PT91785A - Processo para a preparacao de polioxometalatos com accao anti-viral e de composicoes farmaceuticas que os contem - Google Patents

Description

RAYMOND_Fi = SgHryAZl_!==CEÔIi==Li = = HrrL "PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE POLIOXOMETALATOS COM ACÇÃO ANTI-VI RAL E DE COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS QUE OS CONTÊM"

Antecedentes da Invenção

Campo da Invenção: A presente invenção refere-se a certos compostos polioxo metalatos, particularmente a sais de aminoacidos de polioxometala tos que são agentes antivírais. Em particular, estes agentes po dem-se utilizar para o tratamento de infecções por retrovfrus tais como HIV [HTLV-nr/LAVl, que provocam a sfndrome de imuno-deficiência adquirida [SIDA], A presente invenção também diz respeito a um método de tratamento de doenças virais, tais como a SIDA, que envolve o tratamento de um animal infectado com HIV com uma composição que contêm um ou mais dos compostos da presejn te invenção. Também podem ser tratadas outras retroviroses com os compostos da presente invenção,

Discussão dos conhecimentos anteriores A primeira vez que se detectou a SIDA foi em 1979, 0 nu mero de casos registados pelos Centros de Controlo de Doenças (Centers for Disease Control], (CDCJ, aumentou dramaticamente cada ano, desde então, e em 1982 os CDC declararam a SIDA uma nova epidemia, SÕ em 1984 foram declarados 3,000 novos casos ,

Em 1 de Junho de 1988, a Organização Mundial de Saude (WHOJ anun_ ciou que tinham sido registados em todo o mundo cerca de 100,000 casos de SIDA. Contudo, na realidade, a WH0 estimou cerca de 200.000 casos da doença no mundo inteiro, Também foi calculado que aproximadamente 5 Q00 000 de pessoas estavam presentemente infectadas com HIV e pelo menos 1 000 000 de novos casos de SIDA podia esperar-se durante os próximos 5 anos.

Nos Estados Unidos, foram assinalados cerca de 70 000 ca^ sos de SIDA pelos U,S. Centers for Disease Control (CDC], Só em 1987 foram registados perto de 28 000, Previu-se que nos Estados t

Unidos serão registados entre 365 000 e 38Q 000 casos totais em 1992. Nos CDC considera-se que 1 milhão ou 1,5 milhões de americanos estão presentemente infectados com HIV, E evidente que o custo da epidemia de SIDA em termos de vidas humanas ê duvidoso e que o pior ainda esta para vir.

Os agentes causadores da SIDA propostos foram os retro-vírus. Dois destes retrovírus que se sabem provocar a SIDA foram identificados e isolados: LAV (Vírus associado com a linfa denopatíaj e HTLV-III [Vírus de leucemia de células T-humanas). Mais tarde, determinou-se que LAV e HTLV-III são idênticos, Re centemente, a designação vírus daimunodeficiencia humana tipo^ (HIV1 foi considerada como sendo a designação preferida para o vírus responsável pela SIDA.

Estão presentes em mais de 80¾ dos doentes diagnostica- dos com SIDA ou com a síndrome pre-SIDA anticorpos para HIV e também se detectaram, com grande frequência, em grupos de risco i denti ficados. Há grande dificuldade em diagnosticar o risco de desenvolvimento de SIDA, Sabe-se que a SIDA se desenvolve pelo menos em 10% dos indivíduos infectados com HIV, embora esta. percentagem se suspeite ser maior.

Geralmente, diagnostica-se um doente com SIDA quando um adulto anteriormente saudável, com um sistema imunologico inta£ to, adquire uma imunidade de cilulas-T diminuTda, A imunidade diminuída aparece babitualmente durante um período compreendido entre 18 meses e 3 anos. Como resultado desta imunidade diminuT da, os doentes tornam-se susceptTveis a infecções oportunistas, a vários tipos de cancro como o sarcoma de 'Kaposi e outras pe£ turbações associadas com um funcionamento reduzido do sistema imunologico.

Outra condição associada com HIV e o complexo relacion£ do com a SIDA ou ARC, Esta condição conduz também, em alguns casos, ã SIDA. Não existe actualmente tratamento capaz de prevenir a doença ou de reverter imunodefíctincia da SIDA ou de ARC. Todos os doentes com infecções oportunistas e aproximadamente metade de todos os doentes com sarcoma de Kaposi morreram nos dois anos a seguir ao diagnóstico, Não têm tido sucesso as tentativas pa_ ra restaurar o sistema imunitário nos doentes com SIDA,

Recentemente referiu-se que a 3 1 -azido-3 '-desoxi timidí ná (AZT) e um agente antiviral que inibe a infectividade e o efeito citopãtico de HIV-1 i_n vi tro e prolonga a vida i_n vivo, (Ver Mitsuya, et al., Proc, Na11t Acad, Sei, USA 82 (1985) 7096-100 , Fischl, et al., New Engl, J, Med,) Contudo, os resultados preli_ minares indicam que este composto exibe toxicidade e neurotoxi-cidade na medula óssea numa experiência clínica., (Ver Yarchoan et al., Laneet (1986), 575-580. Richman, et al , AZT foi primeiro sintetizada por Horwitz et al., J, Org, Chem, 29 (1964), 2076-2078, Em 1973 foi referida a sua’ actividade contra o vírus da leucemia de Friend (um retrovírus) (Ver Ostertag et al,-Proc, Natl. Acád.

Sei. USA, 71 , (1974), 4980-49.85 e Krieg et al ,Ex-ptl , Cell ,

Res. 116, (1978), 21-29,e referências aqui citadas),

Os compostos da presente invenção não estão estruturalmente relacionados com AZT, A patente de invenção norte-americana n<? 4,681,933 diz respeito a certas 21,31-didesoxi-5-substituída-uridínas e compostos relacionados, como agentes antivirais, Estrutural mente estes compostos são semelhantes a AZT e são muito diferentes dos compostos da presente invenção, A patente de invenção norte-americana n? 4.759,929 tem uma relevância particular para o presente pedido de patente de invenção. Nesta patente de invenção descreve-se um método para o tratamento de infecção por HIV-1 em animais de sangue quente que envolve o tratamento com um sal de 9-antimõnio-III-21 -tungs_ ten-VI-soda.to, (’NH^+)-| yH^NaSbgW^i 0gç7 j (também conheci do por Η PA-23) - Este composto 5 um polioxometalato, mas sob o ponto de vista da composição i diferente dos comoostos da presente inveji ção. Contudo, existem inconvenientes ligados· com este fãrmaco, tais como: 1] induz tromboci'topenta e, em geral, apresenta uma toxicidade elevada sobre as células da medula óssea humana e 2) deve administrar-se por via endovenosa, uma vez que se degrada a um pH <£4.

Também se descobriu que os compostos polioxometalatos possuem actividade anticoagulante, A patente de invenção francesa n9 2.587.214 diz respeito a heteropolianioes de tungsténio com acção anticoagulante para utilização In-vivo e tn vftro a fim de impedir a coagulação do sangue,

Os polioxometalatos ou polioxoanioes são agregados oligo mericos condensados de átomos de metal e de átomos de oxigénio que ocorrem em duas formas genéricas: as que contem apenas es-tes átomos (isopolioxoaniões, tsopoli-compostos ou isopolioxome-talatos] e os que contém um ou mats "heteroãtomos11 alem dos átomos de metal e de oxigénio (heteropolianioes , heteropol i compos-· tos ou heteropolioxometalatos], Nesta ultima classe de comple-

I xos, os heteroãtomos podem ser iões de grupo principal tal como 4+ 5+

Si (sob a forma de si 1icotungstato = ST], P (sob a forma de tungstato de Dawon, DT] ou grupos de iões de transição tais como 3+2+ - - -

Fe ou Co . Os polioxometalatos sáo conhecidos hd um século mas apenas recentemente é que aumentou o interesse por estes com postos. Em certa medida, isto deve-se ao facto de estes compostos serem agora quimicamente melh.or definidos. Alem disso, desde 1977, os polioxometalatos e, em especial, os heteropolicompo^ tos ou heteropol iacidos receberam uma atenção maior como reagentes ou como catalisadores para processos redox que envolvem sub£ tratos orgânicos.

Apesar dos agentes conhecidos para o tratamento da SIDA, mantém-se a necessidade de métodos novos e eficazes para o trata mento de infecçoes retrovirais, particularmente infecçoes por HIV, incluindo a SIDA e o complexo relacionado com a SIDA (ARC) . Foi neste contexto que a presente invenção se realizou,

Resumo da Invenção

Nestas condições, e um objecto da presente invenção proporcionar novas composições eftcazes para o tratamento de infec-ções virais, particularmente para infecçoes por retrovírus; E ainda um objecto da presente invenção proporcionar métodos para o tratamento de infecçoes virais, particularmente para o tratamento de infecçoes retrovirais;

Constitui também outro objecto da presente invenção proporcionar compostos e composições para o tratamento de SIDA ou de ARC em mamíferos, incluindo os seres humanos.

Estes e outros objectos da presente invenção, como poste riormente se tornará mais evidente, realizaram-se pela descoberta de que os polioxometalatos com as estrutras identificadas an-teriormente exercem actividade inibidora sobre as células tnfec- tadas por diversos retrovírus, conduzindo a uma e.XDectativa de que estes agentes tenham actividade in vivo contra esses retro vírus em mamíferos, tais como seres humanos,

Breve Descrição dos Desenhos- A apreciação mais completa da presente invenção e de mui_ tas das suas vantagens sera mais facilmente conseguida se a in venção for bem compreendida em referencia à descrição pormenorizada que se segue quando considerada em ligação com os desenhos que as acompanham, em que: A Fig, 1, representa três tipos de estrutura de políoxómetalatos representativos, A Fig. 2 representa um esquema de síntese para ArgH-ST, o sal de arginina do silicotungstato, A Fig. 3 representa o efeito relativo de HPA-23, ST, BT, NH^BT e NH^ST na formação de colónias de células precursoras de gra-nulocito-macrófagos humanos,

Descrição Pormenorizada dos Aspectos Preferidos Polioxometalatos da Presente invenção

Os polioxometalatos da presente invenção podem represen-tar-se pelas formulas gerais seguintes. -8 -8 n = 0 - 4 m = 0 - 5 n = 0 - 4 p = 0 - 6 (^nC^U-nCSi^Ml4 tX+imfH+Í5-mCBW12°40!5' fX )n^H ^4-η^10°32^ (x+)pCH+i6.p(P2(f,8062!6 em que X representa um átomo de potássio ou de sódio ou um grupo amónio, histidina H, lisina H, arginina H e seus hidratos, X tam bem pod.e representar qualquer aminoãcido ou polipêptido monocatio nico de ocorrência natural (por exemplo com 2 a 10 aminoãcidos, de preferência 2 a 4 amtnoãctdòs contendo um aminoãcido básico de ocorrência natural que pode ser arg, bis, lys na sua forma protonada, portanto sob a forma catiõnica],

Com a finalidade de simplicidade e clareza utilizam-se aqui as abreviaturas seguintes: tStW12°40l4’ = ST (8Μ12°40!5' = BT = W10 CP2W18°S2 ^ = DT hi strdina = Flts 1i sina = Lys argi nina = Arg

De entre os grupos representados por X, preferem-se, pa ra a presente invenção, os aminoãcidos básicos protonados de

J ocorrência natural, histidina H, lisina H e arginina H e, em es_ pecial, arginina H. No entanto, para os fins da presente invenção também ê possível utilizar outros aminoãcidos ou pequenos peptidos de ocorrência natural, como catiões, que sejam capazes de formar uma carga positiva sob condiçoes acidas, Exemplos de pequenos peptidos são Gly-Arg, AIa-fíis-Ala, e outros. Os peque nos pépt.idos podem não ocorrer naturalmente, mas serã preferível que sejam à base de aminoãcidos de ocorrência natural , Os aminoãcidos de ocorrência natural sao, geralmente, escolhidos entre os 20 aminoãcidos de ocorrência natural que se encontram mais vulgarmente nas proteTnas,

Os compostos da presente invenção podem-se sintetizar por métodos conhecidos convencionais, Os fsopoltoxometalatos , tais como W1Q e os Fieteropolioxometalatos, tais como ST, são preparados mais frequentemente por acidificação cuidadosa a con_ centrações correctas de tungstato monomerico, util izando-se habi_ tualmente o sal de sÕdio, NaWO^, em solução aquosa, com um precursor solúvel na ãgua do heteroãtomo, se apropriado, seguida de precipitação do produto, 0 sal solúvel na agua apropriado dos catfoes desejados X+ é adicionado na última fase, Na secção dos Exemplos, proporcionam-se os processos para a preparação de S'T, BT e alguns dos sais dos aminoãcidos ST e BT.

Exemplos especrficos destes compostos que são abrangidos pelo âmbito da presente invenção são os seguintesí

Cnh41h3st Cnh4Ik4bt (;nh4[2h2st cnh4j2h3ht

Cnh4!4hbt

(NH4)4ST

(ArgHln(H]4.nST, η = 1 - 4 [NH4!5BT (.UysH 1 n (Η) s_nBT, η = 1 - 5 k5bt (HlsH)n(H)6.nDT, n = 1 - 6 NajBT Têm interesse especial os compostos de formula geral (ArgH } (H ]r BT na qual n representa um numero inteiro de 1 Π D*íl a 5.

Quando se refere a actividade antivtral, nesta invenção, quer significar-se a capacidade de um composto para inibir o desenvolvimento de um vTrus in vitro ou in- vivo, Os vTrus com par ticular interesse no presente pedido de patente de invenção são HIV-1, HIV-2, vTrus de herpes simplex tipo 1(HSV-1] e Tipo 2 (JÍSV-2J e vTrus da fmunodeficiencia no SIV, Têm especial importância HIV-1 e HIV-2,especial mente HIV-1. Contudo, os presentes compostos podem também exibir actividade antivtral sobre outros retrovTrus e mesmo sobre vTrus em geral, tais como vTrus da famT 1 ta do herpes,incluindo vTrus do herpes simplex tipo 1 e tipo 2 e os 2 retrovTrus murinos (EY 10 e Cas-Br-M^, Os presentes compostos podem ainda apresentar propriedades antimicrobianas.

Os seres humanos que sofrem de doenças provocadas, por exemplo, por HIV podem-se tratar mediante administração ao doen_ te de uma quantidade eficaz sob o ponto de vista farmacêutico de um ou mais dos compostos da presente invenção, facultativamente, mas de preferência na presença de um veiculo ou um dissolvente aceitável sob o ponto de vista farmacêutico. Podem ainda incluir -se agentes de ligação compatíveis aceitáveis em farmácia e/ou substâncias adjuvantes. Os componentes activos também se podem misturar com outros componentes activos que não diminuam a acçao pretendida e/ou complementem a acçao desejada, As substâncias activas, de acordo com a presente invenção, podem administrar-se por qualquer via, por exemplo por via o-al , parenteral, endoveno sa, intradêrmica, subcutânea ou tópica, sob a forma solida ou sob a forma liquida. Para injecção o meio utilizado deverá ser um liquido estéril. Como meio injectável prefere-se utilizar água que contenha agentes de estabilização,' agentes de solubili-zação e/ou agentes tampão convencionais, no caso das soluções i njectávei s.

Os aditivos desejáveis incluem, por exemplo, tampões de tartarato e borato, etanol, dimetilsulfÕxido, agentes formadores de complexos (por exemplo, acido etílenodiaminatetracêtico}, polímeros. de peso molecular elevado, (por exemplo polioxíetileno líquido], para regular a viscosidade ou derivados de polietileno de anidridos de sorbitano.

As substâncias solidas para veículo incluem, por exemplo, o amido, a lactose, o manitol, a meti 1celulose, o talco, o ácido salicílico de grande dispersão, ácidos gordos de alto peso molecular (tais como o ácido esteárico), gelatina, ágar-ágar , fosfato de cálcio, estearato de magnésio, gorduras animais e ve getais ou polímeros de alto peso molecular sõlidos, tal como os pol ieti 1 enogl icõis, As composi ções apropriadas para admini stra ção oral podem, se apropriado, conter agentes apaladantes e/ou agentes edu1 corantes. A forma de administração preferida dos compostos· desta invenção e a via oral. Assim os compostos podem apresentar-se sob a forma de comprimidos.

As substancias activas, de acordo com a presente invenção, podem empregar-se em dosagens e quantidades que são determinadas por métodos convencionais da farmacologia, Assim, para seres humanos, as substancias podem-se utilizar em doses compre endidas entre 0,1 e 100 mg/kg, de peso do corpo e por dia, Os limites mais preferidos variam entre 1 e 3Q mg/kg de peso do corpo total e por dia, Os limites mais preferidos estão compre endidos entre 1 e 2Q mg/kg de peso do corpo e por dia. As dosjj gens podem administrar-se por uma so vez ou repartidas em um cer to numero de doses mais pequenas para se administrarem com inter valos de tempos variáveis.

Esperasse que os compostos da presente invenção sejam utilizáveis no tratamento de mamíferos, incluindo os seres humanos. Outros mamíferos são os cães, gatos, macacos, cavalos e ou_ tros.

Para serem utilizáveis, os compostos devem exibir toxfci dade relativamente baixa sobre as células normais, As toxicidades de alguns dos presentes compostos foram avaliadas em células Vero e em células mononucleares humano de sangueperiférico e detérmina ram-se os valores da toxicidade. Os testes de toxicidade são descritas a seguir. A presente invenção, descrita agora de um modo geral, se ra melhor entendida por referência a certos exemplos específicos que são incluídos com fim de esclarecimento apenas e não devem ser entendidos como limitando a presente invenção em qualquer dos seus aspectos, a menos que especificado,

Exemplos Experimentais Síntese de compostos representativos i. h4stw12o4Q QJ, Pope, Michael Tfior,

Ffeteropoly and Tsopoly Oxometalates, Springer-Verlag,

Berlim, 1983, p. 1.

Preparou-se uma solução de M-a^WQ,^^ ^2 por dtssolução de 25 g do composto em 125 ml de agua desiontzada soB agitação num Balão de fundo redondo de 250 ml. Em seguida, adfcionaram-se 1,25 ml de solução aquosa de stlreato de sodto (NaSiOg) saturada, (agua arrefecida], e aqueceu-se a mistura resultante ã temperatura de 80°C durante 5 minutos, Mesta altura, adicionaram--se 15 ml de acido clorídrico concentrado durante 1,5 hora, uti lizando-se um funil de gotejamento, ã solução quente, sob aqita ção. Em seguida, retirou-se o aquecimento e transferiu-se a so lução para uma ampola separadora que se deixou arrefecer durante 15 minutos. A adição de 10 ml de acido clorídrico e 50 ml de eter dietTlico provocou a formação de três camadas. As duas ca_ -14- / madas superiores eram límpidas, sendo a camada de cima etérea e a camada seguinte aquosa, Havia em seguida uma zona de separação branco-sujo mal definida de composição desconhecida constituída provavelmente por uma mistura da camada anterior e da camada do fundo. A camada do fundo era constituída Dor um líqui-do viscoso transparente que era o eterato que continha o produ to. Retiraram-se cada uma das camadas superiores e a camada de eterato ficou em repouso durante uma noite 5 temperatura am&ieii te para formar cristais. Estes cristais recristalizaram-se em agua e o produto cristalino Branco (14 g} foi caracterizado por TV, VV e e RMN 183 W. Os espectros eram caracterTsticos do com posto. ΓΧ, Síntese de sais de aminoãcidos:

Lisínio, arginínio e histidídio a partir de'K A. Sal de lisínio (2j

Este processo foi adaptado do processo de E, 0, North para o sal de sodio, Jasmín, C,, et ai. J. Natl, Câncer Inst. 53, (1974^, 469, Preparou-se uma solução saturada de'1_ em agua

I utf1fzando-se 3,6 g numa quantidade mínima de água. Em seguida, preparou-se uma solução saturada utilizando-se 1 gde monocloridra to de listna (Aldrích) numa quantidade mínima de agua, A solução de lisina foi depois adicionada ã solução de'2, com agitação. A adição resultou num precipitado Branco Brilhante cuja nature za de polioxòmetalato foi confirmada qualitativamente por uma rápida mudança da cor para azul quando se expôs uma pequena quaii tidade numa espátula de metal durante alguns minutos. Filtrou--se sob vazio o precipitado e secou-se uma pequena quantidade sob

vazio a temperatura de 40°C. Um IV da substancia seca 0:35) mostrou a presença do conjunto de picos caracterTsticos de assim como vários picos provenientes de um cattão contrário ("countercatton"} de lisina, A recristalização do composto ob^ teve-se por dissolução deste em água com pouco aquecimento e deixando a solução repousar ã temoeratura ambiente ate à formação de cristais. Após vários dias, formaram-se torrões gelatinosos branco-azulados, Os torrões transformaram-se numa massa em põ branco quando filtrados sob vazio, Utilizando as mesmas condições de recristal ização obteve-se uma segunda recristal iza_ ção de mais torrões que se tornaram em microcristais brancos quando filtrados sob vazio, ARMn"*H do produto confirmou a pre sença de lisina (por comparação com o espectro da reférência). 0 IV ' também mostrou a presença dos picos caracterTsticos do cloridra-to de lisina, assim como os picos de referências esperados para o anião de B. Sal de argininto (31

J

Uttlizou-se o mesmo processo geral Dara a preparação de£ te sal que se utilizou para a preparação de 2 com a substituição do monoclortdrato de arginina (Alfa] pelo cattão contrario. Em contraste com o sal de lisina, formou-se um precipitado branco apenas apos a adição de 3 ml da solução saturada, em vez de se formar imediatamente. Devido a esta formação do precipitado mais lenta, a solução foi deixada sob agitação durante 1 hora antes de se submeter a filtração sob vazio para se retirar o pro duto. Efectuou-se a recristalização por tratamento de 3 g do composto com 25 ml de ãgua.

Embora a mafor parte do composto permanecesse insolúvel apos tratamento com ultra-sons e agitação sob aquecimento moderado, recolheu-se o filtrado e deixou-se repousar Ϊ temperatura ambiente durante vários dias, Formaram-se cristais brancos (_0,5 gj que se recolheram, 0 espectro de IV do produto exibiu os picos caracterfsticos do anião de 1_ e observaram-se os picos provenientes do catião contrario de argininto. A RMN mostrou um perfil de picos quase idêntico ao que se observa para o comoo^ to inicial do catião contrario de argínínio, assim como se ajustava com o espectro dos seus componentes descrito na bibliografia. C, Sal de histidTnio C£1

Nesta preparação segutu-^se o mesmo processo geral nesta nesta que se utilizou para a síntese de 2 com substituição do cloridrato de histidina CAlfaJ pela "fonte do catião contrario, Preparou-se uma solução saturada de 1 por dissolução de 4 g de£ te numa quantidade mínima de agua, Preparou^-se uma solução saturada de cloridrato de ftfstidina e adicionou-se, gota a gota , a solução de 1_, Durante as adições iniciais, formaram^se peque_ nas partículas de precipitado branco que desapareceram rapidameni te por redissolução, Â medida que se adicionou mais solução do catião, aproximadamente 2 ml, este precipitado tornou-se permanente e apos adição de mais 1 ml de solução, a solução resultan te foi deixada sob agitação durante 1 hora e o precipitado forma_ do filtrado sob vazio, Efectuou-se a recristalização por trat£ mento de 1,71 g com 200 ml de agua, Embora alguma quantidade do composto permanecesse insolúvel, recolheu-se o filtrado e deixou- -se em repouso ate ã formação de microcristais brancos. 0 TV e o RMN do composto eram consistentes com os componentes do composto. ΓΠ - Síntese de

Adicionou-se sucessivamente a 1Q0 ml de água sob agitação vigorosa o seguinte: 50 g de 2,5 g de H^BOg e 30 ml de HC1 6 M. A solução resultante, pFf aproximadamente 6 , deixou-se em ebulição durante 8 horas. Adicionou-se água de tem pos a tempos, quando necessário, Qualquer substancia solida for mada neste período foi retirada por filtração, beta-paratungsta^ to CNaiq2°4'2*se9ut'da> acidtficou-se a solução para pfÍ2 com acido clorídrico 6M e manteve-se em ebulição durante mais 30 minutos. Efectuou-se a precipitação com 10 g de cloreto de potássio solido, ApÕs filtração e uma lavagem com éter dietíli-co, recristalizou-se o produto impuro a temperatura de 6O°C em 25 ml de água, 0 espectro de infravermelho do produto era típico do espectro da bibliografia relativa ao composto, IV, Síntese de sais de aminoãcidos:

Lisínio, arginínio e histidínio, a partir de'5_, A. Sal de lisínio (6):

Utilizou-se o mesmo processo geral para esta síntese que o utilizado para os sais de aminoácidos de Preparou-se uma solução de 5 por dissolução de 1,3 g em 25 ml de água. Obteve-se um líquido turvo . Também se preoarou uma solução saturada de cloridrato de lisina em água. Adicionou-se esta solução, gota a gota, à solução 5_ sob agitação. Durante a adição a solução foi-se tornando progressivamente límpida com a adição de cada go ta e desapareceu a turvação após a adição de 20 ml, Deixou-se a solução em repouso ate ficar branca, formando-se glóbulos arredondados. Filtrou-se e redissolveu-se em água, deixando-se a re pousar para recristalização. Decorrdios 10 dias obtiveram-se cristais poliédricos transparentes g), Utilizou-se IV e RMN ^H para caracterizar o composto, 0 espectro de IV indicou a presença de anião de 5_ assim como do catião contrario de 11sí_ na. 0 espectro de RMN apresentou a prova mais concludente da presença do catião contrario de lisina pela comparação do espectro com o espectro da bibliografia do cloridrato de lisina e com o espectro dos compostos iniciais, B. Síntese de um composto de formula geral

XgBW^O^o na °lual X representa um grupo NH4+, Na+,

Arginina H+, Histidina H+, a partir de CD·

Prepararam-se estes derivados utilizando-se uma solução de na fase preparatória antes da precipitação de Jã por adição de hidróxido de potássio, Em vez de se utilizar o hidróxido de potássio, prepararam-se diferentes sais mediante acidificação da lução dejj com ácido clorídrico 6M ate pH 1,4, Em seguida,separou-se a solução em 5i alíquotas iguais, depois do que se adicionaram soluções aquosas saturadas de catião contrario até se atiji gir um pH 2,30. As soluções permaneceram em repouso durante 30 minutos e filtraram-se depois os vários precipitados. 1. X representa arginina H+ (7) :

Adicionou-se uma solução de cloridrato de arginina aquo sa saturada como fonte de catfao e obtiveram-se 3,6 g de um pre cipitado branco. Este foi caracterizado por IV e RMN sendo os espectros consistentes com os componentes do composto. 2, X representa fitstidina H+ £81:

Adicionou-se uma solução de cloridrato de histidina aquo^ sa saturada como fonte de catião e obtiveram-se 3,7 g de um precipitado branco, Caracterizou-se o composto por IV e RMN ^H sendo os espectros consistentes com os componentes do composto.

Actfvidade Biológica

Actualmente, não se dispõe de experiências animais para HIV-1 . Podem-se infectar chimpanzés mas estes não desenvolvem a doença. Portanto, de um modo geral, descreve-se a actividade in vitro sobre células infectadas, Células, Células mononucleares de sangue periférico humano [PBMCJ de dadores saudáveis seronegativos para vírus HIV-1 e de hepatite B que se isolaram por gradiente descontinuo de Fícoll--Hypaque, por centrifugação a 1,QQ0 x g durante 30 minutos, que se lavaram duas vezes com solução de cloreto de sodio tamponada com fosfato [pH 7,2, PBSJ e agl omeraram-se a 300 x g durante 10 minutos, Antes da infecção, estimularam-se as células com fito hemagl utini na (PHA) com uma concentração de 16,7 |ig/ml durante três dias em meio RPMI 1640 suplementado com soro de vitela fetal inactivado por aquecimento a 15%, 1,5 mM de L-glutamina , 100 U/ml de penicilina, 100 ^ug/ml de estreptomicina e 4 mM de tampão de hidrogenocarbonato de sódio. Vírus. Obtiveram-se vírus HIV-1 da estirpe LAV-1 por fornecimento do Dr. P. Feonino (Centers for Disease Control, Atlanta, GA). Propagaram-se estes vírus em PBMC humanos utilizando-se meio RPMI 1 640, como descrito anteriormente [McDougal, et al,, J. Immun, Metfí. 76 , (1985), 171 -183 , isento de fito-hemaglutinina e suplementado com ínterleucina-2 97% v/v [Advanced Biotechnol^ gies, Silver Spring, M0), 7 jjg/ml de DEAE-dextrano [Pharmacia, Uppsala, Suécia), e 370 U/ml de [alfa-] interferon de leucócitos anti-humano [TCfí, Lisle, Π). OBtiveram-se os vírus a partir de sobrenadante de cultura isento de células titulado e armazenado em alTquotas a -80°C ate utilização,

Inibição da Replicação do Vírus em PBMC humanos.

Distribuíram-se uniformemente PBMC humanos estimulados „ 2 por PHA nao infectados em frascos de 25 cm para se obter 5 ml fi — de uma suspensão contendo cerca de 2 x 10 celulas/ml. Adicionaram-se os vírus em diluições apropriadas para infectar as cul_ turas. Determinou-se a actividade de transcriptase inversa media [RT] do inoculo como 50 000 decomposições por minuto/ml co_r respondendo a cerca de 100 TCID^q, determinada de acordo com Gro^ opman et al , ["Groopman J. E, et al , , AIDS Res. Human Retro,-3 -21

.% C1987], 71-857, Adícíonàram-se ãs culturas os fãrmacos em concentrações finais duplas em 5 ml de meio RPMI 1640 suplementado como descrito anteriormente, Como controlos desenvolveram-se paralelamente PBMC não Infectados e não tratados com densidades de células equivalentes. Mantiveram-se as culturas numa atmosfera húmida com 5% de diõxido de carbono e 95¾ de ar, em incuba dor, ã temperatura de 37°C durante seis dias apés a infecção, mo mento em que se recolheram amostras de todas as culturas para a análise· da actividade de transcriptase inversa (RT) do sobrena-dante. Estudos prévios tinham indicado que os níveis máximos de RT eram obtidos neste momento.

Ensaio da actividade de RT. - Desembaraçaram-se de células 6 ml de sobrenadante de cada cultura por centrifugação 300 x g durani te 10 minutos. Aglomeraram-se as partículas de vírus a partir de amostras de 5 ml ã velocidade de 40,000 rpm durante 30 minutos utilizando-se um rotor 'Beckman 70,1 Ti e suspenderam-se em 200 ^1 de tampão de fragmentação de vírus (50 mM Tris-Cl, pH 7,8, 80Q mM NaCl,, glicerol a 20¾. fluoreto de fenilmetilsulfonilo 0,5 mM e 0,5¾ de Trfton X-100),

Realizou-se um ensaio para transcriptase inversa em pl«a cas microtituladoras de 9.6 cavidades de acordo com o método de£ crito por Spira et al, /Spira, T, J,, et alJ, Cl in. Microbi ol, 22 (1987), 97-99J, A mistura reaccional contendo 50 mM de Tris--C1, pH 7,8, 9 mM MgC12, 5 mM dttiotreitol (DTT), 4,7 /ig/ml (rA]n. CdTli2_-|8’ ^TP e ^,22 de /½] TTP de activida^ de especifica 78,0 Ci/mmole equivalente a 17 30Q cpm/pmole; NEN Research Products, Boston, MA, que se adicionou a cada cavidade. -s22- í ft amostra (20 jjl] foi adicionada a mistura reaccional que se iii cubou em seguida a temperatura de 37°C durante 2 horas, Interrompeu-se a reacção mediante adição de 100 jj! de acido tricloro acético a 10% (TCA1 contendo 0,45 mM de pirofosfato de sÕdio,

Os ácidos nucleicos insolúveis em ácido precipitaram tendo sido recolhidos em filtros de vidro utilizando-se tim dispositivo de colheita semi-automãtico Skatron (regulado para 9], Lavaram--se os filtros com TCA a 5% e etanol a 7Q%, secaram-se e coloca-rarn-se em ampolas de cintilação,

Adicionaram-se 4 ml de líquido de cintilação (Econofluor, NER' Research Products, Boston, MA] e determfnou^se a quantidade de radioactividade em cada amostra uttlizando-se um analisador de cintilação em liquido Packard Tri-Carb, modelo 2,000CA, Os resultados expressaram-se em dpm/ml do sobrenadante original cia rifi cado.

Ensaio de cttotoxfcidade. Avaliaram-se os fãrmacos relatrvamen te aos seus efeitos tóxicos potenciais sobre PBMC humanas estinui ladas com fito-hemoglutimina não infectadas. Fizeram-se sementeiras nos frascos de forma a que a concentração celular final fos-5 - se de 2 x 1Q celulas/ml, Cu 1ttvaram-se as células com e sem a presença do fãrmaco durante 6 dias numa altura em que se retiraram aliquotas para se contar a viabilidade das células avaliadas pelo método de exclusão-corante de azul de Trtpan utilizando-se um hemacitometro. A concentração inibidora media (CI^q) calc.uloi[ -se utilizando-se o método de efeito médio (Chou, J,, e T. -C. (1985), EIsevfer-Biosoft, Elsevier Science Publishers, Cambridge, Reino Unido; Chou, T,-C:, e P. Talalay, Adv. Enz. Regul22 (1984] 27-55].

Avaliação de compostos- sobre transcríptas-e inversa de retrovfrus purifΐcada. Isolou-se transcríptase inversa de ΗΓV-1 a partir de vírus desagregados em detergente obtidos de sobrenadante isen_ to de células de PBMC estimuladas com fito-hemaglutínina infecta_ da. Purificou-se a enzima por passagens do extracto através de colunas de cromatografia de permuta iõnica, como descrito anteH ormente (Eriksson, B,, et al., Antimicrob. Agents Chemother. 31, ( 1977)'600-604 . Resumidamente, 750 ml de liquido da cultura coibida de ultracentrifugado de PBMC infectados por HIV-1 para aglomerar os virus. Dissolveu-se o aglomerado em tampão A C5Q mM Tris-BCi, pH 7,9/Nonidet P-40 a 0 »2 5 % / 5 mM ditiotreitol/glicerol a 20¾ (p/v]j contendo 1 mM de EDTA e congelado e descongelado quatro vezes, Apos clarificação por centrifugação, purificou-se parcialmente a enzima a partir do sobrenadante por passagem do extracto através de uma coluna de celulòse/DEAE (Whatman DE-52, 2,6 x 15 cm[ equilibrada previamente com tampão B ( 50 mM T.ris--Cl., pH 7,9, 50 mM KC 1, 1 mM EDTA, 1 mM ditiotreitol, glicerol a 20¾]. Efectuou-se a eluição utilizando-se um gradiente linear 50--50Q mM KC1 em tampão B, Dialisaram-se as fracções que continham a actividade enzimitica contra tampão B e purificaram-se depois numa coluna de fosfocelulose Qfhatman P-ll] utilizando-se um gra^ diente linear de KC1 (5Q-500mM] em tampão B, Reuniram-se as fra£ çoes dos picos e dialisaram-se contra tampão B. Caracterizou-se a enzima como transcriptase inversa de HIV-1, baseado nas suas ex£ gincias de catião, sal, pH e matriz, de acordo com descrições ain terrores (Eriksson, B,, et al, Antimicrob, Agents Chemother. 31 (1977] 60Q-604). Utilizou-se uma mistura reaccional padrão para

avaliar o efeito inibidor dos fãrmacos, como descrito previamen-te (Erifcsson, B., et ai . Antimtcrob. Agents Cliemotlier. 31 (1 977) 600-604). As misturas reaccfonais (volume final 100 jil) continham 100 mM Tri s-HCl, pH 8,0, 50 mM KC1, 2 mM MgCl2, 5 mM DTT, 400 jug/ml de albumina de soro bovino, 3 jjg/ml (rA) ’ (dT) 1 ^ g e 1 jiM o de í Η] TTP (actividade especifica 82,3 Ci/mmolesJ, Ini.ciaram-se as reacções por adição de 10^1 de transcriptase inversa parcial_ mente purificada e incubaram-se a temperatura de 37°C durante 60 minutos processam-se de acordo com a descrição ^ anterior (Eriksson, B., et al. Antímicrob.-Agents Chemother,-31 (1977) 600-604).

Ensaios em culturas de célu1 as- para vTrus de fíerpes stmplex * Pa ra os ensaios em placa utilizaram-se células Vero isentas de mi-croplasma obtidas no Flow LaBoratory (^McLean, VA), Os métodos pa ra a redução da placa e ensaios de cftotoxicidade foram descritos anteriormente (Schinazt, R.F., et al, Anttrotcrob'. Agents Chemo-ther. 22 Cl982). 499-507). Método do efeito médio - Analtsaram-se as relações dose-efefto pela equação do efeito médio CCftot·» T.-C, e P. Talalay, Adv. Enz. Regul. 22 984J, 27-55). Os valores da curva (m) e o efeito mé dio e concentração inibidora CCE50. e CI^J obtiveram-se através da utilização de um programa computorizado desenvolvido por Chou e Chou CCRou> e T.-C. Chou, Elsevier-Biosoft, Elsevier Science Publisfiers, Cl985)? Cambrigde, Reino Unido),

Ensaio UV/XC para retrovTrus Murino. Células . Obtiveram-se fibroblastos embrionários SC-1 e células XC na American Type Culture Collection, Rockville, MD. A linha de células XC era derivada de um tumor transplantado induzido em ratos White-Weston recêm-nascidospor injecção intramuscular da estir pe Prague de vTrus de sarcoma Rous. Esta linha de células não liberta vírus infecciosos. Mantiveram-se as células em meio essencial mTnimo de Eagle com solução salina equilibrada de Hanks, suplementado com 100 U/ml de penicilina, 100 ug/ml de estreptomici-na, 24 mM de hidrogenocarbonato de sodio, 25 mM Hepes e com 2% (manutenção) ou 10¾ (desenvolvimento) de soro de vitela fetal ou recém-nascida inactivado.

Quantificação do vTrus pelo ensaio UV/XC, 0 teste XC [Rowe, W, P., W. E. Pugh, e J. W. Hartley. "Plaque assay techniques for murine leukemia viruses", Virology 42 , (1970) 1 136-1 139] é um tipo de eri saio em placa que verifica a presença e o tipo de vTrus de leucemia murina B e N-trÕpica. Dado que estes vTrus não provocam sinais evidentes de infecção sobre as células de murganho SC-1, e necessário revestir a cultura que produz o vTrus com uma linha de célu^ las indicador, XC. 0 número de sincTcios produzidos constitui uma medida directa do tTtulo do vTrus em FFU: - 5

Semearam-se seis cavidades com células de murganho 1 X 10 SC-1 no primeiro dia. No dia seguinte retirou-se o meio e adicionaram-se 0,2 ml de inoculo em meio contendo polibreno (4 jig/ml). Para a determinação da actividade antiviral dos compostos, na cul_ tura, a diluição de vTrus escolhida produziu nas culturas não tra tadas cerca de 80 foci por cavidade. ApÕs 1 hora, retiraram-se os vTrus e adicionou-se o farmaco em várias concentrações. Encheram- -se as placas com o meto no terceiro e quinto dias. Retirou-se o meio ao oitavo dia e expuseram-se as células a radiação UV (60 erg/ /mm por segundo) durante 30 segundos, 0 meio contendo 10 células XC foi, em seguida, adicionado a cada placa, Ao decimo primei ro dia, fixaram-se as placas com formalina tamponada a 10¾ e cora ram-se com violeta de cristal, A comparação do numero de foct com os que se encontraram nas células infectadas pelos vírus que não receberam farmaco, permitiu determinar se um farmaco, numa d£ da concentração, era eficaz, As células de controlo, isentas de vTrus mas que receberam o farmaco, proporcionaram uma estimativa dos efeitos toxicos deste, quantificados pela utilização da cio-ração de azul de tripan.

Ensaio de Toxicidade na Medula ftssea,

Preparação de Células. Recol h.eram-se células de medula ossea humana por aspiração da cristã iliaca posterior de voluntários saudãveis normais tratados com heparfna e separou-se a população mononuclear por centrifugação em gradiente- de Ficoll-Hypaque, Lavaram-se duas vezes as células com solução salina de Hanks equilibrada, contaram-se num fiemacitÕmetro e obteve-se uma viabilidade >98% de acordo com a avaliação por exclusão em azul de tripan,

Ensaio da Citotoxicidade do Farmaco · em granulõcftos macrôfagos, Unidades

Formadoras de Colónias, 0 ensaio de cultura para CFU-GM realizou-se utilizando-se o método de ágar mole em camada dupla como descrito recentemente por Sommadossi e Carltsle' Antimtcrob,

Agents Chemotfier, 31, 0987) 452-454, Utilizou-se meio nutri ente

McCoy 5A suplementado com soro bovino fetal dialisado a 15% (ina£ tivado por aquecimento à temperatura de 56°C durante 30 minutos) (Gibco Laboratories, Grand Tslands, NY) em todas as experiências. Este meio era totalmente isento de timidina e uridina. Clona-ram-se as células em agar a 0,3¾ na presença de concentrações r crescentes do composto modulador ou apenas no meto (controlo] .

ApÕs 14 dias de incubação à temperatura de 37°C numa atmosfera humidificada contendo dtõxtdo de carbono a 5% em ar, contaram-se as colónias (> 50 células] utilizando-se um microscÕDio inver ti do.

Estudos de Toxicidade na Medula Õssea:

Avaliaram-se as toxicidades de diversos poltoxometalatos para ce lulas de medula õssea humana (células precursoras de granulocitos macrõfagos humanos]. As toxicidades e afinidades de toxicidades nestes testes (resultados apresentados em seguida] não foram idênticas is exibidas nos estudos de toxicidade no murganho. Os ensaios de toxicidade para a medula õssea revelaram resultados com algum Interesse e multo encorajadores, 1] Os ensaios de amonio revelaram-se como sendo substaii cialmente menos toxicos que as formas de acido livre de qualquer dos poltoxometalatos.

2] Estabeleceu-se, nestes ensaios, a ordem de toxicidade seguinte: amonio BT = NH^BT Co menos toxico] -^BT e NH^ST ^ AZT e ST<tHPA-23, o pol toxometal ato de French, agente anti-HIV-1) habitual no ensaio clinico (o mats tóxico], Fig. 3.

Efectivamente, o amonio BT não exibiu toxicidade para as -28

L células de medula Õssea humana, A substituição dos catíões inorgânicos dos polioxometala-tos (Na , K e H , etc.) por iao amonio e catiòes provenientes de aminoâcidos básicos não afecta de um modo indesejável a eficã cia antiviral elevada e a baixa toxicidade dos polioxometalatos exibidas nas culturas de células (PBMC), mas estes pol ioxometal a-tos exibem uma toxicidade grandemente melhorada para as células da medula ossea humana e tolerância acentuadamente melhor nos an_i mais relativamente aos sais anteriores,

Os resultados da análise da actividade de alguns dos pr£ sentes compostos representam-se no Ouadro 1. seguinte,

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Ensaios em murganhos completamente tnfectados

Realizaram-se testes em murganhos totalmente tnfectados utilizando-se um dos compostos da presente invenção, 0 método deste teste e idêntico ao utilizado por Ruprecht et al., Nature 323 , 467-469, com excepçao da utilização de vTrus Friend em vez de vTrus Rauscher, Os resultados deste teste apresentam-se no Quadro 2 seguinte.

33 J

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-34-

Tomando em consideração os ensinamentos anteriores, e Óbvio que são possTveis numerosas modificações e variações da presente invenção. Deve entender-se, portanto, que a presente invenção pode realizar-se doutras formas do que as especificameji te descritas, no âmbito das reivindicações apensas.

Claims (7)

1. -35- REIVINDICAÇÕES J 1·“ Processo para a preparação de compostos de fórmula geral - - 4* + 5- (aminoacido básico Η ) (H )BW, n 5-n 12 40 ou — ** +4* (aminoacido básico Η ) (H )c _(SiW,.0*.)4- n d—n LZ 40 em que ‘ J n representa um número inteiro de 1 a 5 ou de 1 a 4, res-pectivamente, caracterizado pelo facto de se acidificar cuidadosamente um tungstato monomérico nas concentrações correctas utilizando, geralmente, como composto inicial o sal sõdico, NaWO^, em solução aquosa, com um precursor de heteroâtomo, solúvel na água; de se precipitar, depois, eventualmente, o produto resultante e de se adicionar na última fase da síntese um sal apropriado, solúvel na água, dos catiões pretendidos. 2.- -36-
2. 2. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de se escolher o aminoácido básico entre arginina, li-sina e histidina.
3. 3. - Processo para a preparação de composições farmacêuticas para administrar por via oral ou parentérica, apropriadas para o tratamento de infecções provocadas por retrovirus tais como HIV-1 ou HIV-2, em um mamífero, caracterizado pelo facto de se associar uma quantidade eficaz, compreendida entre 0,1 e 100 mg/Kg, de um composto de fórmula molecular geral escolhida entre <XVH+WSiW12°4</~ n = 0 - 4, (X+)n(H+>5-m(BW12°40>5' m = 0 - 5, <X+)nÍH+WW10O32> 4~ n = 0 - 4, (X+)pÍH+)6-p!P2W18°62> 6‘ Ό II 0 1 σ> em que X representa um átomo de potássio ou de sódio, um grupo NH4+, um aminoácido natural monocatiõnico ou um poli-peptido constituído por aminoãcidos naturais e que comporta um aminoácido básico natural escolhido entre arginina, lisina e histidina na forma protonada, n representa zero ou um numero inteiro de 1 a 4, m representa zero ou um numero inteiro de 1 a 5, e p representa zero ou um numero inteiro de 1 a 6, com um veículo aceitável sob o ponto de vista farmacêutico. 4.- -37-
4. 4. - Processo de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo facto de se associar um composto de fórmula geral (Arg H+)n <H+)5_n (BW12O40)5- na qual n representa um número inteiro de 1 a 5.
5. 5. - Processo de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo facto de se associar um composto de formula geral B\ (H+)5-n ÍBW12°40>5' na qual n representa um número inteiro de 3 a 5.
6. 6. - Processo de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo facto de se escolher a espécie monocatiõnica entre um catião K+, Na+, NH^+, arginina H+, lisina H+, histidina H+ ou de fórmula NR^+ na qual R representa um grupo alquilo .
7. 7. - Método para o tratamento de infecções como por exemplo, SIDA ou ARC, provocadas por retrovirus tais como HIV-1 ou HIV-2, em um mamífero, incluindo o homem, caracterizado pelo facto de se administrar a esse mamífero, por via oral ou parentéri-ca, uma quantidade efectiva, compreendida entre 0,1 e 100 mg/Kg de peso total do corpo/dia, de preferência entre 1 e 30 mg/Kg de peso total do corpo/dia, e mais preferivelmente entre 1 e 20 mg/Kg de peso total do corpo/dia, de um composto de fórmula mole- -38-

   κ / V cular geral escolhida entre: (X+)n(H+)4-n(SiB12°40>4' n = 0-4, (X+)nlH+)5-mtBW12°40)5~ m = 0-5, (X+)n(H+)4-n(w10°32>4' n = 0 1 > (X+)p(H+)6-p^lP2W18°62)6* P = 0-6, em que X representa um átomo de potássio ou de sódio, um grupo NH4+, um aminoácido natural monocatiõnico ou um polipeptido constituído por aminoácidos naturais e que comporta um aminoácido básico natural escolhido entre arginina, lisina e histidina na forma protonada, Π representa zero ou um número inteiro de \ a 4, m representa zero ou um número inteiro de 1 a 5, P representa zero ou um número inteiro de 1 a 6. Lisboa, 14 de Fevereiro de 1990 O Agsnte Oficial da Prcpr saade Industrial