PT94564A - Processo para a preparacao de uma composicao bacteriana utilizada em avicultura - Google Patents

Description

FAKMO S ~ YHTYMÃ .QY "PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE DMA COMPOSIÇÃO BACTERIANA UTILIZADA EM AVICULTURA" A presente invenção refere-se a uma preparação bacte-riana a ser utilizada em avicultura, que se destina, em especial, a evitar a colonização do intestino das aves, por bactérias pato genicas humanas, especialmente a' Campylobacter spp. A avicultura ê a fonte mais importante das infecções humanas causadas pela campylobacter e pela salmonela. Encontra--se bem documentada a função da' Campylobacter jejuni e da Campylobacter coli como uma causa vulgar de doenças gastrointestinais humanas. Como referência, King, E.O.: "The laboratory recognition of Vibrio fetus and a closely related Vibrio isolated from cases of human vibrosis", Annals of the New York Academy of Sciences, 98:700-711, 1962, referiram as galinhas como fonte primaria das infecções humanas. Skirrow, M.B.: "Campylobacter enteritis: a 'new' disease", Brit. Med. J. 2:9-11 (1977) demonstraram, nalguns casos, uma associação entre a doença humana e o contacto com galinhas portadoras do organismo, nas quintas, nos talhos e nas co zinhas. Esta associação foi posteriormente documentada em diversos estudos epidemiolõgicos, por exemplo, Harris, N.V., Weiss, N. S. and Nolan C.M.: "The role of poultry and meats in the etiolo-gy of Campylobacter jejuni coli enteritis". Am. J. of Public Health 76:407-411 (1986). Existem também diversas referências de destruições nas quais o veículo de campylobacteriose epidemiolé-gicamente implicado ou de que se suspeitava, consistia em galinhas cruas, assadas ou mal passadas. Segundo a Newsletter n°20. -2-

publicada na WHO em Abril de 1989, o número de infecções causadas pela campyTobacter excedia, nos últimos anos, o número de in fecções por salmonella, em diversos países industrializados.

Num estudo efectuado pelo National Veterinary Institu-te na Finlândia, confirmou-se que uma razão provável para a sus-ceptibilidade dos intestinos dos frangos, que se destinavam a se rem grelhados, a colonização pela' salmonella (desenvolvimento e ligação), residia no desenvolvimento retardado da flora bactéria na intestinal, normal. Este atraso i um resultado dos métodos mo dernos de produção em massa de frangos que se destinam a serem consumidos grelhados. Tais animais possuem, além disso, uma fraca defesa contra as bactérias exégenas que penetram no corpo. E. Nurmi e M. Rantala, Nature 241:210-211, 1973 demonstraram que se se fornecer o conteúdo do intestino adulto normal a aves recêm--nascidas, aumenta a sua resistência â colonização pela salmonella. Com base neste trabalho pioneiro, formulou-se a teoria da ex clusão competitiva (daqui em diante designada por EC). Divulgam--se as preparações bacterianas, especialmente para a profilaxia das infecções pela salmonella, em avicultura, por exemplo, as pa tentes de invenção europeias 6695, 33584 e 154478. 0 sucesso na prevenção da Salmonella,por exclusão competitiva em pintos que se destinavam a ser grelhados, encorajou diversos grupos de trabalho em todo o mundo a aplicarem o mesmo método para a profilaxia de Campylofoacter ssp♦Soerj adi-Lien, Snoeyenbos and Weinack, Avian Diseases .26:520-524 (1982) e 28:139-146 (1983) referiram que, quando se administrava a aves recém-nascidas uma suspensão de fezes a 10% a partir de flocos específicos isentos do agente patogénico colonizados com uma microflora de protecção. óptima, a sua resistência a C. jejuni aumentava. Este grupo de investigação -3- referiu, mais tarde, que o efeito de CE de uma microflora admi- / /a’ nistrada diminuía com doses crescentes de' Campylobacter spp. De acordo com outras referências, de CE sobre o campylobacter spp., não se descobriu nenhum efeito quer utilizando floras de CE originadas a partir das fezes e das excreções cecais (Stern, Bailey e Blankenship, Avian Diseases' '32:330-334, 1988), ou utilizando floras de CE originadas a partir da flora fresca do cego de um adulto (Shanker, Lee & Sorrel, Epidemiology e Infection 100;27--34, 1988). A presente invenção proporciona uma preparação bacte-riana útil na profilaxia da colonização das bactérias patogéni-cas humanas na avicultura, que compreende bactérias derivadas de uma ave adulta, a partir do nicho microecolõgico, que a bactéria patogênica ocupa. A preparação da presente invenção compreende uma flora bacteriana, derivada, de um modo mais específico, da flora cecal normal e, especialmente, da camada mucosa do cego de aves adultas, que se podem utilizar para inibir a colonização de bactérias pa-togénicas humanas, especialmente 'Campylobacter, nas aves jovens.

Os resultados aqui referidos divulgam a redução da colonização do biótipo 1 de C. jejuni, em frangos destinados a grelhados. A preparação bacteriana da presente invenção ê também eficaz contra ou tras espécies de CampyTobaCter e, possivelmente, também contra ou tras bactérias patoginicas.

Seleccionou-se a flora utilizada na presente invenção, a partir dos mesmos nichos microecologicos que a Campylobacter ten de a ocupar no cego dos frangos destinados a grelhados. Obtiveram -se floras altamente eficazes, por cultura da flora bacteriana a partir da camada mucosa da parede cecal a partir de uma ave adulta -4- guer em condições anaeróbicas quer em condições microaerofilicas, de preferência, num caldo de mucina. É, também preferível selec-cionar bactérias com elevada motilidade na mucina.

As floras utilizadas nos ensaios foram todas originadas a partir do cego de uma galinha poedeira, mais velha. CRIAÇÃO DAS FLORAS;

Homogenato cecal (Flora A)

Homogeneizou-se o cego, na sua totalidade e diluiu-se com agua de peptona a 0,1% nos ensaios ã escala laboratorial e com agua potável, normal, nas experiências em maior escala. A fio ra não continha nem Salmonella spp nem Campylobacter spp.

Os métodos de ensaio foram os seguintes:

Salmonella: Agua de peptona tratada com tampão a 1% (37°C/20 h), caldo de Rapport-Vassilia-dis a 41,5^C/20 h) e caldo de tetratio-nato (37^C/20 h), agares verdes brilhan tes e Onoz (37°C/20 horas).

Campylobacter: Caldo de Brucella enriquecido com piru- vato de sódio, metabissulfito de sódio e aço ferroso (FBP) (41,5°C/20 h, numa atmosfera microaerofílica), agar CCD (41,5°C/44 h, numa atmosfera microaerofílica) .

Cultura de homogenato cecal· (Flora B)

Utilizou-se 1 ml de homogenato cecal para se inocular em -δ- ΙΟ ο ml de caldo de' Brucela (BBL) reforçado com lg de Mucina Gãs trica de Porcino (SIGMA),. Efectuou-se rima suspensão da mucina em pequenas porções em agua em ebulição e neutralizou-se antes de se adicionar o resto do meio. Adicionou-se assepticamente, ce foperazona (Cefobis, Pfizer), apôs autocalvagem, até uma concentração final de 32 mg/1. Prolongou-se a incubação durante 48 horas, a 41,5°C em condições microaerofílicas.

Cultura e Purificação da Camada da Mucosa Cecal (Flora C)

Descarregou-se a porção essencial das bactérias não mõ veis da flora B, em agar de mucina semi-sõlido a 10%, que possuia a seguinte composição:

Agar de mucina semi-sõlido a 10%

Mucina 10,00 g Caldo de Brucella 0,50 g K2HP04 0,25 g Agar 1,10 g Ãgua 100 ml

Deve dissolver-se a mucina em ãgua em ebulição, antes da autoclavagem. Ajustou-se o pH para 7,2 com NaOH 0,1N

Transferiu-se a flora B para uma linha de uma placa de Petri de 12 cm, contendo 33 ml de agar de mucina semi-sõlido a 10%.

Apõs a incubação microaerofílica (41,5^C/48 h/ oxigénio a 5%., CC>2 a 15% e azoto a 80%) transferiu-se uma pequena porção da agar situado entre 2 e 4 cm da linha, para caldo de mucina a 10%. Â composição deste caldo era idêntica ã do agar de mucina com -6- excepção. de çpie não continha cefoperazona nem agar. Repetiu-se o procedimento ate não se observarem bactérias não moveis no caldo.

Isolamento' das bactérias

Efectuou-se uma cultura da flora C em agar de Brucella numa atmosfera microaerofílica a 41,5°C, durante 48 a 96 horas. Isolaram-se os organismos móveis de conformação em espiral.

Transferiu-se a flora B para uma linha de uma placa de Petri de 12 cm, contendo 33 ml de mucina de agar semi-sólida a 10%. Após incubação anaeróbica (41,5°C/48 h), transferiu-se uma pequena porção de agar situada entre 2 a 4 cm da linha, para um caldo II de mucina, que também se incubou, numa atmosfera anaeró bica. Repetiu-se este procedimento até não se observarem bactérias não móveis, no caldo. Após três repetições, existia apenas, no caldo, uma espécie de bactérias que se designou por Y.

ADMINISTRAÇÃO DAS FLORAS

Ensaios Laboratoriais

Nos ensaios laboratoriais, dividiram-se 60-72 aves recém-nascidas em 12 grupos. Administraram-se as floras de CE nas cristãs das aves de 2 x 4 grupos. Utilizaram-se os quatro grupos restantes como controlos e não receberam floras de CE.No dia seguinte, administraram-se, a todos os grupos, com excepção de dois dos quatro grupos de controlo, de acordo com o mesmo método, 100--3000 CFU de C. jejuni biótipo I Penner 15 ou Penner 3/43/59. Sacrificaram-se metade das aves uma semana depois e as restantes, sacrificaram-se decorridas duas semanas. Efectuou-se a observação quantitativa de Campylobacter, a partir dos cegos das aves. -7- -7- / // '/

Ensaios· de campo

Nos ensaios de campo dividiram-se 1600-1700 aves em 16 grupos, oito dos quais funcionavam como grupos de ensaio, quatro como controlos positivos de' Campylobacter e quatro como grupos de referência. Misturaram-se as floras de CE na primeira agua. de beber de oito grupos de ensaio. Administraram-se 4,16-5,80 log^ CPU de C. jejuni, biótipo 1 Penner 15 no dia seguinte a três aves alimentadas com sementes, em cada uma das gaiolas, com ex-cepção das gaiolas dos quatro grupos de referência. Todas as semanas, até ao fim do período de crescimento, sacrificaram-se três a cinco aves de cada gaiola e examinou-se o cego das aves, quantitativamente, quanto a CaMpylobacter spp.

Utilizou-se caldo de Brucella com FBP (sulfato ferroso, metabissulfito de sódio e piruvato de sódio, 0,5 g/1, de cada) e cefoperazona (32 mg/1) e agar de desoxichoato de carvão-cefopera-zona (CCD) nos exames quantitativos e qualitativos de Caffipylobac-ter spp. Incubaram-se os caldos durante 20 horas e os agares durante 44 horas a 41,5°C numa atmosfera microaerofilica.

Resultados 0 factor de colonização ê a media aritmética dos valores de log-^Q do número de CPU por grama de conteúdo cecal das aves, individualmente, em cada um dos ensaios ou grupos de contro lo.

Uma ave Campylobacter negativa (quer por observação qualitativa quer quantitativa) , de acordo com o convencionado pos; sui, segundo os cálculos, um valor de log^Q de 0,1. .··/··· -8- /· /

Ensaio' 1

Experiências Laboratorials 0 quadro 1 indica que a incubação microaerofxlica da flora B proporcionou uma exclusão competitiva mais eficaz de Cam pylobacter spp. do que a incubação anaeróbica da flora B.

Quadro 1. Dose de 895 CFU de C.' jejuni biotipo I estereotipo estável ao calor 15/galinha

Eactor de Colonização 1 semana 5,13 5 f 96

Controlo 1 Controlo 2 2 semanas 7,74 8,35

Cultura microaerofxlica de flora B

Grupo 1 <2,00 <2,00 Grupo 2 <£2,00 <2,00 Grupo 3 <£2,00 o o CN V Grupo 4 2,34 <2,00 Cultura anaeróbica de flora' B Grupo 1 <2, 00 3,24 Grupo 2 4, 91 <2,00 Grupo 3 3, 89 <2,00 Grupo 4 ^ 3, 70 7,04

Ensaio 2

Purificou-se a flora B, de acordo com a: mobilidade e a atmosfera, no interior de uma flora C microaerofxlica e de uma -9-

flora B anaerõbica Y, tal como anteriormente descrito. As bactérias anaerébicas Y, sozinhas não suscitaram o efeito de CE. A combinação destas floras (1:1) voltaram a apresentar o efeito de CE, conforme se indica nos grupos 3 e 4, Quadro 2.

Experiências Laborator i ai s

Quadro 2. Dose de 245 CFU de C. jejuni biotipo I estereotipo estável ao calor 15/galinha

Factor de Colonização

Controlo 1 Controlo 2 Apenas Flora Y Grupo 1 Grupo 2 1 semana 7,78 8,33 2 semanas 7,58 8,74 1,90 6,70 6,55 8,06

Flora Y + Flora C (1:1)

Grupo 3 1,80 <£2,00

Grupo 4 3,22 ^2,00

Ensaios de campo

Desenvolveram-se 16 x 100 frangos que se destinavam a serem posteriormente grelhados, em unidades de crescimento normais, durante seis semanas. Utilizaram-se oito grupos num ensaio de exclusão competitiva. Quatro grupos funcionaram como um controlo negativo, que não se indica no gráfico. Proporcionaram-se aos grupos de ensaio duas espécies de floras cecais, na sua pri- -10 meira agua para beber. As diluições das floras foram de 1/30. Cada ave recebeu aproximadamente 0,25 ml de líquido de tratamento . A quatro grupos de ensaio forneceu-se bactérias moveis anaerobicas adaptadas a mucina (flora Y). Os restantes quatro grupos receberam flora combinada (1:1) que consistia em flora C, que ê uma flora microaerofílica adaptada a mucina, conforme an-teriormente descrito.

Infectaram-se 36 frangos com Campylobacter jejuni,bio-tipo 1, Penner, serotipo 15, com a idade de um dia. A dose foi de log10 4,16 CFU. Administrou-se três destes fornecedores de se mentes a cada grupo. Examinaram-se quantitativamente os conteúdos cecais de cada grupo, com intervalos de uma semana, para se pesquisar Campylobacteria em agar-CCD. Calculou-se o factor de colonização como uma média aritmética dos valores de log^Q do nú mero de CFU por grama de conteúdo cecal de cada uma das aves de cada grupo. 0 controlo negativo conservou-se qualitativamente ne gativo para o campylobacter spp. até se abaterem as aves.

Na Figura 1, indicam-se os resultados. Pode observar--se que as bactérias anaerobicas adaptadas à mucina (flora Y) não protegeram o cego da colonização pela Campylobacter spp., apesar do número de campylobacter spp. no cego ter diminuido le vemente (cerca de 4.1 1°U^q unidades). A combinação (1:1) da fio ra Y com a flora C retardou, o inicio da colonização de campylobacter spp. em, duas semanas. Decorridas três semanas de infec-ção o número de CampyTobacter spp, conservou-se a um nível 4 log^Q unidades inferior ao dos grupos de controlo. -11-

Ensaio 3

Comparou-se o efeito de CE de um homogenato diluído do cego (flora A) com o efeito de CE de uma flora cecal não especifica desenvolvida numa atmosfera anaerõbica. A quantidade de aves ensaiadas e os grupos bem como as quantidades administradas de flora de CE por ave foram idênticos aos que se utilizaram no ensaio anterior. Administrou-se a quatro grupos de ensaio flora A e a outros quatro grupos flora cecal não especificada, desenvolvida numa atmosfera anaerõbica. Designa-se esta flora por 427/C. Injectaram-se dezoito frangos para grelhar com Campylobacter jejuni, biótipo 1, Penner serotipo 15, aos dezoito dias de idade. A dose foi de log^Q 5,80 CFU. Retiraram-se três dessas aves de cada grupo. A Figura 2, indica que a flora A (o homogenato de cego diluido) apresentou o efeito de CE mais eficaz. A flora A colonizou, aparentemente, o cego das aves e evitou a colonização de C. jejuni em dois dos grupos e diminuiu a proporção de colonização (de 4 log.^ unidades) nos outros dois grupos. A flora 427/C retardou o inicio da infecçio em 1-2 semanas, mas provavelmente após duas semanas o número de Campylobacter no cego das aves teria atingido o mesmo nível que o atingido no cego dos grupos de controlo (completamente colonizados pela campylobacter spp.).

Claims (7)

1. f -12-

   REIVINDICAgOES 1.- Processo para a preparação de uma composição bacte riana útil para a profilaxia de infecções bacterianas intestinais em avicultura, em particular na profilaxia de "Camaylobacter spp.'', caracterizado pelo facto de se incorporar bactérias derivadas de aves adultas, a partir de nichos mi-croecolõçicos susceptlveis de serem ocupados normalmente por bactérias patogênicas, em uma quantidade compreendida entre 50% e 100%,
2. 2.- Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de se incorporar bactérias derivadas do ceco de uma ave adulta.
3. 3.*- Processo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo facto de se incorporar bactérias derivadas da camada mucosa do ceco de uma ave adulta. -13-
4. 4.- Processo de acordo com uma qualquer das reivindicações anteriores, caracterizado pelo facto de se incorporar bactérias derivadas do ceco homogeneizado de uma ave adulta.
5. 5.- Processo de acordo com uma qualquer das reivindicações anteriores, caracterizado pelo facto de se cultivarem as bactérias derivadas sob condições microaerofílicas ou anaeróbicas para produzir a composição.
6. 6. - Processo de acordo com uma qualquer das reivindicações anteriores, caracterizado pelo facto de se cultivarem as bactérias num caldo de mucina.
7. 7. - Processo de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo facto de se incorporar bactérias móveis em forma de espiral, Lisboa, 29 de Junho de 1990