PT98007A

PT98007A - Processo para a preparacao de aminobenzodiazepinas e de composicoes farmaceuticas que as contem

Info

Publication number: PT98007A
Application number: PT98007A
Authority: PT
Inventors: Ming-Chu Hsu; Steve Yik-Kai Tam; Anne Roberte Bellemin; James Valentine Earley
Original assignee: Hoffmann La Roche
Priority date: 1990-06-18
Filing date: 1991-06-17
Publication date: 1992-03-31
Also published as: US5141735A; HUT58069A; EP0462522A1; CN1057462A; IL98499A0; CS182991A3; IE912061A1; KR920000746A; NO912346L; FI912927L; FI912927A0; NO912346D0; MX26267A; BR9102489A; MC2263A1; HU912005D0; AU7846991A; LTIP863A; JPH04230280A; CA2044694A1

Description

"PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE AMINQBENZQDIAZEPINAS E DE COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS QUE AS CONTÊM" A presente invenção refere-se a aminobenzodiazepinas de formula geral I na gual R^ representa um ãtomo de hidrogénio ou de halogéneo ou um grupo nitro, triflugrometilo alguil inferior hidroxi alcoxi inferior oceano e R2 representa um ato mo de hidrogénio ou um grupo metilo e os seus sais aceitáveis sob o ponto de vista farmacêutico.

Os obgectivos da presente invenção são os compostos citados anteriormente por si só e a sua aplicação como agentes terapêuticos activos especialmente no tratamento ou na profila xia de infecções virais, particularmente infecções retrovirais tais como, as infecções por HIV 1 e/ou HIV 2 ou para protecção das células contra essas infecções; ainda -um processo para a preparação destes compostos e medicamentos contendo um ou mais dos compostos citados e, eventualmente, um segundo agente anti--viral, especialmente um inibidor de transcriptase inversa tal como, ddC, AZT o inibidor da protease de HIV, e/ou ^-in- terferon, interleucina-2 e/ou GM-CSF e a aplicação destes compostos para a preparação de medicamentos especialmente no trata mento ou na profilaxia de infecções virais particularmente infecções retrovirais tais como as infecções por HIV 1 e/ou HIV 2 ou para a protecção das células contra essas infecções.

Tal como agui se utiliza o termo "inferior" refere-se a cadeias hidrocarbonadas de cadeia linear ou ramificada até 7 átomos de carbono tais como metil, etil, propilo e isopropilo. -2- -2-

Os sais aceitáveis sob o ponto de vista farmacêutico podem ser sais de ácidos orgânicos por exemplo de ácido láctico, ácido acético, ácido mãlico, ou ácido p-toluenossulfónico; e/ou sais de ácidos minerais tais como o ácido clorídrico ou o ácido sulfúrico.

Os compostos citados anteriormente podem existir sob formas estereoiscméricas ou tautomêricas sendo todos incluídos no âmbito da presente invenção.

Os compostos preferidos da presente invenção são aque les em que o símbolo R·^ representa um átomo de cloro, em especial 7-cloro-N-metil-5-(lH-pirrol-2-il)-3H-1,4-benzodiazepina--2-amina.

Os compostos de fórmula geral I podem preparar-se fazendo-se reagir uma benzodiazepina de formula geral II

H

na qual R^, tem o significado definido antes ou a amida correspondente na qual 0 está substituído por enxofre, com um composto de fórmula geral R2_NH2· Pode realizar-se a reacção de uma forma convencional, por exemplo mediante reacção da benzodiaze-pinotiona em tetra-hidrofurano e metanol â temperatura de -78°C com amoníaco ou mediante a reacção da amida correspondente com uma amina de fórmula geral R2-NH2 em um dissolvente inerte, tal como tetra-hidrofurano, tolueno ou dioxano na presença de um ácido de Lewis, tal como o tetracloreto de titânio ou tetraclo- -3 reto de estanho. As benzodiazepinotionas de fórmula geral II podem preparar-se fazendo-se reagir a amida correspondente com pen tassulfureto fosforoso ou com 2,4-bis(4-metoxifenil)-1,3-ditio--2,4-difosfetano-2,4-dissulfureto (reagente de Lawessen^), por exemplo, em tetra-hidrofurano, em tolueno, piridina ou dioxano, de preferência a uma temperatura compreendida entre 50 e 100°C.

Os compostos de fórmula geral 1 e os seus sais tem actividade anti-viral, em especial anti-retrcviral particularmente contra HIV, o virus associado com o desenvolvimento da SIDA e doenças relacionadas tais como ARC (complexo relacionado com a SIDA). Estes compostos também inibem a replicação de HIV mediante a inibição de funções virais de HIV importantes como actividade TAT (transactivação transcricional).

Os compostos de fórmula geral I foram testados relati vamente â inibição do efeito citopãtico sobre HIV e redução dos anti-génios virais associados com a célula numa experiência que se desenvolveu como segue:

Familxas de vírus de título alto (estirpe HIV-1 NIT) foram desenvolvidas em células CRIO CD^+ em meio de RMPI-1640 dos Laboratórios Gibco suplementado com soro de vitela fetal a 10% e 0,1 mg/ml de gentamicina. Recolheu-se o meio que se filtrou e os isolados de virus concentraram-se 100 vezes e conser varam-se â temperatura de -80°c. Lavaram-se as células com solução de cloreto de sódio tamponada com fosfato e resuspende- - 5 ram-se no meio na concentração de 2 x 10 /ml. Adicionaram-se quantidades variáveis dos compostos em ensaio em dimetilsulfõ-xido. Quatro dias após a infecção, contaram-se o numero de células vivas por exclusão azul de tripano (Proc. Natl. Acad, Sei, 83, 1986, 1911). Simultaneamente fixaram-se alíquotas de células com acetona e coraram-se com anti-corpos provenientes de doen tes com SIDA seguido por uma segunda cloração com IgCJ anti-huma na de caprino conjugada com fluoresceína (Cappell, As células coradas com anti-corpo fluorescente contaramose usando-se um mi croscopio de fluorescência e os resultados foram expressos sob a forma de percentagem do número total de células contadas (J. Med. Virol. 19, 1986, 325).

Os resultados expressaram-se sob a forma de Dl,-0 yiM) isto ê a concentração do composto ensaiado que reduz o número de células positivas â imunofluorescência em 50%, quantidades de 0,5 e JM para o produto do Exemplo 1 (composto A) e^aM para 0 produto do Exemplo 2 (composto B).

Para testar a citoioxicidade trataram-se células CEM com um composto de fórmula geral I com concentrações similares e mediu-se a toxicidade do composto por contagem das células vi vas.

As figuras 1 e 2 apresentam actividade anti-Hiy do Composto A. A figura 1 mostra a taxa de sobrevivência de células CEM infectadas com HIV-1 tratadas com o composto A. A Figura 1 também demonstra que o tratamento das células com quantidades crescentes do composto A resulta na diminuição, em percentagm, das células que se apresentam positivas com imunofluorescência após a cloração com os anti-corpos HIV. A Figura 2 proporciona uma comparação da actividade HIV, medida avaliada pela sobrevivência das células e o antigênio p24 e quantidade .'de FNA virai do Composto A versus AZT e ddC.

Os Compostos A e B foram também testados para activida de anti-HXV-TAT num ensaio constituído pelas fases seguintes ; (a) submição da expressão de o gene de fosfatase alcalina segregada CSeAP) e do gene TAT transactivador yiral sob -5- -5-

o control do promotor de Hiy LTR responsável pela acção do transactivador de HIV TAT; (b) transfecçao de células de mamífero cultivadas com plasmídios que contêm as construções genéticas citadas em (a), anteriormente, e causam a produção celular do factor de transactivação TAT e SeAP? (c) adição do agente a testar, aqui os compostos A e B; e determinação da quantidade de SeAP produzida medindo-se a actividade enzimãtica de SeAP, portanto a inibição da produção de SeAP relacionada com a actividade de inibição anti-TAT. Neste ensaio, a inibição de SeAP relaciona-se positivamente com a actividade anti—TAT, Quanto maior for a capacidade de um agente para inibir a fosfatase alcalina segregada, maior ê a sua acti vidade anti-TAT.

Especificamente, no que se refere aos resultados referidos em seguida, o ensaio anti-HlV-TAT desenvolveu-se do se guinte modo: 24 horas apõs a transfecção, adicionaram-se 1,10,25 e do composto em ensaio de formula geral I a um meio de cul^ tura com células COS transfectadas com dois plasmídios, um con tendo o gene informador que codifica para SeAP sob o control de HIV-LTR e outro contendo gene HIV-TAT também sob control de HIV-LTR. Actividade de fosfatase alcalina no meio foi doseada 48 horas após a adição do composto ensaiado por meio de um ensaio colorimétrico usando-se como substracto para nitrofenilfojs fato. A actividade anti-TAT é avaliada pela percentagem da ini bição da expressão do gene de fosfatase alcalina segregada sob RSV-LTR que não responde a TAT. Uma inibição superior a 60% foi a determinada com uma média de três ensaios independentes

de cada um dos compostos ensaiados A e B.

Os resultados comprovam que os compostos A e B são inibidores específicos da expressão do gene que regula HIV-TAT sem efeitos citotõxicos não específicos. A especificidade dos compostos AeB como inibidores de TAT ficou demonstrada com um ensaio paralelo em que a expressão do gene da fosfatase alcalina segregada ê colocada sob o control do vírus de sarcoma Rous (RSV-LTR) que não reage a TAT. Este ensaio portanto elimina a possibilidade dos compostos AeB serem agentes citotõxicos gerais ou inibirem a actividade da fosfatase alcalina segregada.

As actividades anti-HIV-TAT dos compostos ensaiados foram determinadas pela avaliação da quantidade fosfatase alcalina no meio de sobrenadantes das culturas das células em que a expressão do gene SeAP estava sob o control do promotor Hiy--LTR. As actividades inibidoras específicas dos compostos em ensaio foram calculadas de acordo com a formula:

100/* (1-A/B)-(1-C/D)J na qual AeB representam as actividades de fosfatase alcalina produzidas por HIV-LTR/SeAP na presença e ausência, respectiva mente do composto em ensaio e C e D são actividades de fosfata se alcalina produzidas por RSy-LTR/SeAP na presença e ausência, respectivamente, do composto em ensaio. As concentrações testadas variaram entre l-5Q^uM. Os resultados obtidos são a média de pelo menos três ensaios, O composto ensaiado foi adicionado 24 horas apõs a transfecção das células com os plasmídios quando RNA específico de SeAP estavam já presentes, e a proteína era muito estável. Portanto a inibição de 100% não será observa da com este processo de ensaio, A Figura 3 refere os resultados -7-

►·> dos ensaios com o composto Λ.

Também se testou o Composto A relativamente â activi-dade entre HIV-TAT com linhas de células que cuja constituição inclui a expressão do gene SeAP sob o control de HIV-LTR. As linhas de células 193C, 191F e 199F foram derivadas de células CHO (linhas de células originais de ovãrio de hamster chinês), Cada linha é de origem colunai e tem as sequências de HIV-LTR/ /SeAP e de HIV-LTR/TAT integradas no cromossoma da célula. Decorrido um dia sobre a placagem das células, confluência aproxi madamente 30%, adicionou-se o composto A em dimetilsulfóxido com uma concentração 0,05% num meio de cultura em concentrações desejadas. As células foram lavadas e o composto A foi reposto após um dia. Analisou-se a actividade de fosfatase alcalina segregada dois dias após segunda adição do composto em ensaio. Os resultados da avaliação da citotoxicidade apresentados na Figura 4 demonstram que, enquanto o composto A inibe significativamente a expressão SeAP sob o control do promotor de HIV-LTR, (demonstrado pelas linhas no topo), ele não tem efeito citotoxico sobre as células (linhas a tracejado na parte inferior).

Relativamente aos doentes humanos infectados com HIV e doentes com infecções por HIV sintomáticas ou assintomaticas, uma quantidade com eficácia anti-viral de um composto de fórmula geral ou do seu sal encontra-se nos limites aproximados de 0,1 e 10 mg/kg, de preferência aproximadamente 0,3 a 5 mg/kg, de forma mais conveniente entre cerca de 1 e 3 mg/kg de massa corporal e por dia. Esta dose pode ser administrada por via pa-rentérica ou oral em uma ou mais doses com vários intervalos diários de preferência por via oral e uma vez ao dia.

Os presentes compostos também podem ser administrados com outros agentes anti-virais e/ou modificadores da reacção biológica. Por exemplo podem ser administrados com inibidores de transcriptase reversa conhecidos tais como ddC, AZT e ddl ou outros inibidores que actuam contra outras proteínas HXV tais como protease assim como modificadores biológicos tais como oC, ^ e/ou ^-interferon, interleucina-2 e/ou GM-CSF. Para ddC o va lor entre 0,005-0,25 mg/Kg de massa corporal aproximado e vi-rustãtico em maioria dos doentes. As doses preliminares para administração oral têm limites um pouco mais amplos, por exemplo 0,001 e 0,25 mg/Kg administrados em uma ou mais doses com intervalos de 2,4,6,8 ou 12 horas. Habitualmente, prefere-se uma dose de 0,01 mg/Kg de massa corporal de ddC administrada de 8 em 8 horas. Quando feita uma terapêutica associada, podem ser administrados outros compostos anti-HIV simultaneamente, o composto da presente invenção, ou a dosagem pode ser reduzida, quando apropriado. Os dois ou mais fãrmacos podem também ser associados numa composição. As doses de cada fãrmaco pode ser inferior quando utilizada em associação de quando são utilizados isoladamente. É possível para os compostos desta invenção serem administrados isoladamente em solução. Contudo é preferível que os componentes activos sejam administrados sob a forma de uma composição farmacêutica. Estas composições contêm pelo menos um componente activo conjuntamente com o veículo aceitável sob o ponto de vista farmacêutico ou um excipiente e podem, eventualmente incluir outros agentes terapêuticos, por exemplo o inibi-dor da protease. Estes veículos incluem os veículos adequados para administração oral, rectal, nasal, tópica, bocal, sublingual, vaginal ou parentêrica, incluindo a via subcutânea^intramuscular, intravenosa e intradêrmica.

Exemplos das composições da presente invenção são soluções dos componentes activos, por exemplo em agua ou solução de cloreto de sódio; capsulas, por exemplo capsulas de gelatina mole; saquetas ou comprimidos, contendo cada um uma quantidade previamente determinada do componente actiyo por exemplo sob a forma de grânulos; soluções ou suspensões em um líquido aquoso ou uma emulsão de agua em óleo ou uma emulsão líquida de ôleo em agua. Os comprimidos podem incluir um ou mais excipien-tes como lactose, celulose microcristalina, diõxido de silico-ne, coloidal, croscarmelose sõdica, estearato de magnésio, ãci do esteárico ou outros excipientes, agentes corantes e veículos com compatibilidade farmacêutica. As composições apropriadas para a administração tõpica incluem pastilhas que contêm compo nente activo, um agente apaladante, usualmente sacarose e acácia tragacanta; as pastilhas que contêm o componente activo têm uma base inerte como por exemplo gelatina e glicerina ou sacaro se e acácia; elixires para lavagens bocais que contêm o componente activo no veículo líquido apropriado. As composições para administração rectal podem apresentar-se sob a forma de supositórios com uma base apropriada contendo manteiga de cacau ou um salicilato. As composições apropriadas para administração vaginal podem-se apresentar sob a forma de pessârios, tampões, cremes, geles, pastas, espumas ou fórmulas em spray. As composições apropriadas para administração parenterica incluem líquidos aquo sos ou não aquosos, soluções injectãveis estéreis isotónicas que podem conter agentes anti-oxidantes, agentes tampão, bacterioes táticos e solutos que tornam a composição isotõnica com o sangue do recipiente a que se destina; as suspensões aquosas e não aquo sas estéreis podem incluir agentes suspensores e agentes espres-santes. As composições podem-se apresentar sob a forma unitária ou de dose múltipla em contentores selados, por exemplo ampolas ou frascos e podem ser conservadas sob uma forma liofilizada re querendo apenas a adição de um veículo estéril líquido, por exemplo água para injectãveis, imediatamente antes do uso. As soluções injectãveis extemporâneas e as soluções podem preparar -se a partir de um pô estéril, grânulos ou comprimidos da espécie anteriormente referida, EXEMPLO 1

Uma solução de 0,5 g de 7-cloro-l,3-diidrQ-5-(lH-pir-rol-2-il)-1,4-benzodiazepina-2-ona em 25 ml de tetra-hidrofura-no foi arrefecida num banho de gelo e acetona. Fez-se borbulhar através da solução cloreto de metileno e adicionou-se-lhe 0,29 ml de tetracloreto de titânio gota a gota sob agitação apõs 5 horas â temperatura ambientee,adicionaram-se mais 0,2 ml de tetracloreto de titânio. Apõs 18 horas adicionou-se uma pequena porção de gelo e filtrou-se a mistura, lavou-se com tetra-hidro furano e concentrou-se. A cristalização com cloreto de metile-no/metanol e recristalização com etanol forneceu 0,25 g (rendi mento 48%) de 7-cloro-N-metil-5-(lH-pirrol-2-il)-3H-l,4-benzo-diazepin-2-amina, P.F. 251°C. EXEMPLO 2 a) A uma solução de 10 g de 7-cloro-l,3-diidro-5-(lH-pir rol-2-il)-1,4-benzodiazepin-2-ona em 40Q ml de tetra-hidrofura-no, adicionaram-se 10 g de P^S-^q sob agitação e fez-se irradiar a mistura com ultrasons â temperatura de 4Q°C, Apõs 2,5 ho ras adicionaram-se mais 10 g de P^S^q a essa mistura. Continua--se a reacção durante 2 horas. Arrefeceu-se a mistura â tempera

tura ambiente e filtrou-se, Após a lavagem do produto sólido com cloreto de metileno, 8Q% do dissolvente proveniente dos filtrados reunidos foram removidos sob vácuo. A solução residual alcalinizQU-se com solução de carbonato de hidrogénio e sódio saturada. 0 produto precipitado foi filtrado. Extraiu-se o filtrado com cloreto de metileno seguido de concentração sob vácuo. Os produtos sólidos recristalizaram com uma mistura de tetra-hidrofurano/êter do petróleo para se obterem 9,9 g (ren dimento 94%) de 7-cloro-l,3-di-hidro-5-(lH-pirrol-2-il)-1,4- Ο Λ* -benzodiazepin-2-tiona, p.f. 258-260 C com decomposição. b) Fez-se borbulhar amoníaco através de uma solução de 0,5 g do produto obtido na alínea a) em 5 ml de tetra-hidrofu-rano e 200 ml de metanol, arrefecendo-se para -78°C, Em seguida deixou-se a reacção retomar a temperatura ambiente e agitou -se durante mais 12 horas. Evaporou-se o dissolvente para se obter 7-cloro-5-(lH-pirrol-2-il)-3H-1,4-benzodiazepin-2-amina com um rendimento de 40%, p.f. 177-179°C com decomposição.

As composições galénicas seguintes contendo um compojs to de fórmula geral I ou o seu sal como componentes activos, co mo definidas anteriormente, podem preparar-se de uma forma convencional : com composições em comprimidos

Componentes mg/comprimido 20 mg 180 mg 15 mg

Componente activo

Lactose

Amido prê-gelatinizado

Composição liquida para administração oral;

Componentes Componente activo Metilparabeno Sacarose Agente apaladante Tampão de citrato Agua purificada q.b.p. Composição em comprimidos; Componentes Componente activo Amido Avicel Lactose Estearato de magnésio mg/compos ição 2Q,0 mg 20,0 mg q.b, q.b, q.b, 5,0 ml mg/comprimido 20 mg 40 mg 80 mg 274 mg 2 mg 416 mg

Composição sob a forma de capsulas de gelatina mole; Componentes mg/cápsula

Componente activo Ácidos gordos etoxilados PEG 4000 Oleos vegetais q.b.p. 20 mg 500 mg 100 mg 1,0 ml

Claims

REIVINDICAÇÕES 1.- Processo para a preparação de compostos de fõrmu la geral

na qual representa um átomo de hidrogénio ou de halo-géneo ou um.grupo N02/ CF^, alquilo inferior, OH, alcoxi inferior ou CN; e R2 representa um átomo de hidrogénio ou um grupo CH^, e dos seus sais aceitáveis sob o ponto de vista farmacêutico, ca

racterizado pelo facto de se fazer reagir uma benzodiazepina de fórmula geral S H i N R, (xi)

na qual R^ tem os significados definidos antes, ou a amida correspondente em que o átomo de oxigénio representa o átomo de enxofre, com um composto de fórmula geral r2-nh2 na qual R2 tem os significados definidos antes.
2. - Processo.de acordo com a reivindicação 1, para a preparação de compostos de fórmula geral I na qual represen ta um átomo de cloro, caracterizado pelo facto de se utilizarem compostos iniciais correspondentemente substituídos.
3. - Processo de acordo com as reivindicações 1 ou 2, para a preparação de 7-cloro-N-metil-5(lH-pirrol-2-il)-3H-l,4--benzodiazepin-2-amina, caracterizado pelo facto de se utilizarem compostos iniciais correspondentemente substituídos. -15- / \
4. - Processo para a preparação de composições farmacêuticas para o tratamento ou a profilaxia de infecções virais, especialmente de infecções retrovirais como, por exemplo, infecções provocadas por HIV2 ou para a protecção das células contra este tipo de infecções, caracterizado pelo facto de se converter em uma forma de dosagem galénica uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto de fórmula geral I, preparado pelo processo de acordo com com as reivindicações 1, 2 ou 3 ou de um seu sal, eventualmente em associação.com um segundo agente antiviral, especialmente um inibidor da transcriptase inversa tal como ddc, AZT, um inibidor da protease de HIV, interferon ^ e/ou, ^ in terleucina-2 e/ou GM-CSF.
5. - Método para o tratamento ou a profilaxia de infecções virais, especialmente de infecções retrovirais tais como as provocadas por HIV e/ou HIV2 ou para a protecção das células contra este tipo de infecções, caracterizado pelo facto de se administrar diariamente a um doente uma quantidade eficaz, compreen dida entre aproximadamente 0,1 e 10 mg/Kg, de preferência entre aproximadamente 0,3 e 5 mg/Kg, mais preferivelmente entre aproximadamente 1 e 3 mg/Kg de peso do corpo, de um composto de fórmula geral I, preparado pelo processo de acordo com as reivindicações 1, 2 ou 3, ou de um seu sal, eventualmente em associação ccm um segundo agente antiviral, especialmente um inibidor da transcriptase inversa tal como ddc, AZT, um inibidor da protease de HIV, interferon e/°u X / interleucina-2 e/ou GM-CSF. © Agente Oticiul da Propriedade Industrie. - (_(^V ^ T- "