PT87555B

PT87555B - Processo para a preparacao e isolamento de esplenina humana e de composicoes farmaceuticas que a contem

Info

Publication number: PT87555B
Application number: PT87555A
Authority: PT
Inventors: Gideon Goldstein; Tapan Audhya
Original assignee: Ortho Pharma Corp
Priority date: 1987-05-22
Filing date: 1988-05-20
Publication date: 1992-09-30
Also published as: EP0292302A2; US4923964A; EP0292302A3; KR880013971A; PT87555A; JPS6410000A

Description

DESCRIÇÃO

Antecedentes da invenção

1. Domínio da invenção

A presente invenção refere-se em geral a proteínas recentemente isoladas e mais em particular a proteínas quer iso ladas sob forma purificada a partir do baço humano quer sinteti zadas quimicamente e a composições terapêuticas que a contém.

2. Descrição do estado da téonioa

Foram isoladas proteínas imunomodulatórias isoladas a partir do baço e do timo do bovino e foram analisadas para se determinar as suas sequências de resíduos de ácidos aminados. Além disso foram sintetizados quimicamente pequenos peptídeos que mimam a actividade biológica das proteínas isoladas de ocor rência natural e foram modificados para apresentarem atributos adicionais como por exemplo resistência a acção enzimatica. Foram publicados até agora numerosos artigos e patentes relaciona

dos com estas proteínas e estes peptídeos sintetizados. Em particular ver, por exemplo, Goldstein, G. (1974) Nature (Londres) 247, 11-14? Basch,R.S. e Goldstein, G. (1974) Proc. Natl. Acod. Sei. U.S.A. 71, 1474-1478; Scheid, M.P., Goldstein, G. e Boyse, E.A. (1978) J. Exp. Med. 147, 1727-1743; Scheid, M.P., Goldstein, G. e Boyse, E.A. (1975) Science 190, 1211-1213; Ranjes, G.E. Scheid, M.P., Goldstein, G. e Boyse, E.A. (1972) J. Exp. Med. 156, 1057-1064;Vankatasubramian, K., Andhya, T. e Goldestein, G. (1986) Pric. Nat. Acul. Soi. U.S.A. 83, 3171-3174; Malaise M.G.,Harz-Hazelstein, M.T., Beuter, A.M., Vrinds-Geort, Y., Goldstein &., e Pranchint, Ρ. (19θ6) Immunoregulatory UCLA Symposium on Molecular and Celular Biology, eds. Goldstein, G., Wigzell, H. e Bach, J.P. (liss, New York), no prelo; Sunshine, G.H., Basch, R.S. Coffey, R.G. Cohen, K.W., Goldstein, G. e Wad den, J.W. (1978) J. immunol. 120, 1594-1599· Ver também as Patentes Norte-Americanas 4 190 646; 4 261 886; 4 361 673;

420 424; 4 629 723 e 4 505 843.

A hormona esplenina (SP) obtida a partir de baço de bovino foi descrita em Audhya et al. Biochemistry, 20, 6195-6200 (I98I). Conforme descrito na presente invenção, determinou-se que a esplenina de bovino (bTP) é um peptídeo de 49 resí duos de ácidos aminados possuindo uma sequência de resíduos de ácidos aminados diferindo da timopoietina de timo de bovino (bTP) por dois resíduos de ácidos aminados nas posiçães 34 e 43. Esta diferença é significativa uma vez que se crê que a posição 34 se encontra dentro da região do local activo da proteí na e uma modificação nessa região afectará as especificaçães do receptor e a actividade biológica da molécula.

Bnbora se tenha realizado uma intensa investigação em ligação com a SP de bovino, até agora, no entanto, a (hSP) não tinha sido ainda isolada a partir do tecido de baço humano e, como e evidente, também a proteína não tinha sido completamente sequenciada ou sintetizada.

Sumário da invenção

A presente invenção refere-se à proteína esplenina

_ humana substancialmente isenta de material nativo que não seja esplenina humana, isto é, isenta de material associado com a proteína no seu meio natural no baço humano. Em particular a presente invenção refere-se a esplenina humana isolada ou sinte tizada tendo a sequência de resíduos de ácidos aminados: -GLY-LEU-PRO-LYS-GLU-VAL-PRO-ALA-VAL-LEU-THR-LYS-GLN-LYS -LEG-LYS-SER-GLU-LEU-VAL-ALA-A5N-ASN-VAL-THR-LEU-PR0-ALA -GLY-GLU-MET-ARG-LYS-ALA-VAL-TYR-VAL-GLU-LEU-TYR-LEU-GLY -SER-LEU-THR-ALA-GLU-HIS-.

Adicionalmente, a presente invenção refere-se a uma composição terapêutica contendo uma quantidade terapeuticamente eficaz de hSP com a sequência acima mencionada e que pode inclu ir entre outros ingredientes uma substância veicular farmaceuti camente aceitável. Especificamente, esta quantidade de polipeptídeo terapeuticamente eficaz pode ser de pelo menos 1 a 1000 jig/kg de peso corporal.

De acordo com um outro aspecto da presente invenção, a composição terapêutica descrita anteriormente pode ser utilizada no tratamento de diversas condições relacionadas com a referida actividade biológica da hSP, como por exemplo para corri gir as condições resultantes de dificiências relativas ou absolutas do timo ou do baço. A composição pode ser utilizada para induzir algumas reacções desejáveis relacionadas com a activida de biológica da hSP, tais como induzir a diferenciação e matura ção de células T ou das células B.

Breve descrição dos desenhos

A Figura 1 ilustra graficamente o resultado de cromatografia de crivo molecular em Sephadex G-75 de extractos de esplenina humana com medição do material imunoreactivo por RIA para bTP. Os picos de peso molecular mais baixo foram ainda purificados a fim de se obter a hSP;

A Figura 2 ilustra graficamente o resultado de separação do produto resultante da digestão com CNBr da hSP dis• solvido em ácido ortofosfórico a 0,1 % numa coluna de fase in* versa C-^θ (Vydec 218TP54, 46 mm x 25 cm) com um caudal de «'•KJBfc,

ml/min. Os picos são designados por I, II e III. A linha de gradiente representa a presença de solvente orgânico;

A Figura 3 ilustra graficamente os rendimentos repetitivos de ácidos aminados derivatizados com feniltio-hidantoína durante uma degradação de Edman automatizada da hSP duran te 46 ciclos;

A Figura 4 ilustra o perfil da eluição do produto de digestão por tripsina da hSP maleada numa coluna Mono Q HR 5/5 (Pharmacia) utilizada num sistema de HPLC. Foram detectados cinco picos principais contendo peptídeos por absorção de UV a 254 nm. Estes picos são designados por I a V; e

A Figura 5 ilustra as sequências integrais de resíduos de ácidos aminados para a hSP em comparação com a hTP, a bTP e a bSP. As dez espécies de resíduos específicos comuns à TP e à SP cada espécie são apresentadas com pontilhado forte nas sequências humanas. Dentro da região de local activo (32-36), a bTP e a hTP são idênticas, mas a bSP e a hSP diferem na posição 34.

Descrição pormenorizada da invenção

Na presente descrição serão utilizadas as seguintes abreviaturas: SP, esplenina; hSP, SP humana; bSP, SP de bovino; FPLC, cromatografia em fase líquida rápida de proteína. Além disso, ao longo da presente descrição os ácidos aminados componentes dos peptídeos e alguns compostos utilizados na sua prepa ração são identificados por abreviaturas para facilitar a exposição. Essas abreviaturas são as seguintes:

Abreviatura

Acido aminado

L - alanina	ALA
D - alanina	D-ALA
L - arginina	ARG
D - arginina	D-ARG
ácido L-aspártico	ASP
ácido D-aspártico	D-ASP
ácido L-gLutâmico	GLU

ácido D-glutâmico	D-GrLU
D-glutamina	D-GLN
L-histidina	HIS
D-histidina	D-HIS
L-isoleuoina	ILE
D-isoleucina	D-ILE
L-leucina	LEU
D-leucina	D-LEU
L-lisina	LYS
D-lisina	D-LYS
eí-m e tilalanina	AIB
L-fenilalanina	PHE
D-fenilalanina	PHE
L-prolina	PRO
L-triptofano	TRP
D-triptofano	D-TRP
L-valina	VAL
D-valina	D-VAL

No seu aspecto mais vasto a presente invenção refere-se a esplenina humana sob uma forma substancialmente isenta de material nativo, isto é, quer isolada a partir do baço humano quer sintetizada, e a composições farmacêuticas que a contêm.

Isolamento e caracterização da esplenina humana esquema para isolamento de hSP de esplenina humana ê ilustrado mais completamente pelo diagrama de fluxo, Esquema 1 apresentado a seguir:

- 5 Esquema 1

Diagrama de fluxo para isolamento de hSP de tecidos humanos

Baço humano fresco

Extracção por bicarbonato de amónio (100 mM) e centrifugação

Ψ

Sobrenadante

Ultrafiltração (XM100)

Concentração (UM-2 ou YM2) do produto da ultrafiltração

Ψ

Proteínas retidas (P.M. 2 1000-100.1000) Filtração em gel Sephadex G-75

Proteína imunorreaotiva (P.M.-3OOO-8OOO) Proteínas de alto

Cromatografia hidrofóbica (HPHT em Bio-Gel)

P.M. (não caracterizadas)

SP imunorreaotiva

Ubiquitina

FPLC preparativa (permuta aniónica) v

SP bruta

Cromatografia de fase inversa de emparelhamento iónico ^:ί»

Baços humanos obtidos a partir de especimens cirúrgicos ou de autópsia foram cortados e armazenados a -35°C. Os materiais de separação e a aparelhagem foram adquiridos comercialmente; Sephadex (Pharmacia), hidroxiapatite (Bio-Gel HPHT; Bio-Bad) e coluna de preparação de permuta aniónica de poros largos (2,5 x 25 cm; DB 500, dimensão de partícula 40-60 μ) para HPLC (Separation Industries, Metuchen, NJ).

A purificação da hSP foi seguida através da utiliza ção de uma técnica de BIA para bTP que apresentava reacção cruzada com a hSP (Goldstein, G. (1976) J. Immunol. 117, 690-692 e Liai, P.J., Teipel, J.W., Goldstein, G. & Schiffman, M. (1980) Clin. Chem· Acta 107, 111-119)· Besumidamente, a bTP foi marcada com ¹² j ρ_θΐο método de Bolton-Hunter (Bolton, A.E. & Hunter, W.M. (1973) Bioohem. J. 133, 529-539), e a bTP marcada radioacti vamente foi purificada conforme descrito (Audhya, T., Talle, M. A. & Goldstein, G. (1984) Arch Biochem. Biophys. 234, (167-177). 0 anticorpo anti-bTP (diluído 1:10 000) e bTP marcada com (10 000 cpm) foram incubados na presença ou na ausência de várias fracções de peptídeos em tampão de fosfato, durante 8 h a 22 C. A separação da bTP ligada e livre foi levada a cabo com 24$ de polietileno glicol à temperatura ambiente, seguida de centrifugação a 2000 rpm durante 15 min. A bTP ligada foi anali sada num espectómetro LKB γ.

Uma porção de 9000 g de esplenina humana foi extraí da em bicarbonato de amónio 100 mM gelado /”25$ (peso liquido) contendo 50 ng de 2-mercaptoetanol, 175 pg de fluoreto de fenil metilsulfonilo e 375 pg de BDTA por nQ/ por homogeneização num misturador Waring (Dynamics, New Hartford, CT). Após centrífuga ção a 14 000 x g durante 10 min a 4°C, o sobrenadante foi filtrado através de gaze e armazenado a 4°C após adição de timerosal a 0,1$ e de azida de sódio a 0,1$. 0 extracto foi processado através de um módulo de fibras ocas Amicon HlOxlOO e em seguida concentrado numa membrana Diaflo ΎΜ2 num sistema de ultra filtração de canais finos.

Esquema 1 (acima) resume os procedimentos para o isolamento. 0 retentado da filtração por UM2 ou ΎΜ2 foi cromato

grafado em Sephadex G-75 de tipo de esferas (tamanho de partícu la 40-120 /im) à temperatura ambiente numa coluna de 5 x 150 cm em bicarbonato de amónia 50 mM. As fracçoes imunorreactivas foram liofilizadas. Verificou-se a ocorrência de dois picos principais contendo material imunorreactivo. (Fig. 1). 0 pico de pe, so molecular inferior (P.M. 5000-8000) foi ainda processado por cromatografia de coluna de hidroxiapatite utilizando Bio-Gel HPHT (coluna de 2,5 x 60 cm; tampão de fosfato de sódio 5 mM, pH 6,8) sendo a amostra aplicada no mesmo tampão. A eluição foi realizada com 30 ml do mesmo tampão e a seguir com 35 ml de tam pão de fosfato 50 mM. As fracçoes imunareactivas foram reunidas» concentradas numa membrana Amicon Diaflo UM2, dessalinizadas nu ma coluna de Sephadex G-25 (fino) 0,6 x 30 cm em bicarbonato de amónia 10 mM (pH 8.0) e liofilizadas.

Após cromatografia em coluna de hidroxiapatite foi realizada uma cromatografia em fase líquida rápida de proteína (FPLC) oom uma coluna Mono Q HR 5/5 (Pharmacia). A eluição foi realizada oom mono etano lamina 20 mM (pH 9,5) e um gradiente linear terminando com NaCl 0,3 no mesmo solvente. As fracçoes eluidas foram parcialmente evaporadas, liofilizadas e reconstituídas em 500 μΐ de bicarbonato de amónio. Analizaram-se alíquo tas de 10 pl em duplicado por RIA e as fracçães imunorreactivas foram reunidas e liofilizadas.

Os rendimentos das diferentes fases da purificação são apresentados no Quadro 1.

— 8 —

Quadro 1. Sumário da purificação da hSP

Total de Proteína imu-

Fase da purificação	proteínas» norreactiva	Vezes Purificada	Rend %
mg	mg	%
Proteína ultrafilt.	230,9	134,7	0,05	1	100
Filt.em gel em G-75	305,8	97,3	3,2	650	72*
Cromatog.hidrofób.	148,5	66,3	45	900	49
FPCL preparativa	22,5	17,4	77	1540	12,9
Cromatografia de fase	6,8	6,1	90	1800	4,5

inversa * Pico de peso molecular mais baixo.

A análise de ácido3 aminados foi levada a efeito com um analisador de ácidos aminados Liquimat III a seguir a hidrólise ácida em HC1 5,7 M contendo 0,5 % de 2-mercaptoetanol durante 22 h a 100° C (Speokmann, D. H., Stein, W.H. & Moore, S. (1985) Anal. Chem. 30, 1190-1206).

Preparou-se hSP maleatada por adição de anidrido ma leico em 1,4-dioxano (100 gl) e adicionou-se num excesso de 20 vezes em relação aos grupos amina livres dos peptídeos (500 gg), que foram dissolvidos em borato de sódio 100 mM (pH 9,3). Adicionou-se anidrido maleico a pouco e pouco ao longo de um perÍ£ do de 4 h, mantendo-se um pH de 9,3 com NaOH 6 Μ. A proteína ma leatada foi então dessalinizada em B10 Gel P-2 em NH^HCO^ 100 mM (pH 8,2) e liofilizada.

Foram levadas a cabo digestões trípticas da hSP maleatada em tampão de acetato de N-etilmorfolina 0,2 M (pH 8,1) a 37° C durante 6 h. A tripsina pancreática de bovino (tratada com cloreto de difenilcarbamilo; 8400 unidades de éster de etilo de NK-benzoil-L-arginina por mg de proteína, Sigma tipo XI) foi adicionada ate uma proporção final de enzima/substrato de

ljlOO (numa base de peso). A mistura foi em seguida liofilizada.

A hSP (200 pmol) foi tratada com CNBr em 150 /al de ácido fórmioo a 70 % durante 23 h à temperatura ambiente ao abrigo da luz; foi utilizado um excesso molar de 200 vezes de CNBr sobre o conteúdo de metionina na amostra. 0 volume foi então reduzido para 60 p.1 em atmosfera de N₂ e aplicado directamen te no filtro de vidro do sequenciador de fase gasosa (Hunkapiller, M.W., Hewiok, R.M., Dryer, W.J. & Hood, L. (1963) Methods Enzymol. 91, 399-413).

Os peptídeos digeridos por tripsina e tratados com CNBr foram purificados da seguinte maneira. Os peptídeos trípti cos foram dissolvidos em ácido ortofosfórico a 0,1 % (pH 2,2) e foram centrifugados a 15 600 x g durante 5 min; 0 sobrenadante foi aplicado à ooluna de fase inversa C^g /Vydac 218TP54, 46 mm x 25 cm, dimensão de partícula 5 pm, (The Separation Griup, Hesperia, CA)_7 para HPLC (módulo de gradiente de LDC com espectromonitor II e integrador assistido por computador CI-10 ligado a um colector de fracções LKB Redirão 2112). Utilizou-se um gradiente de eluição linear começando com ácido fosfórico a 0,1 % e terminando com 80% de acetonitrilo. 0 acetonitrilo de alto grau de pureza foi obtido de Burdick e Jackson (Muskegon, MI) e destilado em vidro. 0 ácido fosfórico (1 %) foi filtrado através de um filtro tipo HA 0,45 um Millipore (Millipore). Foram eliminados todos os gases dos solventes durante 20 minutos sob váculo oom agitação.

Foram realizadas análises de sequenciação automática em hSP intacta e em fragmentos de hSP obtidos por tratamento com brometo de cianogénio por sequenciação em fase gasosa utili zando um sequenciador de fase gasosa applied biosystems modelo 470A com Polybrene como substância veicular e um programa normal de acoplagem simples e de hidrólise simples. Os ácidos aminados resultantes derivatizados com feniltio-hidantoína foram identificados por HPLC com um cromatógrafo líquido de alta press são Hewlett Packard 1084B (Sohlesinger, D.H. (1983) Methods Enzymol. 91, 494-502).

A análise C-terminal da hSP (150 p.g cada) foi levada a cabo com carboxipeptidase Y de levedura (2 nmol) dissolvida em 100 mM de acetato de sódio (pH 6,0) a 37° C. A diversos períodos foram removidas as alíquotas do digerido e adicionadas a tubos contendo pl de ácido acético glacial e a mistura foi en tão liofilizada. A amostra foi dissolvida em citrato de sódio 0,2 M (pH 2,2) e aplicada no analisador de ácidos aminados. Aplicaram-se também brancos de enzimas e de peptídeos.

Como resultado dos métodos acima descritos, aproximadamente 9 kg de baço congelado de fresco deu um rendimento de 6 mg de proteína homogénea (rendimento de 4,5 Quadro 1). Por electroforese analítica de disco de gel a pH 8,9 e 4,3 obteve—se uma banda fina simples com um ponto isoeléctrico de 6, + 0,15.

A composição em ácidos aminados é apresentada no

Quadro 2.

Composição em ácidos aminados da hSP (razões molares)

Ácidos aminados Determinado Média + DP*

ácido cisteíco	0	ND
Acido aspartico	2	1.78 + 0.13
Trionina	3	2.86 + 0.18
Serina	2	1.84 + 0.13
Ácido glutâmico	7	7.36 + 0.42
Prolina	3	2.56 + 0.18
Glicina	2	2.22 + 0.14
Alanina	5	4.84 + 0.17
Valina	6	5.62 + 0.27
Metionina	1	0.89 + 0.14
Isoleucina	0	0.21 + 0.12
Leucina	8	8.41 + 0.41
Tirosina	2	1.69 + 0.19

Fenilalanina	0	0.22 + 0.10
Lisina	5	5 · 36 0 · 34
Histidina	1	0.96 + 0.13
Arginina	1	1.16 + 0.12

ND, não detectado.

«Media de duas determinações (24 e 76 h). A serina foi aumentada de 10 % e a treonina de 5 % para compensar a destruição pelo ácido. Realizou-se a hidrólise com HC1 em fervura constante a 110° C sob vácuo.

tratamento com CNBr da hSP deu origem a três picos (Fig. 2). A sequência de ácidos aminados e os resultados pa ra cada um estão resumidos no Quadro 3.

Digestão tríptica de hSP maleado e separação de frag mentos. Por digestão tríptica com anidrido maleico da hSP foram obtidos cinco picos distintos em HPLC (Fig. 4). As regiões das sequências do peptídeo em cada pico são resumidas no Quadro 3.

Quadro 3

Métodos de determinação das sequências para as várias regiões da hSP.

Método de sequenciação Resíduos identificados

Degradação N-terminal

Cisão por CNBr de	SP nativa	1-34
Pico	I		1-16
Pico	II		32-39
Digestão	tríptica	de SP maleatada
Pico	I		1-15
Pico	II		8-20
Pico	III		37-47
Pico	IV	Não se	obtiveram sequências
Pico	V		18-30
Método da carboxipeptidase C-terminal	45-48

A determinação da estrutura da hSP foi levada a cabo da maneira que se segue. A hSP (110 pmol) foi submetida a análise automática de sequência em fase gasosa por degradação de Eãman e foram efectuadas identificações contínuas através dos 34 resíduos N-terminais. 0 rendimento médio por ciclo foi de 90,2 % e os rendimentos medidos de alguns resíduos são apresentados na Fig. 3. A sequência C-terminal (Quadro 4) da proteína intacta foi determinada com oarboxipeptidase Y resultando líber tação de ácidos aminados dependente do tempo. A sequencia C-ter minai de -Ala-Glu-His-COOH- proporcionou uma sobreposição de uma sequência de dois ácidos aminados com a sequência do pico II obtida a partir de uma digestão tríptica de hSP maleatada (Fig.

4). As composições de ácidos aminados da hSP e os fragmentos ob tidos quer de cisão por CNBr quer por digestão enzimática foram concordantes com as determinações da sequência N-terminal e a conclusão da sequência por análise com carbopeptidase.

Quadro 4. Libertação de ácidos aminados livres em função do tem po da extremidade C-tenainal com oarboxipeptidase Y

Ácido aminado

Ala

Glu

His

Rendimento dos ácidos aminados, nmol lOOs 120s 150s 200s 250s 300s hSP

- - - 0.32 - 0.80

0.27 - - 0.80 - 0.80

0.91 - - 0.80 0.90

Resumo do isolamento e da caracterização da hSP

A reactividade cruzada dos anticorpos anti-bTP já foi anteriormente utilizada para detectar e isolar o polipeptídeo bSP estreitamente relacionado (Audhya, T., Schlesinger, D.H. & Goldstein, G. (1981) Bio-Chemistry 20, 6195-6200). De modo si. milar, os anticorpos para a bTP mostraram ter reactividade cruza da com a hSP β utilizou-se uma técnica de RIA de bTP para seguir o isolamento da hSP a partir de extractos de timo e de baço humano respectivamente. 0 processo de isolamento envolveu a . extracção de tecidos em solvente aquoso, uma ultrafiltração pa- 13 ra a dimensão aproximada, uma cromatografia hidrofóbica e FPLC de permuta aniónica. Aproximadamente 50 % do material imunorreaç tivo no extracto estava presente numa forma de peso molecular mais alto que-provavelmente representa uma forma percursora bio logicamente inactiva (Steiner, D.F. & Oyer, P,E. (1967) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 57, 473-480). Esta foi separada por crivagem molecular em Sephadex 0-75.

rendimento em esplenina de 4,5 % (purificação 1800 vezes)(Quadro 4) era comparável aos rendimentos em bSP (Audhya, T., Schlesinger, D.H. & Goldstein, G. (1981) Biochemis try, 20, 6195-6200). A pureza do hSP foi determinada por electroforese em gel de poliacrilamida, por HPLC e pela sequência de ácidos aminados.

Os resíduos 1 a 34 foram determinados por degradação de Edman automática com um sequenciador de fase gasosa,com confirmação dos resíduos 1 a 16 a partir de um fragmento da cisão por CNBr e a extensão da sequência 32 a 39 foi determinada a partir do outro fragmento da cisão por CNBr. Beste modo foi obtida uma confirmação independente da região do local activo da hSP, o qual e diferente do da hSP e também quer da bTP quer da hTP (ver abaixo). A sequência que restou foi determinada por degradação de Edman dos fragmentos produzidos por digestão tríja tica de hSP maleatada (resíduos 1-15, 8-2018-30 e 37-47) e por digestão com carboxipeptidase retardada. A clivagem tríptica da hSP maleatada deu origem a fragnentos que representam as cisões entre os resíduos 7-8 (-Pro-Ala-), 17-18 (-Ser-Glu-) e 36-67 (-Tyr-Val-)j não houve qualquer cisão no local protegido 31-32 (4tet-Arg-). Nós somos incapazes de explicar estas cisões anómalas para além de que se podem ser atribuídas a contaminação por enzimas na preparação da tripsina e não à própria tripsina.

De acordo com a Figura 5, a hSP e a timopoietina humana (hTP) (tal como descrito num pedido de Patente relacionada com o N.fi de Serie , depositado no mesmo dia e aqui incorporado por referência) eram muito semelhantes na sequência de ácidos aminados, sendo tanto uma como a outra polipeptídeos lineares de 48 ácidos aminados diferindo só em 4 re-

síduos, nas posições 23» 34» 43 e 47. São também idênticas à bTP e à bSP (esplenina bovina), sendo idênticos 10 resíduos na hTP e na hSP mas diferentes dos resíduos comuns na bTP e na bSP nestas posições. Estas comparações confirmam que as sequências de ácidos aminados da hTP e da hSP foram realmente determinadas e indicam que a conversão do gene deve ter ocorrido durante a _e volução para manter a evolução sequencial paralela destes dois polipeptídeos dentro de cada espécie. Outros sistemas de genes importantes que utilizam a conversão de genes incluem a imunoglobulina (Schreier, P.H., Bothwell» A.L.M., Muller-Hile, B. & Baltimore, D. (1981) Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 78, 4495-4499) s a maior parte dos genes do complexo de histocompatibilidade (Steinmetz, M. & Hood, L. (1983) Scienci 222, 727-733).

A conservação de evolução paralela de regiões da TP e da SP fora da região de local activo (resíduos 32-36) implica que estas regiões C e N-terminais da molécula têm também de ter uma função importante, com exigências idênticas quer para a TP quer para a SP mantidas dentro de cada espécie.

Sabe-se que os resíduos 32 a 36 de bTP representam o local activo, possuindo o pentapeptídeo sintético TP-(32-36) correspondente TP-5 as actividades biológicas da TP em animais e no homem (Goldstein, G., Scheid, M.P., Boyse, E.A., Schlesinger, D.H. & Van Waue, J. (1979) Scienci 204, 1309-1310, Audhya,

T. , Scheid, M.P. & Goldstein, G. (1984) Proc. Natl Acad. Sei.

U. S.A. 81, 2847-2849)· Os estudos presentes determinam que 0 lo cal activo da hTP (resíduos 32-36) é idêntico ao da bTP de manei ra que 0 TP-5 sintético (Arg-Lys-Asp-Val-Tyr) também representa 0 local activo humano.

A bSP difere da bTP por possuir um resíduo de ácido glutômico na posição 34, em contraste com 0 ácido aspártico nes ta posição na bTP e esta mudança confere as actividades biológi cas contrastantes na bSP e em esplenopentina sintética ou em SP-5 (Arg-Lys-Glu-Val-Tyr) em comparação com a bTP e 0 TP-5. Curiosamente, a hSP possui uma alanina na posição 34, diferindo assim da bSP e da TP. A hSP difere nas suas actividades biológi cas da bSP no facto de induzir a elevação de cGMP intracelular em MOLT-4, uma célula T humana (B. Baker, G. Viamontes, T.A. e

- 15 r

— G.G., dados não publicados), o que não acontece com a bSP. Assim foi previsto que o local activo da hSP seria diferente do da bSP e esta diferença é agora confirmada directamente pela se quência de ácidos aminados.

Deverá notar-se que o peptídeo da presente invenção, além de poder ser isolado a partir do baço humano, pode também ser produzido pela intervenção da mão humana, por exemplo, por via recombinante utilizando técnicas de engenharia genética ou por via sintética utilizando a síntese química. De modo conveniente, os peptídeos podem ser preparados seguindo a técnica sintética de fase sólida descrita inicialmente por Merrifield em JACS, 85, 2149-2154 (1963)· Estes métodos são também expostos em algumas patentes segundo a técnica anterior, às quais se fez referência anteriormente. Podem ser descobertas outras técnicas, por exemplo, em M. Bodanszky, et al., Peptide Synthesis, John Wiley & Sons, segunda edição, 1976, bem como em outros tra balhos de referência conhecidos pelos peritos na técnica. Serão encontrados nos textos, acima citados grupos protectores 'apropriados utilizáveis em tais sínteses e as respectivas abreviaturas, bem como em J.P.W. McOmie, Protective Groups in Organic Chemistry, Plenum Press, New York, 1973. Ambos os livros meneio nados são aqui incorporados por referência. Os grupos protectores .tomuns utilizados neste caso são t-butiloxicarbonilo (BOC), benzilo (BZL), t-amiloxicarbonilo (AOC), tosilo (TOS), o-bromo-fenilmetoxicarbonilo (Brz), 2-6-diclorobenzilo (BZLClg) e fenilmetoxicarbonilo (Z ou CBZ).

Em virtude das características imunomodulatórias dos peptídeos da presente invenção, estes são terapeuticamente úteis no tratamento de seres humanos e animais, uma vez que poes suem a capacidade de induzir a diferenciação e a maturação de células T e de células B, as quais são capazes de participar na resposta imonulógica do corpo. Como resultado, os peptídeos da presente invenção são considerados como possuidores de múltiplas utilizações terapêuticas.

Em primeiro lugar, uma vez que os compostos possuem • a capacidade de realizar algumas das funções indicadas do baço,

estes possuem aplicação em diversas funçães e áreas de imunidade esplénicas. Além disso, os peptídeos da presente invenção são considerados úteis no apoio da imunidade colectiva do corpo devido à circunstância de provocarem o aumento ou auxiliar a esti mulação terapêutica da imunidade celular e por isso são úteis no tratamento de doenças que envolvam infecções crónicas, tais como infecções por fungos ou por microplasmas, tuberculose, lepra, infecções virais agudas e crónicas, bem como outras do género.

Os compostos da presente invenção são em geral considerados como úteis em qualquer área na qual a imunidade celular é uma finalidade pretendida e particularmente nos casos em que há deficiências na imunidade. Assim, quando há um excesso de produção de anticorpos devido a um desequilíbrio entre as cé lulas T e as células B, os peptídeos da presente invenção podem corrigir este estado através do estímulo da produção de células. Assim, prevê-se que tenham utilização terapêutica em algumas doenças autoimunes nas quais são produzidos anticorpos prejudiciais, tais como lupus eritematoso sistémico, artrite reumatóide ou outras do mesmo género.

Na sua aplicação mais ampla, os compostos da presen te invenção são úteis para regulação do sistema imunitário de um indivíduo, humano ou animal, que tenha necessidade de tal re gulação. Na presente descrição, o termo regulação significa que os compostos da presente invenção provocam o regresso do sis tema imunitário de um estado anormal de doença para um estado normal equilibrado. Esta regulação pode muito bem encontrar uma grande aplicação na correcção de deficiências imunológicas (por exemplo, na síndroma de DiGeorge), sendo também aplicável para corrigir condições de excesso de actividade imunológica (por exemplo, doenças autoimunes). A presente invenção inclui assim métodos para regular o sistema imunitário de um indivíduo que tenha necessidade desta regulação que compreende a administração ao referido indivíduo de uma quantidade imunoregulatória eficaz de um dos compostos da presente invenção, bem como composições farmacêuticas para praticar estes métodos.

A presente invenção proporciona também um método de tratamento de condições resultando de dificiências relativas ou absolutas do baço de um indivíduo que compreende a administração ao referido indivíduo de uma quantidade terapêuticamente eficaz de hSP. Tal como utilizado na presente invenção o termo quantidade terapêuticamente eficaz significa uma quantidade que é eficaz para tratar as respectivas condições ou dificiênci as do baço, A presente invenção proporciona também um método pa ra induzir a diferenciação e a maturação de células B e de célu las T que compreende administração ao indivíduo de uma quantida de indutora eficaz de hSP. A presente invenção proporciona ainda composições farmacêuticas para a prática destes métodos.

Para preparar as composições farmacêuticas da presente invenção, a hSP é combinada constituindo o ingrediente a£ tivo numa mistura íntima com uma substância veicular farmacêuti ca de acordo com as técnicas de composição farmacêuticas conven cionais. Esta siibstância veicular pode tomar uma larga variedade de formas dependendo da forma de preparação desejada para ad ministração, por exemplo sublingual, rectal, nasal, oral ou parenteral. Na preparação de composições na forma de dosagem oral quaisquer dos meios farmacêuticos usuais podem ser empregues, tais como, por exemplo, água, óleos, alcoóis, agentes que confe rem sabor, conservantes, corantes e outros do mesmo género no caso de preparação oral líquida (por exemplo, suspensões, elixi res e soluções) ou substâncias veiculares tais como amidos, açúcares, diluentes, agentes de granulação, lubrificantes, agentes de ligação, agentes de desintegração e semelhantes no caso de preparações orais sólidas (por exemplo, pós, cápsulas e comprimidos). Podem também ser preparadas formas de libertação con trolada. Por causa da sua facilidade de administração, os comprimidos e as cápsulas representam a forma unitária de dosagem oral mais vantajosa, em cujo caso são obviamente empregues subs tâncias veiculares sólidas. Se desejado, os comprimidos poderão ser revestidos com açúcar ou com revestimento entérico segundo as técnicas normais.

Para produtos parenterais, a substância veicular compreenderá normalmente água estéril, além de se poderem in- 18 -

cluir outros ingredientes para ajudar a solubilidade ou para ob jectivos de conservação (por exemplo). Também se podem preparar suspensões injectáveis, em cujo caso podem-se empregar substâncias veiculares líquidas apropriadas, agentes de suspensão e ou tros semelhantes.

A hSP ém em geral activa quando administrada parenteralmente em quantidades superiores a cerca de 1 P-g/kg de peso corporal e, de preferencia, desde cerca de 0,1 até cerca de 10 mg/kg de peso corporal. Em geral a mesma gama de quantidades de dosagem pode ser utilizada no tratamento das doenças ou das con dições mencionadas anteriormente em que se pretende tratar a imunodeficiência. Quantidades maiores (por exemplo), cerca de 10 a 100 mg/kg de peso corporal) são úteis para suprimir excesso de actividade imunitária.

Claims

Processo para a preparação e isolamento de esplenina humana substancialmente isenta de impurezas caracterizado por compreender pelo menos uma das seguintes fases:

(al) expressão a partir de células obtidas por via recombinante usando técnicas de manipulação genética, (a2) síntese química a partir dos ácidos aminados isolados ou de fragmentos peptídicos apropriados, (a3) extracção a partir do baço humano, (b) separação do sobrenadante da cultura ou do extraoto por centrifugação, (c) purificação por ultrafiltração e/ou concentração e/ou cromatografia, (d) liofilização.

- 2ã Processo de acordo com a reivindicação 1, caracteri zado por a esplenina humana obtida ter a seguinte sequência de ácidos aminados.

-GLY-LEU-PRO-LYS-GLU-VAL-PRO-ALA-VAL-LETJ-THR-LYS-GLN-LYS -LEU-LYS-SER-GLU-LEU-VAL-ALA-ASN-ASN-VAL-THR-LEU-PRO-ALA -GLY-GLU-MET-ARGr-LYS-ALA-VAL-TYR-VAL-GLU-LEU-TYR-LEU-GrLY -SER-LEU-THR-ALA-GLU-HIS-.

- 3â Processo de acordo com a reivindicação 1, caracteri zado por a esplenina humana ser extraída do baço humano com bicarbonato de amónio e ser em seguida isolada por um procedimento constituido pelo menos por uma das seguintes fases:

(a) separação do extracto por centrifugação, (b) purificação por ultrafiltração e/ou concentração e/ou cromatografia, (c) liofilização.

•a ₄â —

Processo de acordo com a reivindicação 1, caracteri zado por a esplenina humana ser obtida por síntese química a partir dos ácidos aminados por técnicas de síntese de peptídeos em fase sólida.

- 5â Processo para a preparação de uma composição terapêutica útil para a oorrecção de deficiências absolutas ou rela tivas do timo ou do baço ou para indução da diferenciação ou da maturação das células T ou B caracterizado por se incorporar co mo substância activa uma quantidade eficaz de esplehina quando obtida de acordo com qualquer das reivindicações anteriores.

— 6â Processo de acordo com a reivindicação 5, caracteri zado por se incorporar igualmente uma substância veicular farma ceuticamente aceitável.

20 Processo de acordo com a reivindicação 5, caracteri zado por a quantidade terapêutica de esplenina humana ser de pe lo menos cerca de 1 P-gAg úe peso corporal.