PT86878B

PT86878B - Processo para determinacao da presenca de virus da imunodeficiencia humana (hiv) mediante a utilizacao de rnase l

Info

Publication number: PT86878B
Application number: PT86878A
Authority: PT
Inventors: William A Carter
Original assignee: Hem Res Inc
Priority date: 1987-03-03
Filing date: 1988-03-02
Publication date: 1992-05-29
Also published as: OA08720A; IE880587L; FI880959A0; ZA881471B; DE3850428T2; IL85576A0; AU1256388A; FI880959A7; KR880011593A; MX173802B; DE3850428D1; JPH0675520B2; RU2049336C1; JPS63309200A; PT86878A; NO880934L; NO880934D0; AU618525B2; EP0285263B1; CA1337278C

Description

MEMÓRIA DESCRITIVA

Antecedentes Gerais da SIDA

A SIDA (Síndrome de imunodeficiência adquirida) representa uma das maiores ameaças à saúde pública do século XX. Por causa da sua natureza biológica variável, dos seus meios súbtis de difusão de indivíduo para indivíduo e do seu período de doença latente que desafia até a detecção eficaz da sua presença, a SIDA rapidamente se tornou num dilema epidemiolõgico de proporções sem precedente. Na realidade, mesmo com os meios consideráveis já postos à disposição para aumentar as capacidades de diagnóstico, as tecnologias disponíveis ainda são bem pequenas para responder ãs necessidades de maneira a que se possa obter um controlo firme deste problema dentro de qual1 satmaoramn

quer sector da população, p. ex., ver as Actas dum Simpósio inti tulado Experience with HTLV-III Antibody Testing, an Update on Screening, Laboratory and Epidemiological Correlations, patroci nado por Center for Drugs and Biologics, FDA, National Institutes of Health e Centers for Disease Control, realizado em 31 de Julho de 1985 nos National Institutes of Health, Bethesda, Maryland; ver também Budiansky, S. em Nature, volume 316 página 96, 11 de Julho de 1985.

Existem várias designações diferentes para o vírus da imunodeficiência humana (HIV) ; LAV ê a desiç[ nação para o vírus da SIDA isolado no Instituto Pasteur, Paris, França e HTLV-III ê a designação para o vírus isolado no National Institute of Health, Bethesda, Maryland, E.U.A.. Na presente memória descritiva o vírus será frequentemente referido generica mente ou designado por HTLV-III ou LAV ou HIV sem intenção de se diferenciar entre eles. Além disso o termo HIV na presente especificação inclui todos e quaisquer outros vírus que se poderão associar como causadores do SIDA, quer já isolados ou não. HIV no singular quer dizer que inclui qualquer dos tipos de HIV sem se ter em conta os seus conteúdos genómicos. De forma similar os sintomas da SIDA serão referidos genericamente incluindo sintomas causados pelo HIV (como definido acima), os ARC ou complexos relacionados com a SIDA, o síndroma de linfadenopatia (LAS) e ou tros vírus causadores de condições substancialmente similares clinicamente.

As considerações terapêuticas correntes tomaram uma de duas abordagens: imunológica (produção de vacinas) ou ataque directo ao próprio vírus (terapia antivirai). Enquanto que a produção de vacinas parecia de início ser extrema mente prometedora, pelo menos em teoria, os novos conhecimentos da composição virai diminuíram significativamente esta esperança; nomeadamente o vírus é objecto de mutações ou de alterações frequentes da súa estrutura bioquímica básica de tal modo que os de terminantes antigénicos virais críticos - necessários para que a vacina seja efectiva - também sofrem frequentes mutações ou al terações. Por exemplo, verificou-se recentemente que os isolados * de HTLV-III da Califórnia, de Maryland e da Inglaterra são signi^ ficativamente diferentes uns dos outros quando os respectivos conteúdos genómicos foram analisados rigorosamente. A implicação de estudos como estes é que uma vacinação contra o HIV não terã benefícios vastos e duradouros tão conclusivamente benéficos e duráveis como é historicamente característica da maioria das outras vacinas, como as vacinas dirigidas contra o vírus da poliomielite e contra o vírus do sarampo, etc..

Na segunda abordagem, ou abordagem antiviral directa, outros cientistas experimentaram vários compostos incluindo AZT, HPA-23, sumarina, ribavirina, interferão e Fascarnet, etc.. Estes compostos foram introduzidos em estudos de laboratório ou clínicos até agora com evidência limitada ou qualificada de êxito terapêutico. Na verdade têm sido relatados em quase todos os casos resultados que evidenciam uma alta toxicidade e/ou efeitos secundários graves (p. ex., ver o artigo pre parado por M. Clark, Newsweek, página 71, 5 de Agosto de 1985; e também C. Wallis, Time, páginas 40-47, 12 de Agosto de 1985). Ne nhuma destas substâncias são, na verdade, novas ou capazes de se rem dirigidas selectivamente para a afecção de base, ou seja a multiplicação de HIV em algimas células. Por exemplo o HPA-23 ê uma combinação de metais pesados (remeniscente do uso de arsénico para o tratamento de doenças venéreas nos anos 20 ou seja na era pré-penicilina); a sumarina ê na verdade um composto anti-pa rasítico (doença do sono) e o Fascarnet é um composto contra o vírus do herpes. Os últimos dois compostos podem inibir uma enzi ma relacionada com o HIV chamada transcritase inversa mas há pouca evidência de que esta inibição enzimática tenha como resul tado qualquer melhoria terapêutica significativa ou qualquer pre venção ou melhoria da doença. A AZT pode estar associada com um ligeiro prolongamento da vida de vítimas de SIDA mas ê altamente tóxica e não elimina o HIV (R. Yarchoan et al., Lancet, 15 de Março, p. 575, 1986; R.E. Chaisson et al., New England Journal of Medicine, volume 315, p. 1611, 1986).

Características progressivas da SIDA

A SIDA segue a deterioração progre^ siva do sistema imunitário causado pela infecção com o vírus de f

imunodeficiência humana, HIV. Nos primeiros momentos da doença a imunidade mediada por intermédio celular fica danificada pela perda de células T (derivadas de timo), as quais expressam o cha mado antigénio T4, um subconjunto de células T consistindo principalmente em adjuvante T e células indutoras. A deficiência em células T4 pode conduzir a várias deficiências na imunidade mediada por intermédio celular, incluindo deficiências em células destruidoras naturais (natural killer cell = NK) , em células de_s truidoras activadas por linfoquina (lymphokine activated killer cell = LAK) e em células T citolíticas. Existem também insuficiências de células B (derivadas de medula de óssea) na SIDA.

A SIDA parece ser uma doença progressiva, apesar do ritmo de transição de uma fase para outra po der ser variável. Estas fases foram classificadas. Existem indivíduos assintomãticos infectados pelo HIV (seropositivos), como demonstra a presença de anticorpos em circulação contra o vírus (M.G. Sarngadharan et al., Science, volume 224, p. 506, 1984). Se não têm mais quaisquer sintomas, estes pacientes são designados como pacientes no estádio WR1 pela classificação Walter Reed (R.R. Redfield et al., New England Journal of Medicine, volume 314, p. 131, 1986). Este estádio também foi denominado por pré-ARC (ARC = complexo relacionado com SIDA) apesar de alguns destes indivíduos poderem nunca vir a desenvolver sintomatologia ARC. Alguns destes pacientes podem desenvolver linfadenopatia (WR2) e apresentam uma deficiência de células T4 (WR3) . Em segujL da, a capacidade dos linfócitos para suportar uma proliferação estimulada.por antigenes e a produção de interferão gama estimulada por antigenes diminuem e estes pacientes WR4 começam a perder hipersensibilidade cutânea retardada. Os pacientes WR5 são usualmente anergéticos. Estes pacientes apresentam infecções de herpes Zoster, candidíase oral (altas) ou sintomas de ARC, os quais incluem febres prolongadas, suores noucturnos, fadiga diar reia e/ou perda de peso. Este período de ARC é normalmente também caracterizado por decadência progressiva da imunidade. Final, mente, os indivíduos WR6 experimentam infecções oportunistas que constituem a SIDA madura em que 50% dos pacientes morrem em 12 meses (H.W. Murray et al., New England Journal of Medicine, volu

Λ me 310, p. 883, 1984).

Breve Descrição dos Desenhos

A FIGURA 1 ê uma fotografia de uma placa de electroforese em gel de poliacrilamida mostrando 7 pistas e bandas ou zonas ao longo de cada pista; e

A FIGURA 2 ê uma ilustração da via bio-sintética 2'-5’ oligoadenilato/RNase L.

SUMÃRIO DA INVENÇÃO

Foi descoberta uma substância inibi dora, libertada ou feita libertar por células infectadas por vírus da imunodeficiência humana. Aparentemente, este inibidor liga-se fisicamente à enzima RNase L, o produto terminal da via bio-sintética 2’-5’ oligoadenilato/RNase L, provocando o funcionamento deficiente de todo o sistema imunitário e permitindo ao HIV multiplicar-se de modo incontrolável. Descrevem-se técnicas para identificar estes inibidores, quer directa quer indirectamente pela ausência de RNase L ou pela inactividade da RNase L ou pela presença de inibidores de intermediários bioquímicos na via 2'-5' A/RNase L, servindo o inibidor ou os inibidores como marcador ou marcadores para detectar a presença de HIV ou de vírus relacionados apresentando condições clínicas substancialmente similares. São também discutidos o significado como prognõsti co deste marcador com respeito ao desenvolvimento da SIDA madura em pacientes, particularmente aqueles que possuem anticorpos a um HIV no sangue periférico e em tecidos incluindo sangue, fracções de sangue, células de orgãos transplantados e extractos de células. São descritos procedimentos para activar RNase L e/ou remover ou inactivar a substância inibidora da RNase L. Fazem parte da presente invenção métodos terapêuticos para tratamento da SIDA e vírus relacionados e para controlar o progresso de tai£ vírus pela activação de RNase L e/ou pela remoção ou inactivação da(s) substância(s) inibidoras de RNase L ou vírus dirigidos par; estes inibidores. Estão incluídos na presente invenção os procedimentos para preparação de anticorpos para estes vírus quer in vivo quer in vitro fico de RNase L ou via 2¹-5¹A/RNase L

utilizando como antigénio um inibidor especíinibidores de intermediários bioquímicos na dirigidos a vírus.

Claims

DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO

Por conseguinte, a presente invenção inclui um processo para a preparação de uma composição farma ceutica mediante o uso de ARNdc e um método de activação de RNase L, remoção ou inactivação dum inibidor específico de RNase L ou de inibidores de intermediários bioquímicos na via 21-5’A/ /RNase L dirigidos contra vírus tanto em animais como em humanos compreendendo, em combinação, um ARNdc, de preferência um ARNdc desemparelhado, tal como anteriormente explicado, e uma linfoqui na, como seja um interferão ou outro produto antiviral específico cuja acção será facilitada pela recuperação e reposição da via 2’-5’A dependente de ARNdc.

De preferência a composição contém o ARNdc e o interferão numa proporção de 0,01 a 1000 miligramas de ARNdc para 0,1 a 100 000 IRU de interferão.

A presente invenção inclui ainda um processo para a preparação dum agente terapêutico mediante a transformação dum fluido biológico de preferência de origem huma na ou de preferência orientado para uso humano ou células resistentes a infecção virai, com resistência melhorada ou que possam mitigar os efeitos da infecção por HIV caracterizado por se misturar ou contactar o referido fluído biológico ou as referidas células com uma quantidade eficaz, por exemplo capaz de inibir HIV, de um ARNdc que active a RNase L. 0 fluído biológico pode ser sangue humano ou uma fracção deste, por exemplo para uso em transfusão ou em diálise. As células podem ser provenientes de pele que se pretenda enxertar ou dum orgão que se pretenda trans plantar.

Para além disso, a invenção inclui também um processo para retirar ou inactivar substâncias que ini bem a formação de RNase L a partir dum aparelho para manuseamento de fluídos parenterais ou para a preparação dum agente tera- L pêutico capaz de mitigar o efeito de infecções provocadas por HIV caracterizado por contactar o referido aparelho com uma composição contendo uma quantidade eficaz de um ARNdc que active a RNase L iniba o HIV.

A presente invenção inclui também um processo para a preparação de composições úteis para o tratamento de indivíduos infectados por HIV, incluindo condições de SIDA, por meio da supressão ou da eliminação dum inibidor de RNase L específico de HIV ou de inibidores de intermediários bio químicos dirigidos contra vírus na via 2’-5'A/RNase L e/ou de ac tivação da RNase L. Estas composições contêm um ARNdc e uma subjs tância veicular ou um diluente farmaceuticamente aceitáveis, em conjunto com instruções para o uso no tratamento de condições in duzidas por retrovírus ou por vírus linfotrõpicos de células T, por exemplo de SIDA ou de outros vírus humanos cuja multiplicação sofra interferência pela activação de RNase L latente.

Deste modo, são descritos na presen te memória descritiva para exemplificação métodos terapêuticos de inibição selectiva de vírus humanos, especificamente de HIV, sem toxicidade significativa para as células normais; métodos de inibição, de atraso ou de prevenção de infecção por HIV; métodos de prevenção ou de tratamento do complexo relacionado com SIDA e de afecções relacionadas com SIDA em humanos; métodos de tratamento de fluídos biológicos humanos, de produtos de células e de tecidos para prevenção ou paragem da infecção ou da contaminação por HIV; e métodos de correcção de lesões específicas associadas com HIV, incluindo perda de receptores de interferão nas células do sistema imunitário, todos baseados na restrição ou na redução da sintetase 2'-5'A intracelular, na inactivação da RNase L e na redução ou perda de RNAdc’s intracelulares em células selecciona das do sistema imunitário. 0 âmbito da presente invenção também inclui um processo para a preparação de composições veterinárias para o tratamento de animais.

A utilização de ã correcção de lesões específicas associadas HIV, incluindo perda de RNase L e de enzimas (por exemplo, quinase de proteína) em várias

ARNdc está adaptado com infecções por dependentes de ARNas células críticas do sistema imunitário, restrição ou redução de sintetase de 2'-5'A intracelular em várias células críticas no sistema de defesa imu nitário ou do corpo e redução ou perda de ARNdc intracelular e redução ou perda de oligõmeros 2'-5'A bioactivos em várias células críticas do sistema de defesa imunitário ou do corpo.

Perturbações na,Primeira Linha de Defesa celular (via 2¹—5' oligoadenilato) na SIDA vários estudos indicam que a via bio-sintética 2'-5’ oligoadenilato (também referida na literatura médica como a via de interferão 2'-5') funciona deficientemen te na SIDA. Esta via constitui uma parte integral do sistema de defesa do organismo contra as infecções. Na SIDA e em vários estados antecedentes (por ex. ARC) ou na LAS (síndrome de linfadenopatia), os enzimas/factores da via bio-sintética são ligados ou activados mas o vírus da SIDA continua a multiplicar-se. Por exemplo, o nível de interferão é normalmente elevado e a concentração de enzima sintetase de 2-5A ê também elevada. No entanto o mecanismo destes aumentos e, em particular, a deficiência da via, activada pelo menos em parte, para inibir o HIV pelo menos em algum grau, constituíam um enigma completo antes da realização dos estudos relatados na presente memória descritiva.

Como resultado das minhas investiga ções, identifiquei um inibidor secundário em relação ã infecçao por HIV e verifiquei que este inibidor paralisa o mecanismo de defesa antiviral, contribuindo para a manifestação da SIDA no seu aspecto integral.

A Figura 1 permite uma caracterização da RNase L em pacientes com ARC/SIDA que rapidamente libertam a carga de HIV no sangue periférico durante a terapia por (R) meio de ARNdc (AMPLIGEN , uma marca registada de HEM Reasearch, INC. de Rockville, Maryland, EUA). A presença ou a ausência de RNase L em extractos citoplãsmicos de células mononucmeares de sangue periférico de pacientes (PBMC) foi determinada pela capacidade de gerar produtos de cisão específica (PCE) de ARNr 28S e 18S de acordo com as técnicas de K. Kariko e J. Ludwig, Biochem. Biophys. Research Comminication, volume 128, p. 695, 1985; D.H.

Wreschner et al., Nucleic Acid Research, volume 9, p. 1571, 1981. O ARN ribossomal (contendo duas espécies moleculares designadas por 28S e 18S) comporta-se de modo similar a ARN virai (p. ex., HIV) no facto de ser susceptível de ser cindido pela RNase L activada mas não pela RNase L inactiva. A RNase L activada é carac terizada por possuir ligada à respectiva estrutura molecular uma preponderância de oligómeros 2-5A e escassa ou nenhuma ligação de inibidor. Os resultados destes estudos são apresentados na Fi gura 1, uma fotografia de uma placa de electroforese em gel de poliacrilamida. 0 Quadro 1 apresenta os resultados reunidos de 10 pacientes tratados com Ampligen.

Incubaram-se extractos de células HL929 (RNase L menos), usadas para fonte de ARN ribossomal, durante 1 hora na ausência (Pista 1) ou na presença (Pista 2) de extractos citoplâsmicos de PBMC dum indivíduo saudável usado como termo de comparação ou de pacientes com ARC e com SIDA (identificados por meio de código) antes de tratamento com Ampligen (as Pistas 3 e 4_ são amostras de pré-tratamento dos pacientes 3 e 7, respectivamente) . As Pistas _1, _3 e ,4 não apresentam qualquer evidência de RNase L activada, conforme se indica pelas ban das na área ou nas áreas de PCE do gel. As células HL929 foram depositadas na American Type Culture Collection sob o número de acesso _______ nos termos do Tratado de Budapeste,

Antes do tratamento, os extractos de todos os pacientes com ARC e SIDA também não mostravam qualquer activação (não mostravam PCE) mesmo quando se forneceram oligoadenilatos /2’ 5' -pgAg (10 M)_7 bioactivos endógenos (os geis não são apresentados), o que confirma que não existem moléculas funcionais de RNase L nos linfôcitos dos pacientes antes do tratamento com Ampligen. Em contraste com estes resultados, quando se efectuou o tratamento com Ampligen, observou-se in vivo uma activação progressiva da RNase L: no paciente com ARC n9. 3 (Pista 5. a 8 semanas e Pista 6 a 16 semanas de tratamento); no paciente com SIDA n9. 7 (Pista Ί_ ^a θ semanas) e nos vários pacientes do Quadro 1 (o gel nao é apresentado). As flechas indicam posições de produtos de cisão específicos (PCE) de RNase L. Apenas no paciente numero 5 não se verificou a activação de RNase L como consequência da terapia com ADNdc e, como resultado provável, este paciente morreu de uma segunda infecçao oportunista.

Caso 1 - A via biológica em indivíduos normais, incluindo os que conseguiram ultrapassar uma infec ção por HIV, ê apresentada na Figura 2.

Caso 2 - Na SIDA e nas doenças.ante cedentes incluindo ARC, LAS, indivíduos seropositivos em relação a HIV assintomáticos que progiedem em direcção a uma SIDA, ate. (veja-se a Figura 2) — os passos /A/, /B7 e ZC.7 são ultrafuncio nais porque a RNase L está ligada a um inibidor /o passo D não está funcional/ ® ^η^ο pode completar a via de bio-síntese; por conseguinte a via de síntese não se completa devido à ausência de uma regulação retriactiva (feedback control) e o HIV multiplica-se mesmo na presença de altas concentrações de interferão de sintetase de 2-5A e de oligõmeros 2-5 bioactivos (são especialmente activos os trímeros e os tetrâmeros de 2-5A).

Resultados experimentais — Observou-se em primeiro lugar que os oligõmeros de 2-5A estavam presentes em concentrações significativas em linfócitos de indivíduos não tratados em todo o espectro clínico da SIDA. No entanto, ao contrário do que se passa com os indivíduos normais (Pista 2 do gel de poliacrilamida na Figura 1), a RNase L era inactiva em preparações de pacientes com ARC e SIDA (pistas 3 e 4). Observei ainda que, quando se obtinham preparações de RNase L inactiva a partir de pacientes com ARC ou SIDA e se se lavavam estas preparações a fundo (antes da análise), incluindo o uso de ãcido tricloroacético (TCA), a preparação de RNase L readquiria então a funcionalidade, isto ê, catalisava a cisão específica (designada PCE nos geis) ou ARN macromolecular, sendo então designada por RNase L activa. Por meio de uma série de experiências de reconstituição determinou-se que um inibidor da RNase L tinha sido eluj do ou se tinha desprendido e que este inibidor, se novamente adi cionado, teria um efeito de terminar novamente, isto ê, de inibir, a reacção da RNase L.

Os factos observados até este momen to indicam que o estado da RNase L celular (activa ou inactiva) constitui um parâmetro importante de prognóstico de HIV e que programas de tratamento específico com ARNs de dupla cadeia podem causar a regressão destas lesões de HIV específicas. Trataram-se indivíduos distribuídos num espectro clínico desde portadores de HIV assintomãticos (p. ex., o paciente número 8, Quadro 1), passando por pacientes nas primeiras fases da doença.(p. ex., ARC ou LAS; pacientes 2, 3, 9, 10, 1 e 4) até doentes com SIDA completamente estabelecida com ARNdc a fim de determinar se o inibidor podia ser forçado a desligar-se da RNase L, com a esperança de que um tal acontecimento molecular podesse levar a uma redução da carga de HIV e a melhoras clínicas consideráveis. Tra taram-se os indivíduos (com cerca de 60 quilogramas de peso) duas vezes por semana com 50 a 250 mg de um ARNdc específico designado por Ampligen. Ê sabido que a sintetase de 2’-5’-oligo-A é uma enzima dependente de ARNdc e concluiu-se que poderia ser possível deslocar esse inibidor da RNase L por um aumento gradual da concentração intracelular de oligõmeros 2'-5* específicos bioactivos por meio da utilização de um ARNdc artificial (sintético).