PT92907B

PT92907B - Processo para a preparacao de um precursor de insulina

Info

Publication number: PT92907B
Application number: PT92907A
Authority: PT
Inventors: Michael Dorschug
Original assignee: Hoechst Ag
Priority date: 1989-01-21
Filing date: 1990-01-19
Publication date: 1995-12-29
Also published as: EP0381958B1; IL93115A; JPH02233699A; HU900197D0; IE900217L; AU624894B2; GR3017591T3; NO178861C; EP0381958A2; CA2008245A1; AU4862190A; IL93115A0; HUT54389A; ATE126808T1; FI900296A0; NZ232178A; EP0381958A3; NO178861B; FI900296A7; DE59009540D1

Description

Descrição

A insulina é uma molécula constituida por duas cadeias polipeptídicas que estão acopladas entre si por meio de pontes de dissulfureto. A cadeia A consiste em 21 aminoácidos e a cadeia B consiste em 30 aminoácidos. Estas duas cadeias estão acopladas entre si na molécula precursora, a próinsulina, por um peptídeo, o peptídeo C.

peptídeo C da próinsulina humana consiste em 30 aminoácidos. 0 peptídeo C, no quadro do processo de maturação da hormona, é dissociado por proteases específicas e a próinsulina é assim transformada na insulina (Lavidson et al, Nature 335. 93-96, 1988). Além dos peptídeos C de ocorrência natural, na literatura estão descritos um certo número de possibilidades de ligação entre as cadeias A e B Yanaihara et al., Diabetes 27, 149-160 (1978), Busse et al., Biochemistry 15, 1649-1657 (1971), Geiger et al., Biochem.

Biophys

Res. Com. 55, 60-66 (1975)).

No âmbito da tecnologia genética é hoje possível preparar insulina a partir de microorganismos modificados pela tecnologia genética. Se for utilizado como microrganismo E. coli. o produto é então expresso frequentemente como proteina de fusão,isto é, o produto é acoplado com uma proteína própria da bactéria, por exemplo com a β -galactosidade. Esta proteína de fusão separa-se na célula por precipitação e está deste modo protegida da degradação proteolítica. Depois da sua remoção da célula a fracção proteina de fusão é dissolvida química ou enzimaticamente e os 6 grupos cisteina do precursor de insulina são transformados, por meio de sulfitólise oxidante, nos seus S-sulfonatos (-S-SO^-). A partir deste ohamado S-sulfonato de préproinsulina tem que ser produzida, num passo subsequente, a préproinsulina nativa com a construção das 5 pontes de dissulfureto correctas.

Este passo é realizado por exemplo de acordo com o processo descrito na Especificação EP-B-0 057 255 por reacção do S-sulfonato de partida com um mercaptano numa quantidade que produz 1 a 5 radicais SH por radical SSO^ , em meio aquoso, a um valor de pH de 7 a 11,5 e a uma concentração de S-sulfonato até 10 mg por ml de meio aquoso, de preferência na ausência de um oxidante .

Para a obtenção dos mais altos rendimentos de enrugamento - isto é, elevado rendimento de préproinsulina com os enlaces correctos das sequências peptídicas (pontes -S-S- de A6 para All, de A 7 para B7 e de A20 para B19) - é necessária neste caso, todavia, a manutenção das relações indicadas - estrtitamente limitadas - SH/SSO^^-, o que exige um cuidado considerável na realização do processo e especialmente - o que não é de todo fácil - uma determinação quantitativa dos grupos

- 2 SSO^ no S-sulfonato de partida.

Surpreendentemente, descobriu-se agora que se conseguem obter altos rendimentos de enrugamento” - praticamente independentes da relação SH/SSO^^-, dentro de ampbs limites - se se trabalhar com elevadas relações SH/SSO^ - isto é, situados acima de 5:1 - na presença de um sistema redox orgânico ou de compostos que, nas condições da reacção, formem um sistema redox orgânico; em vez dos grupos SSO^~ potem também estar presentes nos correspondentes produtos de partida outros grupos de bloqueio de enxofre; além disso as sequências peptídicas das cadeias -A- e -B- da insulina podem também estar modificadas por permuta de um ou mais aminoácidos.

A alta relação SH/SSO^^- - (ou grupos de bloqueio de enxofre) - significa que - desde que se ultrapasse apenas uma determinada quantidade mínima de mercaptano - se pode trabalhar de forma praticamente independente da grandeza do excesso de mercaptano sem influência essencial sobre o rendimento; deste modo pode também prescindir-se de uma determinação quantitativa exacta dos grupos SSO^- (ou grupos de bloqueio de enxofre) no correspondente produto de partida de insulina, o que representa uma vantagem considerável do processo.

A trabâlhar-se praticamente independentemente da grandeza do excesso de mercaptano é possibilitado pela presença de um sistema redox orgânico ou de compostos que, nas condições da reacção, formem um sistema redox orgânico do tipo referido.

E de resto sabido que a proinsulina reduzida - isto é, proinsulina cujas pontes S-S foram dissociadas a grupos SH por via redutiva, por exemplo com um mercaptano - pode ser reoxidada à proinsulina original e que esta reoxidaçfio é acelerada pela presença de ácido deshi-

droascórbico - ver D. P. Steiner e J. L. Clark, Proc. Natl. Mod. Sei. USA 60, 622-624 (1968): mesmo que, nas condições de reacção ali descritas, se deva formar a partir de ácido deshidroascofbico um sistema redox composto por ácido deshidroascórbico e ácido ascórbico, parte-se ali da oxidação da proinsulina reduzida com grupos enxofre não bloqueados, enquanto que no caso da presente invenção, intereesa como produto de partida apenas precursores de insulina com grupos enxofre bloqueados. Além disso a referida fonte da literatura de D. P. Steiner e J. L. Clark, obra citada, não contém qualquer recomendação ou disposição no sentido da utilização e da acção de um sistema redox orgânico na recombinação de produtos insulina-precursor, que contém grupos de bloqueio de enxofre, por meio de mercaptanos.

Q objectivo da invenção é pois, em particular, um processo para a preparação de um precursor de insulina de fórmula I (A-1)

Gly-NH (A-6)

Cys-S-S (A-20) (A-21) (A-7)

Cys---Cys— (A-ll)

S ι

S

------Cys - Z - R<

(I) (B-1)

R₁-HN-Phe —

Cys(B-7)

Cys (B-19)

Y (B-30)

na qnal

Rj. representa hidrogénio, um radical de aminoácido ou de peptídeo dissociável química ou enzimaticamente.

R2 representa hidroxilo ou um radical de aminoácido ou de peptídeo, de preferência hidroxilo,

X representa um radical ligado às cadeias A e B da insulina, de preferência um radical de aminoácido ou de peptídeo,

Y representa um radical de um aminoácido codificável geneticamente, de preferência Thr, Ala, Ser, especial mente Thr,

Z representa um radical de um aminoácido codificável geneticamente, de preferência Asn, Gli, Asp,

Glu, Gly, Ser, Thr, Ala ou Met, especialmente Asn,

A1-A20 e B1-B29 representam sequências peptídicas da insulina, não modificadas ou modificadas por permuta de um ou mais aminoácidos, de preferência as sequências peptídicas não modificadas da insulina humana, de porco ou de vitelo, especialmente de insulina humana ou de porco, por reacção de um precursor com grupos Cys-S protegidos com um mercaptano em meio aquoso;

processo é caracterizado por se fazer reagir um precursor com grupos Cys-S bloqueados, de fórmula II

preferêc

R, representa um grupo de bloqueio de Cys-S, de cia o grupo -S0^~ ou o grupo t-butilo, com um mercaptano, numa quantidade correspondente e aaa relação SH de mercaptano/Cys-S-R^ (na fórmula II) superior a 5, na presença de um sistema redox orgânico ou pelo menos de um composto orgânico que nas condições de reacção forme um sistema redox orgânico referido.

Se nas fórmulas I e II representar hidrogénio, trata-se da próinsulina ou de produtos derivados da próinsulina; se R^ representar um radical de aminoácido ou peptídeo dissociável química ou enzimâticamente, trata-se da préproinsulina, bem como de produtos dela derivados.

Os radicais de aminoácido dissociável quimicamente sSo aqueles que podem ser dissociados por exemplo por meio de BrCN ou N-bromossucinimida; são por exemplo a metionina (Met) ou triptofano (Trp). Os radicais de aminoácido dissociáveis enzimâticamente são aqueles que são dissociáveis por exemplo por meio de tripsina (como por exemplo Arg ou Lys).

Os radicais peptídicos dissociáveis química ou enzimâticamente são radicais de peptídeo com pelo menos 2 aminoácidos.

Genericamente os aminoácidos que interessam para R^ são de preferência os do grupo dos aminoácidos naturais, isto é, principalmente

Gly, Ala, Ser, Thr, Vai, Leu, Ile, Asn, Gin, Cys, Met, Tyr, Phe, Pro, Hyp, Arg, Lys, Hyl, Orn, Cit e His.

Rg representa hidroxilo ou - tal como Rj_ - representa igualmente um radical de aminoácido ou de peptídeo, sendo preferido o significado de hidroxilo. Os aminoácidos (e também aqueles que formam o radical peptídico - constituido por pelo menos 2 radicais de aminoácido) tal como no caso de R^, derivam preferivelmente do grupo dos aminoácidos naturais.

X é um radical que liga as cadeias A e B da insulina, de preferência um radical de aminoácido ou peptídeo.

Se X representar um radical de aminoácido, é então de preferência o radical de Arg ou Lys; se X

- 7 - =?

representar um radical peptídico é então preferivelmente o radical de um peptideo C de origem natural - especialmente o peptideo C de insulina humana, de porco ou de vitelo.

Os aminoácidos codificáveis geneticamente - para Y - são (todos na forma L) : Gly, Ala, Ser,

Thr, Vai, Leu, Ile, Asp, Asn, Glu, Gin, Cys, Met, Arg,

Lys, His, Tyr, Phe, Trp, Pro.

Rs aminoácidos codificáveis geneticamente são Thr, Ala e Ser, especialmente Thr.

Z, tal como Y, representa igualmente o radical de um aminoácido codificável geneticamente, sendo no entanto preferidos neste caso Asn, Gin, Asp,

Glu, Gly, Ser, Thr, Ala e Met, especialmente Asn.

A1-A20 e B1-B29 podem em principio representar as substâncias peptidicas, não modificadas ou modificadas por permuta de um ou mais aminoácidos, de todas as possíveis insulinas; os mutantes podem ser produzidos de acordo com processos conhecidos da tecnologia genética (site directed mutagenesis). São no entanto preferidas as sequências peptidicas não modificadas da insulina humana, de porco ou de vitela, especialmente da insulina humana ou do porco (as sequências A1-A20 e Bl-B29 das insulinas humana e de porco são idênticas).

radical R^, que sé aparece na fórmula II, representa praticamente qualquer grupo de bloqueio de enxofre de cisteina, mas de preferência os grupos -S0₃ - ou t-butilo, tendo no presente caso o grupo -S0^~ - uma maior importância.

produto de partida de fórmula II pode em principio ser utilizado num amplo intervalo de concentraçães - preferivelmente em solução entre cerca de

ug e 10 mg/ml - conduzindo como se sabe as menores concentrações aos maiores rendimentos de renaturação, visto que com menores concentrações de proteína a tendência para agregação é reduzida. As concentrações preferidas situam-se entre valores de cerca de 0,1 mg e 0,5 mg/ml.

Como mercaptanos interessam para a reacção de ocordo com a invenção, em principio, todos os compostos orgânicos possíveis com grupos SH; são preferidos mercaptoetanol, ácido tioglicólico, glutationa e cisteina, especialmente mercaptoetanol e cisteina. Os mercaptanos podem ser utilizados individualmente ou em mistura.

A quantidade do mercaptano deverá ser escolhida de modo que a relação dos grupos SH para os grupos Cys-SR^ do composto de partida de fórmula II seja, tanto quanto possível, superior a 5.

Esta relação é limitada superiormente praticamente apenas por razões económicas; á conveniente um limite superior de cerca de 100. E preferida uma relação de cerca de 10 a 50» especialmente de cerca de 10 a 30.

A concentração de mercaptano no preparado reactivo dependerá então da quantidade do composto de partida utilizado de fórmula II e da relação escolhida SH/Cys-SR^.

Como sistema redox orgânico interessam de preferência pares de compostos dos quais um dos componentes é um composto orgânico com o elemento de estrutura de fórmula III

OH OH O

I I il

- C = G - C

Z ° OH °^H

I ι I

-0-0 = 0 (III) ou ue composto aromático componente é um composto tura de fórmula III numa tura de fórmula III de 0- ou p-dihidroxi, e o outro orgânico com o elemento de estruforma oxidada = elemento de estru0-0 0

- C - C - C ou uma o- ou p-quinona.

(III’)

As valências livres dos elementos de estrutura de fórmula III ou III’ podem ser preenchidas por hidrogénio ou por grupos orgânicos, como por exemplo grupos alquilo com 1 a 4 átomos de carbono. 0 elemento de estrutura pode no entanto formar também parte de um -anel tendo de preferência 4, 5 ou 6 átomos de carbono de anel, bem como eventualmente ainda um ou dois heteroátomos, como por exemplo oxigénio, podendo ainda o anel, por seu lado, estar também substituido por grupos inertes nas condições da reacção, por exemplo grupos alquilo ou hidroxialquilo.

A título de exemplo de compostos com os elementos de estrutura de fórmula III citam-se:

reductora

OH OH 0 ácido reductínio

OH

HC

CH h₂c

H, ácido oetilreductínico

OH OH

HC - CH

ácido ascórbico (Vitamina C) θ^Η

I

H0CH₂ - CH

OH OH

HC — -- CH

I ¹

CH C - O

As fórmulas são aqui apresentadas, cada uma, apenas numa das formas tautoméricas.

Todos os compostos estão reduzidos. Na forma oxidada o elemento de estrutura de fórmula III conv erte-se no de fórmula III’.

Como compostos aromáticos de o- ou p-dihidroxi interessam em principio todos os compostos de oe p-dihidroxi interessam em principio todos os compostos aromáticos possíveis com 2 grupos hidroxilo na posição o ou p, sendo apenas recomendável ainda que a ligação o- ou p-quinona dos compostos de o- e p-dihidroxi não deve ficar impedida estereoquimicamente por qualquer substituinte especial ou semelhante. Como exemplos de compostos aromáticos de o- e p-dihidroxi mencionam-se

1,2-dihidroxibenzeno = pirocatequina,

1,4-dihidroxibenzeno = hidroquinona, metil-hidroquinona, naftohidroquinona-1,4- e antra-hidroquinona; no caso da oxidação formam-se a partir destes as correspondentes quinonas.

Na reacção de acordo com a invenção podem então ser utilizados cada um dos sistemas redox orgânicos, constituídos por exemplo pelos pares de compostos ácido ascórbico + ácido desidroascórbico, pirocatequina + o-quinona, hidroquinona + p-quinona, naftohidroquinona + naftoquinona, etc, em praticamente qualquer proporção (de preferência numa proporção equimolecular). Mas também é possível utilizar apenas, em cada caso, um componente individual destes pares de compostos - e por conseguinte, por exemplo, apenas ácido ascórbico ou apenas ácido desidroascórbico, ou apenas hidroquinona, etc - porque se forma no meio reactivo o outro componente que em cada caso pertence ao par de oompostos redox (ácido desidroascorbico ou ácido ascórbico ou p-quinona, etc).

Os sistemas Redox orgânicos preferidos são as combinações constituidas pelos pares de compostos ácido ascórbico + ácido deshidroascórbico, pirocatequina + o-quinona e hidroquinona + p-quinona, e os compostos individuais preferidos que nas condições de reacção formam um tal sistema redox, são os componentes individuais destes pares de compostos.

A maior preferência recai no ácido ascór bico e/ou ácido deshidroascórbico.

A quantidade utilizada do composto ou compostos que formam o sistema redox orgânico pode variar dentro de amplos limites. Tomando como referência um equivalente-grama de mercaptano (=peso molecular do mercaptano utilizado em grama/número de grupos SH na molécula de mercaptano) o número de moles do composto ou compostos que formam o sistema redox orgânico pode ser escolhido entre cerca de 1/10 000 e 10 000, de preferência entre cerca de 1/10 e 10.

A reacção de acordo com a invenção é convenientemente realizada numa gama alcalina de pH, de preferência entre cerca de 7 e 12, especialmente entre cerca de 9,5 θ 11. Para a manutenção do valor de pH pretendido é conveniente a adição de uma substância tampão, tendo a natureza e a força iónica do tampão escolhido uma determinada influência sobre o rendimento de enrugamento.

E conveniente manter a força iónica baixa, sendo preferido um intervalo de cerca de 1 mM (mM = = milimolar) até 1 Μ (M = molar) especialmente um intervalo de cerca de 5 eiM até 50 mM. Como substâncias tampão podem ser utilizados, por exemplo, tampão de borato, tampão de carbonato ou tampão de glicina, sendo preferido este último.

Como intervalo genérico da temperatura da reacção pode ser indicado um intervalo entre cerca de 0 e 45°C; é preferido um intervalo de cerca de 4 a 8°C.

A protecção da solução de renaturação com determinados gases, como por exemplo oxigénio, azoto ou hélio, não tem qualquer influência marcada sobre o rendimento da renaturação.

A duração da reacção situa-se em geral entre cerca de 2 e 24 horas, de preferência entre cerca de 6 e 16 horas.

Depois do termo da reacção (o que pode ser fixado por exemplo por HPLC) procede-se ao restante tratamento de forma corrente, por exemplo também da forma descrita na especificação acima mencionada EP-B-0 037 255.

produto de fórmula I correctamente enrugado pode então ser transformado na correspondente insulina, enzimática ou quimicamente, de acordo com técnicas conhecidas.

Os exemplos adiante permitem elucidar mais pormenorizadamente a invenção a salientar também as vantagens relativamente ao estado da técnica.

Como produto de partida para a experiência de renaturação foi utilizada préproinsulina -S-SO^“ que foi obtido por tecnologia genética.

Como sistema de expressão utilizou-se E. coli. Em E.coli o gene para proinsulina está acoplado com uma parte do gene de β -galactosidase e é sintetisado como proteína de fusão que precipita na célula e se acumula nas extremidades (de acordo com o processo da especificação DE-A- 3 805 150). Depois da abertura da célula a fracção da fracção de fusão é separada por meio de halogenociano

( de ac ordo com o processo da espificação DE-A- 3 440 988) e finalmente é submetida a sulfitólise oxidante (R. C. Marshall e A. S. Inglês em A. Darbre (Hrsg.) Practical Protéin Chemistry - A Handbook (1986) págs 49-53) para transformar as 6 cisteinas na sua forma S-sulfonato. A préproinsulina-S-SO^^- assim preparada (o prefixo pré·' significa que a proinsulina está aumentada no seu terminus azoto de 5 aminoácidos) é em seguida recolhida de forma conhecida por meios de um permutador de iões, é precipitada e liofilizada. 0 produto de partida liofilisada assim obtido tem um teor de 60$ de acordo com a fieterminação por HPLC.

1® Dependência do rendimento de enrugamento da relação mercaptano/ácido ascórbico

Dissolve-se préproinsulina -S-SO^ (60$) com uma concentração de 0,33 mg/ml em tampão de glicina 20 milimolar, pH 10,5, o que corresponde a uma concentração de préproinsulina-S-SO^^- de 0,2 mg/ml. Utilizam-se por preparado 20 ml, aos quais se adicionam 480 ul de uma solução 0,1 molar de cisteina (excesso aproximadamente 20 vezes molar por grupo S-SO^~) e entre 0 e 480 /il de uma solução 0,1 molar de ácido ascórbico. A temperatura de renaturaçâo é de 8°C e a duração da reacção é de 16 h.

ácido ascórbico	(0,1 M)	rendimento	de enrugamento
0				25 $o	comparação
24	Λ¹			28 $ -
48	jul			53 %	de acordo com a
96	ul z			78 $
480	ul			81 $
composto redox que no caso do	Este exemplo sobre o rendimento preparado em ácido	mostra a influência do de enrugamento. Enquanto ascórbico se verifica pre-

dominantemente a formaçao de proteínas não enrugadas, o rendimento do enrugamento sobe na presença do composto redox.

2s Dependencia do rendimento de enrugamento do excesso mercaptano/ácido ascórbico peso, volume, tampão, tempo de reacção e temperatura da mesma, bem como o pH, correspondem aos valores do ensaio 1. Adicionam-se em cada caso quantidades equimoleculares de cisteina e ácido ascórbico, situam-se o excesso molar por grupo S-SO^~ entre 2,5 e 100.

Quantidades adicionadas de cisteina e ácido ascórbico

Processo por grupo S-SO^Rendimento de enrugamento

60	hl	2,5	38	%
120	χΐ	5	70	% -
240		10	85	% -
480	zUl	20	85	%
1200		50	81	%
2400	.ul	100	72	% -
		Este exemplo	mostra	que

comparação da invenção ultrapasse uma determinada quantidade mínima de mercaptano o rendimento de enrugamento, dentro de um intervalo amplo, é praticamente independente do excesso de mercaptano.

5² Dependência do rendimento de enrugamento do valor do pH peso, volume, concentração de tampão, tempo de reacção e a temperatura da mesma, correspondem ao exemplo 1. No ensaio adicionam-se 480 ul da solução

- 16 0,1 molar de cisteina e 480 _zul de solução 0,1 molar de ácido ascórbico (excessoiamolar aproximadamente 20 vezes por grupo S-SO^-)

pH	rendimento enrugamento
11,0	79 %
10,5	81 %
10,0	66 %
9,5	53 %
9,0	46 %
8,5	33 %
8,0	24 %

4² Dependência do rendimento de enrugamento do tipo de mercaptano peso, volume, concentração de tampão tempo e temperatura da reacção, e pH, correspondem ao ensaio 1. No ensaio adicionaram-se em cada caso 480 μιΐ da correspondente solução 0,1 molar de mercaptano e 480 ,ul da solução 0,1 molar de ácido ascórbico (excesso molar aproximadamente 20 vezes por grupo S-SO^^-)

Mercaptano rendimento de enrugamento

Cisteina 81 %

Mercaptoetanol 86 %

Glutationa 75 %

Acido tioglicólico 74 %

3-Meroapto-l,2-propandiol 76 %

5² Dependência do rendimento de enrugamento da substância tampão e da força iópioa do tampão

peso, volume, tempo e temperatura da reacção, e pH correspondem ao ensaio 1. Neste ensaio adicionam-se por cada caso 480 jul da correspondente solução 0,1 molar de mercaptano e 480 _zul de solução 0,1 molar de ácido ascórbico (excesso apromimadamente 20 vezes molar por grupo S-SO^~).

Tampão	rendimento	de enrugamento
10 mM Glicina	89	%
100 mM Glicina	82	%
10 mM Borato	82	%
100 mM borato	51	%
10 mM Carbonato	88	%
100 mM Carbonato	72	%

6s Dependência do rendimento de enrugamento do tempo de reacção peso, volume, concentração do tampão, o pH e temperatura da reacção correspondem ao ensaio 1. Adicionam-se em cada caso 480 _zul de uma solução 0,1 molar de mercaptoetanol e 480 _zul de uma solução 0,1 molar de ácido ascorbico (excesso aproximadamente 20 vezes molar por grupo S-SO^~) tempo de reacção (h) rendimento de enrugamento

0,25

0,5 % 40 % 46 % 61 % 70 % 77 % 83 % 79 %

7² Dependência do rendimento da concentrição do S-sulfonato de préproinsulina volume, composição do tampão, pH tempo de reacção e temperatura correspondem ao ensaio 1.

À quantidade de S-sulfonato de préproinsulina utilizada adicionam-se, em cada caso, de uma solução mãe de mercaptoetanol e de uma solução mãe de ácido ascórbico, em quantidades tais que se obtenham um excesso molar aproximadamente 20 vezes por grupo S-SO^^-

Concentração de	rendimento	de enrugamento
Préproinsulina S-SO^~
0,1 ml/ml	86	%
0,2 ml/ml	84	%
0,5 ml/ml	78	%
0,4 ml/ml	65	%
0,5 ml/ml	55	%
1,0 ml/ml	19	%
2,5 ml/ml	5	%

8² Dependência do rendimento de enrugamento do excesso ácido ascórbico/meroaptoetanol para um material de partida modificado

Interessa para utilização uma molécula precursora na qual as cadeias A e B da insulina estão acopladas apenas por uma arginina. A obtenção por tecnologia genética desta molécula é realizada como foi descrito inicialmente na descrição dos ensaios. 0 material liofilizado tem um teor de 60% e é dissolvido com uma concentração de 0,5 mg/ml em tampão de glicina 20 milimolar, pH 10,5, o que corresponde a uma concentração de precursor de 0,5 mg/ml. 0 tempo e a temperatura da reacção correspondem ao ensaio 1, e o excesso molar da mistura ácido ascórbico/mer- 19 -

captano varia entre 2,5 e 50 vezes.

Excesso por grupo S-SO^

2,5 5 rendimento de enrugamento 56 $ # „ i

i 55 Í>

Dependência do rendimento de enrugamento do sistema redox peso, volume, composição do tampão, pH, tempo e temperatura da reacção, correspondem ao ensaio

1. Trabalha-se com um excesso molar aproximadamente 20 vezes de mercaptoetanol/grupo S-SO^ e um excesso molar 20 vezes do correspondente parceiro redox.

parceiro redox Ácido ascórbico

Ácido desidroascórbico Pirocatequina Hidroquinona benzo(-p-)quinona rendimento de enrugamento 77 % ia 66 % ia 23 Í

Claims

REIVINDICAÇÕES

- 16 _

Processo para a preparação de um precursor de insulina, com a fórmula I

- 20 X (I) (A-l) Gly-NH I (Α-6) Cys-S-S (Α-7) Cys Cys— (A-ll)

S s

(B-1) (A-20) (A-21) ---- Cys - Z - Rg

S

I

S

R^-NH-Phe—Cys------(B-7)

---Cys---------Y (B-19) (B-30) na qual R^ representa hidrogénio, um radical de aminoácido ou de peptídeo dissociável química ou enzimâticamente,

Rg representa hidroxilo ou um radical de aminoácido ou de peptídeo, de preferência hidroxilo,

X representa um radical ligado às cadeias A e B da insulina, de preferência um radical de aminoácido ou de peptídeo,

Y representa um radical de um aminoácido codificável gene tioamente, de preferência Thr, Ala, Ser, especialmente Thr Z representa um radical de um aminoácido codificável geneticamente, de preferência Asn, Gin, Asp, Glu, Gly, Ser, Thr, Ala ou Met, especialmente Asn,

A1-A20 e B1-B29 representam sequências peptidicas da insulina, não modificadas ou modificadas por permuta de um ou mais aminoácidos, de preferência as sequências peptidicas não modificadas da insulina humana, de porco ou de vitelo, especialmente de insulina humana ou de porco, por reacção de um precursor com grupos Cys-S protegidos e um mercaptano em meio aquoso, caracterizado pelo facto de se fazer reagir um precursor com grupos Cys-S bloqueados,

- 21 de fórmula II ' (A-l) Gly-NH- X

I (A-6) Cys-S-R^ S-R^ (A-20) (A-21) (A-7) Cys-------Cys----- Cys - Z - R₂ (A-ll) s-r₅ S-R^ s-r₅ s-r₅ (B-1)

R^-NH-Phe---Cys----------------Cys------------Y )B-7) (B-19) (B-30)

II na qual R^, R₂, X, Υ, Ζ, A1-A20 e B1-B29 tem os mesmos si gnificados que na fórmula I e

Rj representa um grupo de bloqueio de Cys-S, de preferência o grupo -S0^~ ou o grupo -t-butilo, com ummercaptano, numa quantidade correspondente a uma relação SH de mercaptano/Cys-S-R^ (na fórmula II) superior a 5, na presença de um sistema redox orgânico ou pelo menos de um composto orgânico que nas condições de reacção forma um sistema redox orgânico referido.

- 2s Processo de acordo com a reivindicação 1 caracterizado pelo facto de se utilizar como mercaptano mercaptoetanol e/ou cisteina.

- 3® Processo de acordo com as reivindicações 1 ou 2, caracterizado peio facto de se trabalhar com uma relação SH, de mercaptano/Cys-SR^ (na fórmula II) superior a 5 e até 100, de preferência de cerca de 10 até 50, especialmente de cerca de 10 até 30.

- 4® Processo de acordo com uma ou mais das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo facto de se utilizar como sistema redox orgânico pares de compostos dos quais um dos componentes é um composto orgânico com o elemento de estrtura de fórmula III

OH OH 0

I » II

C = C - C (III)

0 OH OH n ι ι

0 - c = c ou um composto de o- ou p-dihidroxi aromático, e como outro componente um composto orgânico com o elemento de estrutura de fórmula III numa forma oxidada, correspondente ao elemento de estrutura de fórmula III’

0 0 0

II II II

- c - c - c ou uma o- ou p-quinona.

(III¹) àsgssa

- 58 Processo de acordo com uma ou mais das reivindicações 1 a 3 caracterizado pelo facto de se utilizar como compostos orgânicos que nas condições de reacção formam um sistema redox orgânico, um ou mais dos componentes individuais mencionados na reivindicação 4.

- 6& Processo de acordo com uma ou mais das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo facto de se uti lizar como sistema redox orgânico os pares de compostos, ácido ascórbico + ácido deshidroascórbico, pirocatequina + o-quinona e hidroquinona + p-quinona e como compostos orgânicos que nas condições da reacção podem formar um sistema redox referido, se utilizar apenas em cada caso um componente destes pares de compostos.

_ 7ô _

Processo de acordo com uma ou mais das reivindicações 1 a 5 caracterizado pelo facto de se trabalhar na presença de ácido ascórbico e/ou de ácido deshidroascórbico.

- 8& Processo de acordo com uma ou mais das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo facto de se utilizar o mercaptano e o ou os compostos que formam o sistema redox orgânico numa relação de 1 equivalente grama de mercaptano para 1/10 000 até 10 000, de preferência 1/10

- 24 até 10 mole, do composto ou compostos que formam o sistema redox orgânico.

- 9® Processo de acordo com uma ou mais das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo facto de se realizar a reacção a um valor de pH compreendido entre cer ca de 7 e 12, de preferência entre cerca de 9,5 e 11.

A requerente reivindica a prioridade do pedido alemão apresentado em 21 de Janeiro de 1989, sob o NS p 39 01 719.2.