos ensaios-testemunhas .
Acção Herbicida
Numa concen tração de 70 yug/ml obser va-se uma ligeira diminuição do crescimento radicular em Lepidium sativum.
Espectro dos microrganismos inibidos pela acção das rizocticinas
- Perfis de acçao: fungos (Tabela 1);
- Procariotas (Tabela 2)
Os diâmetros das areas de inibição foram determinadas para todas as concentrações referidas- Nas linhas indicam-se (do lado esquerdo para o lado direito) as concentrações eficazes (expressas, em cada caso, em termos de mm de diâmetro da area de inibição), e, na falta de numeros de lado direito, o espeço deixado em branco significa ausência de acçao. com excepção de : Microsporum gypseum (na rubrica Onygenales...) - neste caso, não foi possivel avaliar os resultados do teste do difusão (no entanto, observou-se alguma acção com o emprego de um prócer dimento experimental diferente).
Os valores de MIC, IC5Q e IC1Q para os hifomicetes foram determinados da seguinte forma:
Preparam-se soluções de rizocticinas. em etanol a 35%, em varias concentrações. Soluções de 50 iul adicionaram-se a 5
ml de agar-agar de malte, esterilizado a 45°C e a mistura obtida foi deitada em pratos de Petri esterilizados (55 mm de diâmetro).
As concentrações de rizocticinas eram de 3.5 1.1 0.35 0.1 1·. 0.035 e 0,011 jug/ml.
As placas foram inoculadas na parte central com pedaços cilíndricos de agar-agar (diâmetro de 6 mm) provenientes da zona periférica de colonias de fungos de crescimento. Durante um periodo de 2 a 10 dias procedeu-se â medição do diâmetro das colonias em crescimento. Os dados medidos foram utilizados para a determinação das concentraçêos inibito rias minimas (MIC) bem como das concentrações em que o antibj. otico tenha provocado uma inibição do cresciemnto de 50% (IC 50) ou uma inibição de crescimenti de 10% (IC^q). Placastestemunhas sem antibióticos serviam de termos de comparaçao (crescimento de 100%).
As concentrações inibitórias mínimas para blastomicetes (MIC) foram determinadas por meio de placas de micro-titulação (24 cavidades, diâmetro de 16 mm ; Costar. Cambridge .EUA).
Por cada cavidade, estas placas contêm 940 pl de um meio de malte. 50 yUl de uma cultura previa obtida durante a noite num meio de malte, bem como 10 pl de uma solução de rizocticina. em etanol a 35%. As concentrações finais de rizocticinas variam entre 3,5 e
0.011 yjl/ml . Decorridas 24 horas de incubação, as concentra^ ções. com as quais não se observou particamente qualquer crescimento dos fungos, designaram-se. na serie de diluições realizadas, por MIC (concentrações inibitórias mínimas).
Na tabela, as linhas sem indicações de numeros nas colunas correspondentes, significam de que nao se realizou qualquer ensaio (MIC. IC50, IC^).
Tabela 1
Acção antifungica da rizocticina sobre fungos (meio de malte)
Tipo de area de inibição:
n = crescimento muito fraco
W = crescimento fraco e moderado
W+= crescimento forte * = ensio na colónia gigante
DIÂMETRO DE AREA DE INIBIÇÃO (MM). COM A Area de MIC IC5Q
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Anexo a tabela 1 valor de IC1Q corresponde a uma inibição de crescimento de 10% valor de IC5Q corresponde a uma inibição de cresciemnto de 50%
MIC = Concentração inibitória mínima
Tabela 2
Procariotas insensíveis às rizocticinas (ausência de acção inibitória no âmbito de ensaios com 3.5 (ug de rizocticina; por cada placa circular)
Meio, temperatura (°C)
BACTERIAS GRAM-POSITIVAS
Arthrobacter aurescens NB, 27
Arthrobacter oxydans NB, 27
Bacillus cereus nHA, 37
Bacillus subtilis Ox, MB,
Brevibacterium flavum Ox, 37
Clostridium pasteurianum Clost,
Corynebacterium insidiosum Ox, 27
Micrococcus luteus NB, 27
Staphylococcus aureus Ox, 37
Streptomyces glaucescens nHA, 27
Streptomyces violaceoruber nHA, 27
Streptomyces viridochromogenes nHA, 27
BACTÉRIAS GRAM-NEGATIVAS
Achromobacter geminiani nHA, 37
Escherichia coli Ox, MB, 37
Proteus mirabilis NB, 37
Proteus vulgaris NB, 37
Pseudomonas fluorescens NB, 27
Salmonella typhimurium nHA, 37
..... I........ -41Meios nutrientes do ensaio:
As indicações acerca dos meios nutrientes referem-se a 1 litro de água desionizada.
Meio NB: Caldo nutritivo 8.0 g. pH = 7.0
Meio nHA: extracto de levedura 4.0 g, extracto de malte 10.0 g. glucose 4.0 g . pH =7.3.
Meio Ox: extracto de carne Ox Lab Lemco 10,0 g, peptona de caseina 10.Og . NaCl 5.0 g, pH=7,2.
Meio MB: glucose 8.0 g. NaCl 5.0 g. di-tartrato de amonio 4.0 g MgS04 χ 7H20 1.0 g K2HP04 2,0 g, CaCl2 200 mg. MnS02 χ H20 10 mg, Ferrioxamina B 20,0 mg. pH=7.0.
Meio Cbst: peptona de caseina 20.0 g. glucose 5,0 g, extracto de malte 3.0 g extracto de carne Ox Lab Lemco 3.0 g. extracto de levedura 3,0 g, ácido ascórbico 200.0 mg. pH =7,0
Meio MA: extracto de malte 20.0 g. pH medio =6.0
presente invento refere-se também a utilização das rizocticinas de formula I e dos seus sais, bem como dos extractos ou concentrados contendo rizo£ ticinas. sob a forma de agentes fungicidas, nematicidas ou herbicidas De igual modo, o invento refere-se a preparados farmacêuticos, que contem como substancia activa. uma dose efectiva de uma das rizocticinas do presen te invento ou de um dos seus sais, em conjunto com uma qua£ tidade significativa de um excipiente farmacêutico, e em especial se refere a preparados farmacêuticos destinados a uma administração por via oral, parenteral , tal como intramuscular ou intravenosa, ou a uma aplicação tópica, a animais de sangue quente, e. mais especialmente, a seres humanos.
A posologia do composto activo depende da especie do animal de sangue quente, do seu peso corporal, da idade e do estado de saude individual, bem como da doença a tratar e da via de aplicação. Para um animal de sangue quente com um peso corporal de cerca de 70 kg a dose a aplicar varia, geralmente entre cerca de 50 e cerca de 500 mg. Os preparados farmacêuticos do presente invento sao proprios para uma administração oral ou parenteral. por ex.. por via. i.v.. em especial para a aplicação tópica.
Assim, por ex.. utilizam-se as substancias activas de formula I sob a forma de preparados ou soluçoes de infusão, susceptiveis de serem injectados, por ex.. por via i.v.. soluções deste genero são, de prefe-43-
rência. suspensões ou soluções aquosas, isotonicas, que podem ser preparadas extemporâneamente, antes de serem tomadas. a partir de preparados 1iofi1izados . que contêm a substancia activa pura ou que contêm a substancia activa juntamente com um excipiente. por ex.. manitol.
Preparados farmacêuticos destinados a uma administração oral podem ser esterilizados e po dem conter adjuvantes, por ex.. conservantes, estabi1izantes, humectantes e/ou emulsivos. solubi1izantes, sais para regular a pressão osmótica e/ou tampões. Para a aplicação tópica são especialmente apropriados sprays; loções e pós, e ainda supositorios. por ex.. supositorios vaginais, que se preparam de maneira usual.
Os referidos preparados farmaceu ticos deste invento que. caso se desejar, podem integrar ainda outras substancias farmacologicamente valiosas, por ex.. outras substancias activas. contem cerca de 0,1% a 100%. em especial cerca de 1% a 100% de substancia activa.
Os preparados farmacêuticos podem ser obtidos de maneira habitual, por ex,. mediante processos usuais, descritos nas farmacopeias.
Os preparados farmacêuticos do presente invento podem ser aplicados no âmbito de um processo para o tratamento terapêutico do corpo de seres humanos ou de outros animais, por ex.. para o tratamento de infecçoes causadas por fungos.
V
Outros domínios de aplicação para as rizcticinas de formula I e dos seus sais abrangem o sec tor fitossanitário por ex.. no combate de doenças fúngicas em plantas, por ex.. nas culturas de estufa, no tratamento de arvores infestadas, etc.
Para esta finalidade servem por ex.. os aerossois. Poderão igualmente actuar neste sentido extractos de/e concentrados. em bruto de estirpes bactérianas capazes de produzir rizocticinas.
Por isso, o presente invento refe re-se também a preparados fitossanitarios contendo uma rizocticina de formula I ou um dos seus sais, fitossanitáriamente aceitáveis, ou a extractos ou concentrados contendo rizocticinas. obtidas a partir de estirpes bacterianas capazes de produzirem rizocticinas. em especial a partir de Bacillus subtilis ATCC 6633.
Os referidos preparados fitossanj^ tarios contem uma quantidade efectiva de rizocticinas de ac ção fungicida, sob a forma de pós ou soluções. De prefereg cia. a aplicaçao realiza-se através de soluções aquosas, pulverizáveis.
Além disso, o presente invento refere-se à utilização das rizocticinas sob a forma de preparados herbicidas. Estes preparados herbicidas contem uma rizocticina de formula I ou um dos seus sais, ou extractos ou concentrados contendo rizocticinas obtidas a partir de estirpes bacterianas capazes de produzirem rizocticinas. em especial a partir de Bacillus subtilis ATTC 6633.
Além disso, o presente invento refere-se a um processo para a preparação de acido L-2-amino-5-fosfono-3-£i_s-pentenico (L-APPA). opticamente puro, caracterizado por se submeter a hidrólise uma rizocticina ou uma mistura de rizocticinas obtidas pela fermentação de uma estirpe bacteriana capaz de produzir rizocticinas, e se isolar o L-APPA na forma opticamente pura.
As rizocticinas preparadas de maneira descrita mais adiante, em especial as rizocticinas A. B e C ou D. ou as suas misturas, podem ser desdobradas de maneira usual, por hidrólise nos seus amino-ácidos individuais. A clivagem hidrolítica pode realizar-se em condições acidas por ex.. mediante acido clorídrico 6N. a temperaturas que vao até cerca de 110°C. ou. de preferencia, por via enzimática. por ex.. mediante tratamento com uma protea se. por ex.. termolisina. carboxipeptidase A ou tripsina, a temperaturas entre a temperatura embiente e 45°C e, de preferencia, segundo o tipo da enzima utilizado, entre cerca de 29°C e 41°C.
isolamento do L-APPA realiza-se mediante cromatografia por ex.. mediante agentes permutadores de ioes. tal como Dowex 50 WX8. ou através de um dos métodos de purificação geralmente adoptados na sintese química de péptidos.
presente invento refere-se também ao acido L-2-amino-5-fosfono-3-cj_s-pentenóico opticamente puro, e aos seus sais.
Os sais de L-APPA correspondem aos sais referidos no caso das rizocticinas, com os mesmos ácidos e bases
Exemplos práticos
Nos exemplos práticos empregaram-se os seguintes meios de cultura:
Meio de preparaçao complexo (meio T)
Glucose 15.0 g
G1icerol 10.0 g
Farinha de soja 15.0 g
(nh4)so4 5.0 g
Extracto de levedura 1 .0 g
NaCl 5.0 g
CaCOg 5.0 g
Agua desionizada 1 litro
pH 7.3
Me*0 de Preparaçao definido (meio PL)
Manitol 20.0
Asparagina 1 .0
acido glutâmico 5 .0
ΚΗΡΟη 1 .0
MgS04.7H20
500.0 mg
(cont)
KC1 500.0 mg
FeS03 _7H20 0.15 mg
CuSOg.5H20 0.16 mg
MnS04 5.0 mg
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PH 6.0
microorganismo Bacillus subtí1 is. utilizado nos exemplos particos é conhecido e pode ser adquirido aos meios comerciais, especializados, por ex.. sob a designação de ATCC 6633. da American Type Culture Collection .Λ
A mesma estirpe bacteriana pode também obter-se das seguintes entidades de depósito de culturas (entidade respetiva /designação da bactéria) National Collection of Industrial Bacteria/NCIB 8054, Institute for Fermentation/IFO 13720. National Collection of Type Cultures/NCTC 10400. Institute of Applied Microbiology/IAM 1069. Deutsche Semmlung von Mikroorganismen/DSM 347.
Nos termos do acordo de Budapeste, a estirpe empregada ATCC 6633 foi novamente depositada, em 2 de Fevereiro de 1987. junto da Colecção de Microorganismos Alema. Grisebachstr. 8. D-3400 Goettingen. tendo-lhe sido atribuído o numero de ordem DMS 3973 (codigo de referencia do depositante : BS 6633).
Adoptaram-se as seguintes abreviaturas:
AA - amino-ácido
Boc = terc.-butiloxicarbonilo
DC =· cromatografia em camada fina
DCC - diciclohexi Icarbodi imida
DMF --· dimeti lformamida
Fmoc= 9-fluorenilmetoxicarbonilo
GC -- cromatografia em fase gasosa
HOBt hidroxibenzotriazol
OSu = ester de N-hidroxi-succinimoda
TFA ácido trifluoroacetico
Exemplo 1
Fermentaçao em escala de balão graduado
Balões de Erlenmeyer de 500 ml de capacidade, com inserção (tubo) lateral contendo, em cada caso. 100 ml de meio nutriente (meio PL). são inoculados com 0.4 ml de uma suspensão de esporos de ATCC 6633 e incubados, num aparelho vibratório, rotativo, a 120 r.p.m. e a 27°C. durante cerca de 72 horas.
Exemplo 2
Fermentação em escala com cubas de 20 litros de capacidade
A fermentaçào efectua-se num bio-reactor munido de um módulo de instrumentos para medição e regulação do numero de rotações da hélice, da temperatura pH. ventilação e adição do agente anti-espuma. A circu) laçao do meio nutriente na caldeira asegura-se através de um sistema de agitaçao ”Intensor.
Introduzem-se no reactor 19 litros de solução do meio nutriente (PL) e estiri1iza-se in situ (20 minutos, a 121°C e 1 atmosfera de sobrepressão). Após
o arrefecimento. inocula-se 5% de uma cultura bem provida de esporos, de pelo menos 10 dias de existência (cf.
o exemplo 1). e incuba-se a 27°C. 800 r.p.m. e 5 litros /minuto de passagem de ar.
Para suprimir a formação de espuma. adiciona-se um agente anti-espuma. em função das necessidades.
A recolha realiza-se passadas horas, atingindo o máximo de reprodução, através de centrifugação da massa celular. A figura 1 mostra um processo de fermentação (escala de 20 litros).
Exemplo 3
I
Fermentação em escala de 200 litros
Realiza-se a preparação dos compo_s I tos desejados num bio-reactor dotado de uma unidade de ins_ trumentos para medição e regulaçao do numero de rotações da helice (pas/). temperatura, valor pH. ventilação e adição do agente anti-espuma mediante sonda para espumas.
A ventilação efectua-se em estado de imersão, através de um sistema de agitação'Intensor1.
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A estiri1ização realiza-se in situ. com 200 litros de solu ção de meio nutriente (PL). segundo um programa interno. 0 material de inoculação, ou seja 5 litro de uma cultura previa de pelo menos 10 dias de existência, descrita no exem pio 1. é adicionado, directamente. bombeando- através de uma tubagem flexível. Parâmetros de fermentação 27°C 800 r.p.m. (numero de rotações da helice) e 50 litro/minuto de passagem de ar.
A recolha realiza-se decorridas cerca de 60-80 horas, atingido o valor máximo da concentração dos compostos que se pretendem obter.
Apos a sua recolha, os compostos podem ser isolados a partir do filtrado de cultura mediante os métodos quimico-fisicos usuais, sobretudo por meio de processos cromatograficos e espectroscópicos.
Rendimento em termos de rizocticinas relativamente ao filtrado de cultura:
cerca de 30 mg/litro. isto é. 60g por caldeira de fermentação. A Figura 2 apresenta um processo de fermentação em escala de 200 litros.
Exemplo 4
Elaboraçao a partir do meio PL. em escala de 5 litro, mediante Amberlite XAD-16 (processo descontinuo /'batch '7 e S e p h a d ex CM-25 e G-15
Pela adição de HC1 5N ajusta-se a
2.5 o valor pH de 5 litros de meio nutriente. 0 precipitado formado e separado numa centrífuga Sorvall com um rotor de GSC 3. 1 10.000 G (cerca de 8.000 r.p.m). e o materq al obtido é rejeitado. Em seguida, o material que sobrenada (4.5 litro) é concentrado, por evaporação, até à secagem. a 50°C e dissolvido em 500 ml de etanol. a 70%.
Procede-se a nova precipitação, a 4°C. e separa-se o precipitado do material altamente activado. que sobrenada. 0 sedimento é extraído duas vezes com 200 ml de etanol a 70% de cada vez. e os materiais activos, que sobrenadam, sao reunidos e concentrados, por evaporação .
Em seguida, introduz-se o concentrado acastanhado em 500 ml de agua desionizada. ajusta-se o pH a 3. e agita-se durante 1 hora, num processo descontinuo com 150 g de Amberlite XAD-16. Desta maneira podem fixar-se as impurezas melânicas e Iipófilas â resina adsorvente. enquanto as rizocticinas não são adsorvidas. Separa -se a resina adsorvente. lava-se com 200 ml de agua desionizada e reunem-se as fracções aquosas. Repete-se a operação de purificação com Amberlite XAD-16 e concentra-se, por evaporação, todo o volume aquoso.
-540 material liofilizado é introduzido em 10-15 ml de etanol a 5%. e é purificado mais exaustivamente mediante filtração em gelo, com Sephadex G-15 (etanol a 5%). Reunem-se as fracções activas. liofilizam-se e dissolvem-se em 2 ml de etanol e 5%. Em seguida, procede-se a uma segunda separação por cromatografia com mais uma coluna G-15.
As fracções activas. liofilizadas da etapa anterior, são dissolvidas em 2 ml de tampão de acetato de amonio 5mM (pH = 4) e a solução é aplicada sobre uma coluna de Sephadex CM-25.
Ao passo que a maioria das impurezas. (com o tampão atras referido) não são adsorvidas sobre o permutador de iões, fraco, retêm-se as rizocticinas Aquando da eluição com tampão de acetato de amonio 100 mM (pH = 4). consegue-se separar as rizocticinas A e B (desig nação anterior: Rizocticina I ou III).
A purificação final das rizocticinas realiza-se mediante cromatografia de exclusão (selectiva). numa coluna de Sephadex G-15.
Exemplo 5
Elaboraçao a partir do meio PL. em escala de 25 litro e 200 litro, por meio de uma coluna de Amberlite XAD-16 e Sephadex CH-25 e G-15 Durante a elaboração de caldeiras de fermentação de 25 ou 200 litros de capacidade, ajusta-se o valor pH da massa celular a 2,5 a 3, separa-se a massa celular através de uma centrífuga de decantação. A concentração imediata, por evaporaçao. no evaporador em camada fina ou através de métodos similares não se pode realizar ou so se pode efectuar com grandes dificuldades com um meio PL como base, devido a presença de produtos de fermentação com forte tendência para formar espuma»
Através de cromatografia em coluna (Amberlite XAD-16; 1/10 do volume inicial), adsorvem-se os detergentes indesejados e uma parte dos compostos lipófilos e melânicos.
Os fluidos aquosos de passagem e as aguas de lavagem são concentradas, por evaporação, no evaporador em camada fina, a 60°C. e os resíduos são 1 iofi1izados.
A purificação posterior das rizoc ticinas realiza-se de modo semelhante ao processo adoptado no exemplo 4.
Exemplo 6
Elaboração a partir do meio PL. em escala de 5 litro mediante Bio-Gel P2. Sephadex CM-25 e Sephadex G-10 valor pH de 5 litros de caldo de cultura é ajustado a 2.5 pela adição de HC1 5N. 0 precipitado formado e separado numa a centrífuga de Sorvall, munido de um rotor GSG 3. a 10.000 G (cerca de 8.000 r.p.m) e e rejeitado.
Em seguida, o material que sobrenada é concentrado, pro evaporação, ate â secagem (4,5 litros a 30-40°C) e é dissolvido em 500 ml de etanol a 70%
Efectua-se nova precipitação a 4°C. e o precipitado obtido é seprado do material activo que sobrenada. 0 precipitado é extraído (2 χ) com 200 ml de etanol a 70% de cada vez. reunem-se os materiais activos que sobrenadam e concentram-se. por evaporação.
Procede-se â purificação mais exaustiva do liofilizado activo (27.5 g) mediante filtração através de um gel )(Bio-Gel) P2 200-400 mesh). utilizando-se agua pura como eluente;V: 70 ml/h; camada de gele: 875 mm χ 50 mm; 10 ml/fracçao.
Em cada passagem ou filtração através do Bio-Gel aplicam-se 9.1 g (quantidade total, atras indicada, dividida em 3 partes aliquotas). dissolvidos em
10-15 mlde água desionizada. Reunem-se as fracções activas (fracções 98-124) e 1iofi1izam-se.
Para a sua purificação mais exaustiva todo o liofilizado (1.85 g. em 2 ml de acetato de amonio 100 mM) e aplicado sobre uma coluna de Sephadex CM-25. equilibrada com 100 mM acetato de amonio. em água (pH - 5,5). A eluição realiza-se também com o referido tampao de partida.
V:50 ml/h :camada de gele: 700 mm x 30 mm; 7 ml/fracção. As fracções activas são reunidas e são liofilizadas ( 3χ) para separar, o tampão na medida do possível (rendimento: 230 mg).
Para a separação em rizocticina
A e B e purificação mais exaustiva, simultânea, realiza-se uma cromatografia de exclusão selectiva sobre uma coluna de Sephadex G-10. utilizando-se EtOH/HgO (15:85%) como sistema eluente.
V:16 ml/h; 4 ml/fracção: camada de gele: 950 mmx20 mm. A actividade anti-fungica total elui-se nas fracções 30-46.
Observam-se dois picos da actividade maxima: rizocticina B: na fracção 33;
rizocticina A: na fracção 41.
-58A respectiva distribuição efectu^ -se por meio de analise de cromatografia em camada fina (sistema I. detecção por ninidrina). Reúnem-se, respectivamente. as fracções puras 30-34 (rizocticina B) e 39-46 (rizocticina A)., (rizocticina B: 13 mg; rizocticina A: 21 mg).
Por meio de cromatografia líquida de alta pressão torna-se agora possível verificar a homoge neidade de rizocticina A e B e separar a mistura 35-38 nos componentes puros A e B.
Controlo de pureza para rizocticina A e B
Coluna : RP18. Nucleosil 5μ; 4.6 χ 250 mm. coluna previa
4.6 χ 10mm.
Fase movei: TFA aquoso, a 0.1% (A)/ACN (B) 10 min. em condições isocrâticas 100% de A. em seguida, gradiente linear de 0% de B a 100% de B. em 30 minutos, caudal : 1 ml/min.
-59Separaçao semi-preparativa do concentrado das fracções mistas
Coluna : RP 18 Nucleosil. 5μ; 8 χ 250 mm. coluna previa x 40 mm Fase Movei: TFA aquosa, a 0.1%. caudal:
3ml/min
A determinação da estrutura da ri_ zocticina A e B realiza-se segundo processos usuais, em especial mediante a analise de aminoácidos do hidrolisado total, esclarecimento estrutural do aminoácido L-APPA, 31 13 1 inicialmente desconhecido, mediante RMN- P, Ce H, e determinação da configuração por comparação, cromatografi_ ca (em fase gasosa) com acido DL-5-fosfonovalérico, com a mistura hidrogenada da hidrólise (TFA/derivado de trimetilo). bem como mediante analise sequencial por degradação combinada de Dansyl-Edman (Dansyl-AA. PTH-AA/DC, GC), derivados de DNP e determinação de C-terminal mediante redução com Β2Ηθ a amino-alcoois.
Caracterização de rizocticina A. B e L-APPA L-APPA
riz. A riz. B
Aspecto colourless colourless colourless
powder powder powder
Formu1 a molecular C11H22N5P06 C16H31N6P07 c5HiOnpo5
Massa molecular 351 450 195
Sequencia de amino-acido L-Arg-L-APPA L-Val-L-Arg -L-APPA L-APPA
Solubi1 idade:
rizocticina A. B e APPA são facilmente solúveis na água e em etanol a 35%. sao moderadamente solúveis em etanol, álcoois superiores e são insolúveis em solventes não-polares.
Reacção cromatíca: os compostos mostram uma reacçao positiva de ninidrina e reacção de cio ro/TDM com 4.4 '-tetrametildiaminodifeniImetano.
Caracterizaçào cromatografica (em camada fina) das rizocticinas A e B e do produto de composição por hidrólise (L-APPA):
Para a cromatografia em camada fina utilizam-se chapas de silica-gel 60 F254 (Merck).
Determinam-se os valores de Rf em sistemas de eluentes acabados de preparar, em câmaras saturadas, revestidas de papael absorvente (fabricante: empresa Camag/Muttenz. Suiça). Geralmente, aplicaram-se 2 pl de uma solução a cerca de 1%. 0 percurso é de 8-10 cm.
A seguinte tabela apresenta os eluentes e os valores de Rf.
C\1 o
r— o
• · • · CO
CO CO ·
r— • · • · O
• · o CM 1^ • ·
CM w— t—
• · • · • · • ·
CM LO LO CM
S i s t e m a de eluentes (v/v )
05 Z5 CP tfO 05 Z5 cd 'CO
i 1 r—1
co co
•r—<
o o
<o CO CO
r Ί Z5
Cd CD
o SfO
LO <_> O
•í-í o I-<
CM +-> ·<—< co
Φ 4-> ··—1
CO o Φ O
co O cO
o5 <o i—4
•i—4 o CD
c: Ό o
o • ι—4 Ό O
E O r—i O
rtí (ϋ o • ^-1
co +·>
<—< co Φ
O c 05 O
c •i—1 C CO
CO Ό
+J • i“4 Ό CO O
Φ í- •ι-1 Z5 O
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O CL \ CO
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ί- c o c: o
Ο co c CO c
4- CL CO O. co
O o +-> O 4-»
ί- í_ O ί- O
ο o. JC ο. £1
^—1 1 1 1 I
o Cl ΣΖ c: c
-63Riz.A riz.B
APPA
I 0,12 0,21 0,17
II 0,21 0,29 0,34
III 0,07 0,12 0,15
IV 0,02 0,04 0,21
V 0,10 0,12 0,16
13 eqjectro de H e C-RMN apresenta os seguintes desvios químicos:
I
Dados do espectro de 1H-RMN da rizocticina A (J ppm); D20
Valores médios -Valores apresentados atribuição
na bibliografia cieiq tifica *
4,05 4,13 Arg a-H
2,00 2,02 Arg β-Η (2H)
1,80 1,88 Arg ?-H
3,29 3,27 Arg Ó-H
4,93 4,81 APPA a-H
(lH;d;J=8.9 Hz)
5,71 (lH;m) 5,64 APPA P-H
5,88 (lH;m) 6,12 APPA ?-H
2,62 2,72 APPA 6-H
(2H;m;J=9.3 Hz)
Dados do espectro de 13C-RMN da rizocticina A 3 (ppm); D20
Valores medidos Valores encontrados na* Multiplicida
bibliografia cientifica des **
179,8 175,2 Arg (C=O)
55,3 55,1 Arg (CH)
30,4 28,5 Arg (CH2)C-3
25,8 24,9 Arg (CH2)C-4
42,9 41,5 Arg (CH2)C-5
159,3 157,5 Arg (C=NH)
171,1 172,7 APPA (C=O)
55,7 (s) 51,5 APPA (CH)
128,6 (d;J=13 Hz) 123,5 APPA (CH)
131,4 (d;J=10 Hz) 132,9 APPA (CH)
31,6 (d;J=128 Hz) 29,3 APPA (CH2)
BK Park. A. Hirot.a. H. Sakai. Agric. Biol. Chem. 41. 573-579 (1977) ** determinadas a partir de experiencias de ressonâncias de spines.
Q
Dados do espectro de °C-RMN da rizocticina B ppm); DgO
179,8 Arg C-l
174,3 APPA C-l
172,2 Vai C-l
159,5 Arg C-6
130,7 APPA C-4 (dupleto 9,5 Hz)
129,4 APPA C-3 (dupleto 13,2 Hz)
61,3 Vai C-2
56,2 Arg C-2
55,9 APPA C-2
43,2 Arg C-5
31,5 APPA C-5 (dupleto 127 Hz)
32,8 Arg C-3
30,8 Vai C-3
26,9 Arg C-4
20,5 Vai C-4
19,5 Vai C-4'
-66Exemplo 7
Isolamento de rizocticina C e D
No caso de composto isolados de rizocticina B. após purificação com Sephadex G-10, existe uma micro-heterogeneidade, isto é. neste caso, o amino ácido N-terminal (valina) foi substituído, em 0.5-5% por leucina e iso-leucina.
Mediante HPLC é possível isolarem-se da mistura, e em pequenas quantidades os tripeptidos rizocticina C (L-Ile-L-Arg-L-APPA) e rizocticina D (L-Leu-L-Arg-L-APPA). que possuem igualmente acção antifungi ca.
Coluna: RP18 Nucleosil. 5μ; 4.6χ 250 mm. coluna pervia
4,6 x 10mm.
Fase movei: KH2P04 0,01M. condições isocráticas: caudal 1m1/min .
A distribuição (atribuição) das estruturas e a detecçao realizam-se mediante analise AS(Cromatografia em fase gasosa).
Valores de Rf (sistema de DC/~cromatografia em camada fina7 II):
Rizocticina C- Rf = 0,31
Rizocticina D - Rf = 0;28
Exemplo 8
Preparação, mediante hidrólise, de acido L-2-amino-5-fosfono-3-cis-penténico (L-APPA). a partir de rizocticinas
Procede-se à hidrólise de 7 mg de rizocticina A. em 1 ml de HC1 6N. durante 18 horas a 110°C; em seguida, faz-se passar uma corrente de azoto através da mistura e concentra-se. por evaporação, até à secagem.
concentrado obtido é dissolvido em 200 pl de agua, para a sua purificação posterior(separaçao de Arginina) e aplicado sobre uma coluna de permuta de ioes Dowex 50 WX8 (forma de H+. 50-100 mesh. 65 χ 8 mm) Enquanto se processa a adsorção de arginina. torna-se possivel eluir L-APPA ja com simples agua desionizada (pH=6). Reunem-se as fracções homogéneas (mediante cromatografia em camada fina) (controlo por cromatografia em camada fina.sobre sílica-gel. coloração amarela com ninidrina, Rf = 0.16 no sistema V) e 1iofi1izam-se estas fracções. Obtem-se 3.1 mg de L-APPA incolor.
Dados da RMN-^H de L-APPA. obtidos da separação (HPLC) do hidrolisado da rizocticina A ($(ppm); D^O; 400. 13MHz)
Valores médios
Valores referidos na literatura cien tifica *
Desvio químico
2,68 (2H;m;m;J=7.5 Hz) 2,72 (2H;d;d;J-8.4 Hz)
4,59 (lH;d;J=9.8 Hz) 4,81 (lH;d;J=9.5 Hz)
5,63 (lH;m) 5,64 (lH;d/t;J=5.2, 9.5 Hz)
6,04 (lH;m) 6,12 (lH;m)
5CH aCH pCH >CH
Dados da RMN-^c de L-APPA. obtidos da separação (HPLC) do hidrolisado da rizocticina A (o (ppm): D20; 100,6 MHz)
Valores medidos Valores referidos na literatura cientifica*
176,19 (s) 172,7 (s) C-l
54,03 (s) 51,5 (S) C-2
126,48 (d;J=13 Hz) 123,5 (d;J=12 Hz) C-3
134,15 (d;J=10 Hz) 132,9 (d;J=ll Hz) C-4
31,23 (d;J=127 Hz) 29,3 (d;J=127 Hz) C-5
* B.K- Park. A Hirota. H. Sakai. Agric. Biol. Chem. 41, 573-579 (1977)
A determinação da configuração realiza-se indirectamente por meio de comparação cromatografica (em fase gasosa) da mistura da hidrólise, hidrogenad. contendo o acido L-B-fosfono-valerico com ácido D. L-5-fosfono-valerico.
Condições da cromatografia em fase gasosa: Chirasi1-Vai. programação de temperatura: durante 5 minutos e 80°C. em condições isotérmica, seguidamente 3°/min. ate 220°C; gas de suporte: H2 (0.7 bar); derivados de (TFA/trimetilsililo).
Exemplo 9
Preparaçao de acido L-2-amino-5-fosfono-3-cis-pentenoíco (L-APPA) a partir de rizocticinas. pela reacção com termolj. sina
Fazem-se reagir 7 mg de rizocticinaA. em 1.5 ml de acetato de N-etilmorfolinio 0.05 N,
CaCl2-6H2H 0.01M (pH=7.8).. com 200 jjI de termolisina (2 mg/ml). Escolhendo uma temperatura de 41°C. a hidrólise esta terminada dentro de 30 horas (analise de amino-ácí·
dos por permuta de iões). Pela adição de HC1 diluído até um valor pH de 3. desactiva-se a enzima, concentra-se a solução, por evaporação, num vacuo (evaporador rotativo), dissolve-se o resíduo num pouco de acido acético 0,05N e aplica-se sobre uma coluna de Sephadex G-25 (10 χ 250 mm eluente: acido acético 0.05 N). Reunem-se as fracções de APPA que na chapa cromatografica (em camada fina sistema V) se colorem num tom amarelo com ninidrina. e procede-se a sua concentração, por evaporação.
A elaboração do concentrado, realiza-se tal como se descreve no exemplo 8. Obtem-se 3,1 mg de L-APPA incolor.
Procedendo de maneira analoga L-APPA. pode obter-se mediante reacção com carboxi-peptidase A e tripsina a partir das rizocticinas. Consoante as condições reaccionais. necessitam-se de um periodo de incubação de 3 a 4 dias para se efectuar com uma hidrólise quantitativa.
Condições reaccionais para reacções com enzimas:
Razão de substracto/enzima : 5-10%
Temperatura de incubação T = 37°C ; para a reacção com carboxipeptidase A : T = 29°C.
Tampao acetato de N-etilmorfolinio 0.05N. CaClg.GHgO
0.01M. pH=7.8.
Concentração do substracto : 0.5 mg/ml.
decurso da reacção enzimática é observado em intervalos apropriados, retirando-se da solução reaccional partes aliquotas (10 ^1). e acidificando-se para um pH de 2.5 pela adição de HC1 1N. para ter minar a reacção.
Para fins de análise, as amostras sao submetidas a uma analise de amino-ácidos por permutadores de ioes (automatizada).
Exemplo 10
Transformação enzimatica da rizocticína B em A
A hidrólise enzimatica de rizocticina B (L-Val-L-Arg-L-APPA) para se formar a rizocticina A, com separação de valina. realiza-se com pronase. obtida a partir de Streptomyces griseus. uma peptidase de especificidade reduzida.
A degradação enzimatica de L-val-L-Arg-L-APPA realiza-se em termos quantitativos, dentro de poucos minutos (cerca de 15 minutos), conservando-se a acção antifungica. pela separação de amino-ácido N-terminal (valina) forma-se a rizocticina A. Confirma-se o resultado da hidrólise mediante cromatografia em camada fina e por meio de analise (sequencial) de amino-ácido
-72por permutadores de iões.
Decorridas 12 horas, ainda naô se pode comprovar qualquer diminuição da actividade em relação ao dipeptido com acçáo antibiótica.
Também a rizocticina nativa A mantém-se inerte durante o tratamento com pronase.
A separaçào dos derivados da degr£ daçao da rizocticina a seguir ao tratamento com pronase efectua-se mediante analise de amino-acidos automatizada ou segundo os métodos descritos anteriormente.
Exemplo 11
Preparação da rizocticina A (L-Arg-L-APPA) partindo de
L-APPA
Juntam-se 51 pmoles (6.9 mg) de HOBt. dissolvidos em 250 jj 1 de DMF a 51 jjmoles (16 mg) de Boc-L-Arg-OH χ HC1 χ HgO.
Sob agitação, adicionam-se 10,7 mg de DCC.. continua-se a agitar durante 30 minutos, â temperatura ambiente, e filtra-se o DCU insolúvel. Adiciona-se o filtrado a 40 jummoles (8 mg) de L-APPA. dissolvidos em 200 jil de DMF. e. após adição de 2 equivalentes (4^u 1) de N-etilmorfolina. agita-se durante 4 horas, à temperatura ambiente (RT). Num evaporador rotativo, num alto vacuo. separa-se o solvente, por evaporação. 0 resíduo e digerido com 2 ml de agua e é separado, por filtração.
valor pH do filtrado é ajustado a 7. aplica-se o filtrado sobre uma coluna Dowex 1x4 (forma de 0H. 7 χ 50 mm), lava-se com agua e depois com acido acético 0.1N. e elui-se o produto sintetizado com acido acético 2N. As fracções são concentradas, por evaporaçao (evaporador rotativo) e são 1iofi1izadas . Obtem-se Boc-L-Arg-L-APPA; Rf = 0.28 (silica-gel. n-propanol/piridína/acido acético glacial/agua . 15:10:3:12).
pmoles (5 mg) de Boc-L-Arg-L-APPA são agitados com 1 ml de TFA/diclorometano: (1:1) durante 15 minutos, a temperatura ambiente. Separa-se, por evaporaçãi. num alto vacuo. num evaporador rotativo, juntam-se 3 ml de diclorometano e separa-se. por evaporaçao. 0 resíduo e dissolvido em HC1 0.01N e a solução é liofilizada. Obtem-se o composto em epígrafe L-Arg-L-APPA (como cloridrato); Rf = 0.21 (silica-gel. n-propanol/piridina/acido acético glacial/água 15:10:3:12).
-74Exemplo 12
Preparação de rizocticina B (L-Val-L-Arg-L-APPA) partindo de L-Arg-L-APPA umoles (6.2 mg) de Boc-L-Val-OSu são dissolvidos em 1 ml de DMF. juntam-se 40 yjmoles (4 jul) de N-eti lmorfol ina e 13 jjmoles (5 mg) de L-Arg-L-APPA x HC1 e agita-se durante 16 horas a temperatura ambiente. A mistura reaccional é separada, por evaporação, num alto vacuo (evaporador rotativo), o residuo é dissolvido em 2ml de agua e extraído (3 χ ) com 2 ml de acetato de etilo, de cada vez.
A fase aquosa é concentrada, por evaporaçao. ate a secagem, e dissolvida em HC1 0,01N e liofilizada. Obtem-se Boc-L-Val-L-Arg-L-APPA;
Rf - 0;23 (silica-gel. n-butanol/acido acético glacial/ água. 2:1:1).
pmoles (5 mg) de Boc-L-Val-L-Arg-L-APPA sao agitados com 1 ml de TFA/diclorometano 1:1). durante 30 minutos, à temperatura ambiente. A mistura reacional é separada, por evaporação (evaporador rotativo) num alto vacuo. 0 residuo é dissolvido em 200 ^ul de DMF Após adiçao de HC1 eterificado (2 ml) dá-se precipitação de um produto incolor. Obtem-se o composto em epígrafe L-Val-L-Arg-L-APPA (Sob a forma de cloridrato); Rf = 0z12 (silica-gel n-butanol/acido acético glacial/água 2:1:1).
Exemplo 13
Procedendo de maneira analoga à referida nos exemplos 11 e 12 podem preparar-se os seguintes tripeptidos ou os seus cloridratos:
L-Ile-L-Arg-L-APPA
L-Leu-L-Arg-L-APPA L-Ala-L-Arg-L-APPA L-HomoArg-L-APPA
L-Va1-L-HomoArg-L-APPA L-Ile-L-HomoArg-L-APPA L-Leu-L-HomoArg-L-APPA
Exemplo 14
Preparaçao de L-Val-L-Lis-L-APPA a partir de L-APPA
Uma soluçào de 40 jjmoles (18.7 mg) de Fmoc-L-Lis (Boc )-0H. 40 jumoles (5.4 mg) de HOBt e mg de DCC. em 1 ml de DMF. e agitada durante 30 minutos a temperatura ambiente. SEpara-se. por filtração, e junta-se o filtrado a 40 jumoles (8 mg) de L-APPA. dissolvidos em
0.5 ml de DMF. Depois de um periodo de agitação de 4 horas, a temperatura ambiente (RT). separa-se. por evaporação (eva porador rotativo), num alto vacuo; dissolve-se o resíduo em 250 ul de DMF. filtra-se o material insolúvel, e aplica-se sobre uma coluna de Sephadex LH20 (200 χ 8 mm. eluente DMF). As fracçoes homogéneas (verificação por cromatografia em camada fina, sobre silica-gel, em cloroformio/metanol/agua 65:25:4. Rf = 0.19) são concentradas, por evaporação, dissolvidas em 5 ml de t-butanol e liofi1 izadas.
Uma solução de 18 ^moles (12 mg) de Fmoc-L-Lis (BOc)-L-APPA-OH. em 2 ml de piperidina a 10% de DMF. é agitada durante 30 minutos à RT. e é separada mediante evaporaçao rotativa, num alto vacuo. 0 resíduo é dissolvido em 0.5 ml de DMF e a solução é levada a reagir com 4 ml de eter dietilico e 4 ml de éter de petróleo (30-50°C). A 4°C. precipita o L-Lis(Boc)-L-APΡA incolor; Rf- 0,25 (silica-gel. cloroformio/metanol/amonia e 12,5%, 2:2:1).
Faz-se reagir uma solução de 12 jmoles (5 mg) de L-Lis (Boc)-L-APPA e 20 jumoles (6.3 mg) de 3oc-L-Val-OSu. em a 1 ml de DMF. com 19/imoles( 2 μ 1) de N-etíImorfolina e agita-se durante 12 horas â RT.
Separa-se por evaporação rotativa. a mistura reaccional. num alto vacuo. o resíduo é digerido com 2 ml de agua e extraído ( 3 χ) com 2 ml de acetato de etilo. de cada vez. a fase aquosa é liofilizada.
Fazem-se reagir 10 ^moles (6,2 mg) de Boc-L-Val-L-Ljs(Boc)-L-APPA com 1 ml de TFA; passados 30 minutos, concentra-se-, por evaporação rotativa, num alto vacuo. o resiudo obtido e dissolvido em 1 ml de DMF e e precipitado com 3 ml de eter dietilico. 0 precipitado e dissolvido em HC1 e 0.01N e é liofilizado. Obtem-se L-Val-L-Lis-L-APPA )(sob a forma de cloridrato) Rf = 0.34 (silica-gel. n-propanol/piridina/acido acético glacial/agua; 15:10:3:12).
Procedendo da mesma maneira é possível preparar os seguintes tripeptidos ou os seus cloridratos:
L-Ile-L-Lis-L-APP L-Leu-L- Lis-L-APP L-Ala-L-Lis-L-APP L-Val-L-Orn-L-APPA L-Ile-L-Orn-L-APPA L-Leu-L-Orn-L-APPA L-Ala-L-Orn-L-APPA
Exemplo 15
Preparaçao de L-Lís-L-APPA
Faz-se reagir uma solução de 40 pmoles (8 mg) de L-APPA e 70 pmoles (29.8 mg) de Boc-L-Lis (Boc)-OSu. em 2 ml de DMF. em 153 pmoles (17 jjl) de N-etilorfolina. e agita-se durante 12 horas, à temperatura ambiente. Separa-se a mistura reaccional. por evaporação rotativa, num alto vacuo. dissolve-se o resíduo em 0,5 ml de DMF e aplica-se sobre uma coluna de Sephadex LH20 (200 χ 10 m. eluente DMF). As fracções homogéneas (verificação por cromatografia em camada fina de silica-gel. em nbutanol/acido acético glacial/agua. 2:1:1; Rf =0,43) são reunidas concentrdas. por evaporação, dissolvidas em terc-butanol e 1 iofi1izadas.
Uma mistura de 9.6 jumoles ( 5mg) de Boc-L-Lis(Boc)-L-APPA é agitada com 0.5 ml de TFA, durante 30 minutos, à RT. concentrados, por evaporação rotativa. dissolve-se em HC1 0,01N e 1iofi1iza-se. Obtem-se L-Lis-L-APPA (como cloridrato): Rf =0?15 (silicagel. n-butanol/acido acético glacial/agua . 2:1:1).
Procedendo de maneira analoga prepara-se o L-Orn-L-APPA ou os seu cloridrato.
-79Exemplo 16
Podem obter-se da maneira seguinte, ampolas liofilizadas ou frascos contendo 0.5 g de rizocticina A como substancia act i va :
Composição (para 1 ampola, ou frasco) ) Subtancia activa
0.5 g man itol
0.05 g
Uma solução aquosa, esterilizada, constituída pela substancia activa e manitol. é introduzida em condiçoes assépticas, em ampolas ou frascos de 5 ml de capacidade; em seguida, fecham-se as ampolas (frascos) e examinam-se quanto à sua idoneidade.
Descríçáo sucinta das figuras
Figura 1: Fermentação de B.Subtilis ATCC 6633. em escala de 20 litros (meio PL. a 27°C).
Δ-Δ. actividade relativamente a Paecilomyces variotti Tu
137 (mm de diâmetro da area de inibição)
0-0 actividade relativamente a Saccharomyces cerevisiae
I Til 125 (mm de diâmetro da area de inibição).
sedimento (%). 9 — · pH.
pO2(%)
Figura 2 : Fermentação de B.subti1 is ATCC 6633. em escala de 200 litros (meio nutriente PL. a 27°C)
Δ-Δ Actividade relativamente a P .variotti Tu 137 (mm de diâmetro da área de inibição ). · pH.
teor me manitol (g/1).

Claims (18)

1â.- Processo para a preparação de rizocticinas de fórmula
REIVINDICAÇÕES
COOHO OH
IIIZ
X-Y-NH-CH-C=C-CH-> -P
II\
Η HOH (I)z em que
X represente hidrogénio ou um radical de aminoácido hidrófobo e Y representa um radical de amino-ácido básico, sendo que os átomos de carbono na posição 2 dos radicais de aminoácidos apresentam a configuração J_. e de derivados protegi dos e sais dos referidos compostos, caracterizado por
a) se cultivar uma estirpe bacteriana capaz de produzir rozocticinas. num meio nutriente, que contem, eventualmente um amino-ácido X e Y ou um dipeptido X-Y. e se isolar, a partir do meio de cultura, a desejada rizocticina ou mistura de rizocticinas. ou
b) se combinar, numa sequencia qualquer, para a formação de uma ligaçao peptidica. os amino-ácidos X. Y e o ácido L-2-amino-5-fosfono-3-cis-pentenoico. ou os seus derivados protegidos, ou
c) para a preparação de uma rizocticina de formula I, em que X representa hidrogénio, se separar X de uma rizocticina de formula I. em que X representa um radical de amino-ácido hidrófobo. e caso se desejar e seja necessário, se separar o(s) grupo(s) protector(es), e se transformar uma rizocticina de formula I num sal ou se converter num sal resultante no composto livre.
23.- Processo de acordo com a reivindicação 1a) caracterizado por se empregar Baci1lus subtil is ATCC 6633 como estirpe bacteriana.
3â.- Processo de acordo com a reivindicaçao 1a) caracterizado por se empregar o meio PL como meio nutriente.
43.- Processo de acordo com a reivindicação 1a) caraterizado por se isolar as rizocticinas A. B . C e/ou D.
5S.- Processo de acordo com a reivindicação 1b). caracterizado por se fazer reagir L-APPA com um amino-acido H-Y-OH. protegido no grupo amino, ou com um dipéptido H-X-Y-OH protegido no(s) grupo(s) amino, em que X representa um radical de amino-ácido hidrófobo, e se separar o(s) grupo(s) protector(es) a partir do di- ou tri-peptido obtido.
8363Processo de acordo com a reivindicação 5. caracterizado por se utilizar o grupo protector BOC ou Fmoc e se empregar DCC como composto de condensação .
73.- Processo de acordo com a reivindicação 5. caracterizado por se utilizar o grupo protector BOC ou Fmoc e o grupo carboxi estar presente, na forma activada. como éster de N-hidroxissuccinimida.
8â.- Processo de acordo com a reivindicação 7. caracterizado por se separar os grupos protec_ tores BOC mediante tratamento com ãcido trifluoroacetico e se separar os grupos protectores Fmoc mediante tratamento com piperidina.
9â.- Processo de acordo com a reivindicação 1c) caracterizado por se separar por meio da pronase o radical de amino-acido X. hidrofobo.
103.- Processo de acordo com a reivindicação 1). caracterizado por se preparar rizocticinas de formula I e os seus sais em que X representa hidrogénio. L-Val- L-Ile. L-Leu. ou L-Ala e Y.representa L-Arg, L-Lis. L-Orn ou L-Homo-Arg.
11-.- Processo de acordo com a reivindicação 1. caracterizado por se preparar rizocticina A. de formula I. e os seus sais, em que X representa hidrogénio e Y representa L-Arg.
12a.- Processo de acordo com a reivindicação 1. caracterizado por se preparar rozocticina B. de formula I. e os seus sais, em que X representa L-Val e Y representa L-Arg.
13â.- Processo de acordo com a reivindicação 1. caracterizado por se preparar rizocticina C, de formula I. e os seus sais, em que X representa L-Ile e Y represente L-Arg.
14ã.- Processo de acordo com a reivindicação 1. caracterizado por se preparar rizocticina D, de de formula I. e os seus sais, em que X representa L-Leu e Y representa L-Arg.
15â.- Processo de acordo com a reivindicação 1 . caracterizado por se preparar rizocticinas de formula i. e os seus sais, em que X representa L-Val e Y representa L-Lis.
I
-8516â.- Processo de acordo com a reivindicação 1. caracterizado por se preparar as rizocticj_ nas L-Ala-L-Arg-L-APPA. L-HomoArg-L-APPA, L-Val-L-HomoArg-L-APPA. L-Ile-L-HomoArg-L-APPA. L-Leu-L-HomoArg-L-APPA, L-1 le-L-Lis-L-APPA. L-Leu-L-Lis-L-APPA, L-Ala-L-Lis-L-APPA. L-Val-L-Orn-L-APPA. L-Ile-L-Orn-L-APPA, L-Leu-L-Orn-L-APPA. e L-Ala-L-Orn-L-APPA, em que L-APPA representa o radical do acido L-2-amino-5-fosfono-3-cis-pentenoico. ou os seus sais.
17â.- Processo de acordo com a reivindicação 1. caracterizado por se preparar extractos e concentrados contendo rizocticinas em forma de concentrada. que se podem obter a partir de caldos de cultura de aco£ do com o processo da reivindicação 1a). por meio da concentração das rizocticinas mediante permutadores iónicos ou resinas de adsorção e cromatografia de exclusão.
18âProcesso para a preparação de ácido L-2-amino-5-fosfono-3-c_i_£-pentenoico, opticamente puro (L-APPA). caracterizado por se decompor mediante hidrólise uma rizocticina ou uma mistura de rizocticinas, obtida por fermentação de uma estirpe bacteriana capaz de produzir rizocticinas. e se isolar L-APPA na forma opticamente pura.
19a,- processo de acordo com a reivindicação 18. caracterizado por se decompor rizoctici
-86nas. por exemplo, rizocticinas A. por meio de termolisina e se isolar L-APPA. opticamente puro.
20ã.- Processo de acordo com a reivindicação 18. caracterizado por se decompor rizocticinas por exemplo rizocticina A. mediante carboxi-peptidase A ou tripsina.
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