PT91849A - Processo de dosagem de poliosidos anionicos sulfatados, e recipiente para o arranque deste processo - Google Patents

Description

0 Invento refere-se a um nova processo de dosagem de poliósidos aniónicos sulfatadoss utilizando no principio de dosagem a estrutura química destes compostos e nSo as suas actividades biológicas» 0 invento refere-se igualmente a um estojo pronto para ser empregue para α arranque deste processa» □s poi i és idos aniónicos sul faiadostais como os glicosaminoglicanos e nomeadamsnte a heparina». cuja activldade anticoagulante é bem conhecida,, são doseados segundo métodos baseadas sobre as suas actividades biológicas, síb particular a sua actividade sobre diversos factores da coagulação» é assim que se dossia a hepsrina pela sua actividade sabre o factar X actíva-do ou o factor II activado5 ou ainda segundo métodos mais globais baseados sobre o tempo de coagulação» tais como o tempo de Céphaline Kaolin ou TCK ou ainda o método descrito na Farmacopeia Francesa» ura os recentes trabalhos sobre a heparina têm mostrado que se tratava de um produto muito heterogéneo^ tanto no que diz respeito ao comprimento das suas cadeias como á sua tana de carga5 s que era possível fraccioné-las s fragmentá-ias tendo em vista aprontar produtos de actividade mais específica» Tem-se podido igualmente p8r em evidência que a heparina5 para além das suas actividades bem conhecidas sobre a coagulação, intervinha coma regulador em diversos sistemas biológicos e que alguns fragmentos desprovidos de actividade sobre a coagulação conservavam no entanto a sua actividade reguladora» Tornava-se portanto necessário aprontar um novo método de dosagem que permitisse avaliar a quantidade de produto contido num líquido» e em particular nos meios biológicos., sem ter de recorrer a uma actividade biológica»

Dawss, Pepper et a 1» <Throí?ib» Baemost» » 1985s 54 (3),, 63®~-à34> proposeram uma técnica que- consiste num deslocamento da hsparina radioactiva» retida numa coluna da tipo Agarose-polica--ti«Co, pelo poliósido aniônico sulfatado a testar» Este método é baseado no principia geral da deslocamento dum produto marcada dos seus locais de ligações5 pelo seu equivalente nlo marcado» Os métodos que apelam a este principia apresentam o inconveniente da necessitar da manipulação de rádio-elementos que por sua vez s-So dispendiosos e implicam precauções no seu emprego» 0 invento propõe—se remediar estes inconvenientes e propõe um novo processa que permite a dosagem quantitativa da poliósidos sulfatados contidos num liquido-., nomeadamente num meio biológico» em particular no plasma» Esta dosagem ê baseada no carácter aniônico forte deste tipo de produtos e permite a dosagem de qualquer poliósido sulfatado, qualquer que seja a sua estrutura ou o seu tipo de actividade5 sob a condição de que tenha uma quantidade de cargas aniónicas total de pelo menos duas, de preferencia pelo menos trts5 por unidade dissacaridica» Produtos deste tipo são representados pela heparina s suas fracções, fragmentos e derivados» pelo pentosano polissulfato» dasítrano sulfato e alguns heparanos sulfatos? em compensação» o ácido bialurónico, o dermatano sulfato, os condroitinos sulfatos e os heparanos fracamente sulfatados, não podem ser doseados por este processo» 0 novo processo do invento é baseado na dosagem, graças a um conjugado aniônico revelador3 dos sítios catiónicos que ficam livres sobre uma superfície recoberta de um policatião, depois de esta ter sido posta em contacto com o liquido que contém o poliósido aniônico sulfatado a dossar» sendo o conjugado revelador escolhido de tal maneira que a sua densidade de carga lhe permite fisar—se sobre os sitios que ficam vagos sobre o ραϊicaiilo que recobra a superfície, sem todavia deslocar α poliósido a dosear que ai se encontrava previamente fixado, s sendo a quantidade do produto a dosear determinada por referfncia a uma curva de escalonamento estabelecida simultansamente sobre a mesma placa.

Este processo pode ser vantajosamente posto em prática segundo as etapas- sucessivas seguintess (a) pSe-se em contacto uma quantidade determinada do liquido que contém o produto a dosear com uma superfície recoberta por um produto catiónicof < b) pSe-se em contacto o conjunto assim obtido com uns excesso de um conjugado aniónico revelador, escolhido de tal maneira que a sua densidade de carga lhe permites fixar-se sobre os sítios que ficam vagos sobre o produto catiónica da etapa <a) sem todavia deslocar o poliósido que aí se encontra ρreviamente finados (c) elimina—se o excesso do conjugado revelador que não se fixou por ligação iónica com o excesso do produto c a t i. ón i c o d a e ta pa < a) p (d) doseia—se, por um método apropriado, função do conjugado revelador sscQlhidQ,a quantidade que convém do conjugado revelador que se fixou por 1igaçao iónica no decurso da etapa Ch)s (e) determina—se a quantidade total do produto a dosear que se encontra na amostra referindo a quantidade do conjugado revelador definido segundo o método apropriado da etapa (d) a uma curva de escalonamento estabelecida simultaneamente sobre a própria placa, segundo o mesmo método, com as quantidades dadas do produto que se quer dosear,, •ν

0 resultado é lida sobre uma curva de escalonamento que indica directamente a quantidade de poliósido aniénico sulfatado por mililitro de meio biológico»

Segundo o processo do invento., o policatião utilizado é um polímero básico escolhido no grupo constituído pelo sulfato de protamina» polibreno3 ou um poliaminDácido tal como a poliargini-na ou a poli--L-lisinã„ Utiliza-se de preferência uma poli-L-lisi-na cujo peso molecular médio se situa entre 6ΦΘΘ e Dalton» Este policatião apresenta com efeito a vantagem de dar uma muito boa rsprodutibí1idade nas dosagens»

De uma maneira vantajosa., α conjugado aniónico revelador á constituído por um glicosamirmglicano ligado de maneira covalente a um pQlipsptidso3 de preferencia uma enzima» Poderia igualmente estar ligado a uma molécula orgânica que contém núcleos aromáticos susceptíveis de serem marcadas5 por exemplo com iodo ou com fósforo., por exemplo tirosina marcada com iodo 125»

No seguimento do texto,, nós utilizaremos a abreviatura SAG para o glicosaminoglicano e o termo GAG-P para qualquer glicosaminoglicano-polipeptídsoj sendo cada conjugado designado pelo qlicosaminoglicano OAG s pelo polipeptídeo P respeitantes, por exemplo BAB~snzima? GAG-peroxidase., SAG-fosfataseP BAG-albu-minân Heparina-Pj Heparina-enzima, Heparina-peroxidase., Heparina--fosfatassg 01igossacarídeo-CHu-peroxidase íOS-CHO-peroxidase) e assim por diante» 0 SAG utilizado para a preparação do conjugado deve ser suficientemente aniónico para se ir fixar nos sítios deixados vagos 5 mas não deve ser ma is aniónico que o produto a dosear., do qual tomaria então o lugar» A escolha do SAG a utilizar para a preparação do conjugado efectua-se então em função da densidade de carga do poliósido aniónico sulfatado que se quer dosear» 0 SA8 utilizado para a preparação do conjugado revelador SA8-P pode ser qualquer 8A8 ou uma das suas fracçSes ou fragmentos» 0 8AB utilizado é de preferlncia a heparina ou um dos seus fragmentos» Estes t'§"m5 com efeito» a capacidade de se fixar» pelas suas cargas aniónicas5 aos sítios deixados vagos sobre o policatiSo depois que o produto a testar tenha sido posto em contacto com este último» Uma mistura de 6A8 particularmente apropriada para a preparação do 8A8-P é representada por uma mistura de fragmentos de heparina constituída por cadeias que possuem essencialmenta de 4 até 1® unidades díssacaridicas»

De uma maneira vantajosa» utilizasse como polipeptídeo para a preparação ao conjugado revelador BAB-P? uma enzimas esta é escolhida de entre as que são facilmente preparáveis e estáveis s que podem ser dossadas facilmente» por exemplo por acção de um substrato e libertação de um produto colorido que se doseia por densidade épticaj a peroxidase de rabanete e a fosfatasa são exemplos de tais produtos»

Num modo particularmente vantajoso do invento5o conjugado GAG-enzima é diluído com um outro conjugado ΒΑ6-Ρ5 de preferãncia com um BAG-a!bumina? sendo ο BA8 idfntico para os dois conjugados» Com efeito» a precisão da dosagem é inversamente proporcional à actividade específica do BAS-enzima eP se esta ôliima for demasiado importantes é dificil definir condições operatórias que dfem uma precisão satisfatória» Portanto recorreu-se de prefer§nc.ia5 para se poder dossar com uma precisão da ordem do pq/ml= & uma mistura de conjugados» sendo a activadade especifica final da mistura estabelecida de maneira a ter uma boa precisão de dosagem nas condiçSas operatórias» 7

De preferencia» a mistura GAB-encima s BAG-albumina tem uma actividade enzimátiea que ss situa nas nossas condicSss operatórias entre 1 uuDO e 2 u»DO, sendo a actividade específica mais favorável de 1,5 u„DO»

De maneira vantajosa, pôde-se constatar que o conjugado formado de um BAG representado por um fragmento de heparina preparado por despolimericação com ácido nitroso e possuindo um pesa molecular médio de 2 = ®θ® Dalton, nomeadamente o produto designado OS 4-íD-CHO cuja preparação é GSBcrits no parágrafo ”PREPARAçSO 1 a>” situado mais abaixo, por um lado, e a titulo de encima a peroxidase de rabanete, constituía um revelador de escolha piara dosear nos meios biológicos diferentes poliésidos sulfatados, tais como a heparina e seus fragmentos como os vendidos sob o nome de hraxiparina (Choay, l-rança), hragmi.n { O \ _ ( o _ _ (Kahi, Suécia), Lovenox (Pharmuka, França), ou ainda tal como a pentosano polissulfato vendido sob a denominação de Hémoclar ',w CHidy, França), ou o dextrano sulfato e seus derivados, ou ainda os dextranos soláveis funcionalieatíos descritos no Pedida ds Patente EP-'i4ô»455, ou os BAS hipersulfatados descritos no Pedidc? de Patente EP-2Í4»879»

Num modo particularmente vantajoso do invento no decurso da etapa (a) o policatiio á absorvido nas cavidades tíe uma placa de microtitulação, em meio básico, por incubação durante 24 a 72 horas, ds preferência 48 horas a uma temperatura que se situa entre 0 e ·*·2Θ°0, ds preferência +4°C« ou fósforo

De maneira vantajosa, o conjugado aniónico revelador da etapa Cb) é constituído por um poliósido aniónico ligado ds maneira covalente a um produto escolhido no grupo constituído por unia encima e uma molécula orgânica que contém núcleos aromáticos susceptíveis de serem marcados com iodo ou fósforo» De

X preferência, utiliza-se uma enzima que evite a utilização de produtos marcados»

Muffi outro modo vantajoso do invento, no decurso da etapa <h> a mistura é incubada pelo menos 2 horas a uma temperatura que se situe entre ® *C e +2® °C, ds preferência *4 °C.,

Segundo um modo preferido do invento, o conjugado aniónico revelador da etapa Cb> é constituído por um poliósido aniénico, nomeadamente um BAS? ligado de maneira cova lente a uma enzima e no decurso da etapa (b) utiliza-ss um método de dosagem enzimática, sendo a enzima do conjugado revelador doseável por exemplo por acçlo sobre um substrato e a libertação de um produto colorido que se doseia por densidade ópiica»

As diferentes lavagens são sfestuadas com a ajuda de soluto clorsisdo isotónico íN-sCl 9 P = í®#®>»

De uma maneira vantajosa,, o meio básico utilizado para se fazer a solução do policatilo é um tampão tris-fosfato ou um tampão bicarbonato a um pH compreendido entre 9 e l®s utiliza-se de preferência um tampão bicarbonato com uma força iórtica compreendida entre ®3ô5 M s ®,2 M, em particular ®?1 11, pH 9,6» 0 policatilo é posto em solução no meio básico com a concentração de 10®pg/ml e deposita-se em cada cavidade 25@ ug desta solução que se deixa incubar durante 48 horas» A dosagem será tanto mais sensível quanto a concentração em policatião for mais fraca, mas a gama de resposta será tanto mais larga quanto a concentração for mais elevada, sendo a sensibilidade inversamsnte proporcional a concentração em polica-tião„ De uma .maneira vantajosa, utiliza-se uma concentração de !0®pg/ml como acima á indicado para dosear um 6AG presente no

plasma a uma concentração compreendida entro Θ,Ι e ¢=,5 pg/ml == Os resultados obtidos são particularments satisfatórios nas condições indicadas acima quando o poliósido aniónico sulfatado a dassar é um fragmento regular de heparina, quer dizer um fragmento constituído por dissacarideos trissulfatados , e cujo peso molecular médio se situa entre 5=Φ0Θ e é»&0® Dalton»

De maneira vantajosa, para a realização do processo do invento, deposita-se em cada cavidade., depois de lavagem para eliminação do policatilo residual, 2Θ© μΐ do líquido que contém o palianião sulfatado a acssar, sendo a este último, assim como ao liquido utilizado para a realização da curva de escalonamento, adicionado um inibidor de protease que por sua vez permite respeitar o policatilo e, quando o liquido é um meio biológico, em particular plasma, impedir a formação de trombina e portanto de um coàgolo que perturbaria a dosagem» Utiliza-se de prefertn-cia como inibidor de protease a benzamitíina que se adiciona com uma coneeniraçlo que se situa entre 0,Θ025 M e Sp M, de preferência 0,©125 M, e deixa-se a incubação efectuar-se durante pelo menos 2 horas entre Q° e *2€>°C, de prefer@nc.ia +4°C =

Vantajosamente, quando a mistura ds conjugados reveladores utiliza como enzima a peroxidase, a iRistura comporta quantidades de BAB-enzima e de BAB-alhumins expressas em equivalente de produto puro da ordem de 3,4 pg/ml de peroxidase e 7,7 pg/ml de albumina. Mestas condições utilizam-se de preferência 2ΘΘ μΐ por cavidade de mistura reveladora»

Num modo de realização vantajoso do processo do invento, quando o conjugado revelador á um BAB-peroxidase, o substrato utilizado para revelar a quantidade de enzima ficada nas cavidades é constituído por uma mistura de ortofenilsno diamina e de peróxido de hidrogénio» Utiliza-se por exemplo para cada cavidade

i®%? μΐ de uma mistura que contém ®P5 mg de oriofeníleno diacnina em um ml de tampão citrato de sódio, HC1 0S i M5 pH 3,5 e Θ;5 μΐ ds psróKido ds hidrogénio, Nestas condições5 deiKâ-se incubar durante cerca de ΪΘ minutos è temperatura ambiente (cerca ds 2Θ a 25 °C> e em seguida pâra-se a reacção por adição ds 'ácido sul fu-rico 1M, vantajosamente 1Θ® μΐ por cavidade»

Num modo particularmente vantajoso do invento, quando o conjugado revelador é um BAB-peroKidãse e o substrato de dosagem é o ortafenilsno diamina adicionado de oeróxido de hidrogénio, a leitura da densidade óptica efectua—ss a 492 nm, seja direeiamen-te no fundo da cavidade, seja por transferfncia para uma cuba de aspsctrofotócnetra„

Obtém-se a curva de escalonamento da figura 1 que dá em ordenada a adsorção a 492 nm s em abcissa o inverso da concentração em pg/ml» A leitura da densidade óptica da amostra a dossar permite» referindo-se á curva ds escalonamento, dsducir a concentração do produto a dossar num ml do mexo biológico»

Num outro modo de rsaiisação, o conjugado revelador é um BA6~fosfatase e o substrato de dosagem o 4-nitrofsnilfosfato, efectuando-se a leitura da densidade óptica a 4Θ5 nnu 0 invento refere igualmsnte um estojo destinado à realização do processo segundo o invento» Este estojo contéms - Placa ds microtítulação, - Policaiião, - Conjugado revelador constituído por um polianião ligado de maneira covalente a um revelador escolhido do grupo constituído por uma encima e uma molécula orgânica susceptível de ser marcada.

-- * ? V C ··' - - Substrato de dosagem escolhida em funçSa do conjugado revelador*

Num aspecto particular da inventa a estajo contéms - Placa de microtitulaçao, - Policatião escolhido no grupo constituída par sulfato de protamina* polibreno, poliarginina s po1i-L-1i si na, ~ GAG-enzima liofiliçado, ~ Substrato da encima escolhida, gerador de um corante*

Num modo particularmente vantajoso do invento o estojo c om ρο r t a * ~ Placa de microtitulação, - Paiicatiso, - GAG--enzims liofilizatío, sendo a encima escolhida no grupo constituído pela peroxidase da rabanete a a fosfatase, - SAS-a1hum ina 1io f i1i zado, - Substrato da encima escolhida, gerador de um corante*

Num outro modo particular do invento o estojo comporta um múltiplo de cada um dos elementos seguintest - Placa de microtitulaçlo s 1, - Poli-L-1isina s 25 ml a iô© pg/ml, BAG-peroxidase de rabanete liofilizado s 68 ug, - GAS-albumina ;; 54 pg, - Drtofenileno diamina s 1© ml (5 mg)*

De preferência o estojo segundo o presente inventa é acompanhado por um método ds utilização como abaixo è definido* 12

Mum outra modo vantajoso do inventos as placas de microtitalação sao recobertas de poIicatiSo e prontas a serem empregues.

Os conjugados BAB-P, nomeadaments BAG-sncima e BAG-al-bumina? pertencem à família dos N-poIiásidos-poi. ipeptídeos tía seguinte fórmula Is (ósido - Z' - CH7----NH> P' Cl) - P' ê o radical n—valente de um polipeptídeo P ligado aos grupos MH que orovfra de n grupos araina livres presentes na origem na molécula de Pp - Z‘ ê a unidade sacaridica terminal redutora do polissacarí-deo òsido—Z na sua forma aideidica, quer natural3 quer proveniente da despolimerizaçSo ηitrosaprivada do grupo aldeitíico de 3p - ósido è o resto do polissacarideo ósido~Z'| ·- n é u<n número inteiro de 3 a 3Θρ ou? se tal suceder, um dos seus sais farmacsuticaments aceitáveis. é com efeito possível efectuar um enxerto da cadeia çjoliosídica sobre a cadeia peptídica num ponto único da dita cadeia poliosídica recorrendo a um grupo aldeidico único presente ou gerado na extremidade da cadeia poliosídica, ή bem conhecido que os açúcares em geral e os polissa-carídeos em particular sSo caracterisados por uma estrutura hemiacetàlica (cíclica ou fechada) em equilíbrio com a estrutura aidsidlca correspondente (linear ou aberta) segundo o Esquema (fi)

(A) sendo R por exempla um hidroxilo ou um grupo amina livre ou sulfatado, sendo o dito equilíbrio, nos açúcares naturais, quase totalmente deslocada para a esquerda*

Por outro lado ê conhecido que certos métodos de despolimerisação de polissacarídsosj nomeadamente a despolimeri-zaçUo por acção do ácido nitroso, em seguida designada por "despolimarisaçla nitrosa", conduzem à transformação das unidades osídicss* Assim* por exemplo* as unidades qlicosídicas da hepairi-na sáo trnsformadas, pela despolimerização nitrosa, em unidades 255-anidromanosidicas segundo d Esquema <B>

(B) -0

Va-oh r NHSC3- \ apresentando a dita unidade 25o~anidramanGsidiea um grupa aldei-dico = A técnica de despolimerização nitrosa permitiu preparar heparinas de baixo peso molecular tendo na extremidade da maioria das espécies d agrupamento 2S5—anitiromanose,, portanto um grupo aldsidico.

Encontrou-se agora que fazendo reagir um polissacarideo com um polipeptídeoj a forma aldsidica do dito polissacarídso reagiu com aminas livres do dito polipsptideo para dar uma polibase de Schiff·» Esta reacçSo comporta o deslocamento do equilíbrio do Esquema CA) acima para a direita e a formação da polibase ds Schiff*

Encontrou-se também que a mesma reacçlo tem lugar com polissacarideos obtidos por despolimerizaçlo nitrosa segundo o Esquema CB> acima* e que a polibase de Schiff se forma rapidamente com rendimentos satisfatórios,

Além disso,. como os poliósidos não fim senão uma única extremidade redutora, o acoplamento nSo pode ter lugar senão ao nível desta extremidade e a estrutura terciária do polipeptídeo é assim conservada«

Ui tarionnente* verificou-se que fazendo reagir o polissacarideo com o polipsptideo na presença de um agente redutors ss obtém directamente o conjugado polissacarideo/poli-peptideo sem isolar a polibase de Schiff intermediária? com rendimentos muito bons*

Na presente descrição, o polipeptideo,. designado por S5P% é esquematicamente representado pela fórmula II seguintes Ρ°(ΝΗ^) (Π) àL (Π na qual Ρ° é ο radical ra-valente do polipeptideo P ao qual estão ligados os seus grupos funcionais livres* sendo os ditos m grupos funcionais MH-, o grupo amino terminal e os €m— í > grupos amino em posição épsílon das lisinas contidas no polipeptideo»

Na fórmula (II) de cima» m representa a totalidade dos grupos amino disponíveis para a formação das polibases de Schiff* mas α acoplamento n'lo tem lugar senão sobre um certo número» designado por ”n% destes grupos aminoo o radical n-valente ligado aos grupos amino que reagiram com o grupo aldeídico de Z é de aqui em diante designado por P'»

Está entendido que3 na presente descrição, o conceito alargado de "valência" se refere às ligações livres dos radicais ou das estruturas a que respeitam» Assim» α radical P' m-valents ou n—valente ê o resíduo do polipeptídeo P com as suas m ou n ligações livres tal. com acima ilustradas e as estruturas bi vai entes Ia% Ih% Ic" e ld!i sbaiKO esplicam-se por si só»

Na presente descrição» o polissacarideo é esquematicamente representado pela fórmula

T T do- sendo Z a unidade sacaridlca terminal redutora, do dito polissaca-ridso na sua forma aldeidica seja natural seja proveniente duma despoliffieritaçlo nitrosa e sendo ósido o resto da cadeia do dito polissacarideo» 0 radical monovalente ásido-Σ'- representa α palissaca™ rídeo òsido-Z tal como foi acima definido, privado do grupo aldeidieo de Z.

Mais particularmente5 na fórmula (I) ósido- representa o radical dum polissacarideo ósido-Z (III) , chamado igualmente "poliósido"5 proveniente de substâncias naturais biocompatíveis, sem resíduos aqlícones5 sendo o dito poliósido privado de uma unidade sacarídica terminal redutora CZK 0 termo “biocompatível" tal como utiliçado na presente memória descritiva designa a propriedade de polissacarideos naturais, tendo um peso molecular de preferência inferior a ΙβΦ,.βθ©, nomeadamente compreendido entre 1..20Θ e 5Θ=0ΘΘ, e dos seus derivadas ou análogos cujos constituintes se encorsontram naturalmente no organismo dos mamíferos e sus, por isso, podem ser facilmente mstaboliçados e eliminados»

De maneira vantajosa, o poliósido proveniente de substâncias naturais biocompatíveis é u® glicosaminoglicano tal corso foi definido por R» W» Jeanlos, Arthritis and Rheumatism, 1960, 3, 233-237 e por Casu, Advances in Carbohydrate Chemistry and Biochemistry, 1985, 43, 51-134»

De maneira preferencial, na fórmula (I) acima, ósido representa o radical de um glicosaminoglicano ósido-Z escolhido de. entre a hsparina, fragmentos de heparina, condroítina sulfata 4-S, condroítina sulfato 6-S, heparano sulfato e dermatano sul fato,privado da unidade terminal redutora Σ „

Num aspecto particular e vantajoso do invento, o N-poliosil-polipeptideo provém tíe um glicosaminoglicano do tipo heparínico ósido-Z cujo motivo Z representa o motivo terminal

redutor de uma cadeia redutora tendo sofrido uma despolimerizaçMo nitrosa* é representado pela fórmula (Ia) seguintes

que corresponde à fórmula <I>5 sendo o agrupamento entre as linhas a tracejado o radical Z' e sendo R1 H ou SG^, ..

Na fórmula (Ia) acima3 ósido designa? segundo um aspecto preferencial do presente invento? o radical proveniente cie uma heparinaP representado pela fórmula

\ν

(la·) na qual N, representa hidrogénio ou um grupo Su_, ? K._s representa um grupo acetilo ou um grupo S0T s p varia de 4 até 24. v> É entendido que o valor de p5 no radical Cia'), é tal que representa o número de unidades dissacaridicas da fragmentas de hsparina proveniente de uma despolimerisaçlo nitrosa da he pari na natural, nas misturas que t'êm vantajosamen te unia massa molecular média que se situa entre 2ΘΘΘ e 65ΘΘ Dalton, de preferencia cerca de 2ΘΦ& a 25Θ® Dalton.

Num outro aspecto particular do invento, o N-poliosil-—polipeptídea provêm de um polissacarideo ósido—Z cujo motiva Z representa o motivo terminal redutor natural de um çlicosamino— glicano de tipo heparinico. é representado pela fórmula (Ib) seguintes

Ρ' (Ib) η que corresponde á fórmula >; I > 5 sendo o agrupamento entre as linhas a tracejado o radical 1' e sendo R, H ou 8CL. «sendo R„ H, ___ I o* * ^ S07 au acetilo e sendo Psido o resto da cadeia heparinica,.

Na fórmula (Ib) acima5 R._, representa de preferencia SQ.^ ou acetilo e ósido representa de prsferfncia o radical <Ia?>5 no qual p varia de 1® até 1®®;; sendo o valor de ρ tal que representa g número de unidades dissacaridicas que formam as misturas de cadeias na heparina natural«

Num outro aspecto particular do invento,, o M-poliasi. 1~ ~polipeptideo que provém de um polissacarideo ósido—Z cujo motivo Z representa o motivo terminal redutor natural de um glicosamino-glicano de tipo condroitina ou dermatano sulfato, é representado pela fórmula (Ic) seguintes

Os ide

— NH- P' (Ic) n

onde um das R1 representa hidrogénio e o outro um grupo Su.r s p varia de 1® até 1®®„ sendo o valor de p tal que representa o número de unidades dissacarídlcas que formam as misturas as cadeias presentes na eondroitina sulfata ou na dermatano sulfato,,

Num outro aspecto particular do inventos o N~poliosil~--polipeptideo que provém de um ρο1issacarideo ósido-Z que sofreu uma despolimericacSío em condições tais que a cadeia possui um número de motivos impares de que o motivo Z redutor representa usr ácido urènico5 ácido D-glucurónico ou L-~idur6nico„ é então representado pela fórmula <Id) seguintes ap

que corresponde à fórmula <I>5 senda a agrupamento entre as linhas a tracejado o radical Z" 3 sendo R, H ou SQ._ 5 e sendo ásido a resta da cadeia polissacaridica» 0 presente invento compreende igualmente compostos de fórmulas Cia) e (Ih) acima., nas quais àsido representa o resto de fragmentos de heparina homogéneos em relaçSo á sua massa molecular (fórmula Ia'5 p - i-ΙΘ) e que sventualmsnta contém o sitio de fiHâçSo è. antitrombina 111= Ele compreende por outro lado compos-i tos da fórmula íb acima, na qual ósido representa o resto de um oligassacarídeo de síntese (fórmula Ia" s p ~ 1-6)

Nas fórmulas (Ia),, Cíb)., CIc) e CId) acima, o radical Z' pode ser melhor representado pelas estruturas .bivaientes -1 respactivas seguintess

CH-OR, I 2 1

CHOH

I -O-CH-CH-CH-

I I OH NHR2 (Ib") CH-OR1 COO I CHOH I -O-CH-CH-CH- I I OH ORj^ (Id") i 2 1

CHOH

I CHOR-, I 1 -O-CH-CH- et

I NHCOCH3 dc") nas quais hU e R.-, sSo tais como foram acima definidos acima e a esterecconfiguração é a da unidade terminal redutora Z=

Na fórmula I acima? P' è vantajosamente o radical n-valente duma proteína snziínáiica? em particular uma encima capaz as agir sobre um substrato libertando um 'produto colorido., podendo este última ser doseada par densidade éptica, A psroxida--· se de rabanete e a fosfatass síd exemplos de tais enzimas» T§m sido obtidos resultados muito setisfatórios s reprodutíveis com a peronidase de rabanete»

De uma n?anaira vantajosa, o N-poliosil-polipsptídeo utilizado a título de GAS~enzima para a realização do presente invento corresponde à fórmula (Ia) acima, na qual P'' é o resíduo de uma molécula de peroxidase de rabanete e n é igual a 3=

Para preparar q conjugado GAG-enzima útil para a realização do presente invento, procede—se por enxerto covalsnte dos motivos aminas livres da enzima P sobre as cadeias do GAG nlo comportando cada uma senão um único agrupamento aldeidlco suscep-tível de reagir com um motiva smina.

Mais particularmsnte, o processo para a preparação de uma GAGjenzima de fórmula íl) acima é caracterizado por se tratar a enzima P representada pela fórmula P" CNH.n> (II)

O na qual P é o radical m-valente da enzima P à qual estão ligados os seus m grupos funcionais MH„ livres, sendo os ditos m grupas funcionais Ml-U o grupo amino terminal s os grupos amina sm posição êpsilon das Cm—1) 1isinas contidas na enzima, com um excesso ds um GAG representado pela fórmula ΙΪΙ seguintes ôsido----Z (III) sendo Z a unidade sacaridica terminal redutora do dito GAG na sua forma aldeídica quer natural, quer proveniente ds uma despolime-rização nitrosa e sendo ôsido o resto da cadeia do dito polisse-caridso e se submeter a polibasa de Schiff assim obtida de fórmula

Cosido-Z'-CH=M~) P* (IV) n 25

na qual o radical monovalente ásido-Z' -· representa o polissacsri-deo ósido-Z tal como acima foi definido,, privado do grupo altísí-dica de Z, s P'' e n sSo como acima foram definidos,, a uma redução com um cianoborD-hidreto»

De maneira vantajosa, os poliòsidos naturais hiocompa-tiveis õsitío—Z utilizados como produtos ds partida III sSo glicosaminoglicanos tal como acima foram definidos (GA6s>, nomeadamente substâncias constituídas por cadeias nas quais alternam ácidos urónicos (ácido D~gIucurórico ou ácido L—iduróni-co) s açúcares amimados, podendo estes últimos ser glucosaminas quando se trata de glicosaminoglicanos de tipo heparínico, ou galactosaminas quando se trata de glicosaminoglicanos de tipo condroitina sulfato, a saber a condroitina sulfato 4-S, a con~ droitina sulfato 6-8 s o dermaiano sulfato, podendo os agrupamentos carboxílicos dos motivos osídicos dos ditos BAGs ser salifi-cados ou estsrificados9 sendo os grupos hidras!los diversamente substituídos por agrupamentos funcionais, de preferência grupos sul fatos 5 e sendo os agrupamentos ensinados substituídos quer pcsr grupos sulfato,; quer por grupos acetilo»

Tais GAGs slo constituídos por uma mistura de cadeias heterogéneas em relação aos seus pesos moleculares, podendo estes últimos variar desde 1»8ΘΘ até 5β„0ΘΘ Dalton, e em relaçlo à posição e número dos seus agrupamentos funcionais» LJs preferência, o poliósido de partida III é um glica™ saminaglicano escolhido de entre heparina, fragmentos de heparina, condroitina sulfato 4-S, condroitina sulfato 6-S, heparano sulfato e dermatano sulfato»

Gs compostos de partida III particularmente preferidos slo glicosaminoglicanos do tipo heparínico, quer dizer

hspãrina.pheparano sulfato e seus derivados’ obtidos quer por fraccionamento a partir da heparina ou do heparano sulfato* quer por hemissíntese ou síntsss. Tais poliésidos têm sida largamente descritos na literatura» Pode tratar-se de produtos naturais obtidos por fraccionamento ou por síntese» tais como os descritos nas patentes francesas 2 440 376 e 2 461 719 ou nas EP 84 999 e 113 599 § pode tratar-se igualmente de produtos obtidos por dsspolimerização tais como os descritos nas patentes europeias 37 3i9? 4© 144 s 181 252, Num aspecto particularmsrite preferido do invento5 utilizam-se misturas de fragmentos de heparina obtidos por daspolimerizaçSo nitrosa tendo uma massa molecular inferior a 10,000 Dalton? em particular os que têm uma massa molecular média que se situa entre 2„0Θ® e 2=56© Dalton» Vantajosamenie podem-se igualmente utilizar fragmentos de heparina homogéneas em relaçSo à sua massa molecular ou oligossacarídeos obtidos por síntese que são homogéneos tanto no que respeita á sua massa molecular como à posição e número dos seus grupos funcionais, No seguimento do texto,: a mistura de cadeias heparínicas obtidas por despolimsri-zaçlo nitrosa e que têm um peso molecular médio de 2*Φ&Θ Dalton» preparada como se descreve na PREPARAÇÃO I a) abaixo5. será designada pela referência "OS 4-10-CHO”,

Um outro produto de partida vantajoso ósido-Z é a mistura de fragmentos de heparina obtida por despolimerização nitrosa e descrita na EP-37 319| é designada por "CY 222-CHO",

Podem-se igualmente escolher como poliésidos derivados da heparina desprovidos de sitio de fixação â antitrombina III CAT III)3 quer as cadeias de heparinas tenham sido ffaccionadas de maneira a eliminar as cadeias oligossacarídicas que comportam o sitio de fixação à AT III recorrendo por exemplo a uma cromato-grafia de afinidade sobre resina Sépharose-AT III ou a cromato-grafias de permuta iéniea3 como está descrito em E„ Sachs et al„.

Throflíb= Res. ? 19829 25, 443-4585 quer estes Sá.ifcio$ tenham eido destruídos por exemplo por daspolimerização com ácido periódico e bsts-eliminação sxaustivs, Lembrar-se-á aqui qus a antitromhina ΪΪΙ ou AT III é um inihirfor piasmático da coagulação, activa sobre diferentes proteases piasmáticas s cuja actividade é fortements acrescida pela heparina que age como co-factor,

De uma maneira vantajosa, o acoplamento entre um dos motivos araínados da enzima P s da cadeia do BA6 õsido-Z efectua--se ao nivel do motivo terminal da cadeia ósida-Z, tendo ou não esta última sofrido uma operação prévia de fragmentação por despolimerização.

Quando se utiliza,, como produto de partida? um BA6 ásido-Z cujo motivo terminal Z é uiri grupo 2,5-anidromanósico obtido por despolimerizaçao nitrosa segundo o Esquema CB) acima, é preferível que a reacçSo de acoplamento seja efectuada sobre o dito ósido—Z imsdiatamente a seguir á sua preparação, para evitar que o grupo aldeídico5 notoriamente pouco estável? perca a sua reactividade»

Ma medida em que se deseja obter uma cadeia poliosídica de tipo heparinico desprovida de sitio de fixação á antitrombina IIIs è vantajoso utilizar como produto de partida um BAB que tenha sofrido uma despolimer!sacão com ácido periódico,, seguida de uma beta-eliminaçlo exaustivas permitindo este processo cortar prefersncialmente a cadeia heparínica entre os carbonos em posições 2 e 3 de todos os ácidos urónicos não sulfatados tal como α GAB descrito por Casu et alArznsim, Forsch=-/Drug Rss==, 1986,, 36 Cí)? nQ 4? 637-646, Oras é sabido que um tal motivo está presente no sítio de fixação da heparina è. antitrombina 111

A quantidade ds cadeias poi ios laicas* a pôr em seção deve estar em grande excesso em reíaçlo às cadeias peptidicas numa proporção de 1Φ© a 2Θ©© moles de ósido—Z para 1 mole da substância peptidica P3 Este eKcesso é vantajosamente de 5Θ© a 15©© moles de ósido-Z para Ufi*a mole da substância peptidica P, De prsferância5 quando se pSe em acção peroxidass de rafoanete? utilizam-se 1©©© a 15ΘΘ moles de ósido-Z para 1 mole de peroxida- 0 meio reaccional é um maio aquoso que deve estar desprovido de aminas primárias ou secundárias susceptiveis ds interferir com a reacçSo ds acoplamento entre o ósido-Z s o psptídeo P„ Ds uma maneira vantajosa., o meio aquoso é um tampão suscsptivsl de ser ajustado ao pH apropriado por adição ds um ácido mineral ou de um hidróxido alcalino* Eventualmente? pode ser adicionado um solvente orgânico miscivel com a água tal como o etanol3 a acetona5 a dimetilformamida*

Num modo preferido do invento? utiliza-se um tampão fosfato ©?©5 M adicionado de cloreto ds sódio* dunta~ss5 se necessário, polissorfaato 8© (derivados de sorbitano monooleato ou twesnlj por exemplo è razão de 1 p* l©*©©©., permitindo este agente tensioactivo evitar a absorção da substância peptidica P sobre as superfícies* 0 pH do meio reaccional é escolhido de maneira a que a amina esteja sob forma protonada? pode variar de é a 9* todavia vantajosamente è de 7 a 8« de preferencia vizinho da neutralidade* A temperatura ds rsacção pode variar sm função da substância peptidica utilizada* situando-se van ta j os-amen te entre -K2!:,C s s35*C, prosseguindo a reacção durante 2 a 15 dias* Ds

preferência, opera-se a baixa temperatura, por* 1 exemplo a 44°C, sobretudo quando a substância peptídica é uma enzima, sendo um grande número destas últimas termolábeis, que é em particular o caso das encimas trombolítieas» é preciso todavia notar que quanto mais baixa é a temperatura tanto mais lenta é a cinética da reacçlo» A duração da reacção é portanto variável conforme a temperatura escolhida» De maneira vantajosa;, deixa-se efsctuar a reacçlo sob agitação s +4°C durante 2 a 8 dias se o poliósido a utilizar possuir um agrupamento aldeidico proveniente de uma despolimerizaçlo nitrosa» Em particular quando a substância peotidica em utilização á uma enzima trombai!tica tal corna a uroquinsse, a pró—uroquinase ou o activador tecitíual do plasmi.no-gáneo, ou ainda quando se trata de uma enzima tal coma a peroxi-tísss ou a fosfatase suscepiível de ser dossada facilmente por acçãa sabre um substrato» a manutenção da reacçlo a f4°C durante 3 a 5 dias permite obter um rendimento de enxerto satisfatório» A polibase de Schiff de fórmula (Iv) assim obtida pode ser isolada segundo as técnicas conhecidas, por exemplo por precipitação com um sal apropriado» tal como o sulfato de amónio, s submetida a uma redução com um cianoboro-hidreto, tal como o cianoboro—hidreto de sódio» A redução pode igualmente ser feita directamente no maio reaccional» sem isolar a polibase de Schiff» é igualmente possível passar directamsnte aos compostos I por reacçlo do polipeptideo P cora o poliésido ôsido-Z em presença de cianoboro—hidreto de sódio nas condições acima»

Desta maneira, a polibase de Schiff intermediária ê reduzida à medida que ela se forma e o produto Ϊ é isolado enquanto único produto final»

Para separar α conjugado assim obtzdty dos produtos que nlo reagirams pode-se operar por precipitação, podendo esta operação efectusr-se por exemplo em meio de sulfato de amónio que se adiciona ao meio reaccional s® quantidade suficiente para saturar a soluçSOp quer dizer à razão de cerca de όββ mg/ml« Deixa-se em seguida decantar e centrífuga—se,-

Esta operação pode ser repetida depois de renovação do precipitado e adicionando de novo a este sulfato de amónio nas mesmas cond içoss =

Para recuperar o N-poliosiI-poIipeptideo sob a. forma pura» efsctua-se uma permeação em gel com a ajuda de um gel escolhido ast função da natureza e da dimensão do polipeptideo* A filtração em gel efectua-se de maneira vantajosa sobra uma coluna que contêm um gel de tipo ultrogel3 por exemplo o vendido pela __ _ f p}

Société IBh (s-rança) sob o nome de Ultrogsl ”' ‘ Ac A 44 ou o vendido por Pharmacia sob o nome de Sephacryl ΛΓν' S 200==

Num modo de realização vantajoso, dissolve-se o precipitado obtido na etapa precedente num tampão apropriado à substância psplidics P posta em arção .= deposita-ss em seguida a solução sobre a coluna que foi previamente equilibrada com a ajuda do mesmo tampão» A filtração em gel é seguida por meio de um espectrofotémetro de 280 nm e o pico de proteína ê recuperado, Ele contêm a totalidade do produto* tíe que se efectua em seguida a caracterização e a dosagem.

As polibases de Schiff de fórmula (IV) acima são produtos novos que representam os intermediários chave na preparação dos N-poiiosil-polipeptideos de fórmula Cl)» Elas constituem portanto um aspecto ulterior do presente invento.

-\

De maneira prefereneial5 na fórmula ílv> acimsj õsido representa d radical de um glicosaminoglicario ôsido-Z escolhido de entre a heparina3 fragmentos de heparina*. condroitina sulfato 4~-B3 condroitina sulfato ò-Ss heparano sulfato s dermatano sulfato^ privado da unidade terminal redutora Z,

Particularmente vantajosas sSo as polibases de Schiff provenientes de um polissacarídeo ôsido~Z cujo íiíotivo Z representa o motivo terminal redutor de uma cadeia de glicosaminogiicano hepariníco que sofreu uma despoiimerisaçSo nitrosa* Ela é representada pela fórmula iIVa) seguintes

que corresponde á fórmula Í1V)5 sendo o agrupamento entre as linhas a tracejado o radical Z' e sendo R1 H ou S0_ „

De uma maneira vantajosa., a polibáse de Schiff do invento corresponde á fórmula (IVa) acimas na qual P" é uma molécula de pero>;idase em particular a. peroxidasa de rabanete ou a fosfatase» s n é igual ou inferior a 6,, de preferencia 3 =

A polibase de Schiff (IVa) acima é transformada na N-poliosir-polipeptideo correspondente (la) por redução com o cianobaro-hidreto tís -sódio. 0 invento nSo se limita aos aspectos particulares acima descritos, pelo contrária ele engloba todas as variantes^ ele será melhor compreendido com a ajuda dos exemplos de aplicação que sa vão seguir,

PREPARAÇÃO I a <1?, na qual

!L.É..^j3emxillss^-da.....rabanete e Z-ósido é o........05 4-Í0-CHO A peroxidase de rabanete pode ser comprada no comércio. Trata-se, por exemplo da peroxidase vendida por SERVA, França, Ho exemplo que se vai seguir, utilizou-ss a peroxidase SERVA Lote Í8®775 cuja actividatíe é de 1,126 u./mg = a) Geração da terminação ald-eídica por despolimerização da heparinas 0 fragmento de heparina foi preparado da seguinte maneira; 5ΘΦ g de heparina injsctávsl, sob a forma de sal de sódio, são dissolvidos em 45#® ml de água desmineralizada, a uma temperatura de 1S°C» A relação YW/USP da heparina utilizada é vizinha de 1, apresentando estes títulos um valor da ordem ds iè©~17®„ A solução obtida é posta sob agitação enérgica, s o seu pH ê diffiinuido até 2,5 por adição de ácido clorídrico concentrado. Juntam-se então 15 g de nitrito de sódio dissolvidos em 3®Θ ml ds água, 0 pH da reacção é ajustado a 2,5 pelo ácido clorídrico concentrado e o volume total da

solução é levado atá , Deixa-se a reacção efectuar-ss durante 45 minutos depois verifica-se a ausência de iSss nitrosos residuais na solução reaccional5 por exemplo por meio de papel indicador impregnado de iodeto ds potássio amidado (desenvolvimento de uma coloração asul-violâcea na presença de iões rCç, ,

Deixa-se a reacção prosseguir até ao desaparecimento total dos ioes nitrosos na ausência de reacção ao papel iodoaminado, efectuando-se controlos todos os 3 ou 4 minutos.

Quando estes controlos se tornam negativos, a reacção é considerada como tendo acabado..

Os produtos da reacção são recuperados por adição tie 1Θ litros de etanol. Depois de 48 horas em repouso, o produto é decantado e elimina-se o sobrenadante. 0 precipitado é redissolvido em 9 litros de ágiAa desmineralizada» Junta-se 1ΘΘ g de cloreto de sódio e baixs-se o pH da solução até 3.8 com a ajuda de ácido clorídrico concentrado. 0 volume é ajustado exaciamente a 1Θ litros com a ajuda de água desmineraliçada, e junta-se sob agitação enérgica 1© litros ds etanol. Deixa-se repousar 48 horas. Sifona—se o sobrenadante e leva-se o seu pH até / ? 00 por meio de hidróxido de sódio 5 N. Junta-se 19 litros ds etanol. Deixa—se repousar 48 horas. Sifona—se o sobrenadante para o separar. 0 precipitado é recuperado, lavado com etanol3 moído e seco sob vazio.

Ohiém~se assim 12Θ g de mistura de oligossacarideos nao reduzidos que constitui a produto OS 4-10-CHO» %

Acoplamento da peroxidase da rabanete com o OS 4—10- -CHOs 1255 mg de peroxidase de rabanete em pé são dissolvidos em 3 ml de tampão fosfato ©»05 I1s NaCl 0,5 M3 pH 7. dunta-se 25 ®g de cianoboro-hidreio de sódio em i ml do mesmo tampão e 805 mg de OS 4-10-CHO em 1 ml do mesmo tampão» Ajusta-se o pH para 7 com soda 2 M e deixa-se reagir sob agitação durante 5 dias à temperatura de -4-4 °C« Verifica—se uma ligeira opalesefncia»

Eliminação do precipitados

Csntrifuga-se a 15»©©© rpm durante 1Θ minutos,, á temperatura de -4-4°C3 s em seguida efectua-se uma filtração sobre filtro Millipors ©,,2 micron»

Filtração em gels 0 produto recuperado na etapa precedente é depositado fs\ _ _ _ numa coluna Ultrogsi ' " AcA 44 i Itít» trança) de dimensão 25ó x IO© cm» A operação é seguida por especfcrofotómetro de 28Θ nm e recupera-se o pico de proteína»

Caracterização do produtos

Estuda-se a taxa de acoplamento do produto doseando-se as proteínas pelo método de Bleu de Coomassie CS» ff» Read e D» H» Worthcote» Ann» Bioehem»» 19815 11653-64) e o CY 216-CHO pelo método do carbazol (dosagem dos ácidos uróni-cos3 Fi„ Bitter e H» Muirg Ann< Biochem», 1962,, 4Ρ 330-334)»

Os resultados são calculados para um PM médio de 2=θ®0 Dalton no que diz respeito ao OS 4-10-CHO e 40»®©© Dalton no que diz respeito à peroxidase»

Os resultados são os seguintess - ί ί· ί ·

Proteínas s 15®28 fiig/nsl 5 i»e = para 7 m í. s 7» 196 mg (0,18 μίνΙ) OS 4-10-CHO s ®, 152 mg/ml5 i = e„ para 7 ml s 1»®64 mg (® s 552μΜ) Actividade s 1,42® u/ml» i»e= para 7 ml s 9 »94® u Rendimento s 7® ,6

Uhtãm-se 3 moles da 06 4-I0-CHU para 1 mole de peroxí- dase =

PREPARAÇÃO II

Preparação do SAS-encima segunda a fórmula < X ) » na gual__P é_____a

albumina.s.......Z-ósido é o QS 4-10-CHO a> Geração da terminação aldeidica por despolimeriseção da heparinss

Procede-se como se descreveu atrás no parágrafo PREPARAÇÃO I a)„ b) Acoplamento da albumina co® o OS 4-1®—CHOs ®»1 ml de albumina bovina sm solução a 3® mg são postos em solução em 2S® ml de tampão fosfato ®?©5 M? íMaCl ®,5 fi3 pH 7= Juntam-se 6® mg ds cianoboro-hidreto de sódio em 1 ml do mesmo tampão e 8®® mg de OS 4-l®-CH0 em 1 ml do mesmo tampão» Ajusta-se o pH para 7 com soda 2 N e deixa-se reagir sob agitação durante 7 dias» Constata-se um importante insolúvel» c) Eliminação do insolúveis

Centrifuga-se a 15»®®® rpm à temperatura de *-40C, e em seguida efectua-se uma filtração sobre filtro flillipore ®s2 mieron e lava-se com 1 ml ds tampão fosfato» d) Filtração em gels G produto recuperada na etapa precedente á depositada { E?) __ numa coluna Llltrogel AcA 44 <I8!-? i-rança) de dimensão

f i - . 2,6 μ 1θ%5 cnu A operação é seguida por espectrafotómetro de 28Θ nm e recupera-se o pico de proteina»

Caracterização do produtos

Estuda-se a taxa de acoplamento do produto doseando—se as proteínas pelo método de 8 leu. da Coomassie e o OS 4--1.0--CHO pelo método do carfaasol» Os resultados são calculados para um Pn médio de 2.ΘΘΘ Dalton no que diz respeito ao OS 4-10-CHO e 65„βθ® Dalton no que diz respeito à albumina.

Os resultados são os seguintess Proteínas s 4.6 mg/ml? i.e. para 7 ml % 32 mg (@-47 μη) OS 4-10-CHOs t?22 mg/ml? x.e» para 7 mis 8S54 mg (4,28 μΜ) T@‘m—se portanto 9 moles de OS 4---1Θ-ΌΗ0 para 1 mole de albumina.

IlaíiiíPLO A^QQ^p_-dg_pol. iça t i ãp. _sg b r e.......as_^^dades_da__alaç.a_____de microtitulação 250 μΐ de uma solução de Poli-L-1isina CPM vendida por Serva. França) com a concentração de 100 μΐ num tampão bicarbonato ô.l n? pH 95è são depositados em cada uma das cavidades de uma placa de microtitulação. Deixa-se incubar 48 horas à temperatura de 4-4 °Cn

As cavidades são em seguida esvaziadas por aspiração e depois lavadas cosi duas vezes 3ΦΘ ui de soluto cloretado i so tón i c o C NaC 1 9 p« í «300 > „

As placas estão prontas para a dosagem.

Incub-acSo do líquido no qual se encontra q poli anila sulfatado a dosear e preparação da curva de escalona-men to

Introduz-se em cada cavidade 2ΘΘ μΐ da solução amostra a dosear e paralelamente estabelece—se uma curva de escalonamento metendo num número de cavidades apropriado 2ΘΘ μΐ do mesmo meio biológica ao qual se terá adicionado uma quantidade conhecida do polianião sulfatado que se deseja dosear? ou seja Θ3® - Θ?25 - β?5 - 1 - 2?5 e 5 pg = A todos os meios biológicos foi adicionada benzsmidina á concentração de Θ,Θ125 ri„

Deixa-se incubar durante 2 horas? à temperatura de •MPC» Lava-se em seguida com 2 vezes ul de soluto cloretado isotónico»

Colocação em contacta com a mistura reveladora

Prepara-se a. mistura reveladora a partir dos conjugados GAG-peroxidase s GAG-albumina na proporção, expressa em equivalente de produto puro» de 34 pg/ml de peroxida.se para 7S7 pg/íiil de albumina* em solução no soluto HaCl 9 ρ» 1Θβ©„

Deposita-se 2’ã® μΐ desta mistura em cada cavidade,. Deixa-se incubar 1 hora a +4 °C« Lava-se em seguida com 2 vezes 4ΘΘ μΐ de soluto cloretado isotónico»

Reye 1 ação _da_çLuanfcidade....de. „,enzima .. presente

Deposita-se em cada cavidade 1ΘΘ μΐ da mistura seguin—

- 0,5 ísg de ortofenileno diamina em 1 ml de tampão citrato de sódio, HCI @,i !i, pH 3,5? - ®?75 μΐ de peróxido de hidrogénio»

DeiKa--se incubar 1Θ minutos à temperatura ambiente (cerca de 2Θ a 25 °C>» Pára—se a reacção por adição em cada cavidade de 1Θ© μΐ de ácido sulfúrico 1 N» Determina-se em seguida a densidade óptics a 492 rm, A curva de escalonamento é dada na Figura 1» Ela dá em ordenada a densidade óptica e em abcissa o log da concentração expressa em ug/ml«

Faz-se rsfsrtncia a esta curva de escalonamento para determinar, a partir da densidade óptics da amostra a dossar, a concentração em produto da amostra»

Os produtos A) a F) da lista seguinte foram ρrev1amsnte introduzidos numa mistura de plasma humano e doseados»

Os produtos testados são os seguintess A) Heparina do comércio, lota Η--8Θ1 <Laboratoire

Choay, Paris, França) B) Dextrano sulfato, lote 12-837 (Pharmacia, Suécia) C) Fragmento de heparina vendido no comércio sob a denominação Fraxiparine, lote MH-716 (Labaratciire Choay, Paris, França) D) Pentosano polissulfato vendido no comércio sob a denominação Hémoclar, lote 02ΘΘ3 <Laboratoire

Midy, Paris, França) E) Dosagem do fragmento de heparina conhecido sob a denominação CY 222 s descrito no Pedido de Patente

X

Europeia Eh ®5/ 31 v, late P 54 WH (Labarataire

Choay, Paris, França) F) Dosagem ds um fragmento de heparina obtido por despolimerização com periodato e tendo as seguintes característicass Pn médios 6,,®®® Dalton Local de fi>;ação è AT I1Is nada

Estruturas essencialmente constituída por dissaca-rídeo trissulfatado regular de tipo he~ parínico

Actividade anti-XA s inferior a 15 u/mg Actividade anti-IIas inferior a 15 u/mg Códigos IC 1772 - late P 37 VH <Laboratoire Choay, Paris, França) 0 produto IC 1772 foi preparado da seguinte maneiras < I < Eorte.....das_cadeias tie_heparina com_a......ajuda...........do ácido mrlàâim .10 g de heparina injectável de muco tie porco,, sob- a fornia de sal ds sódio, titulando 157 ul/mg na dosagem CodeK e 155 u/mg na dosagem anti-factor Xa de Yin et al„, slo dissolvidos sm 25® ml de água desminsralizada a 4C'L 0 pH da solução é ajustado a 5,0 por ácido clorídrico concentrado» 1® g de raetaperiodato de sódio (NalO^5 Plis 213,87) dissolvidos em 25Θ ml de água desmineralizada são adicionados sob agitação moderada, 0 pH do conjunto é ajustado a 5,® por ácido clorídrico concentrado, A solução è abandonada 24 horas, na obscuridade, em câmara fria a 4°C= <2) Eliminação da periodato residual

Reparte-se em seguida a solução reaccional por 3 tubos de diálise NOJftX 40‘' (porosidade de 3 a 4ΘΘ® Da) e suhmeta-ss a uma diálise durante 15 horas em contraccr-rente com água desmineralizada» <3 > PggggliJieEizaslQ ew...........Msico

Aos 780 ml de solução obtida a pés diálise» são adicionados ié ml de soda 퀷 Ns s a conjunto é submetido a agitação durante 3 horas à temperatura ambiente (da ordem de 18-21 °C), (4) Redução 5ΘΦ mg de boro—hidreto de sódio (NaBHU .. PMs 37?S3> são então adicionados e a solução é agitada de novo durante 4 horas à temperatura ambiente» 0 seu. pH é em seguida levado a 4 com a ajuda de ácido clorídrico concentrado» Depois de 15 minutos de agitação, o pH ê ajustado para 7 com ajuda de soda concentrada.

Aos 82Θ ml de solução assim obtida são adicionados ló?4 g de NaCl e depois 127Φ ml de etanol» 0 conjunto é deixado em repouso durante 3 horas e depois é centrifugado a 25ΘΦ rot/minuto durante 2Θ minutos, 0 precipitado é recolhido, reposto em suspensão em 200 ml de etanol puro5 moído no Ultra-iurrax " e finalmente recuperado por filtração sobre buchner fritado» 41

έ então seco sob vácuo a 4€> °u durar?te o horas»

Racupsra-se assim 8,9 g de produto intermediário que tem as seguintes propriedades? - dosagem Codex % 8 ul/mg - dosagem APTT s 7 ul/mg - dosagem An ti-Xa s 8 u/mq,, <5> FraccignaigntQ alcoólico

Estes 8s9 g são dissolvidos em cerca de 12® ml de água desmineralizada à temperatura ambiente» Adiciona-se i?78 g de NaCl e o pH da solução é baixado até 3,5 com a ajuda de ácido clorídrico» Q volume da solução é ajustado a 178 ml com a ajuda de água desmineralizada» São adicionados sob agitação 151 ml de etanol puro» A agitação ê mantida por 15 minutos após o fim tía adição e depois o conjunto é deixado em repouso durante 1® horas5 à temperatura ambiente» 0 precipitado formado é recolhido por centrifugação 2® minutos a 25®® rot/min» £ ressuspenso em 15® ml de etanol puro, moído no UItra-Turrax» recuperado por filtração sobre buchner fritado lavado por 3®® ml de etanol puro g finalmente seco sob vazia a 4® ’:‘C durante 24 horas»

Recuperam-se assim sob a forma de pó branco 5 q do produto 10 1772 que tem as caracteristicas seguintes? - titulo Codex s 11 ul/mg - titula APTT :,i 9 ul/mg -- titulo Anti-Xa s 12 u/mg.

Os resultados obtidas são repostos nas figuras la 6 que representam as curvas de escalonamento obtidas com os produtos A a F. por ordem.

Sobressai das figuras 1 a 6 que5 com base no método de dosagem descrito no presente invento^ se obtém uma variação da densidade óptica que é função da quantidade de produto presente nc plasma. Esta variação de densidade óptica permite portanto avaliar numa dada amostra, por exemplo o plasma de um animal ou ds um paciente tratado por um dos produtos (palianiSss sulfatados fortes)s d teor deste plasma no produto considerado.

Claims (1)

1. REIVINDIÇAC8ES 8 iâ - Processo de dosagem de poliósidos sulfatados fortemente aniónicos num líquido? caracterizado por estar baseado na dosagems graças a um conjugado aniénico revelador,, dos sítios catiónicos que ficam livres sobre uma superfície recoberta de um policatião, logo que este tenha sido posto em contacto com o liquido que contém o poliósido aniónica sulfatado a dosear, sendo o conjugado sniónico revelador escolhido de tal maneira que a sua densidade de carga lhe permite fixar-se nos sítios que ficam vagos sobre o policstião que recobre a superfície? sem todavia deslocar α poliósido a dosear que aí ss encontra previamente fixado, e sendo a quantidade do produto a dosear determinada por referencia a uma curva de escalonamento estabelecida simultaneamente sobre a própria placa» 2sí - Processo de dosagem de poliósidos sulfatados fortemente aniónicos num liquido, caractsrisado por: Ca) ss pâr em contacto uma quantidade determinada do líquido biológico que contém o produto a dosear com uma superfície recoberta de um produto catiónicop <h> se pBr em contacto o conjunto assim obtido com um excesso de um conjugado aniónico revelador, escolhido de tal maneira que a sua densidade de carga lhe permite fixar-se sobre os sítios que ficam vagos sobre o produto catiónico da etapa Ca) sem todavia deslocar o poliósido que ai se encontra prsviamente fixado?

   <c> se eliminar o excesso da mistura reveladora que não se fixou por ligação iónica com o excesso do produto caiiónico da etapa Ca)s (d) se dosear, por um método apropriado» função do conjugado revelador sscolhido»a quantidade da dita conjugada revelador que se fixou por ligação iónica no decurso da etapa Cb)p (s) se determinar a quantidade total do produto a dosear na amostra referindo a quantidade do conjugado revelador definida segundo a método apropriado da etapa (d) a uma curva de escalonamento estabelecida simultaneamente sobre a própria placa segundo o mesmo método» 3S - Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 e 2S carasterisado por α catião utilizado ser um polime-ro básico escolhido do grupo constituído por sulfato de protami-nã5 polibrenon poliarginina e poli-L-lisina» 4s - Processo de acordo com a reivindicação 3 caracte-risada por se utilizar como policatiãa uma poli-L-lisina com um peso molecular médio que se situa entre ό„ΘΘΘ e daltons» 5s - Processo de acorda com qualquer uma das reivindicações 2a 4» caracterizado por na etapa ía) o polieatião ser absorvido nas cavidades de uma placa de microtit.ulação5 em meia básico, por incubação durante 24 a 72 horas, de preferência 48 horas a uma temperatura que se situa entre & e 2®°C5 depois de lavagem» és - Processo de acordo coo· a reivindicação o5 caracte-rizado por o meio básico no qual se encontra o palicstiSo ser um tarapSo um tamplo bi

   χ' CíCS 7e ... Processo d e StOrdu uOfli a reivi .ndicaçlo 2S E_ 3. rizado por α c on j íãcj ad o aniónico rev 'Siâdor o a s ca ρ a í b consti tu ido DO] r um qlicos am inoq1ic ano 1 íqado d e man s* i r a cov a uma enzima Bã — Krocssso de at incubada durante oslo menos 20°C« depois de U cAU OSb por n caracterisatio por OlTl o ua i o u e r Ui na etapa ( h as a uma tS! 8m! em a OiTi qualquer ' Ui etaoa C d) rsivindi' illl temperatura que reivinoi-. lisar um íné'cooo do oosaqeín ©nzirnâuico* im - Processo acuruo !_ι_Εΐΐι a rsivisidu.si.So P ;1 t-arcíu-· ’csri xado por a enzima tí o conjugado rev elaoor ssr ooseave1 por acçao S-O brs um substrato e ixbertaçeio qs ura produto colondcj que se dosei a por densidade ópt i c a = 10. csractsrizado oor o pollósido aniónico do coniucia- da revtóladur < Um g1xcos aminoglicano» 12ê - jp !*Qr" ;~SSD de acordo l. ucn a reiv x i ioil au a o i 1 .. f" -¾ 1 racterizado por o q1icqs •aoiinog 1 ícano do c onjugado revelador sar he pa r i n a ou um dos seus τ raqmenxos« 1 ó ~ .... Processa ar-nrcjn com _ s... j, jL »: c a r a c t. e r x z a q d do r qIicDssminoq1icano ser uma mistura do X fragmentos de heparina constituídos por cadeias que possuem essencialments de 4 a 1® unidades tíissacarídicas. 14ã - Processo de acordo com qualquer uma das reivindi™ cações 1 a 13, carsctsrizado por o conjugado revelador ser um conjugado GAG-enzima diluído com um conjugado GAS-albumina. sendo idfnticos os GAGs utilizados para os dois conjugados. 15§ ~ Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14.·, caracterizado por a enzima utilizada ser a perosíi-dase de rabanete. 1&ã - Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1. a i55 caracterizado por os constituintes do GAG-enzima serem rsspectivamente o 08 4-1Θ-0Η0 s a peroMidase de rabanete. 17ã - Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a lô5 caracterizado por a quantidade de enzima presente em cada uma das cavidades ser revelada por uma mistura de ortofs-nilsno diamina e de perónido de hidrogénio. ISã - Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 25 15g 16 du 17. caracterizado por na etapa Cd) se revelar a quantidade de enzima presente por adição de uma mistura de ortofenileno diamina em tampão citrato,, pH 3P5 e de perónido de hidrogénio e incubação 1® minutos à temperatura ambiente,, depois de paragem da reacção por adição de um ácido forte. 19â - Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14. caracterizado por a enzima utilizada ser a fosfa-tase. X 20a - Processo de acordo com a reivindicação 19s caracterizado por o substrato de dosagem do conjugado BAG-fosfa-tass ser o 4~-nitrofsn.il fosfato» 2iâ - Recipiente destinado à dosagem de poliósidos sulfatados fortemente aniónicos caracterizado por conter os elementos seguintes; - Placa de ffiicrotitulação - PolicatiSo - Conjugado revelador constituído por um polianião ligado de maneira covalente a um revelador escolhido do grupa constituído por uma enzima e uma molécula orgânica susceptivel de ser «larcada -·- Substrato de dosagem escolhido em função do conjugado revelador, 22ã - Kecipients de acordo com a reivindicação 21 ? caracterizado por conter os elementos seguintess --- Placa de microtitulação -- Policstião escolhido do grupo constituído por sulfata de protamina? polibreno, poliarginina e poli-L-lisina - GAS-enzima liofilizado - Substrato da enzima escolhidas gerador de um corante» 23ã - Recipiente de acorda com a reivindicação 21 ou 223 caracterizado por conter os elementos seguintess - Placa de micro titulação - Policatião escolhido do grupo constituído por sulfato de protamina3 polibreno3 poliarginina a poli-L-Iisina 5

   \ - 8A8-enζima liofilizado? senda a enzima escolhida na grupo constituído pela perozidase de rabanete e a fosfatase - SAG-albumina liofilizado Substrato da enzima escolhida, gerador de um corante, 24s - Recipiente de acordo com a reivindicação 21 a 23, caracterizado por conter um múltiplo de cada um dos elementos seguintesã ~ Placa de microtitulação s 1 - Poli-L-lisina s 25 ml a 1Θ0 pg/ml - BAB-peroKitíase liofilizado s 68 pg - GA8~albumina liofilizado s 54 p.g - Ortofenileno diamina s I® ml <5 mg)= 25-â - Recipiente de acordo com qualquer uma das reivindicações 21 a 24 caracterizado por as placas de microtitulação serem recobertas pelo policatilo e prontas a serem empregues, 26S - Recipiente de acordo com qualquer uma das reivindicações 21 a 25s caracterizado por ser acompanhado de instruções de utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 2ô, Lisboa 3 29 de setembro de i¥69

   RUA VÍCTOR CQ?ffi©N, 10- A, l.‘ 1200 LISBOA