PT91543A

PT91543A - Processo para a preparacao de peptidos flanqueadores

Info

Publication number: PT91543A
Application number: PT91543A
Authority: PT
Inventors: Klaus Muller; Hans Rink
Original assignee: Ciba Geigy Ag
Priority date: 1988-08-26
Filing date: 1989-08-24
Publication date: 1990-03-08
Also published as: DK421589A; JPH02256699A; EP0356395A3; DK421589D0; EP0356395A2; US5354843A

Description

r

0 invento diz respeito a novos péptidos» em particular a péptidos flanqusdores ds procalcitonina humana N-tsrminalg aos seus sais3 a determinadas sequências de DNA e a microrganismos contendo essas sequências de DNA que se encontram aptos para a produção dos péptidos de acordo com o invento.. como produtos intermediários para a preparação dos referidos péptidos5 a um processa para a preparação dos péptidos ou das sequências de DNA? a preparações farmacêuticas contendo os referidos péptidos ou sais dos mesmos? bem como à utilização desses péptidos ou das seus sais como produtos farmacêuticos» Q inventa diz respeita em particular a péptidos de

fórmula I R” A1 a-Pro—Fers-Ar g-~Ser-A x a-Leu-B 1 u~Bev—Ser-

Pro-Ala-Asp-Pro—Ala-Trs-Lsu-Ser-GIu-Asp- (í)

G1u.~ A1a-Arg-Leu-Leu-Leu-A1a-A1a~teu-va1-Gin-Asp-T1r-Va1~8 i n-Me t—Lis—A1a-Ssr~G1u-Leu-G 1 u-B 1 n-S 1U---B l n-B 1 u--fir g-B 1 u-B 1 i -Ser- X-OH em que R representa hidrogénio ou acstila e X a sequência ds ami.no ácidos de fórmula -Ser-Leu-Asp-Ber—Pro—Arg-Ser— Cia) ou da fórmula -Arg-Ile-íle-Ala-Gln em particular péptidos ds fórmula

H-Ala-Pro-Fen-ftrg-Ser-Ala-Leu-Glu-Ser-Ser-Pro-Ala~Asp~Pro~A1a-Tre-Leu-Ser-B1u-Asp-G1 u—A1 a-Ar y-Leu--Leu-Leu-Al a—AI a-Leu-Va 1 -61 n-Asp~T i r-Va 1 -61 n-ffe t-L.is-A 1 a-Ser·~G 1 u-Leu—tí 1 u~G1 n—k>i u—b'l η—Itíl u—Ar-y—B i u—Bl z—tíer—X—UH em que X representa, de prefsrincia, a ssqufncia ds amina ácidos de fórmula (ia) (PCATFPs péptidos flanqueadores de procalcitonina humana amina terminal), que também é designada por PAS-57 (Pèptido Alanina Serina—57), e ainda os de fórmula <Ib> íPCSRPrTFPs péptidos f1anqueadares amina-terminal do pépfcida relacionado com o gene da procalci tonina humana.; bem como os sais dos referidos péptidos.

Em conformidade com as regras de nomenclatura reconhecidas internacionalmente, as abreviaturas representam neste pedido de patente os amino ácidos, por εκεορίο, os que atrás foram referidos, os ácidos livres e, quando nada for indicado em contrário, a sua configuração L» 0 grupo s~ami.no encontra—se respectivamente no lado esquerdo da abreviatura © o grupo carboMi do lado direito. A ausfncia de um átomo de H no grupo s-amino é caractsrisada por um traço de uniSo presente á esquerda da abreviatura do amino ácido, a ausfncia ds um grupo HO no grupo carboíd. é ©«pressa através de um traço ds unilo presente à direita. Os substituintes na cadeia lateral dos amino ácidos livres ou dos seus radicais são colocados entre parfntesis imediatamsnts atrás do símbolo do amino ácido.

Depois da data ds prioridade do presente pedido de patente descobriu-se que os péptidos de acordo com o invento se encontram como tais no organismo humano. Por esse motivo, o invento diz respeito, em primeiro lugar, aos péptidos atrás referidos s aos seus sais numa concentração mais elevada do que aquela que skíbís na natureza ou em eKtractos eventualmente conhecidos. 0 invento diz respeito, em particular, aos péptidos atrás referidos sob uma forma isolada ou enriquecida, sob uma forma simples ou essencialmente simples, num ambiente essencial-mente diferente em relação àqueles que surjem na natureza, isto é, com outras misturas, por exemplo, misturados com veículos *

i' _____ fv farmacêuticos5 numa forma ds utilização farmacêutica adequada., numa forma característica s/ou numa forma que não a da um organismo vivo ou morto* de um órgão, de uma célula* ds um tecida ou ds um liquido corporal* 0 invento refere-se, particuiarmente, a péptidas ds fórmula (I) e aos seus sais produzidos sinteticamente ou obtidos por engenharia genética»

No contexto atrás referida a termo Kisolada” significa separado ds outras substâncias, em particular de outros compostos químicos com os quais as compostos de acordo com o invento podem eventualmente aparecer na natureza» 0 termo "puro” significa submetido a métodos químicos s/ou físicos de purificação* 0 termo "essencialmente puro" significa um grau de pureza superior a 5©% = 0 invento também diz respeito aos sais» em particular aos sais não tóxicos, farfiiacêuticaments aceitáveis das péptidas ds acordo com o invento» Os péptidas atrás referidos podem formar sais de adição de ácidos, por exempla, com ácidos inorgânicos, em particular ácidos minerais, por exemplo, ácido clorídrica, ácido sulfúrico ou ácido fosfórico, ou sais com ácidos carboxílicos, sul fónicos ou sulfo, por exemplo, ácido acético, ácido propiónico, ácido glicólica, ácido succinico, ácida malsi-c:o= ácido hidroximaleico, ácido metiímalsico, ácido fumárico, ácida málico, ácido tartárico, ácido cítrica, ácida benzóico, ácido cinámico, ácido salicílico, ácido 4-amino-salicílico, ácido 2-feno>;ibenzóico5 ácida 2-acstoMibsnzaiccs, ácido embónica, ácido nicotínico ou ácido isonicotinico, e ainda asiino ácidos, tais como ácida metanassulfónica, ácido efcanossulfónica, ácida 2--hi-droxietanossulfónico, ácido etan-1,2-dissulfónico, ácido beze~ nossulfónico, ácido 4-iBetil--benzsnassu.Ifónico ou ácido naftalin--2~sij1 fónico, ou com outras composições orgânicas ácidas, tais como ácido ascórhica» s

Os péptidos atrás referidos podem formar também sais metálicos ou de aíBénios tais como ácidos de metais alcalinos a metais alcalino terrosos, por exemplo, sais de sódio, potássio, magnésio ou cálcio·., bem como sais de amónio com amoníaco ou aminas orgânicas adequadas, situando-se na primeira linha, para a formaçao de sais, mono™, di- ou poli-aminas primárias, secundárias ou terciárias a!ifáticas, cicloalifáticas, cicloalifáticas--alifáticas ou araiitáticas, bem como bases heterocic1icas, tais como alquil inferior amina, por exemplo, trietílamina, hidroxi alquxl inferior amina, por exemplo, 2-hidroxietilamina, bis-(2-hidroxietil>-amina, 2-hidra~etil~dietil-amina ou tri-<2-hidroxie-til )---smina, ésteres básicos alifáticos ds ácidos carboxí1icos, por exensplo, éster 2—dieiilaminostílico de ácido 4-aiTiinobenzáica, alquileno inferior amina, por exemplo, i-stilpiperidina, ciclo-alquilamina, por exemplo, diciclohexilamina, ou hsnzilamina, por exemplo, M,N'-ddibensiletilenodiamina, e além disso bases do tipo piridina, par exempla, piridina, colidina ou quinolina.

Os péptidos acima referidos podem além disso formar sais internos»

Para isolamento ou purificação também podem ser de utilidade sais farmaceut icaroente não adequados» Para aplicação farmacfutica apenas servem, no entanto, os sais não tóxicos farmaceuticamente adequados, que são por isso os preferidos»

Os compostos de acordo com o invento podem ser preparados de maneira conhecida per se» por exemplo a) formando uma ligação amida presente num composto com a sequência de amina ácidos de fórmula I, por raacçSo de um fragmento desse composto, que apresenta um grupo carboxi livre reactivo, ou um seu derivado de ácido carboxílica 7 - Μ*

reactivo, com o fragmento complementar do referido composto,, que apresenta um grupo amino livre, ou com um seu derivado reactivo, em que as grupos funcionais livres nas referidas fragmentos, com a excepçSo dos dois grupos que participam na rsacção, estão, se necessário, numa forma protegida, e removendo os grupos protegidos que possam estar presentes, ou b) propagando células hospedeiras, transformadas com um vsctor de expressão, que contém uma sequência de DMA que codifica a sequência de amino ácidos de fórmula í e que é regulada por uma sequência de controlo de expressão,, s, caso seja necessário, libertando das células hospedeiras um composta com a sequência de amino ácidos de fórmula e isolando, s, quando for necessário, num composto obtido de acordo com o invento, que contém um agrupamento sulfaxido, convertendo este agrupamento num grupo tio, s sempre que se deseje, convertendo o sal obtido de acordo com o processo no composto livre s/οιχ convertendo o composto livre obtido de acordo com o processo num sal„

Processo as De acordo com este processo é ligada, como última fase da rsacçSo, na síntese do produto final, uma combina™ cão amida num lugar qualquer da sequência de amino ácidos de fórmula I, No que respeita ao fragmento referido, pode tratar-se tanto ds um único amino ácido, como de um di-, oliqo- ou poli— -péptido= Esse fragmento, que apresenta um grupo amino livre, representa igualments um único amino ácido, um di-, oligo- ou poli-psptido, - ' V · .

\V A rsacçlo efectua-ss? ds preferencia, ds modo a fassr reagir um derivado de ácido reactivo do fragmento com o fragmento complementar que apresenta um grupo amino livre, podendo assim a oerivatisação do grupo carboxi rio fragmento de ácido carboxílico sfeciuar-se também in siti.u

Qs derivados de ácido carboxilico rsactivos são em primeiro lugar ésteres activados reactivos ou anidridos rsctivos & ainda amidas cíclicas reaetivasj neste caso podem, tsl como se referiu, formar-se derivados de ácido csrboxil iccs reactivo também in„.sitid=

Os ésteres activados são, em particular, ésteres insaturados no átomos ae carbono ds ligação ao radical que se pretende estarificar? por exemplo,, do tipo ésteres vinilicos, tal como os ésteres vinilicos propriamente ditos (que se podem obter, por exemplo, por esterificaçlo de um éster correspondente, com acetato ds vinila? Método da éster vinilico aciivado), ésteres carbamoilvinilicos (que se podem obter, por exemplo, através do tratamento da ácido correspondente com um reagente de isoxazólio;! Método do 1,2-OKacólio ou Método Woodward), ou ésteres i-alcoxi inferior vinilicos (que ss podem obter através da tratamento ac ácido correspondemte com um alcoxi inferior acstilsnop Método do etoxi-acetileno), ou da tipo amidino, tal como ésteres N,N* ~ami~-dino di-substituídos (que se podem obter por tratamento do ácido correspondente com uma carbodiimida -di-substituida adequada, por exemplo, ••-tíiisopropil- ou N?N'-dicicloheK.ilcardiifnida| Método da carbodiimida), ou ésteres amidina di—substituídos (que ss podem obter por tratamento do ácido correspondente com uma cianamida N,M'—di-substituídag Método da cianamids). Os ésteres activados são, além disso, por exemplo, ésteres arilicos adequados, em particular, ésteres fenilicas adequados substituídos através de substituintes que atraiem os electrõss íque ss podem , * ί: ··...··' obter3 por exemplo* por tratamento do ácido correspondente com um fsnol substituído adequado* por B^smplo, 4-nitrofenol* 4—metil— sulfonil-fenol* 2*4*õ-triclorofenol* 233?4555o-pentaclorofsnol ou 4~fsnildiasofsnol5 na presença de um agente de condensação* tal como a WjH'"•diciclohexil-carbodiimidai Método dos ésteres aríli-cos activados)* ésteres cianometílicos (que se podem obter por tratamento do ácido correspondente com cloroacetonitrilo na presença de uma base? Método do éster cianometilico)* tio-ésteres adequados, em particular tio-ésteres fenílicos eventualmente substituídos * por exempla, com nitro (que se podem obter* por exemplo* por tratamento do ácido correspondente com tiofsnéis evsntua 1 asente substituídos, por exemplo* com nitro e também com o auxilio do Método dos anidridos ou das carbodiimitías? Método dos ésteres tiol activados>* ou amino— ou amido-ésteres (que se podem obter por tratamento do ácido correspondente com um composto N-hidroxi-amino ou hidroxi—amido* por exemplo* N-hidroxi-succiní-fliida, M-hidroxi-piperidina* M-hidroxiftalimida ou 1-hidroxi-lH-“bensotriaeol* por exemplo* de acordo com o Método dos anidridos ou da carbodiimidas Método dos ésteres N-hidroxi activados),

Os anidridos ácidos reactivos podem ser simétricos ou* de qreferlncia* anidridos mistos desses ácidos* ou seja* por exemplo* anidridos com ácidos inorgânicos* tais como haletos as ácidos* em particular cloretos de ácidos (que se podem obter* por exemplo* por tratamento do ácido correspondente com um agente cie HalogenaçSo adequado* tal como cloreto de tionilo* psntaciareio de fósforo ou cloreto de oxalilos Método do cloreto de ácido)* acidas (que se podem obter, por exemplo* a partir de um éster de ácido através da hídrasida correspondente e por tratamento da mesma com ácido nítrico? Método da acida)* anidridos com hemi--derivados de ácido carbónico* tal comes os ésteres correspondentes* por exemplo* hemi-ésteres de alquilo inferior ds ácido carbónico (que se podem obter por tratamerstodo ácido correspondente com ésteres de alquila inferior halafórmicas, por exemplo, clorofòrmicos ou com i-alcoxi inferior carbonii-2~aleoxi inferior-t52-ui~hidroquinDlina3 por exemplo» i-alcoxi inferior™ •-'carbonil“2“stoKi“l jS-di-hidroquinolinap Método dos anidrádos mistos ds ácido O-alquilcarbónico)? ou anidridos com ácida fosfórico di--haIoqenado, em especiais di-clorado Cque pode ser obtido, por exemplo, tratando o ácido correspondente com oxiclo--reto de fósforop iiétodo do oxicloreto de fósforo)» ou anidridos com ácidos orgânicos, tais como anidridos mistos cora ácidos csrboaílicos orgânicos (que podem ser obtidos, por exemplo, tratando o ácido correspondemts com um baleio de ácido alcanocar-boxilico inferior ou fenil~alcano~carboxílico inferior substitui™ do ou insubstituídop por exemplo, cloreto de ácido fenilacética., ácido piválico ou ácido trifluoroacético 5 métodos dos anidridos mistas de ácido carboxílico) ou com ácidos sul fónicos orgânicos Cque podem ser obtidos, por exemplo, tratando um sal» tal como um sal de metal alcalino» do ácido correspondente» com um halsto de ácido sulfénico orgânico adequado, tal como cloreto de ácido alcanossulfónico ou arilssulfónico inferior, por exemplo, cloreto de ácido metano— ou p—toluenossulfónícop Método dos anidridos de ácido sulfénico), bem como anidridos simétricos Cque podara ser obtidos por condensaçSo do ácido correspondente na presença de uma carfaodiimida ou de l-dletilaminopropina? Métodos dos anidridos simétricos)»

As araidas cíclicas adequadas sSo, em particular, amidas com ciclos diaza de cinco membros de carácter aromático, tais coma amidas com imidazóis, por exemplo imídazole Cque pode ser obtido» por exemplo, tratando o ácido correspondente cam Ν,Ν'--· •••carbcsniIdiimioazoles Método da imidazolida) ou pirazóis, por exemplo, 3,5-diffletilpirazóis (que podem ser obtidos, por exemplo, por meio da hidrazida do ácido por tratamento com acetilacetonas Método da pirazolida)» 11

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Tal como foi mencionado, os derivados ds ácido csrboxí-li ca pode® também formar-se in situ= Por exemplo, os ésteres de amidino N,N' -di-substituido podem formar-se in si tu fazendo reagir a mistura do fragmento complementar contendo o grupo smino livre e o fragmento do péptido contendo o grupo carhoxi livre na presença ds uma carbodiimida Ν,Μ1-dí-suhstituída adequada, por exemplo, N,N'-diisopropi1- ou Ν,Ν'-dioielohexil-carhodiiffiida. Além disso, os ésteres smino ou amido dos ácidos podem formar-se na presersçs da smina que se pretende acilar fazendo reagir a mistura So ácido correspondente e os materiais de partida aaiino na presença de uma carbodiimida Ν,Ν'-di-substituida, por exemplo, N5N'-dicicloheKÍl- ou Ν,Ν'-diisopropiIcarbodilmida s na presença de uma M~hidroxismina ou N-hidroxismitía, por exemplo, N-hidroxi-succinimida, facultativamsnte na presença de uma base adequada, por exemplo, 4~dimstilaminopiridina= AIternativamente, o processo da variante a) também pode efectuar-ss fazendo reagir um fragmento contendo um grupo carhoxi livre com um fragmento complementar em que o grupo amimo se encontra presente ns forma reactiva§ o grupo amino pode ser activado, por exemplo, por rsacção com um íosíiio, por exemplo, clorofosfito dietílico, clorofosfito i,1-fenileno, diclorofosfito etílico5 clorofosfito de etileno ou pirofosfito tstraetílico, ou com um agente de si. 1 ilação adequado, tal como um halos!lano orglnico, por exemplo, trimetilclorossilano, O grupo amino pode também ser activido ligando-o a um halocarbonilo, por exempla, clorocarbonilo, ou pode ser activado sob a forma de um grupo isocianato*

Os grupos funcionais nos fragmentos mencionados que, se não se pretender que participem na reacção, se apresenta® vantajosamente na forma protegida, são especialmsnts grupos carboxi, amino e bidroxi, e também grupos carbaieoiío s quanidino*

Os grupos protectores s a maneira coma sao introduzidos e removidos são descritos, por exemplo, ssn "Protective Broups in Organic Chemistry55 5 PI ©num Prsss5 Londrss5 Nova Iorque 1973 s em “nethodsn der Organischsm Chsmie" Cnêtodas da Química Orgânica)3 Houben-Wsyl? 4i edição, Vol= 15/15 Georg -Thleme verlag, Estu-garda 1974 e em Thsodora W» Bresne* "Prospective Sroups in Organic Chemistry"5 John Wiley & Sons, Nova Iorque 1981= É caracteristico dos grupos protsctores o facto de poderem ser facilmente removidos, isto é, sem se verificarem reacçSes secundárias;, por exemplo, por solvólise, reduçlo ou fotólise»

Qs grupos protsctores de hidroxx são3 por exemplo., radicais acilo5 tais como alcanoilo inferior substituído ou insubstituidpj por exemplo, haio~subsiituído3 tal corno, 2323™di™ cloroacstilo9 ou radicais acilo de hemi-ésteres de ácido carbónico, especialmente t-butoxicarbonilo3 benziloxicarbonilo substituído ou insuhstituldo, por exemplo, 4—nitrobenziloxicarboniIo5 ou difenilmstoxicarboniloj ou 2-halo-alcoxi inferior carbonila, tal como 2P232-tricciorDetoKicarbonilo3 ou formilo» Outros grupos protsctores de hidroxx são, por exemplos grupos etsrificadores adequados, tais como tritilo, t-alquilo inferior» por exemplo, t—butiIo? radicais hidrocarboneto 2-oxa- ou 2-tia—alifáticos ou -cicloalifáticos, em particular» 1—alcoxi inferior-alquilo inferior ou i-alquil inferior tio-alquilo inferior, por exemplo, rastoxinstilo, l~metoximei.il o, l-etoxietilo, metil tiomstilo, 1-mstiltioetilo ou 1-etiltioetilo ou 2-oxa- ou 2—tia-cicloal-quilo com 5 a 6 átomos de carbono» por exemplo» 2—tetrahidrofu— ri lo ou 2—tetrahidropiranilo ou os análogos tia correspondentes e também l-fenil-alquilo inferior substituído ou insubstituido, tai como benzilo ou difenilmetilo substituído ou insubstituido,, sendo adequados como substituintes dos radicais fenilo, por exemplo, hslogénio, tal como cloro, alcoxi inferior, tal como metoxi e/au nitro» Outros grupos protectores de hidroxi são também radicais νΓ sililo ou estanilo orgSnicos que conténs, ds prsfsr§nciss alquila inferior5 em especial metilo s/ou ariio, por exemplo, fenilo como substituin tss, especialmente tri~alquil inferior sililo, ma is particularmente, trimetilsililo e também dimetil-t-butil-sililo ou sstanilo correspondemtemente substituído, por exemplo, tri-n·-·-" bu t i 1 ss tan i 1 o =

Os grupos carboxi são protegidos, ds prsfsrfncis5 na forma esterifiçada, tal como agrupamentos éster facilmente cliváveis em condiçSes suaves» Os grupos carbosi protegidos desta maneira contém como grupos esterificadorss sspecialnssnte grupos alquilo inferior que estão ramificados na posição-1 ou adsquadamente substituídos na posição 1 ou 2= Os grupos carboxi preferidos na forma esterificada são, entre outros5 t-alcoxi inferior carbonilo, por exemplo, t- butoxicarhaniia, ar.il-s.l~ cokí inferior carbonilo contendo um ou dois radicais ariio, sendo estes radicais fenilo substituídos ou insubstituídos, por exsm--· pio,, com alquilo inferior, tal como t-alquilo inferior,, por exemplo, t-butilo, alcoxi inferior, tal como nsetQKi, hidroxi, halogéneo, por exemplo cloro, nitro b/du com fenilo, tal como benciloxicarhonilo que é substituído ou insubstituido, por exemplo, tal como atrás foi mencionado, por exemplo,, 4-metoxibsn-ciloxicarboní1q ou á—nitrobenziloxicarbonilo, bifsnililo-slcoxi inferior carbonilo em que o bifenililo substitui a posição s, por exemplo, 2~p~hifeniliio)~2~propoxicsrbQnilo, ou difenilmetoxicar--· bonilo que é substituído ou insubstituido, por exemplo, tal como atrás foi mencionado, por exemplo, aifenilmstaxicarbonilo ou d :l.~í4-ffistox ifen.ill-metoxicarbonilo, 1-alcoxi inferior-slcoxi inferior carbonilo, tal como metoximetoxicarbonilo, l-metoxieto---xicarbonilo ou 1-stoximetoxicarbonilo, 2,2-diari1-stoxicarfconi1o em que ariio é fenilo qus è substituído ou insubstituido, por exemplo, com nitro, tal como 4-nitrofenilo, tal como 2,2-di~C4--nitrofenilol-etoxicarbonilo, em que os dois radicais ariio, por

exemplo fsnilo também podem estar ligados um ao outro, por SKSsiiplo 2-<9-fluorofenil>-etoxicarbonilo, í-alquil inferior-tio--alcoxi inferior carbonilo, tal como 1-met.iltiomstoxiearbonilo ou 1- etiltiomsloxicarbonilD, aroilmetoxicarbonilo em que o grupo aroilo é benzoila que é substituído ou insubstituído, por enem-plo, com haloçénio, tal como, por exemplo, bromo, por exemplo, fenaciloxicarhonilo, 2~halo~alcoxi inferior carbonilo, 2—halo alcoxi inferior carbonilo, por exemplo. 2,2,2-iriclaroetoxicar-bonilo, 2-bromoetGxicarbonilo ou 2-iodoetoxicarbanilo3 ou 2-ísi-lilo tri--substituido)-etoxicarbonilo sm que cada um dos substi-tuintss, independentsmente uns dos outros, representam um radical hidrocarboneto alifático, cicloalifático ou aromático que é substituído ou insubstituído, por exemplo, com alquilo inferior, aicoxi inferior, arilo, halogénio e/ou com nitro tal como alquilo inferior insubstituído ou correspondsntemsnte substituído, fenilo alquilo inferior, cicloalquilo ou fsnilo, por exemplo, 2-tri-al-quil inferior sililetoxicarbonilo, tal como 2“trimetilsiliIstoxi-carbonilo ou 2—(metil-di-Cn-butil)-silil) -etoxicarbonilo, ou 2- triarilsililetox.icarbonilo, tal como 2-trifenilsililetoxicar-bon i1o,

Os grupos carfaoxi protegidos preferidos sSo, por exempla, t-alcaxi inferior carbonilo, tal coma t—butoxicarbonilo s banziloxicarbanilo que é insubstituído ou substituído, por exemplo, tal coma atrás foi mencionado, 4-metoxi— ou 4-nitroben-ziloxicarbonilo, ou difenilmetoxicarbonílo e também Ξ—ítrimetii-silil >-etoxicarbonilo.

Um grupo amino protegido pode apresentar-se, por exemplo, sob a forma de ura grupo acílaraino, aril me ti lamino., mercaptoamino stsrifiçado, 2-acil inferior alqu-1-enilamino, sililaraíno ou sstanilamino ou sob a forma de ura grupo acido.

Í5 .. . .·

Mura grupo acilamino correspondente, acilo é5 por exemplo, o radical correspondente de ura ácido carboxílico orqâni-ca contendo5 por SKSsiiplo5 o nxáximo da iS átosoa de carbono, especial mente ura ácido alcanocarboxilico insubstituido ou substituída» por exemplo, com halogénea ou arilo? ou tís um ácida benzóico insubstituido ou substituído, por sKs®pÍo3 com halogè-neo5 por exemplo., cloros alcoxi inferior3 por exemplo, metaxi,, nitro e/ou com fenilo3 ou de um hemi-èster de ácido carbónico. Estes grupos acilo são, por exemplo, alcanoilo inferior,, tal coma forraiXo¥ acetilo ou propionilo3 balo— alcanoilo inferior3 tal como 2~halaacstilo3 especial mente 2-cloro-, 2—bromo-, 2-iod£3-, 23232-triíluoro- ou 2»232-tricloroacetilo» benzoilo insubstituido ou substituído,, por exemplo, com halogénao? alcoxi inferior» nitro e/ou cora fenilo? por exemplo, benzoilo, 4-c1oroben zoi1o5 4-rastoxibenzoilo ou 4—nitrohenzoilo, ou alcoxi inferior carbonilo que ê ramificado na posição i do radical alquilo inferior ou substituído adequadamente na posição 1 ou 25 em especial t-alcoxi inferior carbonilo5 por exemplo t-butoxicarbonilo3 a-alcoxi inferior carbonilo com ura ou dois radicais arilo que são de prefertneia fenilo insubstituido ou substituído,, por exemplo,, cora alquilo inferior5 especialmenta t-alquilo inferior,, tal como t-butilo3 alcoxi inferior, tal como metoxi, hidroxi» hâlogéneo3 por exemplo, cloro, nitro e/ou com fenilo,, tal ccsrao benziloxicar-bonilo insubstituido ou substituído,, por sxsmplo3 4—nitrobenzi-loxicarbonilo5 bifenilil-alcoxi inferior carbonilo em que g bifenililo substitui a posição s , por exemplo» 2-Cg~biíenílil) — -Ξ-prQpoxicarbonilo) 3 ou difeniImetoxicarbonilo sutasti.tuido3 por exemplo, hsnzidriloxicarbonilo ou di-<4~mstoxifenil)-®etoxícarbonilo, 2,2-diarilstoxicarbonilo era que arilo significa fenilo que é insubstituido ou substituído» por exemplo., com nitro, tal como 4—nitrafenilQj tal como, 252-di-(4-nitrofenil)-etoxicarbonilo» era que os dois radicais ariio3 por exemplo, fenilo,, podem também estar ligados um ao outro5 por exemplo, 16

-V -: 2-(9-f luorenil )“StQKÍcârbonilo3 aroilmefcoxicarbonilo, em que o grupo aroilo è de preferfncia benzoilo que é insubstituído ou substituído, por exemplo, com halogénea, tal como bfu®o5 por exemplo, fenaciloxicarDonilo, 2-halo--aIcoxi inferior carbonilo, por exemplo, 25232“triclaroetoxicarbonila3 2-broiBoetoxicarbanila ou 2-iodQstoxIcarfaonilo, ou 2-ísilil tri-substituído)—stoxicarbo— nilo em que cada um dos suhstiiuintes, indspendentemente uns dos outros, é um radical hídrocarboneto alifáiico, cicloalifático ou aromático cora α máximo de 13 átomos de carbono e é insubstituído ou substituído, por exemplo, com alquilo inferior, alcoxi inferior, arilo, halogénea ou com nitra, tal como alquilo inferior,, fenil—alquilo inferior, cicloalquilo ou fenilo insuhstituídos ou substituídos correspondentes, por exemplo, 2—tri-alquil inferior sililsioxicarbonlio, tal como, 2~trimetilsiliIstoxicarbonilo ou 2-Cdi-n-buiiI-raeiil-silil> -etoxicarbonilo, ou 2-trIarilsilisto·--xicarbonilo, tal como 2-trifsniIsi1iletoxicarhonilo*

Outros radicais acilo adequados como grupos protectores de amíno sao também os radicais correspondentes de ácidos fosfóricos, fosfónicos ou fosfinicos orgânicos, tal coma di-alquil inferior fosforilc-, por exemplo, di~meti1fosforilo, tíisti1fosío-riio, di-n-propilfosforila ou diisopropilfasforilo, diciclaal-quilfosforilo, por exemplo diciclohexilfosforilo, difenilfosfo-rilo insubstituído ou substituído, par exemplo, difenil fasfo™ rilo, di~(fsni1-alqui1 inferiorl-fosforilo que é insubstituído cu substituído, por exemplo, cora nitro, por exemplo, di-bensi1fos-forilo ou di-(4-nitrobencil)-fosforilo, fenoxifenilfosfonilo insubstituído ou substituído, por exemplo fenoxifenilfosfonilo, di-alquil inferior fosfinilo, por exemplo, di-eti1fosfinilo, ou difsnilfasfinilo insubstituído ou substituído, por exemplo, d i f en i 1 fosf inilo,.

Num grupo arilmetilamino, que pode ssr u?n grupo mano-., di- ou especialmente tri-ariImeti1amino3 os radicais arilo slo em especial radicais fenilo insubstituidos ou substituídos« Esses grupos são, por exemplo; benzi lamino,, difeni Imeti lamino e espe-cialmente tritilamino.

Um grupo mercapto sierificado num grupo amino protegido com um radical desse tipo é5 em especial5 ariltics ou aril-alquil inferior-tio* em que arilo signififica particu1armente fenilo que é insubstituído ou substiiuído? por exemploj com alquilo inferior,, tal como metiio ou t-butilo* alcoxi inferior* tal como metoxi 5 halogénso, tal como cloro e/ou nitro* Um grupo protector de amino correspondente ©, por eKemploP 4-nitrofeniltio*

Num radical 2~aci l-alqu-j.-en-i ~i lo inferior que pode ssr usado como grupo protector de amino5 acilo significa* por exemplo,, o radical correspondente de um ácido alcano inferior carboníIico5 de um ácido benzóico que é insubstituído ou substituído·. por exemplo., com alquilo inferior,, tal como metilo ou t~taut.ilor. alcoxi inferior, tal como metoxij halogénso* tal como cloro e/ou com nitro., ou especial mente de um hemi— éster de ácido carbónico, tal como um hemi-éster de alquilo inferior de ácido carbónico* Os grupos protectores correspondentes sSo5 em particular* 1-alcanoilo inferior prop-l~en-2—ilo? por exemplo, l-ace-tilprop-í-sn-2-ilo* ou í-alcoxi inferior carbonilprap-l-en-2-ila5 por exempla* 1 -etoxicarboni1 -prop-1 -en-2-i 1 o«

Um qrupo amino pode também ser protegido na forma pratonadas como aniSes correspondentes consideram-se espeeialmen-te os dos ácidos inorgânicos fortes, tais como os ácidos hidra---hálicaSj por exemplo o aniSo do cloreto ou do brometo* ou ácidos sul fónicos orgânicos* tal como o ácido ρ-ioluenossuifónico* ν -.

Os grupos protestares de smino oreferidos sMo as radicais acilo dos hemi-ésteres do ácido carbónico* em especial,; i-butoxicarbonilo* ou bensilaxicarbonilo que é insubstituido ou substituído* por exemplo tal como indicado* por exemplo* 4-nitro-benciloxicarbonilo* ou difenilioetoxicfirhonila* 2--í?-f luoreriil )--· -stoxicarbonilo* ou 2~-halo-aIcoxi inferior carbonilo* tal como 2*2*-tricloroetoxicarhanilo e também tritilo ou formilo»

Os grupos carbamoilo insubstituídos sáo protegidos* por exesisplo* sob a forma de derivados N-\9--xanÍ0nilo} ou sob a forma de derivados N~isono-= di-* ou tri-arilineti 1 o) * em que arilo è especial mente metilo que é insubstituido ou conténs o máximo de 5 substituintes iguais ou diferentes* de preferencia alquilo inferior* tal como metilo* alcoxi inferior* tal coma metoxi= Fadem mencionar-se como exemplos destes grupos protectorss de arilmetilo os seguintess 4-metoxibenzilo* 2*4*6—trimetoxíbencilo * d i f en i1met i1o s d i - < 4 -me t o x i f en i 1 >-metilo* di-(4-metilfenil>-meti lo e (4-metilfenil )-í Cveículo poiiméricoj-fenil)-metilo» Tritilo é um grupo protector de carbamoilo preferido»

Os grupos auanidino podem ser protegidos* por exemplo* por meio rfa grupos sulfonilo substituídos adequados* tais coso arilsulforsílo em que arilo é fenilo que é insubstituido ou contém* por exemplo* alquilo inferior* tal como metilo* ou beneo-hsterociclilo* tal como cromanilo* que insubstituido ou substituído* por exemplo* com alquilo inferior* tal como metilo* e ligado por meio de um átomo aromático de carbono* tal como me t o x i fersilsulfonilo ou 2„2,5,7?8-pen t ame til- 6-c roman ilsulfanilo»

Meste pedido de patente deve entender-se por grupo protector* em particular um grupo protector de carboxi e também um veículo polimérico que está ligado ao grupo funcional a ser

protegido, especiairaents a um grupa carboni* por meia ds um veiculo que é especialmente adequado para a chamada síntese de pêptidas de Merrifiela e que pode ser facilmente removido* Um tal veículo policaêrico pode ser, por sKsmplo, de preferencia, uma resina ds poliestireno de fraca ligação cruzada por copal imeri·--\ zaçSo com divinilbenzeno, resina essa que contém membros em ponte adequados à ligação reversível das resíduos de amino ácidos s da pêptidos* Em relação especialmente ás resinas de poliestireno de fraca ligação cruzada estes membros em ponte slo, eoi particular, grupos meti leno que são ínsuhsiiiuidos ou substituídos e que são .1 ligados directamente a radicais aromáticos da resina de poliestireno* Os subsiiiuinies dos grupos meti leno estão ligados aos grupos metileno de prsfer@ncia por aqrupamsntos éter ou éster s contendo agrupamentos funcionais adequados que, juntamente com os grupos funcionais, espsciaImante os grupos carboni, do fragmento de amino ácido ou péptido, podem formar grupos protegidos* em especial grupos carboMi correspondentes, tais grupos cardo;·;! esterificados*, estes membros em ponte são, por essapio* os radicais dlvaientes de alcoóis 4-metOKlbenzílicos contando facu1tativamente fenilo na posição a que è insuhsiituído ou substituído* por exemplo, na posição g- ou g* por sKsmpIa, cora alcoKi inferior, tal como metoKi, alcoéis 4-mstoKibenzí1icos esses soí que o átomo ds carbono do grupo 4-rasto>;i sstá ligada directamente a um radical fenilo da resina de poliestireno, e o grupo hidroni benzilico sstsrifica a função carboKi do arnina ácido ou do fragmento de péptido* A rsacção para formar a ligação araida pode efectuar-ss de forma conhecida ssr se* dependendo as condiçSes da reacção em particular ds se s como α grupo carbOKi que participa na reacção foi activaflo, geralmente na presença de um solvente ou diluente adequado ou de uma sua mistura e, se necessário, na presença ds um agente de condensação que, por exemplo, no caso do grupo carboxi que participa na reacçlo sstar presente sob a forma de um anidriuO:: pode também ser um agente ds ligação ds ácidos adequado ? mediante aquecimento ou arrefecimento, por esemplo, dentro ds unia gama de temperaturas ds aproximadamente ~30°C s aproximada-ments -í-Í50°C? síb especial ? ds *i€>°C a ·*·7©°0, de pjreferfncia da temperatura ambiente íaproximadaments -Κ2Θο0) a -H5®0C5 num recipiente ds rsacçSo fechado s/ou numa atmosfera de um gás inerte, por exemplo3 asoto.

Os agentes de condensação usuais são, por exemplo, carbodiimidas, por exempla, N,MJ-distil-, M,N' -diisapropil-, N-diciclohexx1— ou N-etil—M'—(3-dimetilaminopropi1)—carbodi-imida, compostos carbonilo adequados, por exemplo, carbonildi-imidasole, ou compostos 1,S-oxaséiio, por exemplo, 3'—sulfonato ds 2—stil-5—feni1—1,2~oxa2ólio s perclorato de 2-t-buti1-5-me™ til-isoxasólio, ou um composto acilamino adequado, por exemplo, 2-stoxi—i-stoxicarbonil-l,2-di-hidroqu.inolina. Os agentes tis condensação de ligação de ácidos são, por exemplo, carbonatos ou bicarbonatos de metais alcalinas, por exemplo, carbonato ou bicarbonato de potássio ou tíe sédio (geralmente juntos com um sulfato), ou bases orgânicas, tais coma tri-alquil inferior aminas, gsralmente impedidas estsricamente, por exemplo, M,M— -di isoprop il-N-etilamina. A síntese de péptidos Merrífield atrás mencionada é espacial mente adequada para uma sintese semi-automática C3U completamente automática dos compostos com a ssquânoia de amino ácidos de fórmula I, em que os fraagmentos da amino ácidos s/ou de péptidos em que os grupos funcionais que não participam na reacçlo se encontram geralmente na forma protegida estão ligados uns aos outros por maio tíe agrupamentos amida sem isolamento dos fragmentos de péptidos formados. Um dos grupos funcionais, normalments o grupo carboxi terminal presente no final do pépiido, está facultativamente ligado a uns veiculo pclimêrico adequado por meio ds um membro em ponte, tal como foi descrito» Em principio, esta variante tío processo efoctua-ss de forma análoga à síntese usual dos péptidos, tendo-se o cuidado ds, no fragmento de pêptidcs já sintstisado que contém a fraeção ds veiculo polimêrico, a libertação, do grupo protegido, do grupo funcional que participa na rsacçlo, em regra o grupo amirso terminal, ss efectuar em cada caso em condições em que os grupos protectores dos grupos funcionais que não participam na reacção slo retidos» A remoção dos grupess de protecção ds carboxi--, amino·--, hidroxi-, amida ds ácido carboxilica-, carbamoila- s/ou guanidina ersetua-se de maneira conhecida per se» por exemplo, por meio de solvólise, especialmente hidrólise (sob condiçSss ácidas ou básicas), alcoólise, acidólis© ou tratamento com uma base, ou por meio ds redução, ssoscia1menta por hidrogenóliss ou redução química, facu1tativamente por fases ou simultaneamente, sendo também possível usar métodos ensimáticos»

Assim, o t-alcoxi inferior carbonilo ou o alcoxi inferior carbonilo substituído na posição 2 com um grupo silila orgSnico ou na posição 1 com alcoxi inferior ou alquilo inferior-tio, ou difenilmetoxicarbonilo insubstituido ou substituído, pode ser convertido no carboxi livre por acidólise, por exemplo, por tratamento com um ácido adequado, tal como ácido aicano inferior carboxilico que pode conter halogéneo, por exemplo, ácido fórmico ou ácido fcrifluoroacático, com ou sem a adição ds um composta nucleofílico, tal como feno! ou anisole» 0 bsnsiloxicarbonilo substituído ou insubstituido pode ser libertado, por exemplo, por hidrogenólise, isto ê, por tratamento com hidrogénio na presença ds um catalisador ds hidroqenação metálico, tal como um catalisador de paládio» Além disso, o bensiloxicarbonilo adequadamente substituído, tal como o 4-nitrQtaenziloxicarbQnilo, podo ser convertido no carboxi livre também por redução química, por exemplo, por tratamento com uma ditionits do metal alcalino,; por exemplo, rfitionite de sódio, ou com um metal redutor, por exemplo, zinco, ou um sal da metal redutor, tal como um sal de crómio C!I>, por exemplo, cloreto de crómio Uil>, geralmente na presença de um dador de hidrogénio que, juntamente com o metal, é capaz de produzir hidrogénio nascente, tal como um ácido, em especial um ácido carboxílico adequado, tal conso um ácido alcano inferior carboKílico que é insubstituído ou substituído, por exemplo com hidroxi, por exemplo, com ácido acético, ácida térmico, ácido glicólico, ácido difenilglicólico, ácido láctico, ácido mandê— lico, ácido 4-cloromandélico, ou ácido tartárico, ou um álcool ou um ticfl, adicionando-se de preferfncia água,, Os grupos 2,2-tíia-riletoxicarbonilo ou 2--(9-f luorenil}~etoxicarhortilo podem ser clivados em condições básicas suaves, por exemplo, por tratamento com piperidina* Por tratamento com um sal redutor ou com um sal metálico, tal como atrás foi descrito, também é possível converter 2-halo-alcoKÍ inferior carbonilo Cfacultativamente após conversão de um grupo 2-bromo-aIcoxi inferior carbonilo num grupo 2-iodo-aleoxi inferior carbonilo correspondente) ou araiImetoxi-carbonilo no carboxi livre, sendo possível clivar o aroilmstoxi-carbonilo também por tratamento com um reagente nuclsofilico, de preferencia formador de sal, tal como tiofsnolato de sódio ou iodeto de sódio* 0 2-sililetoxicarbonilo substituído também pode ser convertido no carboxi livre por tratamento com um sal de ácido hitírofluórieo fornecendo um anilo de fluoreto, tal como um fluorato de metal alcalino, por exemplo, fluoreto de sódio ou de potássio, na presença de um poliéter mscrocíclico btrown ethsr") ou com um fluoreto de uma base quaternária orgânica, tal como fluoreto de tetra—alquil inferior amónio ou fluoreto de tri--alquil inferior amónio, por exemplo fluoreto de tetraetilamónio ou fluorsto de tetrabuiilamónio na presença "d© urn solvente polar aprético, tal como sulíóxido de dimetilo ou NsN-dimetilacetamida =

Um grupo amino protegido è libertado de maneira conhecida per se e, conforme a natursza. dos grupos protectores, por várias métodos3 mas de preferência por solvúlise ou redução» 0 2-halo-aIcoxi inferior carbonilamino Cfacultativamente após conversão de um grupo 2-bromQ-alcoKÍ inferior carbonilamino num grupo Ξ-iodo—alcoxi inferior carbonilamino), o aroilmetoxicarbo-nilamino ou o 4~nitrGtaenzilQxicarbonilaffii.no podem ser clivados, por exemplo, por tratamento com um agente de redução químico adequado, tal como o zinco, em presença de um ácido carboxílica adequado, tal como o ácido.acético aquoso» O aroiImetoxiearbo— nilamino também pode ser clivado por tratamento com um reagente nucleofílico, de preferência formador de sal, tal como o tiofe— nalato de sódio, s o á-nitrabenziloxicarbonilamino também por tratamento com uma ditionite de metal alcalino, por exemplo, ditionits de sódio. 0 difenilmetoxicarbonilamino insubstituído ou substituído, o fc-alcoxi inferior carbonilamino ou o 2---sililetoxi~ cartaonilamino tri-sufestituído podem ser clivados por tratamento com um ácido adequado, tal como o ácido alcano inferior cartao-xílico que é insubstituído ou substituído, por exemplo, com halogéneo, tal como flúor, por exemplo, ácido fórmico ou ácido trifluoroacético, e 2,2-diariIstQxicarbGnilaffiinQ, tal como 2,2—di—<4—nitrofenil>—etoxicarbonilamino, e também 2-í9-fluorofe— ni1)-sfcoxicarboni1amino, por tratamento com uma base adequada, tal como uma amina alifática, de preferência secundária, por exemplo, piperidina» 0 grupo amino pode ser libertado do benzi-loxicarbonilamino insubstituído ou substituído, por exemplo, por bidrogenólise, isto é, par tratamento com hidrogénio na presença de um catalisador de hidrogenação adequado, tal como um catalisador de paládio, da iriarilmetilamino ou formilamina insubstituído ou substituído, por exemplo, por tratamento com um ácido, tal X -.- c-x > como um ácido mineral, por exemplo, ácido clorídrico, ou um ácido orgânico, por exemplo, ácido fórmieo, acético ou trífluoroscá-tico, na presença ou na ausância de água, e de um grupo silil-amino orgânico, por exemplo, por hidrólise ou alcoólise» Um grupo amino protegido por 2-haloacstilo, por exemplo, 2-cloro-acstilo, pode ser libertado, por exemplo, por tratamento com tio-ureia na presença de uma base, ou com um sal de tiolato, tal como um tiolato de metal alcalino, de tio-ureia, e por subsequente solvélise, tal como alcoólise ou hidrólise do produto de condensação resultante» Um grupo amino protegido com silil-etoxicarbonilo Ξ-substituido também pode ser convertido no grupo amino livre por tratamento com um sal de ácido hidrofluórico fornecendo sniões de fluoreto, tal como atrás foi descrito em relação à libertação de um grupo carboxi protegido correspondente» 0 amino protegido sob a forma de um grupo asido pode ser convertido no amino livre, por exemplo, por reduçlo, por exemplo, por hidrogenaçlo catalítica, com hidrogénio na presença de um catalisador de hidrogenaçlo, tal como óxido de platina, paládio ou níquel de Ransy, ou alternativamente por tratamento com zinco na presença de um ácido, tal como o ácido acético» A hidrogenaçlo catalítica pode efectuar-se, de preferencia, num solvente inerte, tal como um hidroearboreto hidrogsnatio, por exemplo cloreto de metileno, ou alternativamente em água ou numa mistura de água e tíe um solvente orgânico, tal como um álcool ou dioxano, de aproximadamente 2ô°C a 25°C, ou altsrnativaments mediante aquecimento ou arrefecimento»

Um grupo hidroxi protegido com um grupo acilo adequado, um grupo sililo orgânico ou 1—fenil-alquilo inferior insubstituí-do ou substituído pode ser libertado analogamente a um grupo amino protegido correspondente» Um grupo hidroxi protegido com 25

2f2~dicicíroacstil pode ser libertado, por exsmplo? por hidrólise básica9 s um grupo hidroxi eterificado por t-alquilo inferior, por exsmplos t-butilo., ou por um radical de hidracarhoneto 2~OKa-ou 2-tia-alitàticD ou -ccicloalifático pode ser libertado por acidólise? por exemplo5 por tratamento com um ácido mineral ou com um ácido carboxilico forte, por exemplo, ácido trifluoroacé— tico.

Um grupo smida de ácido carboxilico protegido com 9--xantsnilo pode ser libertados por exemplo,, por tratamento com brometo de hidrogénio em ácido glacial acético ou com fluoreto de hidrogénio na presença de anisole» Um grupo amida de ácido carboxilico protegido com πίοηο-5 di- ou tri-arilmetilo pode ser libertados por exemplo* por tratamento com fluoreto de hidrogénio na presença de anisolep além disso3 um grupo protector de difenilmetilo pode ser removido* por exemplo* por hidrogsnólise na presença de um catalisador de paládio sobre carbono, s um grupo protector tís d:L-í4~metoxifenil)-metilo ou um grupo proiec--· tor ds 2s436-trimetoxibenzilo pode ser removido* por exemplo* por tratamento com ácido trifluoroacético,

Os grupos guanidino protegidos com grupos sulfonilo orgânicos* tais como 4~metilfenilsulfonilguanidino ou 2*2*5*7,8----pentameti1-6-cromani1sulfoniIguanidino podem ser libertados, por exemplo* por tratamento com um ácido adequado, tal como o ácido t ri f1uoroacético»

Um grupo funcional protegido* em especial um grupo carboxi correspondente em que o grupa protector acfcua simultansa-mente como material servindo de veículo na já mencionada síntese ds péptidos Merrifields pode ser clivada de maneira conhecida per se, por exemplo, tal como atrás foi descrito. Um grupo carboxi correspcnden temen te esterifiçado que ê ligado ao material r .· - -V ;· ν· c íf polimèrica que serve de veicula através de u«i membro em ponte adequado, é clivado de acordo com a natureza do membro em ponte* Par exemplo, um grupo carboxi ligada a um material ροIimérico que serve de veiculo por meio de um agrupamento ester com um membro bsnzílico em ponte activado, par exenipla* um grupa 4-meioxiben···-siloKic®rbonilD9 em que o átomo de carbono do grupo mstoxi é ligado* por exemploa um radical fenila da resina da poliestireno de fraca ligação cruzada com divinilbenzeno, pode ser libertada analogamente aos grupos hsnziloxicarbonilo insubsti-tuídos ou substituídos atrás mencionados, por exemplo,, por tratamento com um ácido adequado* tal como o ácido trifluoro-scéiico»

Caso se deseje, se se encontrarem presentes vários grupos funcionais protegidos,, os grupos protectores podem ser ssleccionados de forma a que mais do que um desses grupos protec-tores possa ser removido ao mesmo tempo* por exemplo,, por acidé--· liss* por exemplo por tratamento com ácido trifluoroacético ou ácido fórmico* ou por redução,, por exemplo por tratamento com cinco e ácido acético,, ou com hidrogénio e com um catalisador de hidrogsnação» por exemplo, com um catalisador de paládio sobre carbono*

Processo___bjg As células hospedeiras transformadas usadas para a manufactura dos palipéptideos da invento sSa produzidas do modo a seguir indicados - produzindo uma sequência de DMA que codifica um palipép-tido do invento* - produzindo um vector híbrido contendo o referido DMA* e transf armando uma estirpe hospedeira adequada com o referido vector híbrido,, 27

0 DMA que codifica υαι polioéptida do invento é a DMA cromossómico correspondente isolado a partir de u® banco de genes humanos por processos conhecidos, o cDNA isolado pela via mRMA ou o DMA sintético correspondente„ Este Dl timo é produzido de &corda com métodos geralmsnte conhecidas, par exemplo de acorda com a método descrito por S«ft« Narang ETetranedron 39, 3 (1938)3, ou a método descrito na pedido de patente europeu nQ14ò785, usando especialmente máquinas de síntese de DMA que se obtêm no comércio =

Um DMA correspondente que codifica PtYYtFP tem a seguinte sequências Υΐ3-Υι-Υΐ5-Υιι,-Υ2-γ16-γ1_γ1 ,_v.,_v v „

z 116 n Ϊ11 Υ7“Υΐ6-Υΐ6-Υΐ5-Υΐ-Υ1(-Υ15-γ1-γ(1_γ1 ,_Y -Ϊ7-Τ,-ϊ,-Υ.-,,,-ϊ,,-ν,,-γ,.γ,6-Yls-Y2_Yl,.z -Í7-,„-Y7-Yt-,... _v, - _v. ...... " 12 11 Yl enquanto um DMA que codifica PCtíRPATFP tem a seguinte sequência

Zi-Yl 3-Yl-Yl 5-Yl I.-Y2-Y1 6-Yl-Yl 1-Ϊ7-Υ1 6-Yl 6-Yl 5-Y1-Y9-Y11-Yl 6 _γ7_γ1(_γ7-Υ1-Υ2-Υ1 i-Υχ !-Yl 1-Yl-Yl-Yl 1-Y3-Y6-Yt*-Y5-Y3-Y6"Y1 3~Yl 2~Υ1-Υ1 6 _Y7_Yl1_Y7_Y6-Y7-Y6-Y7-Y2-Y7-Y8-Yl6-γ2-γ1O-Yl0-γ1-γ6-γ17-Zz» Y, codifica a alanina (Ala) e é buí, GCC, BCA ou BCB, Y0 codifica a arginina (Arg) e é CGT, CBC, CBA, CSG, ASA ou ABG, X Yp; codifica a Y4 codifica o Y5 codifica a Yé codifica a V : 7 codifica o Ya codifica a V ' 9 codifica a ¥ i® codifica a Yii codifica a Y12 codifica a Y13 codifica y:h codifica a v ís codifica a Y16 codifica a YÍ7 representa Z., e 1„ sSo λ especialmente i cia de rsconhe .sina (Lis) e é AAA ou AABS codifica a metionina (rfst) e é ATB» Z.-, sSo regiões flanqueadoras de uNA contendo b a 100 = 0 invento refere—se especialmente ás sequências de DMA que codificafii PCATFP e PCGRPATFP ccontendo triplstos preferidos pela ii£aiL ou 1λ,......sanEd&àam-

Uni DMA preferido codificando PCATFP tem a sagiAints sequência Cem que slo indicados os locais de clivagem tía enzima de restriçlo) x

5' HetAlaProPheArgSerAlaLeuGluSerSerProAlaAspProAlaThr CTGGAATTCATGGCTCCGTTCCGTTCTGCTCTGGAATCTTCTCCGGCTGACCCGGCTACC GACCTTAAGTACCGAGGCAAGGCAAGACGAGACCTTAGAAGAGGCCGACTGGGCCGATGG 3’------

EcoRI

LeuSerGluAspGluAlaArgLeuLeuLeuAlaAlaLeuValGlnAspTyrValGlnHet

CTGTCTGAAGACGAAGCTCGTCTGCTGCTAGCTGCTCTGGTTCAGGACTACGTTCÀGATG

GACAGACTXCTGCTTCGAGCAGACGACGATCGACGAGACCAAGTCCTGATGCAAGTCTAC

Nhel

LysAlaSerGluLeuGluGlnGluGlnGluArgGluGlySerSerLeuAspSerProArg

AAAGCTTCTGAACTGGAACAGGAACAGGAACGTGAAGGTTCTTCICTGGACTCTCCGCGT

TTTCGAAGACTTGACCTTGTCCTTGTCCTTGCACTTCCAAGAAGAGACCTGAGAGGCGCA

SerNON 3'

TCTTAGGATCCTG

AGAATCCTAGGAG ------5' (III) .

BamHI U olxgonucíeòtido da fórmula ÍIIÍ) é preparado,, por sxemplo, da acordo com o processo descrito no pedido de patente europeu ny 3.68342 5 sintetizando quimicamente as sequências par— ciais sublinhadas na fórmula III5 tratando cosi quiri aseprocessando de modo a obter-se duplexes usando DMA polímeras® s os quatro trifosfatos de nucIsosideos e ligando por meio dos locais de clivagem de restrição inseridos a fim ds formar o gene PCATFP, U xnvento refere—se ainda a vectorss de expressão contendo uma sequência ds DNA qus codifica PCATFP ou PC8RPATFP regulada por uma sequência ds controlo ds expressão,. 0

Os vectores de expressão do presente invento sao preparados, por exemplo, inserindo uma sequência ds DMA qus codifica um polipéptido do invento num vsctor de DMA que contém uma sequência ds controlo ds expressão ds tal modo qus a sequência ds controlo ds expressão regule a referida sequência ds DMA* A escolha ds um vsctor adsquado hassia-ss na célula hospedeira fornecida para a transformação» As células hospedeiras adsquaclas são, por exemplo, microrganismos, tais como Isvsdu-ras, por exemplo, Sagcjwpmyces cerevisiae, e estirpes bac ter lanas., em especial estirpes ds Eschsrichia coli, Bacillus subtil is., i§SÍ.l.lys_________stearotMrmpphi lus, Hae.mpphil.us,

Btreptacoccus, e outros, s também células ds organismos superiores, em especial linhas ds células humanas ou animais estabelecidas » São adequados, em principio, todos os vectores capases de replicar s exprimir na hospedeira seleccionada as sequências ds DMA heteróIogas que codificam os polipéptidos do invento»

Constituem exemplos de vectores qus sao adequados para a expressão de um gene numa estirpe de E„coli os bactsriófagos, por exemplo, derivados do bacteriéfago lambda, ou qlasmídsos, tais como, eoí particular, o plasmídeo colEl e os seus derivados, por exemplo, pBR322„ Os vectores adequados contêm um rsplicSo intacto e um gene marcador que torna possível a selecção e a identificação dos microrganismos transformados pelos olasmideos da expressão por meio de uma esracterística íenotipica» Os genes marcadores adequados conferem, por exemplo, ao microrganismo, resistência aos metais pesados, antibióticos e outros» Além disso, os vectores preferidos contêm, para além da replicãa s das regiões de genes marcadores, sequências de reconhecimento para as endonuc 1 sases de restrição, de tal forma que a sequência de DMA Ν que codifica o polipéptido do invento e facultativamsnte a sequência de controlo de expressão podem ser inseridas nestes locais, 0 plasmideo pBR322 contém im repliclo intacto s genes p p marcadores < tet“ s amp*') conferindo resistência à tetraciclina e & ampicilina»

Pode® usar-sã várias sequências de controlo ds expressão para regular a expressão do polipéptido. Usam-se particular-mente sequências de controlo de expressão de genes fortements expressos ds células hcsspedeiras a ser transformadas. Quando ss usa pBR322 como vector híbrido e E» coli como microrganismo hospedeiro as sequências de controlo ds expressão adequadas Cque? entre outros, contêm o promotor e o local da ligação cromossé-iiiico) são, por exemploj as do operSo lactose, do operSo tripto-fanc, c!o operSo arabinoss e outras? s do gene B-laetamasa, as sequências correspondentes do qsns do fago lambda M? do gene da proteína da camada do fago fd s outros. Enquanto o promotor do gene fâ-lactafi*ase (fí-lac-gsne) iá está contido no plasmídeo BR322, as outras sequências ds controlo de expressão têm de ser inseridas no plasmídeo.

Os vsctores adequados para a replicação s expressão na levedura contêm unsa origem de replieaçSo de levedura e um marcador genético selectivo para a levedura. Os vsctores híbridos que contêm uma origem de replicação de levedura^ por exemplo5 o segmento cromossómico que replica autonomamente (ars) são retidos sxtra-croffiossomicaments dentro da célula de levedura apés tranin;-farmaçlo e são replicados autonomaments durante a mitose. Do mesmo modo3 podem ser usados os vsctores híbridos que contêm sequências homólogas à do DNA do piasmídeo 2u da levedura. Estes vsctores híbridos são integrados por recomhinaçSo dos olasmídeos 2μ já presentes dentro da célula, ou replicar autonomamente, As sequências 2μ são particularmente adequadas para olasmídeos com C> .- uiaa elevada frequência de transformação s permitem um elevado número de cópias» Os genes marcadores adequados para a levedura são ais especial aqueles que transmitem resistência antibiótica ao hospedeiro ou5 no caso de mutantes de levedura auxotróficos,, genes que complementam a deficiência do hospedeiro» Qs genes correspondentes transmitem,, por exemplo,, resistência ao antibiótico ciclobeximidap ou forneceni fotoirofia num mutante de levedura auxotrófico* por exemplo? o gene URA3·, LEU2« Hl53., ou em especial» o gene TRPi» De preferência» os vectares híbridos da levedura contêm um replição de origem e um gene marcador para um hospedeiro bacterianoP em particular,, a Eh coli, ds forma a que a construção e a clonação dos vectores híbridos e dos seus precursores possa efectuar-se num hopedeiro hacteriancu As sequências de contraio ds expressão adequadas para a expressão na levedura são? por exemplo3 as do gene TRPi, ΑΡΗΪ. ou PH05 s também dos promotores envolvidos na degradação glicolítica* por exemplo o promotor P8K s a promotor ΘΑΡΡΗ» 0 invento refere-se especialmente a vectores ds expressão capazes ds replicaçlo e de selecção fenotípica que contêm uma sequência de controlo de expressão e uma sequência ds DhIA que codifica um dos polipspiidsos do invento., &m que a referida sequência de DMA* juntamente com o sinal as inicio de transcrição» o sinal ds terminação* o sinal ds inicio ds translação e o sinal stop no referido plasmidso de expressão* está arranjada de tal modo» com a regulação da referida sequência ds controlo de expressãos que ds palipéptídeos do invento se encontram expressos numa célula hospedeira transformada com o referido plasmídeo de ax pressão,, A fim de se obter uma expressão eficaz, o gene deve ser arranjada carreciaments ("em fase”) com a sequência ds controlo de expressão, s vantajoso ligar a sequência ds controlo de expressão na região situada entre a origem mRNA principal s ο ΑΤΘ da uma sequência que codifica o gana que está ligado naturaimsnte á sequência de controlo ds expressão ípor exemplo a sequência que codifica ¢-1 ac quando se usa o promotor fS-lac), com o gene, qua de preferência traz coís ele o seu próprio sinal ds inicio da translação s o sinal stop da translação ípor exemplo TAS)n Fica assim assegurada uma translação eficaz.

Por exemplo, um vector, espacialmente o pBR322s á clivado com uma endonucleass de restrição ss facultativamsnts após a modificação do vector linearizado resultante, é inserida un?a sequência de controlo de expressão com extremidadss ds restrição correspondentes. A sequência ds controlo de expressão contém,, na extremidade 3" (na direcção da translação) , a sequência ds rsconhecimsnto de uma endonucleass ds restrição,, de forma a que o vsctor que jà contém a sequência de controlo de expressão possa ser digerido com a referida enzima de restrição, s o gene que codifica um dos polipepiídeos do invento s está provido de extremidades compatíveis possa ser inserido» 0 resultado é uma mistura de dois plasrnídeos híbridos, que contêm cs gene na orientação correcta e incorrecta, respectivamente. é vantajoso clivar o vsctor contendo já s sequência ds controlo de expressão com uma segunda endonucleass ds restrição dentro do vsctor DMA e inserir no fragmento de vsctor resultante o gene que codifica um das palipsptídsos do invento provido de extremidades corrsctas. Todas as operaçóes sobre o vector efsctuam-se, de preferência, de maneira tal que a função do repliclo e de pelo menos um gene marcador não fique prejudicada, A construção do vector pode também conter uma sequência de sinal que seja adicionada de forma operativa à sequência de controlo de expressão e possua o esquema de leitura correcto em relação ao gene que codifica o polipeptídeo tío invento,, As sequências de sinal adequadas sãoP por exemplo? a§sequências de sinal OmpA? ίρρ e |5~lac quando se usa E»coli como microrganismo hospedeiro e as sequências de sinal invsrtase, factor-a e PHG5 quando se usa como microrganismo hospedeiro S» csrevisias» A transformação das células hospedeiras com os plasmí--· dsos de expressão do invento efectua-se de acordo cosi processos conhecidos» 0 isolamento das células hospedeiras transformadas efectua-se vantajosamente a partir de um meio nutriente selectivo a que se adicionou o biocida contra o qual o gane marcador contido no plasmideo de expressão confere resistência»

Se3 como é preferido,; os plasmidaos de expressão contêm o gene amp!'=, adiciona-se por consequência ampicilina ao meio nutriente» As células que não contém α plasmideo da expressão são destruídas num tal meio» G invento refere-se também -às células hospedeiras transformadas susceptíveis de serem obtidas da maneira mencionada» A cultura das células hospedeiras transformadas do invento da acordo com o processo b5 efectua-se de modo conhecida per se» Por exemplo? podem usar-se várias fontes de carbono para fazer a cultura dos microrganismos hospedeiros transformados do invento» Como exemplos das fontes de carbono preferidas temos os carbo-hidratos assimiláveis5 tais como a glucose,, a mal tose» α manitol ou a lactose., ou um acetato? que pode ser utj.li2e.d0 quer sozinho? quer em misturas adequadas» Constituem fontes de azoto adequadas5 por exemplo? os ami.no ácidos? tais como os ácidos c-asasii.no5 os peptídeos e as proteínas s os seus produtos de degradação? tais como a trintona? a pepiona ou os extractos de carnes s também os extractos de levedura;, os extractos de malte e ainda os sais de amónio* por exemplo, cloreto,-•"'sulfato ou nitrato de aménIo que podem ser usados sosinhos ou em misturas adequadas,, Os sais inorgânicos que também podem ser usados são, por exemplo, os sulfatos, cloretos, fosfatos e carbonatos de sódio, potássio, magnésio s cálcio*

Além disso, o meio contém substâncias promotoras do crescimento, tais coma elementos residuais, por exemplo, ferro, cinco, manganésia s outros, e, de preferância, substâncias que exerceni uma pressão na selecção e impedem o crescimento de células que perderam o seu plasmideo de expressão* Assim, por exemplo, adiciona-se ampicilina ao meio quando o plasmideo de expressão contém um gene amp”* Uma tal adição da substâncias antibioticamente activas também tem o efeito de destruir organismos antibiotico-sensíveis confcaminantes* A cultura efectua-se de acordo com processos que slo conhecidos per se* As condições de cultura, tais como a temperatura* o valor do pH do meio e o tempo de fermentação, slo sslec-cianados de modo a obterem-se titulações máximas de polipeptí-dsos* Assim, u«?a estirpe de E. coíi ou de uma levedura cultiva--ss, de preferância, em condições aeróbieas, em culturas submersas, sacudindo ou agitando a uma temperatura de aproximadamente 2® a 4ô°C, ds prefsrfncia, de aproximadamente 3®0C, e com um valor do ρ·Η de ···!· a s; de preferencia um PH 7, durante aproximada-mente 4 a 2® horas, de preferância 8 a 2® horas. ou

Quando a densidade das células atingiu um valor adequado, dá-se a cultura por terminada e o polipeptideo do inventa é libertado das células do microrganismo* Para tal, as células são destruídas, por exemplo, por tratamento com um detergente, tal como o SDB ou Triton, ou são Usadas com uma lisosima ou uma encima ac tiiando de forma semelhante* AI ter nativamente,

Cv

V tais coma adiciorialmenfce* podem utilizar—se farças mecânicas* forças de corte (por exemplo* prsnsa-X* prensa francesa* moinho— -Dyna) ou agitação com contas de vidra ou óxido de alumínio* ou congslamenfco altsrnsdO; por exemplo* em azoto líquido* e descongelamento 5 por exemplo5 da 3@°C a 4®°C* s ultra-sons» para fraccionar as células» A mistura resultante contendo proteínas* ácidos nucleieas e outros constituintes celulares é enriquecida* após centrifugação* de maneira conhecida per se em relação ao teor de proteínas» Assim* por exemplo» os constituintes nio proteicos slo* na maior parte dos casos* removidos por meio de tratamento com palietilenoimina e as proteínas* incluindo os ροΐipeptideos do invento* são precipitadas* por exemplo* saturando a solução com sulfata de amónia ou com outros sais» As proteínas bacterianas podem também ser precipitadas por meio de acidificaçSo com ácido acética (par exemplo θ,Ιχ, pH 4-5)» Outros passos de purificação incluem* por exemplo* processos cromatográficos* tais como cromatografia da permuta de iSes* cramatografia de permeaçlo de gel* cromatografia de partição* CLAP* CLAP cie fase invertida e outros» Por exemplo* a separação dos constituintes da mistura ê feita por diálise* de acordo com a carga* por meio de electroforese a gel ou electroforese isenta de veículos* de acordo com a dimensão molecular por meio de uma coluna Sephadex adequada* por c rornatoga fia por afinidade* por exemplo* com anticorpos* em especial anticorpos monoclonais* ou com trombina accplada a um veicula adequada à cromatografia por afinidade* ou por outros processos conhecidos»

Por exempla* o isolamento de um polipeqtídea da invento expressado pode compreender os seguintes passoss

Separação das células da solução de cultura por ceniri-fugaçãop produção de um extracto em bruto através da destruição das células» por exemplo» por tratamento com uma enzima que as ‘ ' ; : vai lisar s/ou congelamsnta/dsscongslaí»en ta alternados remoção dos constituintes insolúveis por centrifuqaçlop precipitação do DMA pela adicSa ds polietilenoimina:^ precipitação das proteínas por meio de sulfato de amónio?; cromatoqrafia ds permuta ds iBes s/ou CLAP ds fass invertida^ remoção dos sais da solução resultante por meio de diàlise ou por cromatoqrafia sobre um permuta-dor de iBes adequado, por exemplo» Sephadex G25 ou Ssphadex Β1Θ»

Podem usar-se testes com anticorpos adequados, per exemplo, anticorpos raonoclonais que se podem obter de células de hibridoma, para detectar os polxpeptídeos do invento»

Obtêm-se, em regra, ds acordo com o processo fo>, psptideos cie fórmula ϊ em que R representa hidrogénio, especial-mente quando slo expressados sm levedura» Em certas células hospedeiras, por exemplo, E. coli, uma acetilaçlo N-terminal pode» na entanto, ocorrer» dai resultando que se obtenham peptí™ deos de fórmula I em que R representa acetilo»

Nos psptideos de fórmula I suscsptivsis ds serem obtidos de acordo com o invento com um radical metionina contendo um grupo sulfóxido, esse grupo é convertido no grupo tio por redução de uma maneira conhecida per se» Para tal, usam-se agentes redutores adequados, de preferência sais da iodeto, tal como iodeto de amónio, geraImante na presença de um díluente, podendo remover-se o iodo resultante, por exemplo, por tratamento com ácido aseórbico»

Os sais dos compostos de fórmula I podem ser manufacturados tíe maneira conhecida per se» Por exemplo, podem formar-se compostos de fórmula I contendo inais grupos ácidos do que básicos, por exemplo, por tratamento com compostos metálicos, tais como sais ds metais alcalinos de ácidos carboxilicos orgânicos

,'S X' adequados? por exemplo, o sal de sódio do ácido a-stilcaoróiso, ou com sais de metais alcalinos ou alcalino terrosos inorgânicos, por sxsmplo, bicarbonato de sódio. ou cosi amónia. ou com uma aííiina orgânica adequada, usando-se de preferência quantidades astequiométricas ou apenas um pequeno excesso do agente forsnador de sal. Os sais de adição de ácidos dos compostos de fórmula I são obtidas da maneira usual, por exemplo? por tratamento com um ácido ou com um reagente de permuta de aniões adequado. Os sais internos dos compostos de fórmula ϊ qus contêm um grupa ácida livre ou um grupo básico livre, podem formar-se, por exemplo, neutralizando os sais, tais como os sais de adição de ácidos até ao ponto isoeléctrico, por exemplo, com bases fracas, ou por tratamento com permutadores de ioes líquidos.

Os sais podem ser convertidos da maneira usual em compostos livresp os sais metálicos e de amónio podem ser convertidos nos compostos livres. por exemplo, por tratamento com ácidos adequados e com sais de adiçao de ácidos, por exemplo, por tratamento com um agente básico adequado.

Os peptidsos de fórmula í possuem valiosas propriedades farmacoíógicas. Se, por exemplo, as células calvarianas de smbriBes de frangos ou da ratos recém-nascidos forem tratadas in vibro com peptídeos de fórmula I, a estimulação da multiplicação celular pode ser determinada por meio do aumento da incorporação de timidina mtulada com trítio no DNA. Esta estimulação pode ser obtida com concentraçSss ds aproximadamsnts 1 a aproximada-mente 1000 nmol/l, e é mais pronunciada com concentrações de aproximadamsnts 1ΘΘ nmol/l, sendo possível determinar o efeito da presença ou ausência do soro no meio de cultura. A acção estimuladora dos peptídeos de fórmula Σ é específica dos osteahlasios;j por exemplo, os fibroblastos da pele dos ratos não reagem. Ao contrário da calcitonina ou do polipsptídso relacionado com o gene da calcitonina, os peptídeos de fórmula ϊ não evitam a reabsorção óssea, o que pode ser demonstrado in vitro no sistema calvariano dos murganhos»

Em consequência destas propriedades farmacológicas, os psptideos de fórmula I podem ser usados, por exemplo* no tratamento de doenças relacionadas com a degenerescência óssea Costeo-penia)5 tais como a osteoporose, a osteosrfcrite, a osteoariross; ou a doença de Sudeck, sendo administradas doses de aproximada-mente ®,1 a aproximadaments 1Θ mq/dia a animais de sangue quente com um peso corporal aproximado de 7Θ kg» 0 invento refere—se? portanto, também a um método para tratar doenças envolvendo a degenerescência óssea em animais de sangue quente, método esse que compreenda a administração a um animal de sangue quente que tenha a referida doença uma dose eficaz de u?5i peptídeo de fórmula I ou de um seu sal farmaceuti-camsnie aceitável»

Além disso5 os peptideos de fórmula I podem ser usados na manufactura de anticorpos de diagnóstico dos carcinomas medulares da tiróide# 0 invento refere-se também a preparações farmacêuticas contendo» como ingrediente activo uma dose eficaz, em especial uma dose eficaz para o tratamento das doenças atrás mencionadas, de um dos compostos do inventa ou de um seu sal, de preferência juntamente com um veiculo, sendo a proporção em que este se encontra geralmante superior a 50% ens peso» Estas são, em particular, preparações adequadas para administração intranasal ou parentérica, por exemplo, subcutânea, intramuscular ou intravenosa, a animais de sangue quente, por exemplo a seres humanos, dependendo a dosagem do ingrediente activo da espécie, do peso

corporal, da idade s do estado do indivíduo, da dosnça a ssr tratada e do modo do administração»

As novas preparações farmacêuticas para administração psrentérica contêm, numa forma pronta a ser usada, de aproximada-mente ©5.Θ1 a aproximadamente 1©% em peso, de preferência de aprox imadamen te ©,©5 a aprox imadamen te 1% em peso,, do ingrediente activo» As preparações farmacêuticas de acordo com o invento podem apresentar-se, por exemplo, sob a forma de unidades de dosagem» por exeniplo, sob a forma de ampolas»

Podem ser preparadas antes da utilização, de preferência 5 soluções do ingrediente actiνα e também suspensões, em especial soluções ou suspensões aquosas isotónicas, e estas, por exemplo no caso de preparações iiofilizadas contendo o ingrediente activo sozinho ou juntamente com um veiculo, por exemplo, o manitol. São especialmente adequadas para administração intrana-sal as suspensões em óleo» As preparações farmacêuticas podem ser esterilizadas e podam contar aditivos, par exempla, conservantes, estabilizantes, molhantes e/ou emulsiíicanies, solubilizanbes, sais para regular a pressão osmótica e/ou tampões, a também substâncias aumentando a viscosidade, tais como carboximetilce— lulosa de sódio, carboximetiIcsluloss, dextrano, polivinilpirra-1idono ou gelatina» Podem ser manufacturadas de maneira conhecida per se, por exemplo, por meio de processos de dissolução e de liofilização convencionais. por exemplo, ácido láurico.

As suspensões em óleo contêm, como componente oleoso os óleos vegetais sintéticos ou semi-sintéticos geralmente usados nas injacçSes» Podem mencionar-se neste caso, em especial, os ésteres de ácidos gordos líquidos que contêm como componente ácido um ácido gordo de cadeia longa contendo cerca de 8 a cerca de 22 átomos de carbono, tal como, \· V . ácido tridecílico, ácido miristico, ácido perrfcadecí lico, ácido palmítico, ácido margârico, ácido esteárico, ácido araquídico, ácido bshénico ou ácidos insaturados correspondentes5 por sxem-pio, ácido oleico, ácido elaidico, ácido erúcico, ácido Prassi— dico ou ácido 1inoleico» 0 componente álcool contém, geralmente, até a um máximo de 7 átomos de carbono inclusive e è um álcool mono- ou poli-hídrico, por exemplo, metanol, etanol, propanol, baianoI ou pentanol ou os seus isómeros, mas especial-mente glicol ou glicerol» Podem, por isso, mencionar—se a titulo de exemplo, como ésteres de ácidos gordoss o oleado de etilo, mistirato de isopropilo, palmitato de isopropilo, trioleato ds polioxietilenoglicerol (por exemplo, “Labrafil M 2735”, manufacturado por Oattefossé, Paris), triglicéritíos ds ácidos gordos saturados com uma cadeia longa contendo 8 a 12 átomos ds carbono (por exemplo, iSriiglyol 812% manufacturatío por Chemische Wsrks, Witten, Ruhr, Alemanha), e também óleos vegetais, tais como óleo ds semente ds algodão, óleo tís amêndoa, aceite, óleo de rícino, ó1gd de sésamo, óleo de soja ou óleo ds amendoim» A manufactura das preparações injectáveis efectua-se da maneira usual, sob condições antimicrobianas, tal como sucede também com a sua introdução em ampolas ou frascos e com a selagem desses recipientes. 0 invento refere-se iquslmente è utilisaçao dos compostos ds fórmula I como ingredientes farmacologicamente activos ou para a manufactura de preparações farmacêuticas, em especial para o tratamento ds doenças que implicam a degenerescência óssea, sendo administradas, ds preferência, doses diárias de aproximada— mente 0,1 a aproKimadamente 1Θ mg» V- Λ' \'ί

Os radicais orgânicos e os compostos referidos até aqui como "inferiores" conttm até 7 inclusivê, de preferencia até 4 inclusive* átomos ds carbono*

Os eKemplos que se seguem ilustram o invento* As temperaturas sSo referidas em graus centígrados* EKepmlo.....1 1 , 1 0 Fníoc-peptídeo/rssina que ss pode obter de acordo com o processo abaixo descrito é submetido num aparelho de síntese ds psptideos completaments automático às seguintes reacçSes e operaçSes de lavagem¥ usando-se aproximadamente 3# ml de liquido de lavagem de cada vez e agitando-se regulanuente o recipiente da rsacçSop os passos da reaeção¥ salvo indicação em contrário., efectuam-se à temperatura ambientes - lavagem simples do material de partida Fmoc-peptideo/re-sina com isopropsnol durante es8 minutos5 - trfs lavagens,, com a duração de €> = 4 minutos cada uma¥ com dimeii1acetamida desgassifiçada sob pressão reduzida (isenta de dimetilamina)ξ - oito tratamentos,, com a duração de ls8 minutos cada um, com uma solução a 2©% de piperidina em dimetilacetamida desgasei-ficada CremoçSo do grupo protector ds Fmoc)j - duas lavagens* com a duração de Φ¥4 minutos cada uma* com dimeti1acetamida desgaseifiçada sob pressão reduzida (isenta de dimetilamina)§ - uma lavagem simples durante ΦΡ8 minutos com isopropanol ?s

'. i - 4 3 - tris lavagens, com a duração ds Θ=,4 minutos cada uma,, com dimetilacetamida dssgaseificada sob pressão reduzida (isenta de dimetilamina)s ~ tris lavagens5 com a duração de ®s4 minutos cada uma# com l-metil-2“piperido»na destilada? adição do primeiro reagente de acoplamento# que foi prsparado entretanto da maneira que se segues dissolvem-se 237 mmol de Fmoc-L-alanina em é575 ml de uma mistura ®:;4 molar ds i"hidrQí;i-ÍH-fcenzotriazole em i-metil-2-piperidona? a adicionam--se è#48 ml de uma solução 0,5 molar de diisopropilcarbodiimida em l-metil-2”piperidona« A mistura da reacção é mantida à temperatura ambiente durante aprozimadamente 4® minutos e depois usada nesta forma. A reacção ds acoqlaiiienta em si mesma leva 4® minutos e a mistura da reacção é mantida a 5©°f - tris lavagens, com a duração ds ®54 minutos cada uma# com 1-mstiΙ-2-piperidona tiesti1ada § - adição do segundo reagente de acoplamento que foi preparado ©ntretanto o tom a mesma composição do primeiro·# tendo sido preparado da mesma maneira^ a reacção de acoplamento sfectua-sa a 5®°C e leva 3® minutos (pode obter-se com a segunda reacção de acoplamento uma reacção quase completa)p -- uma lavagem simples com a duração de ®#4 minutos com dimstilacatamida desgasei ficada., sob pressão reduzida (isenta ds dimoti lamina)s - um tratamento simples com a duração ds 4?5 minutos# com aproMimadamsnte 3® ml de uma mistura 1 = 1=8 Cv/v/v) ds anidrido acético# piridina e dimetilacetamida (para a acetilação dos 44

W ' * - grupas amina que ainda estio livres, sendo as compostas M-acstx-lados removidos no sistema de processamento subsequente)5 - tr@s lavagens3 com a duração da ®,4 minutos cada uma, ccjm dicnetilacstamida desgaseifieada, sob pressão reduzida í isenta de dxmstilamina) ϋ - uma lavagem simples com a duração de Θ,Β minutos com isoprapanol§ - lr@s lavagens, com a duração de ®,4 minutos cada uma, com dxsetílacsiamxda desgaseifiçada, sob pressão reduzida (isenta de dimetilamina)§ - oito tratamentos, com a duração de 1,8 minutos, com uma solução a 20% tís piperidina em dimetilacetamida (remoção do grupo protector de Fmoc)5 -· duas lavagens, com a duração tis ©,4 minutos cada uma, com dimetilacetamida desgaseifiçada, sob pressão reduzida (isenta de dimetilamina)5 -- uma lavagem simples com a duração de Θ,Β minutos com isopropanolρ - trfs lavagens, com a duração ds ®,4 minutos cada uma, com dimetilacetamida desgaseifiçada, sob pressão reduzida (isenta de dimetilamina)ρ s fcrfs lavagens, com a duração de ®,4 minutos cada uma, com 1-me t i1-2”ρiperidona destiladas

Depois de afectuados estas passos do processo, α composto peptídso/rssins resultante é lavado cinco vezes com isopropanol s saco sob pressão reduzida (alto vácuo), 1=2 A fim de se remover o veiculo poliméríco e;! caso se deseje, alguns dos grupos protectores lábeis ralativamants aos ácidos5 agitam-se lsI g do composto peptítíeo/resina (aproximada-mente βΡ1 mmal>, qus é obtido de axzaréa com o processo atrás referido, durante 5 minutos, à temperatura ambiente5 em 6 ml de uma mistura 98s2 ív/v) de ácido trifluoroacético <95%5 a stano·--ditiol? filtram-se seguidamente e trata—se de novo o resíduo da filtraçlo durante u® período de 5 minutos cons a mesma quantidade da mistura ácido triflúoroacético/etanodiol e filtram-se mais uma vez, 0 resíduo da filtração é depois lavado duas vezes com L· ml tíe i,2-dicloroetano de cada vezP e duas vezes com 6 ml de tri-fluoroetanol ds cada vez. Os filtrados combinados e os líquidos de lavagem slo concentrados à temperatura ambiente sob pressão reduzida para uo· volume de aproximadasente 5 ml ? e o peptídeo em bruto é precipitado através da adição de 25 ml de uma mistura 1s1 Cv/v) de éter diisopropilico e éter de petróleo (baixa ebulição), 0 precipitado è isolado por filtração e seco sob pressão reduzida (pressão elevada).

Os grupos protectorss podem ser removidos completamente dissolvendo o peptídeo era bruto em 5 ml de uma mistura 93s2 (v/v) cie ácido trif luoroacético (95%) e etanoditiol; a solução á mantida à temperatura ambiente durante 60 minutos? e o peptídeo é precipitado de novo pela adição de 25 ml de uma mistura 1s í Cv/v) de éter diisopropílica e éter de petróleo (baixa ebulição)§ este tratamento é repetido roais uma vez e o tempo de reacção atinge os 5® minutos, 0 precipitado é dissolvido eni 2Θ ml ds ácido acética aquoso a 10% s Xioíilizado§ o peptídeo em bruto é obtido sob a forma de um pó branco. 1=3 rara a redução de qualquer porção de sulfó;<ido de mstionina que possa estar presente dissolves-se ®=í g do peptideo era bruto resultante em 1 ml ds ácido trifluoroacático C9@%)? sdiciona-ss uma solução de 0?©15 g de iodeto de amónio em i ml de água e5 após 1® minutos3 o peptideo ê precipitado á temperatura ambiente através da adição de 6 ml de uma mistura isi ív/v) de éter diisopropi1ico e éter de petróleo <hai«s ebulição)= 0 álea avermelhado assim obtido é dissolvido em Ξ ml de ácido acético aquoso a i®% = adicionando-se ura total de ® = ®1 g de ácido ascór-bico em porções até a solução ficar completamente incolor= A solução é submetida a uma filtração com asl = para o que se usa urna coluna de um produto de poliacrilamida com uma gama de separação de 1®Θ® a 6ΦΘ® (coluna Biogel-Pàj, manufacturada por Bio-Rad)» A eluiçSo efectua-se com ácido acético aquoso a í®%5 e o peptideo em bruto desejado ê obtido coma uma primeira fracçãa depois de separado por lavagem com aproKimadamente 4® ral§ 0 produto é obtido sob a forma de ura pó branca par liofilicaçãa»

Partilham-se 265 mg do produto filtrado com Bíoqel num aparelha de partição era contra-corrente cora ura volume de fase de 3 ml no sistema álcool t-amilo/âcido acètico/áqua <4s2s5§ vsvsv) por 19Θ® etapascomeçando nos rec ipients 3-5= Temam-se 2 fracçSes limite dos recipientes 33-39 e dos recipientes Bi—9®= Continua a processar-se o material obtida após concentração no vácuo e liofilisação da fracção principal altamente purificada dos recipientes 40-8®. manufacturado por

Dissolvem-se para purificação ®3®65 q do peptideo em bruta assim obtido era 6=5 ml de ácido acético aquoso a 2®% e submetem-se em duas porções (2=2 ml e 453 ml) a cromatoqrafia liquida de alta pressão sob as condições que se segueras a coluna,, que mede 2®κ25Θ mms ê constituída por gel de sílica5 carregada cora cadeias alifáticas (Nucleosil 7CÍ8P ’ ’ 'χ

Macherey-Magel3 Dueren3 República Federal da Alemanha) usando-~ss ácido trifluoroacêtico aquoso a β?1% como eluente CA) e uma solução a ®nl% de ácida trifluoroacêtico em acetonitrilo coma eluente (3) „ 0 gradiente linear ê de 15% de B ·--> 45% de B em 5Θ fiiinutoSj 45% de B —> é©% de B em 1Θ minutos3 6@% de B -> 1©β% de B em i@ minutos5 a velocidade de passagem é de IB ml/min e a dstecção de raios UV de 2i5 nm = A fracção principals com um tempo de retenção de aproximadamente 45 minutosê recolhida5 concentrada sob pressão reduzida Calto vácuo) e depois liofi-lizsds= Deste modo o peptídeo PCATFP de fórmula CH.-r-CQ-"-A 1 a-Pro-Fsn-Arg-Ser-Ala-Leu-Slu-Ser-Ber—·

Prc3"Ala~-Asp~Pro-"Ala--Trs-Leu“Bsr-Slu-Aspj"· G1u~A1 a-Arg“Leu-Leu"Leu-A 1 a-A 1 a-Leu-va 1 -· Sln-"Asp~Tir”Val---Gln'“i1et-LiS"”Ala~-Ssr~-Siu-Leu-G 1 u~8 1 n-G 1 u-S In-Glu-Arq-G 1 u-G 1 i -Ser--·

Arg-I le-~I le-Al a-Gln-OH é obtido sob a forma de um pó branco, A cromatografia liquida de alta pressão (colunas gel de silica5 carregada com cadeias slifáticas CNucleosii 5Cí8;i manufacturado por Macherey-Nagel, Dueren, República Federal da Alemanha)2 dimensãos 4?ό x 25Θ mm3 eluents As ácido trifluoro-acético aquoso a ô?l%? e elusnte Bs uma solução a 0,1% de ácido trifluoroacêtico em acetonitrilop gradiente linear ®% de B 90% .....> de B em &Φ minutos| velocidade de passagems 1 ml/min? detec- ção por raios Uv§ 215 nm) para o produto homogéneo assim obtido, dá um tempo de retenção de 3758 minutos π A espectrometria de massa de desadsorção de plasma (257 Cf) fornece o peso molecular correspondente,:

X s -í í í FAB-HSs MH' 6220), ponto isoeléctricos 4,2 (calculados D material de partida pode ser obtido da seguinte maneiras A construção da molécula do peptideo sfectua—se de acordo com a síntese de Merrifield, a partir do chamado éster Fmoc-SeríBuw-g-benziloxIbenxilico-resina ds poliestireno (ligação crusads 1%) snanufacturado por Novahiochem, Laeufeifingen, Suíça)5 em que o grupo carhoxi ds L-serina, de que o grupo amino è protegido por 9-fluoroenil—metoKi—carbonil CFmoc) e o grupo HidroKi. é protegido por t-butilo (But), é esterificado com álcool 4-metoKÍbensí1ico em que o átomo de carbono do grupo mstoKi está ligado a um anel aromático ds resina de poliestireno., 1% ds ligação cruxada com divinilbenxeno, que actua simultaneamente como veículo. Para tal usa-se uíb aparelha de síntese peptídica completamente automático que é adequado para a remoção alternada de grupos protectores ds amino, no casa presente, o grupo Fmoc, e o acoplamento dos derivados ds ácido Fmoc-amino sem isolamento dos intermediários peptídeo/resina que se podem obter em cada etapa. Numa primeira etapa o Fmoc-Arg(Pmc)-0H (Pmcs 2,2,5,7,8--psntamstil-crofiian-ó-su.1 fonilo) é acoplado com o material de partida Ser(Bui)/resina e em seguida os outros amino ácidos Fmoc sSo acoplados em várias etapas, na seguinte sequfncia, ao intermediário peptideo/resina que se pode obter após cada etapas Fffloc-Pro-OH, Fffloc-Ssr(But)-OH, Fmoc-AspíGBut)-OH Co segundo grupo carboKi que não participa na reacção encontra—se sob a forma de éster t-butílico), Fmoc-Lau, Fmoo-Ssr<But}-OH, Fmac-Ssr<But>-OH, Fmoc-Eli-OH, Fmoc-GIuCOBut>-0H, Fmoc-Arg(Pmc)-OH, Fmoc--BluCOByt >~ -OH, Fscc-Sln—OH, Fmoc-Glu(OBut)”OH, Fmoc~6In-0H, Fmoc—GluCOBut)--ΌΗ, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-61u(0But)~0H, Fmoc-Ser(But)-0H, Fmoc-AIa-—OH, Fmoc—Lis<Boc)-0H, Fmoc—Met—OH, Fmoc—Gin—OH, Fmoc-val-OH, Fmoc ”T ir (Bu.t)-Oh,. Fmoc-Asp( DBut )~0H, Fmoc-Sln-OH, Fmoc-val-OH, Frooc-Leu-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Leu-Oh, Fmoc-Leu-OH,

Fnsoc-Leu-OHj Fmac-Arg<Pmc)-OHj rmoc-Ala-OH? Fíncc-OIu(QBut)-DH? !::iBoc-Asp(OBut)— OH 5 Fmoc-BIu COBui )-0H? Fmoc--Ssr (But )”0H5 Fmoc~ “L.0U'”OH3 Fmoc-Treí But>“OH;i Fraoc-Ala-OH» F®oC"Pro~-OH3 Fmoc-ftsp™ (OBut)“OH5 Fciíoc-AIa-OH? Fmoc-Pro—OH3 Fmoc-BerCBut}-OH5 Fsoc~-GIu·-<QBut)~OHs Fffloc““L®U“OH? Fisoc“-Leu~OHs Fmac-Ala--OH5 F®oc~8er·--(But)-OH5 Fmoc-Arg(Pmc )--0H? Fmoc-Fen-OH e Fmoc~-Pro-~OHS

As etapas individuais efectusm-se de acordo cam a seguinte ssqaesna, usando-se aproKimsdamenie, em cada caso, 3Θ mi de líquidos de lavagem5 com as operaçSes individuais* salva indicação em contrário e são rsalissdos è temperatura ambiente e a rsacção da mistura é rsgularmente agitada»

Partindo da 2 g do material de partida Fmoc—BerCBut)— /resina atrás descrito,, sfectuam-ss as seguintes etapas do processo3 repetidas para cada etapas - unia lavagem simples durante ® =8 minutos com isopropanol ρ - tr@s lavagenss com a duração de 0;:4 minutos cada umas com diroeiilacetamida desgaseifiçada sob pressão reduzida (isenta de dimetilamina)f - oito tratamentos,, com a duração de 1»Β minutos cada um? com uma solução a 20 de piperidina em dimetilacetansida (remoção do grupo protector de Fmoc)§ ™ duas lavagensj com a duração de θ54 minutos cada uma» com d imeti1acstamida desgaseifiçada sob pressão reduzida (isenta de dimstilamina)§ - uma lavagem simples durante ©*8 minutos com isopropanols 5®

- três lavagens, com a duração de 6,4 minutos cada uma, com dimstiiacetamida desgaseificada sob pressão reduzida (isenta de dimsiilsfiíina)? ™ três lavagens, com a duração de ®,4 minutos cada uma, com í-msfciI-2-pipsridona destilada§ - adição do primeiro reagente de acoplamento, que foi preparado entretanto da maneira que se segues dissolvem-se 2,7 mmol de Fmoc-L-amino ácido respectivo em è,75 ml de uma mistura 0,4 ffiolar de l-hidroííi-lH-bsnzotriazols em l~metil~2“pipsridana5 s adicionam-se è,48 ml de uma solução ®,5 molar de diisopropil-carbodiimida em l-mstil-2-pipsridona» A mistura da reacçao é mantida è temperatura ambiente durante aprozimadamente 4Θ minutos e depois usada nesta forma= A raacção de acoplamento em si mesma leva 4Θ minutos s a mistura da rsacçlo ê mantida a 5®°§ - três lavagens, com a duração de ®,4 minutos cada uma, com 1 "~ms t i 1 -2- piperidona destilada? - adição do segundo reagente de acoplamento que foi preparado entretanto e tem a mesma composição do primeiro, tendo sido idêntica a sua preparação? a raacção de acoplamento sfectua-se a 5®° e leva 3Θ minutos (pode obter-se uma rescção quase completa com a segunda reacçSo de acoplamento)? ~ lavagem simples, com a dursção de ®,4 minutos, com tíime-tilacetamida dasgasaifiçada sob pressão reduzida (isenta de disistilamina) § - tratamento simples com a duração de 4,5 minutos, com aproí?imadamente 3© ibI de uma mistura de isisS (v/v/v) de snidrido acético, piridina e dimstiiacetamida (para a acstilaçlo de grupos 51

«mino que ainda se encontram livres na cadeia peptidea crescente) ;; - tr‘§s lavagensf. com a duraçSo de minutos cada uma? com dímetilacsiâffiidâ desgaseificada sob pressSo reduzida (isenta de dimetilamina)5 -- uma lavagem simples durante ®?8 minutos com isopropanoI= e - tr‘ês lavagens;, com a duração de ®54 minutos cada uma5 com dimetilacetamida desgaseificada sob pressão reduzida (isenta de dimetilamina)§

Obtém—se deste modo o intermediário Fmoc-pepiideo/— resina usado como material de partida na Exemplo atrás descrito que tem a seguinte fórmulas

Fmoc-Pro-Fen-Arq < Pmc)-Ser(But)-Ala-Leu-Glu(OBut >-Ser(But)-Ser (But)-Pro-Ala—Asp<OBu t)-Pro—AIa-Tre í But)-Lsu-Ber(But)-Slu C OBut) Asp(OBut)-Glu(OBut)—Ala—Arg(Pmc)—Leu-Leu—Leu—AIa—Ala—Leu—Vai— B1n-Asp C DBut)-T i r < Bu t >-Va1-G1n-Me t-L i s(Boc)-A1a-Ser C Bu t)-G1u (OBut) --Leu -Glu (OBut) -Sln-Siu íGBut)-Arg < Pmc > -Giu< OBut) -G1 i -Se r (But)-Ser(Bu c)-Leu-AspC OBut)-Ser(But)-Pro-Arg <Pmc)-Ser(But)-resina, em que “resina” representa o radical poliestireno CligsçSo cruzada a 1¾ com divinilbenzeno)-mstoxi-4-fenilmetoxi que ssteri-fica o grupo carboni.

Exemplo 2 s Substância estéril injectável

Dissolvem-se ®51 mg do peptideo ΡΟΑΊΠ-Ρ (Exemplo 1) em 1 ml de uma solução aquosa juntamente com 2® mg de manitol, A solução

X ’ estéril ê filtrada e introduzida sob condições assépticas numa ampola de 2 nil 5 for temente congelada s liofilizada» Antes de utilizado» α liofilizado é dissolvida em 1 ml da água destilada ou tsm 1 ml de soro fisiológico e a solução é administrada, por exemplo» por via intramuscular ou intravenosa» Ε&βββΙα......3 s

De maneira análoga à que foi descrita no Exemplo 1» mas acetilando com anidrido acético do modo descrito no Exemplo 1 o grupo amimo livre da alanina terminal obtida após a remoção do grupo protector de Fmocs obtém-se o seguintes CH-^-CO-Ala-Pro-Fen-Arq-Ser-Ala-Leu-Blu-Ser-Ser- v?

Pro-AIa-Asp-Pro-AIa-Tre-Lsu-Ser-Slu-Asp-81 u-A1a-ft rg-Leu-Leu-Leu—A1a-A1a-Lsu-val-G1 n-Asp-Tir-va 1 -B1 π--Me t-Lis-Al a-Ser-Bl u-Leu ~G1u—G1n —G1u—G1n —Glu—Arç—Glu—Gli—Ser— Ser-Lsu-Asp-Ser-Pro-Arg-Ser-OH

De maneira análoga à que foi descrita no Exemplo 1 ,, nsss partindo de uma resina sintética preparada tal como a seguir se descreve». com ligação dos amimo ácido protegidos que correspondem à estrutura do produto final desejado5 mas usando Fmoc-Glnítri™ tilo)--OH em lugar de Finoc-Gln-OH» s com a remoção final de todos os grupos protectores residuais com ácido trifluoracético/água/-1 »2-stanDdiol <95s5m5) durante um período de 4® minutos à temperatura ambiente» obtém-se o seguintes -X . Η-Α1 a-Hro"i-· en-Arg-Ser-A 1 a~Leu~81 u-Ssr-Ssr-Pro-ftla-fisp"-Pro--AIa-Tre~L©u-Bsr-Bli.i-Asp~ 131n-Asp—T i r-Va 1 --61 n—Het—Lis-AIs—Ser-81u—

Lsu-G I u-G 1 η ~·81 u--G 1 n -G1 u-Arg~G I u-G 1 i -Ser-A r g-11e-11e-ft1a™81n-OH

Os materiais de partida são obtidos tal como se segues

EmocrmnJJrtirQH,),

Adicionam-se com agitação vigorosa 3=,4 g de carbonato de 9—f luorenilmetil-sucoinifflidinilo ΐ i© mmol> soí 2® ml de tetrahi-tírofursno e i© ml a uma solução de 4 g ds hemi—hidrato de H-Sln-(Trt)-OH <i® íumol) em 2© ml tís tetrahidrofurano s 1© ml ds uma solução ds hidróxido ds sódio aquoso 1NS e ao mesmo tempo adicionam-se ls4 ml de trietilamina de tal modo que o valor do pH atinja aproxlmadaments 8*5, Passados 2® minutos esse todo é arrefecido num banho de gelo5 recoberto com acetato de eiilo e acidificado com 25 ml de uma solução aquosa ln de sulfato de potássio até se obter um valor do pH de 2~255= A fase orgânica é lavada com água até ficar neutra» seca sobre sulfato ds sódio s concentrada para 3© g sob pressão reduzida* 0 produto é cristalizado pela adição em porções de 35 ml ds éter diisopropxlico» Depois de um repouso prolongado a temperatura reduzida» o material cristalino é isolado por filtração e lavado uma vez numa mistura de 1=4 de acetato de ©tilo © éter diisopropílico e trfs vazes com éter diisopropilico» 0 Fmoc-GlníTrt>-0H ainda contem ©35 ml de éter diisopropílico mesmo depois de secagem prolongada sob alto vácuo a 68° P p„f. a partir de 125° (fusão lenta com a libertação de éter diisopropíiico) 54

l-.mac"ei.n<jrt)-QH

Agita-se uma mistura de 7»4 g de Fínoc-GIn-OH (2Θ mmol) e :L®54 g tíe trifenilmetanol (40 mmol) em 3Θ© ml de ácido acético a durante 1© minutos» Depois da adição de 0? i ml de ácido sulfõrico concentrada a toda é agitada a 1.00o durante mais 15 minutos5 formando-se uma solução clara, amarela,: Esta é concentrada par evaporação sob pressão reduzida a 6®° e o resíduo é seca sob pressão reduzida durante 1® minutos» 0 resíduo sólido è dissolvido em 6Θ ml de ácido acético a 60°s deixada a 6Θ* durante Ξ® minutos» Adicionam-se em seguida 2 ml ds anidrido acético (2Φ mmol) e após uma hora a 60° o todo έ concentrado por evaporação sob pressão reduzida» 0 resíduo oleoso è saco durante 1$ minutos a Ò0*;, depois á dissolvido em 1Θ0 ml ds ácido acético e introduzido gota a gota em 5Θ6 ml de égua gelada» 0 precipitado é isolado por filtração, bem lavado com água e dissolvido em acetato ds etilo? a fase aquosa ê separada por filtração e a fase orgânica é lavada com uma solução saturada de cloreto de sódio» Depois de seca sobra sulfato de sódio, a solução orgânica é concentrada até à secura por evaporação, o resíduo é dissolvido em 50 ml de í »2-dicloroetano e aplicado a 1ΦΦ g de gel de sílica;; a eluição efectua-se com 1,2-dicloroetano s com 132-dicloroetano contendo 2% e depois 4% de metanol» As fracçSes contendo Fmoc— -8InCírt>-0H são concentradas por evaporação sob pressão reduzida '·:· o produto è cristalizado a partir de uma mistura de acetato de etilo e éter diisopropí1ico5 p„f» a partir de 125°»

Resina sintética

Adicionam—se 3,35 ml C23,4 mmol) de cloreto de 2»6—diclo— robenzoilo (Fluka) em 4 porções durante um período de 5 horas a uma suspensão ds 1Θ g do chamado poliestireno de álcool 4-bsnzi-loxibenzi1ico <0,78 mmol OH/g§ ligação cruzada 1% com r di.viπiIhsnzsno3 Os grupos feniJ.o da paliestirsna sSo substituídos na posiçSo 4 com 4~hiciro;<iffielilfenoKimetiiop Novabiochem)? Í5;i6 miBol ds Fmoc-Gln(Trt)-OH e 3Pi. ml <38 = 5 mmol) ds piridina sm &Φ ml ds dimetilaceiamída, e o todo é agitado durante 24 noras* A resina ê isolada por filtraçSo e cuidadosaments lavada com metanol s com 1s2-dicloroetano* A resina tem uma carqa de 0*48 mmol/g Cdeterminação fotoméfcrics ds Faioc)* Os grupas residuais OH sao acetilados durante 2 horas com anidrido acètico/piridina/-dímstilacstamida is 1=8 antas do começa da síntese dos peptídeos*

EjiefflElo_5

Ds maneira análoga à descrita no Exemplo 4S mas por acetila-çSo com anidrido acètico5 tal coma foi descrita no Exemplo i* do grupo amino livre da alanina terminal obtida apés remoção do grupo protector de Fmoc5 obtém-se α seguintes

Cny-CO-H1a-Pro-Fsn-Arg-Ssr-A1a~Leu-B1u-Ser-Ser- *»!

PrD—ftla-Asp“Pro~Ala—Tre-'Leu—Ser-Slu—Asp—

81 u-Ά 1a-Arg-Leu-Leu-Leu-AIa-A1a-Leu-~ VaI-B1n-Asp~Tir-Va1~G1n-Mei-Lis—AIa-Ber-B1u-L eu ~G1u-GIn-Glu-Sln-Glu-ftrg—Slu-Gli-Ssr-Arg-Ile-Ile-AIa-G1n-OH

Claims

56 * I 3»

igivindicacões lã - Processo para a preparaçlo de um péptido de fórmula (I), R-Als-Pro-Fen-Arg-Ser-Ala-Leu-Glu-Ssr-Ssr- Pro—Ala-Asp-FJro-Ala—Tre-Leu-Ssr-Glu-Asp- < I) GIu-AIa-Arg-Leu-Leu-Leu-A1a-Ala-Leu~Va1 -Gin -Asp-T i r~Va 1 -81n—Me t-Lis-A 1 a-Ssr-G 3. u-Leu-B 1 u~iá i n~B í ur-B1 n--B í u~ Ar g~S I u.~tí 1 x -Ser-- 3í ~UH mm qua R representa hidrogénio ou acetilo s X a sequ@ncia da smino ácidos de fórmula -Ser-Leu~Asp-Ser~Pro~Arg-Ser- (Ia) ou da fórmula -Arg-Ile-ϊle-Ala-Gln ílh), e dos sais dos referidos compostos, caracterizado por a) ss f «raiar, uma ligaçla amida presente num composto com a sequência de amino ácidos de fórmula 1por reacção de um fragmento desse composto, que apresenta um grupo carboni livre reactivo, ou um seu derivado de ácido carboKilico rsactivQj com o fragmento complementar do referida compostas que apresenta um grupo amino livre, ou com um seu derivado rsactivog em qua os grupos funcionais livres nos referidos fragmentoss coa a excepçlo dos dois grupos que participam na rsacçlo, estio, sa necessário, numa forma protegida, s por ss remover os grupos protegidos que possam estar presentes, ou b) se propagar células hospedeiras, transformadas com um vsctor de SKpresslOj que contém uma sequfncia de DMA qua codifica a sequência de amimo ácidos de fórmula I e que é regulada por uma sequência de controlo de exprssslo, ε? caso seja necessário, se libertar das células hospedeiras um composto com a sequência ds aralno ácidos da fórmula 13 a ;;s isolar, s, quando for necessário, nui composto obtido ds acordo com o inv©ntc*3 contando um agrupamento sulfóxido3 se convsrtsr este agrupamento num grupo tio5 e sempre que se tíessje,, se converter o sal obtido de acordo com o processo no composto livre e/ou se converter o composto livre obtido de acordo com o processo num sal= 2ã --· Processo de acordo com a Reivindicação 1,, caracte-risado por se escolher os materiais de partida de modo a preparar um péptido de fórmula 13 em que R representa hidrogénio e X tem o significado referido na Reivindicação I. ou um sal desse composta „ ós - Processo de soarão com a Reivindicação 23 caracts- ricado por se escolher os materiais de partida de modo a preparar um péptido de fórmula I3 em que X representa uma sequência de amima ácidos ds fórmula -Ser-Leu-Asp- Ber-Pro-Arg-Ser-CIa)=, ou um sai desse composto. Lisboa5 24 de Agosto de 1989

]. PEPuEtílÃ DA CRUZ Agante Cf.dd da Prepiísdado Industrial RUA ViCTOFi COPtDSM, 10-A, 1/ 1200 LISBOA'