PT91738B - Processo para a producao de substancias de origem vegetal - Google Patents
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Description
DESCRIÇÃO
A presente invenção refere-se a um pro cesso para a produção de substâncias de origem vegetal por cultu ra in vitro.
São conhecidas numerosas substâncias de origem vegetal com algum interesse económico para indústrias como a farmacêutica, (princípios activos dos medicamentos), a cosmética (perfume), a alimentar (aromas e aditivos). A produção destas substâncias faz-se geralmente por extracção, a partir de plantas colhidas ou cultivadas. No entanto, este método apresenta numerosos inconvenientes, particularmente no que respeita ao armazenamento de matérias primas vegetais (periodicidade, estahi lidade, qualidade...).
A fim de superar estes inconvenientes, estudaram-se diversos processos de substituição. Entre estes, é de salientar o processo de cultura in vitro de tecidos ou cêlu las indiferenciadas de espécies produtoras. A este respeito, podemos citar a patente japonesa JP 57-39778, relativa â cultura de calos num meio líquido agitado contendo a celulose, a fim de daí extrair os princípios activos por meio de óleo de parafina e/ou de matérias gordurosas, assim como a publicação de Bisson et al. (Journal of medicinal Plant Research, 1983-47-164), relativa à extracção de óleos essenciais de uma cultura de células indiferenciados de camomila, por adição ao meio nutritivo de pequenas gotas de uma fase gasosa, na qual os óleos se irão acumular. Contudo, utilizando células indiferenciadas, estas técnicas ficam limitadas à produção de produtos bem definidos.
A presente invenção proporciona acumular as vantagens de um sistema diferenciado às de cultura in vi tro .
Assim, o processo de acordo com a presente invenção é caracterizado por:
- implantar um órgão vegetal num meio de cultura e
- manter esse órgão em anoxia ou hipoxia por imersão sob um leito de óleo.
De preferência, extraem-se as substâncias produzidas do órgão vegetal do meio de cultura e/ou do óleo, Para isso, podem utilizar-se as técnicas de extracção tradicional. 0 principal interesse do processo consiste na colocação em cultura in vitro de órgãos vegetais produtores das substâncias procuradas, e na sua manutenção em sobrevivência e em fase de produção destas substâncias, durante longos períodos.
óleo utilizado para manter a hipoxia pode permitir evitar eventuais perdas de substâncias voláteis e assegurar a respectiva extracção.
Uma vantagem da invenção é proporcionar a produção de substâncias de um modo constante e reproduzível.
Uma outra vantagem ê poder prolongar a fase de produção de substâncias a partir de órgãos vegetais, por períodos bastante mais longos do que a duração normal da pro dução in situ a partir de plantas.
Outra vantagem é poder conservar no ór gão vegetal as caracteristicas qualitativas específicas, o que raramente acontece no caso de culturas celulares indiferenciadas,
nas quais se podem produzir substâncias secundarias.
Deste modo, os órgãos vegetais não só não perdem a vida e sobrevivem durante vários meses, como continuam a acumular nos seus tecidos, no meio de cultura e no óleo da hipoxia substâncias como os óleos essenciais, de natureza idêntica ou aproximada âs das produzidas pelos métodos tradicionais de extracção a partir de plantas.
Este processo refere-se â manutenção em sobrevivência de órgãos vegetais, a não ao crescimento e/ou à proliferação de tecidos, mesmo que isso possa acontecer em certos casos, de um modo reduzido.
De entre os critérios utilizáveis para a apreciação da sobrevivência de um órgão vegetal, é de notar os seguintes:
- ‘como critérios quanto ao aspecto . a evolução da pigmentação do implante . o aparecimento de clorose ou manchas escuras (oxidação)
- como critérios morfológicos:
. o desabrochamento floral . o aparecimento de calos ou raízes
A apreciação destes critérios é feita de diferentes modos:
- de modo visual
- com o auxílio de testes bioquímicos (teste de coloração,
...), que permitem apreciar a viabilidade do órgão.
Os órgãos vegetais colocados em cultura podem ser de todos os tipos e cultivados em partes ou por inteiro.
Pode tratar-se, por exemplo, de fragmentos de raízes, de folhas ou de caules, ou ainda botões de fio res ou flores desabrochadas.
Estas plantas ou órgãos podem ser de qualquer origem:
- obtidos por recolha de plantas cultivadas ou colhidas. Nescaso, o processo irã permitir melhorar a utilização de produtos vegetais tradicionais, graças a um prolongamento da fase de biosíntese e de produção das substâncias procuradas.
- ou formadas a partir de culturas celulares. Neste caso, o
processo permitira uma total independência em relação à cul tura tradicional.
As plantas ou órgãos vegetais podem ser previamente descontaminados, antes do seu implante no meio de cultura, a fim de eliminar os microorganismos prejudiciais. A descontaminação pode ser efectuada por imersão das plantas ou or ganismos, durante alguns minutos, numa solução de descontaminante, como a água de javel, o bicloreto de mercúrio, o hipoclorito de cálcio ou sódio, ou qualquer outro descontaminante usual, ou por qualquer outro modo de natureza química ou física (raios x,
.. .) .
meio de cultura utilizado deve proporcionar ao órgão vegetal os alimentos necessários à sobrevivên cia em fase de produção.
Este meio nutritivo pode ser semi-sõLi do (substância gelatinosa aquosa) ou liquido, agitado ou não, a fim de simplificar a colocação de órgãos vegetais em cultura. No último caso, a colocação em cultura pode resumir-se a uma imersão dos órgãos descontaminados no meio nutritivo, sendo em segui_ da cobertos por uma película de óleo, a fim de evitar as mudanças da superfície.
É possível renovar o meio de cultura, a fim de proporcionar sempre ao órgão os elementos necessários à sua sobrevivência e de modo a daí retirar os eventuais compostos dispersos (opostos e/ou pretendidos). 0 renovamento pode efectuar-se de modo continuo ou semi-contínuo.
Do mesmo modo, é possível modificar e_s te meio com o adicionamento de reguladores de crescimento e/ou com o adicionamento de elementos susceptíveis de favorecer a pro dução dos metabolismos pretendidos (adicionamento de percursores).
meio de cultura ê de preferência um meio usual no domínio da cultura de tecidos in vitro, tal como os meios de Gamborg, de Heller, ou ainda de Murashige e Skoog, cujas composições são dadas no Quadro I.
Segundo a presente invenção, o meio de cultura preferido ê o meio de Gamborg.
õleo que cobre o órgão vegetal pode
assegurar duas funções:
- tem primeiramente o papel de agente de conservação, assegurando a manutenção da hipoxia e
- pode actuar como agente para atrair/extrair as substâncias lipo-permeãveis pretendidas.
A escolha do óleo estã ligada a determinados critérios tais como:
- a sua capacidade para provocar hipoxia, ou seja, a não trans ferir, ou transferir pouco oxigénio exterior para o órgão vegetal e o seu meio de cultura,
- o seu poder solvente em relação às substâncias pretendidas,
- a sua ausência de toxicidade em relação aos órgãos vegetais.
Visto ser preferível renovar periódica mente o óleo, podendo este ficar saturado devido ã extracção das substâncias pretendidas, um meio de hipoxia liquido ê mais fácil de manipular do que um meio sólido, no entanto utilizável.
óleo pode ser renovado de modo contí nuo ou semi-contínuo.
Entre os óleos utilizáveis, de citar os óleos de origem orgânica ou vegetal, os óleos de síntese, assim como qualquer outro óleo susceptível de desempenhar o papel de agente conservador.
De acordo com a presente invenção, o óleo preferido é um óleo de parafina.
óleo pode ser previamente desgaseif/ cado e esterilizado. A desgaseificação pode ser efectuada colocando-se o óleo em vácuo, fazendo assim sair os gases nele cont/ dos que podem eventualmente ser substituídos por azoto.
A fim de evitar uma degradação da clorofila que poderia alimentar a sobrevivência do órgão vegetal, pode utilizar-se uma iluminação fraca, da ordem de 0-400 lux, no momento de pôr em prática o processo de acordo com a invenção. A temperatura da cultura pode variar entre 189 C e 359 C. De prefe rência deverá ser de cerca de 259 C
O processo de produção de substâncias de origem vegetal pode realizar-se descontinuamente, semi-continuamente ou continuamente.
Os exemplos que se seguem ilustram mais detalhadamente a invenção.
Os exemplos A, B e C ilustram mais par ticularmente a manutenção em sobrevivência e os seus critérios de apreciação. Os exemplos são precedidos pelo quadro seguinte, que apresenta a composição dos meios de cultura utilizados.
Quadro I: composição dos meios utilizados (pH = 5,8)
| Meio de Mura shige e Skoog mg/1 | Meio de Gamborg mg/1 | Meio de Heller mg/1 | |
| Sacarose | 20000 | 20000 | 20000 |
| Ãgar '(meio gelificado) | 8000 | 8000 | 8000 |
| Macroelementos | |||
| nh4no3 | 1650 | - | - |
| (nh4)2so4 | - | 134 | - |
| CaCI2, H20 | 440 | 150 | 75 |
| MgSO4, 7H2O | 370 | 250 | 250 |
| KC1 | - | - | 750 |
| kno3 | 1900 | 2500 | - |
| kh2po4 | 170 | - | - |
| NaNO3 | - | - | 600 |
| NaH2PO4, H20 | - | - | 125 |
| Microelementos | |||
| A1C13, 6H2O | - | - | 0,05 |
| CoCl2, 6H2O | 0,025 | 0,025 | - |
| CuSO4, 5H2O | 0,025 | 0,025 | - |
| FeCl3, 6H2O | - | - | 1,0 |
| FeSO4, 7H2O | 27,8 | 27,8 | 27,8 |
| Na2 -EDTA | 37,3 | 37,3 | 37,3 |
| MnSO4, 4H2O | 22,3 | 10,0 | 0,1 |
| NíC12, 6H2O | - | - | 0,03 |
| Kl | 0,83 | 0,75 | 0,01 |
| Meio de Mura shige e Skoog (mg/1) | Meio de Gamborg (mg/1) | Meio de Heller (mg/1) | |
| Na_MoO., 2H„0 2 4 2 | 0,25 | 0,25 | - |
| ZnSO., 7H„0 4 2 | 8,6 | 2,0 | 1,0 |
| h3bo3 | 6,2 | 3,0 | 1,0 |
| Vitaminas | |||
| Pantotenato de cálcio | - | - | 1 |
| Meso-inositol | 100 | 100 | 100 |
| Acido nicõtico | 10,5 | 1 | 1 |
| Piridoxina (vit. Bg) | 0,5 | 1 | 1 |
| Tiamina (vit. B^) | 0,1 | 10 | 1 |
| Biotina | 0,1 | ||
| EXEMPLO A | |||
| Descontaminaram- | se fragmentos de cau- | ||
| les de funcho por imersão | durante alguns minutos numa | solução de | |
| hipoclorito de cálcio, em | seguida enxaguam | -se abundantemente em | |
| água destilada esterilizada. Estes fragmentos são depois implan- | |||
| tados num meio de Gamborg | solidificado por | adição de | ãgar-ãgar. |
Sao em seguida colocados em hipoxia por adicionamento de óleo de parafina esterilizado, e deixados ã temperatura de 259 C, sob uma iluminação fraca (200 lux).
Observa-se a evolução da pigmentação dos caules de funcho colocados em hipoxia, em comparação com cau les semelhantes, colocados no mesmo meio nutritivo, mas sem adicionamento de óleo, durante um período de 18 semanas.
Decorridas 6 semanas, todos os caules em hipoxia ainda estão verdes, sem sinais de clorose, enquanto que os caules de comparação apresentam todos um princípio de cic rose. A oxidação ou clorose total atingiu 30% dos caules de comparação depois de decorridas 8 semanas, enquanto apenas 10% dos caules em hipoxia apresentam um princípio de clorose, aumentandc
para 20% ao fim de 12 semanas.
Depois de 16 semanas, 90% dos caules de comparação estão oxidados totalmente contra 40% dos caules em hipoxi, estando os restantes ainda verdes.
Depois de 18 semanas, 100% dos caules de comparação estão completamente oxidados, enquanto que apenas 50% dos caules em hipoxia estão oxidados, apresentando os restan tes 50% apenas um princípio de clorose.
De notar que após 6 semanas, jã não hã caules de comparação totalmente verdes, enquanto que 50% dos cau les em hipoxia ainda estão verdes decorridas 16 semanas.
EXEMPLO B
As flores em botão de tuberosos são co lhidas em três fases diferentes de desenvolvimento.
Fase I: Corola de 1-1,5 cm de comprimento - pétalas verdes
Fase II: Corola de 2 cm - princípio de branqueamento das pétalas
Fase III: Corola de 3 cm - pétalas brancas
Os botões são descontaminados e implan tados num meio de Gamborg gelifiçado.
Estes botões são em seguida colocados em hipoxi por adicionamento de óleo de parafina. Não se adiciona óleo aos botões de comparação. Deixa-se o conjunto sob iluminação fraca (200 lux) e a 259 C.
A evolução da oxidação destas flores em botão com o tempo ê anotada arbitrariamente segundo uma escala de 0 a 7 , explicitada seguidamente:
grau 0: ausência de manchas de oxidação grau 1: princípio de oxidação nas extremidades das pétalas, num máximo de 10% das pétalas grau 2: princípio de oxidação nas extremidades das pétalas, em mais de 10% das pétalas grau 3: oxidação de metade da superfície das pétalas num máximo de 10% das pétalas grau 4: oxidação de metade da superfície das pétalas em mais de
10% das pétalas grau 5: oxidação de metade da superfície das pétalas em mais de 50% das pétalas grau 6: oxidação considerável da flor (80%) grau 7: oxidação completa da flor.
De notar gue a adição de antioxidantes ao óleo de parafina não proporciona qualquer diminuição notável da oxidação.
A utilização de óleo desgaseifiçado também não permite notar uma diferença significativa em relação ao óleo não desgaseifiçado. Pelo contrário, a diferença entre os botões colocados em hipoxia e os botões de comparação é evidente.
Os quadros seguintes mostram a evolução do grau de oxidação com o decorrer do tempo:
Para os botões da fase I:
| Tempo (dias) | 2 | 5 | 7 | 10 | 13 | 17 | 18 | 24 | 28 |
| Comparação | 0 | 0 | 1 | 1 | 5 | 5 | 6 | 7 | 7 |
| Õleo | 0 | 0 | 0 | 1 | 1 | 1 | 2 | 2 | 3 |
| Õleo desgasei- | |||||||||
| ficado | 0 | 0 | 0 | 1 | 1 | 1 | 2 | 2 | 3 |
| Verifica-se | que os | botões | de | compara | |||||
| ção estão completamente | oxidados | decorridos | 24 dias | , enquanto | |||||
| que a sobrevivência dos | botões eir | hipoxia se | prolonga | para além | |||||
| das 6 semanas. | |||||||||
| Para os botões | da fase | II | |||||||
| Tempo (dias) | 2 | 5 | 7 | 10 | 13 | 17 | 18 | 24 | 28 |
| Comparação | 0 | 0 | 2 | 2 | 5 | 7 | 7 | 7 | 7 |
| Õleo | 0 | 0 | 0 | 1 | 1 | 1 | 1 | 2 | 2 |
| Õleo desgasei- | |||||||||
| ficado | 0 | 0 | 0 | 1 | 1 | 1 | 1 | 2 | 2 |
Os botões de comparação apresentam-se oxidados após 17 dias, estando os botões em hipoxia apenas leve- 9 mente oxidados
Para os botões Tempo (dias)
Comparação
Õleo
Õleo desgaseifiçado
11 2
Os botões de comparação estão oxidados os botões colocados em õleo podem ser antes de ficarem totalmente oxidados.
apos 7 dias, enquanto que conservados até 28 dias,
EXEMPLO C
Vários õrgãos vegetais foram descontaminados, implantados num meio de Gamborg gelifiçado e depois colocados em hipoxia sob um leito de õleo de parafina e deixados à temperatura de 259 C, sob uma iluminação fraca (200 lux). Entre estes vegetais, encontram-se plantas aromáticas (I), plantas per fumadas (II) e plantas não produtoras de aromas, mas produtoras de substâncias não voláteis de interesse farmacológico ou cosmético (III).
Os resultados destas experiências são dados no Quadro que se segue:
| Espécies | Õrgãos | Possibilidade sobrevivência | ||
| I | . Ocimum basilicum | folhas | 10-12 | semanas |
| . Verbena triphylia | folhas | 3-4 | semanas | |
| II | . Pelargonium capitatum | folhas | 8-10 | semanas |
| . Pogostemon patchouli | folhas | 8-10 | semanas | |
| III | . Ferula galbanum | raízes | 10-12 | semanas |
| aparecimento de calos | ||||
| . Gingko biloba | folhas | 14-16 | semanas |
Qualquer que seja o tipo de planta ou de órgão implantado, a sobrevivência em hipoxia é possível duran te pelo menos um mês e pode ser mantida por um período que pode atingir os 4 meses.
EXEMPLO 1
Folhas de mentol, descontaminadas e se guidamente implantadas num meio de Gamborg, são colocadas em hipoxia sob um leito de óleo de parafina, à temperatura de 259 C. Segue-se a produção de compostos aromáticos durante a sobrevivên cia, por um período de 5 semanas. As folhas de mentol são separa das em 3 lotes e submetidas a condições experimentais diferentes
| Lote | .A- | iluminação | forte | (2000 | lux) |
| Lote | B: | iluminação | fraca | (200 | lux) |
| Lote | C: | iluminação | forte | (2000 | lux) e adição de percursor de |
terpenos.
Segue-se mais especificamente a presen ça no óleo de um composto característico da essência: a carvona.
óleo ê renovado regularmente durante um período de 35 dias, nos 3 lotes, e efectua-se uma análise quantitativa por densimetria num leito delgado de cromatografia, a fim de determinar a quantidade de carvona contida no óleo reco lhido. Os resultados são confirmados por uma análise por cromato grafia em fase gasosa.
Quadro que se segue dã a quantidade de carvona acumulada no óleo, para os 3 lotes, e por um período de 5 semanas.
A quantidade de carvona ê dada em micrograma por grama de matéria fresca de folha implantada.
| Tempo (dias) | 1 | 2 | 3 | 4 | 7 | 14 | 21 | 28 | 35 |
| Lote A | 20 | 60 | 10 | 240 | 10 | 170 | 120 | 240 | 110 |
| Lote B | 110 | 60 | 10 | 20 | 20 | 20 | 20 | 140 | 110 |
| Lote C | 620 | 60 | 80 | 10 | 170 | 170 | 260 | 340 | 170 |
Verifica-se um auge de produção de car vona no início da operação, seguido de uma baixa de produção, e depois de um novo aumento, com um novo auge de acumulação ao 289 dia.
quadro que se segue apresenta a produção de carvona acumulada durante um período de 35 dias, (em pg/g de matéria fresca).
I II III IV
| Lote A | 690 | 980 | 635 | 925 | |
| Lote | B | 690 | 510 | 600 | 420 |
| Lote | C | 690 | 1880 | 820 | 2010 |
| I: | conteúdo | inicial de | carvona | na folha | implantada |
| II: | carvona | acumulada nc | óleo durante 35 | dias | |
| III: | quantidade final de | carvona | nos tecidos residuai | ||
| IV: | ganho de | carvona em | 35 dias |
Estes dados mostrambem o retomar da síntese de carvona com o decorrer do tempo, mais do que um simples fenómeno de extracção sôlida/líquida, podendo o produto pro duzido atingir três vezes a quantidade contida no implante inic_i al.
EXEMPLO 2
Caules de funcho de acordo com o exemplo A são cultivados in vitro num meio de Gamborg gelifiçado e sob óleo de parafina.
Segue-se a produção de p-aliloanisol, composto característico da essência, durante a sobrevivência, por um período de 2 meses.
Os caules de funcho são separados em 3 lotes que se submetem a condições experimentais diferentes:
Lote A:
meio de Gamborg de base sacarose: 20 g 1 1 iluminação: 200 lux Lote B: meio de Gamborg de base + regulador de crescimento sacarose: 20 g 1 iluminação: 200 lux
Lote C: 1/10 de meio de Gamborg de base sacarose: 10 g 1 iluminação: 200 lux
O óleo de parafina é regularmente reno vado ao fim de 1, 3, 5 e 7 semanas, depois analisado quantitativamente e qualitativamente por cromatografia em fase gasosa. Verifica-se a presença de p-aliloanisol no óleo assim como o apare cimento de outros numerosos compostos de natureza aromática.
O quadro seguinte apresenta a quantida de de p-aliloanisol acumulado no óleo (em pg/g de matéria fresca de folha implantada), em função do tempo:
| Tempo (dias) | 7 | 21 | 35 | 49 | I | II | III | IV |
| Lote A | 222 | 42 | 122 | traces | 333 | 386 | 35 | 88 |
| Lote B | 400 | 48 | 42 | traces | 333 | 490 | 30 | 187 |
| Lote C | 291 | 94 | 52 | 136 | 333 | 573 | 106 | 346 |
I: conteúdo inicial de p-aliloanisol no caule implantado.
II: p-aliloanisol acumulado no óleo
III: quantidade final de p-aliloanisol nos tecidos residuais.
IV: ganho de p-aliloanisol depois de 7 semanas (II+III-I)
A produção total pode atingir o dobro da do implante (L0te C).
Claims (5)
- - 1- Processo para a produção de substâncias de origem vegetal por cultura in vitro, caracterizado por:- implantar um órgão vegetal num meio de cultura e- manter o órgão em hipoxia por imersão sob um leito de óleo
- 2- Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se extraírem substâncias de origem vegetal produzidas a partir do órgão vegetal, do meio de cultura e/ou do óleo.Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o meio de cultura e/ou o óleo serem renovados de modo contínuo ou semi-contínuo.Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o óleo ser de origem orgânica, de origem ve getal ou um óleo sintético, e ser esterilizado e/ou desgaseifica do.Processo de acordo com a reivindicação
- 4, caracterizado por o óleo ser um óleo de parafina.Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o órgão vegetal ser um órgão completo ou parte de uma raiz, de uma folha, de uma flor, ou de uma flor em botão.
- 7- Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o órgão vegetal ser previamente descontaminado antes do implante.
- 8- Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se adicionarem percursores e/ou reguladores de crescimento ao meio de cultura.Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se manter o órgão em hipoxia sob uma ilumi15 nação que pode variar entre 0 e 400 lux.- 10- Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se manter o órgão em hipoxia, a uma tempera tura entre 18 e 359 C.A requerente reivindica a prioridade do pedido apresentado como pedido de patente europeia em 19 de Setembro de 1988, sob o n9. 88115354.8.
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